CN109924121B - 一种改良水稻稻瘟病抗性的方法 - Google Patents

一种改良水稻稻瘟病抗性的方法 Download PDF

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本发明提供了一种改良水稻稻瘟病抗性的方法，将携带Pi1、Pita 2个稻瘟病抗性基因的水稻品种Tetep与不携带上述2个抗性基因的待改良的水稻材料杂交，以稻瘟病抗性待改良的水稻材料为轮回亲本进行连续回交，在每个回交世代利用特异性的功能标记选择同时携带上述2个稻瘟病抗性基因的单株，在此基础上，根据农艺性状对应基因的特异性SNP标记选择回复率最高的3个单株，通过多次回交和自交之后，获得同时聚合Tetep的2个抗性基因且农艺性状与待改良的水稻材料相似的水稻改良后代材料。本发明专利通过特异性SNP标记筛选稻瘟病抗性基因以及高回复率的子代，不仅实现聚合Tetep的2个稻瘟病抗性基因以达到改良稻瘟病抗性的目的，且育种周期短，节省成本。

Description

一种改良水稻稻瘟病抗性的方法
技术领域
本发明涉及水稻育种技术领域，特别涉及一种改良水稻稻瘟病抗性的方法。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物。稻瘟病是危害水稻的主要病害，危害严重时可导致水稻减产30-50％甚至绝收。培育具有抗性的水稻品种一直是育种界公认的防治稻瘟病的最经济有效的途径。利用多个抗性基因聚合到同一个品种中是使该品种获得持久抗性的前提和基础。Tetep是华智水稻生物技术有限公司自有的常规稻材料。通过分子生物学检测发现Tetep携带Pi1、Pita2个稻瘟病抗性基因，因此Tetep可作为抗性基因供体亲本以改良水稻材料的稻瘟病抗性。
传统的杂交结合表型的选育方法往往因为宏观上表型把握不准而需要加大回交群体，这极大的增加了育种工作量与成本。分子标记辅助育种可以从遗传基础上跟踪目标性状，选择含有目标基因的单株进行杂交(回交)，能准确的进行目标性状方向的育种，且减小回交群体的大小，节省成本。SNP是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。SNP包括单个碱基的转换或颠换，也包括插入或缺失，在整个基因组上具有高密度性，因此比较容易找到目标基因的SNP。利用目标基因的SNP标记可以在育种过程中进行相关性状的精准选育，也可以将相关的SNP锚定进芯片，在进行全基因组标记选择的同时选择含有此目标基因的个体(单株)。
国内授权专利201510175308.4公开了一种利用中早39改良水稻稻瘟病抗性的方法，获得了同时聚合中早39的5个稻瘟病抗性基因且农艺性状与稻瘟病抗性待改良的水稻材料相似的水稻改良后代材料。但该方法通过宏观上表型把握以对农艺性状进行选择，因此需要进行通过多次回交和自交，存在育种周期长、劳动强度大、靶向性较差的问题。
但在此背景下，本发明提出了一种将Tetep携带的Pi1、Pita2个抗性基因同时导入到不携带这2个抗性基因的水稻待改良材料中，以获得稻瘟病抗性改良的水稻材料，且有效缩短育种周期的育种方法。
发明内容
本发明采用的是利用特异性连锁SNP标记来选择性的聚合Tetep中存在的Pi1、Pita 2个抗性基因，同时利用在Tetep与待改良水稻材料之间具有多态性的全基因组SNP标记进行背景选择，选育稻瘟病抗性提高且农艺性状与待改良材料基本一致的水稻新材料，且育种周期短的育种方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是通过下述步骤实现的：
(1)将不携带Pi1、Pita2个抗性基因的待改良水稻材料与携带Pi1、Pita 2个抗性基因的Tetep杂交，获得杂种F1代:
(2)种植步骤(1)获得的杂种F1代，并将杂种F1代与步骤(1)描述的不携带Pi1、Pita2个抗性基因的待改良水稻材料回交，获得BC1F1代种子；
(3)种植步骤(2)获得的BC1F1代种子，并利用检测Pi1、Pita 2个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita 2个抗性基因的BC1F1代单株，然后从这些BC1F1代单株中，利用在Tetep与步骤(1)描述的待改良材料之间具有多态性的SNP标记，筛选遗传背景与步骤(1)描述的待改良材料相比回复率最高的2-4个单株，与步骤(1)描述的不携带Pi1、Pita2个抗性基因的待改良水稻材料回交，获得BC2Fl代种子；
(4)种植步骤(3)获得的BC2Fl代种子，并利用检测Pi1、Pita 2个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita 2个抗性基因BC2Fl代单株，然后从这些BC2F1代单株中，利用在Tetep与步骤(1)描述的待改良材料之间具有多态性的SNP标记，筛选遗传背景与步骤(1)描述的待改良材料相比回复率最高的2-4个单株，与步骤(1)描述的不携带Pi1、Pita 2个抗性基因的抗性待改良水稻材料回交，获得BC3Fl代种子；
(5)种植步骤(4)得到的BC3Fl代单株，利用检测Pi1、Pita 2个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita 2个抗性基因单株，然后从这些BC3F1代单株中，利用在Tetep与步骤(1)描述的待改良材料之间具有多态性的标记，筛选遗传背景与步骤(1)描述的待改良材料相比回复率最高的2-4个单株自交，自交代数为n(n≧2)，获得农艺性状稳定的BC3Fn代材料。
(6)种植步骤(5)获得的农艺性状稳定的BC3Fn代材料，用检测Pi1、Pita 2个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita 2个抗性基因的BC3Fn代单株，得到抗性改良且农艺性状与步骤(1)描述的不携带Pi1、Pita 2个抗性基因的待改良水稻材料相似的改良新材料。
进一步地，所述步骤(1)中，不携带Pi1、Pita 2个抗性基因的待改良水稻材料可以是籼稻、粳稻、恢复系、保持系中的任意一种育种材料。
进一步地，所述步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)利用不携带Pi1、Pita 2个抗性基因的待改良水程材料作为轮回亲本进行连续回交的目的是，使最终获得的水稻新材料的农艺性状与不携带Pi1、Pita 2个抗性基因的抗性待改良水稻材料相似。
进一步地，所述步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)，利用检测Pi1、Pita 2个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita 2个抗性基因的单株进行回交或自交的目的是，保证Pi1、Pita 2个抗性基因在改良后代中始终存在。
进一步地，所述步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)中，检测Pi1、Pita 2个抗性基因的特异性SNP标记可以根据Pi1、Pita 2个抗性基因的己公开DNA序列进行自行开发。
进一步的，所述步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)中，检测农艺性状对应基因的特异性SNP标记根据农艺性状对应基因的己公开DNA序列进行自行开发。
本发明的有益效果：
(1)本发明最终获得的育种材料同时聚合Tetep携带的Pi1、Pita2个抗性基因；
(2)本发明在检测抗性基因的特异性SNP标记下，对农艺性状对应基因的全基因组SNP标记进行检测，可显著缩短育种周期，提高育种效率；
(3)本发明使最终获得的育种材料与待改良材料的农艺性状基本保持一致，而稻瘟病抗性上有显著提高。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
利用Tetep改良黄华占的稻瘟病抗性。本发明人利用特异性的SNP标记检测显示黄华占不携带Pi1、Pita 2个抗性基因，而Tetep携带Pi1、Pita2个抗性基因，具体实施步骤如下：
1.将Tetep与黄华占杂交，获得杂种Fl代种子50粒(用黄华占做母本Tetep做父本进行杂交，或者用Tetep做母本黄华占做父本进行杂交)；
2.种植杂种Fl，将杂种Fl单株与黄华占回交，获得BC1F1代种子1600粒。种植BC1F1代种子，利用4个特异性的SNP标记对BC1F1代单株进行检测，选择同时携带Pi1、Pita2个抗性基因的单株220株，再利用Tetep与黄华占在全基因组中具有多态性的SNP标记120个进行背景检测，从这220个单株中筛选遗传背景回复率最高(达到90％)，也即与黄华占遗传背景最相似的3个单株与黄华占回交，获得BC2F1种子1400粒。
遗传背景进行检测，如果受体基因型为AA，记为“0”，供体基因型为BB，记为“2”，杂合基因型为AB，记为“1”，遗传背景回复率＝(a*2+b)/[(a+c+b)*2]。
其中a代表“0”的总数，b代表“1”的总数，c代表“2”的总数；
3.种植BC2F1代单株，利用4个特异性的SNP标记对BC1F1代单株进行检测，选择同时携带Pi1、Pita2个抗性基因的单株190株，再利用Tetep与黄华占在全基因组中具有多态性的SNP标记120个进行背景检测，从这190个单株中筛选遗传背景回复率最高(达到95％)，也即与黄华占遗传背景最相似的3个单株与黄华占回交，获得BC3F1代种子1500粒；
4.种植BC3F1代单株，利用4个特异性的SNP标记对BC1F1代单株进行检测，选择同时携带Pi1、Pita 2个抗性基因的单株180株，再利用Tetep与黄华占在全基因组中具有多态性的SNP标记120个进行背景检测，从这180个单株中筛选，遗传背景回复率(达98％)最高，也即与黄华占遗传背景最相似的3个单株自交，3个BC3F1代单株分别收获，每单株全收，得到3个BC3F2代株系；
5.种植3个BC3F2代株系，每株系种300株，每株系每个单株均提取叶片利用4个特异性的SNP标记进行检测，发现共有16个单株同时携带纯合的Pi1、Pita 2个抗性基因，成熟后进行自交，将这16个单株收获，每个单株全收，得到16个BC3F3代株系；
6.种植16个BC3F3代株系，每株系种64株，发现其中4个株系农艺性状与黄华占相似，这3个株系为导入了Pi1、Pita 2个抗性基因而且农艺性状又和黄华占相似的最终改良品系。
检测Pi1、Pita 2个抗性基因是否存在的特异性的SNP标记的开发方法为根据已报道的Pi1、Pita 2个抗性基因的DNA序列自行开发。
检测一个水稻单株是否同时携带Pi1、Pita 2个抗性基因的方法为：利用4个自行开发的相应的特异性SNP标记分别检测该单株的叶片DNA，如果4个相应的特异性SNP标记都能同时检测出为有利基因型，则该单株同时携带Pi1、Pita 2个抗性基因。
检测黄华占的农艺性状对应的特异性SNP标记根据农艺性状对应基因的己公开DNA序列进行自行开发。
本发明涉及的SNP检测等实验技术为竞争性等位基因PCR(Kompetitive AlleleSpecific PCR，KASP)原理，反应检测在Array Tape基因分型平台上进行，该方法已陆续应用于分子辅助育种、目标性状基因定位、种子纯度及真实性鉴定等工作，具有成本低、通量高和荧光信号采集数据准确等优势，因此在这里不再赘述。配套的试剂耗材均购于英国LGC公司。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种改良水稻稻瘟病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将不携带Pi1、Pita 2个抗性基因的待改良水稻材料与携带Pi1、Pita2个抗性基因的Tetep杂交，获得杂种F1代；
(2)种植步骤(1)获得的杂种F1代，并将杂种F1代与步骤(1)描述的不携带Pi1、Pita 2个抗性基因的待改良水稻材料回交，获得BC1F1代种子；
(3)种植步骤(2)获得的BC1F1代种子，并利用检测Pi1、Pita 2个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita 2个抗性基因的BC1F1代单株，然后从这些BC1F1代单株中，利用在Tetep与步骤(1)描述的待改良材料之间具有多态性的SNP标记，检测农艺性状对应基因的特异性SNP标记根据农艺性状对应基因的己公开DNA序列进行自行开发，筛选遗传背景回复率最高的2-4个单株，与步骤(1)描述的不携带Pi1、Pita 2个抗性基因的待改良水稻材料回交，获得BC2Fl代种子；
(4)种植步骤(3)获得的BC2Fl代种子，并利用检测Pi1、Pita 2个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita 2个抗性基因的BC2Fl代单株，然后从这些BC2F1代单株中，利用在Tetep与步骤(1)描述的待改良材料之间具有多态性的SNP标记，筛选遗传背景回复率最高的2-4个单株，与步骤(1)描述的不携带Pi1、Pita 2个抗性基因的抗性待改良水稻材料回交，获得BC3Fl代种子；
(5)种植步骤(4)得到的BC3Fl代单株，利用检测Pi1、Pita 2个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita 2个抗性基因单株，然后从这些BC3F1代单株中，利用在Tetep与步骤(1)描述的待改良材料之间具有多态性的标记，筛选遗传背景回复率最高的2-4个单株自交，自交代数n(n≧2)根据育种需要确定，获得农艺性状稳定的BC3Fn代材料；
(6)种植步骤(5)获得的农艺性状稳定的BC3Fn代材料，用检测Pi1、Pita2个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita 2个抗性基因的BC3Fn代单株，得到抗性改良且农艺性状与步骤(1)描述的不携带Pi1、Pita2个抗性基因的待改良水稻材料相似的改良新材料。
2.根据权利要求1所述的改良水稻稻瘟病抗性的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，不携带Pi1、Pita 2个抗性基因的待改良水稻材料来自籼稻、粳稻、恢复系、保持系中的任意一种育种材料。
3.根据权利要求1所述的改良水稻稻瘟病抗性的方法，其特征在于，所述步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)利用不携带Pi1、Pita 2个抗性基因的待改良水稻材料作为轮回亲本进行连续回交的目的是，使最终获得的水稻新材料的农艺性状与不携带Pi1、Pita 2个抗性基因的抗性待改良水稻材料相似。
4.根据权利要求1所述的改良水稻稻瘟病抗性的方法，其特征在于，所述步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)，利用检测Pi1、Pita 2个抗性基因的特异性SNP标记选择同时携带Pi1、Pita 2个抗性基因的单株进行回交或自交的目的是，保证Pi1、Pita 2个抗性基因在改良后代中始终存在。
5.根据权利要求1所述的改良水稻稻瘟病抗性的方法，其特征在于，所述步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)、步骤(6)中，检测Pi1、Pita 2个抗性基因的特异性SNP标记根据Pi1、Pita 2个抗性基因的己公开DNA序列进行自行开发。
6.根据权利要求1所述的改良水稻稻瘟病抗性的方法，其特征在于，所述步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)中，选择回复率最高的3个单株进行回交或自交。
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