CN114025606B - 霜霉病抗性菠菜和赋予对霜霉病的抗性的基因 - Google Patents
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Abstract
本公开内容涉及对由粉霜霉(Peronospora farinosa，Pfs)引起的霜霉病具有抗性的菠菜植物。本公开内容还涉及在菠菜植物中赋予对多个Pfs小种之抗性的抗性基因。另外，本公开内容涉及用于获得对霜霉病具有抗性的菠菜植物的方法。
Description
技术领域
本公开内容涉及对由粉霜霉(Peronospora farinosa，Pfs)引起的霜霉病具有抗性的菠菜植物。本公开内容还涉及在菠菜植物中赋予对多个Pfs小种(race)之抗性的抗性基因。另外，本公开内容涉及用于获得对霜霉病具有抗性的菠菜植物的方法。
背景技术
菠菜(Spinacia oleracea)是生长在许多不同环境中的露天作物。菠菜是在春季期凉爽湿润、夏季凉爽和秋季干燥的地区生长良好的二倍体作物。菠菜生长的最佳土壤条件包括排水良好的土壤和6以上的pH。如今，菠菜育种主要侧重于抗病性(例如，抗霜霉病)、作物产量和改善的营养价值。
育种和筛选活动有助于在主要生产区选择菠菜品种，其中当地市场适应性和动态抗性是成功的重要因素。菠菜育种计划旨在为所有细分市场提供品种：新鲜(嫩叶)市场、捆扎(bunching)市场以及冷冻和罐头产品市场。主要类型中存在数种特定的菠菜品种：光滑(smooth)型、皱叶(savoy)型和东方型(oriental type)。菠菜市场在全世界迅速增长，并且正在进行大量研究以改善菠菜遗传学。菠菜遗传改良的具体目标是改善抗病性、降低对生化物质或农药的需求以及提高作物产量和作物质量二者。育种计划的另外的目标是对由粉霜霉引起的霜霉病具有广泛抗性的菠菜品种，其在理想情况下已经考虑了未来的菌株。
霜霉病是指寄生于植物的数种类型的卵菌。霜霉病可来源于多种物种，但主要的霜霉病属是霜霉属(Peronospora)、单轴霉属(Plasmopara)和盘霜霉属(Bremia)。霜霉病是许多粮食作物中的问题，并且是菠菜中最成问题的病害之一。在菠菜中，霜霉病是由粉霜霉(Peronospora farinose sp.，Pfs)引起的，并且这种病原体在全世界影响这种作物的生产。病害通过空气中的孢子在植物之间传播。感染霜霉病的菠菜表现出变色区域和上叶表面上不规则黄色斑块的症状，以及位于下叶表面上的白色、灰色或紫色霉菌。病变可最终变干并变成棕色。
杀真菌剂可用于控制粉霜霉，但最终粉霜霉会变得对这些化学物质具有免疫力，因为随着时间的推移，病原体也会获得对杀真菌剂的抗性。另外，市场希望减少这样的化学物质在粮食作物生产中的使用。因此，寻找其他方法来控制粉霜霉感染至关重要。最优选的控制形式将是针对粉霜霉提供广泛抗性的抗性基因。此外，可将一种或更多种(例如，具有较窄抗性的)抗性基因组合以实现针对粉霜霉的广泛且持久的抗性。因此，鉴定新的抗性基因是对化学防治的有希望的替代。
迄今为止，已鉴定出粉霜霉的17个官方小种(Pfs1至Pfs17)。这些小种的表征是基于对特定组的不同宿主(差异)的定性疾病反应，这是广泛用于鉴定许多植物病原体小种的方法。对于菠菜，当前的差异组包含新的和老的商业杂交种以及开放授粉品种和育种系(NIL系)。这样范围的差异是必需的，因为菠菜中的霜霉病特别复杂，并且会迅速进化以逃避抗病性。在抗病性基因的压力下，病原体突变以破坏抗病性，这意味着需要作物中新的抗病性来控制感染。霜霉病有许多不同的小种，并且新的抗性霜霉病小种，即打破当前菠菜抗性的小种，一直在出现。在新的菠菜抗性产生后的4至6个月内就可很快发生突破。主要问题是随着粉霜霉迅速进化出新的毒力小种，市场上组合了不同抗性的现存菠菜品种很快就会过时。在过去的数年里，随着新的粉霜霉小种在菠菜中不断涌现，要在这种毁灭性疾病之前领先一步变得越来越困难。
目前，还没有可用的单个抗性基因对粉霜霉的所有小种提供全谱抗性。因此，将多个抗性基因组合或堆叠到菠菜植物中是有利的，这样获得的植物包含多个抗性基因并对所有粉霜霉小种都具有抗性，或至少对尽可能多的粉霜霉小种具有抗性。
考虑到上述情况，本领域需要在菠菜中开发更多样化和更持久的抗性，并提供对由粉霜霉引起的霜霉病具有抗性的菠菜植物。特别地，需要提供针对粉霜霉具有广谱抗性的菠菜植物。此外，本公开内容的一个目的是提供获得这样的霜霉病抗性植物的方法。需要更多的基因多样性，以使得在商业杂交种中实现更多的遗传变异，使病原体例如粉霜霉更难适应。这些基因的抗性越广泛，它们就越能有效地用于开发抗性植物。
发明内容
本公开内容的一个目的以及其他目的是解决本领域中的上述需要。本公开内容的目的以及其他目的通过如所附权利要求中概述的本公开内容来满足。
具体地，根据第一方面，上述目的以及其他目的通过本公开内容通过对由粉霜霉(Pfs)引起的霜霉病具有抗性的菠菜植物来满足，其中所述菠菜植物包含一种或更多种抗性基因，其中所述一种或更多种抗性基因编码与SEQ ID No.4具有至少85％序列同一性的蛋白质，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％，最优选100％，其中所述蛋白质包含保守氨基酸序列KDHKIEKE和保守氨基酸序列LSNNRNLKIL。本公开内容的新的候选显性Pfs抗性基因的鉴定也被称为CC-NBS-LLR基因。发现了新的抗性基因，更具体地通过对菠菜中基因座1的测序以及粉霜霉抗性基因的基因作图获得T10、T70、T71、T72、T75、T76、T83、T89、T96、T253、T18、T133、T139、T170和T175。优选地，本公开内容的菠菜植物包含至少两种选自T10、T70、T71、T72、T75、T76、T83、T89、T96、T253、T18、T133、T139、T170、T175的新的抗性基因。
在菠菜中，在菠菜基因组中2号染色体的基因座1上对这些新的抗性基因进行作图。新的Pfs抗性基因的相似性使用多重比对软件确定，并显示出高度保守，参见表1。新的Pfs抗性基因的编码序列显示出至少约94％的序列相似性。T10的编码序列由SEQ ID No.1表示，T70由SEQ ID No.3表示，T71由SEQ ID No.5表示，T72由SEQ ID No.7表示，T75由SEQID No.9表示，T76由SEQ ID No.11表示，T83由SEQ ID No.13表示，T89由SEQ ID No.15表示，T96由SEQ ID No.23表示，并且T253由SEQ ID No.25表示，T18由SEQ ID No.27表示，T133由SEQ ID No.29表示，T139由SEQ ID No.31表示，T170由SEQ ID No.33表示，以及T175由SEQ ID No.35表示。
根据一个优选的实施方案，本公开内容涉及菠菜植物，其中所述一种或更多种抗性基因编码蛋白质，其中所述蛋白质选自SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.24、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34和SEQ ID No.36。T10的氨基酸序列由SEQ ID No.2表示，T70由SEQ ID No.4表示，T71由SEQ ID No.6表示，T72由SEQ ID No.8表示，T75由SEQ ID No.10表示，T76由SEQ ID No.12表示，T83由SEQ ID No.14表示，并且T89由SEQ ID No.16表示，T96由SEQ ID No.24表示，并且T253由SEQ ID No.26表示，T18由SEQ ID No.28表示，T133由SEQ ID No.30表示，T139由SEQ ID No.32表示，T170由SEQ ID No.34表示，以及T175由SEQ ID No.36表示。
根据另一个优选的实施方案，本公开内容涉及菠菜植物，其中所述一种或更多种基因包含选自以下的编码序列：SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ ID No.31、SEQ ID No.33和SEQ ID No.35。
根据一个优选的实施方案，本公开内容涉及菠菜植物，其中所述一种或更多种抗性基因编码蛋白质，其中所述蛋白质包含氨基酸序列KDHxIzKE，其中x是氨基酸K或E，优选K，并且其中z是氨基酸K或E，优选E。氨基酸序列KDHxIzKE优选对应于蛋白质中第429位至第449位的氨基酸位置。
根据另一个优选的实施方案，本公开内容涉及菠菜植物，其中所述一种或更多种抗性基因编码蛋白质，其中所述蛋白质包含氨基酸序列LSNNRNLKIL。氨基酸序列LSNNRNLKIL优选对应于蛋白质中第592位至第612位的氨基酸位置。
根据又一个优选实施方案，本公开内容涉及菠菜植物，其中所述抗性基因编码蛋白质，其中所述蛋白质包含氨基酸序列KDHKIEKE和/或氨基酸序列LSNNRNLKIL。本公开内容的新的Pfs抗性基因的蛋白质在蛋白质内特定位置处共享至少一个保守氨基酸序列，KDHKIEKE和/或LSNNRNLKIL。
本公开内容一般地涉及具有一种或更多种抗性基因的植物，例如具有编码在氨基端结构域中具有CC基序的NBS-LRR蛋白(也被称为NLR)的R基因的植物。NLR具有独特的结构域结构，由核苷酸结合(NB-ARC)结构域和一系列C端富含亮氨酸的重复序列(leucine-richrepeat，LRR)组成，并且大多数具有由Toll/白介素-1受体(Toll/interleukin-1receptor，TIR)结构域、卷曲螺旋结构域(CC)或发散卷曲螺旋结构域(CCR)组成的N端延伸。NLR可结合和识别效应物或通过其效应物功能识别另一种植物成分的修饰。本发明抗性植物的蛋白质中的KDHKIEKE基序位于例如APAF-1和CED-4的蛋白质(即参与凋亡调控网络的胞质蛋白)以及是其他R蛋白共有的核苷酸结合衔接子的这些蛋白质的NB-ARC结构域中。假设NB-ARC结构域能够结合和水解ATP。ADP结合已通过实验验证。提出了该结构域对ATP的结合和水解会诱导整个蛋白质的构象变化，从而导致凋亡体的形成。NLR(高序列同源性)之间共有的结构域和共同的进化起源表明，在ADP交换为ATP之后通过NB-ARC结构域的多聚化是NLR激活的关键步骤，并作为例如植物免疫信号传导中的分子开关。认为ADP结合状态是“关闭状态”，其中LRR与NB-ARC结构域缔合，从而将NLR稳定在非活性状态。NLR的激活通常与ATP结合状态相关，并且被称为“开启状态”。优选地，KDHKIEKE基序位于由本发明包含的抗性基因编码的蛋白质中的氨基酸第433位至第442位。
LSNNRNLKIL基序位于蛋白质的LRR(富含亮氨酸的重复序列)结构域之一中。这些基序的主要功能看起来是为蛋白质-蛋白质相互作用的形成提供通用的结构框架。通过重组和基因转换的NLR多样化产生了能够识别高度可变和效应物并且可提供针对病原体的抗性的多种LRR区域。据信，这些结构域决定效应物识别，并因此参与直接效应物相互作用和疾病易感性/抗性。优选地，LSNNRNLKIL基序位于由本发明包含的抗性基因编码的蛋白质中的氨基酸第596位至第607位。
根据一个优选的实施方案，本公开内容涉及菠菜植物，其中所述菠菜植物包含选自以下的一种或更多种抗性基因：SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7和SEQ IDNo.15。T70由SEQ ID No.3表示，T71由SEQ ID No.5表示，T72由SEQ ID No.7表示，以及T89由SEQ ID No.15表示。
根据又一个优选的实施方案，本发明涉及对由粉霜霉(Pfs)引起的霜霉病具有抗性的菠菜植物，其中所述菠菜植物包含一种或更多种抗性基因，所述抗性基因包含选自以下的编码序列：SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQID No.11、SEQ ID No.13和SEQ ID No.15、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ ID No.31、SEQ ID No.33和SEQ ID No.35。这些一种或更多种抗性基因编码选自以下的蛋白质：SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID10、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14和SEQ ID No.16、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34和SEQ ID No.36。
根据另一个优选的实施方案，本公开内容涉及菠菜植物，其中所述植物至少对粉霜霉小种Pfs1至Pfs4以及Pfs7至Pfs17具有抗性。预期菠菜植物也将对Pfs6具有抗性。
根据另一个优选的实施方案，本公开内容涉及菠菜植物，其中所述一种或更多种抗性基因来源于保藏号NCIMB 43360。根据本发明的菠菜植物的种子于2019年2月21日保藏在NCIMB Ltd，Ferguson Building，Craibstone Estate Bucksburn，AB21 9YA Aberdeen，United Kingdom。
根据第二方面，本公开内容涉及由根据本公开内容的菠菜植物产生或从其获得的种子，所述种子包含一种或更多种抗性基因，其中所述一种或更多种抗性基因编码与SEQID No.4具有至少85％序列同一性的蛋白质，其中所述蛋白质包含保守氨基酸序列KDHKIEKE和保守氨基酸序列LSNNRNLKIL。
根据第三方面，本公开内容涉及在菠菜植物中赋予对霜霉病之抗性的抗性基因，其中所述基因编码与SEQ ID No.4具有至少85％序列同一性的蛋白质，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％，最优选100％。新的抗性基因编码在菠菜中赋予广泛Pfs抗性的蛋白质。抗性基因的编码序列与SEQ ID No.3具有至少90％的序列同一性，优选至少94％，更优选至少98％，甚至更优选至少99％，最优选100％。
根据一个优选的实施方案，本公开内容涉及抗性基因，其中所述基因包含选自以下的编码序列：SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQID No.29、SEQ ID No.31、SEQ ID No.33和SEQ ID No.35。
根据又一个优选实施方案，本公开内容涉及抗性基因，其中所述抗性基因编码蛋白质，其中所述蛋白质包含氨基酸序列KDHxIzKE，其中x是氨基酸K或E，优选K，并且其中z是氨基酸K或E，优选E。
根据一个优选的实施方案，本公开内容涉及抗性基因，其中所述抗性基因编码蛋白质，其中所述蛋白质包含保守氨基酸序列、保守氨基酸序列LSNNRNLKIL。
根据又一个优选的实施方案，本公开内容涉及抗性基因，其中所述抗性基因编码蛋白质，其中所述蛋白质包含氨基酸序列KDHKIEKE和/或氨基酸序列LSNNRNLKIL。
根据另一个优选的实施方案，本公开内容涉及抗性基因，其中所述抗性基因的编码序列选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7和SEQ ID No.15，并且在菠菜中提供至少对粉霜霉小种Pfs1至Pfs4以及Pfs7至Pfs17的抗性。优选地，抗性基因是SEQ ID No.7，更优选SEQ ID No.5，甚至更优选SEQ ID No.3，并且最优选SEQ ID No.15。
根据另一个方面，本公开内容涉及用于提供对霜霉病具有抗性的菠菜植物的方法，其中所述方法包括将一种或更多种抗性基因引入或修饰到菠菜植物的基因组中的步骤，其中所述一种或更多种抗性基因选自：SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.23、SEQID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ ID No.31、SEQ ID No.33和SEQ ID No.35。
根据另一个优选的实施方案，本公开内容涉及这样的方法，其中一种或更多种Pfs抗性基因的引入或修饰是通过基因组编辑技术、CRISPR Cas或诱变技术实现的。
根据另一个方面，本公开内容涉及用于提供对霜霉病具有抗性的菠菜植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)提供包含一种或更多种本公开内容的抗性基因的菠菜植物，
b)将步骤a)所述的菠菜植物与易感菠菜植物杂交，
c)任选地，将步骤b)中获得的植物自交至少一次，
d)选择对霜霉病具有抗性的植物。
根据一个优选的实施方案，本公开内容涉及这样的方法，其中所述一种或更多种抗性基因的编码序列选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7和SEQ ID No.15。
根据另一个优选的实施方案，本公开内容涉及这样的方法，其中所述菠菜植物对由粉霜霉小种Pfs1至Pfs4以及Pfs7至Pfs17引起的霜霉病具有抗性。
根据一个优选的实施方案，本公开内容涉及这样的方法，其中所述一种或更多种抗性基因是从保藏号NCIMB 43360获得的。
附图说明
将在以下实施例和附图中进一步详述本发明，其中：
图1示出了qPCR定量，其显示出在VIGS基因沉默之后感染Pfs小种14(Pfs 14)的菠菜植物中Pfs肌动蛋白的定量。用于定量的菠菜植物是未用VIGS构建体转化的菠菜植物(“未处理”)、包含T70基因的用RFP VIGS沉默构建体瞬时转化的抗性菠菜植物(“VIGSRFP”；阴性)和包含T70基因的用T70 VIGS沉默构建体瞬时转化的抗性菠菜植物(“VIGST70”)。进行了三个技术重复。如果T70基因表达水平在感染Pfs 14的菠菜中被VIGS沉默，则Pfs肌动蛋白的表达水平急剧提高。对Pfs易感的植物叶显示出Pfs肌动蛋白管家基因的高转录水平，表明易感性与由于VIGS沉默导致的低T70基因表达相对应。
图2示出了由抗性基因T10、T70、T71、T72、T75、T76、T83和T89编码的蛋白质中两个保守氨基酸序列基序的比对。所有这些蛋白质都包含第一保守氨基酸序列基序KDHxIzKE(示出于图2的顶部)，其位于第429位至第449位(x＝氨基酸K或E，优选K；z＝K或E，优选E)。大多数这些蛋白质还包含第二保守氨基酸序列基序LSNNRNLKIL(示出于图2的底部)，约在第592位至第612位。
图3示出了由抗性基因T10、T70、T71、T72、T83、T89、T96、T253、T18、T133、T139、T170和T175编码的蛋白质中两个保守氨基酸序列基序的比对。所有这些蛋白质都包含第一个保守氨基酸序列基序KDHKIEKE和第二保守氨基酸序列基序LSNNRNLKIL。
具体实施方式
抗病基因和蛋白质
核苷酸结合位点富含亮氨酸重复序列蛋白(Nucleotide-binding site leucine-rich repeat protein)，也被称为NBS-LRR蛋白，由植物中称为R基因的抗病基因编码。NBS-LRR蛋白的特征在于核苷酸结合位点(nucleotide-binding site，NBS)和富含亮氨酸的重复序列(LRR)结构域以及可变的氨基端和羧基端结构域。这些蛋白质参与多种病原体的检测，包括细菌、病毒、真菌、线虫、昆虫和卵菌。植物NBS-LRR蛋白有两个主要的亚家族，由在其氨基端结构域中的Toll/白介素1受体(TIR)或卷曲螺旋(coiled-coil，CC)基序限定，并且这两个亚家族的蛋白质都参与病原体识别。
菠菜中大多数已知的抗性是从称作基因座1的基因座中鉴定出的，并位于2号染色体(LG2)上并且高度可变。尽管已经在许多不同的野生菠菜登记库(accession)中鉴定了许多基因，但对于大多数基因，它们是否是功能性的(例如，提供霜霉病抗性)仍然未知。
本公开内容一般地涉及具有一种或更多种抗性基因的植物，例如具有编码在氨基端结构域中具有TIR基序的NBS-LRR蛋白之R基因的植物。在一些实施方案中，具有一种或更多种抗性基因提供对霜霉病(例如，粉霜霉)的广谱抗性。在一些实施方案中，具有一种或更多种抗性基因提供对粉霜霉的至少十五个小种的抗性。
在一些方面中，本公开内容的植物是菠菜(Spinacea oleracea)，也被称为菠菜(spinach)。菠菜包含许多抗性基因，被称为R基因。特别地，菠菜包含来源于基因座1的R基因。在一些方面中，本公开内容的植物具有存在于以登录号NCIMB 43360保藏的种子中的抗性基因。
本公开内容的某些方面涉及具有核苷酸编码序列SEQ ID NO：1的抗性基因。本文中还提供了SEQ ID NO：1的同源物和直系同源物。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的同源物或直系同源物具有与SEQ ID NO：1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的编码序列。
本公开内容的某些方面涉及具有核苷酸编码序列SEQ ID NO：3的抗性基因。本文中还提供了SEQ ID NO：3的同源物和直系同源物。在一些实施方案中，SEQ ID NO：3的同源物或直系同源物具有与SEQ ID NO：3具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的编码序列。
本公开内容的某些方面涉及具有核苷酸编码序列SEQ ID NO：5的抗性基因。本文中还提供了SEQ ID NO：5的同源物和直系同源物。在一些实施方案中，SEQ ID NO：5的同源物或直系同源物具有与SEQ ID NO：5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的编码序列。
本公开内容的某些方面涉及具有核苷酸编码序列SEQ ID NO：7的抗性基因。本文中还提供了SEQ ID NO：7的同源物和直系同源物。在一些实施方案中，SEQ ID NO：7的同源物或直系同源物具有与SEQ ID NO：7具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的编码序列。
本公开内容的某些方面涉及具有核苷酸编码序列SEQ ID NO：9的抗性基因。本文中还提供了SEQ ID NO：9的同源物和直系同源物。在一些实施方案中，SEQ ID NO：9的同源物或直系同源物具有与SEQ ID NO：9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的编码序列。
本公开内容的某些方面涉及具有核苷酸编码序列SEQ ID NO：11的抗性基因。本文中还提供了SEQ ID NO：11的同源物和直系同源物。在一些实施方案中，SEQ ID NO：11的同源物或直系同源物具有与SEQ ID NO：11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的编码序列。
本公开内容的某些方面涉及具有核苷酸编码序列SEQ ID NO：13的抗性基因。本文中还提供了SEQ ID NO：13的同源物和直系同源物。在一些实施方案中，SEQ ID NO：13的同源物或直系同源物具有与SEQ ID NO：13具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的编码序列。
本公开内容的某些方面涉及具有核苷酸编码序列SEQ ID NO：15的抗性基因。本文中还提供了SEQ ID NO：15的同源物和直系同源物。在一些实施方案中，SEQ ID NO：15的同源物或直系同源物具有与SEQ ID NO：15具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的编码序列。
在一些方面中，本公开内容的植物具有核苷酸编码序列为SEQ ID NO：1的抗性基因。在一些实施方案中，这些植物也可具有一种或更多种具有选自以下的核苷酸编码序列的抗性基因：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQID NO：13或SEQ ID NO：15。
本公开内容的某些方面涉及具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的抗性蛋白。本文中还提供了SEQ ID NO：2的同源物和直系同源物。在一些实施方案中，SEQ ID NO：2的同源物或直系同源物具有与SEQ ID NO：2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的编码序列。
本公开内容的某些方面涉及具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的抗性蛋白。本文中还提供了SEQ ID NO：4的同源物和直系同源物。在一些实施方案中，SEQ ID NO：4的同源物或直系同源物具有与SEQ ID NO：4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的编码序列。
本公开内容的某些方面涉及具有氨基酸序列SEQ ID NO：6的抗性蛋白。本文中还提供了SEQ ID NO：6的同源物和直系同源物。在一些实施方案中，SEQ ID NO：6的同源物或直系同源物具有与SEQ ID NO：6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的编码序列。
本公开内容的某些方面涉及具有氨基酸序列SEQ ID NO：8的抗性蛋白。本文中还提供了SEQ ID NO：8的同源物和直系同源物。在一些实施方案中，SEQ ID NO：8的同源物或直系同源物具有与SEQ ID NO：8具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的编码序列。
本公开内容的某些方面涉及具有氨基酸序列SEQ ID NO：10的抗性蛋白。本文中还提供了SEQ ID NO：10的同源物和直系同源物。在一些实施方案中，SEQ ID NO：10的同源物或直系同源物具有与SEQ ID NO：10具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的编码序列。
本公开内容的某些方面涉及具有氨基酸序列SEQ ID NO：12的抗性蛋白。本文中还提供了SEQ ID NO：12的同源物和直系同源物。在一些实施方案中，SEQ ID NO：12的同源物或直系同源物具有与SEQ ID NO：12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的编码序列。
本公开内容的某些方面涉及具有氨基酸序列SEQ ID NO：14的抗性蛋白。本文中还提供了SEQ ID NO：14的同源物和直系同源物。在一些实施方案中，SEQ ID NO：14的同源物或直系同源物具有与SEQ ID NO：14具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的编码序列。
本公开内容的某些方面涉及具有氨基酸序列SEQ ID NO：16的抗性蛋白。本文中还提供了SEQ ID NO：16的同源物和直系同源物。在一些实施方案中，SEQ ID NO：16的同源物或直系同源物具有与SEQ ID NO：16具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的编码序列。
在一些方面中，本公开内容的植物具有氨基酸序列为SEQ ID NO：2的抗性蛋白。在一些实施方案中，这些植物还可具有一种或更多种具有选自以下的氨基酸序列的抗性蛋白：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ IDNo.32、SEQ ID No.34和SEQ ID No.36。
在一些方面中，本公开内容的植物具有包含一个或更多个或者两个氨基酸共有基序的抗性蛋白。在一些实施方案中，抗性蛋白具有第一氨基酸共有基序KDHxIzKE，其中x是氨基酸K或E，优选K，并且其中z是氨基酸K或E，优选E。在一些实施方案中，第一氨基酸共有基序是KDHKIEKE。在一些实施方案中，抗性蛋白具有第二氨基酸共有基序LSNNRNLKIL。在一些实施方案中，抗性蛋白具有第一氨基酸共有基序和第二氨基酸共有基序二者。
第一氨基酸共有基序KDHxIzKE(例如KDHKIEKE)位于例如APAF-1和CED-4的蛋白质(即参与凋亡调控网络的胞质蛋白)以及是其他R蛋白共有的核苷酸结合衔接子的蛋白质的NB-ARC结构域中。假设NB-ARC结构域能够结合和水解ATP。ADP结合已通过实验验证。提出了NB-ARC结构域对ATP的结合和水解会诱导整个蛋白质的构象变化，从而导致凋亡体的形成。
第二氨基酸共有基序LSNNRNLKIL位于蛋白质的LRR(富含亮氨酸的重复序列)结构域之一中。这些基序的主要功能看起来是为蛋白质-蛋白质相互作用的形成提供通用的结构框架。认为这些结构域决定效应物识别，并因此决定疾病易感性/抗性。
对粉霜霉的抗性
本公开内容一般地涉及对霜霉病(例如，粉霜霉)抗性具有抗性的植物。在一些实施方案中，本公开内容的植物对粉霜霉具有广谱抗性。在一些实施方案中，本公开内容的植物对粉霜霉的15个或更多个、16个或更多个、或者17个或更多个小种具有抗性。在一些实施方案中，本公开内容的植物对选自以下的粉霜霉的15个或更多个、16个或更多个、或者17个小种具有抗性：Pfs1、Pfs2、Pfs3、Pfs4、Pfs5、Pfs6、Pfs7、Pfs8、Pfs9、Pfs10、Pfs11、Pfs12、Pfs13、Pfs14、Pfs15、Pfs16或Pfs17。在一些实施方案中，本公开内容的植物对Pfs1、Pfs2、Pfs3、Pfs4、Pfs7、Pfs8、Pfs9、Pfs10、Pfs11、Pfs12、Pfs13、Pfs14、Pfs15、Pfs16和Pfs17具有抗性。在一些实施方案中，本公开内容的植物另外对粉霜霉的其他小种具有抗性。
在一些实施方案中，一种或更多种抗性基因的一个或更多个编码序列的存在导致粉霜霉抗性。在一些实施方案中，所述一个或更多个编码序列选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ ID No.31、SEQ IDNo.33和SEQ ID No.35。在一些实施方案中，所述一个或更多个编码序列选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：15。
在一些实施方案中，一种或更多种抗性蛋白的存在导致粉霜霉抗性。在一些实施方案中，所述一种或更多种抗性蛋白选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID No.24、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.32、SEQ ID No.34和SEQ ID No.36。在一些实施方案中，抗性蛋白是SEQ ID NO：4。
本公开内容的植物
在一些方面中，本公开内容的植物是苋科(Amaranthaceae)植物。在一些实施方案中，本公开内容的植物是菠菜(菠菜)种的植物。
根据本说明书，植物部分包括但不限于叶、茎、分生组织、子叶、下胚轴、根、根尖、根分生组织、胚珠、花粉、花药、雌蕊、花、胚、种子、果实、部分果实、细胞等。植物组织可以是组织或任何植物部分。植物细胞可以是任何植物部分的细胞。
本公开内容的植物包括具有编码序列为选自以下的抗性基因的植物：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ IDNo.31、SEQ ID No.33和SEQ ID No.35。在一些实施方案中，本公开内容的植物包括具有编码序列为选自以下的抗性基因的植物：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：15。
本公开内容的植物包括具有氨基酸序列为选自以下的抗性蛋白的植物：SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ IDNo.32、SEQ ID No.34和SEQ ID No.36。在一些实施方案中，本公开内容的植物包括具有氨基酸序列为SEQ ID NO：4的抗性蛋白的植物。
本公开内容的植物包括具有包含以下的抗性蛋白的植物：第一保守氨基酸基序KDHxIzKE，其中x是氨基酸K或E，优选K，并且z是氨基酸K或E，优选E(例如，KDHKIEKE)；第二保守氨基酸基序LSNNRNLKIL；或者第一保守氨基酸基序KDHxIzKE和第二保守氨基酸基序LSNNRNLKIL二者。
本公开内容的植物包括从以登录号NCIMB 43360保藏的种子生长的菠菜植物。在另一个实施方案中，本发明涉及具有通过种植具有NCIMB登录号43360的菠菜种子产生的菠菜植物的所有生理和形态特征的菠菜植物和从其分离的部分。在又一个实施方案中，本发明涉及具有菠菜植物作为亲本的F1杂种菠菜种子、从该种子生长的植物和从其分离的叶，其中所述菠菜植物从具有NCIMB登录号43360的菠菜种子生长。在一些实施方案中，从以登录号NCIMB 43360保藏的种子生长的植物中存在具有选自以下的编码序列的一种或更多种抗性基因：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ IDNo.29、SEQ ID No.31、SEQ ID No.33和SEQ ID No.35。在一些实施方案中，从以登录号NCIMB 43360保藏的种子生长的植物中存在具有选自以下的氨基酸序列的一种或更多种抗性蛋白：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ IDNo.29、SEQ ID No.31、SEQ ID No.33和SEQ ID No.35。
为了确定植物是否是本公开内容的植物，并因此确定所述植物是否与本公开内容的植物具有相同的基因，可将植物的表型与本公开内容的已知植物(例如，从以登录号NCIMB 43360保藏的种子生长的植物)的表型进行比较。在一些实施方案中，本公开内容的植物具有广谱霜霉病(粉霜霉)抗性。在一些实施方案中，本公开内容的植物对选自以下的15个或更多个Pfs小种具有抗性：Pfs1、Pfs2、Pfs3、Pfs4、Pfs5、Pfs6、Pfs7、Pfs8、Pfs9、Pfs10、Pfs11、Pfs12、Pfs13、Pfs14、Pfs15、Pfs16或Pfs17。在一些实施方案中，表型可通过例如霜霉病叶盘测定来评估，如实施例4中所述。在一些实施方案中，表型可通过本领域技术人员已知的抗病性测定来评估。
除表型观察之外，还可检测植物的基因型。有许多本领域已知的可用于植物基因型的分析、比较和表征的基于实验室的技术。这样的技术包括但不限于同工酶电泳、限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA(Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、任意引物聚合酶链式反应(Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction，AP-PCR)、DNA扩增指纹识别(DNAAmplification Fingerprinting，DAF)、序列特征扩增区(Sequence CharacterizedAmplified Region，SCAR)、扩增片段长度多态性(Amplified Fragment LengthPolymorphism，AFLP)、简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR，也被称为微卫星)和单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)。通过使用这些技术，可评估涉及本公开内容植物的霜霉病抗性表型的等位基因、基因和/或基因座的存在。
另外，可检测植物或病原体的基因表达。有许多本领域已知的可用于植物或病原体基因表达的分析、比较和表征的基于实验室的技术。这样的技术包括但不限于定量聚合酶链式反应(Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR；也被称为实时PCR)、逆转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)和RNA测序(RNA-Seq)。例如，病原体基因的表达可使用qPCR进行评估，并用于确定植物是否具有本公开内容的植物的霜霉病抗性表型，如实施例3中所述。
获得本公开内容的植物的方法
在一些实施方案中，本公开内容涉及通过以下选择菠菜植物的方法：a)种植包含本公开内容的一种或更多种抗性基因或者一种或更多种抗性蛋白的菠菜植物和b)从步骤a)中选择植物。在一些实施方案中，本公开内容涉及通过将菠菜植物与包含本公开内容的一种或更多种抗性基因或者一种或更多种抗性蛋白的植物杂交来培育菠菜植物的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及通过以下培育对霜霉病具有抗性的菠菜植物的方法：(a)提供包含本公开内容的一种或更多种抗性基因或者一种或更多种抗性蛋白的菠菜植物，(b)将步骤(a)所述的菠菜植物与易感菠菜植物杂交，(c)任选地，将步骤(b)中获得的植物自交至少一次，以及(d)选择对霜霉病具有抗性的植物。在一些实施方案中，本公开内容涉及通过以下将期望性状引入包含本公开内容的一种或更多种抗性基因或者一种或更多种抗性蛋白的菠菜植物中的方法：(a)将包含本公开内容的一种或更多种抗性基因或者一种或更多种抗性蛋白的菠菜植物与包含期望性状的另一菠菜品种的植物杂交以产生后代植物，其中期望性状选自除草剂抗性；昆虫或害虫抗性；以及对细菌病、真菌病、卵菌病或病毒病的抗性；(b)选择具有期望性状的一种或更多种后代植物；(c)将选择的后代植物与包含本公开内容的一种或更多种抗性基因或者一种或更多种抗性蛋白的菠菜植物回交以产生回交后代植物；(d)选择具有期望性状以及包含本公开内容的一种或更多种抗性基因或者一种或更多种抗性蛋白的菠菜植物的所有生理和形态特征的回交后代植物；以及(e)连续重复步骤(c)和(d)两次或更多次以产生包含期望性状的选择的第三代或更高代的回交后代植物。在一些实施方案中，本公开内容涉及通过种植包含本公开内容的一种或更多种抗性基因或者一种或更多种抗性蛋白质的菠菜种子来获得菠菜植物的方法。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，菠菜后代植物对霜霉病(粉霜霉)具有广谱抗性。
在一些实施方案中，本公开内容涉及通过以下选择菠菜植物的方法：a)种植来自具有NCIMB登录号43360的菠菜种子的菠菜植物以及b)从步骤a)中选择植物。在一些实施方案中，本公开内容涉及通过将菠菜植物与从具有NCIMB登录号43360的菠菜种子生长的植物杂交来培育菠菜植物的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及通过以下培育对霜霉病具有抗性的菠菜植物的方法：(a)提供菠菜植物，其中菠菜种子样品以NCIMB登录号43360保藏，(b)将步骤(a)所述的菠菜植物与易感菠菜植物杂交，(c)任选地，使步骤(b)中获得的植物自交至少一次，以及(d)选择对霜霉病具有抗性的植物。在一些实施方案中，本公开内容涉及通过以下将期望性状引入从具有NCIMB登录号43360的菠菜种子生长的菠菜植物中的方法：(a)将菠菜植物(其中菠菜种子样品以NCIMB登录号43360保藏)与包含期望性状的另一菠菜品种的植物杂交以产生后代植物，其中期望性状选自除草剂抗性；昆虫或害虫抗性；以及对细菌病、真菌病、卵菌病或病毒病的抗性；(b)选择具有期望性状的一种或更多种后代植物；(c)将选择的后代植物与从具有NCIMB登录号43360的菠菜种子生长的菠菜植物回交以产生回交后代植物；(d)选择具有期望性状以及从具有NCIMB登录号43360的菠菜种子生长的菠菜植物的所有生理和形态特征的回交后代植物；以及(e)连续重复步骤(c)和(d)两次或更多次以产生包含期望性状的选择的第三代或更高代的回交后代植物。在一些实施方案中，本公开内容涉及通过种植具有NCIMB登录号43360的菠菜种子来获得菠菜植物的方法。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，菠菜后代植物对霜霉病(粉霜霉)具有广谱抗性。
本公开内容的抗性基因或蛋白质可通过育种的方式引入植物中。被称为回交的育种技术使品种(cultivar)的除转移到品系中的单个基因之外基本上所有期望的形态和生理特征得到恢复(例如，编码氨基酸序列为SEQ ID NO：4的蛋白质的抗性基因)。为期望特征提供基因(例如，编码氨基酸序列为SEQ ID NO：4的蛋白质的抗性基因)的亲本菠菜植物被称为非轮回(nonrecurrent)或供体亲本。该术语是指非轮回亲本在回交方案中使用一次并因此不再出现的事实。转移来自非轮回亲本的基因的亲本菠菜植物被称为轮回亲本，因为其被用于数轮回交方案中。在典型的回交方案中，将目的原始品种(轮回亲本)与携带待转移的单个目的基因的第二品系(非轮回亲本)杂交。然后将来自该杂交的所得后代再次与轮回亲本杂交，并重复该过程，直至获得菠菜植物，其中在转换植物中恢复了轮回亲本的除来自非轮回亲本的单个转移基因之外的基本上所有期望的形态和生理特征。本公开内容还涉及用于使用植物育种技术在菠菜植物育种计划中培育菠菜植物的方法，所述植物育种技术包括轮回选择、回交、谱系育种、限制性片段长度多态性增强选择和遗传标志物增强选择。
本公开内容的抗性基因或蛋白质也可以通过转基因技术引入植物中。植物转化涉及构建将在植物细胞中发挥作用的表达载体。这样的载体包含含有受调节元件(例如，启动子)控制或与其可操作地连接的基因的DNA。表达载体可包含一个或更多个这样的可操作地连接的基因/调节元件组合。载体可以是质粒的形式，并且可单独或与其他质粒组合使用以提供经转化的瓜(melon)植物。启动子可以是诱导型的、组成型的、组织特异性的或组织优选的。用于植物转化的方法包括生物方法和物理方法(参见，例如，Miki，et al.，″Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants″in Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology，Glick和Thompson Eds.，CRC Press，Inc.，BocaRaton，pp.67-88(1993))。另外，可获得用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达载体和体外培养方法(参见，例如，Gruber，et al.，″Vectors for Plant Transformation″inMethods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick和Thompson Eds.，CRCPress，Inc.，Boca Raton，pp.89-119(1993))。然后可将产生的转基因品系与另一种(未经转化的或经转化的)品系杂交，以产生新的转基因品系。或者，可使用在植物育种领域中公知的传统回交技术将使用前述转化技术已工程化到特定菠菜品种中的遗传性状转移到另一品系中。例如，回交方法可用于将工程化性状从公共、非优良近交系转变为优良近交系，或从其基因组中包含外来基因的近交系转变为不含该基因的近交系。
在一些实施方案中，可使用诱变、基因编辑技术或本领域已知的其他方法来修饰或突变内源抗性基因以获得本公开内容的植物。在一些实施方案中，基因编辑技术选自转录激活因子样效应核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)基因编辑技术、成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas9)基因编辑技术或锌指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFN)基因编辑技术。在一些实施方案中，使用包含选自以下的基因编辑组分的一种或更多种载体来引入突变：CRISPR/Cas9系统、TALEN、锌指和设计成靶向编码抗性基因的核酸序列的兆核酸酶(meganuclease)。
本公开内容的植物可通过如上所述的多种方法鉴定。基因表达水平可例如通过分析本公开内容的编码序列(例如SEQ ID NO：3)产生的转录水平(例如，通过RT-PCR)来测试。另一种选择是例如通过使用抗体来量化抗性蛋白水平(例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的抗性蛋白)。技术人员还可使用通常的病原体测试来查看霜霉病抗性是否是广谱霜霉病抗性。这些方法是本领域技术人员已知的，并且可用于鉴定本公开内容的植物。然后将具有期望抗性基因或蛋白质的植物繁殖、回交或与其他育种系杂交，以仅将期望的新基因转移到所需作物的背景中。
实施例
提供以下实施例以进一步举例说明本公开内容的一些方面。这些实施例是非限制性的并且不应被解释为限制本公开内容的任何方面。
实施例1：遗传作图以鉴定新的候选显性抗性基因
通过对菠菜(S.oleracea)中的粉霜霉抗性基因进行基因作图获得新的候选显性抗性基因。使用集团分离分析(Bulked segregant analysis，BSA)方法对抗性基因进行作图。将多个抗性家族(来源于F3代)的RNA合并且与易感家族的RNA库进行比较。所有F3家族都来源于相同的F2植物。在观察到SNP数量增加的区域开发标志物。使用F2群验证标志物。一旦目的区域(region of interest，ROI)可被鉴定并且侧面有标志物，便开始精细的作图方法。
实施例2：菠菜中T70基因的病毒诱导基因沉默(Virus Induced Gene Silencing，VIGS)
为了证明T70基因与粉霜霉抗性相关，使用基于烟草脆裂病毒(tobacco rattlevirus，TRV)的病毒诱导基因沉默(VIGS)使推定的抗性基因(T70)沉默。这样做是为了观察含有T70抗性基因的抗性菠菜品系的VIGS沉默是否会诱导对粉霜霉(P.farinosa)感染的易感性。
VIGS构建体的构建和VIGS构建体至菠菜的转化
使用TRV来源VIGS载体研究基因功能是公知的，并且VIGS载体已被用于研究多种植物物种的基因功能，所述植物物种包括拟南芥(Arabidopsis thaliana)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)和番茄(Lycopersicon esculentum)(参见，例如，Huang C，QianY，Li Z，Zhou X.：Virus-induced gene silencing and its application in plantfunctional genomics.Sci China Life Sci.2012；55(2)：99-108)。为了确认T70基因是否与观察到的抗性表型有关，使用VIGS沉默来沉默抗性来源菠菜中的T70。为此，制作了靶向T70的VIGS构建体，并将该构建体克隆到K20载体中。制作了另一种靶向不同的基因(RFP)的VIGS构建体用作阴性对照。表1提供了在各基因的VIGS构建体中使用的序列。使用与根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101的共培养将构建体转化到菠菜中，并用于研究T70的功能。
表1.用于产生VIGS构建体的靶序列
VIGS沉默测定和结果
简而言之，使用VIGS对含有T70基因的菠菜品系进行T70的沉默。用T70沉默构建体(如上所述产生)瞬时转化抗性菠菜植物。然后，植物感染了已知在菠菜中引起霜霉病的粉霜霉小种Pfs14。发现T70沉默的植物对粉霜霉小种Pfs14易感。这些结果表明沉默T70足以使先前具有抗性的植物易感，并证明T70与霜霉病抗性相关。
实施例3：qPCR检测感染有粉霜霉的菠菜中粉霜霉肌动蛋白的表达
进行qPCR实验是为了获得关于含有T70基因的抗性菠菜植物对粉霜霉感染的应答的更深刻的见解。从在VIGS实验中(在实施例3中所述)已经感染有粉霜霉的抗性菠菜植物、经T70沉默的植物和经RFP沉默的植物收获叶。从这些受感染的叶中分离出RNA，并从RNA合成cDNA。使用表2中示出的引物(SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22)通过qPCR分析粉霜霉肌动蛋白的表达。
表2.用于确定受感染菠菜组织中粉霜霉和菠菜基因表达的qPCR引物
图1示出了使用设计成用于检测粉霜霉肌动蛋白基因(Pfs肌动蛋白；管家基因)的引物的qPCR结果。进行了三个技术重复，并通过计算相对数量(RQ＝1/(2^Ct靶))和归一化表达(NE＝RQ靶/RQref)来分析相对Pfs肌动蛋白表达。将靶基因的相对数量用菠菜延伸因子基因(菠菜中的管家基因)的表达归一化。y轴上的值是相对Pfs肌动蛋白表达。在x轴上从左到右：从未使用VIGS沉默构建体的植物的叶中获得的样品、从使用RFP VIGS构建体的植物的叶中获得的样品(阴性对照)和从使用T70VIGS构建体的植物的叶中获得的样品。来自没有VIGS沉默构建体的植物的样品和来自使用了RFP VIGS构建体的植物的样品均具有抗性表型。这些样品都表达T70基因。如图1中示出的qPCR结果所示，使用qPCR在这些样品中检测不到Pfs肌动蛋白，并且因此不存在粉霜霉。相比之下，在从经T70沉默的植物获得的样品中测量出Pfs肌动蛋白的高转录水平。因此，存在粉霜霉，这与在经T70沉默的植物中观察到的易感表型相关。
实施例4：霜霉病叶盘(leaf disc)感染测定
在包括对照菠菜品系Viroflay、Resistoflay、Califlay、Clermont、Campania、Boeing和Lazio的测试中，测试了含有T70基因的菠菜植物对霜霉病病原体粉霜霉的不同小种的抗性。这些对照品系中的每一个都对不同的Pfs小种具有已知的抗性和易感性。用于测试的植物至少处于第二叶期，并且尚未开花。
使用叶盘测试来测试抗性。将不同菠菜植物的叶放入带有湿润纸板的托盘中。为了获得用于感染测试叶的粉霜霉，将已经感染有粉霜霉的幼苗悬浮在20mL水中，用粗棉布(cheesecloth)过滤，并将流通物收集在喷雾瓶中。用该粉霜霉悬浮液喷雾接种托盘。对于喷雾接种，喷洒叶以使其完全被接种物覆盖，并通过确保所有盘都是湿的来检查这种完全覆盖。将托盘用玻璃板覆盖并储存在15℃的气候室中(12小时光照：12小时黑暗循环)。在接种之后7至14天，通过肉眼对叶进行粉霜霉(Pfs)的存在的表型评分。
根据叶盘上侧(近轴侧)或下侧(远轴侧)上的孢子形成症状对叶进行评分。孢子形成的程度由孢子形成的量而不是盘的变色来限定。表3提供了对用于感染测定的疾病评分量表的详细描述。
表3.叶盘感染测定评分量表
感染测定是通过包括对不同Pfs小种(Viroflay＝V、Resistoflay＝R、Califlay、Clermont、Campania、Boeing和Lazio)具有已知易感性和抗性的对照菠菜品系以及含有T70基因的菠菜(T70)进行验证。
表4示出了叶盘感染测定结果的概述。对上述菠菜品种的粉霜霉小种Pfs1至Pfs17的分离物进行了测定。结果表明，含有T70抗性基因的菠菜至少对粉霜霉小种Pfs1至Pfs4以及Pfs7至Pfs17具有抗性。对于Pfs6抗性尚未确定(not determined，ND)，但预计菠菜植物也将对Pfs6具有抗性。含有T70抗性基因的菠菜对Pfs5易感。对照品系显示为每个都对多个Pfs小种易感。只有T70菠菜对最近鉴定的Pfs17具有抗性。
表4.叶盘感染测定的结果
实施例5：Pfs抗性基因编码序列和蛋白质序列的比对
使用多重比对软件确定新的抗性基因编码序列(表5)和新的抗性蛋白(表6)的相似性。表5中示出了使用T10(SEQ ID NO：1)、T70(SEQ ID NO：3)、T71(SEQ ID NO：5)、T72(SEQ ID NO：7)、T75(SEQ ID NO：9)、T76(SEQ ID NO：11)、T83(SEQ ID NO：13)、T89(SEQ IDNO：15)、T96(SEQ ID NO：23)和T253(SEQ ID NO：25)的编码序列生成的结果。表6中示出了使用T10(SEQ ID NO：2)、T70(SEQ ID NO：4)、T71(SEQ ID NO：6)、T72(SEQ ID NO：8)、T75(SEQ ID NO：10)、T76(SEQ ID NO：12)、T83(SEQ ID NO：14)、T89(SEQ ID NO：16)和T96(SEQID NO：24)和T253(SEQ ID NO：26)的蛋白质序列生成的结果。此外，对于核苷酸和蛋白质序列二者，T18(分别为SEQ ID No.27、SEQ ID No.28)、T133(分别为SEQ ID No.29、SEQ IDNo.30)、T139(分别为SEQ ID No.31、SEQ ID No.32)、T170(分别为SEQ ID No.33、SEQ IDNo.34)和T175(分别为SEQ ID No.35、SEQ ID No.36)也具有约90％或更高量的序列的高序列同源性。所有抗性基因在核苷酸和氨基酸水平上都高度相似。在氨基酸水平上，T70与T10、T75、T76和T83具有较低的相似性(＜94％同一性)，但与T71、T72和T89高度相似(＞97％同一性)。
表5.新的抗性基因编码序列的百分比同一性矩阵
| T10 | T70 | T71 | T72 | T75 | T76 | T83 | T89 | T96 | T253 | |
| T10 | 100.00 | 95.47 | 95.44 | 95.63 | 95.49 | 94.27 | 95.13 | 95.44 | 94.91 | 94.93 |
| T70 | 95.47 | 100.00 | 99.57 | 98.51 | 95.72 | 94.74 | 96.53 | 99.91 | 95.64 | 95.59 |
| T71 | 95.44 | 99.57 | 100.00 | 98.94 | 95.92 | 94.48 | 96.10 | 99.66 | 95.21 | 95.22 |
| T72 | 95.63 | 98.51 | 98.94 | 100.00 | 96.59 | 94.33 | 96.88 | 98.59 | 96.11 | 96.24 |
| T75 | 95.49 | 95.72 | 95.92 | 96.59 | 100.00 | 95.09 | 96.39 | 95.75 | 94,77 | 94,79 |
| T76 | 94.27 | 94.74 | 94.48 | 94.33 | 95.09 | 100.00 | 96.82 | 94.65 | 96,67 | 96,62 |
| T83 | 95.13 | 96.53 | 96.10 | 96.88 | 96.39 | 96.82 | 100.00 | 96.44 | 99.94 | 99.97 |
| T89 | 95.44 | 99.91 | 99.66 | 98.59 | 95.75 | 94.65 | 96.44 | 100.00 | 95.55 | 95.50 |
| T96 | 94.91 | 95.64 | 95.21 | 96.11 | 94.77 | 96,67 | 99.94 | 95.55 | 100.00 | 99.91 |
| T253 | 94.93 | 95.59 | 95.22 | 96.24 | 94.79 | 96,62 | 99.97 | 95.50 | 99.91 | 100.00 |
表6.新的抗性蛋白氨基酸序列的百分比同一性矩阵
| T10 | T70 | T71 | T72 | T75 | T76 | T83 | T89 | T96 | T253 | |
| T10 | 100.00 | 92.11 | 91.85 | 92.26 | 92.62 | 90.09 | 91.30 | 91.93 | 90.57 | 90.92 |
| T70 | 92.11 | 100.00 | 99.48 | 97.50 | 93.23 | 91.41 | 93.84 | 99.83 | 92.44 | 92.79 |
| T71 | 91.85 | 99.48 | 100.00 | 98.02 | 93.32 | 91.23 | 93.32 | 99.66 | 91.92 | 92.27 |
| T72 | 92.26 | 97.50 | 98.02 | 100.00 | 94.36 | 90.97 | 94.75 | 97.67 | 93.45 | 94.03 |
| T75 | 92.62 | 93.23 | 93.32 | 94.36 | 100.00 | 92.36 | 94.01 | 93.23 | 91,67 | 92,0I |
| T76 | 90.09 | 91.41 | 91.23 | 90.97 | 92.36 | 100.00 | 94.79 | 91.23 | 94,19 | 94,55 |
| T83 | 91.30 | 93.84 | 93.32 | 94.75 | 94.01 | 94.79 | 100.00 | 93.66 | 99.48 | 100.00 |
| T89 | 91.93 | 99.83 | 99.66 | 97.67 | 93.23 | 91.23 | 93.66 | 100.00 | 92.27 | 92.62 |
| T96 | 90.57 | 92.44 | 91.92 | 93.45 | 91.67 | 94,19 | 99.48 | 92.27 | 100.00 | 99.48 |
| T253 | 90.92 | 92.79 | 92.27 | 94.03 | 92,01 | 94,55 | 100.00 | 92.62 | 99.48 | 100.00 |
保藏信息
菠菜(Spinacia oleracea 2017.02544-B/SNNLENBL 19011503)的保藏由EnzaZaden USA，Inc.保存，其地址为7Harris Place，Salinas，California 93901，UnitedStates。在本申请未决期间，专利和商标专员根据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122确定有权获得该保藏的人员可得到该保藏。在允许本申请中的任何权利要求后，通过向国家工业、食品和海洋微生物保藏中心(National Collection of Industrial，Food and MarineBacteria Ltd.，NCIMB Ltd)，Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen，AB21 9YA，United Kingdom提供至少2,500粒相同品种种子的保藏，将不可撤销地取消对该品种向公众提供的所有限制。
根据布达佩斯条约，于2019年2月21日将至少2500粒菠菜种子(Spinaciaoleracea 2017.02544-B/SNNLENBL 19011503)保藏在国家工业、食品和海洋微生物保藏中心(NCIMB Ltd)，Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen，AB219YA，United Kingdom。该保藏已分配了NCIMB编号43360。在本申请未决期间，专利和商标专员根据37 C.ER.§1.14和35 U.S.C.§122确定有权获得该保藏的人员可得到该保藏。在允许本申请中的任何权利要求后，将不可撤销地取消对该品种向公众提供的所有限制。
保藏将在NCIMB保藏机构(公共保藏机构)保存至少30年的时间，或在最近一次请求保藏样品之后至少5年，或专利的有效期限，以较长者为准，并且如果在此期间保藏变得不再存活则将被替换。
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Claims (14)
1.用于产生对由粉霜霉(Peronospora farinosa，Pfs)引起的霜霉病具有抗性的菠菜植物的方法，其中使所述菠菜植物包含抗性基因，其中所述抗性基因编码由SEQ ID No.4的序列组成的蛋白质，其中所述蛋白质包含保守氨基酸序列KDHKIEKE和保守氨基酸序列LSNNRNLKIL。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗性基因包含SEQ ID No.3的编码序列。
3.用于产生对由粉霜霉(Pfs)引起的霜霉病具有抗性的菠菜植物的方法，其中使所述菠菜植物包含抗性基因，所述抗性基因包含SEQ ID No.3的编码序列，其中所述抗性基因编码由SEQ ID No.4的序列组成的蛋白质。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述植物至少对粉霜霉小种Pfs1至Pfs4以及Pfs7至Pfs17具有抗性。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述抗性基因来源于保藏号NCIMB43360。
6.一种提供从根据权利要求1至5中任一项所述的菠菜植物获得的种子的方法，所述种子包含抗性基因，其中所述抗性基因编码由SEQ ID No.4的序列组成的蛋白质，其中所述蛋白质包含保守氨基酸序列KDHKIEKE和保守氨基酸序列LSNNRNLKIL。
7.在菠菜植物中赋予对霜霉病之抗性的抗性基因，其中所述基因编码SEQ ID No.4的蛋白质，其中所述蛋白质包含保守氨基酸序列KDHKIEKE和保守氨基酸序列LSNNRNLKIL。
8.根据权利要求7所述的抗性基因，其中所述基因包含SEQ ID No.3的编码序列。
9.根据权利要求7或8所述的抗性基因，其中所述基因在菠菜中提供对粉霜霉小种Pfs1至Pfs4以及Pfs7至Pfs17的抗性。
10.用于提供对霜霉病具有抗性的菠菜植物的方法，其中所述方法包括将抗性基因引入菠菜植物的基因组中的步骤，其中所述抗性基因包含SEQ ID No.3，其中所述抗性基因编码由SEQ ID No.4的序列组成的蛋白质，以及其中所述蛋白质包含保守氨基酸序列KDHKIEKE和保守氨基酸序列LSNNRNLKIL。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗性基因的引入是通过基因组编辑技术、CRISPR Cas或诱变技术实现的。
12.用于提供对霜霉病具有抗性的菠菜植物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)提供包含抗性基因的菠菜植物，其中所述抗性基因根据权利要求7或8所述，
b)将步骤a)所述的菠菜植物与易感菠菜植物杂交，
c)任选地，将步骤b)中获得的植物自交至少一次，
d)选择对霜霉病具有抗性的植物。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述菠菜植物对由粉霜霉小种Pfs1至Pfs4以及Pfs7至Pfs17引起的霜霉病具有抗性。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述抗性基因是从保藏号NCIMB 43360获得的。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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