CN109862782A - 菠菜的霜霉菌抗性 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种被命名为α‑WOLF 8的等位基因，所述等位基因赋予针对至少一个菠菜粉霜霉菌小种的抗性，其中由所述等位基因编码的蛋白为CC‑NBS‑LRR蛋白，所述CC‑NBS‑LRR蛋白在其氨基酸序列中包含：a)在其N‑末端处的基序“MAEIGYSVC”；和b)基序“KWMCLR”；并且其中所述蛋白的LRR结构域按递增的优先顺序与SEQ ID No:12具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性。当所述等位基因以纯合形式存在于菠菜植株中时，赋予针对菠菜粉霜霉菌小种pfs:1,pfs:2、pfs:6、pfs:8和pfs:15以及分离株US1508的完全抗性，并且赋予针对pfs:5、pfs:10和pfs:16的中等抗性，以及不赋予针对pfs:3、pfs:4、pfs:7、pfs:9、pfs:11、pfs:12、pfs:13和pfs:14的抗性。

Description

菠菜的霜霉菌抗性
技术领域
本发明涉及能够赋予菠菜植株以针对多个菠菜粉霜霉菌(Peronospora farinosaf.sp.spinaciae)小种的抗性的等位基因。本发明还涉及携带有所述等位基因的菠菜植株、所述菠菜植株的繁殖材料、所述菠菜植株的细胞，以及所述菠菜植株的种子。本发明进一步涉及制备携带所述等位基因的菠菜植株的方法以及所述等位基因在育种从而赋予针对菠菜粉霜霉菌的抗性中的应用。
背景技术
霜霉病(菠菜粉霜霉菌)是菠菜种植者的主要威胁，因为它直接影响收获的叶子。在菠菜中，霜霉病由卵菌菠菜粉霜霉菌(以前称为菠菜霜霉病菌(P.effusa))引起。感染导致叶子不适合销售和消费，因为其本身表型表现为老叶上的黄色病斑，并且在叶背面上可以观察到灰色霉菌生长。感染可以非常快速地传播，并且其可以在温室栽培和土壤栽培两者中出现。菠菜粉霜霉菌孢子形成和萌发的最适温度是9-12℃，并且高的相对湿度会促进其形成和萌发。当孢子沉积在湿润的叶子表面上时，它们可以很容易地萌发并感染叶子。在8℃和20℃之间以及≥80％的相对湿度下最适于霉菌生长，并且在感染后6天-13天内可以观察到菌丝体生长。粉霜霉菌的卵孢子可以在土壤中存活达3年，或作为菌丝体存活于种子或活的植株中。
目前官方已经鉴定并表征了菠菜霜霉病(Pfs)的16个致病小种，并且在该领域中观察到许多新的候选物。菠菜粉霜霉菌的16个官方认可小种被指定为Pfs:1至Pfs:16(Irish等人，Phtypathol.Vol.98pg.894-900,2008；Plantum NL(Dutch association forbreeding,tissue culture,production and trade of seed and young plants(荷兰种子和株苗的育种、组织培养、生产和贸易协会))新闻稿,“Benoeming van Pfs:14,eennieuwe fysio van valse meeldauw in spinazie”,2012年9月19日；Report Jim Correl(Univ.Arkansas)和Steven Koike(UC Cooperative Extension,Monterey County),“RacePfs:14–Another new race of the spinach downy mildew pathogen(小种Pfs:14–菠菜霜霉病病原体的另一个新小种)”,2012年9月18日；Plantum NL新闻稿,“Denomination ofPfs:15,a new race of downy mildew in spinach(菠菜霜霉病的一个新小种Pfs:15的命名)”，2014年9月2日,Plantum NL新闻稿,“Denomination of Pfs:16,a new race ofdowny mildew in spinach(菠菜霜霉病的一个新小种Pfs:16的命名),2016年3月15日)。第4-15小种鉴定于1990年和2014年之间，而仅在最近另一个新的霜霉属分离株被鉴定，该分离株称为UA201519B，随后被霜霉属国际工作小组(IWGP)官方命名为Pfs:16(Plantum NL(Dutch association for breeding,tissue culture,production and trade of seedand young plants(荷兰种子和株苗的育种、组织培养、生产和贸易协会))新闻稿,“Denomination of Pfs:16,a new race of downy mildew in spinach(菠菜霜霉病的一个新小种Pfs:16的命名)”,2016年3月15日。公众可从美国阿肯色州大学植物病理学系(费耶特维尔，AR72701，美国)获得所有16个官方认可的Pfs小种，也可从荷兰NAK Tuinbouw,Sotaweg 22,2371 GD Roelofarendsveen获得。
特别是最近鉴定的粉霜霉菌小种可以破坏全球目前商业上使用的许多菠菜品种的抗性，并且因此它们对菠菜工业的生产率施加了严重的威胁。因此，在此领域中这就重要地站在了开发的前沿，因为粉霜霉菌不断地进化其破坏存在于市售菠菜品种中的抗性的能力。为此，针对霜霉病的新抗性基因是非常有价值的财富，它们在育种且特别在菠菜和莴苣育种中形成了重要的研究焦点。菠菜育种者的主要目标之一是要在这些粉霜霉菌小种广泛传播并且对工业施加威胁之前快速地开发出具有对尽可能多的粉霜霉菌小种(包括最近鉴定的小种)的抗性的菠菜品种。
在市售的菠菜品种中，针对霜霉病的抗性通常由所谓的R-基因产生。R-基因介导的抗性基于植物识别侵入的病原体的能力。在许多情况下，这种识别发生在病原体已经创建了相互作用的第一阶段并将所谓的致病性(或无毒性)因子转移到植物细胞中后发生。这些致病性因子与宿主成分相互作用以便创建有利于病原体侵入宿主并且因此导致病害的条件。当植物能够识别被致病性因子触发的事件时，可以引发抗性反应。在许多不同的植物病原体相互作用系统(诸如菠菜与不同的粉霜霉菌株的相互作用)中，植物仅在对侵入病原体的特异性识别之后引发这些事件。
植物和病原体的协同进化导致了军备竞赛，其中R-基因介导的抗性有时由于病原体以不同的方式与备选的宿主靶标或同一靶标相互作用并对其进行修饰的能力而被压制，使得丧失了识别，可以成功地形成感染，导致病害。为了在植物中重建抗性，不得不引入新的R-基因，所述新的R-基因能够识别备选致病性因子的作用模式。
尽管存在R-基因的耐久性相对较低的事实，但在菠菜中R-基因仍然是占优势的防御霜霉病的形式。这主要是因为下面的事实：其是提供绝对抗性的仅有防御形式。到目前为止，植物育种者已经通过利用存在于多个作物种类的野生种质中的抗性基因非常成功地产生了抗霜霉病的菠菜品种。即使R-基因广泛地用于菠菜育种中，但是至今对这些R-基因了解不多。存在于目前市售菠菜品种的R-基因还从未在分子水平被表征，即，它们的序列至今还未知。此外至今本领域中还不存在已知的分离这些R-基因的紧密连锁的分子标记，在本领域中这些基因本身的分子特征也未知。因此，对新的R-基因的搜索和R-基因鉴定目前基于表型分析，在表型分析中筛选多份材料的抗性谱中可能的变异。随后，通过杂交和选择确定新观察到的抗性实际上是不是由R-基因引起的。
对新出现的霜霉病小种适当反应对于开发商业上成功的菠菜品种是至关重要的。因此，本发明的目的是提供一种新的抗性等位基因，所述等位基因赋予对新出现的霜霉病分离株的抗性，以及提供了用于鉴定此新的抗性等位基因的分子生物学工具。
发明内容
在获得本发明的研究中，发现菠菜中赋予对菠菜粉霜霉菌抗性的不同抗性基因不是独立的抗性基因座，如以前假设的那样，但是它们是同一个基因或两个基因的不同等位基因。这一个或两个基因是“α-WOLF”型或“β-WOLF”型基因(一起称作“WOLF基因”)，它们各自编码属于CC-NBS-LRR(卷曲螺旋–核苷酸结合位点–富含亮氨酸的重复区)家族的蛋白质。取决于存在于菠菜植株中的等位基因变体(或多个等位基因变体)，所述植株将产生WOLF蛋白的变体，所述变体赋予对菠菜粉霜霉菌的多个致病小种的特定抗性谱。获得本发明的研究进一步证明了存在于菠菜植株的基因组中的不同等位基因与所述植株对菠菜粉霜霉菌的多个不同致病小种的抗性谱之间的关系。
在本发明的上下文中，术语“等位基因”或“等位基因变体”用来指与特定的表型(即，抗性谱)连锁的基因版本。发现菠菜植株可以携带一个或两个WOLF基因。这两个WOLF基因中的每一个包含多个等位基因，每个等位基因赋予特定的抗性谱。βWOLF基因位于scaffold12735(序列:GenBank:KQ143339.1)上，在位置213573-221884处。在菠菜植株还携带或仅携带α-WOLF基因的情况下，α-WOLF基因位于与β-WOLF基因定位于Viroflay基因组组装体中的scaffold12735上的位置大致相同的位置处。
对菠菜种质中的新WOLF-等位基因的筛选鉴定出了α-WOLF基因的一个新等位基因，该等位基因赋予了针对几个霜霉病小种(包括最近鉴定的小种pfs:16)的新的、独特的抗性谱。
发明详述
关于菠菜品种Viroflay(其对菠菜粉霜霉菌的所有已知的致病小种均易感)的基因组装体可公共地获得(菠菜(Spinacia oleracea)培育植株SynViroflay,全基因组鸟枪测序项目；Bioproject:PRJNA41497；GenBank:AYZV00000000.2；BioSample:SAMN02182572,还参见Dohm等人，2014,Nature 505:546-549)。在此Viroflay基因组组装体中，β-WOLF基因位于scaffold12735(序列:GenBank:KQ143339.1)上，在位置213573-221884处。被此区间覆盖的序列包含Viroflay的β-WOLF基因的全部基因组序列，加上该基因上游的2000个碱基对序列，加上该基因下游的序列，直至位于WOLF基因下游的邻近基因的基因座。菠菜品种Viroflay仅拥有单个WOLF基因，即β-WOLF基因，但大多数其他菠菜品系在基因组的相同位置具有单个α-型WOLF基因。其他菠菜品系在基因组中大致相同位置处具有两个WOLF基因。在这样的情况下，两个WOLF基因彼此相邻定位。在大多数具有两个WOLF基因的菠菜品系中，所述WOLF基因中的一个属于α-型，另一个WOLF基因属于β-型。在获得本发明的研究中，观察到WOLF基因座中的这个等位基因变异是造成对菠菜粉霜霉菌的致病小种的抗性差异的原因。
α-WOLF基因的等位基因和β-WOLF基因的等位基因之间的差异在于所编码的蛋白序列中的特异性保守氨基酸基序的存在。如上所述，所有WOLF蛋白从N-至C-末端拥有下面的本领域公知的结构域：卷曲螺旋结构域(RX-CC-样，cd14798)、NBS结构域(也称为“NB-ARC结构域”,pfam00931；van der Biezen&Jones,1998,Curr.Biol.8:R226-R228)，和富含亮氨酸的重复区(IPR032675)，所述重复区包含LRR结构域。另外，所有WOLF蛋白在其氨基酸序列中包含N-末端处的基序“MAEIGYSVC”。除此之外，所有α-WOLF蛋白在其氨基酸序列中包含基序“KWMCLR”，而所有β-WOLF蛋白在其氨基酸序列中包含基序“HVGCVVDR”。
本发明涉及α-WOLF基因新的赋予菠菜粉霜霉菌抗性的等位基因，命名为α-WOLF8。
具体地，本发明涉及赋予菠菜粉霜霉菌抗性的等位基因，命名为α-WOLF 8，其中由所述等位基因编码的蛋白是CC-NBS-LRR蛋白，所述蛋白在其氨基酸序列中包含：a)在其N-末端处的基序“MAEIGYSVC”；和b)基序“KWMCLR”；并且其中所述蛋白的LRR结构域按递增的优先顺序与SEQ ID No:12具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性。任选地，αWOLF 8等位基因在其氨基酸序列中进一步包含附加的基序，即“DQEDEGEDN”。
为了本发明的目的，α-WOLF 8等位基因的蛋白的LRR结构域被定义为按递增的优先顺序与SEQ ID No:12具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的氨基酸序列。
本领域技术人员熟悉序列相似性的计算方法。序列相似性合适地使用EMBOSSstretcher 6.6.0(www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_stretcher)，使用EBLOSUM62矩阵以及得到的“相似性分数”计算。
如本文所定义的α-WOLF 8等位基因的LRR结构域可以通过如下的步骤来确定：使用特异性引物扩增并测序编码LRR结构域的氨基酸序列的基因组DNA，随后将DNA序列翻译成氨基酸序列，由此采用常规知识来选择正确的阅读框。本领域技术人员能够使用可自由获得的在线生物信息学工具诸如可以从此处：http://web.expasy.org/translate/获得的工具来完成此过程。
α-WOLF基因诸如α-WOLF 8的LRR结构域的基因组序列可以使用引物对来扩增，所述引物对具有正向引物和反向引物，正向引物是具有SEQ ID No:8的序列的核酸分子，反向引物是具有SEQ ID No:9的序列的核酸分子。
使用具有SEQ ID No:8和SEQ ID No:9的引物扩增α-WOLF基因的LRR结构域编码区的PCR条件为：使用Platinum Taq酶(Thermo Fisher Scientific):95℃3分钟(初始变性步骤)；40个扩增循环，每个循环由下列步骤组成：在95℃变性30秒，在60℃退火30秒，以及在72℃延伸30秒；在72℃2分钟(最后延伸步骤)。
β-WOLF基因(例如，如存在于Viroflay品种中的无效等位基因)的LRR结构域可以使用正向引物和反向引物来扩增，所述正向引物是具有SEQ ID No:10的序列的核酸分子，所述反向引物是具有SEQ ID No:9的序列的核酸分子。
使用具有SEQ ID No:9和SEQ ID No:10的引物扩增β-WOLF基因的LRR结构域编码区的PCR条件如下：使用Platinum Taq酶(Thermo Fisher Scientific):95℃3分钟(初始变性步骤)；40个扩增循环，每个循环由下列步骤组成：在95℃变性30秒，在58℃退火50秒，以及在72℃延伸50秒；在72℃2分钟(最后延伸步骤)。
因此，本发明还涉及用于扩增α-WOLF基因的LRR结构域的引物对，更具体地是用于扩增α-WOLF 8等位基因的LRR结构域的引物对，其中正向引物是具有SEQ ID No:8的序列的核酸分子，反向引物是具有SEQ ID No:9的序列的核酸分子。本文公开的引物已经被特异性地设计用于选择性地扩增WOLF基因的一部分，而不会扩增任意其他CC-NBS-LRR蛋白编码基因的一部分。
本发明涉及α-WOLF 8等位基因，该α-WOLF 8等位基因具有按递增的优先顺序与SEQ ID No:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的基因组序列。
本发明涉及三个不同的剪接变体。在一个实施方案中，本发明涉及α-WOLF 8等位基因，该α-WOLF 8等位基因具有按递增的优先顺序与SEQ ID No:2具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的编码序列。这是α-WOLF 8等位基因的第一个剪接变体。
在进一步的实施方案中，α-WOLF 8等位基因具有按递增的优先顺序与SEQ ID No:3具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的编码序列。这是第二个剪接变体。
在另一个实施方案中，α-WOLF 8等位基因具有按递增的优先顺序与SEQ ID No:4具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的编码序列。这是第三个剪接变体
在本发明的另一个方面，α-WOLF 8等位基因编码具有按递增的优先顺序与SEQ IDNo:5具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的氨基酸序列的蛋白。
在另一个实施方案中，α-WOLF 8等位基因编码具有按递增的优先顺序与SEQ IDNo:6具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的氨基酸序列的蛋白。
在另一个实施方案中，α-WOLF 8等位基因编码具有按递增的优先顺序与SEQ IDNo:7具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的氨基酸序列的蛋白。
α-WOLF 8等位基因当以纯合形式存在于菠菜植株中时，赋予针对官方认可的菠菜粉霜霉菌小种pfs:1、pfs:2、pfs:6、pfs:8和pfs:15的完全抗性，并且赋予针对pfs:5、pfs:10和pfs:16的中等抗性，以及不赋予针对霜霉病小种pfs:3、pfs:4、pfs:7、pfs:9、pfs:11、pfs:12、pfs:13和pfs:14的抗性(参见表1)。如表1中所示，对于α-WOLF 8等位基因是杂合的并且不携带任何其他赋予抗性的等位基因的菠菜植株将对霜霉病小种Pfs:5、Pfs:10和Pfs:16是易感的。
菠菜植株针对菠菜粉霜霉菌的一个或多个小种的抗性可以使用幼苗试验来确定。在本文中，幼苗试验被定义为这样的试验，其中菠菜植株种植在含有生长培养基的托盘中，任选地在出苗后每周施肥两次。植株在第一真叶期时接种孢子囊悬液，所述孢子囊悬液具有大约2.5×105个/ml待测试的菠菜粉霜霉菌的致病小种之一或分离株的浓度。被接种的植株放置在18℃、相对湿度100％的露珠箱中持续24小时的时期，然后移到18℃的生长箱中，以12小时的光周期持续6天。6天后，将植株返回至露珠箱持续24小时以诱发孢子形成，随后针对病害反应对植株进行评分。优选地，每个小种测试30个植株。
如本文所用，当在本文所述的幼苗试验中植株显示没有症状时，则该植株对菠菜粉霜霉菌小种具有完全抗性。
如本文所用，当在本文所述的幼苗试验中植株显示仅有萎黄病的症状，或仅在子叶的尖端上发生孢子形成时，该植株对菠菜粉霜霉菌小种具有中等抗性。
如本文所用，当在本文所述的幼苗试验中植株显示不仅有萎黄病的症状，或当比仅在子叶的尖端更大的区域上发生孢子形成时，该植株对菠菜粉霜霉菌小种的分离株易感。
本发明的另一个方面涉及一种菠菜植株，该菠菜植株包含本发明的α-WOLF 8等位基因，所述菠菜植株的种子的代表性样品保藏于NCIMB，NCIMB保藏号为42646。
在又一个实施方案中，本发明的包含α-WOLF 8等位基因的植株是农艺优良的菠菜植株。在本发明的上下文中，农艺优良的菠菜植株是具有导致积累可辨识的和需要的农艺性状的基因型的植株，所述农艺性状允许生产者收获具有商业意义的产品，优选地，所述包含α-WOLF 8等位基因的农艺优良的菠菜植株是近交系或杂交种的植株。
如本文所用，近交系的植株是作为三轮或更多轮自交或回交的结果的植株群体的植株；或所述植株是双单倍体。近交系可以例如是用于生产市售杂交种的亲本系。
如本文所用，杂交植株是作为两种不同的具有不同基因型的植株之间的杂交结果的植株。更具体地，杂交植株是两个不同的近交系的植株之间杂交的结果，诸如此类杂交植株可以例如是F1杂交品种的植株。
携带杂合子形式的α-WOLF 8等位基因的植株可以进一步包含如例如存在于Viroflay品种中的β-WOLF 0等位基因，其中所述β-WOLF 0等位基因不赋予任何针对霜霉病的抗性。然而，α-WOLF 8等位基因杂合的植株可以进一步包含α/β-WOLF基因的等位基因，所述等位基因提供针对霜霉病的抗性。优选地，这样的等位基因将补充α-WOLF 8等位基因，使得菠菜植株将对α-WOLF 8等位基因不提供抗性的一个或多个其他小种至少是中等抗性的。最优选地，α/β-WOLF基因的其他等位基因补充α-WOLF 8等位基因，使得所述植株对菠菜粉霜霉菌小种Pfs:1至Pfs:16有抗性。在一个实施方案中，这样的植株是农艺优良植株。
可选地，携带α-WOLF 8等位基因的植株的抗性谱由完全不同的基因的赋予抗性的等位基因来实现。这样的基因的实例例如是如US8,354,570中所述的DMR1和如US9,121,029中所述的DMR6。
因此本发明涉及一种菠菜植株，所述菠菜植株携带α-WOLF 8等位基因，并且进一步包含产生针对菠菜粉霜霉菌小种pfs:1至pfs:16的抗性的遗传决定因子。所述遗传决定因子可以是另一个赋予抗性的α/β-WOLF等位基因或完全不同的基因的赋予抗性的等位基因。
本发明进一步涉及包含α-WOLF 8等位基因的繁殖材料。在一个实施方案中，所述繁殖材料适合于有性繁殖。这样的繁殖材料包括例如小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞。在另一个实施方案中，所述繁殖材料适合于营养繁殖。这样的繁殖材料包括例如插条、根、茎、细胞、原生质体和再生细胞的组织培养物。适合于制备组织培养物的植株的一部分特别地是叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生细胞、根尖、花药、花、种子和茎。
本发明此外涉及包含α-WOLF 8等位基因的菠菜植株的细胞。这样的细胞可以是分离形式或可以是整个植株的一部分或其多个部分，并且仍然构成本发明的细胞，因为这样的细胞具有赋予针对霜霉病的抗性的α-WOLF 8等位基因。本发明的植株的每个细胞携带了赋予针对菠菜粉霜霉菌的抗性的遗传信息。本发明的这种细胞也可以是再生细胞，所述再生细胞可以用来再生包含本发明的等位基因的新植株。
本发明的另一个方面涉及制备杂交菠菜种子的方法，所述方法包括将第一亲本菠菜植株与第二亲本菠菜植株杂交，并且收获所得的杂交菠菜种子，其中所述第一和/或第二亲本菠菜植株包含α-WOLF 8等位基因。在具体的实施方案中，所述第一和/或第二亲本植株是如本文所定义的近交系的植株。
本发明进一步涉及由种子生长成的杂交菠菜植株，所述种子通过以下步骤制备：将第一亲本菠菜植株与第二亲本菠菜植株杂交并且收获所得的杂交菠菜种子，其中所述第一和/或第二亲本菠菜植株包含α-WOLF 8等位基因。
本发明的另一个方面涉及一种鉴定或选择携带有α-WOLF 8等位基因的菠菜植株的方法，包括确定在植株的基因组中基因组核苷酸序列或其部分的存在，其中所述序列按递增的优先顺序与SEQ ID No:1具有92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性。
本发明进一步涉及一种鉴定或选择携带有α-WOLF 8等位基因的菠菜植株的方法，包括确定在植株的基因组中编码序列或其部分的存在，其中所述序列按递增的优先顺序与SEQ ID No:2具有92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性。
本发明进一步涉及一种鉴定或选择携带有α-WOLF 8等位基因的菠菜植株的方法，包括确定在植株的基因组中编码序列或其部分的存在，其中所述序列按递增的优先顺序与SEQ ID No:3具有92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性。
本发明进一步涉及一种鉴定或选择携带有α-WOLF 8等位基因的菠菜植株的方法，包括确定在植株的基因组中编码序列或其部分的存在，其中所述序列按递增的优先顺序与SEQ ID No:4具有92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性。
确定菠菜植株的基因组中WOLF基因的至少一部分的基因组DNA或编码DNA序列可以使用本领域中已知的任何合适的分子生物学方法来进行，包括但不限于(基因组)PCR扩增接着进行Sanger测序、全基因组测序、转录组测序、序列特异性靶标俘获接着进行新一代测序(例如，使用Integrated DNA Technologies的靶标俘获系统)、包含LRR-结构域的基因序列的特异性扩增(例如，使用RenSeq方法，如US专利申请14/627116以及在Jupe等人,2013,Plant J.76:530-544中所述)接着进行测序，等等。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种鉴定或选择携带α-WOLF 8等位基因的植株的方法，包括确定编码如本文所定义的LRR结构域的DNA序列。
在所述方法的进一步实施方案中，α-WOLF 8等位基因的LRR结构域通过使用引物对扩增LRR结构域的基因组DNA区来确定。正向引物优选地是具有SEQ ID No:8的序列的核酸分子，反向引物优选地是具有SEQ ID No:9的序列的核酸分子。
本发明的另一个方面涉及一种制备包含对菠菜粉霜霉菌的抗性的菠菜植株的方法，所述方法包括：(a)将包含α-WOLF 8等位基因的植株与另一植株杂交；(b)任选地进行一轮或多轮自交和/或杂交；(c)任选地在每轮自交和/或杂交后选择包含α-WOLF 8等位基因的植株。
选择包含α-WOLF 8等位基因的植株可以从基因型的角度通过确定等位基因的基因组DNA序列的存在来完成，所述基因组DNA序列按递增的优先顺序与SEQ ID No:1具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性。
在另一个实施方案中，选择包含α-WOLF 8等位基因的植株可以从基因型的角度通过确定等位基因的编码序列的存在来完成，所述编码序列按递增的优先顺序与SEQ ID No:2具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性。
在另一个实施方案中，选择包含α-WOLF 8等位基因的植株可以从基因型的角度通过确定等位基因的编码序列的存在来完成，所述编码序列按递增的优先顺序与SEQ ID No:3具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性。
在另一个实施方案中，选择包含α-WOLF 8等位基因的植株可以从基因型的角度通过确定等位基因的编码序列的存在来完成，所述编码序列按递增的优先顺序与SEQ ID No:4具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性。
可选地，α-WOLF 8等位基因的存在可以从显表的角度通过在病害试验(例如如本文所述的试验)中测定植株，以及基于如本文所述和表1中所指示的抗性谱来鉴定携带α-WOLF 8等位基因的植株来确定。
本发明进一步涉及携带α-WOLF 8等位基因的菠菜植株在育种从而赋予针对菠菜粉霜霉菌的抗性中的应用。
本发明还涉及一种用于培育携带本发明的α-WOLF 8等位基因的菠菜植株的育种方法，其中使用包含所述等位基因的种质。能够生长成包含本发明的等位基因的植株并且是所述种质的代表的种子保藏于NCIMB，保藏号为NCIMB 42646。
在另一个方面，本发明涉及一种制备包含α-WOLF 8等位基因的菠菜植株的方法，所述方法包括：(a)将包含所述等位基因的植株与另一植株杂交；(b)任选地在F1中选择包含所述等位基因的植株；(c)任选地将所得的F1与优选的亲本回交并且在BC1F1中选择具有所述等位基因的植株；(d)任选地进行额外的一轮或多轮自交、杂交和/或回交，随后选择包含所述等位基因或显示与所述等位基因对应的抗性谱的植株。本发明还包括通过此方法制备的菠菜植株。
本发明还涉及收获的本发明的菠菜植株的叶子、包含天然形式或加工形式的收获的本发明的菠菜植株的叶子的食品。
菠菜叶子以包装形式销售，包括不限于经预先包装的菠菜叶子或经加工在包含所述叶子的沙拉中。对这样的包装的描述例如见美国专利号5,523,136，该专利提供了包装膜和来自该包装膜的包装，包括含有带叶产品的此类包装，以及制备和使用这样的包装膜和包装的方法，所述方法适合于与本发明的菠菜叶一起使用。因此，本发明涵盖制备和使用本发明的菠菜植株的叶子的应用和方法，以及来源于本发明的菠菜植株的叶子。
本发明进一步涉及一种容器，所述容器包括本发明的一种或多种植株，或来源于本发明的植株的一种或多种菠菜植株，所述植株处于用于来自所述植株的叶子收获物的生长基质中，处在家庭环境中。当植株处于待收获条件时，采用这种方式消费者可以挑拣非常新鲜的叶子用在沙拉中。
本发明还涉及代表性种子以保藏号NCIMB 42646保藏于NCIMB的菠菜植株在制备包含α-WOLF 8等位基因的菠菜植株中的应用。
在进一步的实施方案中，所述菠菜植株是杂交的、双单倍体的或近交的菠菜植株。
本发明的另一个方面是包含α-WOLF 8等位基因的细胞在制备显示对菠菜粉霜霉菌的抗性的菠菜植株中的应用。
本发明还涉及包含α-WOLF 8等位基因的组织培养物在制备显示对菠菜粉霜霉菌的抗性的菠菜植株中的应用。
抗性信息
表1.
由α-WOLF 8等位基因赋予的抗性谱。“-”意指针对特定的霜霉病小种的完全抗性；“(-)”意指针对特定的霜霉病小种的中等抗性；“+”意指该等位基因不赋予抗性并且将导致仅携带α-WOLF 8等位基因的植株对特定的霜霉病小种完全易感。
*由α-WOLF 8等位基因赋予的针对Pfs:5、Pfs:10和Pfs:16的中等抗性仅在纯合状态观察到。携带杂合状态的所述等位基因并且不携带任何其他赋予抗性的等位基因(即，携带β-WOLF 0等位基因)的植株对Pfs:5、Pfs:10和Pfs:16易感。
保藏信息
在基因组中包含本发明的α-WOLF 8等位基因的植株16R.58468的种子于2016年9月9日保藏于NCIMB Ltd(Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,AberdeenAB21 9YA,英国)，保藏登记号为42646。保藏物依照布达佩斯条约的条款制备。在专利授权后，对保藏物的所有限制将被解除，并且保藏物意在满足37CFR§1.801-1.809的要求。在专利授权后保藏物将不可撤销地且毫无限制或毫无条件地向公众发放。保藏物将在保藏机构维持持续30年的时期，或在最后一次请求后5年，或持续以该专利的有效期，以最长者为准，并且在该时期期间如有必要将被更换。
序列信息
表2.序列信息。
本发明将在下面的实施例中进一步阐明，所述实施例的提供仅用于说明目的并且不意在以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1
测试菠菜植株中对菠菜粉霜霉菌的抗性
如Irish等人(2008；Phytopathol.98:894-900)所述，使用差分集测定对霜霉病感染的抗性。本发明的菠菜植株与来自不同的其他基因型的菠菜植株(参见表3)一起播种在含有Scotts Redi-Earth培养基的托盘中，在出苗后用Osmocote Peter’s(13-13-13)肥料(Scotts)每周施肥两次。在第一真叶期用菠菜粉霜霉菌致病小种的孢子囊悬液(2.5×105个/ml)接种植株。以此方式，测试16个官方认可的致病小种。
将接种的植株放置在18℃、相对湿度100％的露珠箱中持续24小时的时期，然后移到18℃的生长箱中，以12小时的光周期持续6天。6天后，将植株返回至露珠箱持续24小时以诱发孢子形成，随后针对病害反应对它们进行评分。
基于萎黄病的症状以及子叶和真叶上的病原体孢子形成的征象，进行此专门试验的植株被评为有抗性、有中等抗性或易感，如Irish等人(2007；Plant Dis.91:1392-1396)所述。在此专门试验中显示没有萎黄病和孢子形成的迹象的植株被认为是有抗性。将有抗性的植株再接种以评估初步被评为有抗性的植株是否已经逃避感染，或是否它们是真的有抗性。显示仅有萎黄病的症状或仅在子叶的尖上发生孢子形成的植株被评为有中等抗性的。显示多于霜霉病感染的这些症状的植株被评为易感的。
表1显示了携带α-WOLF 8等位基因的植株对这些致病小种的每一种的抗性。表3显示了菠菜霜霉病小种和多个菠菜品种(杂交种)对这些致病小种中的每一个的抗性的差分集。易感反应被评为“+”(指示被霉菌成功感染，在整个子叶上发生孢子形成),有抗性被表示为“-”(在子叶上没有孢子形成)。弱抗性反应被标为“(-)”,实践中这意指稍低水平的感染(在差分幼苗试验中仅有萎黄病的症状，或仅在子叶的尖上发生孢子形成)。
表3
实施例2
对LRR结构域编码区的扩增
在聚合酶链式反应(PCR)中使用包含α-WOLF 8等位基因的菠菜植株(其种子的代表性样品保藏于NCIMB，NCIMB保藏号为42646)的分离的基因组DNA，所述聚合酶链式反应使用正向引物ACAAGTGGATGTGTCTTAGG(SEQ ID No:8)和反向引物TTCGCCCTCATCTTCCTGG(SEQID No:9)。该引物对扩增α-WOLF基因的LRR结构域编码区，并且已经被设计用于选择性地扩增WOLF基因的一部分，而不扩增其他CC-NBS-LRR蛋白编码基因的一部分。
使用具有SEQ ID No:8和SEQ ID No:9的引物扩增α-WOLF基因的LRR结构域编码区的PCR条件如下，使用Platinum Taq酶(Thermo Fisher Scientific):
-在95℃3分钟(初始变性步骤)
-40个扩增循环，每个循环由下列步骤组成：在95℃变性30秒，在60℃退火30秒，以及在72℃延伸30秒
-在72℃2分钟(最后延伸步骤)
在聚合酶链式反应(PCR)中使用包含β-WOLF 0等位基因的Viroflay品种的菠菜植株的分离的基因组DNA，所述聚合酶链式反应使用正向引物TCACGTGGGTTGTGTTGT(SEQ IDNo:10)和反向引物TTCGCCCTCATCTTCCTGG(SEQ ID No:9)。该引物对扩增β-WOLF基因的LRR结构域编码区，并且已经被设计用于选择性地扩增WOLF基因的一部分，而不扩增其他CC-NBS-LRR蛋白编码基因的一部分。
使用具有SEQ ID No:9和SEQ ID No:10的引物扩增β-WOLF基因的LRR结构域编码区的PCR条件如下，使用Platinum Taq酶(Thermo Fisher Scientific):
-在95℃3分钟(初始变性步骤)
-40个扩增循环，每个循环由下列步骤组成：在95℃变性30秒，在58℃退火50秒，以及在72℃延伸50秒
-在72℃2分钟(最后延伸步骤)
在琼脂糖凝胶上显现PCR产物(未显示)，从PCR反应纯化DNA。随后使用本领域中公知的方法确定PCR产物的序列。
在表2中由SEQ ID No:11提供由具有SEQ ID No:8和SEQ ID No:9的引物扩增的αWOLF 8等位基因的LRR结构域的序列。
在表2中由SEQ ID No:13提供由具有SEQ ID No:9和SEQ ID No:10的引物扩增的β-WOLF 0等位基因的LRR结构域的序列。
最后，将获得的序列翻译成LRR结构域的相应氨基酸序列，对α-WOLF 8等位基因和β-WOLF 0的所述氨基酸序列分别具有SEQ ID No:12和SEQ ID No:14(也参见表2)。
如果要使用SMRT测序仪(Pacific Biosciences)对PCR产物进行测序，则PCR引物和PCR条件是不同的。
向上述的正向引物中加入下列的标准扩增序列：GCAGTCGAACATGTAGCTGACTCAGGTCAC。
向反向引物中加入下列的标准扩增序列：TGGATCACTTGTGCAAGCATCACATCGTAG。
实施例3
在不携带α-WOLF 8等位基因的植株中引入该等位基因
将包含α-WOLF 8等位基因的菠菜植株(其种子的代表性样品保藏于NCIMB，NCIMB保藏号为42646)与携带β-WOLF 0等位基因的品种Viroflay的植株杂交，从而获得F1代。随后，将F1植株自交以获得F2群体。
如实施例1中所述测定F2群体的植株对菠菜粉霜霉菌pfs:15的抗性。在测定中大约75％的植株评为完全抗性。
分离同一F2群体的每个植株的基因组DNA并用于两个不同的聚合酶链式反应(PCR)中。第一个PCR反应使用用于扩增α-WOLF等位基因的LRR结构域的引物完成，第二个PCR反应使用用于扩增β-WOLF等位基因的LRR结构域的引物完成，两个反应均描述于实施例2中。
在琼脂糖凝胶上显现PCR产物(未显示)，这表明大约25％的植株仅含有α-WOLF片段，大约50％含有α-和β-WOLF片段两者，并且剩余的大约25％的植株仅含有β-WOLF片段。含有α-WOLF片段的植株与被评为对pfs:15有抗性的植株完全相关。仅包含β-WOLF片段的植株与被评为对pfs:15易感的植株完全相关。
从PCR反应纯化DNA，随后确定PCR产物的序列。α-WOLF PCR产物得到的序列与SEQID No:11的序列(α-WOLF 8等位基因的LRR结构域的基因组序列)对应。β-WOLF PCR产物得到的序列与SEQ ID No:13的序列(β-WOLF 0等位基因的LRR结构域的基因组序列)对应。
PCT/RO/134表

Claims (28)

1.一种命名为α-WOLF8的等位基因，所述等位基因当存在于菠菜植株中时赋予针对至少一个菠菜粉霜霉菌(Peronospora farinosa f.Sp.spinacea)小种的抗性，其中由所述等位基因编码的蛋白为CC-NBS-LRR蛋白，所述CC-NBS-LRR蛋白在其氨基酸序列中包含：a)在其N-末端处的基序“MAEIGYSVC”；和b)基序“KWMCLR”；并且其中所述蛋白的LRR结构域按递增的优先顺序与SEQ ID No:12具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性。
2.权利要求1所述的等位基因，其中所述等位基因当以纯合形式存在于菠菜植株中时，赋予针对菠菜粉霜霉菌小种pfs:1、pfs:2、pfs:6、pfs:8和pfs:15以及分离株US1508的完全抗性，赋予针对pfs:5、pfs:10和pfs:16的中等抗性，以及不赋予针对pfs:3、pfs:4、pfs:7、pfs:9、pfs:11、pfs:12、pfs:13和pfs:14的抗性。
3.权利要求1或2所述的等位基因，其中所述等位基因具有按递增的优先顺序与SEQ IDNo:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的基因组核苷酸序列。
4.权利要求1或2所述的等位基因，其中所述等位基因具有按递增的优先顺序与SEQ IDNo:2具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的编码序列。
5.权利要求1或2所述的等位基因，其中所述等位基因具有按递增的优先顺序与SEQ IDNo:3具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的编码序列。
6.权利要求1或2所述的等位基因，其中所述等位基因具有按递增的优先顺序与SEQ IDNo:4具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的编码序列。
7.权利要求1或2所述的等位基因，其中所述等位基因编码具有按递增的优先顺序与SEQ ID No:5具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的氨基酸序列的蛋白质。
8.权利要求1或2所述的等位基因，其中所述等位基因编码具有按递增的优先顺序与SEQ ID No:6具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的氨基酸序列的蛋白质。
9.权利要求1或2所述的等位基因，其中所述等位基因编码具有按递增的优先顺序与SEQ ID No:7具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的氨基酸序列的蛋白质。
10.一种包含权利要求1-9中任一项所述的等位基因的菠菜植株，所述菠菜植株的能够生长成为包含所述等位基因的植株的种子的代表性样品保藏于NCIMB，NCIMB保藏号为42646。
11.权利要求10所述的菠菜植株，其中所述植株是农艺优良植株。
12.权利要求11所述的菠菜植株，其中所述农艺优良植株是杂交种或近交系。
13.权利要求11所述的菠菜植株，其进一步包含产生针对菠菜粉霜霉菌小种pfs:1至pfs:16的抗性的遗传决定因子。
14.能够发育成权利要求10-13中任一项所定义的菠菜植株和/或来源于权利要求10-13中任一项所定义的菠菜植株的繁殖材料，其中所述繁殖材料包含权利要求1-9中任一项所述的等位基因，并且其中所述繁殖材料选自：小孢子、花粉、子房、胚珠、胚、胚囊、卵细胞、插条、根、根尖、下胚轴、子叶、茎、叶、花、花药、种子、分生细胞、原生质体、细胞或其组织培养物。
15.菠菜植株的细胞，所述细胞包含权利要求1-9中任一项所述的等位基因。
16.一种制备杂交菠菜种子的方法，所述方法包括将第一亲本菠菜植株与第二亲本菠菜植株杂交，并且收获所得的杂交菠菜种子，其中所述第一亲本菠菜植株包含权利要求1-9中任一项所述的等位基因。
17.权利要求16所述的方法，其中所述第一和/或第二亲本是近交系的植株。
18.一种由权利要求16或权利要求17所述的方法制备的种子长成的杂交菠菜植株。
19.鉴定或选择携带有权利要求1-9中任一项所述的等位基因的菠菜植株的方法，所述方法包括确定植株的基因组中基因组核苷酸序列或其部分的存在，其中所述序列按递增的优先顺序与SEQ ID No:1具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性。
20.鉴定或选择携带有权利要求1-4和7中任一项所述的等位基因的菠菜植株的方法，所述方法包括确定植株的基因组中基因组核苷酸序列或其部分的存在，其中所述序列按递增的优先顺序与SEQ ID No:2具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性。
21.鉴定或选择携带有权利要求1-3、5和8中任一项所述的等位基因的菠菜植株的方法，所述方法包括确定植株的基因组中基因组核苷酸序列或其部分的存在，其中所述序列按递增的优先顺序与SEQ ID No:3具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性。
22.鉴定或选择携带有权利要求1-3、6和9中任一项所述的等位基因的菠菜植株的方法，所述方法包括确定植株的基因组中基因组核苷酸序列或其部分的存在，其中所述序列按递增的优先顺序与SEQ ID No:4具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性。
23.权利要求19-22中任一项所述的方法，所述方法包括确定权利要求1中所定义的LRR结构域的存在。
24.权利要求23所述的方法，其中所述LRR结构域通过使用引物对扩增所述LRR结构域来确定，其中正向引物是具有SEQ ID No:8的序列的核酸分子。
25.权利要求23所述的方法，其中所述LRR结构域通过使用引物对扩增所述LRR结构域来确定，其中反向引物是具有SEQ ID No:9的序列的核酸分子。
26.包括正向引物和反向引物的引物对，其中所述正向引物是具有SEQ ID No:8的序列的核酸分子，所述反向引物是具有SEQ ID No:9的序列的核酸分子。
27.一种制备显示对菠菜粉霜霉菌的抗性的菠菜植株的方法，所述方法包括：(a)将包含权利要求1-9中任一项所述的等位基因的植株与另一植株杂交；(b)任选地进行一轮或多轮自交和/或杂交；(c)在一轮或多轮自交和/或杂交后选择包含权利要求1-9中任一项所述的等位基因的植株。
28.权利要求27所述的方法，其中对包含所述等位基因的植株的选择包括根据权利要求19-25中任一项所述的方法确定所述等位基因的存在。
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