CN111978387B

CN111978387B - 水稻稻瘟病抗性基因Pikg、编码蛋白及其应用

Info

Publication number: CN111978387B
Application number: CN202010869538.1A
Authority: CN
Inventors: 章志宏; 孟芬; 何永刚; 刘少佳
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2020-08-26
Filing date: 2020-08-26
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2040-08-26
Also published as: CN111978387A

Abstract

本发明公开了一种水稻稻瘟病抗性基因Pikg、编码蛋白及其应用，属于水稻抗病育种领域。水稻稻瘟病抗性基因Pikg包括Pikg‑1和Pikg‑2，其编码区核苷酸序列和编码蛋白的氨基酸序列分别如序列表所示。本发明的基因、蛋白可用于提高水稻植株对稻瘟病菌的抗性。

Description

水稻稻瘟病抗性基因Pikg、编码蛋白及其应用

技术领域

本发明属于水稻抗病育种领域，具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因Pikg、编码蛋白及其应用。

背景技术

水稻(Oryza sativaL.)是重要的粮食作物，在我国有一半以上的人口将稻米作为主食，因此，维持、提高水稻产量对维护我国粮食安全具有重要意义。然而，水稻的产量受到了多种病虫害的影响，其中，真菌性病害稻瘟病、纹枯病和细菌性病害白叶枯病由于危害严重被称为水稻的三大病害。在这3种病害中，由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病发病频率高、流行性强、影响范围极广，据统计，每年由稻瘟病引起的水稻产量损失高达10％-30％。传统防控稻瘟病主要依赖于杀真菌剂，但长期使用药物会使病原菌产生抗药性，同时会造成环境污染不利于可持续发展，育种实践表明利用抗稻瘟病基因培育具有广谱抗病能力的水稻新品种是防治稻瘟病经济、高效且环境友好的方法。

随着1999年第一个水稻抗稻瘟病基因Pib被克隆，目前通过图位克隆、基因组学以及反向遗传学等方法从水稻中已经成功分离、克隆了超过30个抗稻瘟病基因。这些基因大多编码NBS-LRR类蛋白，除了位于4号染色体上的pi21编码富含脯氨酸的蛋白和6号染色体上的Pi-d2编码β-凝集素受体蛋白激酶。在已经克隆的抗稻瘟病基因中，Pik位点的7个等位基因以及Pi5和Pia的抗性是由两个基因共同决定的。Pi5位于9号染色体上，该基因的抗性由Pi5-1和Pi5-2共同决定，其中Pi5-1的表达受到了稻瘟病菌侵染的诱导，Pi5-2则为组成型表达。 Pia是位于11号染色体上的抗病基因，该基因的抗性由两个相邻的基因RGA4和RGA5共同决定，其中位于RGA5蛋白C端的非LRR区参与了对稻瘟病菌无毒基因的识别。而位于11号染色体长臂末端的Pik位点上，迄今为止有7个具有广谱抗性的抗稻瘟病基因(Pik、Pi1、Pikm、Piks、Pike、Pikp、Pikh)被克隆，且这7个抗病基因为复等位基因，其中Pikm是该位点上最早被克隆的抗病基因。功能分析发现这7个等位基因的抗性都是由2个相邻但转录方向相反的具有 CC-NBS-LRR结构的基因共同决定的。在这两个相邻的基因中，Pikm-2对应的等位基因相对保守，其相似度达到了99％以上，而Pikm-1与Pikp-1及Pikh-1的相似度仅为95％，与其他的4个等位基因的相似度则达到了99％以上。对其无毒基因研究发现，位于Pikh-1编码蛋白的HMA结构域能直接与稻瘟病菌分泌的无毒蛋白相互作用，从而决定着Pikh对稻瘟病菌无毒基因的识别。

本发明采用同源克隆的方式对Pik-1在部分亚洲栽培稻和野生稻株系中的遗传变异进行了分析，共发现了40个等位变异体。通过转基因功能验证，本发明在Pik位点克隆了一个新的等位基因Pikg，该基因编码氨基酸序列与Pik位点的等位基因Pik、Pi1、Pikm、Piks和Pike的相似度达到了99％以上，其中Pikg-1 与Pike-1相比只有229^th氨基酸残基发生变化，而Pikg-2和Pike-2的氨基酸序列完全一致。但抗谱分析发现Pikg与Pike的抗谱存在着差异，且Pikg的抗病频率显著高于Pik位点的6个等位基因(Pik、Pi1、Pikm、Piks、Pikp、Pikh)，因此，本发明克隆的Pikg将为水稻的抗病育种提供新的基因资源。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供水稻稻瘟病抗性基因 Pikg-1和Pikg-2；另一目的在于提供上述水稻稻瘟病抗性基因Pikg-1和Pikg-2编码的蛋白；再一目的在于提供上述基因、蛋白的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

第一方面，本发明提供一种水稻稻瘟病抗性基因Pikg，其特征在于：包括 Pikg-1和Pikg-2，Pikg-1和Pikg-2的编码区核苷酸序列分别如序列SEQ 1和SEQ 3所示。

第二方面，本发明提供一种如上述的水稻稻瘟病抗性基因Pikg编码的蛋白，其特征在于：所述Pikg-1和Pikg-2编码的蛋白的氨基酸序列分别如序列SEQ 2 和SEQ 4所示。

本发明中提高植物对稻瘟病菌的抗性的方法，为将上述的基因Pikg转入到植物中。通过将上述的基因Pikg连接到植物表达载体上，通过农杆菌转化方法将Pikg导入到植物中；或将含有上述的基因Pikg的植株或种子通过有性杂交的方式将Pikg转入到植物中。

第三方面，本发明提供一种如上述的水稻稻瘟病抗性基因Pikg在抗稻瘟病水稻品种育种或鉴定中的应用。

第四方面，本发明提供一种如上述的水稻稻瘟病抗性基因Pikg在提高植物对稻瘟病菌的抗性中的应用。

第五方面，本发明提供一种如上述的水稻稻瘟病抗性基因Pikg编码的蛋白在抗稻瘟病水稻品种育种或鉴定中的应用。

第六方面，本发明提供一种如上述的水稻稻瘟病抗性基因Pikg编码的蛋白在提高植物对稻瘟病菌的抗性中的应用。

本发明从野生稻品系中分离得到Pikg基因的编码DNA片段，该片段赋予植物对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)所引起的病害产生特异性(专化性)的抗病反应，适用于所有对该病原菌敏感的植物(包括单子叶植物和双子叶植物)。 Pikg基因包括2个编码CC-NBS-LRR类蛋白的基因Pikg-1和Pikg-2，其编码区全长序列如SEQ1和SEQ3所示，它们分别编码氨基酸序列如SEQ2和SEQ4所示的蛋白。Pikg-1和Pikg-2都包含3个主要的结构域：CC、NBS和LRR结构域。根据本发明提供的Pikg基因序列信息(SEQ1和SEQ3)，可以通过下列方法获得与Pikg等同的基因：依据Pikg基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从水稻的基因组、mRNA和cDNA中获取。

本发明提供的稻瘟病抗性基因Pikg具有重要的应用价值，Pikg基因对稻瘟病菌所引起的病害产生特异性的抗病反应。应用之一是将所述的Pikg编码基因序列连接到植物表达载体，通过农杆菌转化方法将Pikg基因导入水稻细胞，获得表达Pikg的转基因抗病品系，进而应用于生产。同时将本发明所述的Pikg基因构建到植物表达载体中，可以对所述基因或其调控元件进行适当修饰，或者使用其他启动子取代所述基因原有的启动子，达到增强或拓宽该基因的转基因植物对病原菌的抗性。同时，可通过分子标记辅助选择和杂交的方式将Pikg导入到不同水稻品系中，对植株的稻瘟病抗性进行遗传改良。

本发明具有如下优点及有益效果：

将从野生稻中克隆的Pikg转入感病植株中，有助于培育出新的抗病植物，同时通过遗传转化技术将多个基因转入同一个植物中，能够大大缩短品种改良年限，同时克服传统杂交回交带来的连锁累赘现象。另外本发明可以提供或利用含有Pikg基因的转基因植株和相应的种子，为水稻抗病育种提供基因资源。

附图说明

图1设计并检测用于特异性扩增Pik外显子片段的引物。

图中：图a是Pik-1的基因结构图及扩增Pik-1外显子片段的特异性引物 Ex1-F/R、Ex2-F/R和Ex3-F/R的结合位点示意图；图b是Pik-2的基因结构及扩增Pik-2外显子片段的特异性引物Ex4-F/R和Ex5-F/R的结合位点示意图，图中黑色方框表示外显子，线条表示内含子，该基因编码区的启动子(ATG)和终止子(TAG)以及内含子、外显子和扩增片段的大小(bp)均标示于图中；图c是检测引物扩增特异性的电泳图。泳道M：标准分子量DL5000；泳道1：引物Ex1-F 和Ex1-R的扩增产物；泳道2：引物Ex2-F和Ex2-R的扩增产物；泳道3：Ex3-F 和Ex3-R的扩增产物；泳道4：Ex4-F和Ex4-R的扩增产物；泳道5：Ex5-F和 Ex5-R的扩增产物。

图2Pik-1的40个等物变异体的氨基酸序列比对图。

图中：图片上方方框所示分别为Pik-1变异体所编码蛋白的3个结构域：CC 区、NBS区和LRR区。Pike-1序列作为参照，垂直的数字表示氨基酸位点，点号表示与Pike-1的氨基酸残基相同，-表示氨基酸缺失，No.表示该类变异体的数目，Allele表示已克隆的Pik-1的等位基因名称。

图3农杆菌介导的水稻遗传转化。

图中：a：去壳后的Nip-Pike-2转基因植株种子；b：诱导4周的愈伤；c：活化农杆菌；d：侵染；e：愈伤组织晾干；f：共培养；g：选择；h：分化；i：生根；j：炼苗。

图4Pikg转基因植株抗性鉴定及基因表达水平检测。

图中：稻瘟病菌株FC11-2用于接种Pikg的T₀代转基因植株，R表示抗病， S表示感病。Pikg表达水平检测的电泳图中由左至右依次为：泳道1：日本晴Nip；泳道2：Pike的转基因植株(阳性对照)；泳道3：Pike-2的转基因植株Nip-Pike-2 (阴性对照)；泳道4-16：Pikg的T₀代转基因植株。RT1和RT2用于检测T₀代转基因植株中Pikg-1和Pikg-2的基因表达水平。Actin用于检测cDNA的质量。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步地详细阐述。

在本发明的实施例部分，阐述了Pikg基因的分离过程和该基因的特点，分离的Pikg基因能够与适当的载体连接，转入植物体中，使该植物体带有一定的抗性。

实施例1抗稻瘟病基因Pikg的获得

本发明利用同源克隆的方法克隆了水稻抗稻瘟病基因Pikg。为了挖掘、鉴定水稻抗稻瘟病基因Pik的新的等位基因，本发明利用Pik(NCBI登录号： HM048900)的两个组成基因Pik-1和Pik-2序列为模板，设计了扩增Pik-1和Pik-2 外显子片段的引物(图1、表1)。由于有研究表明Pik-1能够直接与稻瘟病无毒蛋白AvrPik-D结合，且Pik-2核苷酸序列相对保守，本发明首先选用特异性扩增 Pik-1外显子的3对引物Ex1-F/R，Ex2-F/R，Ex3-F/R(图1a，1b)，以79份水稻叶片基因组DNA为模板(表1)，利用高保真聚合酶KOD酶进行了PCR扩增，PCR产物经电泳检测后(图1c)，切胶回收并与pMD-20T载体(TaKaRa)相连，转化大肠杆菌DH5α后挑斑送样测序。为保证PCR扩增和测序的准确性，每个片段挑选3个克隆进行测序。

测序结果返回后，利用DNAMAN 8.0软件对3个克隆序列进行比对，通过序列比对获得每个片段的正确序列。从每个材料中扩增的3个片段的DNA序列经ContigExpress软件拼接后获得Pik-1变异体的编码区序列。本发明共获得79 条长度为3429bp-3441bp的全长编码区序列，序列相似度为95.7％-99.9％，进而用MEGA软件对基因所编码的氨基酸序列进行比对分析，79条序列共编码40 种不同变异类型的蛋白Var.1-Var.40(图2)，其氨基酸序列与本课题组克隆的等位基因Pike-1的相似度为92.5％-99.9％。其中，来自9份野生稻品系的变异体Var.2 与Pike-1编码蛋白的序列相似度高达到99.9％，只有229^th位氨基端残基发生了替换。随后，本发明对这9份野生稻品系中Pik-2编码区进行了扩增和测序，发现其核苷酸序列和Pike-2序列完全一致。为了研究方便，本研究将Pik在这9份野生稻材料中的等位基因命名为Pikg，Pik-1和Pik-2对应的两个基因命名为 Pikg-1和Pikg-2。

表1用于Pik-1序列分析的79份水稻材料信息

表2本发明中使用的引物序列及其功能

实施例2转Pikg水稻植株获得及基因功能验证

由于Pikg-2与Pike-2的核苷酸序列完全相同，本发明将Pikg-1编码区DNA 片段与双元转化载体pRGV相连构建了载体pRGV-Pikg-1，随后转化含有Pike-2 的日本晴愈伤组织，具体操作如下：

将以日本晴为背景构建的Pike-2转基因植株Nip-Pike-2的成熟种子在诱导培养基上诱导愈伤组织，携带载体pRGV-Pikg-1的EHA105菌株28℃振荡培养至 OD₆₀₀值为0.5-0.6时将水稻愈伤组织浸入菌液30分钟，吸干愈伤组织表面的菌液后将愈伤组织转移到共培养培养基上19-22℃条件下暗培养2-3天。取出共培养的愈伤组织，用已灭菌的去离子及含有400ppm羧苄青霉素的无菌水中清洗后转移到已灭菌的滤纸上风干。风干后的愈伤组织转移到含有新霉素、卡那霉素和羧苄青霉素的选择培养基上26-28℃黑暗培养。第一次筛选培养时间为10天左右，第二次筛选培养至长出新的阳性愈伤，而后转移新的阳性愈伤组织至含有新霉素浓度为50mg/L的分化培养基中进行分化出转基因苗(图3)。本发明共获得了13株T₀代转基因阳性植株，利用日本晴植株感病的稻瘟病菌菌株FC11-2进行接种鉴定，发现13株T₀代转基因阳性植株全部表现出抗稻瘟病抗性(图4)，因此，本发明中的Pikg具有稻瘟病抗性。

实施例3抗稻瘟病基因Pikg的抗性特征

首先，为了比较和明确本发明中的Pikg和Pik位点上已克隆的7个等位基因的抗谱是否存在差异，本发明选用了对日本晴和丽江新团黑谷感病的稻瘟病菌株进行抗谱分析，这些菌株来源于黑龙江(HLJ)、江西(NC)、湖南(HN)和湖北(HB)(表5)。以日本晴为遗传背景的转基因植株Nip-Pike(Pike)和Nip-Pikg (Pikg)及以丽江新团黑古为背景构建的单基因系IRBLkm-Ts(Pikm)、IRBL-CL (Pi1)、IRBLks-S(Piks)、IRBLk-Ka(Pik)、IRBLkp-K60(Pikp)和IRBLkh-K3 (Pikh)被用来进行抗性鉴定。温室喷雾接种鉴定发现，Pikg的抗病频率与Pik位点上的其它7个等位基因(Pike、Pik、Pikh、Pikm、Pikp、Piks、Pi1)不同， Pikg的抗病频率(71.43％)仅次于Pike(90.40％)，但显著高于其它6个等位基因的抗病频率(表3)。

表3 Pikg和7个等位基因的抗谱分析

实施例4转化Pikg基因产生的抗性植株的应用

将Pikg-1基因克隆到植物转化载体pRGV，并导入农杆菌菌株EHA105中，转化以日本晴为背景构建的Pike-2转基因植株，获得了13株含有Pikg的T₀代转基因阳性植株。接种鉴定发现同时含有Pikg-1和Pikg-2基因的转基因植株表现抗性反应，见表3、图4。这说明可以利用基因Pikg转化水稻育种株系，经过筛选后，即可获得含有Pikg的抗病植株并将其应用于水稻的抗病育种中。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 水稻稻瘟病抗性基因Pikg、编码蛋白及其应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3432

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza rufipogon)

<400> 1

atggaggcgg ctgccatggc cgtaaccgca gccacggggg ccttggcgcc cgtgctagtg 60

aagctggccg ctttgctgga cgacggggag tgcaatcttc tggaggggag ccggagcgac 120

gcagagttca tcagatccga gctggaggcc gttcattctc tcctcacccc aaatatcttg 180

gggaggatgg gggatgacga tgcggcgtgc aaggatggct tgattgcgga ggtccgggag 240

ctgtcctacg acctggatga tgccgtcgac gacttcttgg agctcaattt cgagcagcga 300

agaagcgcaa gccctttcgg tgagctcaag gcaagagttg aggagcgtgt ctccaatcgc 360

ttctctgact ggaagctacc ggcggcgagc cttccgccgt cgtcggtaca ccgtcgagct 420

ggcttgccgc caccagatgc agggctggtg gggatggaca aacgtaagga agagctcatc 480

gagttgctgg aacaagggag cagtgatgct tcacgatggc gcaagcgaaa acctcatgtc 540

cccctcagga taatgggagg ggaaatgcaa aaaatcgtgt tcaagattcc catggtggac 600

gataagagcc gtacaaaagc aatgtcattg gttgcaagca cggttggagt gcactcggtt 660

gcaatcgccg gtgacctaag agacgaggtt gtggtggtcg gtgatggcat tgactccatc 720

aatctggtct ctgcgctccg gaagaaggtg ggccctgcga tgtttctgga ggtcagccaa 780

gtaaaggaag atgtgaagga gataacggcg atgcttgcgc cggtgaaatc catatgtgaa 840

tttcacgagg tcaaaacaat ttgcatcctt ggattgccag ggggaggcaa aacaacgatt 900

gcccgagtac tatatcatgc attgggaacg cagttccaat gccgggtttt cgcatcaatc 960

tctccaagtt ccagccccag tcccaatcta acagagactc ttgcagacat tttcgctcaa 1020

gcacaactag gagtaactga tacacttagc acaccatatg gtgggagtgg gaccgggaga 1080

gctcttcaac aacatctcat cgacaacata tcagctttcc tcctcaacaa aaagtatctc 1140

attgtaatcg atgacatttg gcattgggaa gaatgggaag tcatcagaaa gtccattccc 1200

aagaatgatc tgggtggtag aataatcatg actactcgtc ttaattcaat agctgagaag 1260

tgccacactg atgacaatga tgtttttgtc tacgaagttg gggatctaga taataatgat 1320

gctttgtggt tgtcttgggg gatagcaaca aagtctgggg caggcaacag gatcggaact 1380

ggagaggata atccatgcta tgatattgtg aacatgtgtt atggtatgcc tttagcactt 1440

atttggctgt cgtcagcatt ggttggagag atagaagaat taggtggtgc tgaagtgaaa 1500

aaatgtaggg atttgagaca catagaggat ggtattttgg acatcccatc cttacaacca 1560

ttggcggaga gtttatgcct tggttataac catcttcctc tttatctgag gactttgttg 1620

ttgtactgta gtgcatacca ttggtctaac agaatcgaaa ggggtcgtct ggtcaggagg 1680

tggattgcgg aaggatttgt gtcggaagag aaagaagcag aaggttactt tggcgagctt 1740

attaacagag gatggattac gcagcacgga gacaacaaca gttataatta ctatgagatc 1800

caccccgtga tgctggcctt cctgagatgc aagtccaagg agtacaattt tttaacatgc 1860

ttgggtctgg gatctgatac tagtactagt gcatcctccc caaggttgat tcgccggctg 1920

tctcttcagg gggggtatcc agtggactgc ttgtcaagca tgagtatgga tgtgtcacac 1980

acttgcagcc ttgtcgtcct tggtgacgtg gcgcgaccca agggaatccc cttctatatg 2040

tttaagcgct tgcgagtgtt ggaccttgaa gataataagg atatacagga ttctcatctg 2100

cagggcatat gtgaacagtt aagcctcaga gtgaggtacc ttggtctcaa gggaacgcgg 2160

atccgaaagc tccctcagga gatgaggaag ctgaagcatt tggagatttt gtatgtgggg 2220

agcactcgga tcagtgaact tccgcaagag attggagagc tgaagcatct gcggattctg 2280

gacgtgagaa acacggacat cactgagctc ccactgcaga tacgggagct gcagcatctg 2340

cacactctgg acgtgaggaa cactccaatc agtgagctcc cgccgcaggt tggcaagctg 2400

cagaatctca agattatgtg cgtgaggagc actggggtta gggagctccc aaaggagatt 2460

ggggagctga atcatctaca gactctggac gtgagaaaca cgagggtgag agagctgcca 2520

tggcaagctg gccagatctc ccaatcgttg cgcgtgcttg ccggtgacag tggcgatggc 2580

gtgcggttgc ccgaaggcgt ctgcgaagct ctgatcaacg gtattccagg ggctacgcgt 2640

gcaaaatgca gggaggttct gtccatcgcg atcatcgatc gtttcggacc tccccttgtt 2700

gggatattca aagttcccgg cagtcatatg cgtatcccga agatgatcaa agaccacttc 2760

cgcgttcttt cttgcctaga catcaggctc tgccacaagc ttgaggatga tgaccaaaag 2820

ttcctcgccg agatgcccaa cctgcagacg ctcgtgctga ggttcgaggc cctaccaaga 2880

caacccataa ccatcaacgg cacaggcttc cagatgctgg agagcttccg tgtcgacagc 2940

cgggtgccaa ggatagcctt ccatgaagac gccatgccca acctcaagct tctcgagttc 3000

aagttctacg ccggcccagc aagcaacgat gccatcggca tcaccaacct gaagagcctc 3060

caaaaggtgg tctttcggtg ctcgccatgg tacaagagcg acgcccctgg catcagcgcc 3120

accattgacg tcgtgaagaa agaagccgag gagcatccca accggccgat caccctcctc 3180

atcaatgctg ggtataagga gatatcaact gagtcacacg ggagcagtga aaacattgcg 3240

ggcagcagtg ggatcgatac tgagcctgca caggcacagc atgataatct ccctgctgtt 3300

cgagatgact acaagggaaa agggattctt cttgatggca ggtgtcctac ctgcggccga 3360

gcgactaaaa ttgaagagga aacccaagat cgagtagcag atattgaaat tcaaacagaa 3420

actactagct ag 3432

<210> 2

<211> 1143

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza rufipogon)

<400> 2

Met Glu Ala Ala Ala Met Ala Val Thr Ala Ala Thr Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

Pro Val Leu Val Lys Leu Ala Ala Leu Leu Asp Asp Gly Glu Cys Asn

20 25 30

Leu Leu Glu Gly Ser Arg Ser Asp Ala Glu Phe Ile Arg Ser Glu Leu

35 40 45

Glu Ala Val His Ser Leu Leu Thr Pro Asn Ile Leu Gly Arg Met Gly

50 55 60

Asp Asp Asp Ala Ala Cys Lys Asp Gly Leu Ile Ala Glu Val Arg Glu

65 70 75 80

Leu Ser Tyr Asp Leu Asp Asp Ala Val Asp Asp Phe Leu Glu Leu Asn

85 90 95

Phe Glu Gln Arg Arg Ser Ala Ser Pro Phe Gly Glu Leu Lys Ala Arg

100 105 110

Val Glu Glu Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Asp Trp Lys Leu Pro Ala

115 120 125

Ala Ser Leu Pro Pro Ser Ser Val His Arg Arg Ala Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Pro Asp Ala Gly Leu Val Gly Met Asp Lys Arg Lys Glu Glu Leu Ile

145 150 155 160

Glu Leu Leu Glu Gln Gly Ser Ser Asp Ala Ser Arg Trp Arg Lys Arg

165 170 175

Lys Pro His Val Pro Leu Arg Ile Met Gly Gly Glu Met Gln Lys Ile

180 185 190

Val Phe Lys Ile Pro Met Val Asp Asp Lys Ser Arg Thr Lys Ala Met

195 200 205

Ser Leu Val Ala Ser Thr Val Gly Val His Ser Val Ala Ile Ala Gly

210 215 220

Asp Leu Arg Asp Glu Val Val Val Val Gly Asp Gly Ile Asp Ser Ile

225 230 235 240

Asn Leu Val Ser Ala Leu Arg Lys Lys Val Gly Pro Ala Met Phe Leu

245 250 255

Glu Val Ser Gln Val Lys Glu Asp Val Lys Glu Ile Thr Ala Met Leu

260 265 270

Ala Pro Val Lys Ser Ile Cys Glu Phe His Glu Val Lys Thr Ile Cys

275 280 285

Ile Leu Gly Leu Pro Gly Gly Gly Lys Thr Thr Ile Ala Arg Val Leu

290 295 300

Tyr His Ala Leu Gly Thr Gln Phe Gln Cys Arg Val Phe Ala Ser Ile

305 310 315 320

Ser Pro Ser Ser Ser Pro Ser Pro Asn Leu Thr Glu Thr Leu Ala Asp

325 330 335

Ile Phe Ala Gln Ala Gln Leu Gly Val Thr Asp Thr Leu Ser Thr Pro

340 345 350

Tyr Gly Gly Ser Gly Thr Gly Arg Ala Leu Gln Gln His Leu Ile Asp

355 360 365

Asn Ile Ser Ala Phe Leu Leu Asn Lys Lys Tyr Leu Ile Val Ile Asp

370 375 380

Asp Ile Trp His Trp Glu Glu Trp Glu Val Ile Arg Lys Ser Ile Pro

385 390 395 400

Lys Asn Asp Leu Gly Gly Arg Ile Ile Met Thr Thr Arg Leu Asn Ser

405 410 415

Ile Ala Glu Lys Cys His Thr Asp Asp Asn Asp Val Phe Val Tyr Glu

420 425 430

Val Gly Asp Leu Asp Asn Asn Asp Ala Leu Trp Leu Ser Trp Gly Ile

435 440 445

Ala Thr Lys Ser Gly Ala Gly Asn Arg Ile Gly Thr Gly Glu Asp Asn

450 455 460

Pro Cys Tyr Asp Ile Val Asn Met Cys Tyr Gly Met Pro Leu Ala Leu

465 470 475 480

Ile Trp Leu Ser Ser Ala Leu Val Gly Glu Ile Glu Glu Leu Gly Gly

485 490 495

Ala Glu Val Lys Lys Cys Arg Asp Leu Arg His Ile Glu Asp Gly Ile

500 505 510

Leu Asp Ile Pro Ser Leu Gln Pro Leu Ala Glu Ser Leu Cys Leu Gly

515 520 525

Tyr Asn His Leu Pro Leu Tyr Leu Arg Thr Leu Leu Leu Tyr Cys Ser

530 535 540

Ala Tyr His Trp Ser Asn Arg Ile Glu Arg Gly Arg Leu Val Arg Arg

545 550 555 560

Trp Ile Ala Glu Gly Phe Val Ser Glu Glu Lys Glu Ala Glu Gly Tyr

565 570 575

Phe Gly Glu Leu Ile Asn Arg Gly Trp Ile Thr Gln His Gly Asp Asn

580 585 590

Asn Ser Tyr Asn Tyr Tyr Glu Ile His Pro Val Met Leu Ala Phe Leu

595 600 605

Arg Cys Lys Ser Lys Glu Tyr Asn Phe Leu Thr Cys Leu Gly Leu Gly

610 615 620

Ser Asp Thr Ser Thr Ser Ala Ser Ser Pro Arg Leu Ile Arg Arg Leu

625 630 635 640

Ser Leu Gln Gly Gly Tyr Pro Val Asp Cys Leu Ser Ser Met Ser Met

645 650 655

Asp Val Ser His Thr Cys Ser Leu Val Val Leu Gly Asp Val Ala Arg

660 665 670

Pro Lys Gly Ile Pro Phe Tyr Met Phe Lys Arg Leu Arg Val Leu Asp

675 680 685

Leu Glu Asp Asn Lys Asp Ile Gln Asp Ser His Leu Gln Gly Ile Cys

690 695 700

Glu Gln Leu Ser Leu Arg Val Arg Tyr Leu Gly Leu Lys Gly Thr Arg

705 710 715 720

Ile Arg Lys Leu Pro Gln Glu Met Arg Lys Leu Lys His Leu Glu Ile

725 730 735

Leu Tyr Val Gly Ser Thr Arg Ile Ser Glu Leu Pro Gln Glu Ile Gly

740 745 750

Glu Leu Lys His Leu Arg Ile Leu Asp Val Arg Asn Thr Asp Ile Thr

755 760 765

Glu Leu Pro Leu Gln Ile Arg Glu Leu Gln His Leu His Thr Leu Asp

770 775 780

Val Arg Asn Thr Pro Ile Ser Glu Leu Pro Pro Gln Val Gly Lys Leu

785 790 795 800

Gln Asn Leu Lys Ile Met Cys Val Arg Ser Thr Gly Val Arg Glu Leu

805 810 815

Pro Lys Glu Ile Gly Glu Leu Asn His Leu Gln Thr Leu Asp Val Arg

820 825 830

Asn Thr Arg Val Arg Glu Leu Pro Trp Gln Ala Gly Gln Ile Ser Gln

835 840 845

Ser Leu Arg Val Leu Ala Gly Asp Ser Gly Asp Gly Val Arg Leu Pro

850 855 860

Glu Gly Val Cys Glu Ala Leu Ile Asn Gly Ile Pro Gly Ala Thr Arg

865 870 875 880

Ala Lys Cys Arg Glu Val Leu Ser Ile Ala Ile Ile Asp Arg Phe Gly

885 890 895

Pro Pro Leu Val Gly Ile Phe Lys Val Pro Gly Ser His Met Arg Ile

900 905 910

Pro Lys Met Ile Lys Asp His Phe Arg Val Leu Ser Cys Leu Asp Ile

915 920 925

Arg Leu Cys His Lys Leu Glu Asp Asp Asp Gln Lys Phe Leu Ala Glu

930 935 940

Met Pro Asn Leu Gln Thr Leu Val Leu Arg Phe Glu Ala Leu Pro Arg

945 950 955 960

Gln Pro Ile Thr Ile Asn Gly Thr Gly Phe Gln Met Leu Glu Ser Phe

965 970 975

Arg Val Asp Ser Arg Val Pro Arg Ile Ala Phe His Glu Asp Ala Met

980 985 990

Pro Asn Leu Lys Leu Leu Glu Phe Lys Phe Tyr Ala Gly Pro Ala Ser

995 1000 1005

Asn Asp Ala Ile Gly Ile Thr Asn Leu Lys Ser Leu Gln Lys Val Val

1010 1015 1020

Phe Arg Cys Ser Pro Trp Tyr Lys Ser Asp Ala Pro Gly Ile Ser Ala

1025 1030 1035 1040

Thr Ile Asp Val Val Lys Lys Glu Ala Glu Glu His Pro Asn Arg Pro

1045 1050 1055

Ile Thr Leu Leu Ile Asn Ala Gly Tyr Lys Glu Ile Ser Thr Glu Ser

1060 1065 1070

His Gly Ser Ser Glu Asn Ile Ala Gly Ser Ser Gly Ile Asp Thr Glu

1075 1080 1085

Pro Ala Gln Ala Gln His Asp Asn Leu Pro Ala Val Arg Asp Asp Tyr

1090 1095 1100

Lys Gly Lys Gly Ile Leu Leu Asp Gly Arg Cys Pro Thr Cys Gly Arg

1105 1110 1115 1120

Ala Thr Lys Ile Glu Glu Glu Thr Gln Asp Arg Val Ala Asp Ile Glu

1125 1130 1135

Ile Gln Thr Glu Thr Thr Ser

1140

<210> 3

<211> 3066

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza rufipogon)

<400> 3

atggagttgg tggtaggtgc ttccgaagcc accatgaaat ctctcttggg caagctgggc 60

aatcttctag cccaggagta tgctctcatc agcggtatcc gtggtgacat ccagtacatc 120

aatgacgagc ttgccagcat gcaggccttc ctccgtgatc tcagcaacgt gccagagggt 180

cacagtcatg gccaccggat gaaggactgg atgaagcaga tccgagacat cgcctatgat 240

gttgaggact gtatcgatga ctttgcccac cgcctccctc aggattccat cagcgatgcc 300

aaatggtcct tcctactcac aaaaatctat gaactatgga catggtggcc acgtcgtgtg 360

attgcttcca acattgccca actcaaggta cgggcacaac agatcgcaga tcgacgtagt 420

agatacggag tgaacaaccc agaacacctt gacagtagca gcagtgccag gacccgtgct 480

gtcaattacg aaattgctga gtatcaggtc acaagccctc agatcattgg tataaaggag 540

cctgtgggga tgaagacggt catggaggag cttgaggttt ggttaactaa tcctcaagct 600

gaaaatgggc aagctgttct gtccatagtc ggttttggag gtgtgggaaa gactaccatt 660

gccacagcat tgtacagaaa agtcagtgat aaatttcagt gccgggcatc agtagctgtg 720

tctcagaact atgaccaagg caaagtcctc aatagtattc tgagtcaagt cagcaatcag 780

gagcagggca gcagcacaac aattagtgag aaaaagaacc tcacctcagg cgctaagagc 840

atgttgaaga cagccctgtc actgctcaga ggtaattgta tatgtcagcc agaaaatgat 900

ggaaaccctg ataatacacc aatcaggctg caggaaacaa cggacgatga tcaaaacccc 960

agaaaactgg aacagctcct ggccgaaaag agttatatcc tcttgattga tgacatttgg 1020

tctgccgaaa catgggagag tatcagatcg attttgccta aaaataataa aggcggtaga 1080

ataatagtga ctacaagatt tcaagctgtt ggttcaacat gctcccctct tgaaactgat 1140

cgtttgcata cagttgattt tctcaccgat gacgagtccc aaaacttatt caatacaagt 1200

atttgtgaat caaagataag aaaagatagc aacaaagtag acgagcaagt ccctgaggaa 1260

atatggaaaa tatgtggggg attgcctttg gccatagtca ccatggctgg tcttgtcgcc 1320

tgcaacccaa ggaaagcctg ctgcgattgg agtaaacttt gcaaatcatt atttccagag 1380

caagaaactc ctcttaccct cgatggtgtt acaaggatac tggattgttg ttacaatgat 1440

ttgcctgcgg atctgaagac ttgcttattg tacttgagta tatttccgaa gggttggaaa 1500

attagtagga aacgtttgtc ccggcgatgg atagctgaag gttttgctaa tgagaagcaa 1560

gggttaaccc aggaaagagt tgcagaggca tactttaatc aactcacaag aaggaactta 1620

gtacgtccca tggagcatgg cagcaatggg aaggtaaaaa cgtttcaagt tcatgacatg 1680

gttcttgaat acatcatgtc caaatcaatc gaagagaatt ttattactgt ggttggtgga 1740

cactggcaga tgactgcacc aagcaataaa gtccgtcgac tgtcgatgca aagcagtgga 1800

tccaatcgtg gaagttcaac aaaaggcctg aacttggctc aagtgagatc actgacggtg 1860

tttgggaacc tgaaccatgt gccattccat tcattcaact atgggataat acaggtgctg 1920

gatcttgagg actggaaggg tttgaaagag agacatatga cggagatatg tcaaatgctt 1980

ttactcaagt atttgagcat ccgacgaaca gaaatttcca aaattccctc caagattcag 2040

aaacttgagt acttggaaac tcttgacata agggagacat atgtcaggga cctgcctaag 2100

tcaatagtcc agctaaaacg gatcattagc atacttggag ggaataaaaa cacacggaag 2160

gggctgaggt tgcctcaaga aaaaagtaag aagccaatta aaaacccgtc gcctcaagga 2220

aaaacaaagg agcccgcaaa gaaaggattc ttatcccaag aaaaaggtaa aggcgcaatg 2280

aaagcactcc gtgtactgtc agggattgag attgttgagg aatcatcaga agtagctgca 2340

ggccttcatc agttgacagg gctaaggaag cttgccatat acaagctcaa tataacaaag 2400

ggtggtgata ccttcaaaca attacagtcc tccattgagt accttggcag ctgtggtctg 2460

cagactctgg ccatcaatga tgagaattct gaatttatca actcactggg cgacatgccc 2520

gcgcctccaa gatatcttgt cgcccttgag ctgtctggca agttggagaa gctacccaag 2580

tggatcacca gcatcactac tctcaacaag ctaaccatat ctgtaacagt tcttaggact 2640

gaaactttgg agatcctcca cattttacct tcattgtttt ccctcacctt cgccttttca 2700

cttagtgcag cgaagcagga tcaggacata ataaaggaca tccttgagaa taataaattg 2760

gacagtgatg gggaaatcgt cattccagct gaaggattca agagtcttaa gctgcttcgc 2820

ttctttgcac ctttagtgcc gaagctcagc tttttggaca agaatgcaat gccagcactc 2880

gaaatcattg aaatgcggtt taaagacttc gaaggtctat ttggcatcga aatccttgaa 2940

aatctccgtg aggtgcatct caaagttagt gatggggcag aagcaataac caagttcctt 3000

gtaaatgatt tgaaggataa tactgagaaa ccaaaagtat ttgttgatgg catcgtcact 3060

gcatga 3066

<210> 4

<211> 1021

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza rufipogon)

<400> 4

Met Glu Leu Val Val Gly Ala Ser Glu Ala Thr Met Lys Ser Leu Leu

1 5 10 15

Gly Lys Leu Gly Asn Leu Leu Ala Gln Glu Tyr Ala Leu Ile Ser Gly

20 25 30

Ile Arg Gly Asp Ile Gln Tyr Ile Asn Asp Glu Leu Ala Ser Met Gln

35 40 45

Ala Phe Leu Arg Asp Leu Ser Asn Val Pro Glu Gly His Ser His Gly

50 55 60

His Arg Met Lys Asp Trp Met Lys Gln Ile Arg Asp Ile Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Val Glu Asp Cys Ile Asp Asp Phe Ala His Arg Leu Pro Gln Asp Ser

85 90 95

Ile Ser Asp Ala Lys Trp Ser Phe Leu Leu Thr Lys Ile Tyr Glu Leu

100 105 110

Trp Thr Trp Trp Pro Arg Arg Val Ile Ala Ser Asn Ile Ala Gln Leu

115 120 125

Lys Val Arg Ala Gln Gln Ile Ala Asp Arg Arg Ser Arg Tyr Gly Val

130 135 140

Asn Asn Pro Glu His Leu Asp Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr Arg Ala

145 150 155 160

Val Asn Tyr Glu Ile Ala Glu Tyr Gln Val Thr Ser Pro Gln Ile Ile

165 170 175

Gly Ile Lys Glu Pro Val Gly Met Lys Thr Val Met Glu Glu Leu Glu

180 185 190

Val Trp Leu Thr Asn Pro Gln Ala Glu Asn Gly Gln Ala Val Leu Ser

195 200 205

Ile Val Gly Phe Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Ile Ala Thr Ala Leu

210 215 220

Tyr Arg Lys Val Ser Asp Lys Phe Gln Cys Arg Ala Ser Val Ala Val

225 230 235 240

Ser Gln Asn Tyr Asp Gln Gly Lys Val Leu Asn Ser Ile Leu Ser Gln

245 250 255

Val Ser Asn Gln Glu Gln Gly Ser Ser Thr Thr Ile Ser Glu Lys Lys

260 265 270

Asn Leu Thr Ser Gly Ala Lys Ser Met Leu Lys Thr Ala Leu Ser Leu

275 280 285

Leu Arg Gly Asn Cys Ile Cys Gln Pro Glu Asn Asp Gly Asn Pro Asp

290 295 300

Asn Thr Pro Ile Arg Leu Gln Glu Thr Thr Asp Asp Asp Gln Asn Pro

305 310 315 320

Arg Lys Leu Glu Gln Leu Leu Ala Glu Lys Ser Tyr Ile Leu Leu Ile

325 330 335

Asp Asp Ile Trp Ser Ala Glu Thr Trp Glu Ser Ile Arg Ser Ile Leu

340 345 350

Pro Lys Asn Asn Lys Gly Gly Arg Ile Ile Val Thr Thr Arg Phe Gln

355 360 365

Ala Val Gly Ser Thr Cys Ser Pro Leu Glu Thr Asp Arg Leu His Thr

370 375 380

Val Asp Phe Leu Thr Asp Asp Glu Ser Gln Asn Leu Phe Asn Thr Ser

385 390 395 400

Ile Cys Glu Ser Lys Ile Arg Lys Asp Ser Asn Lys Val Asp Glu Gln

405 410 415

Val Pro Glu Glu Ile Trp Lys Ile Cys Gly Gly Leu Pro Leu Ala Ile

420 425 430

Val Thr Met Ala Gly Leu Val Ala Cys Asn Pro Arg Lys Ala Cys Cys

435 440 445

Asp Trp Ser Lys Leu Cys Lys Ser Leu Phe Pro Glu Gln Glu Thr Pro

450 455 460

Leu Thr Leu Asp Gly Val Thr Arg Ile Leu Asp Cys Cys Tyr Asn Asp

465 470 475 480

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485 490 495

Lys Gly Trp Lys Ile Ser Arg Lys Arg Leu Ser Arg Arg Trp Ile Ala

500 505 510

Glu Gly Phe Ala Asn Glu Lys Gln Gly Leu Thr Gln Glu Arg Val Ala

515 520 525

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530 535 540

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545 550 555 560

Val Leu Glu Tyr Ile Met Ser Lys Ser Ile Glu Glu Asn Phe Ile Thr

565 570 575

Val Val Gly Gly His Trp Gln Met Thr Ala Pro Ser Asn Lys Val Arg

580 585 590

Arg Leu Ser Met Gln Ser Ser Gly Ser Asn Arg Gly Ser Ser Thr Lys

595 600 605

Gly Leu Asn Leu Ala Gln Val Arg Ser Leu Thr Val Phe Gly Asn Leu

610 615 620

Asn His Val Pro Phe His Ser Phe Asn Tyr Gly Ile Ile Gln Val Leu

625 630 635 640

Asp Leu Glu Asp Trp Lys Gly Leu Lys Glu Arg His Met Thr Glu Ile

645 650 655

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740 745 750

Gln Glu Lys Gly Lys Gly Ala Met Lys Ala Leu Arg Val Leu Ser Gly

755 760 765

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770 775 780

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785 790 795 800

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805 810 815

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820 825 830

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835 840 845

Leu Glu Leu Ser Gly Lys Leu Glu Lys Leu Pro Lys Trp Ile Thr Ser

850 855 860

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865 870 875 880

Glu Thr Leu Glu Ile Leu His Ile Leu Pro Ser Leu Phe Ser Leu Thr

885 890 895

Phe Ala Phe Ser Leu Ser Ala Ala Lys Gln Asp Gln Asp Ile Ile Lys

900 905 910

Asp Ile Leu Glu Asn Asn Lys Leu Asp Ser Asp Gly Glu Ile Val Ile

915 920 925

Pro Ala Glu Gly Phe Lys Ser Leu Lys Leu Leu Arg Phe Phe Ala Pro

930 935 940

Leu Val Pro Lys Leu Ser Phe Leu Asp Lys Asn Ala Met Pro Ala Leu

945 950 955 960

Glu Ile Ile Glu Met Arg Phe Lys Asp Phe Glu Gly Leu Phe Gly Ile

965 970 975

Glu Ile Leu Glu Asn Leu Arg Glu Val His Leu Lys Val Ser Asp Gly

980 985 990

Ala Glu Ala Ile Thr Lys Phe Leu Val Asn Asp Leu Lys Asp Asn Thr

995 1000 1005

Glu Lys Pro Lys Val Phe Val Asp Gly Ile Val Thr Ala

1010 1015 1020

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagatacttt ttgttgagga ggaaagc 27

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caaaaagtat ctcattgtaa tcg 23

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccagcatcac ggggtggatc tcatagt 27

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatccacccc gtgatgctgg 20

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agctgaaagt tgcagtgaga agtacaga 28

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggatataact cttttcggcc aggag 25

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaaagagtta tatcctcttg attgatgaca t 31

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcagatgatt ggtaagttct ccgatttg 28

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

actttctgat gacttcccat tcttc 25

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gacattttcg ctcaagcaca ac 22

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccctgtcact gctcagaggt aat 23

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcagaccaaa tgtcatcaat caag 24

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gagacattca gcgttccagc 20

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gcataacctt cgtagattgg gac 23

Claims

1.一种水稻稻瘟病抗性基因Pikg-1在抗稻瘟病水稻品种育种或鉴定中的应用，其特征在于：所述Pikg-1的编码区核苷酸序列如序列SEQ ID NO. 1所示。

2.一种水稻稻瘟病抗性基因Pikg-1在提高水稻对稻瘟病菌的抗性中的应用，其特征在于：所述Pikg-1的编码区核苷酸序列如序列SEQ ID NO. 1所示。