CN101045928A

CN101045928A - 一种克隆野生稻新抗性基因的方法

Info

Publication number: CN101045928A
Application number: CN 200710034424
Authority: CN
Inventors: 曹孟良; 辜显旺; 田志坚; 李磊; 邢俊杰; 袁隆平; 李强; 崔玲玲; 张朝良; 金纬; 李煊; 孔洁洁
Original assignee: Changsha Hybrid Rice Genetic Engineering Research Center; HUNAN WEST CITY HYBRID RICE GENE TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Changsha Hybrid Rice Genetic Engineering Research Center; HUNAN WEST CITY HYBRID RICE GENE TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2007-02-12
Filing date: 2007-02-12
Publication date: 2007-10-03

Abstract

本发明公开了一种克隆野生稻新抗性基因的方法，它包括首先构建供体野生稻可转化基因组文库，再根据已克隆抗稻瘟病基因及抗白叶枯基因的保守序列设计引物，获得扩增产物作为探针，然后使用已标记探针对文库进行磁珠富集，建立候选抗性基因富集文库，最后对富集文库的克隆进行点杂交分析、PCR鉴定、扩增产物的克隆测序分析及功能验证。本发明集成了候选抗性基因克隆技术和磁珠富集文库构建技术，适用于野生稻新抗性基因及其他植物有利基因的克隆。

Description

一种克隆野生稻新抗性基因的方法

技术领域

本发明属于植物基因克隆技术领域，特别涉及一种克隆野生稻新抗性基因的方法。

背景技术

野生稻中蕴含丰富的有利基因，被誉为植物大熊猫。由于长期处于野生状态，野生稻在其生长过程中要受到包括病毒、细菌、霉菌和线充等多种病原生物的侵害，同时还要经受各种自然灾害和不良环境的选择，从而在缓慢的进化过程中形成了对各种病虫害的抗性和各种逆境的适应性，如抗病、抗虫、耐寒、耐旱、耐盐碱、耐淹、耐荫以及高产、优质、雄性不育、磷钾高效利用等性状，这些优良性状都是水稻遗传改良的重要基因资源。野生稻有利基因资源的成功挖掘和利用曾带来了世界的二次绿色革命：从野生稻中转育矮秆基因到栽培稻带来了第一次绿色革命；袁隆平院士最先从野生稻中发现野败不育基因并成功培育了杂交水稻，开创了第二次绿色革命。

对于产物未知的植物抗性基因的克隆，现阶段常用的策略是图位克隆法和转座子标签法。图位克隆法是分离克隆基因的一种方法，需要先要构建一个覆盖目的基因区域的精密分子标记遗传连锁图，并以此为基础进一步制作覆盖目标基因区域的物理图谱，获得包含目的基因的克隆及候选基因，最后通过转化验证。在分离性状简单稳定的条件下，理论上任何一个基因都可以分离得到，但前提条件是前期工作基础要扎实，必须完成包括目的基因区域的精细遗传图谱、必须构建基因组文库、cDNA文库等多种文库、必须有连锁非常紧密的分子标记、目的基因所控制的性状必须容易识别等，由于野生稻基因组基础研究才刚刚起步，在尚未获得遗传图谱、物理图谱、序列图谱和表达图谱之前，要利用这一方法分离特定基因显然存在不少困难。

转座子标签法是利用转座子插入突变使某一基因失活，进而用转座子特异基因片段做探针分离出突变的目的基因，该方法需要筛选并鉴定突变体，工作量较大且转座子引起有效变异的频率很低，约10^-6～10^-4，而转座子从一个突变基因切离的频率却很高，自主转座子的跳跃很不容易控制，转座子从插入位点切离后会使原来的突变恢复或产生新的变异造成变异的不稳定性，从而无法控制和研究好底频率变异。科学家通过对转座子标签的修饰，改造成第二代转座子——非自主转座子标签，这样可以使突变得以稳定并提高转座频率，但双转座子标签仍不能解决转座因子继续转座的问题。

以上克隆技术分离克隆野生稻新基因都需要对目标基因研究比较透彻且过程烦琐、工作量巨大，因此，现阶段迫切需要寻求一种简便、有效的高通量技术来分离克隆有重要经济价值及广阔的应用前景的野生稻新抗性基因。

发明内容

为解决现有水稻基因克隆技术所存在的技术问题，本发明提供一种高效、快捷的克隆野生稻新抗性基因的方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案包括如下步骤：

(1)供体野生稻可转化基因组文库的构建；

(2)设计植物抗性基因引物，获得扩增产物用生物素标记作为探针；

(3)使用已标记探针对文库进行磁珠富集，构建富集文库；

(4)对富集文库的克隆进行鉴定分析，包括使用上述引物进行PCR分析、点杂交分析、扩增产物克隆测序分析；

(5)对利用富集文库筛选到的阳性克隆进行功能验证，筛选出野生稻新抗性基因。

本发明的技术方案能产生以下技术效果：

1、本发明利用了植物抗性基因的保守性构建富集可转化基因组文库，只要对候选抗性基因的磁珠富集文库作进一步鉴定，就可以快速搜寻到抗性基因家族的新成员，适合于现阶段对野生稻的结构基因组学背景研究不够的情况下从野生稻分离克隆新抗性基因。

2、本发明提供了一种全新高效的从文库溶液中快速构建候选抗性基因富集文库的技术方法，克服了传统的文库构建方法的过程烦琐、费时费力等缺点。

3、本发明率先大规模利用野生稻基因资源发掘水稻抗性基因，将野生稻抗性基因引入栽培稻中，并可用于其它水稻有利基因的筛选，使现有水稻品种得到整体改良。

附图说明：

图1为pCAMBIA1301质粒的酶切电泳图。

图2为pCAMBIA1301载体经HindIII酶切，Lambda DNA-6kb连接测试结果图。

图3为东乡野生稻基因组DNA质量检测结果图。

图4为东乡野生稻基因组DNA回收结果图。

图5为8-10kb和10-23kb胶块大量酶切第二次回收结果图。

图6为Qiagen胶回收试剂盒回收片段浓度测定结果图。

图7为文库质粒插入片断大小检测结果图。

图8为Nautilus^TMMiniPrepKit纯化东乡野生稻文库质粒浓度测定图。

图9为PCR检测到文库质粒中含有待富集基因结果图。

图10为探针模板回收检测图。

图11为特异性PCR产物电泳定量结果图。

图12为质粒文库富集前后比较图。

图13为富集文库的点杂交筛选图。

图14为两个阳性克隆DB19H21和DB17G9的PCR检测图。

图15为所得两个阳性克隆序列DB19H21和DB17G9与已知9个抗性基因NB-ARC保守结构域比较图。

图16为所得两个阳性克隆序列DB19H21和DB17G9序列与已知9个抗性基因的聚类分析图。

具体实施方式

实施例1：利用东乡野生稻候选抗性基因富集文库分离克隆稻瘟病和白叶枯病新抗性基因。

1、东乡野生稻可转化基因组文库的构建

1)pCAMBIA1301质粒的大量抽提及纯化

将鉴定后的小规模培养物按1∶200接种于1L的Km/LB液体培养基中，在37℃恒温摇床，225rpm培养过夜。按照分子克隆实验指南第三版大量法抽提质粒方法抽提质粒，然后将1L培养物提取的质粒溶解于3mlTE中。

将粗提的质粒转入15ml尖底离心管中，然后加入3ml预冷的5M的LiCl溶液，充分混匀，4℃，10000rpm，离心10min。将上清转入30ml尖底离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀。室温10000rpm离心10min。弃上清，在干净的卫生纸上将离心管中残留的溶液扣干。然后将沉淀物溶解于4mlTE中，并用2M的Tris碱调节pH到7.5-8.0。在每4ml溶解质粒的TE溶液，加入4g的CsCl，稍加热使CsCl固体溶解，然后转入超速离心管中，向每管中加入0.2ml、10mg/ml的EB，再用TE调节平衡，使液面离管口距离约为1mm。25℃、62500rpm，离心16hrs。离心完毕后，将离心管轻轻取出，固定于铁架台上，在暗室下，用带18号针头的5ml一次性注射器在离管底最近的一条红色的环带下附近刺穿管壁，将目的带慢慢的吸出，操作时尽量不要将分层的液面搅动。把含超螺旋质粒的液体转入新的超速离心管中，加入含有1g/ml CsCl的TE溶液，向其中加入10mg/ml、0.05ml的EB，25℃、625000rpm离心16hrs。同上从超速离心管中取出超螺旋质粒，转入到1.5mlEP管中，然后加入等体积的用TE饱和的异戊醇，用16000rpm离心5min，吸取上清部分，重复以上步骤用异戊醇抽提EB，直至上清溶液颜色由红色变成无色透明。

将上清液体转入50ml的透明离心管中，加入3倍体积的TE，然后加入8倍于含有CsCl的上清液体体积的无水乙醇，4℃下静置15min。然后，4℃、20000g离心15min。将上清转入新的50ml离心管，加入等体积的无水乙醇，4℃、静置15min以上，4℃、20000g，离心15min。将两次离心的沉淀用70％的乙醇洗涤两次，在干净的卫生纸上将离心管中残留的液体扣干。用合适体积的TE溶解，使终浓度为1mg/ml，分装后放入-20℃低温冰箱保存。

2)pCAMBIA1301质粒的大量酶切

pCAMBIA1301质粒的质粒浓度确定。用已知浓度的Lambda DNA作为Marker，1.0％的琼脂糖，150V，普通琼脂糖电泳20min，电泳完毕后在EB工作液中染色20min，对纯化的pCAMBIA1301质粒的浓度进行测定；对比紫外分光光度计的结果。在以下反应体系对载体进行限制性酶切反应：

DNA(pCAMBIA1301)10×bufferSpermidine(40mM)HindIII(15U/μl，Takara)ddH₂O

10μl40μl20μl2μl328μl

以上反应体系在37℃下反应2hrs后补加15U的HindIII，37℃，再继续反应1hrs后进行电泳，(参见图1)，图中M₁为LambdaDNA/HindIII marker，1-3分别为pCAMBIA1301质粒经XhoI、BamHI、HindIII酶切的效果，4为超高速离心纯化质粒，M₂为100bp marker。

分别将2ul酶切前和酶切后的质粒溶液，转化DH10B感受态，用1ml的SOC在37℃，225rpm条件下复苏1hr，将1hr培养物涂布于Km/LB固体培养基上，然后放置于37℃生化培养箱中，培养过夜。当酶切后的产物转化后出现极少量的克隆则表明酶切比较彻底，继续进行去磷酸反应。向酶切后的反应体系加入1/10体积的pH7.0、3M的NaAC和2倍体积的无水乙醇，-80℃放置10min，10000rpm，离心15min。用70％乙醇洗涤沉淀，在干净的卫生纸上将离心管中残留的液体扣干，最后将沉淀溶解于40ul的TE中。

3)载体的去磷酸化

根据琼脂糖凝胶电泳测定的酶切后载体的浓度，计算其pmol数。然后按以下反应体系进行去磷酸化反应：40ul的DNA(pCAMBIA1301/HindIII)，40ul的10buffer，按0.1U/pmol加1U/ul CIAP，最后加dd H2O使终体积为400ul，37℃下反应30min。去磷酸化反应结束后立即加入4ul的0.5M、pH8.0的EDTA，20ul的10％SDS，40ul的1mg/ml proteinase K，56℃下反应30min。反应结束后在室温条件下进行冷却，然后分别用1倍体积的苯酚、1∶1的苯酚+氯仿、氯仿抽提。然后加入1/10倍体积的3M、pH7.0的NaAC和2倍体积的无水乙醇，-80℃放置10min，10000rpm，离心15min。再用70％的乙醇对沉淀进行洗涤，在干净的卫生纸上将离心管中残留的溶液扣干，最后将沉淀溶解于无菌的ddH₂O。通过1.0％的琼脂糖电泳确定其浓度，调整DNA溶液终浓度为40-60ng/ul，将溶液等份分装后，放置于-20℃低温冰箱中进行保存。然后进行去磷酸化效果检测。

4)处理后载体质量的检测

将Lambda DNA质粒用pCAMBIA1301质粒的大量酶切的方法进行酶切，酶切后利用步骤3)中有机溶剂抽提，然后加入1/10倍体积的3M、pH7.0的NaAC和2倍体积的无水乙醇，-80℃放置10min，10000rpm，离心15min。用70％乙醇洗涤沉淀，在干净的卫生纸上将离心管中残留的溶液扣干，将沉淀溶解于适当体积的TE中，然后用1.0％的琼脂糖电泳确定其浓度。将处理好的pCAMBIA1301载体和Lambda/HindIII按照1∶10的摩尔比浓度在10ul反应体系中，用PCR热循环仪，16℃条件下进行连接过夜，连接完毕后，将连接液在65℃条件下失活15min。并设置连接对照：酶切的pCAMBIA1301，去磷酸化的pCAMBIA1301。

取2ul连接液，电击转化到DH10B感受态中，用1ml的SOC对电转后的细胞进行1hr复苏。吸取1hr的培养物0.1ml涂布于Km/LB，IPTG/X-gal固体培养基上，放入37℃生化培养箱中，培养过夜。共有5个处理：pCAMBIA1301以确定转化效率；酶切的pCAMBIA1301回收产物以确定酶切效果；酶切的pCAMBIA1301自连以确定连接效果；去磷酸化的pCAMBIA1301自连以确定去磷酸化效果；pCAMBIA1301载体和Lambda/HindIII的连接产物以确定与插入片断连接效果。

挑取重组单克隆，接种于Km/LB液体培养基中，在37℃恒温摇床、225rpm条件下培养过夜。参照分子克隆第三版的SDS碱裂解法小量制备质粒DNA提取pCAMBIA1301重组质粒。采用HindIII酶对提取的重组质粒进行酶切，一般采用20ul反应体系，37℃，反应1～2hr。通过0.7％的普通琼脂糖电泳进行检测，电泳完毕后，将凝胶在EB工作液中浸泡20min，然后用凝胶成像系统拍照。确定是否有插入片段来判断载体的处理质量。以载体的空载率小于10％，克隆数≥2cfu/ul判断为质量较好。

5)载体特定片段的连接测试。

将处理后的pCAMBIA1301载体与用HindIII酶切的Lambda DNA-6kb片段按照摩尔比浓度为1∶5室温连接一小时后连接过夜，并将1ul连接液电击转化DH10B，通过统计单克隆数的数目来判断处理的载体去磷酸化效果，即处理过的载体是否可以用于文库构建(参见图2)，计算显示克隆数大约为1600个，克隆数＞8cfu/ul。同时对处理好的载体进行自连并电击转化DH10B，结果只出现少数的克隆。阳性克隆用HindIII酶切进行酶切分析，琼脂糖凝胶电泳。

6)包埋法提取东乡野生稻大片段基因组DNA

取50g分装保存于-80℃的东乡野生稻幼嫩叶片，在液氮预冷的研钵中加液氮将其迅速研磨成比较细的粉末。将研磨好的叶片粉末转入到1L的三角瓶中，加入500ml预冷的BME，冰上放置12min，期间每2min对溶液轻摇20s。用四层无菌的纱布对混合物进行过滤，将溶液转入另一个无菌的预冷的1L三角瓶中，纱布过滤两次，过滤完后再用2～4层无菌的擦镜纸对溶液进行过滤，然后溶液转入到新的预冷的1L三角瓶中，过滤好的溶液颜色一般为淡黄绿色。然后加入25ml的Lysis buffer，冰上放置12min，期间每2min轻摇溶液20s。

将溶液分装于50ml离心管中，用转头T12A4，4℃，3200rpm离心12min。弃上清后用3～5ml BME重旋，将两管悬液并入一管中，将离心管加满BME，4℃，3200rpm离心12min。重复以上步骤，直到悬液全部并入一个离心管中，用BME重悬，4℃，1300rpm，离心12min。如果沉淀物颜色有明显的绿色物质，可通过增加离心次数和降低离心力来尽可能的将叶绿体从中分离出去。沉淀物为淡的黄绿色最佳。用NIB重悬沉淀，4℃，3200rpm离心12min。轻弃上清，留沉淀物大小1/2体积的NIB重旋沉淀。将重旋液和已经溶解好的1.0％的低熔点琼脂糖在45℃恒温浴中预热7min，将两者等体积混合。混合后琼脂糖的浓度控制在0.3％～0.5％。将混合物用大口吸头转入plugmold中，每个孔的体积约为85μl，将plug mold置于冰上放置60min使琼脂糖凝固好。

用plug mold配套的工具将胶块挤出到50ml离心管中，然后向离心管中加入含1mg/ml proteinase K的EPS buffer，体积为胶块数的10倍体积，将离心管置于50℃的水浴摇床中，低速振荡24hrs。轻轻的将EPS buffer倒掉，加入同体积的含1mg/ml proteinase K的EPS buffer，将离心管置于50℃的水浴摇床中，低速振荡24hrs。轻轻的将EPS buffer倒掉，按每个胶块加入1ml T₁₀E₁₀溶液，其中PMSF终浓度为1mM，室温下轻摇1hr，重复此步骤一次。弃掉溶液，按每个胶块加入1ml T₁₀E₁溶液，室温下轻摇1hr，重复此步骤三次。将胶块保存于T₁₀E₁中，置于4℃冰箱，可放置半年而DNA不发生明显降解。

将1/2、1/4、1/8、1/16大小的胶块依次放入到1×TAE配置的1.0％浓度的琼脂糖胶的胶孔中，用1.0％的低熔点琼脂糖胶将胶孔封好，冷却后将琼脂糖胶放入脉冲电泳仪电泳槽中，按下面的参数条件进行脉冲电泳：1TAE；buffertemperature＝12℃；volts/cm＝6.0；included angle＝120；initial switchtime＝1s；final switch time＝40s；ramping＝linear；run time＝20hrs。电泳完毕将琼脂糖胶放入到EB工作液中浸泡20～30min，凝胶成像系统拍照(参见图3)，图中M为NEB脉冲marker，1-4分别是1/16、1/8、1/4、1/12大小的胶块电泳效果。

7)野生稻基因组DNA的酶切和分离

为获得高质量的基因组DNA，对包埋的胶块进行回收，将包埋块通过下列参数：5V/cm，12℃，switch time＝50s，time＝4h，将包埋胶块中的DNA回收至0.6％的低熔点琼脂糖。回收与包埋胶块相邻的3～5mm胶块，并用TE洗涤(参见图4)，再进行梯度酶切实验：配置15ml Hind的1×工作缓冲液，分别吸取250ul 1×工作缓冲液于11个标记为a-k的1.5ml的EP管中。将回收的100mg的低熔点琼脂糖胶块保存于T₁₀E₁的胶块放入到剩下的HindIII 1×工作缓冲液，置于冰上放置1hr。配置两个不同浓度的HindIII溶液，配方如下：

Dilution I	[HindIII]＝2U/μl	Dilution II	[HindIII]＝0.2U/μl
Dilution I	[HindIII]＝2U/μl	Dilution II	[HindIII]＝0.2U/μl	HindIII(15U/μl)10bufferddH2O	13.3μl10.0μl76.7μl	HindIII(15U/μl)10bufferddH2O	10μl10μl80μl

然后在a-k这11个管中按下表的量加入HindIII

试管编号	加入到管中的体积	HindIII在250μl反应体系的酶量(U)	HindIII在1000μl反应体系的酶量(U)
试管编号	加入到管中的体积	HindIII在250μl反应体系的酶量(U)	HindIII在1000μl反应体系的酶量(U)	abcdefghIJK	01.0μl的dilution II2.5μl的dilution II5.0μl的dilution II7.5μl的dilution II1.0μl的dilution I1.5μl的dilution I2.0μl的dilution I2.5μl的dilution I5.0μl的dilution I3.3μl的undiluted HindIII	00.20.51.01.52.03.04.05.010.050.0	00.82.04.06.08.012.016.020.040.080.0

将胶块从HindIII工作缓冲液中取出，在洁净的载玻片上用经乙醇消毒的盖玻片将每个胶块放入b-k管，a中放入200mg胶块，置于冰上放置1h，使酶与胶块的中的DNA充分接触。1h后将11个管子在37℃恒温水浴中准确反应20min，然后马上将11个管子插在冰上，每个管中加入，pH8.0、0.5M的EDTA 30ul，终止酶活反应。将HindIII/Lambda Marker，10kbmarker及各个管中的胶块依次放入到1TAE配置的1.0％浓度的琼脂糖胶的胶孔中，用1.0％的低熔点琼脂糖胶将胶孔封好，冷却后将琼脂糖胶放入脉冲电泳槽中，按以下参数条件进行脉冲电泳：1TAE；buffer temperature＝12℃；volts/cm＝6.0；included angle＝120；initial switch time＝1s；final switch time＝40s；ramping＝linear；runtime＝20hrs。电泳完毕将琼脂糖胶放入到EB工作液中浸泡20～30min，通过凝胶成像系统拍照。根据酶切产生的片段是否在所需片段的范围内来确定最佳的酶量

用酶切测试确定的最佳酶量对回收胶块进行大量酶切，准确反应之后按上述的参数进行脉冲电泳。开始第一次分离：切取边缘少量的酶切胶块进行EB染色，然后准确度量确定8-10kb和10-23kb位置，切取含有目的片段未染色的胶块；第二次分离：对8-10kb和10-23kb胶块以以上条件再回收(参见图5)，图中M₁为LambdaDNA/HindIII marker，M₂为10kb marker，A为10-23kb回收效果，B为8-10kb回收效果。最后使用Qiagen试剂盒对含目的片段的胶块进行胶回收操作。用已知浓度的Lambda DNA作为Marker、1.0％的琼脂糖、150V普通琼脂糖电泳20min，电泳完毕后在EB工作液中染色20min(参见图6)，图中1～5分别为浓度是50、25、10、5、2.5ng的Lambda DNA电泳效果，6～7分别为0.5ul回收的8-10kb和10-23kb电泳效果，8为0.5ul处理的pCAMBIA1301质粒电泳效果。

8)连接反应及电击转化

将处理后的pCAMBIA1301载体与用HindIII酶切进行两次分离的东乡野生稻8-10kb和10-23kb片段按照摩尔比浓度为1∶5室温连接1小时后连接过夜，并将连接液在0.025um Millipore滤膜、10％PEG8000上进行脱盐和浓缩1.5-2hrs。然后用宽口吸头轻轻地将连接液放入1.5ml EP管中，可以在4℃条件下短时间保存，也可在-20℃做较长时间的保存。取1ul浓缩连接液电击转化20ulInvitrogen ElectroMAX^TMDH10B^TMCells。电击参数为：1800V，25uF，20Ω，1mm，在37℃恒温摇床、225rpm条件下复苏1hrs，然后将培养物涂布于含有Km的LB固体培养基中，于37℃培养过夜。共获得80个平板，平均每个平板单克隆数为1700-2000个，故文库共有约130000-150000个克隆。

9)东乡野生稻文库的检测及文库质粒抽提

随机在平板挑取100个克隆进行文库插入片断大小的检测，过夜培养并用分子克隆实验指南第三版小量抽提质粒法抽提质粒，20ul反应体系，37℃，反应1-2h(参见图7)，图中M为LambdaDNA/HindIII marker，1-15分别为文库质粒经BamH I酶切鉴定结果，16为pCAMBIA1301载体经BamH I酶切结果，M为LambdaDNA/HindIII marker。进行文库容量的估计：根据文库所抽提的100个单克隆质粒，自连＜1％，空载＜0.5％，平均插入片断长度9.5kb，覆盖东乡野生稻基因组约3.28倍，覆盖每个基因的概率为96.2％。

由于含有质粒的细菌间发生竞争时不利于基因的选择，故先将细菌在平板上扩增然后刮取扩增的单克隆优于使用液体培养基的方法。对于在起始文库中含量很少的基因，有必要进行第二轮的富集。第一轮富集的DNA作为第二轮富集的起始材料。将5mlLB加入到平板中，小心的将平板上的菌落用涂布棒混入液体中。按此方法一般能得到2000-3500个克隆。用移液枪将细胞悬液移至50ml的离心管中，重复此步操作，将所有的平板中的克隆收集。4℃，4000rpm离心10min，小心的倒掉上清。使用Nautilus^TMMiniPrep Kit抽提质粒并将浓度定至1μg/ul。提取质粒后对DNA进行定量(参见图8)，图中1～6分别为浓度100、50、25、10、5、2.5ng的Lambda DNA，7～8分别为两批纯化0.5ul文库质粒DNA。用筛选引物检测富集后的DNA，与富集之前进行定量比较。将纯化的文库质粒分装后-80℃保存。采用PCR分析检测到文库中确实含有所要富集的基因(参见图9)，图中M为100bp marker，1～3分别为pCAMBIA1301、文库质粒、探针模版相同的五对混合引物扩增。引物设计及扩增方法均按本实施例候选抗性基因富集文库的构建所述方法。

上述实施例仅对双元质粒载体文库的构建进行了详细说明，同样本发明涉及的野生稻可转化基因组文库也可以采用普通双元质粒载体文库或双元细菌人工染色体文库。

2、候选抗性基因富集文库的构建

1)引物设计

根据已克隆的抗稻瘟病基因Pi-9的NBS和LRR保守序列设计三对特异性引物：

①Pi-9N(上游引物：5-TGGTTTAGGCAAGACAGC-3，下游引物：5-ATGTTATGGCATCGTT CA-3)

②Pi-9L1(上游引物：5-GATGTTACGGGTCTTGGA-3，下游引物：5-ACTACTGGTCCGCCTGAT-3)

③Pi-9L2(上游引物：5-ATGTGAATGCTGCGTTAT-3，下游引物：5-GCCTAGCCAC TTTACTTTT-3)

根据抗白叶枯基因Xa21的LRR和STK保守序列设计两对特异性引物：

④Xa21L(上游引物：5-GCGATAACTCCATCCAAG-3，下游引物：5-TCCACTGAACAAGTTGCC-3)

⑤Xa21S(上游引物：5-GTTTCACTGCCGAATGTG-3，下游引物：5-CGAGCTTGTTGACTGTTG-3)

根据NBS-LRR类及STK类抗病基因保守区域设计并合成两对简并引物：

⑥RNL1F 5’-GGN GGN NTN GGN AAR ACN AC-3’，RNL1R 5’-AN NSH NAR NGG NAR NCC-3’

⑦RS1F 5’-TTY GGN RDN GTN TAY MRN GG-3’，RS1R5’-AY NCC RWA NGA RTA NAY RTC-3’

(简并引物中混合碱基代码：R＝A/G，W＝A/T，Y＝C/T，M＝A/C，S＝C/G，H＝A/T/C，N＝A/T/G/C.)

2)探针模板的制备

制备用于探针合成的DNA模板并检测文库中是否含有所需要富集的基因，PCR反应体系(35ul)为：

文库质粒10×PCR buffer(200mM Tris-HCl pH＝8.0，500mM KCl)50m的MgCl250％Glycerol10mM的dNTP Mix五对上游引物等量混合(5μM)五对下游引物等量混合(5μM)Taq DNA Polymerase(5U/μl)ddH₂O

14.0ul2.5ul0.75ul5.0ul0.5ul1.0μl1.0μl0.25μl10μl

PCR反应程序如下：

①95℃预变性3min；②95℃变性1min→54.3℃退火1min→72℃延伸1min，共进行34个循环；③72℃延伸7min。可以根据设计的引物对条件进行适当调整。

3)模板的纯化

取摸板12μl，用1％的琼脂糖胶电泳检测PCR产物的纯度，选择用于探针合成的最佳模板。对产物进行胶回收用于探针合成(参见图10)，图中M为100bpmarker，1～4分别为Pi-9L2、Pi-9L1、Xa21S和Xa21L四对特异性引物对东乡基因组DNA扩增片段。结果显示四个引物组合均能够产生特异的PCR产物。

4)探针生物素标记

PCR反应体系(50μl)为：

DNA模板(五种引物扩增模板等量混合)10×buffer(200mM Tris-HCl pH＝8.0，500mM KCl)50m的MgCl₂50％GlycerolBiotin-dNTP Mix五对上游引物等量混合(5μM)五对下游引物等量混合(5μM)5U/μl Taq DNA PolymeraseddH₂O

0.5μl5.0μl1.5μl10.0μl7.0μl2.0μl2.0μl0.5μl21.5μl

PCR反应程序如下：

①95℃预变性3min；②95℃变性1min→54.3℃退火1min→72℃延伸2min，共进行34个循环；③72℃延伸7min。

5)探针的回收

取2μl PCR产物用1％的琼脂糖胶进行电泳，检测产物的纯度和浓度。对胶回收的特异性PCR产物进行回收，通过电泳或者光吸收进行定量(参见图11)，图中M为100bp marker，1为混合引物扩增生物素探针。每50μl PCR反应体系应该产生0.5～1.5μg的探针。回收后用含10mM Tris-HCl、pH＝8.0，0.1mM EDTA的TE)将探针浓度稀释到25ng/μl。

6)富集反应

按以下步骤进行生物素标记的探针包装重组酶：将50ng生物素标记的探针加入1.5ml的EP管中，并加入足够的水，使终体积为12.4μl；将探针在95℃变性3min，在冰上淬火1min。短时间离心使液体聚集到管底；在0.5mlEP管中依次加入：5×Coating Mix 6.0μl、Nucleotide Cofactor3.7μl、RecA recombinase0.7μl、准备RecA反应混和液；将10.4μl的RecA反应混和液加入含有12.4μl 50ng变性的生物素标记探针中，轻轻的混和；37℃温浴15min。为了优化试验，此步操作之后不要将样品放到冰上。在温浴的过程中开始磁珠的准备。

在温浴开始磁珠的准备：磁珠的体积和其他缓冲液的体积应该跟据样品的数目按比例增加。具体步骤为：轻轻的涡旋亲和素标记的磁珠成悬液，每个反应在1.5mlEP管中加入30μl的磁珠悬液。每次反应加入100μl Binding Buffer，然后室温下在环形摇床上混匀2min；低速短时间离心把所有的液体聚集的管底；打开EP管盖并放置到磁力架上1min，将EP管放置到磁力架上，小心的用移液器去上清；重复用100μl Binding Buffer洗两次，一共洗三次；先将30μl BindingBuffer加入盛有磁珠的EP管中，然后每次反应加入2μl没有稀释的CompetitorDNA饱和非特异性的结合位点，轻轻摇匀并放到环形摇床上室温下摇匀10-30min；短时间离心将所有液体沉到管底，敞开EP管盖，放置到磁力架上大约1min。EP管放到磁力架上的同时，小心的去上清，每个反应加入30μl Bindingbuffer。

进行探针与目的片断杂交：先将1.5μl CompetitorDNA和148.5μl TE加入到0.5ml EP管中，取1.5μl 1∶100稀释液倒新的0.5mlEP管中，95℃变性3min，在冰上淬火1min。短时间离心把管内液体沉到管底；再将已标记的生物素探针包装反应物从37℃取出，加入1∶100变性的Competitor DNA 1μl，轻轻的用移液器充分混匀；立即加入试剂盒提供的Targeting Additive 1.2μl、质粒文库混合液5.0μl，总体积为30.0μl；轻轻混匀后在37℃放置20min；加入1.2μl SDS去除核酸核蛋白中的蛋白，总体积为31.2μl；再轻轻的混匀并在37℃温浴10min。

与磁珠进行杂交结合：先将30μl处理的磁珠加到盛有31.2μl同源重组反应的EP管中，总体积为61.2μl；再将混合液室温在环形摇床上摇匀30min，使磁珠与同源重组形成的杂交复合物连接；进行短时间离心，使管中的液体沉到管底；打开EP管盖并放置到磁力架上1min，小心的用移液器去上清；加入1ml的WashBuffer，室温下在环形摇床上摇匀5min。短时间离心使管内的液体沉到管底，将EP管放置到磁力架上，小心的用移液器去上清。再重复该步操作3次，一共处理4次；加入1ml 0.1×TE，室温下在环形摇床上摇匀5min。打开EP管盖并放置到磁力架上1min，将EP管放置到磁力架上，小心的用移液器去上清；加入10μl0.1×TE，充分混合，用移液枪充分的重悬磁珠混合液；将磁珠重悬液加入到新的0.5mlEP管中，65℃温浴5min，以洗脱目的DNA；将管放置到磁力架上，室温下使磁珠聚集，小心的将上清移至新的0.5mlEP管中。上清中含有富集的目的DNA。

使用InvitrogenDH10B感受态细胞进行转化。富集前后的比较(参见图12)，图中A表示质粒文库富集前，B表示经RecActive^TM富集试剂盒提供的质粒文库富集后，图中可以观察到质粒文库富集后菌落密度远远超出富集前。

挑取单菌落至含80μl LB冻存液为384孔板，并进行复制以制备富集平板文库，共3板，其中两块保存，另1块使用。

3、富集鉴定与筛选

由于富集文库DNA转化的感受态所铺的平板太密集会使挑单克隆非常困难。故稀释SOC转化物后重新铺平板，并在37℃过夜培养16小时。

1)点杂交实验

对富集平板，使用生物素标记的探针，按点杂交方法检测，并设置阳性和阴性对照(参见图13)。图中显示3块平板共筛选12个阳性克隆。

2)PCR鉴定及扩增产物的克隆测序

为了保证获得含量低的基因和基因的全长度，使用两个96孔板，将含有Km抗生素的LB加入到96孔板中；从平板上挑取单克隆至含有LB的96孔板中，用渗透性膜封好96孔板防止污染；将96孔板在37℃温浴2hrs；再将9μl水加到两个新的96孔PCR板上；加1μl 37℃温浴的克隆平板样品到相应的96孔板上，留出两个孔作为阳性和阴性对照。用100ng的文库DNA作为阳性对照；将其在PCR仪上95℃变性10min，快速的在冰上淬火；在每个96孔板中加入15μl下列反应混和物：

10×PCR buffer(200mM Tris-HCl pH＝8.0，500mM KCl)50m的MgCl250％Glycerol10mM的dNTP Mix5μM正向引物5μM反向引物Taq DNA Polymerase(5U/μl)ddH₂O

2.5μl0.75μl5.0μl0.5μl1.0μl1.0μl0.25μl4.0μl

PCR反应程序为：①95℃预变性3min；②95℃变性1min→54.3℃退火1min→72℃延伸2min，共计34个循环；③72℃延伸7min。反应后通过12μl点样到1％的琼脂糖胶上，检测PCR产量。选择与预期条带一样的阳性克隆。进行扩增片断克隆与测序：挑取2个阳性克隆DB19H21和DB17G9抽提质粒后，用PCR进行扩增鉴定(参见图14)，图中M为100bp marker，1-12均为阳性克隆。同时用TA载体进行克隆。上述2个阳性克隆测序结果见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

由于氨基酸水平上更容易反映序列的保守性，采用SMS软件将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2翻译成蛋白序列，结果见SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

因为序列DB19H21与DB17G9是采用简并引物扩增得到的，将其氨基酸序列用NCBI网站上的blastp程序进行分析，显示所得的序列中含有保守的NB-ARC结构域。该区域为植物抗病基因产物中的信号传导结构，含有典型的保守区的P-loop(GGXGKTT)、Kinase-2(VLDD)、Kinase-3(SRXXXTTR)和跨膜区GLPL结构，为NBS-LRR类型抗病蛋白编码基因。

从NCBI网站上获得已知的9个植物抗病基因RPS2、RPS-2、I2C-1、I2C-2、RPP13、RPP8、RPM1、Prf、RPP5的序列，利用ClustalX 1.81软件对这9个已知的植物抗病基因的NB-ARC保守区域序列(SEQ ID NO.5～13)与DB19H21、DB17G9序列的保守结构域序列(SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15)之间进行比对，发现它们的保守结构域高度一致(参见图15)，且都具有抗病基因的NBS特征结构域。

将所得的氨基酸序列与9个已知抗性基因的序列在氨基酸水平上进行聚类分析(参见图16)，结果表明：DB19H21、DB17G9与Prf基因的亲缘关系较近，与RPP5的亲缘关系较远；同时DB19H21、DB17G9被聚为一类，由此推测这两个序列可能属于同一个基因家族。鉴于Prf基因已经被证明是蕃茄中的一个抗细菌性斑点病的基因，故推测所得到的序列也是一个新候选抗性基因。

Untitled.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>湖南西城杂交水稻基因科技有限公司

长沙杂交水稻基因工程技术研究中心

<120>一种克隆野生稻新抗性基因的方法

<130>

<160>15

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>504

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<400>1

gggggggtgg ggaagacgac actagctcag aaaatattca atgataaaaa attagaaggg

60

agatttgacc atcgtgcctg ggtttgtgtc tccaaggagt attctatggt ttcccttttg

120

acacaagttc ttagtaacat gaaaattcat tatgaacaaa atgaatcagt tgggaacctt

180

caaagcaaac tcaaagcagg cattgcagac aagagttttt tccttgtgtt ggatgatgta

240

tggcactata aagcatggga agatttacta agaactccac taaatgcggc agccacagga

300

ataattctag taactactcg agatgaaact attgctcgtg taattggggt ggaccggact

360

catagagttg atttgatgtc agccgatgta ggatgggagt tactttggag gagcatgaac

420

atcaaagaag agaaacaagt gaaaaatcta cgggacacag gtatcgagat tgtccgcaaa

480

tgtggtggcc tccccctcgc cctc

504

Untitled.ST25

<210>2

<211>504

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<400>2

gggggggtgg ggaagacgac actagctcag aaaatattca atgataaaaa aataaaagat

60

caattcaaca tgcatacatg ggtctgtgtt accaaggact attctgaagc ttctattttg

120

agagaaattc ttcggaacat gggaaagcca tatgcgcaag atgaatcagt tggagagctc

180

caaattaagc tccaatcagc cattgaaggg aagagttttt tccttgtgtt ggatgatgtg

240

tggcaatctg aagcatggac aaatttacta agaactccac tgcgtgctgc agccacagga

300

atacttctag tgactacacg acatgataat atcacaaaag aaattgggac aaaccatact

360

catagagtaa atttgatgtt agctgatgtg ggatgggagc tactttggag gagcttgaac

420

atcgatgaag aaaaaccagt gcaaaaactg cggaacatag ggattgagat tgttcgcaga

480

tgtgatggcc tccccctcgc cctc

504

<210>3

<211>168

<212>PRT

<213>Oryza sativa

<400>3

Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Leu Ala Gln Lys Ile Phe Asn Asp Lys

1 5 10 15

Lys Leu Glu Gly Arg Phe Asp His Arg Ala Trp Val Cys Val Ser Lys

20 25 30

Untitled.ST25

Glu Tyr Ser Met Val Ser Leu Leu Thr Gln Val Leu Ser Asn Met Lys

35 40 45

Ile His Tyr Glu Gln Asn Glu Ser Val Gly Asn Leu Gln Ser Lys Leu

50 55 60

Lys Ala Gly Ile Ala Asp Lys Ser Phe Phe Leu Val Leu Asp Asp Val

65 70 75 80

Trp His Tyr Lys Ala Trp Glu Asp Leu Leu Arg Thr Pro Leu Asn Ala

85 90 95

Ala Ala Thr Gly Ile Ile Leu Val Thr Thr Arg Asp Glu Thr Ile Ala

100 105 110

Arg Val Ile Gly Val Asp Arg Thr His Arg Val Asp Leu Met Ser Ala

115 120 125

Asp Val Gly Trp Glu Leu Leu Trp Arg Ser Met Asn Ile Lys Glu Glu

130 135 140

Lys Gln Val Lys Asn Leu Arg Asp Thr Gly Ile Glu Ile Val Arg Lys

145 150 155 160

Cys Gly Gly Leu Pro Leu Ala Leu

165

<210>4

<211>168

<212>PRT

<213>Oryza sativa

<400>4

Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Leu Ala Gln Lys Ile Phe Asn Asp Lys

1 5 10 15

Untitled.ST25

Lys Ile Lys Asp Gln Phe Asn Met His Thr Trp Val Cys Val Thr Lys

20 25 30

Asp Tyr Ser Glu Ala Ser Ile Leu Arg Glu Ile Leu Arg Asn Met Gly

35 40 45

Lys Pro Tyr Ala Gln Asp Glu Ser Val Gly Glu Leu Gln Ile Lys Leu

50 55 60

Gln Ser Ala Ile Glu Gly Lys Ser Phe Phe Leu Val Leu Asp Asp Val

65 70 75 80

Trp Gln Ser Glu Ala Trp Thr Asn Leu Leu Arg Thr Pro Leu Arg Ala

85 90 95

Ala Ala Thr Gly Ile Leu Leu Val Thr Thr Arg His Asp Asn Ile Thr

100 105 110

Lys Glu Ile Gly Thr Asn His Thr His Arg Val Asn Leu Met Leu Ala

115 120 125

Asp Val Gly Trp Glu Leu Leu Trp Arg Ser Leu Asn Ile Asp Glu Glu

130 135 140

Lys Pro Val Gln Lys Leu Arg Asn Ile Gly Ile Glu Ile Val Arg Arg

145 150 155 160

Cys Asp Gly Leu Pro Leu Ala Leu

165

<210>5

<211>70

<212>PRT

<213>arabidopsis thaliana

<400>5

Untitled.ST25

Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Leu Met Gln Ser Ile Asn Asn Tyr Asp

1 5 10 15

Val Leu Ile Trp Val Gln Met Ser Lys Arg Phe Leu Leu Leu Leu Asp

20 25 30

Asp Val Trp Leu Glu Lys Thr Gly Val Pro Arg Pro Lys Val Met Phe

35 40 45

Thr Thr Arg Ile Arg Arg Leu Ala Glu Ile Ile Val Ser Lys Cys Gly

50 55 60

Gly Leu Pro Leu Ala Leu

65 70

<210>6

<211>70

<212>PRT

<213>arabidopsis thaliana

<400>6

Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Leu Phe Lys Lys Ile His Asn Phe Asp

1 5 10 15

Ile Val Ile Trp Ile Val Val Ser Lys Arg Phe Val Leu Met Leu Asp

20 25 30

Asp Ile Trp Leu Glu Ala Ile Gly Ile Pro Tyr Pro Lys Val Ala Phe

35 40 45

Thr Thr Arg Ile Val Glu Leu Ala Arg Glu Val Ala Gln Lys Cys Arg

50 55 60

Gly Leu Pro Leu Ala Leu

65 70

<210>7

Untitled.ST25

<211>70

<212>PRT

<213>lycopersicom esculentum

<400>7

Gly Gly Met Gly Lys Thr Thr Leu Ala Lys Ala Val Tyr Asn Phe Gly

1 5 10 15

Leu Thr Ala Trp Phe Cys Val Ser Lys Arg Phe Leu Val Val Leu Asp

20 25 30

Asp Val Trp Trp Asp Asp Leu Arg Asn Leu Phe Leu Lys Ile Ile Val

35 40 45

Thr Thr Arg Phe Glu Glu Val Gly Lys Gln Ile Ala Asp Lys Cys Lys

50 55 60

Gly Leu Pro Leu Ala Leu

65 70

<210>8

<211>70

<212>PRT

<213>lycopersicom esculentum

<400>8

Gly Gly Leu Gly Lys Thr Thr Leu Ala Lys Ala Val Tyr Asn Phe Asp

1 5 10 15

Leu Lys Ala Trp Phe Cys Val Ser Lys Lys Phe Leu Ile Val Leu Asp

20 25 30

Asp Val Trp Trp Asp Glu Leu Arg Asn Val Phe Val Lys Ile Ile Val

35 40 45

Thr Thr Arg Leu Glu Glu Val Gly Arg Gln Ile Ala Ala Lys Cys Lys

50 55 60

Untitled.ST25

Gly Leu Pro Leu Ala Leu

65 70

<210>9

<211>70

<212>PRT

<213>arabidopsis thaliana

<400>9

Gly Gly Leu Gly Lys Thr Ala Leu Ala Arg Lys Leu Tyr Asn Phe Glu

1 5 10 15

Tyr Arg Ala Trp Thr Tyr Val Ser Lys Lys Tyr Leu Val Val Val Asp

20 25 30

Asp Ile Trp Trp Asp Ser Leu Lys Arg Ala Leu Pro Arg Val Ile Ile

35 40 45

Thr Thr Arg Leu Leu Lys Thr Gly Lys Glu Met Val Gln Lys Cys Arg

50 55 60

Gly Leu Pro Leu Cys Ile

65 70

<210>10

<211>70

<212>PRT

<213>arabidopsis thaliana

<400>10

Gly Gly Ile Gly Lys Thr Thr Leu Ala Arg Gln Val Phe His Phe Asp

1 5 10 15

Gly Phe Ala Trp Val Cys Val Ser Gly Arg Tyr Leu Val Val Leu Asp

20 25 30

Asp Val Trp Trp Asp Val Ile Lys Ala Val Phe Pro Lys Met Leu Leu

Untitled.ST25

35 40 45

Thr Ser Arg Met Glu Ala Met Gly Lys Glu Met Val Thr His Cys Gly

50 55 60

Gly Leu Pro Leu Ala Val

65 70

<210>11

<211>70

<212>PRT

<213>arabidopsis thaliana

<400>11

Gly Gly Ser Gly Lys Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ile Phe Lys Phe Glu

1 5 10 15

Ser Tyr Ala Trp Val Thr Ile Ser Lys Arg Tyr Ile Val Val Leu Asp

20 25 30

Asp Val Trp Trp Arg Glu Ile Ser Ile Ala Leu Pro Arg Val Met Met

35 40 45

Thr Thr Arg Leu Glu Pro Ile Ala Arg Lys Leu Val Glu Arg Cys Gln

50 55 60

Gly Leu Pro Leu Ala Ile

65 70

<210>12

<211>70

<212>PRT

<213>lycopersicom esculentum

<400>12

Pro Gly Leu Gly Lys Thr Thr Leu Ala Lys Lys Ile Tyr Asn Phe Asp

1 5 10 15

Untitled.ST25

Val His Ala Gln Cys Val Val Thr Lys Arg Phe Leu Ile Leu Ile Asp

20 25 30

Asp Val Trp Trp Asp Asn Leu Cys Met Cys Phe Ser Arg Ile Ile Leu

35 40 45

Thr Thr Arg Leu Glu Asp Val Gly Phe Glu Ile Ser Lys Ser Cys Arg

50 55 60

Gly Leu Pro Leu Ser Val

65 70

<210>13

<211>70

<212>PRT

<213>arabidopsis thaliana

<400>13

Ser Gly Ile Gly Lys Ser Thr Ile Gly Arg Ala Leu Phe Ser Arg Ala

1 5 10 15

Phe Leu Thr Tyr Lys Ser Thr Ser Lys Lys Val Leu Ile Leu Leu Asp

20 25 30

Asp Val Asp Leu Lys Thr Leu Val Gly Lys Ala Glu Arg Ile Ile Val

35 40 45

Ile Thr Gln Phe Lys Glu Leu Ala Phe Glu Val Ala Glu Leu Val Gly

50 55 60

Ser Leu Pro Leu Gly Leu

65 70

<210>14

<211>70

<212>PRT

<213>Oryza sativa

Untitled.ST25

<400>14

Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Leu Ala Gln Lys Ile Phe Asn Phe Asp

1 5 10 15

His Arg Ala Trp Val Cys Val Ser Lys Ser Phe Phe Leu Val Leu Asp

20 25 30

Asp Val Trp Trp Glu Asp Leu Leu Arg Thr Pro Leu Ile Ile Leu Val

35 40 45

Thr Thr Arg Leu Arg Asp Thr Gly Ile Glu Ile Val Arg Lys Cys Gly

50 55 60

Gly Leu Pro Leu Ala Leu

65 70

<210>15

<211>70

<212>PRT

<213>Oryza sativa

<400>15

Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Leu Ala Gln Lys Ile Phe Asn Phe Asn

1 5 10 15

Met His Thr Trp Val Cys Val Thr Lys Ser Phe Phe Leu Val Leu Asp

20 25 30

Asp Val Trp Trp Thr Asn Leu Leu Arg Thr Pro Leu Ile Leu Leu Val

35 40 45

Thr Thr Arg Leu Arg Asn Ile Gly Ile Glu Ile Val Arg Arg Cys Asp

50 55 60

Gly Leu Pro Leu Ala Leu

65 70

Claims

1、一种克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)供体野生稻可转化基因组文库的构建；

(2)根据植物抗性基因的保守性设计引物进行PCR扩增，用生物素标记扩增产物作为探针；

(3)使用已标记探针对文库进行磁珠富集，构建富集文库；

2、根据权利要求1所述的克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于：步骤(1)中野生稻可转化基因组文库为普通双元质粒载体文库、双元细菌人工染色体文库或可转化人工染色体文库。

3、根据权利要求1所述的克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于步骤(2)中：所述的引物为以下5对特异性引物：

①Pi-9，上游引物：5-TGGTTTAGGCAAGACAGC-3，下游引物：5-ATGTTATGGCATCGTTCA-3；

②Pi-9L，上游引物：5-GATGTTACGGGTCTTGGA-3，下游引物：5-ACTACTGGTCCGCCTGAT-3；

③Pi-9L2，上游引物：5-ATGTGAATGCTGCGTTAT-3，下游引物：5-GCCTAGCCACTTTACTTTT-3；

④Xa21L，上游引物：5-GCGATAACTCCATCCAAG-3，下游引物：5-TCCACTGAACAAGTTGCC-3；

⑤Xa21S，上游引物：5-GTTTCACTGCCGAATGTG-3，下游引物：5-CGAGCTTGTTGACTGTTG-3。

4、根据权利要求3所述的克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于：所述五对引物中Pi-9N、Pi-9L1、Pi-9L2是根据已克隆的抗稻瘟病基因Pi-9的NBS和LRR保守序列所设计的三对特异性引物，Xa21L和Xa21S是根据已克隆的抗白叶枯基因Xa21的LRR和STK保守序列所设计的特异性引物。

5、根据权利要求1所述的克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于步骤(2)中：所述的探针为以上五对引物等量混合所扩增野生稻的混合产物。

6、根据权利要求1所述的克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于步骤(2)中：所述的引物可以为以下两对简并引物：

⑥RNL1F 5’-GGN GGN NTN GGN AAR ACN AC-3’，RNL1R 5’-AN NSH NAR NGG NARNCC-3’

⑦RS1F 5’-TTY GGN RDN GTN TAY MRN GG-3’，RS1R5’-AY NCC RWA NGA RTA NAYRTC-3’。

7、根据权利要求6所述的克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于：所述两对引物是根据NBS-LRR类及STK类抗病基因保守区域设计并合成的两对简并引物，且简并引物中混合碱基代码为：R＝A/G，W＝A/T，Y＝C/T，M＝A/C，S＝C/G，H＝A/T/C，N＝A/T/G/C。

8、根据权利要求1所述的克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于步骤(2)中：所述的PCR扩增反应程序为：①95℃预变性3min；②95℃变性1min、54.3℃退火1min、72℃延伸1min，共34个循环；③72℃延伸7min。

9、根据权利要求1所述的克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于步骤(4)中：PCR反应程序为：①95℃预变性3min；②95℃变性1min、54.3℃退火1min、72℃延伸2min，共34个循环；③72℃延伸7min。

10、根据权利要求1所述的克隆野生稻新抗性基因的方法，其特征在于步骤(4)中：扩增产物克隆测序分析得到2个阳性克隆核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。