CN102134602A - 转Xa21基因水稻或其制品检测用引物和探针、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于检测转Xa21基因水稻或其制品的寡核苷酸引物及探针。本发明还涉及用于测定转Xa21基因水稻或其制品的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用本发明的特异性寡核苷酸引物及探针。本发明还涉及用于检测转Xa21基因水稻或其制品的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的特异性寡核苷酸引物和探针。本发明还涉及本发明的特异性寡核苷酸引物及探针或试剂盒在检测转Xa21基因水稻或其制品中的应用。使用本发明的特异性寡核苷酸引和探针、试剂盒以及PCR检测方法，能够简单、快速、特异且灵敏地测定转Xa21基因水稻或其制品。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于转Xa21基因水稻或其制品检测的寡核苷酸引物及探针和试剂盒，用于测定转Xa21基因水稻或其制品的实时荧光PCR检测方法，以及本发明的特异性寡核苷酸引物和探针或试剂盒在检测转Xa21基因水稻或其制品中的应用。
背景技术
转基因生物是指利用生物技术，将外源基因转移到他物种中以改造其遗传特性，从而获得人类所需的性状、营养品质而产生的生物新品种。以转基因生物或以其为原料加工而来的食品就是转基因食品。从1994年第一例转基因食品(转基因番茄)在美国诞生至今，转基因生物已广泛用于食品领域。
转基因生物的发展状况
国际国内转基因生物的研发、生产蓬勃发展，通过基因工程方式培育农作物新品种是目前作物育种的发展方向，在提高作物产量、改善品质、提高抗性等方面具有巨大潜力。水稻(Oryza sativa L.)是我国最大的粮食作物，常年播种面积约为3100万公顷，总收获量在2亿吨左右，约占我国粮食总产量的40％。水稻生产在我国的农业生产中占有举足轻重的地位。1991年，Christou等用基因枪转化技术获得了转基因水稻植株，随后几年，基因枪技术日臻成熟，将各类目的基因导入水稻获得转基因植株的报道大量出现。
Xa21基因分离自非洲马里的长花药野生稻(Oryzae longistaminata)，是对白叶枯病抗谱最广的显性抗性基因，编码一个受体蛋白激酶，在抗病过程中负责信号识别。中国农科院生物技术研究所、安徽农科院水稻所的贾士荣、倪大虎、汪秀峰等将Xa21基因转入水稻不育系皖21A中，采用基因枪双质粒共转化法，质粒PC822含Xa21基因结构，Xa21基因结构全长9.6kb，包括启动子、终止子、内含子、编码区，启动子、终止子来自于水稻本身的天然序列。质粒PHX4含35S启动子、潮霉素基因hph、NOS终止子，通过二代分离，35S启动子、潮霉素基因hph已去除，但共转化质粒的NOS终止子仍保留于转基因水稻中。
经农业部批准，转Xa21基因水稻品系已进行了中间试验、环境释放，预计在较短时间内可在农业生产上获得应用。
转基因食品的管理要求
随着转基因食品的广泛应用，作为一种新技术产品，其对人体健康、生态平衡是否具有危害还未确定。它潜在的安全性如转基因食品的过敏原、营养品质等越来越受到消费者的关注。
世界上主要国家立法对转基因产品进行管理，美国、加拿大、欧盟、日本、韩国、澳大利亚、新西兰的法律明确规定，转基因品种需经政府批准，并经严格的生物安全、环境安全测试才可以田间种植、环境释放及作为食品、饲料，欧盟、日本、韩国、澳大利亚、新西兰等要求转基因食品进行标识，并规定了相应阈值水平。我国于2001年5月23日颁布《农业转基因生物安全管理条例》，规定对农业转基因生物实行检验检疫。2002年3月20日开始实行的《农业转基因生物标识管理办法》也规定了转基因食品的标识制度。对于执行上述各国的法规措施，转基因产品的检测是关键措施之一，需要通过定性检测确定转基因的种类，鉴别其是否为已批准的或已获准用于食品饲料，以防止具有风险的未知转基因产品的任意扩散，对社会产生危害；还需要通过定量检测确定转基因产品的含量，明确是否已达到所在国家规定的阈值水平，因为每个国家转基因标识的阈值水平都不相同。
转基因食品的检测方法
转基因食品检测大致可分为两类，一类是核酸检测，当外源基因插入到受体细胞染色体时，一般要构建启动子、终止子、选择标记基因和报告基因，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子，胭脂碱合酶NOS终止子等，转基因食品核酸检测的靶标是插入的外源基因，包括外源基因的整合位点、启动子、终止子、选择标记基因和报告基因的核酸序列，目前的转基因成分检测数据库中有超过400对PCR检测引物和以及40多种内源参照基因。另一类是蛋白检测，即通过插入外源基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测，已有大约20种转基因蛋白检测方法在转基因检测领域中投入了使用。
核酸检测主要应用PCR方法和基因芯片技术。PCR方法具有很高的灵敏度，在转基因领域使用最为广泛。与蛋白质具有组织特异性相比，PCR技术不受到材料的限制。另外，核酸比蛋白质稳定，变性之后容易复性，在加工食品中仍可检出。PCR方法的关键是引物设计，引物一般长为17-30nt，严格限制上下游引物的配对和引物自身配对。
转基因的标识需求和一些法规对转基因成分含量的限制，要求对食品中转基因成分进行定量检测。
目前，国内外少见报道能快速、简单、特异且灵敏地检测转Xa21基因水稻或其制品的方法。
因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的转Xa21基因水稻或其制品检测方法，进行转Xa21基因水稻或其制品的检测。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供用于快速检测转Xa21基因水稻或其制品的特异性寡核苷酸引物及探针。
本发明的另一个目的在于，提供快速测定转Xa21基因的水稻或其制品的实时荧光PCR检测方法。
本发明的再一个目的在于，提供用于快速检测转Xa21基因水稻或其制品的试剂盒。
本发明的再一个目的在于，提供本发明的特异性寡核苷酸引物和探针或试剂盒在检测转Xa21基因的水稻或其制品中的应用。
针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
根据本发明的一个实施方案，本发明提供用于实时荧光PCR方法检测转Xa21基因水稻品系M12的特异性寡核苷酸引物对及探针。本发明的寡核苷酸引物/探针是根据水稻线粒体基因与外源的Xa21基因的接合区序列设计的。在一个实施方案中，所述引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物为M12-F：GAGAACAAGAAGCCCCTTCTGTCTCG(SEQ ID No.1)，所述下游引物为M 12-R：AAGGTACTAAAGCTTGAAAATCCTAAGGC(SEQ ID No.2)；所述探针为M12-P：CACATTCGGCAGTGAAACTCTTGAGCGCC(SEQ ID No.3)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在另一个实施方案中，所述引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物为Xa21-F：GGACTCTAGAGCTACCACACACTCAA(SEQ ID No.4)，所述下游引物为Xa21-R：CTCCTCCATCAGTTCATGTAGAAG(SEQ ID No.5)；所述探针为XA21-P：ATTGCAGTGTAGAGCAGAAAACACCCA(SEQ ID No.6)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
根据本发明的另一个实施方案，本发明提供转Xa21基因水稻或其制品的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用针对Xa21基因序列的特异性寡核苷酸引物对和探针。
在一个实施方案中，本发明的转Xa21基因水稻或其制品的实时荧光PCR检测方法包括如下步骤：
(a)从待测产品中提取DNA样品；
(b)提供核酸扩增反应的条件；
(c)使用本发明的特异性寡核苷酸引物对及探针通过实时荧光PCR方法进行核酸扩增反应和检测扩增产物。
在本发明方法的优选实施方案中，所使用的本发明的特异性寡核苷酸引物对及探针包含以下一组或两组特异性寡核苷酸引物对和探针：
(1)碱基序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的寡核苷酸引物对以及碱基序列为SEQ ID No.3的探针，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM；和/或
(2)碱基序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的寡核苷酸引物对以及碱基序列为SEQ ID No.6的探针，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
在一个实施方案中，本发明的转Xa21基因水稻或其制品实时荧光PCR检测方法包括样品转化事件特异性的检测。在一个实施方案中，所述方法包括DNA提取步骤和通过检测水稻线粒体与外源Xa21基因接合区序列来测试样品转化事件特异性。在一个优选的实施方案中，所述检测转化事件特异性的引物对及探针序列选自
(1)碱基序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的寡核苷酸引物对以及碱基序列为SEQ ID No.3的探针，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM；和
(2)碱基序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的寡核苷酸引物对以及碱基序列为SEQ ID No.6的探针，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
根据本发明的另一个实施方案，本发明提供用于检测转Xa21基因水稻或其制品的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的特异性寡核苷酸引物对以及探针。在本发明的试剂盒的优选实施方案中，所述试剂盒包含以下一组或两组特异性寡核苷酸引物对和探针：
(1)碱基序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的寡核苷酸引物对以及碱基序列为SEQ ID No.3的探针，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM；和/或
(2)碱基序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的寡核苷酸引物对以及碱基序列为SEQ ID No.6的探针，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
在优选的实施方案中，所述试剂盒还包括用于样品DNA提取的试剂和用于PCR反应的试剂以及使用说明书。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒中的使用说明书包括对用于快速检测转Xa21基因水稻或其制品的PCR扩增条件的描述。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的说明书中给出的PCR扩增条件是：95℃，10min；95℃15s；60℃，1min，45个循环。
根据本发明的再一个实施方案，本发明提供本发明的特异性寡核苷酸引物对和探针在检测转Xa21基因的水稻或其制品中的应用。在根据本发明的应用的优选实施方案中，所述特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.2；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在根据本发明的应用的另一优选实施方案中，所述特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.4，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.5；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.6，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在另一个实施方案中，本发明还提供本发明的试剂盒在检测转Xa21基因水稻或其制品中的应用。优选地，在本发明的上述应用中，所述试剂盒包含以下一组或两组特异性寡核苷酸引物对和探针：
(1)碱基序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的寡核苷酸引物对以及碱基序列为SEQ ID No.3的探针，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM；和/或
(2)碱基序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的寡核苷酸引物对以及碱基序列为SEQ ID No.6的探针，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
本发明以转基因水稻产品的DNA为检测基础，根据水稻的Xa21基因序列设计引物及探针，利用实时荧光PCR法检测转Xa21基因水稻或其制品。
实时荧光定量PCR是在常规PCR方法的基础上建立起来的。在该PCR体系中，除了两条普通的引物外，还有一条在5′和3′端分别标记了报告荧光染料基团(R)、猝灭荧光染料基团(Q)、并与PCR产物特异结合的寡核苷酸探针。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成的完全同步。通过分析PCR模板的起始拷贝数，并以标准品制备标准曲线，判定待检产品中的转基因含量。
本发明的实时荧光PCR检测方法由于使用荧光染料实时显示PCR产物的动态积累，在整个检测过程中闭管操作，没有PCR后处理过程，有效地解决了PCR后污染问题。使用本发明的实时荧光PCR检测方法，能够简单、快速、特异且灵敏地检测出含有转Xa21基因的农产品、食品。
附图说明
图1是显示水稻转化事件特异性的实时荧光PCR检测结果，其中使用特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2和探针SEQ ID No.3进行检测，荧光曲线编号与样品对应如下：基线以上的荧光曲线为抗优97样品(4次重复)，基线位置为科丰6号、克螟稻(KMD1)、巴呑米、K105、明恢63、培杂35、津稻9618、皖稻181、春优59及空白对照。这些水稻品种由国家农业部门命名，为本领域所公知。图1的横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值。
图2是针对事件特异性的引物和探针进行灵敏度评价，其中使用特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2和探针SEQ ID No.3进行检测。将100ng的相对质量分数为5％(W/W)转基因水稻抗优97的基因组DNA 5个梯度的4倍稀释。图2的横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值。
图3是显示水稻Xa21基因特异性实时荧光PCR检测结果，其中使用特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.4和SEQ ID No.5和探针SEQ ID No.6进行检测，其中荧光曲线编号与样品对应如下：基线以上的荧光曲线为抗优97样品(4次重复)，基线位置为科丰6号、克螟稻(KMD1)、巴呑米、K105、明恢63、培杂35、津稻9618、皖稻181、春优59及空白对照。图3的横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值。
图4是针对基因特异性引物和探针进行灵敏度评价，其中使用特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.4和SEQ ID No.5和探针SEQ ID No.6进行检测。将100ng的相对质量分数为5％(W/W)转基因水稻抗优97的基因组DNA 5个梯度4倍稀释。图4的横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值。
具体实施方式
通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
本发明的发明人首次通过水稻Xa21基因序列设计检测转Xa21基因水稻或其制品的Xa21基因特异性寡核苷酸引物对及探针。
斜体为水稻线粒体基因序列，下划线部分为Xa21基因序列
转化事件特异性引物及探针序列：上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，下游引物的碱基序列为SEQ ID No.2；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
Xa21基因内含子序列
TCCTTCCAGTATTTTGCATTTTCTGATCTCTAGTGCTATATGAAATAGTTTTTACCTCTAGTGAAACTGATGGAGAATATAAGTAATTAATTGAACTAATTAAATTGCACAAAAATAAGATTATTTGCCATATCTATTCAGATGCTAAATATAGCTAGTTCATAGAGGTACAGATTTTTTTATATAGGACTCTAGAGCTACCACACACTCAAATCAAATTATGAAATGATTATTACTTCTACATGAACTGATGGAGGAG(SEQ ID No.8)
Xa21基因特异性引物及探针序列：上游引物的碱基序列为SEQ ID No.4，下游引物的碱基序列为SEQ ID No.5；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.6，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
实施例2
本实施例测试了转化事件特异性及灵敏度，其中使用特异性引物M12-F/R，即所使用的寡核苷酸引物的碱基序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
通过检测不同相对质量分数的抗优97水稻的DNA，可以测试转化事件特异性及灵敏度。
使用本发明的引物对和探针的组合，在样品量极少的情况下，相对于其他引物对仍能特异、灵敏地扩增出目的片段。
在本实施例中，检测了10份样本：抗优97、科丰6号、克螟稻(KMD1)、巴呑米、K105、明恢63、培杂35、津稻9618、皖稻181、春优59。
所使用的检测主要仪器：
微量移液器(10μL、100μL、1000μL Eppendorf)、荧光定量PCR仪、高速台式离心机(Pico17 Thermo)、高速粉碎机(IKA-WEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析仪(DYY-6C 北京六一仪器厂)等
检测主要试剂：
Taq酶、dNTPs、10×PCR Buffer、溴化乙锭、DNA Ladder Marker(Takara)；TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI)；引物和探针(按序列制成试剂盒)，移液器Tips：务必使用带滤芯的型号，否则在混匀和分样时非常容易污染；同时10uL和2.5uL的移液器务必使用长Tips，普通短Tips在工作时，移液器杆部可能会与离心管内壁接触，造成污染。
检测主要步骤：
1 DNA提取
待测样品为：抗优97、科丰6号、克螟稻(KMD1)、巴呑米、K105、明恢63、培杂35、津稻9618、皖稻181、春优59。
称取50.0mg样品粉末，加入1.0ml CTAB提取缓冲液及4.0μL蛋白酶K(10mg/ml)，65℃温浴孵化1h；12000rpm离心15min，取几近清澈的上清700μl；加入500μL氯仿，高速涡旋混合30秒；12000rpm离心10min，收集500μL上清，转移到新的1.5ml反应管中；加入两倍体积的CTAB沉淀缓冲液，室温，孵育1h；12000rpm离心5min弃上清，将沉淀溶于350μL的1.2mol/L的氯化钠溶液中，充分溶解；加入350μL三氯甲烷，小心高速涡旋混合30秒；以12000rpm离心10min，将上清转移到新的反应管中；加入0.8倍的异丙醇，室温孵育至少20min；12000rpm离心10min，弃上清；在沉淀中加入500μL 70％乙醇，高速涡旋30秒，以12000rpm离心10min；弃上清，60℃干燥15-25min，并溶于50μLTE(pH 8.0)，-20℃保存备用。每次提取均设立相应的空白对照(以双蒸水代替样品)。
2 实时荧光PCR检测所用转化事件特异性引物和探针：引物的探针的碱基序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
3 实时荧光PCR反应体系：
TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5μL
探针(10μM) 0.5μL
上游引物(10μM) 0.5μL
下游引物(10μM) 0.5μL
模板DNA 5μL
加ddH2O至总体积为25μL
注：每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染)；
4实时荧光PCR反应参数：
95℃ 10min
95℃ 15s
60℃ 1min
45个循环。
注：不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。
如图1所示，使用引物M12-F/R扩增待测样品的DNA，测试转化事件特异性，仅抗优97水稻能在基线以上出现荧光扩增曲线，K105、明恢63、培杂35、津稻9618、皖稻181、春优、科丰6号、克螟稻(KMD1)、巴呑米59及空白对照的荧光曲线在基线位置。
图2为确定事件特异性引物和探针的检测限。由图2可以看出，事件特异性检测体系的检测灵敏度为0.005％。
实施例3
本实施例测试了Xa21特异引物/探针的特异性及灵敏度，其中使用特异引物Xa21-F/R，即所使用的寡核苷酸引物的碱基序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5，探针的碱基序列为SEQ ID No.6，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
通过检测线Xa21基因内含子序列，可以测试转Xa21基因的特异性及灵敏度。
使用本发明的引物对和探针的组合，在样品量极少的情况下，相对于其他引物对仍能特异、灵敏地扩增出目的片段。
在本实施例中，检测了10份样本：抗优97、科丰6号、克螟稻(KMD1)、巴呑米、K105、明恢63、培杂35、津稻9618、皖稻181、春优59。
所使用的检测主要仪器：
微量移液器(10μL、100μL、1000μL Eppendorf)、荧光定量PCR仪、高速台式离心机(Pico17 Thermo)、高速粉碎机(IKA-WEARKE GERMANY)、核酸蛋白分析仪(DYY-6C 北京六一仪器厂)等
检测主要试剂：
Taq酶、dNTPs、10×PCR Buffer、溴化乙锭、DNA Ladder Marker(Takara)；TaqMan Universal PCR Master Mix(ABI)；引物和探针(按序列制成试剂盒)，移液器Tips：务必使用带滤芯的型号，否则在混匀和分样时非常容易污染；同时10uL和2.5uL的移液器务必使用长Tips，普通短Tips在工作时，移液器杆部可能会与离心管内壁接触，造成污染。
检测主要步骤：
1 DNA提取
待测样品为：抗优97、科丰6号、克螟稻(KMD1)、巴呑米、K105、明恢63、培杂35、津稻9618、皖稻181、春优59。称取50.0mg样品粉末，加入1.0ml CTAB提取缓冲液及4.0μL蛋白酶K(10mg/ml)，65℃温浴孵化1h；12000rpm离心15min，取几近清澈的上清700μl；加入500μL氯仿，高速涡旋混合30秒；12000rpm离心10min，收集500μL上清，转移到新的1.5ml反应管中；加入两倍体积的CTAB沉淀缓冲液，室温，孵育1h；12000rpm离心5min弃上清，将沉淀溶于350μL的1.2mol/L的氯化钠溶液中，充分溶解；加入350μL三氯甲烷，小心高速涡旋混合30秒；以12000rpm离心10min，将上清转移到新的反应管中；加入0.8倍的异丙醇，室温孵育至少20min；12000rpm离心10min，弃上清；在沉淀中加入500μL 70％乙醇，高速涡旋30秒，以12000rpm离心10min；弃上清，60℃干燥15-25min，并溶于50μLTE(pH 8.0)，-20℃保存备用。每次提取均设立相应的空白对照(以双蒸水代替样品)。
2 实时荧光PCR检测所用引物和探针
Xa21-F GGACTCTAGAGCTACCACACACTCAA(SEQ ID No.4)，Xa21-R CTCCTCCATCAGTTCATGTAGAAG(SEQ ID No.5)XA21-P ATTGCAGTGTAGAGCAGAAAACACCCA(SEQ ID No.6)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
3 实时荧光PCR反应体系：
TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5μL
探针(10μM) 0.5μL
上游引物(10μM) 0.5μL
下游引物(10μM) 0.5μL
模板DNA 5μL
加ddH2O至总体积为25μL
注：每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染)；
4 实时荧光PCR反应参数：
95℃ 10min
95℃ 15s
60℃ 1min
45个循环。
注：不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。
如图3所示，使用基因特异性引物Xa21-F/R扩增待测样品的DNA，测试其特异性，仅抗优97水稻能在基线以上出现荧光扩增曲线，K105、明恢63、培杂35、津稻9618、皖稻181、春优、科丰6号、克螟稻(KMD1)、巴呑米59及空白对照的荧光曲线在基线位置，说明该引物和探针表现出基因特异性。
图4为确定事件特异性引物和探针的检测限。由图4可以看出，事件特异性检测体系的检测灵敏度为0.005％。
Claims (8)
1.用于实时荧光PCR方法检测转Xa21基因的水稻或其制品的特异性寡核苷酸引物对及探针，其中所述引物对和探针选自以下组：
(1)碱基序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的寡核苷酸引物对以及碱基序列为SEQ ID No.3的探针，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM；和
(2)碱基序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的寡核苷酸引物对以及碱基序列为SEQ ID No.6的探针，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
2.用于实时荧光PCR方法检测转Xa21基因水稻或其制品的试剂盒，其包括权利要求1所述的寡核苷酸引物对和探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其还包括用于提取DNA的试剂、用于实时荧光PCR的试剂、空白对照以及使用说明书。
4.转Xa21基因水稻或其制品的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用权利要求1所述的寡核苷酸引物对及探针或权利要求2或3所述的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的实时荧光PCR检测方法，其中所述实时荧光PCR方法为Taqman荧光探针法。
6.根据权利要求4或5所述的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括如下步骤：
(a)从待测产品中提取DNA样品；
(b)提供核酸扩增反应的条件；
(c)使用权利要求1所述的寡核苷酸引物对及探针或权利要求2或3的试剂盒，通过实时荧光PCR方法进行核酸扩增反应和检测扩增产物。
7.权利要求1所述的特异性寡核苷酸引物对及探针在检测转Xa21基因水稻或其制品中的应用。
8.权利要求2或3所述的试剂盒在检测转Xa21基因水稻或其制品中的应用。
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