CN115209725A - 菠菜的霜霉病抗性 - Google Patents

Abstract

本发明涉及命名为α‑WOLF 24的等位基因，其赋予对至少一种粉霜霉菠菜专化型小种的抗性，其中由所述等位基因编码的蛋白质是CC‑NBS‑LRR蛋白，其在其氨基酸序列中包含：a)在其N‑末端处的基序“MAEIGYSVC”；b)基序“KWMCLR”；并且其中所述蛋白的LRR结构域按照增加的优先顺序与SEQ ID NO:10具有至少95％、96％、97％、98％、98.2％、98.5％、98.8％、99％、100％的序列相似性。所述等位基因在存在于菠菜植物中时，赋予至少对粉霜霉菠菜专化型小种Pfs:1、Pfs:2、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:9、Pfs:11、Pfs:13、Pfs:15和Pfs:17的完全抗性，并且不赋予对霜霉病小种Pfs:16的抗性。

Description

菠菜的霜霉病抗性

技术领域

本发明涉及能够赋予菠菜植物对一个或多个粉霜霉菠菜专化型小种(Peronospora farinosa f.sp.Spinaciae races)的抗性的基因。本发明还涉及菠菜植物、所述菠菜植物的繁殖材料、所述菠菜植物的细胞以及携带该基因的所述菠菜植物的种子。本发明还涉及产生携带该基因的菠菜植物的方法，以及该基因在育种中赋予对粉霜霉菠菜专化型的抗性的用途。

技术背景

粉霜霉菠菜专化型(Peronospora farinosa f.sp.Spinaciae)是菠菜种植者的主要威胁，因为其直接影响收获的叶子。在菠菜中，霜霉病由卵菌纲粉霜霉菠菜专化型(以前称为散展霜霉(P.effusa))引起。感染使得叶子不适合销售和消费，因为其在表型上表现为老叶上的黄色损伤，并且在叶背面上可以观察到灰白色真菌生长。这种感染可以迅速传播，并且在温室栽培和土壤栽培中都可能发生。粉霜霉菠菜专化型孢子的形成和萌发的最适温度为9至12℃，高相对湿度有利于孢子的形成和萌发。当孢子落在潮湿的叶子表面时，它们能够很容易萌发并感染叶子。真菌生长的最佳温度为8至20℃，相对湿度≥80％，感染后6至13天内可观察到菌丝生长。粉霜霉的卵孢子可以在土壤中存活长达3年，或者作为菌丝体存在于种子或活体植物中。

到目前为止，已经正式鉴定和表征了17个菠菜霜霉病(Pfs)的致病小种，并且在田间观察到许多新的候选者。这17个正式认可的粉霜霉菠菜专化型小种被命名为Pfs:1至Pfs:17(Irish等人Phtypathol.第98卷第894-900页、2008；Plantum NL(荷兰种子和幼苗育种、组织培养、生产和贸易协会)新闻稿，“Benoeming van Pfs:14,een nieuwe fysio vanvalse meeldauw in spinazie”，2012年9月19日；Report Jim Correl(Univ.Arkansas)和Steven Koike(UC Cooperative Extension,Monterey County),“Race Pfs:14–Anothernew race of the spinach downy mildew pathogen”，2012年9月18日；Plantum NL新闻稿，“Denomination of Pfs:15,a new race of downy mildew in spinach”，2014年9月2日；Plantum Nl新闻稿，“Denomination of Pfs:16,a new race of downy mildew inspinach”，2016年3月15日；Plantum Nl新闻稿，“Denomination of Pfs:17,a new race ofdowny mildew in spinach”，2018年4月16日)。在1990年与2014年期间鉴定了4号至16号小种，而仅在最近才鉴定了两个新的霜霉属分离株，命名为UA201519B和US1602，它们随后被霜霉菌国际工作组(International Working Group on Peronospora，IWGP)正式命名为Pfs:16和Pfs:17(Plantum NL(荷兰种子和幼苗育种、组织培养、生产和贸易协会)新闻稿，“Denomination of Pfs:16,a new race of downy mildew in spinach”,2016年3月15日；Plantum Nl新闻稿，“Denomination of Pfs:17,a new race of downy mildew inspinach”，2018年4月16日。所有17个正式认可的Pfs小种可从University of Arkansas,Fayetteville,AR 72701,USA的植物病理学系公开获得，也可从NAK Tuinbouw,Sotaweg22,2371 GD Roelofarendsveen,the Netherlands获得。

特别是最近鉴定的霜霉属小种可以破坏目前在世界范围内商业使用的许多菠菜品种的抗性，因此它们对菠菜产业的生产力构成严重威胁。因此，保持在该领域发展的前沿是至关重要的，因为霜霉属不断发展破坏商业菠菜品种中存在的抗性的能力。因此，抗霜霉病的新抗性基因是非常有价值的资产，它们在育种中，特别是在菠菜和莴苣育种中形成重要的研究焦点。菠菜育种者的主要目标之一是在这些小种广泛传播并对产业构成威胁之前，快速开发对尽可能多的霜霉属小种(包括最近鉴定的小种)具有抗性的菠菜品种。

在商业菠菜品种中，对霜霉病的抗性通常是由所谓的R基因引起的。R基因介导的抗性基于植物识别入侵病原体的能力。在许多情况下，这种识别发生在病原体建立了相互作用的第一阶段并将所谓的致病性(或无毒性)因子转移到植物细胞中之后。这些致病因子与宿主组分相互作用，以建立有利于病原体侵入宿主从而引起疾病的条件。当植物能够识别由致病因子触发的事件时，可以启动抗性反应。在许多不同的植物病原体相互作用系统(诸如菠菜与不同霜霉病菌株的相互作用)中，植物仅在特异性识别入侵病原体后才引发这些事件。

植物和病原体的共同进化导致了一场军备竞赛，其中R基因介导的抗性有时被克服，这是由于病原体能够以不同的方式与替代宿主靶标或相同靶标相互作用并对其进行修饰，从而导致识别丧失，并且可以成功地建立感染从而导致疾病。为了在植物中重建抗性，必须引入新的R基因，该基因能够识别替代的致病因子的作用模式。

尽管R基因的持久性相对较低，但菠菜中的R基因仍然是抵御霜霉病的主要形式。这主要是因为其是唯一能给予绝对抗性的防御形式。到目前为止，植物育种者已经非常成功地通过利用存在于作物物种的野生种质中的抗性基因来产生抗霜霉病的菠菜品种。尽管R基因在菠菜育种中被广泛使用，但直到现在对这些R基因的了解还不多。

直到最近，人们才发现菠菜中正式认可的R基因实际上是两个紧密连锁的基因α-WOLF基因和β-WOLF基因的所有不同等位基因。这也是R基因，或更好的R等位基因首次在分子水平上得到表征，即确定它们的核苷酸和氨基酸序列。虽然这为育种者提供了提高检测和选择R-等位基因的效率的工具，但对新出现的霜霉病小种的充分反应对于开发商业上成功的菠菜品种仍然至关重要。因此，本发明的目的是提供赋予针对新出现的霜霉病分离株的抗性的新抗性等位基因，以及提供用于鉴定该新抗性等位基因的分子生物学工具。

发明内容

在导致本发明的研究中，发现了WO2018059651中描述的α-WOLF基因的新等位基因变体。α-WOLF基因编码属于CC-NBS-LRR家族(卷曲螺旋-核苷酸结合位点-富含亮氨酸的重复序列)的蛋白质。根据菠菜植物中存在的等位基因变体(或多个等位基因变体),所述植物将产生WOLF蛋白的变体，该变体赋予针对Peronospora farinosa f.sp.spinaciae的致病小种的一定抗性谱。

在本发明的上下文中，术语“等位基因”或“等位基因变体”用于表示与特定表型(即抗性谱)关联的基因版本。人们发现，菠菜植物可能携带一个或两个WOLF基因。这两个WOLF基因中的每一个都包括多个等位基因，每个等位基因赋予特定的抗性谱。在本发明的上下文中，等位基因或等位基因变体是核酸。

βWOLF基因位于scaffold12735(序列:GenBank:Kq143339.1)的位置213573-221884处。在菠菜植物也携带或仅携带α-WOLF基因的情况下，α-WOLF基因位于与β-WOLF基因在Viroflay基因组装配中在scaffold12735上所处的位置大致相同的位置。

新发现的α-WOLF等位基因至少提供了对霜霉病小种Pfs:7的抗性。

具体实施方式

对粉霜霉菠菜专化型的所有已知的致病小种敏感的菠菜品种Viroflay的基因组组装可公开获得(菠菜栽培品种SynViroflay，全基因组鸟枪法测序项目；Bioproject:PRJNA41497；GenBank:AYZV00000000.2；BioSample:SAMN02182572，另见Dohm等人，2014,Nature 505:546-549)。在Viroflay的该病毒基因组装配中，β-WOLF基因位于scaffold12735(序列：GenBank:Kq143339.1)的位置213573-221884处。该区间覆盖的序列包含Viroflay的β-WOLF基因的完整基因组序列，加上该基因上游2000个碱基对的序列，加上该基因下游的序列，直至位于WOLF基因下游的相邻基因的基因座。菠菜品种Viroflay只拥有单个WOLF基因，即β-WOLF基因，但大多数其它菠菜品系在基因组的相同位置上都含有单个α-型WOLF基因。其它菠菜品系在基因组的大致相同位置含有两个WOLF基因。在此类情况下，两个WOLF基因彼此相邻。在大多数含有两个WOLF基因的菠菜品系中，所述WOLF基因之一属于α型，另一个WOLF基因属于β型。据观察，WOLF基因座中的这种等位基因变异是对粉霜霉菠菜专化型的致病小种的抗性差异的原因。

α-WOLF基因的等位基因与β-WOLF基因的等位基因之间的差异在于编码的蛋白质序列中存在特定的保守氨基酸基序。如上所述，所有的WOLF蛋白从N-末端至C-末端都具有本领域公知的下列结构域：卷曲螺旋结构域(RX-CC-样，cd14798)、NBS结构域(也称为“NB-ARC结构域”，pfam00931；van der Biezen&Jones,1998,Curr.Biol.8:R226-R228)以及包含LRR结构域的富含亮氨酸的重复序列(IPR032675)。另外，所有的WOLF蛋白在其氨基酸序列中包含N末端处的基序“MAEIGYSVC”(SEQ ID NO:1)。除此之外，所有的α-WOLF蛋白都在其氨基酸序列中包含基序“KWMCLR”(SEQ ID NO:2),而所有β-WOLF蛋白在其氨基酸序列中都包含基序HVGCVVDR”(SEQ ID NO:3)。

本发明涉及命名为α-WOLF 24的α-WOLF基因的新的赋予粉霜霉菠菜专化型抗性的等位基因。

具体而言，本发明涉及命名为α-WOLF 24的赋予粉霜霉菠菜专化型抗性的等位基因，其中由所述等位基因编码的蛋白质是CC-NBS-LRR蛋白质，其在其氨基酸序列中包含:a)在其N-末端处的基序“MAEIGYSVC”；和b)基序“KWMCLR”；并且其中所述蛋白质的LRR结构域按照增加的优选顺序与SEQ ID NO:10具有至少95％、96％、97％、98％、98.2％、98.5％、98.8％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、100％的序列相似性。此外，α-WOLF 24等位基因在其氨基酸序列中包含额外的基序，即“DQEDEGEDN”。

本发明还涉及命名为α-WOLF 24的赋予粉霜霉菠菜专化型抗性的等位基因，其中由所述等位基因编码的蛋白质是CC-NBS-LRR蛋白质，其在其氨基酸序列中包含：a)在其N-末端处的基序“MAEIGYSVC”；和b)基序“KWMCLR”；并且其中所述蛋白质的LRR结构域按照增加的优先顺序与SEQ ID NO:10具有至少93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.2％、98.5％、98.8％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、100％的序列同一性。另外，α-WOLF 24等位基因在其氨基酸序列中包含额外的基序，即“DQEDEGEDN”

本发明还涉及具有LRR结构域的α-WOLF 24等位基因，所述等位基因的基因组序列按照增加的优选顺序与SEQ ID NO:9具有至少93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％的序列相似性。

本发明还涉及具有LRR结构域的α-WOLF 24等位基因，其基因组序列按照增加的优选顺序与SEQ ID NO:9具有至少95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性。

为了本发明的目的，α-WOLF 24等位基因的蛋白质的LRR结构域被定义为按照增加的优选顺序与SEQ ID NO:10具有至少95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.2％、98.5％、99.8％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、100％的序列相似性的氨基酸序列。

为了本发明的目的，α-WOLF 24等位基因的蛋白质的LRR结构域被定义为按照增加的优选顺序与SEQ ID NO:10具有至少95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.2％、98.5％、99.8％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、100％的序列同一性的氨基酸序列。

技术人员熟悉计算序列相似性和序列同一性的方法。使用EMBOSS stretcher6.6.0(www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_stretcher)，利用EBLOSUM62矩阵(其中设置缺口开放(Gap open)为12，缺口延伸(Gap extend)为2)计算氨基酸序列的序列相似性。在DNA的情况下，使用DNA全矩阵(其中设置缺口开放为16，缺口延伸为4)计算序列相似性.

可以通过使用特异性引物扩增编码LRR结构域的氨基酸序列的基因组DNA并对其进行测序，随后将DNA序列翻译成氨基酸序列，从而应用常识选择正确的阅读框来确定本文定义的α-WOLF 24等位基因的LRR结构域。技术人员能够使用免费的在线生物信息学工具，诸如可以在此处:http://web.expasy.org/translate/找到的生物信息学工具做到这一点。

α-WOLF基因诸如α-WOLF 24的LRR结构域的基因组序列可以使用具有正向引物和反向引物的引物对来扩增，所述正向引物是具有SEQ ID NO:4的序列的核酸分子，所述反向引物是具有SEQ ID NO:5的序列的核酸分子。

本发明还涉及赋予对至少一种粉霜霉菠菜专化型小种的抗性的核酸分子,其中由所述核酸分子编码的蛋白质是CC-NBS-LRR蛋白质，其在其氨基酸序列中包含：a)在其N-末端处的基序“MAEIGYSVC”；和b)基序“KWMCLR”；并且其中所述蛋白质的LRR结构域按照增加的优选顺序与SEQ ID NO:10具有至少95％、96％、97％、98％、98.2％、98.5％、98.8％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、100％的序列相似性。任选地，该核酸分子是分离的核酸分子。

本发明还涉及赋予对至少一种粉霜霉菠菜专化型小种的抗性的核酸分子，其中由所述核酸分子编码的蛋白质是CC-NBS-LRR蛋白质，其在其氨基酸序列中包含：a)在其N-末端处的基序“MAEIGYSVC”；和b)基序“KWMCLR”；并且其中所述蛋白质的LRR结构域按照增加的优先顺序与SEQ ID NO:10具有至少93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.2％、98.5％、98.8％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、100％的序列同一性。任选地，该核酸分子是分离的核酸分子。

该等位基因显示出与其赋予的对霜霉小种Pfs:1、Pfs:2、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:9、Pfs:11、Pfs:13、Pfs:15和Pfs:17的抗性的显性遗传相一致的分离模式。该等位基因还显示了其赋予的对霜霉小种Pfs:8、Pfs:12和Pfs:14的抗性的显性遗传。此外，该等位基因还显示出其赋予的对霜霉小种Pfs:4的抗性的隐性遗传。

使用铂Taq酶(Thermo Fisher Scientific)，利用具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的引物扩增α-WOLF基因的LRR结构域编码区的PCR条件是:95℃下3分钟(初始变性步骤)；40个扩增循环，每个循环由以下组成：在95℃变性30秒，在60℃退火30秒，在72℃延伸30秒；在72℃进行2分钟(最终延伸步骤)。

β-WOLF基因的LRR结构域，例如存在于变种Viroflay中的无效等位基因，可以使用正向引物和反向引物进行扩增，所述正向引物是具有SEQ ID NO:6的核酸分子，所述反向引物是具有SEQ ID NO:5的核酸分子。

使用Platinum Taq酶(Thermo Fisher Scientific)，利用具有SEQ ID NO:5和SEQID NO:6的引物扩增β-WOLF基因的LRR结构域编码区的PCR条件如下：在95℃下3分钟(初始变性步骤)；40个扩增循环，每个循环由以下组成：在95℃变性30秒，在58℃退火50秒，在72℃延伸50秒；在72℃进行2分钟(最终延伸步骤)。

因此，本发明还涉及用于扩增α-WOLF基因的LRR结构域的引物对，更具体地说，用于扩增α-WOLF 24等位基因的LRR结构域的引物对，其中正向引物是具有SEQ ID NO:4的序列的核酸分子，所述反向引物是具有SEQ ID NO:5的序列的核酸分子。本文公开的引物已被专门设计用于选择性扩增WOLF基因的一部分，而不是任何其它CC-NBS-LRR蛋白编码基因的一部分。

本发明涉及α-WOLF 24等位基因，其具有按照增加的优先顺序与SEQ ID NO:11具有至少80％、81％、82％、83％、84％,85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.2％、98.5％、98.8％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、100％的序列相似性的编码序列。

本发明还涉及α-WOLF 24等位基因，其具有按照增加的优先顺序与SEQ ID NO:11具有至少80％、81％、82％、83％、84％,85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.2％、98.5％、98.8％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、100％的序列同一性的编码序列。

在本发明的又一方面，α-WOLF 24等位基因编码具有按照增加的优先顺序与SEQID NO:12具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％的序列相似性的氨基酸序列的蛋白质。

在本发明的又一方面，α-WOLF 24等位基因编码具有按照增加的优先顺序与SEQID NO:12具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。

α-WOLF 24等位基因在存在于菠菜植物中时赋予对17种正式认可的粉霜霉菠菜专化型小种中的至少一种的完全抗性。在又一实施方案中，α-WOLF 24等位基因在存在于菠菜植物中时，赋予对17种正式认可的粉霜霉菠菜专化型小种中的至少两种的完全抗性。在又一实施方案中，α-WOLF 24等位基因在存在于菠菜植物中时，赋予按照增加的优先顺序对至少三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种或十六种正式认可的粉霜霉菠菜专化型小种的完全抗性。α-WOLF 24等位基因不赋予对霜霉病小种Pfs:16的抗性。

α-WOLF 24等位基因在杂合地或纯合地存在于菠菜植物中时，赋予对至少正式认可的粉霜霉菠菜专化型小种Pfs:1、Pfs:2、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:9、Pfs:11、Pfs:13、Pfs:15和Pfs:17的完全抗性，并且不赋予对霜霉病小种Pfs:16的抗性(见表1)。αWOLF24等位基因在杂合地或纯合地存在于菠菜植物中时，也赋予至少对正式认可的粉霜霉菠菜专化型小种Pfs:8、Pfs:12和Pfs:14的完全抗性。此外，αWOLF24等位基因在纯合地存在于菠菜植物中时，赋予对粉霜霉菠菜专化型小种Pfs:4的完全抗性。

菠菜植物对粉霜霉菠菜专化型小种的一个或多个小种的抗性可以通过幼苗测试来确定。在本文中，幼苗测试被定义为这样的测定，其中菠菜植物被种植在含有生长培养基的盘中，在出苗后每周施肥两次。在植物的第一真叶期，用具有浓度约为2.5×10⁵/ml的待测试的粉霜霉菠菜专化型或分离株的致病小种之一的孢子囊悬浮液接种植物。每个小种测试30株植物。将接种的植物置于18℃的相对湿度为100％的露水室中24小时，然后移至18℃、12小时光周期的生长室中6天。6天后，将植物放回露水室24小时以诱导孢子形成，随后对疾病反应进行评分。

如本文中所用，当植物在本文所述的幼苗测试中没有表现出症状时，植物对粉霜霉菠菜专化型小种具有完全抗性。

如本文中所用，当植物在本文所述的幼苗测试中仅表现出萎黄病的症状或仅在子叶顶端出现孢子形成时，植物对粉霜霉菠菜专化型小种具有中等抗性。

如本文中所用，当植物在本文所述的幼苗测试中不仅仅表现出萎黄病的症状时，或者当孢子形成发生在大于子叶顶端的区域时，植物易受粉霜霉菠菜专化型小种的分离物影响。

本发明的另一方面涉及菠菜植物，其包含本发明的α-WOLF 24等位基因，其种子的代表性样品保藏在NCIMB，登录号为NCIMB43554。

在又一个实施方案中，包含α-WOLF 24等位基因的本发明的植物是农学上优良的菠菜植物。在本发明的上下文中，农学上优良的菠菜植物是具有导致可区分的和期望的农艺性状积累的基因型的植物，其允许生产者收获具有商业意义的产物，优选地，包含α-WOLF24等位基因的农学上优良的菠菜植物是近交系或杂交的植物。

如本文中所用，近交系的植物是作为三轮或更多轮自交或回交的结果的植物群体的植物；或者所述植物是双单倍体。近交系可以是例如用于生产商业杂交植物的亲本系。

如本文中所用，杂交植物是作为具有不同基因型的两种不同植物之间的杂交的结果的植物。更具体地，杂交植物是两种不同近交系的植物之间杂交的结果，这种杂交植物可以是例如F₁杂交品种的植物。

携带杂合形式的α-WOLF 24等位基因的植物还可包含β-WOLF0等位基因(例如存在于Viroflay变种中的)，其中β-WOLF 0等位基因不赋予对霜霉病的任何抗性。然而，α-WOLF24等位基因杂合的植物还可包含确实提供对霜霉病的抗性的α/β-WOLF基因的等位基因。优选地，这种等位基因将与α-WOLF 24等位基因互补，使得菠菜植物将至少对α-WOLF 24等位基因对其不提供抗性的一个或多个其它小种具有中度抗性。最优选地，α/β-WOLF基因的另一个等位基因与α-WOLF 24等位基因互补，使得植物对粉霜霉菠菜专化型小种Pfs:1至Pfs:17具有抗性。在一个实施方案中，这种植物是农学上优良的植物。

或者，携带α-WOLF 24等位基因的植物的抗性谱被完全不同基因的赋予抗性的等位基因所互补。此类基因的实例是例如US8,354,570中描述的DMR1、US9,121,029中描述的DMR6和US20170327839中描述的p10。

因此，本发明涉及携带α-WOLF 24等位基因的菠菜植物，其还包含导致对粉霜霉菠菜专化型小种Pfs:1至Pfs:17的抗性的遗传决定因子。所述遗传决定因子可以是另一种赋予抗性的α/β-WOLF等位基因或完全不同基因的赋予抗性的等位基因。

本发明还涉及包含α-WOLF 24等位基因的繁殖材料。在一个实施方案中，繁殖材料适用于有性繁殖。这种繁殖材料包括例如小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞。在另一个实施方案中，繁殖材料适用于营养繁殖。这种繁殖材料包括例如插条、根、茎、细胞、原生质体和可再生细胞的组织培养物。适于制备组织培养物的植物的部分特别地是叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根尖、花药、花、种子和茎。

本发明还涉及包含α-WOLF 24等位基因的菠菜植物细胞。这种细胞可呈分离的形式，或者可呈完整植物的一部分或其部分，其仍然构成本发明的细胞，因为这种细胞含有赋予对霜霉病的抗性的α-WOLF 24等位基因。本发明植物的每个细胞携带赋予对粉霜霉菠菜专化型的抗性的遗传信息。本发明的这种细胞也可以是可再生细胞，其可用于再生包含本发明等位基因的新植物。

本发明的另一方面涉及制备杂交菠菜种子的方法，其包括将第一亲本菠菜植物与第二亲本菠菜植物杂交，并收获所得杂交菠菜种子，其中所述第一和/或第二亲本菠菜植物包含α-WOLF 24等位基因。在一个特定的实施方案中，所述第一和/或第二亲本植物是本文定义的近交系植物。

本发明还涉及由通过将第一亲本菠菜植物与第二亲本菠菜植物杂交并收获所得杂交菠菜种子而产生的种子生长而来的杂交菠菜植物，其中所述第一和/或第二亲本菠菜植物包含α-WOLF 24等位基因。

确定菠菜植物基因组中WOLF基因的至少部分的基因组DNA或编码DNA序列可以使用本领域已知的任何合适的分子生物学方法来进行，所述方法包括但不限于(基因组)PCR扩增，随后是Sanger测序、全基因组测序、转录组测序、序列特异性靶标捕获，随后是下一代测序(使用例如整合DNA技术的

靶标捕获系统)、含LRR结构域的基因序列的特异性扩增(使用例如RenSeq方法，如美国专利申请14/62711和Jupe等人，2013,Plant J.530-544中描述的)，然后测序，等等。

在一个实施方案中，本发明涉及鉴定携带α-WOLF 24等位基因的植物的方法，其包括确定编码本文定义的LRR结构域的DNA序列。

在该方法的又一个实施方案中，通过使用引物对扩增LRR结构域的基因组DNA区域来确定α-WOLF 24等位基因的LRR结构域。正向引物优选是具有SEQ ID NO:4的序列的核酸分子，反向引物优选是具有SEQ ID NO:5的序列的核酸分子。

本发明的另一个方面涉及生产包含对粉霜霉菠菜专化型的抗性的菠菜植物的方法，其包括:(a)将包含α-WOLF 24等位基因的植物与另一植物杂交；(b)任选地进行一轮或多轮自交和/或杂交；(c)任选地在每轮自交或杂交后选择包含α-WOLF 24等位基因的植物。

选择包含α-WOLF 24等位基因的植物可以通过确定该等位基因的NBS-LRR结构域的基因组DNA序列的存在而在基因型分型上进行，所述基因组DNA序列按照增加的优先顺序与SEQ ID NO:9具有95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％的序列相似性，或与SEQ ID NO:9具有95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性。

在另一个实施方案中，选择包含α-WOLF 24等位基因的植物可以通过确定整个等位基因的编码序列的存在而在基因型分型上进行。

或者，α-WOLF 24等位基因的存在可以通过在疾病测试(例如本文所述的测试)中测定植物而在表型分型上进行测定。

本发明还涉及在育种中使用携带α-WOLF 24等位基因的菠菜植物以赋予对粉霜霉菠菜专化型的抗性。

本发明还涉及培育携带本发明的α-WOLF 24等位基因的菠菜植物的育种方法，其中使用包含所述等位基因的种质。能够生长成包含本发明等位基因的植物并代表该种质的种子保藏在NCIMB，登录号为NCIMB 43554。

另一方面，本发明涉及生产包含α-WOLF 24等位基因的菠菜植物的方法，所述方法包括：(a)将包含该等位基因的植物与另一植物杂交；(b)任选地在F1中选择包含所述等位基因的植物；(c)任选地将所得F1与优选的亲本回交，并在BC1F1中选择具有所述等位基因的植物；(d)任选地进行一轮或多轮额外的自交、杂交和/或回交，随后选择包含所述等位基因或显示对应于所述等位基因的抗性谱的植物。本发明还包括通过这种方法生产的菠菜植物。

本发明还涉及本发明菠菜植物的收获叶，涉及包含呈天然或加工形式的本发明菠菜植物的收获叶的食品。

菠菜叶以包装形式出售，包括但不限于预包装的菠菜叶或在含有所述叶的沙拉中加工的菠菜叶。例如在美国专利第5,523,136号中提到了这种包装，所述专利提供了包装膜和由这种包装膜制成的包装，包括含有叶产品的这种包装，以及制造和使用这种包装膜和包装的方法，所述包装适用于本发明的菠菜叶。因此，本发明包括本发明的菠菜植物叶的用途以及制造和使用其的方法，以及源自本发明的菠菜植物叶。

本发明还涉及容器，所述容器在家庭环境中的生长基质中包含一种或多种本发明的植物，或一种或多种源自本发明的植物的菠菜植物，用于收获植物的叶子。这样，当植物处于准备收获的状态时，消费者可以采摘非常新鲜的叶子用于沙拉。

本发明还涉及代表性种子保藏在NCIMB、登录号为NCIMB43554的菠菜植物在生产包含α-WOLF 24等位基因的菠菜植物中的用途。

在又一个实施方案中，所述菠菜植物是杂交菠菜植物、双单倍体菠菜植物或近交菠菜植物。

本发明的另一个方面是包含α-WOLF 24等位基因的细胞用于生产表现出对粉霜霉菠菜专化型的抗性的菠菜植物的用途。

本发明还涉及包含α-WOLF 24等位基因的组织培养物用于生产表现出对粉霜霉菠菜专化型的抗性的菠菜植物的用途。

在一个实施方案中，本发明涉及命名为αWOLF24的等位基因，当该等位基因杂合地或纯合地存在于菠菜植物中时，其赋予至少对粉霜霉菠菜专化型小种Pfs:1、Pfs:2、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:9、Pfs:11、Pfs:13、Pfs:15和Pfs:17的完全抗性，并且不赋予对霜霉病小种Pfs:16的抗性，其中由所述等位基因编码的蛋白质是CC-NBS-LRR蛋白，其在其氨基酸序列中包含：a)在其N末端处的基序“MAEIGYSVC”；和b)基序“KWMCLR”；并且其中所述蛋白的LRR结构域按照增加的优选顺序与SEQ ID NO:10具有至少98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性。

在另一个实施方案中，本发明涉及命名为αWOLF24的等位基因，当该等位基因杂合地或纯合地存在于菠菜植物中时，其赋予对至少粉霜霉菠菜专化型小种Pfs:1、Pfs:2、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:9、Pfs:11、Pfs:13、Pfs:15和Pfs:17的完全抗性，并且不赋予对霜霉病小种Pfs:16的抗性，其中由所述等位基因编码的蛋白质是CC-NBS-LRR蛋白，其在其氨基酸序列中包含：a)在其N末端处的基序“MAEIGYSVC”；和b)基序“KWMCLR”；并且其中所述蛋白的LRR结构域按照增加的优选顺序与SEQ ID NO:10具有至少98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性，并且其中LRR结构域的基因组DNA序列按照增加的优先顺序与SEQ ID NO:9具有至少99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性。

在又一个实施方案中，本发明涉及包含命名为αWOLF24的等位基因的菠菜植物，当该等位基因杂合地或纯合地存在于菠菜植物中时，其赋予至少对粉霜霉菠菜专化型小种Pfs:1、Pfs:2、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:9、Pfs:11、Pfs:13、Pfs:15和Pfs:17的完全抗性，并且不赋予对霜霉病小种Pfs:16的抗性，其中由所述等位基因编码的蛋白质是CC-NBS-LRR蛋白，其在其氨基酸序列中包含：a)在其N末端处的基序“MAEIGYSVC”；和b)基序“KWMCLR”；并且其中所述蛋白的LRR结构域按照增加的优选顺序与SEQ ID NO:10具有至少98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性。优选地，该菠菜植物是农学上优良的菠菜植物。

在又一个实施方案中，本发明涉及包含命名为αWOLF24的等位基因的菠菜植物，当该等位基因杂合地或纯合地存在于菠菜植物中时，其赋予对至少粉霜霉菠菜专化型小种Pfs:1、Pfs:2、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:9、Pfs:11、Pfs:13、Pfs:15和Pfs:17的完全抗性，并且不赋予对霜霉病小种Pfs:16的抗性，其中由所述等位基因编码的蛋白质是CC-NBS-LRR蛋白，其在其氨基酸序列中包含：a)在其N末端处的基序“MAEIGYSVC”；和b)基序“KWMCLR”；并且其中所述蛋白的LRR结构域按照增加的优选顺序与SEQ ID NO:10具有至少98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性，并且其中LRR结构域的基因组DNA序列按照增加的优先顺序与SEQ ID NO:9具有至少99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性。优选地，该菠菜植物是农学上优良的菠菜植物。

在一个实施方案中，本发明涉及农学上优良的杂交菠菜植物，其包含如本申请中所述的本发明的αWOLF24等位基因和α/β-WOLF基因的另一个赋予霜霉病抗性的等位基因，其中所述α/β-WOLF基因的另一个赋予霜霉病抗性的等位基因是β-WOLF 3，其具有按照增加的优先顺序与SEQ ID No:13具有至少95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的基因组序列，并且其中所述植物至少对粉霜霉菠菜专化型小种Pfs:1、Pfs:2、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:9、Pfs:11、Pfs:13、Pfs:15、Pfs:16和Pfs:17具有抗性。

本发明由以下编号的段落进一步描述：

1.一种农学上优良的菠菜植物，其包含等位基因，所述等位基因在存在于菠菜植物中时赋予对至少一种粉霜霉菠菜专化型小种的抗性，并且编码按照增加的优先顺序与包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的蛋白质具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性的蛋白质；其中所述蛋白质在其氨基酸序列中包含：a)SEQ ID NO:1，b)SEQ IDNO:2，并且其中所述蛋白质的LRR结构域按照增加的优先顺序与SEQ ID NO:10具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.2％、98.5％、98.8％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、100％的序列同一性。

2.段落1的农学上优良的菠菜植物，其中所述等位基因在杂合地或纯合地存在于菠菜植物中时编码如下蛋白质，所述蛋白质赋予至少对粉霜霉菠菜专化型小种Pfs:1、Pfs:2、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:9、Pfs:11、Pfs:13、Pfs:15和Pfs:17的完全抗性，并且不赋予对霜霉病小种Pfs:16的抗性。

3.一种农学上优良的菠菜植物，其包含等位基因，所述等位基因在杂合地或纯合地存在于菠菜植物中时编码如下蛋白质，所述蛋白质赋予至少对粉霜霉菠菜专化型小种Pfs:1,Pfs:2,Pfs:5,Pfs:6,Pfs:7,Pfs:9,Pfs:11,Pfs:13,Pfs:15和Pfs:17的完全抗性，并且不赋予对霜霉病生理小种Pfs:16的抗性，其中所述等位基因具有按照增加的优先顺序与SEQ ID NO:11具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.2％、98.5％、98.8％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、100％序列同一性的核苷酸序列。

4.段落1至3中任一项的农学上优良的菠菜植物，其能够生长成包含所述等位基因的植物的种子，其代表性样品被保藏在NCIMB，登录号为NCIMB 43554。

5.段落1至4中任一项的农学上优良的菠菜植物，其中所述农学上优良的菠菜是杂交品种的植物或近交系的植物。

6.一种能够发育成段落1至5中任一项的农学上优良的菠菜植物的繁殖材料，其中所述繁殖材料包括小孢子、花粉、子房、胚珠、胚、胚囊、卵细胞、插条、根尖、下胚轴、子叶、茎、叶、花、花药、种子、分生组织细胞、原生质体、细胞或其组织培养物。

7.段落1至5中任一项的农学上优良的菠菜植物的细胞。

8.一种生产F1杂交菠菜种子的方法，其包括将第一亲本菠菜植物与第二亲本菠菜植物杂交，并收获所得杂交菠菜种子，其中所述第一亲本菠菜植物和/或所述第二亲本菠菜植物是段落1至5中任一项的农学上优良的菠菜植物。

9.段落8的方法，其中所述第一和/或第二亲本是近交系植物。

10.一种由通过段落8或9的方法产生的种子生长而来的F1杂交菠菜植物，其中所述F1杂交植物携带等位基因，所述等位基因在存在于菠菜植物中时赋予对至少一种粉霜霉菠菜专化型小种的抗性，并且编码CC-NBS-LRR蛋白，所述蛋白按照增加的优先顺序与包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的蛋白质具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性；其中所述蛋白在其氨基酸序列中包含：(a)SEQ ID NO:1，(b)SEQ ID NO:2，并且其中所述蛋白的LRR结构域按照增加的优先顺序与SEQ ID NO:10具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.2％、98.5％、98.8％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、100％的序列同一性。

11.一种生产表现出对粉霜霉菠菜专化型的抗性的菠菜植株的方法，其包括：(a)将段落1至5中任一项的农学上优良的菠菜植物与另一菠菜植物杂交；(b)任选地进行一轮或多轮自交和/或杂交；(c)任选地在所述杂交或一轮或多轮自交和/或杂交后选择包含所述等位基因的植物。

12.段落11的方法，其中所述方法包括进行任选的选择，并且对包含表达所述蛋白质的等位基因的植物的选择包括根据包括以下步骤的任一步骤或多个步骤的方法确定所述等位基因的存在：确定植物中核苷酸序列的存在，其中所述序列按照增加的优选顺序与SEQ ID NO:11具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.2％、98.5％、98.8％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、100％的序列同一性，或者确定LRR结构域的存在，所述结构域按照增加的优选顺序与SEQ ID NO:9具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性。

13.段落11或12的方法，其中所述方法包括进行任选的一轮或多轮自交和/或杂交以及任选的选择，并且对包含表达所述蛋白质的等位基因的植物的选择包括根据包括以下步骤的任一步骤或多个步骤的方法确定所述等位基因的存在：确定植物中核苷酸序列的存在，其中所述序列按照增加的优先顺序与SEQ ID NO:11具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.2％、98.5％、98.8％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、100％的序列同一性，或者确定LRR结构域的存在，所述结构域按照增加的优先顺序与SEQ ID NO:9具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性。

14.一种生产F1杂交菠菜种子的方法，其包括将第一亲本菠菜植物与第二亲本菠菜植物杂交，并收获所得杂交菠菜种子，其中所述第一亲本菠菜植物和/或所述第二亲本菠菜植物是段落1至5中任一项的农学上优良的菠菜植物。

抗性信息

表1

由α-WOLF 24等位基因赋予的抗性谱。“-”表示对特定霜霉病小种的完全抗性；“(-)”表示对特定霜霉病小种的中等抗性；“-*”表示当等位基因纯合地存在时，其赋予对特定霜霉病小种的完全抗性，而当等位基因杂合地存在时，其不赋予对该霜霉病小种的抗性；“+”表示该等位基因不赋予抗性，并将导致仅携带α-WOLF 24等位基因的植物对该特定霜霉病小种完全易感；“nt”表示尚未针对该分离株进行测试。

保藏信息

在其基因组中纯合地包含本发明的α-WOLF 24等位基因的种子于2020年1月17日保藏于NCIMB Ltd,Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen AB219YA,UK，登录号为NCIMB 43554。保藏是根据布达佩斯条约的条款进行的。在授予专利后，对该保藏物的所有限制将被取消，并且该保藏将旨在满足37CFR§1.801-1.809的要求。保藏将在授予专利后不可撤销且无限制或无条件地向公众发放。保藏物将在保藏机构保存30年，或最后一次请求后5年，或专利的有效期限，以较长者为准，并在此期间如有必要将被替换。

序列信息

表2.序列信息

本发明将在下面的实施例中进行进一步阐明，所述实施例仅仅是为了说明的目的，并不打算以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1

测试菠菜植物对粉霜霉菠菜专化型的抗性

如Irish等人(2008；Phytopathol.98:894-900)中所述，使用鉴别组(differential set)测定对霜霉病感染的抗性。将本发明的菠菜植物与来自不同其它基因型的菠菜植物(见表3)一起播种在含有Scotts Redi-土壤培养基的托盘中，并在苗出现后用Osmocote Peter's(13-13-13)肥料(Scotts)每周施肥两次。第一真叶期用粉霜霉菠菜专化型的致病小种的孢子囊悬浮液(2.5×10⁵/ml)接种植物。以这种方式，测试了4个正式认可的致病小种。

将接种的植物置于18℃的相对湿度为100％的露水室中24小时，然后移至18℃的光周期为12小时的生长室中6天。6天后，将植物放回露水室24小时以诱导孢子形成，并对它们的疾病反应进行评分。

如Irish等人(2007；Plant Dis.91:1392-1396)所述，基于萎黄病的症状以及子叶和真叶上病原体孢子形成的迹象，将用于该特定测试的植物评分为抗性的、中等抗性的或易感的。在该特定测试中，未表现出萎黄病和孢子形成的证据的植物被认为是抗性的。抗性植物被重新接种以评估最初被评分为抗性的植物是否逃脱了感染，或者它们是否真正具有抗性。仅表现出萎黄病的症状或仅在子叶顶端出现孢子形成的植物被评分为中等抗性的。表现出超出这些霜霉病感染症状的植物被认为是易感的。

表1显示了携带α-WOLF 24等位基因的植物对这些致病小种中的每一种的抗性。表3显示了菠菜霜霉病小种的鉴别组和各种菠菜品种(杂种)对这些致病小种中的每一种的抗性。易感性反应评分为“+”(表示真菌成功感染，在整个子叶上有孢子形成)，抗性描述为“-”(子叶上无孢子形成)。弱抗性反应用“(-)”表示，这实际上意味着感染水平略有降低(其中在鉴别幼苗测试中，仅出现萎黄病的症状或仅在子叶顶端孢子形成)。

表3：

实施例2

LRR结构域编码区的扩增

使用正向引物ACAAGTGGATGTGTCTTAGG(SEQ ID NO:4)和反向引物TTCGCCCTCATCTTCCTGG(SEQ ID NO:5)，将包含α-WOLF 24等位基因的菠菜植物(其种子的代表性样品保藏在NCIMB，登录号为NCIMB 43554)的分离的基因组DNA用于聚合酶链式反应(PCR)。引物对扩增α-WOLF基因的LRR结构域编码区，并被设计用于选择性扩增WOLF基因的一部分，而不扩增其它CC-NBS-LRR蛋白编码基因的一部分。

使用Platinum Taq酶(Thermo Fisher Scientific)，利用具有SEQ ID NO:4和SEQID NO:5的引物扩增α-WOLF基因的LRR结构域编码区的PCR条件如下:

-在95℃下进行3分钟(初始变性步骤)，

-40个扩增循环，每个循环由以下组成：在95℃下变性30秒，在60℃下退火30秒，以及在72℃下进行30秒延伸，

-在72℃下进行2分钟(最终的延伸步骤)。

使用正向引物TCACGTGGGTTGTGTTGT(SEQ ID NO:6)和反向引物TTCGCCCTCATCTTCCTGG(SEQ ID NO:5)，将包含β-WOLF 0等位基因的品种Viroflay的菠菜植物的分离的基因组DNA用于聚合酶链式反应(PCR)。该引物对扩增β-WOLF基因的LRR结构域编码区，并且被设计成选择性扩增WOLF基因的一部分，而不扩增其它CC-NBS-LRR蛋白编码基因的一部分。

使用Platinum Taq酶(Thermo Fisher Scientific)，利用具有SEQ ID NO:5和SEQID NO:6的引物扩增β-WOLF基因的LRR结构域编码区的PCR条件如下：

-在95℃下进行3分钟(初始变性步骤)，

-40个扩增循环，每个循环由以下组成：在95℃下变性30秒，在58℃下退火50秒，以及在72℃下进行50秒延伸，

-在72℃下进行2分钟(最终的延伸步骤)。

在琼脂糖凝胶上显现PCR产物(未显示)，从PCR反应中纯化DNA。随后使用本领域熟知的方法测定PCR产物的序列。

通过具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的引物扩增的α-WOLF24等位基因的LRR结构域的DNA序列以SEQ ID NO:9提供于表2中。

通过具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物扩增的β-WOLF0等位基因的LRR结构域的DNA序列以SEQ ID NO:7提供于表2中。

最后，将获得的序列分别翻译成α-WOLF 24等位基因和β-WOLF0等位基因的LRR结构域的相应氨基酸序列，即SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:8(也参见表2)。

如果使用SMRT测序法(Pacific Biosciences)对PCR产物进行测序，则PCR引物和PCR条件是不同的。

向上述正向引物中添加以下标准扩增序列：GCAGTCGAACATGTAGCTGACTCAGGTCAC(SEQ ID NO:14)。

向反向引物中加入添加以下标准扩增序列：TGGATCACTTGTGCAAGCATCACATCGTAG(SEQ ID NO:15)。

实施例3

在不携带α-WOLF 24等位基因的植物中引入该等位基因

将包含α-WOLF 24等位基因的菠菜植物(其种子的代表性样品保藏在NCIMB，登录号为NCIMB 43554)与携带β-WOLF 0等位基因的品种Viroflay的植物杂交以获得F1代。随后，使F1植物自交以获得F2群体。

如实施例1所述测定F2群体的植物对粉霜霉菠菜专化型Pfs:7的抗性。大约75％的植物在测定中被评分为完全抗性。这种分离模式与显性遗传的模式一致。

分离同一F2群体的每株植物的基因组DNA，并将其用于两种不同的聚合酶链式反应(PCR)。使用用于扩增α-WOLF等位基因的LRR结构域的引物进行第一PCR反应，使用用于扩增β-WOLF等位基因的LRR结构域的引物进行第二PCR反应，两者都如实施例2所述。

在琼脂糖凝胶上显现了PCR产物(未显示)，这表明约75％的植物含有α-WOLF片段，剩余约25％的植物仅含有β-WOLF片段。含有α-WOLF片段的植物与被评分为抗Pfs:7的植物完全相关。仅包含β-WOLF片段的植物与被评分为对Pfs:7易感的植物完全相关。

纯化来自PCR反应的DNA，随后测定PCR产物的序列。α-WOLF PCR产物给出了对应于SEQ ID NO:9的序列(α-WOLF 24等位基因的LRR结构域的基因组序列)的序列。β-WOLF PCR产物给出了对应于SEQ ID NO:7的序列(β-WOLF 0等位基因的LRR结构域的基因组序列)的序列。

序列表

<110> Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel B.V.

<120> New Invention Title

<130> 菠菜的霜霉病抗性

<140>

<141> 2021-03-12

<160> 15

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 菠菜（Spinacia oleracea）

<220>

<223> N-末端基序

<400> 1

Met Ala Glu Ile Gly Tyr Ser Val Cys

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 菠菜

<220>

<223> 基序

<400> 2

Lys Trp Met Cys Leu Arg

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 菠菜

<220>

<223> 基序

<400> 3

His Val Gly Cys Val Val Asp Arg

1 5

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物LRR结构域 (α)

<400> 4

acaagtggat gtgtcttagg 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物LRR结构域 (α)

<400> 5

ttcgccctca tcttcctgg 19

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物LRR结构域 (β)

<400> 6

tcacgtgggt tgtgttgt 18

<210> 7

<211> 1597

<212> DNA

<213> 菠菜

<220>

<223> β-WOLF 0等位基因的LRR结构域的扩增子

<400> 7

tcacgtgggt tgtgttgtcg atagagatcc agaaatagtc tttttatgta gcaataagat 60

tcgttcgtat attagcggtc gctgcataaa gaatccggtg gattcacaaa tagacaactg 120

gatgtgcctt agggtgttgg acttgtcaga ttcatgtgtt aaagatttgt ctgattcaat 180

aggtaagctg ctgcacttaa ggtatcttaa cctctcttct aatataaagt tggagataat 240

ccctgatgca attacaagac tgcataactt gcagacacta cttttagaag attgcagaag 300

tttaaaggag ttgccaaaag atttttgcaa attggtcaaa ctgaggcact tggaattaca 360

gggttgtcat gatttgattg gtatgtcatt tggaatggat aagctaacta gtcttagaat 420

actaccaaac attgtggtgg gtaggaagga acaaagtgtt gatgatgagc tgaaagccct 480

aaaaggcctc accgagataa aaggctccat tgatatcaca atctattcaa aatatagaag 540

agttgaaggc atgaatggca caggaggagg agctgggtat ttgaagagca tgaaacatct 600

cacgggggtt aatattacat ttgatgaagg tggatgtgtt aaccctgaag ctgtgtattt 660

gaagagcatg aaacatctca cgagggttat tattatattt gattataaag gtggatgtgt 720

taaccctgaa gctgtgttgg caaccctaga gccaccttca aatatcaaga ggttagagat 780

gtggcattac agtggtacaa caattccagt atggggaaga gcagagatta attgggcaat 840

ctccctctca catcttgtcg acatcacgct tgaagattgt tacaatttgc aggagatgcc 900

agtgctgagt aaactgcctc atttgaaatc actggaactt acagagttgg ataacttaga 960

gtacatggag agtagaagca gcagcagtag cagtgacaca gaagcagcaa caccagaatt 1020

accaacattc ttcccttccc ttgaaaaact tacactttgg cgtctggaca agttgaaggg 1080

ttttgggaac aggagatcga gtagttttcc ccgcctctct aaattggaaa tctggaaatg 1140

tccagatcta acgtcatttc cttcttgtcc aagccttgaa gagttggaat tgaaagaaaa 1200

caatgaagcg ttgcaaataa tagtaaaaat aacaacaaca agaggtaaag aagaaaaaga 1260

agaagacaag aatgctggtg ttggaaattc acaagatgat gacaatgtca aattatggaa 1320

ggtggaaata gacaatctgg gttatctcaa atcactgccc acaaattgtc tgactcacct 1380

cgaccttaca ataagtgatt ccaaggaggg ggagggtgaa tgggaagttg gggatgcatt 1440

tcagaagtgt gtatcttctt tgagaagcct caccataatc ggaaatcacg gaataaataa 1500

agtgaagaga ctgtctggaa gaacagggtt ggagcatttc actctgttgg aatcactcaa 1560

actttcagat atagaagacc aggaagatga gggcgaa 1597

<210> 8

<211> 532

<212> PRT

<213> 菠菜

<220>

<223> LRR结构域 Β Wolf 0 (Viroflay)的扩增子编码的氨基酸序列

<400> 8

His Val Gly Cys Val Val Asp Arg Asp Pro Glu Ile Val Phe Leu Cys

1 5 10 15

Ser Asn Lys Ile Arg Ser Tyr Ile Ser Gly Arg Cys Ile Lys Asn Pro

20 25 30

Val Asp Ser Gln Ile Asp Asn Trp Met Cys Leu Arg Val Leu Asp Leu

35 40 45

Ser Asp Ser Cys Val Lys Asp Leu Ser Asp Ser Ile Gly Lys Leu Leu

50 55 60

His Leu Arg Tyr Leu Asn Leu Ser Ser Asn Ile Lys Leu Glu Ile Ile

65 70 75 80

Pro Asp Ala Ile Thr Arg Leu His Asn Leu Gln Thr Leu Leu Leu Glu

85 90 95

Asp Cys Arg Ser Leu Lys Glu Leu Pro Lys Asp Phe Cys Lys Leu Val

100 105 110

Lys Leu Arg His Leu Glu Leu Gln Gly Cys His Asp Leu Ile Gly Met

115 120 125

Ser Phe Gly Met Asp Lys Leu Thr Ser Leu Arg Ile Leu Pro Asn Ile

130 135 140

Val Val Gly Arg Lys Glu Gln Ser Val Asp Asp Glu Leu Lys Ala Leu

145 150 155 160

Lys Gly Leu Thr Glu Ile Lys Gly Ser Ile Asp Ile Thr Ile Tyr Ser

165 170 175

Lys Tyr Arg Arg Val Glu Gly Met Asn Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly

180 185 190

Tyr Leu Lys Ser Met Lys His Leu Thr Gly Val Asn Ile Thr Phe Asp

195 200 205

Glu Gly Gly Cys Val Asn Pro Glu Ala Val Tyr Leu Lys Ser Met Lys

210 215 220

His Leu Thr Arg Val Ile Ile Ile Phe Asp Tyr Lys Gly Gly Cys Val

225 230 235 240

Asn Pro Glu Ala Val Leu Ala Thr Leu Glu Pro Pro Ser Asn Ile Lys

245 250 255

Arg Leu Glu Met Trp His Tyr Ser Gly Thr Thr Ile Pro Val Trp Gly

260 265 270

Arg Ala Glu Ile Asn Trp Ala Ile Ser Leu Ser His Leu Val Asp Ile

275 280 285

Thr Leu Glu Asp Cys Tyr Asn Leu Gln Glu Met Pro Val Leu Ser Lys

290 295 300

Leu Pro His Leu Lys Ser Leu Glu Leu Thr Glu Leu Asp Asn Leu Glu

305 310 315 320

Tyr Met Glu Ser Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ala Ala

325 330 335

Thr Pro Glu Leu Pro Thr Phe Phe Pro Ser Leu Glu Lys Leu Thr Leu

340 345 350

Trp Arg Leu Asp Lys Leu Lys Gly Phe Gly Asn Arg Arg Ser Ser Ser

355 360 365

Phe Pro Arg Leu Ser Lys Leu Glu Ile Trp Lys Cys Pro Asp Leu Thr

370 375 380

Ser Phe Pro Ser Cys Pro Ser Leu Glu Glu Leu Glu Leu Lys Glu Asn

385 390 395 400

Asn Glu Ala Leu Gln Ile Ile Val Lys Ile Thr Thr Thr Arg Gly Lys

405 410 415

Glu Glu Lys Glu Glu Asp Lys Asn Ala Gly Val Gly Asn Ser Gln Asp

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Asp Asp Asn Val Lys Leu Trp Lys Val Glu Ile Asp Asn Leu Gly Tyr

435 440 445

Leu Lys Ser Leu Pro Thr Asn Cys Leu Thr His Leu Asp Leu Thr Ile

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Ser Asp Ser Lys Glu Gly Glu Gly Glu Trp Glu Val Gly Asp Ala Phe

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Gln Lys Cys Val Ser Ser Leu Arg Ser Leu Thr Ile Ile Gly Asn His

485 490 495

Gly Ile Asn Lys Val Lys Arg Leu Ser Gly Arg Thr Gly Leu Glu His

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Phe Thr Leu Leu Glu Ser Leu Lys Leu Ser Asp Ile Glu Asp Gln Glu

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Asp Glu Gly Glu

530

<210> 9

<211> 1385

<212> DNA

<213> 菠菜

<220>

<223> α-WOLF 24等位基因的LRR结构域的扩增子

<400> 9

acaagtggat gtgtcttagg atgttggact tgtcaaggtc ggatgttaaa aatttgccta 60

attcaatagg taaattgttg cacttgaggt atcttaacct gtcagataat agaaatctaa 120

agatacttcc tgatgcaatt acaagactgc ataatttgca gacacttctt ttagtagatt 180

gcagaagttt aaaggagttg ccaaaagatt tttgcaaatt ggtcaaactg aggcacttgg 240

aattacaggg ttgtcatgat ttgattggta tgccatttgg aatggataag ctaactagtc 300

ttagagtact accaaaagtt gtggtgggta agaaggaaca aagtgatgat cagctgaaag 360

ccctaaaagg cctcaccgag ataaaaggct ccattgatat cacaatctat tcaaagtata 420

gaatagttga aggcatgaat gacacaggag gagctgggta tttgaagagc atgaaacatc 480

tcacgggggt tgatattaca tttttgggtg aatgtgttaa ccctgaagct gtgttggcaa 540

ccctagagcc accttcaaat atcaagagct tatctataca tcgttttgat ggtaaaacac 600

ttccagtatg gggaagagca gagattaatt gggcaatctc cctctcacat cttgtcgaca 660

tcaagcttag ttgttgtcgt aatttgcagg agatgccagt gctgagtaaa ctgcctcatt 720

tgaaatcact ggaacttcga tgtttggaaa acttagagta catggagagt agaagcagca 780

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cttgtccaag ccttgaaacg ttgaaattgg aaaaaaacaa tgaagcgttg caaaaaataa 1020

caacaacaag aggtaaagaa gaaaaagaag aagacaagaa tgctggtgtt ggaaattcac 1080

aagatgatga caatgtcaaa ttacggaagg tgaaaataga caatctgggt tatctcaaat 1140

cactgcccac aaattgtctt actcacctcg accttacaat aagagattcc aaggaggggg 1200

agggtgaatg ggaagttggg gatgcatttc agaagtgtgt atcttctttg agaagcctca 1260

ccataatcgg aaatcacgga ataaataaag tgaagagact gtctggaaga acagggttgg 1320

agcatttcac tctgttggac tcactcaaat tttcaaagat agaagaccag gaagatgagg 1380

gcgaa 1385

<210> 10

<211> 461

<212> PRT

<213> 菠菜

<220>

<223> α-WOLF 24的LRR结构域的扩增子编码的氨基酸序列

<400> 10

Lys Trp Met Cys Leu Arg Met Leu Asp Leu Ser Arg Ser Asp Val Lys

1 5 10 15

Asn Leu Pro Asn Ser Ile Gly Lys Leu Leu His Leu Arg Tyr Leu Asn

20 25 30

Leu Ser Asp Asn Arg Asn Leu Lys Ile Leu Pro Asp Ala Ile Thr Arg

35 40 45

Leu His Asn Leu Gln Thr Leu Leu Leu Val Asp Cys Arg Ser Leu Lys

50 55 60

Glu Leu Pro Lys Asp Phe Cys Lys Leu Val Lys Leu Arg His Leu Glu

65 70 75 80

Leu Gln Gly Cys His Asp Leu Ile Gly Met Pro Phe Gly Met Asp Lys

85 90 95

Leu Thr Ser Leu Arg Val Leu Pro Lys Val Val Val Gly Lys Lys Glu

100 105 110

Gln Ser Asp Asp Gln Leu Lys Ala Leu Lys Gly Leu Thr Glu Ile Lys

115 120 125

Gly Ser Ile Asp Ile Thr Ile Tyr Ser Lys Tyr Arg Ile Val Glu Gly

130 135 140

Met Asn Asp Thr Gly Gly Ala Gly Tyr Leu Lys Ser Met Lys His Leu

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Thr Gly Val Asp Ile Thr Phe Leu Gly Glu Cys Val Asn Pro Glu Ala

165 170 175

Val Leu Ala Thr Leu Glu Pro Pro Ser Asn Ile Lys Ser Leu Ser Ile

180 185 190

His Arg Phe Asp Gly Lys Thr Leu Pro Val Trp Gly Arg Ala Glu Ile

195 200 205

Asn Trp Ala Ile Ser Leu Ser His Leu Val Asp Ile Lys Leu Ser Cys

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Cys Arg Asn Leu Gln Glu Met Pro Val Leu Ser Lys Leu Pro His Leu

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Lys Ser Leu Glu Leu Arg Cys Leu Glu Asn Leu Glu Tyr Met Glu Ser

245 250 255

Arg Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Lys Glu Ala Ala Thr Pro Glu Leu

260 265 270

Pro Thr Phe Phe Pro Ser Leu Glu Lys Leu Thr Leu Trp Tyr Leu Glu

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Lys Leu Lys Gly Leu Gly Asn Arg Arg Ser Ser Ser Phe Pro Arg Leu

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Ser Lys Leu Glu Ile Arg Glu Cys Pro Asp Leu Thr Trp Phe Pro Pro

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Cys Pro Ser Leu Glu Thr Leu Lys Leu Glu Lys Asn Asn Glu Ala Leu

325 330 335

Gln Lys Ile Thr Thr Thr Arg Gly Lys Glu Glu Lys Glu Glu Asp Lys

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Lys Val Lys Ile Asp Asn Leu Gly Tyr Leu Lys Ser Leu Pro Thr Asn

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Gly Glu Trp Glu Val Gly Asp Ala Phe Gln Lys Cys Val Ser Ser Leu

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Arg Ser Leu Thr Ile Ile Gly Asn His Gly Ile Asn Lys Val Lys Arg

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Leu Ser Gly Arg Thr Gly Leu Glu His Phe Thr Leu Leu Asp Ser Leu

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Lys Phe Ser Lys Ile Glu Asp Gln Glu Asp Glu Gly Glu

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<210> 11

<211> 3453

<212> DNA

<213> 菠菜

<220>

<223> α-WOLF 24 等位基因的编码序列

<400> 11

atggccgaaa tcggatactc ggtttgtgcg aaactcatcg aagtgattgg cagtgagctg 60

atcaaagaga tttgtgacac atggggttac aaatctcttc ttgaggacct caacaaaact 120

gtattgacgg tcaggaacgt tctcattcaa gccggggtga tgcgggagct tactagtgaa 180

caacaaggtt tcattgcaga ccttaaagat gttgtttatg atgctgatga cttgttcgac 240

aagttactca ctcgtgctga gcgaaaacag attgatggaa acgaaatctc tgaaaaggta 300

cgtcgtttct tttcctctag taacaagatc ggtcaagctt actacatgtc tcgtaaggtt 360

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gatgtcaaga atattcttgg gagggataaa gataagaatg atatcataga taggttgctt 540

aatcgtaatg gtaatgaagc ttgtagtttc ctgaccatag tgggagcggg aggattggga 600

aaaactgctc ttgcacaact tgtgttcaat gatgaaaggg tcaaaattga gttccatgat 660

ttgaggtatt gggtttgtgt ctctgatcaa gatgggggcc aatttgatgt gaaagaaatc 720

ctttgtaaga ttttagaggt ggttactaag gagaaagttg ataatagttc cacattggaa 780

ttggtacaaa gccaatttca agagaagtta agaggaaaga agtacttcct tgttcttgat 840

gatgtatgga acgaggatcg tgagaagtgg cttcctttgg aagagttgtt aatgttgggt 900

caagggggaa gcaaggttgt agtgaccaca cgttcagaga agacagcaaa tgtcataggg 960

aaaagacatt tttatacact ggaatgtttg tcaccagatt attcatggag cttatttgaa 1020

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ctttatggag aggagataag taagtggcgg tcatttgaaa tgagtgagtt ggccaaaatt 1200

ggcaatgggg ataataagat tttgccgata ttaaagctca gttaccataa tcttataccc 1260

tcgttgaaga gttgttttag ttattgtgca gtgtttccca aggatcatga aataaagaag 1320

gagatgttga ttgaactttg gatggcacaa ggatatgttg tgccgttgga tggaggtcaa 1380

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gatgtaaaga aggataaata tggtgatgtt gattctgtta aaatccacga cttgatgcac 1500

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gtggatacac taatagacaa gtggatgtgt cttaggatgt tggacttgtc aaggtcggat 1740

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gataagctaa ctagtcttag agtactacca aaagttgtgg tgggtaagaa ggaacaaagt 2040

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cgcagtttga gaattaaaga ctctgacaaa atgacaagtt tgcccatggg gatgcagtac 3180

ttaacctccc tccaaaccct ctatctacac cattgttatg aattgaattc ccttccagaa 3240

tggataagca gcttatcatc tcttcaatcc ctgtacatat acaaatgtcc agccctaaaa 3300

tcactaccag aagcaatgcg gaacctcacc tcccttcaga gccttgtgat acggcggtgt 3360

ccagacctaa ttgaaagatg cgaagaaccc aacggcgagg actatcccaa aattcgacac 3420

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<210> 12

<211> 1150

<212> PRT

<213> 菠菜

<220>

<223> α-WOLF 24等位基因的氨基酸序列

<400> 12

Met Ala Glu Ile Gly Tyr Ser Val Cys Ala Lys Leu Ile Glu Val Ile

1 5 10 15

Gly Ser Glu Leu Ile Lys Glu Ile Cys Asp Thr Trp Gly Tyr Lys Ser

20 25 30

Leu Leu Glu Asp Leu Asn Lys Thr Val Leu Thr Val Arg Asn Val Leu

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Ile Gln Ala Gly Val Met Arg Glu Leu Thr Ser Glu Gln Gln Gly Phe

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Ile Ala Asp Leu Lys Asp Val Val Tyr Asp Ala Asp Asp Leu Phe Asp

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Lys Leu Leu Thr Arg Ala Glu Arg Lys Gln Ile Asp Gly Asn Glu Ile

85 90 95

Ser Glu Lys Val Arg Arg Phe Phe Ser Ser Ser Asn Lys Ile Gly Gln

100 105 110

Ala Tyr Tyr Met Ser Arg Lys Val Lys Glu Ile Lys Lys Gln Leu Asp

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Glu Ile Val Asp Arg His Thr Lys Phe Gly Phe Ser Ala Glu Phe Ile

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Pro Val Cys Arg Gly Arg Gly Asn Glu Arg Glu Thr Arg Ser Tyr Ile

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Asp Val Lys Asn Ile Leu Gly Arg Asp Lys Asp Lys Asn Asp Ile Ile

165 170 175

Asp Arg Leu Leu Asn Arg Asn Gly Asn Glu Ala Cys Ser Phe Leu Thr

180 185 190

Ile Val Gly Ala Gly Gly Leu Gly Lys Thr Ala Leu Ala Gln Leu Val

195 200 205

Phe Asn Asp Glu Arg Val Lys Ile Glu Phe His Asp Leu Arg Tyr Trp

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225 230 235 240

Leu Cys Lys Ile Leu Glu Val Val Thr Lys Glu Lys Val Asp Asn Ser

245 250 255

Ser Thr Leu Glu Leu Val Gln Ser Gln Phe Gln Glu Lys Leu Arg Gly

260 265 270

Lys Lys Tyr Phe Leu Val Leu Asp Asp Val Trp Asn Glu Asp Arg Glu

275 280 285

Lys Trp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Leu Met Leu Gly Gln Gly Gly Ser

290 295 300

Lys Val Val Val Thr Thr Arg Ser Glu Lys Thr Ala Asn Val Ile Gly

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Lys Arg His Phe Tyr Thr Leu Glu Cys Leu Ser Pro Asp Tyr Ser Trp

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Ser Leu Phe Glu Met Ser Ala Phe Gln Lys Gly His Glu Gln Glu Asn

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His His Glu Leu Val Asp Ile Gly Lys Lys Ile Val Glu Lys Cys Tyr

355 360 365

Asn Asn Pro Leu Ala Ile Thr Val Val Gly Ser Leu Leu Tyr Gly Glu

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405 410 415

Asn Leu Ile Pro Ser Leu Lys Ser Cys Phe Ser Tyr Cys Ala Val Phe

420 425 430

Pro Lys Asp His Glu Ile Lys Lys Glu Met Leu Ile Glu Leu Trp Met

435 440 445

Ala Gln Gly Tyr Val Val Pro Leu Asp Gly Gly Gln Ser Ile Glu Asp

450 455 460

Ala Ala Glu Glu His Phe Val Ile Leu Leu Arg Arg Cys Phe Phe Gln

465 470 475 480

Asp Val Lys Lys Asp Lys Tyr Gly Asp Val Asp Ser Val Lys Ile His

485 490 495

Asp Leu Met His Asp Val Ala Gln Glu Val Gly Arg Glu Glu Leu Cys

500 505 510

Val Val Asn Asp Asn Thr Lys Asn Leu Gly Asp Lys Ile Arg His Val

515 520 525

His Arg Asp Val Ile Arg Tyr Ala Gln Arg Val Ser Leu Cys Ser His

530 535 540

Ser His Lys Ile Arg Ser Tyr Ile Gly Gly Asn Cys Glu Lys Arg Cys

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Asp Cys Arg Ser Leu Lys Glu Leu Pro Lys Asp Phe Cys Lys Leu Val

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Val Val Gly Lys Lys Glu Gln Ser Asp Asp Gln Leu Lys Ala Leu Lys

675 680 685

Gly Leu Thr Glu Ile Lys Gly Ser Ile Asp Ile Thr Ile Tyr Ser Lys

690 695 700

Tyr Arg Ile Val Glu Gly Met Asn Asp Thr Gly Gly Ala Gly Tyr Leu

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Lys Ser Met Lys His Leu Thr Gly Val Asp Ile Thr Phe Leu Gly Glu

725 730 735

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Ile Lys Ser Leu Ser Ile His Arg Phe Asp Gly Lys Thr Leu Pro Val

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Asp Ser Lys Glu Gly Glu Gly Glu Trp Glu Val Gly Asp Ala Phe Gln

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Lys Cys Val Ser Ser Leu Arg Ser Leu Thr Ile Ile Gly Asn His Gly

980 985 990

Ile Asn Lys Val Lys Arg Leu Ser Gly Arg Thr Gly Leu Glu His Phe

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1025 1030 1035 1040

Arg Ser Leu Arg Ile Lys Asp Ser Asp Lys Met Thr Ser Leu Pro Met

1045 1050 1055

Gly Met Gln Tyr Leu Thr Ser Leu Gln Thr Leu Tyr Leu His His Cys

1060 1065 1070

Tyr Glu Leu Asn Ser Leu Pro Glu Trp Ile Ser Ser Leu Ser Ser Leu

1075 1080 1085

Gln Ser Leu Tyr Ile Tyr Lys Cys Pro Ala Leu Lys Ser Leu Pro Glu

1090 1095 1100

Ala Met Arg Asn Leu Thr Ser Leu Gln Ser Leu Val Ile Arg Arg Cys

1105 1110 1115 1120

Pro Asp Leu Ile Glu Arg Cys Glu Glu Pro Asn Gly Glu Asp Tyr Pro

1125 1130 1135

Lys Ile Arg His Ile Ser Arg Ile Val Leu Asn Glu Tyr Trp

1140 1145 1150

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 菠菜

<220>

<223> 基序

<400> 13

Asp Gln Glu Asp Glu Gly Glu Asp Asn

1 5

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物标准扩增序列

<400> 14

gcagtcgaac atgtagctga ctcaggtcac 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物标准扩增序列

<400> 15

tggatcactt gtgcaagcat cacatcgtag 30

Claims (18)

1.一种命名为α-WOLF 24的等位基因，其赋予对至少一个粉霜霉菠菜专化型小种(Peronospora farinosa f.sp.Spinacea race)的抗性，其中由所述等位基因编码的蛋白质是CC-NBS-LRR蛋白，其在其氨基酸序列中包含：a)在其N-末端处的基序“MAEIGYSVC”；b)基序“KWMCLR”；并且其中所述蛋白的LRR结构域按照增加的优先顺序与SEQ ID NO:10具有至少95％、96％、97％、98％、98.2％、98.5％、98.8％、99％、99.2％、99.5％、99.8％、100％的序列同一性。

2.如权利要求1所述的等位基因，其中所述LRR结构域的基因组DNA序列按照增加的优先顺序与SEQ ID NO:9具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性。

3.如权利要求1所述的等位基因，其中所述等位基因在存在于菠菜植物中时，赋予对至少粉霜霉菠菜专化型小种Pfs:1、Pfs:2、Pfs:5、Pfs:6、Pfs:7、Pfs:9、Pfs:11、Pfs:13、Pfs:15和Pfs:17的完全抗性，并且不赋予对霜霉病小种Pfs:16的抗性。

4.一种菠菜植物，其包含如权利要求1至3中任一项所述的等位基因，所述菠菜植物的能够生长成包含所述等位基因的植物的种子的代表性样品保藏在NCIMB，登录号为NCIMB43554。

5.如权利要求4所述的菠菜植物，其中所述植物是农学上优良的植物。

6.如权利要求5所述的菠菜植物，其中所述农学上优良的植物是杂交品种或近交系。

7.如权利要求6所述的菠菜植物，其还包含导致对粉霜霉菠菜专化型小种Pfs:1至Pfs:17的抗性的遗传决定因子。

8.一种繁殖材料，其能够发育成如权利要求4至7中任一项所定义的菠菜植物和/或由所述菠菜植物衍生而来，其中所述繁殖材料包含如权利要求1至3中任一项所述的等位基因，并且其中所述繁殖材料选自由以下组成的组：小孢子、花粉、子房、胚珠、胚、胚囊、卵细胞、插条、根、根尖、下胚轴、子叶、茎、叶、花、花药、种子、分生组织细胞、原生质体、细胞或其组织培养物。

9.一种菠菜植物的细胞，所述细胞包含如权利要求1至3中任一项所述的等位基因。

10.一种生产杂交菠菜种子的方法，其包括将第一亲本菠菜植物与第二亲本菠菜植物杂交并收获所得的杂交菠菜种子，其中所述第一亲本菠菜植物包含如权利要求1至3中任一项所述的等位基因。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述第一和/或第二亲本是自交系的植物。

12.一种杂交菠菜植物，其由权利要求10或权利要求11的方法产生的种子生长而来。

13.一种用于鉴定携带如权利要求1至3中任一项所述的等位基因的菠菜植物的方法，其中包括通过确定植物基因组中如权利要求1中所定义的LRR结构域的基因组核苷酸序列或其部分来确定所述LRR结构域的存在，其中所述序列按照增加的优先顺序与SEQ ID NO:9具有95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、100％的序列同一性。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述LRR结构域是通过使用引物对扩增所述LRR结构域来确定的，其中所述正向引物是具有SEQ ID NO:4的序列的核酸分子。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述LRR结构域是通过使用引物对扩增所述LRR结构域来确定的，其中所述反向引物是具有SEQ ID NO:5的序列的核酸分子。

16.引物对，其中包含正向引物和反向引物，所述正向引物是具有SEQ ID NO:4的序列的核酸分子，所述反向引物是具有SEQ ID NO:5的序列的核酸分子。

17.一种用于生产表现出对粉霜霉菠菜专化型的抗性的菠菜植物的方法，其包括：

(a)将包含如权利要求1或2所述的等位基因的植物与另一植物杂交；

(b)任选地进行一轮或多轮自交和/或杂交；

(c)在一轮或多轮自交和/或杂交后选择包含如权利要求1至3中任一项所述的等位基因的植物。

18.如权利要求16所述的方法，其中对包含所述等位基因的植物的所述选择包括根据权利要求13至15中任一项所述的方法确定所述等位基因的存在。