CN103667309B - 水稻抗褐飞虱基因Bph9及其分子标记和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了水稻抗褐飞虱基因Bph9及其分子标记和应用。其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其cDNA序列如SEQ ID No.2所示。Bph9基因定位于分子标记InD2和RM28466之间。与该基因紧密连锁的分子标记还有RM28438、InD28450、InD28453、InD14、InD28432、RM28481和RM28486之一，可用于筛选含有抗褐飞虱基因Bph9的水稻。Bph9基因属于NBS-LRR基因家族，编码的蛋白质与植物抗病性相关，通过遗传转化和杂交，将Bph9基因转入普通水稻品种，能够提高水稻对褐飞虱的抗性，从而减轻褐飞虱产生的危害，达到增产和稳产的目的。

Description

水稻抗褐飞虱基因Bph9及其分子标记和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种水稻抗褐飞虱基因Bph9，同时还涉及该基因的分子标记以及该基因及其分子标记在选育抗褐飞虱水稻及水稻种子中的应用。

背景技术

水稻是一种重要的粮食作物，世界上有超过一半的人以其为主食。同时，由于水稻基因组精细遗传图和物理图谱已完成，其转基因技术相对容易，并且与其它禾本科作物基因组具有共线性，因而被视做模式植物。随着包括水稻在内的多种生物基因组测序的完成，人类开始进入后基因组时代。全面开展功能基因组研究已成为生命科学的前沿领域。因此水稻功能基因的研究对社会经济发展和生物学研究具有重大意义。

粮食安全问题，是全世界人民面临的挑战。50、60年代的矮化育种和70年代的杂交水稻培育两次科技革命使水稻产量大幅度提高。褐飞虱是一种爆发力强、危害性大的水稻虫害。褐飞虱的成虫、若虫刺吸水稻汁液，引起黄叶或枯死，褐飞虱还传播或诱发多种水稻病害，导致减产或绝收。上世纪60年代以前，褐飞虱仅在我国局部稻区时有发生。其后，随着气候、环境、种植结构、耕作制度、栽培方式的变化，褐飞虱为害地域由南向北扩展，发生频次增加，危害程度加重。据中国农业年鉴记载，1966、1969、1973、1977、1983和2003年全国性大发生，1987、1991、2005、2006和2007年全国性特大发生，褐飞虱危害面积达到水稻总面积的50％以上，给我国水稻生产造成了严重的损失。目前我国每年水稻褐飞虱发生面积为2000万公顷以上，每年因褐飞虱危害造成的直接产量损失达280万吨以上。褐飞虱已对我国水稻生产安全形成严重威胁。

目前，褐飞虱已经成为我国水稻生产中的第一大虫害，对我国当前粮 食安全已形成严重威胁。长期以来，褐飞虱的防治主要是依靠施用化学杀虫剂。由于褐飞虱爆发多发生在水稻成熟灌浆期，此时稻株长势旺盛，将杀虫剂施到稻株基部的操作非常困难。事实上由于化学杀虫剂的连年大量施用，褐飞虱抗药性成倍增加，使药剂防治的效果有限。同时使用化学杀虫剂防治褐飞虱，一方面增加了农民的生产成本，另一方面化学杀虫剂还造成对非目标生物的毒杀、对环境和粮食污染等环境和生态问题。

褐飞虱连年持续爆发猖獗的内在原因是我国水稻品种大面积种植的主要水稻品种抗褐飞虱性能普遍差，加上杂交稻品种株型高大，中后期田间群体大，茎叶茂密，田间郁蔽度高，营养适宜，有利于褐飞虱快速繁殖，对褐飞虱等虫害表现为“超感虫性”，在虫源基数大、气候条件适宜时，极易形成爆发流行之势，造成严重危害(寒川，刘光杰等2003）。国际水稻研究所和东南亚的水稻生产实践证明，栽种的水稻品种即使只带有中等水平的抗性基因，也足以将褐飞虱的群体控制在造成危害的水平以下，不至于对水稻造成严重的危害和产量损失。因此，防控褐飞虱最为经济有效安全生态的措施是种植含抗褐飞虱基因的水稻品种。

水稻抗褐飞虱基因的研究始于上世纪70年代初。至今已经在普通栽培稻和野生稻资源中鉴定和定位了二十多个水稻抗褐飞虱的主效抗虫基因（具体综述见Jena等，2010.Current status of Brown Planthopper(BPH)resistance and genetics.Rice 2010(3),161-171）。如Bph1（Athwal et al.,1971;Hirabayashi and Ogawa,1995；Sharma et al.,2003;Cha et al.,2008),bph2（Athwal et al.,1971;Murata et al.,1998;Murai et al.,2001），Bph3(Lakshminarayana and Khush,1977;Jairin et al.,2007），bph4(Kawaguchi et al.,2001),bph5(Khush et al.,1991），Bph6(Kabir and Khush,1988;Qiu et al.,2010),bph7(Kabir and Khush,1988),bph8(Nemoto et al.,1989),Bph9((Nemoto et al.,1989;Muruta and Fujiwara,2001),Bph10(Ishii et al.,1994),Bph11(Takita,1996），bph12(Hirabayashi et al.,1998，1999），Bph13(t)(Liu et al.,2001），Bph14(Wang et al.,2001;Du et al.,2009)，Bph15(Huang et al., 2001;Yang et al 2004)，Bph17(Renganayaki et al.,2002），Bph18(t)(Jena et al.,2006），bph19(t)(Chen et al.,2006）,bph20（t）、bph21（t）、bph22（t）、bph23（t）、Bph24（t）(Li et al.,2006;李容柏等，2008）,Bph20、Bph21(Rahman et al 2009),Bph22(t)、Bph23(t)(Ram et al 2010),bph24(t)(Deen et al 2010),bph22(t)、bph23(t)(Hou et al 2011),Bph25(t)、Bph26(t)(Myint et al.2005;Yara et al.2010;Myint et al.2012)。其中，Bph14基因已经成功克隆，这是国际上首次利用图位克隆法分离得到的第一例水稻抗虫基因（Du et al 2009）。

图位克隆（map-based cloning）又称为定位克隆（positional cloning），是随着分子标记遗传连锁图谱的发展而发展起来的一种基因克隆技术。图位克隆法步骤包括对目标基因进行遗传定位、物理定位、序列分析及遗传转化验证功能。从理论上讲，任何一个能定位的基因都可用图位克隆法分离。图位克隆法一般适合于基因组比较小的物种，如单子叶模式植物水稻，具有基因组小、基因组物理距离与遗传距离之比小而且标记丰富的特点。水稻作为禾本科模式植物，其基因组是麦、高梁等七种禾本科植物基因组组成的同心圆的圆心，是最适合应用图位克隆法分离目的基因的作物之一。水稻中已经克隆的多个基因都是通过图位克隆法克隆的，如抗白叶枯病基因Xa-21（Song WY等1995,A Receptor Kinase-Like Protein Encoded by the Rice Disease Resistance Gene,Xa21.Science,270:1804-1806）、Xa-1（Yoshimura等1998,Expression of Xa-1,a bacterial blight-resistance gene in rice,is induced by bacterial inoculation.PNAS，95:1663-1668）和Xa-26（Sun等2004,Xa26 a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice,encodes an LRR receptor kinase-like protein.Plant Journal,37:517-527），抗稻瘟病基因Pi-b（Wang等1999,The Pi-b gene for rice blast resistance belongs to the nucleotide binding and leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes.Plant Journal,1999,19:55-64）和Pi-ta（Bryan等2000,A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible  alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta.Plant Cell,12:2033~2046），我国科学家克隆的分蘖基因（Li等2003,Control of tillering in rice.Nature 422:618-621）、耐盐基因（Ren等2005，A rice quantitative trait locus for salt tolerance encodes a sodium transporter.Nature Genetics 37(10):1141-1146）和高产基因（Weiya Xue等2008，Natural variation in Ghd7is an important regulator of heading date and yield potential in rice.Nature Genetics 40,761-767），以及应用图位克隆法分离得到的第一例水稻抗虫基因（Du等2009，Identification and characterization of Bph14,a gene conferring resistance to brown planthopper in rice.PNAS,106:22163-22168）。

发明内容

本发明目的在于提供一种水稻抗褐飞虱的基因Bph9及其应用。

本发明另一目的是提供一种抗褐飞虱基因Bph9的分子标记及其应用。

本发明采用遗传学的方法，构建水稻抗褐飞虱的分离群体，利用图位克隆的方法，分离到水稻抗褐飞虱基因Bph9。通过共分离标记检测表明该基因与抗褐飞虱性能是共分离的，通过遗传转化Bph9基因，使感性水稻出现抗褐飞虱的表型，证实了该基因的功能。

本发明提供一种分离的多核苷酸，其具有水稻抗褐飞虱基因Bph9序列，所述序列是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或该序列经替换、缺失或增加一个或多个核苷酸，且编码相同或相似，且具有相同功能的氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明提供一种分离的多核苷酸，其具有水稻抗褐飞虱基因Bph9的cDNA序列，所述序列是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或该序列经替换、缺失或增加一个或多个核苷酸，且编码相同或相似,且具有相同功能的氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明提供的分离的多核苷酸，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供的Bph9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因全长15628bp，具有2个内含子和3个外显子，其CDS分别为区段分别为 2963-4073、6373-6996和12663-14960，cDNA全长4042bp，编码1206个氨基酸，其蛋白序列如序列表SEQ ID NO.3所示。该蛋白属于NBS-LRR家族，活性中心175-322区段为保守的NB-ARC区、392-672区段为保守的NB-ARC区（包括P-loop NTPase、AAA ATPase domain）、822-873区段为Leucine rich repeat（LRR，富亮氨酸重复）。

应当理解，在不影响Bph9蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本领域技术人员可对SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。

此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的多核苷酸序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的多核苷酸序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码具有相同功能蛋白的核苷酸序列。

本发明提供的上述多核苷酸片段其与一个同源或异源启动子序列可操纵地连接。

本发明还包括基于所述多核苷酸的正义序列或反义序列，包括含有所述多核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化的植物细胞和转基因植物。

其中所述植物是单子叶植物。

其中所述单子叶植物是水稻。

本发明提供了上述多核苷酸在水稻选育中的应用。

本发明提供了上述多核苷酸在提高水稻抗褐飞虱抗性中的应用

本发明提供了上述多核苷酸在制备转基因抗褐飞虱水稻中的应用。

本发明提供一种培育具有褐飞虱抗性的植物的方法，包括：

1)用多核苷酸转化植物细胞；所述多核苷酸含有水稻抗褐飞虱Bph9基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；

2)将被转化的植物细胞再生为植株；

3)培养再生的植株并使上述多核苷酸得到表达。

本发明还提供一种产生具有褐飞虱抗性的植物的方法，所述方法包括将具有褐飞虱抗性基因Bph9的植物与其他植物杂交产生具有褐飞虱抗性的子代植株。

其中所述植物是单子叶植物。

优选地，所述植物是水稻。

本领域技术人员应能理解，根据本发明公开的序列来设计或产生分子标记可用于抗褐飞虱水稻的选育工作。

本发明同时还提供与抗褐飞虱主效基因Bph9连锁的分子标记，其为

RM28438标记引物：

正向引物序列GTTCGTGAGCCACAACAAATCC

反向引物序列GTTAAATGCTCCACCAAACACACC

或InD28450标记引物：

正向引物序列GGTTGGAAAAGAAGCGATCA

反向引物序列GCATCRTAAGGTTGCCATCA

或InD28453标记引物：

正向引物序列GGCAAAGACAAGCCATAAGC

反向引物序列ATCCATCAGCAATGACACGA

或InD28432标记引物：

正向引物序列TGCAGACACCACATGCATAA

反向引物序列ACGCATACACACAGGGACAA

或InD2标记引物：

正向引物序列AACAGACACGTTGCGTCTTG

反向引物序列CTTGCCGCTTAGAGGAGATG

或InD14标记引物：

正向引物序列CCACTCTGAAAATCCCAAGC

反向引物序列ACCAGTTAAGTCACGCTCAAA

或RM28466标记引物：

正向引物序列CCGACGAAGAAGACGAGGAGTAGCC

反向引物序列AGGCCGGAGAGCAATCATGTCG

或RM28481标记引物：

正向引物序列GTCAATTAACCATTGCCCATGC

反向引物序列TTCACGTGGGAACTACTCATGC

或RM28486标记引物：

正向引物序列TTCTCTGAATGCCCTGTCTCTCC

反向引物序列GGCAAATCAGAACAAGTCTCACC，

用上述标记引物扩增水稻基因组DNA，如果用引物RM28438能够扩增出213bp的扩增片段，或者用引物InD28450能够扩增出221bp的扩增片段，或者用引物InD28453能够扩增出323bp的扩增片段，或者用引物InD28432能够扩增出320bp的扩增片段，或者用引物InD2能够扩增出241bp的扩增片段，或者用引物InD14能够扩增出397bp的扩增片段，或者用引物RM28466能够扩增出85bp的扩增片段，或者用引物RM28481能够扩增出237bp的扩增片段，或者用引物RM28486能够扩增出161bp的扩增片段，均标志着水稻品种抗褐飞虱主效基因位点Bph9的存在。因此，分子标记RM28438、InD28450、InD28453、InD28432、InD2、InD14、RM28466、RM28481、RM28486能用于筛选含有抗褐飞虱基因Bph9的抗褐飞虱水稻。

本发明还提供了另一个水稻抗褐飞虱基因Bph9的分子标记，其由InDel分子标记IR2引物经PCR扩增获得，该引物为：

正向引物序列AGGATGGGGAGAAGAAGACG，

反向引物序列GTGTTCCTTGTCGGGTGTA。

本发明还提供与水稻抗褐飞虱抗性相关的分子标记，其为

RM28438标记引物：

正向引物序列GTTCGTGAGCCACAACAAATCC

反向引物序列GTTAAATGCTCCACCAAACACACC

或InD28450标记引物：

正向引物序列GGTTGGAAAAGAAGCGATCA

反向引物序列GCATCRTAAGGTTGCCATCA

或InD28453标记引物：

正向引物序列GGCAAAGACAAGCCATAAGC

反向引物序列ATCCATCAGCAATGACACGA

或InD28432标记引物：

正向引物序列TGCAGACACCACATGCATAA

反向引物序列ACGCATACACACAGGGACAA

或InD2标记引物：

正向引物序列AACAGACACGTTGCGTCTTG

反向引物序列CTTGCCGCTTAGAGGAGATG

或InD14标记引物：

正向引物序列CCACTCTGAAAATCCCAAGC

反向引物序列ACCAGTTAAGTCACGCTCAAA

或RM28466标记引物：

正向引物序列CCGACGAAGAAGACGAGGAGTAGCC

反向引物序列AGGCCGGAGAGCAATCATGTCG

或RM28481标记引物：

正向引物序列GTCAATTAACCATTGCCCATGC

反向引物序列TTCACGTGGGAACTACTCATGC

或RM28486标记引物：

正向引物序列TTCTCTGAATGCCCTGTCTCTCC

反向引物序列GGCAAATCAGAACAAGTCTCACC，

或IR2标记引物：

正向引物序列AGGATGGGGAGAAGAAGACG，

反向引物序列GTGTTCCTTGTCGGGTGTA。

本发明还提供了上述分子标记在选育抗褐飞虱水稻中的应用。

本发明提供了水稻抗褐飞虱基因bph9的分子标记方法，其通过下述之一的引物对扩增待检水稻基因组DNA，并检测扩增产物：

1）标记引物，RM28438标记引物：

正向引物序列GTTCGTGAGCCACAACAAATCC

反向引物序列GTTAAATGCTCCACCAAACACACC

2）标记引物，InD28450标记引物：

正向引物序列GGTTGGAAAAGAAGCGATCA

反向引物序列GCATCRTAAGGTTGCCATCA

3）标记引物，InD28453标记引物：

正向引物序列GGCAAAGACAAGCCATAAGC

反向引物序列ATCCATCAGCAATGACACGA

4）标记引物，InD28432标记引物：

正向引物序列TGCAGACACCACATGCATAA

反向引物序列ACGCATACACACAGGGACAA

5）标记引物，InD2标记引物：

正向引物序列AACAGACACGTTGCGTCTTG

反向引物序列CTTGCCGCTTAGAGGAGATG

6）标记引物，InD14标记引物：

正向引物序列CCACTCTGAAAATCCCAAGC

反向引物序列ACCAGTTAAGTCACGCTCAAA

7）标记引物，RM28466标记引物：

正向引物序列CCGACGAAGAAGACGAGGAGTAGCC

反向引物序列AGGCCGGAGAGCAATCATGTCG

8）标记引物，RM28481标记引物：

正向引物序列GTCAATTAACCATTGCCCATGC

反向引物序列TTCACGTGGGAACTACTCATGC

9）标记引物，RM28486标记引物：

正向引物序列TTCTCTGAATGCCCTGTCTCTCC

反向引物序列GGCAAATCAGAACAAGTCTCACC，

10）标记引物，IR2标记引物：

正向引物序列AGGATGGGGAGAAGAAGACG，

反向引物序列GTGTTCCTTGTCGGGTGTA，

如果用引物RM28438能够扩增出213bp的扩增片段，或者用引物InD28450能够扩增出221bp的扩增片段，或者用引物InD28453能够扩增出323bp的扩增片段，或者用引物InD28432能够扩增出320bp的扩增片段，或者用引物InD2能够扩增出241bp的扩增片段，或者用引物InD14能够扩增出397bp的扩增片段，或者用引物RM28466能够扩增出85bp的扩增片段，或者用引物RM28481能够扩增出237bp的扩增片段，或者用引物RM28486能够扩增出161bp的扩增片段，或者用引物IR2能够扩增出228bp的扩增片段，则标志着水稻品种抗褐飞虱基因位点Bph9的存在。

本发明还提供了一种筛选抗褐飞虱水稻的方法，其用上述的引物对之一进行PCR方法扩增待检水稻基因组DNA，如果用引物RM28438能够扩增出213bp的扩增片段，或者用引物InD28450能够扩增出221bp的扩增片段，或者用引物InD28453能够扩增出323bp的扩增片段，或者用引物InD28432能够扩增出320bp的扩增片段，或者用引物InD2能够扩增出241bp的扩增片段，或者用引物InD14能够扩增出397bp的扩增片段，或者用引物RM28466能够扩增出85bp的扩增片段，或者用引物RM28481能够扩增出237bp的扩增片段，或者用引物RM28486能够扩增出161bp的扩增片段，或者用引物IR2能够扩增出228bp的扩增片段，则标志着水稻品种对褐飞虱抗性的存在。

本发明通过如下步骤克隆得到Bph9基因：

1．创建定位群体。利用抗褐飞虱水稻与普通水稻品种杂交，F₁代自交 获得F₂群体，作为抗褐飞虱基因定位群体。

2.抗褐飞虱鉴定。苗期集团法鉴定定位群体的抗褐飞虱性能。从F₂代植株上收获种子，每份F₂代植株收获的种子于秧盘中播种20棵苗(称为1个家系)。2叶1心期，放入2-4龄的褐飞虱若虫（10头/株），记录各家系的受害情况，每份材料重复3次实验。根据抗虫鉴定结果，对定位群体株系的进行了抗虫级别的划分。

3.抗褐飞虱基因定位。用PCR（polymerase chain reaction）和聚丙烯酰胺凝胶电泳，以及RFLP标记和Southern杂交的方法，检测F₂各个单株的SSR和RFLP分子标记的分离情况，结合相应各家系的抗虫级别，应用JoinMap3.0和MapQTL5.0软件，构建水稻第12染色体的分子标记遗传连锁图，将Bph9定位在分子标记RM28438和RM28486之间。

4.加密目标区段分子标记与精细定位。根据国际水稻基因组计划公布的水稻基因组序列，设计第12染色体Bph9所在目标区段的SSR标记和InDel标记的引物，用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测标记在BC₂F2大群体中的分离，通过筛选得到的重组单株的表型与基因型的关系，将抗褐飞虱基因Bph9定位在分子标记InD2和InD18之间，与标记InD14紧密连锁。

5.候选基因确定。构建了含抗褐飞虱基因Bph9的抗性亲本水稻材料（Pokkali，IRGC 108921）基因组Fosmid文库，通过定位区间分子标记进行PCR筛选，得到了覆盖Bph9定位区间的阳性克隆，以双脱氧终止法（Sanger法）进行大片段测序，得到Bph9所在区段的基因组序列，应用RiceGAAS软件预测基因，并通过与日本晴和9311序列作对比分析，确定Bph9的候选基因。

6.根据序列设计引物进一步做共分离检测。根据Bph9候选基因序列设计引物，用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法对BC₃F2大群体进行检测，这些引物对应的标记与抗褐飞虱的表现型共分离，筛选得到了抗褐飞虱的水稻株系。

7.全长cDNA克隆。根据预测的cDNA序列，以3’末端的序列设计引物，从抗褐飞虱水稻的cDNA中扩得1692bp片段，以该段序列设计引物，通过RACE（cDNA末端快速扩增技术）得到了cDNA的3’端和5’端序列，最终获得Bph9的全长cDNA。

然而，本领域技术人员应当理解，根据本发明公开的Bph9的核苷酸序列，通过设计恰当的PCR引物，即可从抗褐飞虱水稻基因组中扩增得到Bph9基因。

8.遗传转化Bph9基因验证其功能。根据Fosmid基因组文库筛选及测序结果，采用SalI和NcoI双酶切Bph9基因所在Fosmid克隆所得3026bp片段作为Bph9基因启动子区域（NcoI位点处为Bph9基因翻译起始密码子）。

利用NcoI和XhoI双酶切Bph9基因全长cDNA克隆获得3346bp片段，包括了Bph9基因大部分ORF区域，也包括了其第3个外显子的大部分（XhoI位点位于第3外显子末端）。Bph9基因组序列长15628bp，具有2个内含子和3个外显子。其ORF长为3621bp，在3344bp处有一XhoI位点，同时该XhoI位点位于第3外显子末端。利用XhoI和EcoRI双酶切Bph9基因所在Fosmid克隆获得了1291bp的片段，该片段包括了第3个外显子XhoI位点后的部分、及Bph9基因转录终止子区域。将以上片段通过3段连接方式连入pGEM T easy载体的NcoI和EcoRI位点。用NcoI和EcoRI双酶切切出的4637bp片段即包括了Bph9基因的完整ORF及其转录终止子区域。

将以上SalI和NcoI双酶切所得Bph9基因启动子区域（3026bp片段）、NcoI和EcoRI双酶切所得Bph9基因完整ORF及转录终止子区域（4637bp片段），通过3段连接方式连入pCAMBIA1301的SalI和EcoRI位点。测序验证无误后，所得载体即为Bph9基因遗传转化载体(利用其启动子区域、完整ORF、及其转录终止子区域)，将其电转入农杆菌EHA105中。

采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将Bph9基因载体（利用其启动子区域、完整ORF、及其转录终止子区域）导入正常籼稻品种Kasalath 中，最后获得Bph9阳性植株15株。用T₁代Bph9转基因植株采用苗期集团法进行了抗虫鉴定，结果表明对照水稻Kasalath全部死亡，转基因阳性植株存活，抗虫级别为2-3级，证实Bph9基因具有抗褐飞虱的功能。因此，抗褐飞虱基因Bph9可以在水稻中应用也可以在水稻种子中应用，培育具有抗褐飞虱性能的水稻品种。

本发明的优点和效果：

1．本基因的成功克隆进一步证实了图位克隆法克隆水稻重要基因的可靠性，该方法克隆的基因其功能明确、效果好。

2．水稻中多个编码具有NBS结构蛋白的基因虽已被克隆，但大多与抗病性有关，本发明克隆的Bph9基因具有明显的抗褐飞虱性能，这对全面理解该类基因的生物学功能有重要意义。

3．除Bph14基因在2009年得到克隆外，国际上尚未克隆出其它的水稻抗褐飞虱基因，对水稻抗褐飞虱的分子机理仍不清楚。而本发明克隆的Bph9基因能够显著提高水稻对褐飞虱的抗性，这对水稻抗褐飞虱的分子机理研究将有极大的推动作用。

4．Bph9使水稻抗褐飞虱性能大大提高，通过遗传转化或杂交将Bph9应用于水稻育种中，可以改善水稻品种的抗褐飞虱性，从而减轻褐飞虱的为害，达到增产和稳产的目的。

5．刺吸式昆虫是农业生产中的一大类虫害，Bph9基因克隆和抗褐飞虱功能证实，对于其他植物的抗刺吸式昆虫研究具有重要参考作用。

附图说明

图1为苗期集团法鉴定F_2:3家系中的抗虫植株和感虫植株结果图。图中所示P09-1至P09-16为抗褐飞虱亲本Pokkali（IRGC 108921，含抗褐飞虱基因Bph9）与褐飞虱感性水稻品种扬稻6号（93-11）杂交构建了含Bph9的F₂群体中每个F₂单株通过自交收种获得相应的F_2:3家系。褐飞虱危害7天后，对照感性品种台中本地1号（TN1）明显死亡，图中显示P09-1、P09-2、P09-8、P09-11、P09-12、P09-13 F_2:3家系在褐飞虱危害后存活，植 株生长健康，为抗虫植株，图中所示P09-7、P09-9、P09-10 F_2:3家系在褐飞虱危害后死亡，为感虫植株。

图2为SSR标记RM28486检测单株的电泳图。前两个泳道分别为抗虫亲本Pokkali（IRGC 108921）和感虫亲本扬稻6号（93-11），后面为Pokkali与扬稻6号杂交构建的F₂₃家系。如图显示，用与抗褐飞虱基因Bph9连锁的SSR标记RM28486能特异扩增出161bp片段的第2、3、5、6、8、10、12、14、15、18、19、20、21、23号F₂₃家系对褐飞虱均表现出抗虫性，而不能扩出161bp特异性片段的第1、4、7、9、11、13、16、17、22、24号F₂₃家系对褐飞虱均表现出感虫性。

图3为Bph9在水稻染色体的定位图。A：Bph9初步定位结果。染色体上边为标记名称，数值是标记间的遗传距离（cM），QTL扫描结果表明在分子标记RM28486和RM28438之间有一个最大的LOD值44.1，RM28486和RM28438相距1.7cM。n代表F₂定位群体单株数。

B：分子标记RM28486和RM28438间重组单株筛选结果。整合分子标记分析及抗褐飞虱表型结果Bph9精细定位在分子标记InD2和RM28466之间，与标记InD14共分离。分子标记下的数字代表相邻两个分子标记之间重组单株数。n代表用于重组单株筛选的BC₂F₂群体单株数。

C：InD2和RM28466之间的物理图谱，Bph9位于InD2和RM28466间约68kb的区域。19和544-22为相互重叠覆盖标记InD2和RM28466区间的Fosmid克隆。

图4为Bph9基因自身启动子、自身完整ORF、及其自身转录终止子区域转化载体转基因植株抗褐飞虱鉴定结果图。1、9代表感虫对照品种TN1，2代表抗性亲本Pokkali（IRGC 108921），3、5、7代表感虫对照品种Kasalath，4、6、8分别代表Bph9基因自身启动子、自身完整ORF、及其自身转录终止子区域转化载体转基因株系POK1、POK2和POK3。苗期集团法放虫前（上图）和放虫后7天（下图）的比较，对照感性品种Kasalath与TN1明显死亡，而抗性亲本Pokkali（IRGC 108921）与转基因株系POK1、POK2 和POK3仍然存活，植株生长健康。

图5为Bph9基因基因组互补载体转基因植株抗褐飞虱鉴定结果图。T0代转基因植株与感虫对照品种TN1按对角线移栽，移栽后4株组成一个类正方形形状，其中1、4代表感虫对照品种TN1，2代表Bph9基因基因组互补载体阳性T0代转基因植株PGK1，3代表Bph9基因基因组互补载体阳性转基因植株T0代PGK2。进入分蘖期后，接入100头2-3龄褐飞虱若虫，接入褐飞虱28天后，感虫对照品种TN1整株死亡，Bph9基因基因组互补载体阳性转基因植株PGK1、PGK2仍然存活，生长健康，无叶片受害。

图6为根据Bph9基因组序列开发的功能性分子标记IR2（属于InDel标记）示例，其扩增片段长度为228bp。图中1代表携带抗褐飞虱基因Bph9的抗虫亲本Pokkali（IRGC 108921），2代表感虫材料扬稻6号（93-11），3代表利用功能性分子标记IR2从Pokkali与扬稻6号回交后代中筛选出的携带抗褐飞虱基因Bph9的材料（该材料抗褐飞虱）。

图7为分子标记辅助选择培育带有Bph9基因的抗褐飞虱水稻图。苗期抗褐飞虱鉴定，虫源为武汉田间褐飞虱群体。图中1、5、9代表感虫对照品种TN1，2、6代表抗性亲本Pokkali（IRGC 108921），3、7代表感虫材料扬稻6号（93-11），4、8代表珞扬9号（扬稻6号遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph9）。苗期集团法放虫前和放虫后7天的比较，其中，上图为放虫前，下图为防虫7天后，对照感性品种TN1与受体亲本扬稻6号明显死亡，而抗性亲本Pokkali（IRGC 108921）与珞扬9号（扬稻6号遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph9）仍然存活，植株生长健康。

图8为分子标记辅助选择培育带有Bph9基因的抗褐飞虱水稻图。苗期抗褐飞虱鉴定，虫源为褐飞虱生物型I、生物型II及生物型III。上图为虫源为褐飞虱生物型I、中图为生物型II及下图为生物型III。图中1、6代表感虫对照品种TN1，2、4代表珞扬9号（扬稻6号遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph9），3、5代表感虫材料扬稻6号（93-11）。放虫后感性受体亲本扬稻6号和台中本地1号明显死亡，而珞扬9号（扬稻6号遗传背景携 带抗褐飞虱基因Bph9）仍然存活，植株生长健康。

图9为分子标记辅助选择培育带有Bph9基因的抗褐飞虱水稻图。近分蘖期抗褐飞虱鉴定，虫源为武汉田间褐飞虱群体。放虫后感性受体亲本扬稻6号和台中本地1号明显死亡，而珞扬9号（扬稻6号遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph9）仍然存活，植株生长健康。

图10为分子标记辅助选择培育带有Bph9基因的抗褐飞虱水稻图。成熟期抗褐飞虱鉴定，虫源为武汉田间褐飞虱群体，放虫后感性受体亲本扬稻6号明显死亡，茎秆枯萎。而珞扬9号（扬稻6号遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph9）仍然存活，茎秆挺拔，植株生长健康。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 Bph9基因的定位克隆及连锁分子标记开发

1.Bph9初步定位结果

抗褐飞虱亲本Pokkali（IRGC 108921，含抗褐飞虱基因Bph9）与褐飞虱感性水稻品种扬稻6号（93-11）杂交构建了含Bph9的F₂群体，93-11和Pokkali（IRGC 108921）均来自中国农业科学院作物科学研究所国家农作物种质保存中心，并用CTAB法（Murray MG&Thompson，1980 Rapid isolation of high-molecular-weight plant DNA.Nucleic Acids Res 8:4321-4325）提取亲本及F₂群体各单株的基因组DNA。每个F₂单株通过自交收种获得相应的F_2:3家系。为了鉴定F₂定位群体中每个单株的抗褐飞虱表型，采用了苗期集团法考察F2:3家系各个单株的抗性表现（见图1），以F_2:3家系抗性级别代表F₂单株的抗褐飞虱表型。为确保亲本和F_2:3群体中的每个家系生长一致，所有供试材料在播种前分别浸种催芽。每个家系 （品种）各60粒种子播种于一个长58cm、宽38cm、高9cm，且盛有7cm厚营养土的面包盒中。每盒每个材料播种3个重复，其中随机播种亲本和TN1(感性对照)各3个重复。播种7天后间苗，淘汰病弱苗。待苗长到两叶一心期时，按8头/苗的比例接种2-3龄褐飞虱若虫，最后罩上尼龙纱网。当感虫品种TN1（台中本地1号）全部死亡时，参照Huang等（Huang Z et al，2001 Identification and mapping of two brown planthopper resistance genes in rice.Theor.Appl.Genet.102,929–934）的方法对每个单株进行0、1、3、5、7或9级的抗性评价（表1），对亲本材料和群体的每个家系通过加权平均计算该家系的抗性级别，并根据抗性级别推测此单株基因型。

表1抗感褐飞虱鉴定分级标准

苗期集团法鉴定结果显示Pokkali（IRGC 108921）和9311的抗虫级别分别为1.9和8.8，这表明Pokkali（IRGC 108921）抗褐飞虱而9311感褐飞虱。135个F_2:3家系对褐飞虱的抗虫级别频率分布呈连续分布，最小为2.1，最大为9.0。根据对褐飞虱的抗虫级别将F_2:3家系分为抗虫、抗感分离和感虫三种表型，而相应的F₂单株的基因型则分别记为RR（纯合抗虫）、Rr（杂合抗虫）和rr（纯合感虫）三种。F₂群体对褐飞虱的抗感分离符合1:2:1的比例（χ²=1.31，χ² _0.05，1=3.84）（表2）。

表2  9311/Pokkali F₂分离群体135个单株对褐飞虱抗感分离比

^aRR，纯合抗虫；Rr杂合抗虫；rr，纯合感虫；^b1RR:2Rr:1rr适合性检测值χ²=1.31， χ² _0.05，1=3.84；^c抗虫级别值：RS，Resistance Score（抗虫级别）

根据Gramene网站（http://www.gramene.org/）公布的标记按照较均匀的遗传距离在每条染色体上选择一定数目SSR分子标记。另外，基于该基因最后的定位区段，比较水稻品种9311及日本晴相应的基因组序列，利用SSR搜索工具SSRIT（http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool）来寻找SSR基序，并根据其侧翼序列设计引物，为备选标记。其中，SSRIT设置参数为：最大基序长度为4聚体，最小重复数为5，搜索所有的SSR基序。选择所有大于15个碱基（基序长度×重复数）的SSR基序。同时根据公共数据库中水稻品种9311及日本晴相应的基因组序列，利用PowerBlast软件，寻找基因组序列中存在的插入\缺失位点，利用Primer Premier 5.0软件开发InDel标记。

SSR标记的分析参照Temnykh的方法（Temnykh S et al，2000.Mapping and genome organization of microsatellite sequences in rice.Theor Appl Genet100：697-712）。10μl反应体系包括：10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，50μM dNTPs，0.2μM引物，0.5U Taq polymerase和20ng DNA模板。扩增反应在PTC-100PCR仪上进行：94℃2min；94℃15sec，55℃30sec，72℃1.5min，35个循环；72℃5min。扩增产物用6%的非变性PAGE胶分离，通过银染显色（Zhu et al,2004.Identification and characterization of a new blast resistance gene located on rice chromosome 1through linkage and differential analyses.Phytipathology 94:515-519）。扩增的DNA条带利用装有荧光灯的灯箱进行观察。记录结果，亲本间有多态的引物在F₂群体中进行分析，获取群体基因型资料。

根据F_2:3家系的抗虫级别，分别选择10个极端抗虫单株和10个极端感虫单株的DNA混合构建抗感池。同时，利用在亲本间有多态性的引物分别筛选抗感池并获得在抗感池之间有多态性的分子标记，该类多态性标记表明与抗性是连锁的。然后，根据连锁标记所在的染色体，选择该染色体上在亲本间有多态性的引物筛选F₂分离群体的各个单株，PCR程序同上， 获得群体基因型资料。根据连锁交换规律，利用软件JoinMap 3.0将群体基因型资料构建水稻的部分遗传图谱并获得各分子标记的遗传距离。最后，结合F₂群体各个单株的分子标记基因型资料和相应的褐飞虱抗性鉴定的抗虫级别，利用MapQTL 5.0软件复合区间作图法，对目标染色体进行QTL位点扫描。结果表明第12染色体长臂RM28486和RM28438间存在一个QTL位点，LOD值为44.1，贡献率为77.8%，该QTL所在的分子标记RM28486和RM28438相距1.7cM（见图3A）。RM28486和RM28438在F₂群体的选择正确率可以达到98%－99%。

2.Bph9的精细定位

由于RM28486和RM28438之间物理距离较大，在测序的粳稻品种日本晴上相距约520kb，在测序的籼稻品种9311上相距约450kb。为了寻找与Bph9连锁更紧密的标记，根据QTL的定位结果，本发明用PCR（polymerase chain reaction）和聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，以两侧的SSR标记RM28486和RM28438筛选了3000株BC₂F₂群体单株，获得两个标记间发生重组的单株32棵。

根据SSR标记RM28486和RM28438区段公共数据库中水稻品种9311及日本晴相应的基因组序列，利用SSR搜索工具SSRIT（http://www.gramene.org/db/markers/ssrtool）来寻找SSR基序，并根据其侧翼序列设计引物，为备选标记。同时利用PowerBlast软件，寻找基因组序列中存在的插入\缺失位点，利用Primer Premier 5.0软件开发InDel标记。用这些新开发的SSR标记、InDel标记对RM28486和RM28438两个标记间发生重组的32颗单株进行分子标记加密，构建饱和连锁图谱，并结合重组单株的抗虫鉴定结果，最后将Bph9定位于InD2和RM28466之间，与标记InD14紧密连锁（见表3、图3B）。

表3 分子标记筛选的BC₂F₂、BC₃F₂部分重组单株的基因型及表现型

^a93-11和Pokkali（IRGC 108921）是两个亲本材料，其余为部分重组单株；^b从表中，可以看到分子标记InD14与抗虫表型是共分离的。R代表抗性亲本Pokkali（IRGC108921）的基因型及表型，S代表感虫亲本9311的基因型及表型，H代表杂合基因型及表型。

3．抗褐飞虱基因Bph9连锁分子标记

在测序的日本晴品种中，标记InD2和RM28466之间的物理距离为129kb；在测序的籼稻品种9311中，标记InD2和RM28466之间的物理距离为113kb。因此，利用图3B中饱和连锁图谱内分子标记即是用：

标记引物RM28438，

正向引物序列，GTTCGTGAGCCACAACAAATCC

反向引物序列，GTTAAATGCTCCACCAAACACACC

或者用标记引物InD28450，

正向引物序列，GGTTGGAAAAGAAGCGATCA

反向引物序列，GCATCRTAAGGTTGCCATCA

或者用标记引物InD28453，

正向引物序列，GGCAAAGACAAGCCATAAGC

反向引物序列，ATCCATCAGCAATGACACGA

或者用标记引物InD28432，

正向引物序列，TGCAGACACCACATGCATAA

反向引物序列，ACGCATACACACAGGGACAA

或者用标记引物InD2，

正向引物序列，AACAGACACGTTGCGTCTTG

反向引物序列，CTTGCCGCTTAGAGGAGATG

或者用标记引物InD14，

正向引物序列，CCACTCTGAAAATCCCAAGC

反向引物序列，ACCAGTTAAGTCACGCTCAAA

或者用标记引物RM28466，

正向引物序列，CCGACGAAGAAGACGAGGAGTAGCC

反向引物序列，AGGCCGGAGAGCAATCATGTCG

或者用标记引物RM28481，

正向引物序列，GTCAATTAACCATTGCCCATGC

反向引物序列，TTCACGTGGGAACTACTCATGC

或者用标记引物RM28486，

正向引物序列，TTCTCTGAATGCCCTGTCTCTCC

反向引物序列，GGCAAATCAGAACAAGTCTCACC，

扩增水稻抗褐飞虱品种或者育种材料DNA，如果用引物RM28438能够扩增出213bp的扩增片段，或者用引物InD28450能够扩增出221bp的扩增片段，或者用引物InD28453能够扩增出323bp的扩增片段，或者用引物InD28432能够扩增出320bp的扩增片段，或者用引物InD2能够扩增出241bp的扩增片段，或者用引物InD14能够扩增出397bp的扩增片段，或者用引物RM28466能够扩增出85bp的扩增片段，或者用引物RM28481能够扩增出237bp的扩增片段，或者用引物RM28486能够扩增出161bp的扩增片段，均标志着水稻抗褐飞虱主效基因位点Bph9的存在。因此，利用本发明提供的上述分子标记方法来鉴定Bph9抗性基因的存在具有非常高的效率，可以预测水稻植株的褐飞虱抗性，加快抗褐飞虱水稻品种育种进程。

4．抗褐飞虱水稻基因组文库的构建

植物高分子量基因组DNA的制备参照张洪斌等的方法（Zhang等，Preparation of megabase DNA from plant nuclei.Plant J 1995,7,175-184）。提取抗褐飞虱亲本Pokkali（IRGC 108921，含抗褐飞虱基因Bph9，来自中国 农业科学院作物科学研究所国家农作物种质保存中心）嫩叶细胞核，用低熔点琼脂糖包埋法提取基因组DNA。用物理方法将基因组DNA进行片段化处理，用CHEF Mapper脉冲电泳仪进行交变脉冲电泳分离片段化的DNA并切胶回收38kbp-48kbp之间的DNA片段。对回收的DNA片段进行末端平滑化和磷酸化处理后，再次通过脉冲电泳回收。将250ng回收后的DNA片段、500ng pCC1FOS（EPICENTRE公司产品）载体，加入T4DNA连接酶，在4℃下连接过夜。取10微升连接反应液加入至25微升冰上融化的Maxplax Lambda packaging Extracts（EPICENTRE公司产品）中，30℃下包装90分钟。再加入25微升Maxplax Lambda packaging Extracts 30℃下包装90分钟。加入噬菌体稀释缓冲液（Phage Dilution Buffer配制）至1毫升。温和混匀。每管加入25微升氯仿。温和混匀后4℃保藏。将包装成功的噬菌体微粒用噬菌体稀释液进行稀释，再转染宿主菌EPI300-T1R（EPICENTRE公司产品），37℃温育20分钟，再涂布到含有12.5微克/毫升氯霉素的LB平板上去，37℃过夜培养，挑取Copycontrol Fosmid克隆。从平板中随机选取16个白色单菌落，培养提取DNA、NotI酶切后脉冲电泳确认插入片断的长度，结果表明16个DNA平均长度大于35kbp，插入率100%，符合文库的要求。将以每孔随机选取约100个单克隆的量进行96孔clon-pool板制作，共制作12板，-80℃保存，文库构建完毕。

5.Fosmid基因组文库筛选及Bph9定位区段序列分析

利用Bph9精细定位区间特异性分子标记对Fosmid基因组文库进行筛选，对筛选得到的阳性克隆进行末端测序确定阳性克隆重叠关系，最终确定两个阳性克隆544-22和19覆盖了整个Bph9精细定位区间（分子标记InD2和RM28466区段）。将Fosmid克隆544-22和19的全序列进行了测序分析，最终得到Bph9定位区间的全序列，即分子标记InD2至RM28466之间的序列，长约68kb。以该全序列作为目标搜索NCBI数据库，得到日本晴基因组在该区段的同源序列。用FGENESH进行基因预测和注解，同样用ClustalW进行比较分析（表4）。

表4 Bph9基因区段抗虫水稻预测基因与日本晴预测基因的比较

比较两者预测的基因，发现抗虫亲本Pokkali（IRGC 108921）Bph9定位区域共有8个预测基因，其中有4个为转座子相关蛋白（表4 Pokkali预测基因g3、g4、g6、g7）、1个编码序列很短的基因（表4 Pokkali预测基因g5）、1个代谢相关基因（表4 Pokkali预测基因g1 Lipoxygenase）、2个抗性基因（表4 Pokkali预测基因g2、g8）。根据基因性质，目前均认为刺吸式昆虫吸食水稻与病原菌对水稻的侵染过程类似，水稻抗刺吸式昆虫的机理就有可能和抗病原菌相同。因此将上述2个抗性基因（表4 Pokkali预测基因g2、g8）作为抗褐飞虱基因Bph9的候选基因，但其中一个预测的抗性基因未能检测到其表达（表4 Pokkali预测基因g2），最终主要将另外一个抗性基因（表4 Pokkali预测基因g8）作为Bph9重点候选基因，其序 列如SEQ ID NO.1所示。

6.RACE获得全长cDNA

以抗褐飞虱亲本Pokkali（IRGC 108921，含抗褐飞虱基因Bph9，来自中国农业科学院作物科学研究所国家农作物种质保存中心）叶鞘总RNA反转录产物为模板，根据基因预测结果设计引物（TPT203,GATCTCAGTGTGGGGAATGG，RR376-1，AGAGCGACAAGGGCAGATAA），扩增出候选基因的一段cDNA序列。通过该序列设计引物，使用TaKaRa公司5’与3’Full RACE试剂盒，获得了该候选基因5’末端及3’末端序列，确定了候选基因的转录起始位点及终止位点，并拼接出该基因的全长cDNA序列。根据全长cDNA序列重新合成引物，扩增获得Bph9的全长cDNA，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，其中第1-64bp为5UTR非翻译区，第3686-4042bp为3UTR非翻译区。

7.水稻抗褐飞虱基因Bph9克隆后，根据Bph9基因的基因组序列和cDNA序列，可设计多对SSR标记或STS标记的引物。如根据Bph9基因所在的基因组序列，与测序水稻品种9311及日本晴相应的基因组序列进行比对，可开发出InDel标记IR2(正向引物序列AGGATGGGGAGAAGAAGACG，反向引物序列GTGTTCCTTGTCGGGTGTA)来选育携带抗褐飞虱基因Bph9具有抗虫功能的水稻，其扩增片段长度为228bp（图5）。提取抗虫水稻，感虫品种以及其杂交、回交后代植株的基因组DNA，应用Bph9基因序列设计的引物PCR扩增后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，进行分子标记检测。杂交后代植株中与抗虫水稻PCR带型一致者（扩增产物中含有228bp的片段），即为选择出来的含有Bph9基因的植株，通过不断回交、农艺性状选择，即可培育成抗褐飞虱的水稻。

实施例2 Bph9基因的功能验证和应用

1．遗传转化载体的构建

（1）Bph9基因自身启动子、自身完整ORF、及其自身转录终止子区域 转化载体的构建。所用载体为pCAMBIA1301（购自澳大利Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture），采用SalI和EcoRI双酶切pCAMBIA1301载体，以将外源片段连入pCAMBIA1301的SalI和EcoRI位点。

根据Fosmid基因组文库筛选及测序结果，采用SalI和NcoI双酶切Bph9基因所在Fosmid克隆所得3026bp片段作为Bph9基因启动子区域（NcoI位点处为Bph9基因翻译起始密码子）。

利用NcoI和XhoI双酶切Bph9基因全长cDNA克隆获得3346bp片段，包括了Bph9基因大部分ORF区域，也包括了其第3个外显子的大部分（XhoI位点位于第3外显子末端）。Bph9基因组序列长15628bp，具有2个内含子和3个外显子。其ORF长为3621bp，在3344bp处有一XhoI位点，同时该XhoI位点位于第3外显子末端。利用XhoI和EcoRI双酶切Bph9基因所在Fosmid克隆获得了1291bp的片段，该片段包括了第3个外显子XhoI位点后的部分、及Bph9基因转录终止子区域。将NcoI和XhoI双酶切Bph9基因全长cDNA克隆获得的3346bp片段、以及XhoI和EcoRI双酶切Bph9基因所在Fosmid克隆获得的1291bp片段，通过3段连接方式连入pGEM T easy载体的NcoI和EcoRI位点。用NcoI和EcoRI双酶切切出的4637bp片段即包括了Bph9基因的完整ORF及其转录终止子区域。

将以上SalI和NcoI双酶切所得Bph9基因启动子区域（3026bp片段）、NcoI和EcoRI双酶切所得Bph9基因完整ORF及转录终止子区域（4637bp片段），通过3段连接方式连入pCAMBIA1301的SalI和EcoRI位点。测序验证无误后，所得载体即为Bph9基因遗传转化载体(利用其启动子区域、完整ORF、及其转录终止子区域)，将其电转入农杆菌EHA105中。挑取单克隆扩大培养，采用Bph9基因特异引物（RSP1：AGGGCTACCTCATTGTGCTG,PCR1：CCTTTTCGCTTCGGTAGACA）进行PCR验证无误后，加等体积的50％甘油混匀，－70℃保存备用。

（2）Bph9基因基因组互补载体构建   所用骨架载体为pCAMBIA1301（购自澳大利亚Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture），将GFP（绿色荧光蛋白）基因连入pCAMBIA1301 NcoI和PmlI位点，取代pCAMBIA1301载体上的GUS报告基因，形成载体pCAMBIA1301（GFP）。

根据Fosmid基因组文库筛选及测序结果，采用SalI和KpnI双酶切Bph9基因所在Fosmid克隆得到2366bp片段；采用KpnI和EcoRI双酶切Bph9基因所在Fosmid克隆得到13257bp片段；以上两片段包括了Bph9基因所在的基因组序列（含启动子区域、基因编码区、转录终止子区域），将上述两片段顺序连入载体pCAMBIA1301（GFP）SalI和KpnI位点、KpnI和EcoRI位点所得载体即为Bph9基因基因组互补载体。将其电转入农杆菌EHA105中。挑取单克隆扩大培养，采用Bph9基因特异引物IR2(正向引物序列AGGATGGGGAGAAGAAGACG，反向引物序列GTGTTCCTTGTCGGGTGTA)进行PCR验证无误后，加等体积的50％甘油混匀，－70℃保存备用。

2．遗传转化

采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法（Hiei等，1994，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant Journal 6:271-282）将上述Bph9基因遗传转化载体(自身启动子、自身完整ORF、及其自身转录终止子区域转化载体;基因组互补载体)导入褐飞虱感性的普通水稻品种Kasalath（购自国家水稻种质资源库或国际水稻研究所）。

3．Bph9基因转基因功能验证

Bph9基因自身启动子、自身完整ORF、及其自身转录终止子区域遗传转化载体获得阳性转基因植株15株（分别命名为POK1、POK2、POK3、POK4、POK5、POK6、POK7、POK8、POK9、POK10、POK11、POK12、POK13、POK14、POK15）。收获种子后，用T₁代Bph9转基因植株，采用苗期集团法进行了抗虫鉴定。如图4所示，对阳性转基因株系POK1、POK2、 POK3进行了抗褐飞虱鉴定。因水稻转基因植株后代中外源基因会符合孟德尔分离规律发生分离，单拷贝转基因植株T₁代植株中有1/4植株不含外源转基因。本例中对POK1、POK2、POK3 T₁代转基因植株采用苗期集团法抗虫鉴定时，先将转基因株系POK1、POK2、POK3 T₁代单独播种，待苗长到一叶一心期时，对转基因株系POK1、POK2、POK3 T₁代转基因植株各自提取DNA，采用Bph9基因特异引物（RSP1：AGGGCTACCTCATTGTGCTG，PCR1：CCTTTTCGCTTCGGTAGACA）从T₁代转基因植株中鉴定出阳性植株，再与感虫亲本TN1、感虫转基因受体材料Kasalath、抗褐飞虱亲本Pokkali移至新的面包盒中，待苗长到两叶一心期时，按8头/苗的比例接种2-3龄褐飞虱若虫，进行褐飞虱抗性鉴定。鉴定结果如图4所示，接入褐飞虱7天后，感虫对照品种TN1以及感虫转基因受体材料Kasalath整株死亡，抗褐飞虱亲本Pokkali植株生长健康，无叶片受害。Bph9基因遗传转化载体获得阳性转基因植株POK1、POK2、POK3也生长健康，无叶片受害，抗虫级别为2-3级，证实Bph9基因具有抗褐飞虱的功能。因此，抗褐飞虱基因Bph9可以在水稻中应用也可以在水稻种子中应用，培育具有抗褐飞虱性能的水稻品种。

Bph9基因基因组互补载体获得阳性转基因植株20株（分别命名为PGK1、PGK2、PGK3、PGK4、PGK5、PGK6、PGK7、PGK8、PGK9、PGK10、PGK11、PGK12、PGK13、PGK14、PGK15、PGK16、PGK17、PGK18、PGK19、PGK20）。对部分T₀代转基因植株，在进入分蘖期后，进行了褐飞虱抗性鉴定。在一个盆栽桶里移栽材料PGK1、PGK2及感虫对照品种TN1(台中本地1号)，植株按对角线移栽，移栽后4株组成一个类正方形形状（图5），待植株进入分蘖期后，接入100头2-3龄褐飞虱若虫，进行褐飞虱抗性鉴定。鉴定结果如图5所示，接入褐飞虱28天后，感虫对照品种TN1整株死亡，Bph9基因基因组互补载体获得阳性转基因植株PGK1、PGK2生长健康，无叶片受害，同Bph9基因自身启动子、自身完整ORF、及其自身转录终止子区域遗传转化载体抗虫鉴定结果，证实Bph9基因具有抗褐飞 虱的功能。

实施例3分子标记的验证

1、材料和方法

1.1材料：抗褐飞虱亲本Pokkali（IRGC 108921，含抗褐飞虱基因Bph9）、褐飞虱感性水稻品种扬稻6号（93-11）及Pokkali与扬稻6号杂交构建的F₂₃家系，93-11和Pokkali均来自中国农业科学院作物科学研究所国家农作物种质保存中心。

分子标记引物：InD2、RM28466、RM28438、InD28450、InD28453、InD14、InD28432、RM28481和RM28486，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.4-21所示。

1.2方法

CTAB抽提法提取水稻样品基因组DNA。分别用引物InD2、RM28466、RM28438、InD28450、InD28453、InD 14、InD28432、RM28481和RM28486扩增样品DNA。10μl体系。10μl反应体系包括：10×PCR缓冲液，1.0μl；10mM dNTPs，0.1μl；10μM引物，0.4μl；5U/μl Taq DNA聚合酶，0.2μl和50ng DNA模板。扩增反应在Bioer PCR仪上进行：94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃40s，32个循环；72℃5min。扩增产物用8%的非变性PAGE胶分离，电泳后用硝酸银银染法染色后读图分析。

2、结果：用上述方法，分别对水稻品种Pokkali、扬稻6号、Pokkali与扬稻6号杂交构建的24份F₂₃家系进行扩增。结果表明，在Pokkali与扬稻6号杂交构建的F₂₃家系中，利用InD2、RM28466、RM28438、InD28450、InD28453、InD14、InD28432、RM28481和RM28486分子标记引物能分别扩增出相应的241bp片段、85bp片段、213bp片段、221bp片段、323bp片段、397bp片段、320bp片段、237bp片段和161bp片段的F₂₃家系对褐飞虱均表现出抗虫性（如原图2用分子标记引物RM28486能扩增出161bp特异性片段的第2、3、5、6、8、10、12、14、15、18、19、20、21、23号材料），结果与阳性对照Pokkali一致。而不能扩出上述特异性片段的 Pokkali与扬稻6号杂交构建的F₂₃家系对褐飞虱均表现出感虫性（如原图2用分子标记引物RM28486不能扩增出161bp特异性片段的第1、4、7、9、11、13、16、17、22、24号材料）。

由此说明，本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有抗褐飞虱基因Bph9，从而大大提高育种效率。

实施例4分子标记辅助选择带有Bph9基因的抗褐飞虱水稻

本例中利用上述分子标记进行分子标记辅助选择选育出携带Bph9基因的抗褐飞虱水稻珞扬9号，具体实施如下：抗褐飞虱亲本Pokkali（IRGC108921，含抗褐飞虱基因Bph9）与褐飞虱感性水稻品种扬稻6号（93-11）杂交F₁，用扬稻6号进行回交，利用与Bph9连锁的分子标记（RM28438、RM28486）对BC₁F₁进行筛选，筛选出含抗褐飞虱基因Bph9的BC₁F₁用扬稻6号进行回交，得到BC₂F₁；利用与Bph9连锁的分子标记（RM28438、RM28486）对BC₂F₁进行筛选，筛选出含抗褐飞虱基因Bph9的BC₂F₁用扬稻6号进行回交，得到BC₃F₁；利用与Bph9连锁的分子标记（RM28438、RM28486）对BC₃F₁进行筛选，筛选出含抗褐飞虱基因Bph9的BC₃F₁用扬稻6号进行回交，得到BC₄F₁；利用与Bph9连锁的分子标记（RM28438、RM28486）对BC₄F₁进行筛选，筛选出含抗褐飞虱基因Bph9的BC₄F₁用扬稻6号进行回交，得到BC₅F₁；利用与Bph9连锁的分子标记（RM28438、RM28486）对BC₅F₁进行筛选，筛选出含抗褐飞虱基因Bph9的BC₅F₁用扬稻6号进行回交，得到BC₆F₁；利用与Bph9连锁的分子标记（RM28438、RM28486）对BC₆F₁进行筛选，筛选出含抗褐飞虱基因Bph9的BC₂F₁用扬稻6号进行回交，得到BC₇F₁；利用与Bph9连锁的分子标记（RM28438、RM28486）对BC₇F₁进行筛选，筛选得到含Bph9基因的BC₇F₁，并利用分子标记（见表5）进行全基因组扫描，选择只在抗褐飞虱基因Bph9位点与扬稻6号存在差异，其余位点均被替换为扬稻6号背景的BC₇F₁进行加代，利用与Bph9连锁的分子标记（RM28438、RM28486）筛选出抗褐飞虱基因Bph9位点纯合的扬稻6号/Pokkali（IRGC 108921）//扬稻6号BC₇F₂， 进行加代繁殖，该材料在农艺性状表型上与扬稻6号无区别，但其含有抗褐飞虱基因Bph9,将此材料暂命名为珞扬9号。利用武汉田间褐飞虱群体进行苗期集团法鉴定、近分蘖期鉴定及成熟期鉴定确认其抗褐飞虱（见图7）。同时利用褐飞虱生物型I、生物型II及生物型III进行苗期集团法鉴定，结果显示放虫后7天，对照感性品种TN1与受体亲本扬稻6号明显死亡，而珞扬9号（扬稻6号遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph9）仍然存活，植株生长健康（图8）。利用武汉田间褐飞虱群体进行近分蘖期鉴定及成熟期鉴定确认其抗褐飞虱（见图9、图10）。目前，珞扬9号已申报水稻品种权。

对于表5中任何一个分子标记，单株的带型与抗褐飞虱亲本Pokkali（IRGC 108921）一致时记为1，与扬稻6号（93-11）一致时记为2，同时具有两个亲本的带型即杂合带型记为3。分子标记筛选结果表明BC7F1只在抗褐飞虱基因Bph9位点（RM28481与RM28438区间）与扬稻6号存在差异，其余位点均被替换为扬稻6号遗传背景。

表5以下分子标记进行水稻品种全基因组扫描结果

Claims (13)

1.一种分离的多核苷酸，其为水稻抗褐飞虱基因Bph9，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种分离的多核苷酸，其为水稻抗褐飞虱基因Bph9的cDNA序列，其序列是SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.权利要求1~2任一所述的多核苷酸编码的蛋白。

4.如权利要求3所述的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.含有权利要求1~2任一所述多核苷酸的载体。

6.含有权利要求5所述载体的非动植物品种的宿主。

7.权利要求1~2任一所述多核苷酸在水稻选育中的应用。

8.权利要求1~2任一所述多核苷酸在提高水稻抗褐飞虱抗性中的应用。

9.权利要求1~2任一所述多核苷酸在制备转基因抗褐飞虱水稻中的应用。

10.水稻抗褐飞虱基因Bph9的分子标记，所述水稻抗褐飞虱基因Bph9的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，以抗褐飞虱亲本Pokkali为模板，其可由下述引物对经PCR扩增获得： 

IR2标记引物：

正向引物序列AGGATGGGGAGAAGAAGACG，

反向引物序列GTGTTCCTTGTCGGGTGTA；该IR2标记引物的扩增长度为228bp。

11.权利要求10所述分子标记在选育抗褐飞虱水稻中的应用。

12.水稻抗褐飞虱基因Bph9的分子标记方法，所述水稻抗褐飞虱基因Bph9的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其通过下述引物对扩增待检水稻基因组DNA，并检测扩增产物：

所述引物对为IR2标记引物：

正向引物序列AGGATGGGGAGAAGAAGACG，

反向引物序列GTGTTCCTTGTCGGGTGTA，

如果能够扩增出228bp的扩增片段，则标志着水稻品种抗褐飞虱基因位点Bph9的存在。

13.一种筛选抗褐飞虱水稻的方法，其用权利要求10中所述的分子标记PCR扩增待检水稻基因组DNA，如果若扩增出228bp的扩增片段，则标志着水稻品种对褐飞虱抗性的存在。