CN107365870B - 一种水稻基因定位与分子育种的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种水稻基因定位与分子育种的方法，涉及水稻基因定位和育种技术领域，所述方法包括以下步骤：(1)选择亲本杂交、自交，构建F2群体定位；(2)考察单株的表型性状和基因型；(3)进行常规连锁分析；(4)选择杂合态的单株，筛选交换株；(5)进行迭代作图，将目标基因定位在不大于5cM以内；(6)进行精细定位或分子育种，利用目标区域杂合态的单株，继续自交，得到2000株的持续F2群体定位，发展精细定位的标记，将目标基因定位在100kb以内；(7)以分子育种为目标，利用与目标基因连锁的分子标记，进行分子标记辅助选择育种。本发明省时高效，用以解决目前水稻功能基因研究和分子育种对基因快速定位的迫切需求。

Description

一种水稻基因定位与分子育种的方法
技术领域
本发明涉及水稻基因定位和育种技术领域，特别涉及一种水稻基因定位与分子育种的方法。
背景技术
自从21世纪初，水稻籼、粳亚种全基因组测序完成之后，水稻从QTL定位转向了功能基因组学研究，开始深层次地挖掘基因的功能、探索基因间的调控网络和遗传机制，为进一步更有效地开展水稻分子育种打下了坚实的基础。近年来，基因组重测序技术的快速发展，使水稻基因组、转录组、蛋白组，甚至是表观组学的研究都取得了突飞猛进的发展，水稻分子育种也随之取得了很大成就，但自始至终，表型组学的研究进展缓慢，其制约的原因主要是数量性状受多基因控制、与环境等众多因素密切相关，表型性状极其复杂。目前，市场上不断出现一些机械辅助表型采集的设备，相对提高了表型研究的效率，但很难应对性状差异较大的不同单株的群体，因此，效果始终很难提高，特别是对于那些精度要求较高、基因效应较弱的性状，较粗放的表型数据不但无效，反而会产生错误的结果，因此，寻求更快速、准确的基因定位方法，可大大提高基因的功能研究和分子育种的效率。
目前，基因定位的方法主要有初级作图群体，如F2群体，次级作图群体，如重组自交系群体，高级作图群体，如近等基因系(包括剩余杂合系)和染色体(单)片段代换系群体等，其中F2群体使用的最为广泛，在所有基因定位的作物上都基本使用过，其背景复杂，遗传信息多，但不可重复；重组自交系(永久F2群体的前身)和剩余杂合系是双亲的嵌合体，前者是纯合体，后者是某片段的杂合体，已在高粱、拟南芥、大豆和水稻等作物上用于QTL定位；染色体(单)片段代换系的背景纯净，精确性高，可以重复，但构建的时间很长。本方案就是结合遗传信息多的初级作图群体和灵敏、精确性高的次级作图群体而发明的，结合了两者的优点，避开了缺点，大大的提高了定位效率。
发明内容
鉴于以上内容，有必要提供一种水稻基因定位与分子育种的方法，本发明针对提高基因定位的效率，提出了一种结合了初级定位群体和高级定位群体的定位方法，省时高效，用以解决目前水稻功能基因研究和分子育种对基因快速定位的迫切需求。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明一种水稻基因定位与分子育种的方法由初级作图群体方法和次级作图群体方法结合，其中利用连锁的分子标记通过两代持续F2群体定位，用于分子标记辅助育种，所述方法包括以下步骤：(1)选择有表型差异的水稻亲本，通过杂交、自交，构建F2群体定位；(2)考察单株的表型性状和基因型；(3)进行常规连锁分析，可将目标基因定位在约10cM左右；(4)选择约10cM左右带目标区域杂合态的单株，通过自交，筛选交换株；(5)利用交换株交换的位置进行迭代作图，将目标基因定位在不大于5cM以内；(6)对这个区间可以进行精细定位或分子育种，如果以精细定位为目标，利用目标区域杂合态的单株，继续自交，得到约2000株的持续F2群体定位，发展精细定位的标记，将目标基因定位在100kb以内；(7)以分子育种为目标，利用与目标基因连锁的分子标记，进行分子标记辅助选择育种。
本发明方法步骤(3)的连锁的分子标记筛选出100对多态性标记，设置水稻覆盖连锁的分子标记密度为不大于5cM/对。
本发明步骤(5)连锁的分子标记所选取的群体数量约200株，再利用常规定位软件且通过两代持续F2群体定位，得到用于精细定位和分子标记辅助育种要求的材料。
本发明所述常规定位软件包括Mapmaker/Exp软件或TASSEL(5.2)软件。
本发明所述F2群体交换选择两对边缘标记和中间1-2对标记检测，保证边缘不缩短，中间不交换，且针对分子标记密度10cM的目标区段进行基因定位标记。
本发明具有以下有益效果：本发明结合了F2快速定位的方法，并在F2定位方法的基础上设计了新的定位方法；结合了染色体(单)片段置换系迭代精准定位的方法，省去了染色体(单)片段置换系构建的繁琐程序；约100对多态标记可覆盖基因组约5cM/对引物的密度，通过两个世代的定位分析，即可用于进一步的精细定位和分子育种研究。本方法在低级作图群体的基础上结合了高级作图群体的方法，既节省了时间，又提高了效率；对于新基因的定位可以进行基因挖掘，对于已克隆过的基因，可以进行分子辅助育种。
附图说明
图1本发明一种水稻基因定位与分子育种方法的流程示意图。
图2依照本发明方法与其他基因定位方法的基因结构的比较示意图。
图3依照本发明方法对粒形和穗型QTL定位的效果示意图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例
具体实施步骤：
第一步定位：选择有表型差异的亲本，杂交、自交，构建背景复杂、遗传信息位点多的F2定位群体，考察单株的表型和基因型，进行连锁分析，初步将目标基因定位在约10cM左右；
第二步定位：选择目标区域杂合态的单株，自交，筛选交换株(目标区域约10％的交换率)，根据不同的交换位置进行迭代作图，将目标基因定位在约5cM以内；
进一步研究：5cM以内的区间可以进一步进行精细定位和分子育种。如以精细定位为目标，利用目标区域杂合态的单株，继续自交，得到约2000株的群体(这种群体也叫作“持续F2”群体)，根据序列的差异，发展精细定位的标记，即可进行精细定位；如以分子育种为目标，杂合态的交换率也小，利用目标基因连锁的标记，即可进行分子标记辅助选择。
本研究技术方法为：a选择有表型差异的亲本，通过杂交、自交，构建背景复杂、遗传信息位点多的F2定位群体；b考察单株的表型性状和基因型；c进行常规连锁分析，可将目标基因定位在约10cM左右；d选择约10cM左右带目标区域杂合态的单株，通过自交，筛选交换株；e利用交换株交换的位置进行迭代作图，将目标基因定位在约5cM以内；f对这个区间可以进行精细定位或分子育种，如果以精细定位为目标，利用目标区域杂合态的单株，继续自交，得到约2000株的群体(这种群体也叫作“持续F2”群体)，发展精细定位的标记，即可将目标基因定位在100kb以内；g如果以分子育种为目标，利用与目标基因连锁的标记，即可进行分子标记辅助选择(交换率只有5％)。总体方案如图1所示。
与传统方法相比，本发明技术方案没有额外构建交换单株群体和进一步利用分子标记鉴定重组体的步骤，不产生额外费用就可以快速地将目标基因定位到理想的区间，具有高精度高效率低成本的特点，可有效提高育种效率、缩短育种周期。依照本发明方法与其他基因定位方法的基因结构的比较如图2所示。
1、材料的构建
利用目前国内大面积推广的高产、优质、广适性品种黄华占为亲本P1，与来自不同国家的几个水稻优质品种分别进行杂交，构建杂种F1代，然后轮回亲本与F1回交得到BC1F1，或自交收种得到F2随机群体，见表1，经对高产、抗病虫、株高、粒型、穗长、产量杂优位点等目标性状构建导入系定位群体，进行目标性状的定位。
表1定位群体及亲本信息
Figure GDA0002490071470000051
注：HHZ：黄华占(Hunag-Hua-Zhan)
2、株高、粒型、穗型等产量QTL鉴定
2015年早、晚稻及2016年早、晚稻，分别对产量、杂种优势等的株高、粒型、穗型QTL进行鉴定。株高的测量：在成熟期，田间测量植株底层基部到主穗顶端(不包括芒长)的长度；穗长的测量：取样干燥后，测量穗颈节到穗顶部(不包括芒长)的长度；粒型的考察：取约50粒均匀的稻谷，平放在万深扫描仪平板上(不粘连)，扫描后，利用软件处理数据。谷粒产量的测量：试验为随机区组试验，每个株系两次重复，每个重复包含两行，每行10个单株。行间距20厘米，株间距16.7厘米。田间管理和施肥参考统一标准进行。产量性状还考察了单株总粒数、单株充实粒数、单株粒重、结实率等，见表2。
表2鉴定到的产量性状和杂种优势QTL及效应
Figure GDA0002490071470000052
Figure GDA0002490071470000061
3、产量QTL的连锁定位
通过本方法，在多个季节，重复、稳定连锁定位了穗长、总粒数、充实粒数、结实率、粒长、粒宽、长宽比和单株粒重等产量QTL。通过这些QTL，结合对应的连锁标记，成功选育了带目标性状的若干品系，见表3。
表3定位到的产量QTL及效应
Figure GDA0002490071470000062
Figure GDA0002490071470000071
4、粒形QTL的精细定位
DNA数据提取来自选择导入系的单株叶片。对亲本进行全基因组重测序，亲本平均测序深度为10X，重测序后提取到的区段序列read数据(73bp长)被比对不同亲本及日本晴(MSU7.0)序列。去除低质量的数据之后，进一步使用Mapping_quality>20，15>Depth>2，missrate＝0和MAF>0.05对群体SNP数据进行过滤，最后得到40万个全基因组SNP位点，取其中41754个高质量的SNP用于全基因组关联分析。通过观察qPL7位于关联标记STS7-STS9之间，比对其物理位置，发现，这一位点与wang等(2015)报道过的GW7(LOC_Os07g41200)的位置一致。虽然这已不是一个新的位点，但印证了利用本方法进行基因定位的准确性，见图3所示。

Claims (2)

1.一种水稻基因定位与分子育种的方法，其特征在于，所述方法由初级作图群体方法和次级作图群体方法结合，其中利用连锁的分子标记通过两代持续F2群体定位，用于分子标记辅助育种，所述方法包括以下步骤：(1)选择有表型差异的水稻亲本，通过杂交、自交，构建F2群体定位；(2)考察单株的表型性状和基因型；(3)进行常规连锁分析，可将目标基因定位在约10cM左右；(4)选择约10cM左右带目标区域杂合态的单株，通过自交，筛选交换株；(5)利用交换株交换的位置进行迭代作图，将目标基因定位在不大于5cM以内；(6)对这个区间可以进行精细定位或分子育种，以精细定位为目标，利用目标区域杂合态的单株，继续自交，得到2000株的持续F2群体定位，发展精细定位的标记，将目标基因定位在100kb以内；(7)以分子育种为目标，利用与目标基因连锁的分子标记，进行分子标记辅助选择育种；
步骤(3)的连锁的分子标记筛选出100对多态性标记，设置水稻覆盖连锁的分子标记密度为不大于5cM/对；
步骤(5)连锁的分子标记所选取的群体数量约200株，再利用常规定位软件且通过两代持续F2群体定位，得到用于精细定位和分子标记辅助育种要求的材料；
所述常规定位软件包括Mapmaker/Exp软件或TASSEL(5.2)软件。
2.根据权利要求1所述一种水稻基因定位与分子育种的方法，其特征在于，所述F2群体交换选择两对边缘标记和中间1-2对标记检测，保证边缘不缩短，中间不交换，且针对分子标记密度10cM的目标区段进行基因定位标记。
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