CN101619360A - 大白菜抗霜霉病的分子标记检测方法及使用的引物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蔬菜分子遗传育种技术领域，尤其涉及一种利用分子标记技术准确、快速检测大白菜抗霜霉病的检测方法和该方法使用的引物。鉴定大白菜霜霉病抗性的引物，该引物由上游引物和下游引物组成，上游引物的序列为5’－GCCAACAAAATAGGCGAG－3’，下游引物的序列为5’－GAGTTGTAGAGCTTCCTAGCA－3’。本发明还公开了采用上述引物快速检测大白菜抗霜霉病的检测方法。本发明的有益效果为：简便易行、快速、特异性地检测，只需采集少量待检植株叶片0.2～0.3g，采用常规PCR技术，就可判断出所检测大白菜材料是否抗霜霉病，而无需在田间进行，不受天气影响，而且检测周期大大缩短。

Description

大白菜抗霜霉病的分子标记检测方法及使用的引物
技术领域
本发明涉及蔬菜分子遗传育种技术领域，尤其涉及一种利用分子标记技术准确、快速检测大白菜抗霜霉病的检测方法和该方法使用的引物。
技术背景
大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis(Lour)Olsson)霜霉病主要危害叶片，茎部、花梗。种荚亦可受害。叶片染病，初生边缘不甚明晰的水渍状褪绿斑，后病斑扩大，因受叶脉限制而呈多角形黄褐色病斑，叶背面则生白色稀疏霉层，湿度大时霉层更为明显。病情进一步发展时，多角形斑常连合成大斑块，终致叶片变褐干枯(朱志英，刘宝传，赵西文，许立春，大白菜霜霉病的发生与防治，北京农业[J]，2003，10：7)。施用农药对大白菜霜霉病的防治有一定的效果，但农药统治在生产上会造成农药残留。在人们普遍重视绿色无公害蔬菜的今天，采用抗霜霉病品种是解决白菜霜霉病危害的重要选择。传统抗病育种对霜霉病鉴定的这一重要环节不但工作量大、费用高、周期长，而且鉴定结果常常受到环境条件的影响。因此，大白菜育种和生产上急需一种能早期、周年、快速、准确鉴定大白菜霜霉病抗性的方法。
分子标记辅助育种(molecular marker-assisted selection，简称MAS)借助分子标记对育种材料从DNA水平上进行选择，从而可以快速选择得到具有目的性状的后代(方宣钧，吴为人，唐纪良。作物DNA标记辅助育种.北京：科学出版社，2001)。通过筛选与抗病基因紧密连锁的分子标记，可快速、稳定、可靠地对抗性基因进行筛选。因此，研究开发与大白菜霜霉病基因连锁的分子标记，可快速、稳定、可靠地对抗性基因进行筛选，加快抗病品种选育的进程。在大白菜抗霜霉病育种中极具应用价值。
于拴仓等(2009)获得一个与大白菜抗霜霉病一个主效QTL相距4.36cM的SSR标记并对其进行了定位(YU Sh C，Zhang F L，Yu R B，et al.Geneticmapping and localization of a major QTL for seedling resistance to downy mildew inChinese cabbage(Brassica rapa ssp.pekinensis)[J].Molecular Breeding，2009，23：573-590.)。我们对抗病亲本与感病亲本杂交的F2分离群体进行抗性鉴定，结果表明本发明中的大白菜霜霉病抗性是由单基因控制的，显性遗传。目前尚未见到单基因显性遗传的大白菜霜霉病抗性相关的分子标记研究报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有大白菜霜霉病抗性鉴定方法的不足，提供一种鉴定大白菜霜霉病抗性的引物序列。本发明的第二个目的是提供一种采用上述引物鉴定大白菜霜霉病抗性的方法。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
鉴定大白菜霜霉病抗性的引物，该引物由上游引物和下游引物组成，上游引物的序列为5’-GCCAACAAAATAGGCGAG-3’，下游引物的序列为5’-GAGTTGTAGAGCTTCCTAGCA-3’。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：
大白菜霜霉病抗性的分子标记检测方法，该方法包括如下步骤：
①提取大白菜基因组DNA；
②进行PCR扩增：在PCR管中加入步骤①提取的大白菜基因组DNA 15～30ng；上游引物0.1～0.4μM，上游引物的序列为5’-GCCAACAAAATAGGCGAG-3’；下游引物0.1～0.4μM，下游引物的序列为5’-GAGTTGTAGAGCTTCCTAGCA-3’；dNTP 0.15～0.5mM；Mg2+1.2～2.0mM；1倍的PCR缓冲液；Taq DNA聚合酶0.8～1.2单位，加无菌超纯水至15μL，进行扩增；
③PCR扩增产物的凝胶电泳分析：在步骤②的扩增产物中加入上样缓冲液，混匀，将混合物在0.8～1.2％琼脂糖凝胶进行电泳分离，至溴酚兰到达凝胶的2/3位置处停止电泳，凝胶经EB染色后用凝胶成像系统进行观察和/或照相；
④依据各被鉴定样品在凝胶上有无条带，鉴定大白菜霜霉病的抗性。
作为优选，上述的扩增条件为：94℃预变性120～180秒，94℃变性60秒，48～52℃退火30秒，72℃延伸45～90秒，25～35个循环，再72℃延伸300～420秒，扩增完成。
本发明的主要依据是：筛选并获得的了与大白菜抗霜霉病基因紧密连锁的DNA标记。研究表明大白菜的霜霉病抗性为质量性状，由单显性基因控制。所以，可通过检测大白菜基因组内是否存在与抗霜霉病基因紧密连锁的特异片段来确定其霜霉病抗性，即如果检测出特异片段，则说明被检植株为抗性株；如果没有检测出特异片段，则说明被植株为感病植株。
本发明的有益效果为：简便易行、快速、特异性地检测，只需采集少量待检植株叶片0.2～0.3g，采用常规PCR技术，就可判断出所检测大白菜材料是否抗霜霉病，而无需在田间进行，不受天气影响，而且检测周期大大缩短。
附图说明
图1为大白菜抗霜霉病特异片段扩增结果图，其中：
1：DNA Marker；2：抗病亲本；3：感病亲本；4-13：F2代抗病植株；14-23：F2代感病植株。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但以下描述不对本发明的保护范围构成任何意义上的限定。
(1)提取大白菜基因组DNA；
(2)进行PCR扩增，在PCR管(0.2mL无菌塑料管)中加入：所述大白菜基因组DNA 20ng；上游引物0.1μM，上游引物的序列为5’-GCCAACAAAATAGGCGAG-3’；下游引物0.1，下游引物的序列为5’-GAGTTGTAGAGCTTCCTAGCA-3’；dNTP 0.15mM；Mg2+1.2mM；1倍的PCR缓冲液；Taq DNA聚合酶0.8单位；加无菌超纯水至15μL；扩增条件为：94℃预变性120秒，94℃变性60秒，50℃退火30秒，72℃延伸45秒，30个循环，再72℃延伸300秒，扩增完成；
(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析：在扩增产物中加入上样缓冲液(0.25％溴酚兰+40％蔗糖)，混匀，将混合物在0.8～1.2％琼脂糖凝胶进行电泳分离，至溴酚兰到达凝胶的2/3位置处停止电泳，凝胶经EB染色后用凝胶成像系统进行观察、照相；
(4)依据各被鉴定样品在凝胶上有无条带，鉴定大白菜霜霉病的抗性。抗性植株能扩增出条带，感病植株无条带。
序列表
<110>浙江省农业科学院
<120>大白菜抗霜霉病的分子标记检测方法及使用的引物
<160>2
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>1
GCCAACAAAATAGGCGAG       18
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>2
GAGTTGTAGAGCTTCCTAGCA    21

Claims (3)

1.鉴定大白菜霜霉病抗性的引物，其特征在于：该引物由上游引物和下游引物组成，上游引物的序列为5’-GCCAACAAAATAGGCGAG-3’，下游引物的序列为5’-GAGTTGTAGAGCTTCCTAGCA-3’。
2.大白菜霜霉病抗性的分子标记检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
①提取大白菜基因组DNA；
②进行PCR扩增：在PCR管中加入步骤①提取的大白菜基因组DNA15～30ng、权利要求1所述的上游引物0.1～0.4μM、权利要求1所述的下游引物0.1～0.4μM、dNTP 0.15～0.5mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2单位，加无菌超纯水至15μL，进行扩增；
③PCR扩增产物的凝胶电泳分析：在步骤②的扩增产物中加入上样缓冲液，混匀，将混合物在0.8～1.2％琼脂糖凝胶进行电泳分离，至溴酚兰到达凝胶的2/3位置处停止电泳，凝胶经EB染色后用凝胶成像系统进行观察和/或照相；
④依据各被鉴定样品在凝胶上有无条带，鉴定大白菜霜霉病的抗性。
3.根据权利要求4所述的大白菜霜霉病抗性的分子标记检测方法，其特征在于扩增条件为：94℃预变性120～180秒，94℃变性60秒，48～52℃退火30秒，72℃延伸45～90秒，25～35个循环，再72℃延伸300～420秒，扩增完成。
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