CN106834527B - 与小麦幼苗纹枯病抗性qtl紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种与小麦幼苗纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记Xgwm635‑99及其应用，该分子标记是以小麦DNA为模板，以核苷酸序列如SEQ No.1和SEQ No.2所示的引物对进行PCR扩增后，再以12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后获得的大小为99bpDNA片段；Xgwm635‑99在室内就可通过检测分子标记对小麦幼苗的纹枯病抗性进行预测和筛选，淘汰感病植株，减少人力物力的浪费，提高育种效率。

Description

与小麦幼苗纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及小麦育种和分子生物学领域，特别是一种与小麦幼苗纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
小麦纹枯病是我国长江中下游麦区和黄淮麦区的小麦重要病害，主要由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis Vander Hoeven)等侵染引起，该病害造成小麦产量损失严重，仅2005年～2009年，我国每年遭受纹枯病为害的麦田面积约670～800万公顷，由此造成的经济损失在数十亿元以上。目前该病害的防治以化学防治为主，由于病害发生部位在小麦茎秆基部，防治不仅需药量大且防治效果易受天气等环境因素影响，化学防治也增加了农本，大规模使用化学药剂势必影响生态环境，培育和使用抗病品种无疑是防治小麦纹枯病最经济和有效的手段。
抗病品种的培育需要有抗性稳定的抗源用于配制杂交组合。近三十年来，我国研究人员对3000余份小麦种质材料进行了纹枯病抗性鉴定，虽筛选到一些抗源，但对这些抗源的抗性遗传规律知之甚少。
国外开展小麦纹枯病抗性的研究报道较少，对小麦纹枯病抗病基因(QTL)定位的报道主要集中在国内，利用牙签嵌入和沟播带菌病麦粒抗性鉴定方法，汤颋等(麦类作物学报,2004,24(4):11-16)采用重组自交系群体ARz/扬麦158，在2D、3B、3D和7D染色体上检测到纹枯病抗性QTL，分别解释纹枯病抗性的8％-14％；张小村等(植物遗传资源学报,2005,6(3):276-279)采用盆栽拌种接种方法鉴定重组自交系群体川35050/山农483的纹枯病抗性，QTL定位结果表明1A染色体存在抗纹枯病QTL，该QTL可解释21.57％的纹枯病抗性，同时检测到4对互作QTL，总贡献率为52.2％；采用鲁麦21/山农0431重组自交系群体，在2B染色体检测到与标记Xgwm526连锁的抗纹枯病QTL。任丽娟等(麦类作物学报,2007,27(3):416-420)利用牙签嵌入和表土接种等方法鉴定重组自交系群体苏麦3号/白免3号的纹枯病抗性，结合基因型资料，在染色体2B、3B、5A、6A和6B上发现抗纹枯病QTL，表型解释率分别为9％-13％；Chen等(Theoretical and Applied Genetics,2013,126(11):2865-2878)在1A、2B、3B、4A、5D、6B和7B染色体也发现存在纹枯病抗性QTL。蒋彦婕等(江苏农业学报,2014,30(6):1222-1226)采用牙签嵌入接种方法，对Niavt14/徐州25重组自交系群体进行纹枯病抗性QTL定位，在2B和7D染色体发现抗病QTL，QTL贡献率在5.46％-12.92％。这些研究都是针对成株期小麦纹枯病抗性的研究，有证据表明，小麦苗期和成株期纹枯病抗性没有显著的相关性(江苏农业学报,2017,33(1):61-66)，迄今为止，对小麦幼苗的纹枯病抗性QTL定位尚未见报道。
小麦的一生中，纹枯病发生呈“S”型曲线，两个发病高峰分别在苗期和拔节孕穗期(麦类作物学报,2007,27(6):1150-1153)，苗期主要造成烂芽和病苗死苗，拔节孕穗期主要造成花秆烂茎，直至枯白穗(安徽农业大学学报，1998,25(1):70-75)。研究发现，小麦产量损失与纹枯病病情严重度呈显著线性相关，严重度每提高一级，产量损失增加约10-20％左右。始病愈早，发病愈重，相应的产量损失愈大(江苏农业学报,1989,5(3):44-45)。孕穗期以前发病，产量损失25-40％，始穗后发病，产量损失一般小于20％(麦类作物学报,2007,27(6)：1150-1153)。因此，对小麦苗期纹枯病抗性的研究应引起足够重视，育种中若能对小麦苗期纹枯病抗性QTL进行辅助选择，可以有效减低由于小麦纹枯病危害造成的产量损失。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种检测小麦幼苗是否存在与小麦品种宁麦9号幼苗纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记，从而判断小麦幼苗是否含有纹枯病抗性QTL，从而预测小麦幼苗的纹枯病抗性，加快抗纹枯病小麦的选择进度，具体步骤如下：
一种与小麦幼苗纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记，所述分子标记是以小麦DNA为模板，以核苷酸序列如SEQ No.1和SEQ No.2所示的引物对进行PCR扩增后，再以12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后获得的DNA片段，申请人将其自命名为Xgwm635-99，其DNA片段大小为99bp。
优选的，本发明所述与小麦幼苗纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记，所述12％聚丙烯酰胺凝胶是指100ml聚丙烯酰胺胶溶液中含有11.6g丙烯酰胺和0.4g甲叉双丙烯酰胺；所述小麦DNA为模板是以小麦植株的叶片分离获取的DNA，优选4叶期以前的小麦植株。
优选的，本发明所述与小麦幼苗纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记，所使用的小麦DNA模板为宁麦9号。
一种本发明所述与小麦幼苗纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记在检测小麦品种或品系幼苗纹枯病抗性中的应用。
优选的，本发明所述与小麦幼苗纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记在检测小麦品种或品系幼苗纹枯病抗性中的应用中，其具体步骤为：将宁麦9号及其衍生品种或品系为父本或母本与其他小麦杂交并繁衍至F2代以上，小麦植株叶片DNA为模板，以SEQ No.1和SEQ No.2为引物进行PCR扩增，扩增产物在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，若电泳产物存在大小为99bp的所述分子标记Xgwm635-99，则预测该小麦植株具有纹枯病抗性，小麦幼苗纹枯病平均病级至少降低8％。
优选的，本发明所述与小麦幼苗纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记在检测小麦品种或品系幼苗纹枯病抗性中的应用中，所述宁麦9号及其衍生品种或品系是指：以宁麦9号为亲本，通过常规杂交或采用玉米与小麦杂交诱导单倍体，再用秋水仙素加倍获得双单倍体的小麦品种或品系。
本发明克服常规育种中小麦幼苗纹枯病抗性鉴定易受环境影响，并且只能在幼苗期鉴定筛选的缺点，在室内就可通过检测分子标记对小麦幼苗(4叶期以前的小麦植株)的纹枯病抗性进行预测和筛选，淘汰感病植株，减少人力物力的浪费，提高育种效率。
附图说明
图1为实施例1Xgwm635-99聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明技术方案做进一步说明。
实施例所涉及的引物对：
SEQ NO:15’TTCCTCACTGTAAGGGCGTT 3’；
SEQ NO:25’CAGCCTTAGCCTTGGCG 3’；
实施例所涉及的小麦样本来源：
宁麦9号为江苏省农业科学院粮食作物研究所通过扬麦6号与西风杂交选育而成的小麦品种，1997年通过江苏省品种审定，审定编号为苏种审字第283号。
实施例中自定义为G001～G148的品系是以宁麦9号为父本，以扬麦158为母本，杂交并繁衍至F6代的高代品系。
12％聚丙烯酰胺凝胶：100ml聚丙烯酰胺胶溶液中加入有11.6g丙烯酰胺和0.4g甲叉双丙烯酰胺。
实施例1
采用宁麦9号与扬麦158配制了重组自交系群体，通过该群体的基因型分析资料和幼苗纹枯病抗性鉴定资料的联合分析，发现分子标记Xgwm635-99与小麦幼苗纹枯病抗性紧密连锁。该标记可通过如下方法获得：
以CTAB的方法(PNAS,1984,81:8014-8018)提取宁麦9号叶片DNA。
采用下列反应体系和运行程序进行PCR扩增。
PCR反应体系：总体积20ul，包括10×buffer 2μl，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTPs，SEQNO:1和SEQ NO:2各0.25μM，模板DNA 50ng。
PCR运行程序：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共40个循环；最后72℃延伸5min。
PCR扩增产物加入3μl 10×Loading buffer，混匀，于12％聚丙烯酰胺凝胶加样5μl，400V电泳1小时，银染观察。结果见图1。图1中1-4泳道均为宁麦9号，泳道6和7为扬麦158；泳道5为20bp DNA分子量标准梯度，该条带从下至上分别为80bp、100bp、120bp、140bp、160bp、180bp和200bp。
泳道1箭头所指为标记宁麦9号扩增出的Xgwm635-99标记，大小为99bp，申请人将其自命名为Xgwm635-99；扬麦158扩增产物大小为93bp。
实施例2
1、预测G001～G148的品系抗性
(1)以CTAB的方法提取G001～G148的品系叶片DNA。
(2)以步骤(1)中获得的小麦DNA为模板，以SEQ NO:1和SEQ NO:2为引物进行PCR扩增。
PCR反应体系：总体积20μl，包括10×buffer 2μl，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTPs，SEQNO:1和SEQ NO:2各0.25μM，模板DNA 50ng。
PCR运行程序：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，共40个循环；最后72℃延伸5min。
(3)扩增产物在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，检查是否含有大小为99bp的Xgwm635-99分子标记,如含有Xgwm635-99分子标记，则可预测该小麦幼苗具有纹枯病抗性，小麦幼苗纹枯病平均病级至少降低8％。
2、在室内，根据文献(江苏农业学报,2017,33(1):61-66)提供的小麦幼苗纹枯病抗性室内鉴定方法，对G001～G148高代品系进行纹枯病抗性鉴定，病情严重度判定标准如下：1级是第1叶鞘病斑长度小于1.0cm，2级是第1叶鞘病斑长度为1.0～2.0cm，3级是第1叶鞘病斑长度大于2.0cm但幼苗未萎焉，4级是幼苗出现萎焉病症，5级是幼苗死亡。每个品系调查20株幼苗，重复2次，计算平均病级。
3、将步骤1利用Xgwm635-99分子标记检测结果与步骤2幼苗纹枯病抗性鉴定实际结果比对，结果见附表1：
表1 分子标记检测结果与幼苗纹枯病抗性鉴定结果比较
Figure BDA0001261563880000051
Figure BDA0001261563880000061
Figure BDA0001261563880000071
Figure BDA0001261563880000081
Figure BDA0001261563880000091
Figure BDA0001261563880000101
+：表示有Xgwm635-99分子标记；-：表示无Xgwm635-99分子标记
表1中，有Xgwm635-99分子标记的高代品系幼苗纹枯病平均病级为2.5，没有Xgwm635-99分子标记的高代品系幼苗纹枯病平均病级为3.0，表明具有Xgwm635-99分子标记的高代品系幼苗纹枯病抗性高，纹枯病平均病级比没有Xgwm635-99分子标记的高代品系幼苗纹枯病平均病级降低16.7％，预测结果与实测结果非常吻合。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 与小麦幼苗纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记及其应用
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttcctcactg taagggcgtt 20
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cagccttagc cttggcg 17

Claims (3)

1.与小麦幼苗纹枯病抗性QTL紧密连锁的分子标记在检测小麦品种或品系幼苗纹枯病抗性中的应用；
所述分子标记是以小麦DNA为模板，以核苷酸序列如SEQ No.1和SEQ No.2所示的引物对进行PCR扩增后，再以12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后获得的DNA片段，其大小为99bp。
2.如权利要求1所述的应用，其具体步骤为：将宁麦9号及其衍生品种或品系为父本或母本与其他小麦杂交并繁衍至F2代以上，再以小麦植株叶片DNA为模板，以SEQ No.1和SEQNo.2为引物进行PCR扩增，扩增产物在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，若电泳产物存在大小为99bp的所述分子标记，则预测该小麦植株具有纹枯病抗性。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述宁麦9号及其衍生品种或品系是指：以宁麦9号为亲本，通过常规杂交或采用玉米与小麦杂交诱导单倍体，再用秋水仙素加倍获得双单倍体的小麦品种或品系。
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