CN103060460A - 检测含有nos终止子的转基因水稻的引物、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于通过环介导等温扩增法检测含有NOS终止子的转基因水稻的引物SEQ ID NOs.1-4或SEQ ID NOs.1-6，包含所述引物的试剂盒，以及利用所述引物或试剂盒通过环介导等温扩增法检测含有NOS终止子的转基因水稻的方法。使用本发明的引物或试剂盒能够简单、快速、高特异性且高灵敏度地测定含有NOS终止子的转基因水稻。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及检测转基因水稻的引物、试剂盒和方法。
背景技术
转基因生物是指利用生物技术，将外源基因转移到物种中以改造其遗传特性，从而获得人类所需的性状、营养品质而产生的生物新品种。以转基因生物或以其为原料加工而来的食品就是转基因食品。从1994年第一例转基因食品(转基因番茄)在美国诞生至今，转基因生物已广泛用于食品领域。
转基因水稻的发展状况
国内外转基因生物的研发、生产蓬勃发展，通过基因工程方式培育农作物新品种是目前作物育种的发展方向，在提高作物产量、改善品质、提高抗性等方面具有巨大潜力。
水稻（Oryza sativa L.）是我国最重要的主粮，常年播种面积约为3100万公顷，总收获量在2亿吨左右，约占我国粮食总产量的40%。1991年，Christou等用基因枪转化技术获得了转基因水稻植株。随后几年，各国将各类目的基因导入水稻获得大量转基因水稻品系。1994年，Hiei等建立了农杆菌介导的高效粳稻遗传转化技术，随后爪哇稻和籼稻的农杆菌介导转化体系也先后建立，并逐步成为水稻的主流转化技术。其它物种的抗除草剂、抗虫、抗病、抗病毒、耐盐、改善稻米品质等有益基因被引入商业水稻品种中。
中国在转基因水稻培育方面取得了重大进展，已将豇豆胰蛋白酶抑制剂基因，Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1c、Cry1Ah、Cry2a等毒蛋白基因，雪花莲凝集素基因，抗菌肽基因和来自野生稻的Xa21基因等导入多种杂交水稻恢复系中。经农业部批准，十多种转基因水稻品系正在进行环境释放、中间试验，其中有2个抗虫转基因水稻已获转基因生物安全证书。目前中国正在进行环境释放、中间试验的转基因水稻的转基因构建中都含有NOS终止子，故采用NOS终止子特异性方法可筛选检测转基因水稻及其制品。
转基因食品的管理要求
转基因食品已经得到广泛使用，但是转基因作为一种新的生物技术，其对人类健康、生态平衡的影响以及转基因食品潜在的安全性越来越成为消费者关注的焦点。
2000年联合国通过了“生物安全议定书”，该议定书对除了药物以外的所有进出境活性转基因生物有关过境、审批、检测、风险评估和管理、赔偿责任等做出了详细的规定。世界上主要国家立法对转基因产品进行管理，美加、欧盟、日本、韩国、澳新的法律明确规定，转基因生物需经政府批准，并经严格的生物安全、环境安全测试才可以田间种植、环境释放及作为食品、饲料。欧盟、日本、韩国、澳洲等要求转基因食品进行标识，并规定了相应阈值水平。我国于2001年5月23日颁布了《农业转基因生物安全管理条例》，规定对农业转基因生物实行检验检疫。2002年3月20日开始实行的《农业转基因生物标识管理办法》也规定了转基因食品的标识制度。对于执行上述联合国及各国的法规措施，转基因产品的检测是关键措施之一，需要通过定性检测确定转基因的种类，鉴别其是否为已批准的或已获准用于食品饲料，以防止具有风险的未知转基因产品的任意扩散，对社会产生危害。由于每个国家转基因标识的阈值水平都不相同，还需要通过定量检测确定转基因产品的含量，明确是否已达到所在国规定的阈值水平。
转基因食品的环介导等温扩增检测方法（LAMP）
转基因食品检测大致可分为两类。一类是核酸检测，当外源基因插入到受体细胞染色体时，一般要构建启动子、终止子、选择标记基因和报告基因，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子，胭脂碱合酶终止子（NOS终止子）等。转基因食品核酸检测的靶标是插入的外源基因，包括外源基因的整合位点、启动子、终止子、选择标记基因和报告基因的核酸序列。目前的转基因成分检测数据库中有超过400对PCR检测引物和40多种内源参照基因。另一类是蛋白检测，即通过插入外源基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测，已有大约20种转基因蛋白检测方法在转基因检测领域中投入使用。
核酸检测主要利用PCR方法和环介导等温扩增方法。核酸检测方法具有很高的灵敏度，在转基因领域使用最为广泛。与蛋白质具有的组织特异性相比，核酸检测技术不受材料的限制。另外，核酸比蛋白质稳定，变性之后容易复性，因此在加工食品中仍可检出。核酸检测方法的关键是引物设计，检测的特异性和灵敏度取都决于引物序列的设计。
2000年日本的Notomi发明一种基因诊断技术-环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，并在中国获得发明专利权（专利号00818262.0）。LAMP法近年已成功地应用于多种疾病病原检测中。LAMP方法具有如下优点：灵敏度高；反应时间短（15～60min完成反应）；不需要贵重仪器（只需60-70℃左右恒温）；操作步骤简单（将反应液、酶和模板混合于PCR管中，置于60-65℃保温）；结果检测简单，可肉眼观察结果。因此，LAMP方法适合现场快速检测诊断，是可替代PCR的基因扩增技术。
通常，LAMP方法针对靶基因的6个序列区域设计4-6条引物，利用具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温(60-65℃)持续15分钟到1小时左右，将靶基因扩增109～1010倍。
可通过3种方法肉眼判断检测结果：1）浊度法，由于LAMP反应可产生大量白色焦磷酸镁沉淀，故可凭肉眼观察反应管内是否出现白色浑浊，进行结果判断；2）荧光显色剂法，由于LAMP反应能将靶基因扩增109倍以上，在反应完成后加入SYBR Green I、Evagreen等核酸染色剂，在紫外光下可对结果进行荧光显色判定；3）金属离子滴定指示剂法，由于LAMP反应生成大量的焦磷酸根，与反应体系中的锰离子、镁离子生成络合物或沉淀，导致反应体系中的锰离子、镁离子浓度降低，故当LAMP反应体系中加入羟基萘芬蓝（英文名：hydroxynaphthol blue或2-Hydroxy-1-(2-hydroxy-4-sulfo-1-naphthylazo)-3,6-naphthalenedisulfonicacid），反应结束后，溶液由浅蓝色变为深蓝色；或者当LAMP反应体系中加入锰离子与钙黄绿素（英文名：Calcein，又名3,3'-双（甲胺二乙酸）荧光素，Bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethyl3’fluorescein）时，反应结束后，溶液由浅棕色变为绿色，可通过观察反应管的颜色变化直接判定反应结果。当然，也可以通过电泳对LAMP反应的扩增产物进行检测，当电泳结果显示特异性条带时，则表明所测样品中包含靶标DNA序列。
目前，国内外少见报道利用LAMP技术简单、快速、特异且灵敏地测定含有NOS终止子的转基因水稻。
因此，本领域需要一种简单、快速、特异性好且灵敏度高的检测含有NOS终止子的转基因水稻的方法。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种操作简单、快速、特异而灵敏地检测含NOS终止子的转基因水稻或其制品用引物、试剂盒及其应用以及相应的检测方法。
第一方面，本发明提供了用于通过环介导等温扩增法检测含有NOS终止子的转基因水稻或其制品的引物，其中，所述引物的序列为SEQ ID NOs.1-4或SEQ ID NOs.1-6。
第二方面，本发明提供了用于通过环介导等温扩增法检测含有NOS终止子的转基因水稻或其制品的试剂盒，其中所述试剂盒包括本发明第一发明所述的引物，并进一步包括甜菜碱。
在一个具体的实施方式中，所述的试剂盒还包括用于提取转基因水稻DNA的试剂、用于环介导等温扩增的试剂、阳性对照、阴性对照、空白对照以及使用说明书。
在一个具体的实施方式中，所述的试剂盒进一步包括可用于环介导等温扩增法的核酸用染色荧光剂和/或金属离子滴定指示剂。
在一个具体的实施方式中，所述核酸染色剂为SYBR Green I或Evagreen，所述金属离子滴定指示剂为羟基萘芬蓝或锰离子与钙黄绿素。
在一个具体的实施方式中，所述锰离子为硫酸锰。
第三方面，本发明提供了通过环介导等温扩增法检测含有NOS终止子的转基因水稻或其制品的方法，所述方法包括使用本发明第一发明的引物或者本发明第二方面的试剂盒。
在一个具体的实施方式中，所述方法包括如下步骤：
（a）从待测样品中提取DNA；和
（b）使用本发明第一方面所述的引物或本发明第二方面所述的试剂盒，通过环介导等温扩增的反应进行核酸扩增反应和扩增产物的检测。
在一个具体的实施方式中，所述核酸扩增反应在实时浊度仪上进行。
在一个具体的实施方式中，所述核酸扩增反应在恒温装置中进行。
第四方面，本发明提供了本发明第一方面所述的引物或者本发明第二方面所述的试剂盒在检测含有NOS终止子的转基因水稻或其制品中的应用。
利用本发明的引物、试剂盒或方法能够对转基因水稻或其制品进行简单、快速、特异而灵敏地检测，从而检出含NOS终止子的转基因水稻或其制品。
附图说明
图1：不加环引物的LAMP方法在实时浊度仪上检测转基因水稻是否包含NOS终止子。样品DNA包括科丰6号、克螟稻（KMD1）、Bt汕优63、T2a-1、T1c-19、阴性对照水稻和空白对照。本发明所述的转基因水稻是农业部公布的水稻品系标准名称。
图2：以钙黄绿素为显色剂检测转基因水稻是否包含NOS终止子。1为科丰6号，2为克螟稻（KMD1），3为Bt汕优63，4为T2a-1，5为T1c-19，6为阴性对照水稻，7为空白对照。
图3：以SYBR Green I为显色剂检测转基因水稻是否包含NOS终止子。1为科丰6号，2为克螟稻（KMD1），3为Bt汕优63，4为T2a-1，5为T1c-19，6为阴性水稻，7为空白对照。
图4：添加锁核酸修饰环引物的LAMP方法在实时浊度仪上检测转基因水稻是否包含NOS终止子。样品DNA包括科丰6号、克螟稻（KMD1）、Bt汕优63、T2a-1、T1C-19、阴性水稻和空白对照。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明作进一步描述，但是，本发明并不限于以下具体实施例。
实施例1：不加环引物在实时浊度仪上检测转基因水稻
在本实施例中利用反向外引物NOS-B3（SEQ ID No.1）、反向内引物NOS-BIP（SEQ ID No.2）、正向外引物NOS-F3（SEQ ID No.3）和正向内引物NOS-FIP（SEQ ID No.4），通过LAMP法实现了在实时浊度仪上检测含有NOS终止子的转基因水稻。
在本实施例中检测的DNA样品分别来自科丰6号、克螟稻（KMD1）、T2a-1、T1c-19，同时还包括已知包含NOS终止子的Bt汕优63作为阳性对照，不含NOS终止子的非转基因水稻的DNA样品作为阴性对照和不含DNA的样品作为空白对照。
1.主要检测仪器：
实时浊度仪（LA-320C，日本）；1000uL、100uL、10uL、2.5uL微量移液器（Eppendorf，德国）。
2.主要检测试剂：
所有引物均由上海英骏生物技术有限公司合成（具体序列见表1）；BstDNA聚合酶、10×ThermoPol Buffer、MgSO4购自NEB公司；dNTPs购自大连宝生物公司；甜菜碱购自北京东方嘉城生物公司。
表1：引物序列
| 引物名称 | 核酸序列（5’→3’） | 序列号 |
| 反向外引物NOS-B3 | gatgacaccgcacgcgataa | SEQ ID No.1 |
| 反向内引物NOS-BIP | gggtttttatgattagagtcccgcaatttatcctagtttgcgcgctata | SEQ ID No.2 |
| 正向外引物NOS-F3 | gatcgttcaaacatttggca | SEQ ID No.3 |
| 正向内引物NOS-FIP | catgcttaacgtaattcaacagaaagattgaatcctgttgccggtc | SEQ ID No.4 |
3.主要检测步骤：
1）DNA提取
使用CTAB分步离心法或者使用符合要求的植物基因组DNA纯化试剂盒，如Qiagen公司或天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)等进行DNA提取。获得的基因组DNA样品-20℃保存备用。
对于CTAB分步离心法（可参见Wang W.,et al.,Simultaneous Detection ofEight Food Allergens Using OpticalThin-Film Biosensor Chips.Journal ofagricultural and food chemistry.2011,59,6889–6894.），具体可包括以下步骤：
称取50.0mg样品粉末，加入1.0ml CTAB提取缓冲液及4.0μL蛋白酶K(10mg/ml)，65℃温浴孵化1h；
以12000rpm离心15min，取几近清澈的上清700μl；加入500μL氯仿，高速涡旋混合30秒；
以12000rpm离心10min，收集500μL上清，转移到新的1.5ml反应管中；加入两倍体积的CTAB沉淀缓冲液，室温，孵育1h；
以12000rpm离心5min弃上清，将沉淀溶于350μL的1.2mol/L的氯化钠溶液中，充分溶解；加入350μL三氯甲烷，小心高速涡旋混合30秒；
以12000rpm离心10min，将上清转移到新的反应管中；加入0.8倍的异丙醇，室温孵育至少20min；
以12000rpm离心10min，弃上清；在沉淀中加入500μL70%乙醇，高速涡旋30秒；
以12000rpm离心10min，弃上清，60℃干燥15-25min，并溶于50μL TE（pH8.0）。
取3μl提取的DNA样品，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，根据其亮度和扩散程度判断DNA的质量。获得的基因组DNA样品-20℃保存备用。
每次提取均设立相应的空白对照（以双蒸水代替样品）。
2）样品总DNA浓度的测定
纯化的样品基因组DNA可以利用紫外分光光度法测定浓度。分别测定DNA在260nm和280nm波长下的吸收光值，并根据测定的吸收光值计算所测定的DNA的浓度。
3）进行LAMP检测，包括以下4个步骤：
（A）配制LAMP检测体系
LAMP检测体系包括Bst DNA聚合酶、ThermoPol Buffer(10×)、MgSO4、dNTPs(4种dNTP各10mM)、甜菜碱、正向外引物、反向外引物、正向内引物、反向内引物、样品DNA等，具体浓度及用量见表2。
表2：NOS终止子用LAMP检测反应体系
*X表示根据所用DNA的浓度量取20ng DNA所需的体积，ddH2O的体积由7.5-X得到。
（B）设置对照
设置阴性对照、空白对照和阳性对照，阴性对照反应管中以20ng的非转基因水稻的DNA为模板，空白对照反应管中以纯水为模板，阳性对照反应管中以20ng的转基因水稻BT汕优63的DNA为模板。对照组LAMP检测体系的其余成分与表2相同。
（C）在实时浊度仪上进行LAMP检测反应
在将LAMP检测方法体系的所有成分加入反应管中后，将其混匀，然后放入实时浊度仪中，65℃保温60分钟。
（D）根据实时浊度曲线判定检测结果
实时浊度仪可实时读出反应体系的浊度，如浊度-时间曲线保持平整无突然跃升现象，则判断检测结果为阴性；如浊度-时间曲线出现典型的急剧跃升现象，则判断检测结果为阳性。
上述方法的检测结果见图1。如图1所示，使用反向外引物NOS-B3（SEQID No.1）、反向内引物NOS-BIP（SEQ ID No.2）、正向外引物NOS-F3（SEQID No.3）和正向内引物NOS-FIP（SEQ ID No.4）扩增待测样品的DNA，科丰6号、克螟稻（KMD1）、T2a-1和T1c-19与阳性对照Bt汕优63均显示急剧跃升的浊度-时间曲线，表明科丰6号、克螟稻（KMD1）、T2a-1和T1c-19包含NOS终止子，而作为阴性对照的非转基因水稻和空白对照则显示平整无突然跃升的浊度-时间曲线。
该实验结果证明，本发明的反向外引物NOS-B3（SEQ ID No.1）、反向内引物NOS-BIP（SEQ ID No.2）、正向外引物NOS-F3（SEQ ID No.3）和正向内引物NOS-FIP（SEQ ID No.4）可用于简单、快速、高特异性且高灵敏度地测定含有NOS终止子的转基因水稻。
实施例2.使用加环引物并以钙黄绿素为显色剂检测转基因水稻
在本实施例中利用反向外引物NOS-B3（SEQ ID No.1）、反向内引物NOS-BIP（SEQ ID No.2）、正向外引物NOS-F3（SEQ ID No.3）、正向内引物NOS-FIP（SEQ ID No.4）、反向环引物NOS-LbLNA（SEQ ID No.5）和正向环引物NOS-LfLNA（SEQ ID No.6），以钙黄绿素为显色剂检测含有NOS终止子的转基因水稻。
在本实施例中检测的DNA样品分别来自科丰6号、克螟稻（KMD1）、T2a-1、T1c-19，同时还包括已知包含NOS终止子的Bt汕优63作为阳性对照，不含NOS终止子的非转基因水稻的DNA样品作为阴性对照和不含DNA的样品作为空白对照。
1.主要检测仪器：
1000uL、100uL、10uL、2.5uL微量移液器（Eppendorf，德国）；恒温装置（60-65℃范围，Thermomixer Comfort，Eppendorf，德国）。
2.主要检测试剂：
所有引物均由上海英骏生物技术有限公司合成（具体序列见表3）；BstDNA聚合酶、10×ThermoPol Buffer、MgSO4购自NEB公司；dNTPs购自大连宝生物公司；钙黄绿素购自北京东方嘉城生物公司；5M甜菜碱溶液(Cat.No.B0300)以及硫酸锰(Cat.No.M3634)购自SIGMA公司。
表3：引物序列
| 引物名称 | 核酸序列（5’→3’） | 序列号 |
| 反向外引物NOS-B3 | gatgacaccgcacgcgataa | SEQ ID No.1 |
| 反向内引物NOS-BIP | gggtttttatgattagagtcccgcaatttatcctagtttgcgcgctata | SEQ ID No.2 |
| 正向外引物NOS-F3 | gatcgttcaaacatttggca | SEQ ID No.3 |
| 正向内引物NOS-FIP | catgcttaacgtaattcaacagaaagattgaatcctgttgccggtc | SEQ ID No.4 |
| 反向环引物NOS-LbLNA | acaTTT*aatacgcgatagaaa | SEQ ID No.5 |
| 正向环引物NOS-LfLNA | tTAT*atgataatcatcgcaaga | SEQ ID No.6 |
*注：大写字母代表锁核酸（LNA），其它为脱氧核糖核苷酸。
3.主要检测步骤：
1）DNA提取
同实施例1。
2）样品总DNA浓度的测定
同实施例1。
3）进行LAMP检测，包括以下4个步骤：
（A）配制LAMP检测体系
LAMP检测方法体系包括Bst DNA聚合酶、ThermoPol Buffer(10×)、MgSO4、dNTPs(4种dNTP各10mM)、甜菜碱以及钙黄绿素和硫酸锰混和液、正向外引物、反向外引物、正向内引物、反向内引物、正向环引物、反向环引物、样品DNA等，具体浓度及用量见表4。
表4.NOS终止子用LAMP检测反应体系
*X表示根据所用DNA的浓度量取20ng DNA所需的体积，ddH2O的体积由4.5-X得到。
（B）对照设置
设置阴性对照、空白对照和阳性对照，阴性对照反应管中以20ng的非转基因水稻的DNA为模板，空白对照反应管中以纯水为模板，阳性对照反应管中以20ng的转基因水稻BT汕优63的DNA为模板。对照组LAMP检测体系的其余成分与表4相同。
（C）LAMP检测反应
在LAMP检测方法体系的所有成分加入反应管中后，将其混匀，然后放入恒温装置中，65℃保温60分钟。
（D）目视判定结果。
如反应体系由棕褐色变黄绿色，则判断检测结果为阳性；如反应体系保持棕褐色，未变为黄绿色，则判断检测结果为阴性。
上述方法的检测结果见图2。如图2所示，使用反向外引物NOS-B3（SEQID No.1）、反向内引物NOS-BIP（SEQ ID No.2）、正向外引物NOS-F3（SEQID No.3）和正向内引物NOS-FIP（SEQ ID No.4）、反向环引物NOS-LbLNA（SEQ ID No.5）和正向环引物NOS-LfLNA（SEQ ID No.6），以钙黄绿素为显色剂检测含有NOS终止子的转基因水稻待测样品的DNA，科丰6号、克螟稻（KMD1）、T2a-1和T1c-19与阳性对照Bt汕优63均显示黄绿色，表明科丰6号、克螟稻（KMD1）、T2a-1和T1c-19包含NOS终止子，而作为阴性对照的非转基因水稻和空白对照则保持棕色。
该实验结果证明，本发明使用反向外引物NOS-B3（SEQ ID No.1）、反向内引物NOS-BIP（SEQ ID No.2）、正向外引物NOS-F3（SEQ ID No.3）和正向内引物NOS-FIP（SEQ ID No.4）、反向环引物NOS-LbLNA（SEQ IDNo.5）和正向环引物NOS-LfLNA（SEQ ID No.6），以钙黄绿素为显色剂可用于简单、快速、高特异性且高灵敏度地测定含有NOS终止子的转基因水稻。
实施例3：使用加环引物并以SYBR Green I为显色剂检测转基因水稻
在本实施例中利用反向外引物NOS-B3（SEQ ID No.1）、反向内引物NOS-BIP（SEQ ID No.2）、正向外引物NOS-F3（SEQ ID No.3）、正向内引物NOS-FIP（SEQ ID No.4）、反向环引物NOS-LbLNA（SEQ ID No.5）和正向环引物NOS-LfLNA（SEQ ID No.6），以SYBR Green I为显色剂检测含有NOS终止子的转基因水稻。
在本实施例中检测的DNA样品分别来自科丰6号、克螟稻（KMD1）、T2a-1、T1c-19，同时还包括来自已知包含NOS终止子的Bt汕优63作为阳性对照，不含NOS终止子的非转基因水稻的DNA样品作为阴性对照和不含DNA的样品作为空白对照。
1.主要检测仪器：
同实施例2。
2.主要检测试剂：
所有引物均由上海英骏生物技术有限公司合成（具体序列见表3）；BstDNA聚合酶、10×ThermoPol Buffer、MgSO4购自NEB公司；dNTPs购自大连宝生物公司；甜菜碱、SYBR Green I购自北京东方嘉城生物公司。
3.主要检测步骤：
1）DNA提取
同实施例1。
2）样品总DNA浓度的测定
同实施例1。
3）进行LAMP检测，包括以下4个步骤：
（A）LAMP检测方法体系配制
LAMP检测方法体系包括Bst DNA聚合酶、ThermoPol Buffer(10×)、MgSO4、dNTPs(4种dNTP各10mM)、甜菜碱、正向外引物、反向外引物、正向内引物、反向内引物、正向环引物、反向环引物、样品DNA等，具体浓度及用量见表5。
表5.NOS终止子LAMP检测反应体系
*X表示根据所用DNA的浓度量取20ng DNA所需的体积，ddH2O的体积由5.5-X得到。
（B）对照设置
设置阴性对照、空白对照和阳性对照，阴性对照反应管中以20ng的非转基因水稻的DNA为模板，空白对照反应管中以纯水为模板，阳性对照反应管中以20ng的转基因水稻BT汕优63的DNA为模板。对照组LAMP检测体系的其余成分与表5相同。
（C）LAMP检测反应
在LAMP检测方法体系的所有成分加入反应管中后，将其混匀，然后放入恒温装置中，65℃保温60分钟。
（D）目视判定结果。
LAMP反应结束后，向管内加入1μL SYBR Green I，涡旋混合并短暂离心，在紫外光下目视判定结果。如反应体系发出强烈荧光，则判断检测结果为阳性；如反应体系未发出强烈荧光，则判断检测结果为阴性。
上述方法的检测结果见图3。如图3所示，使用反向外引物NOS-B3（SEQID No.1）、反向内引物NOS-BIP（SEQ ID No.2）、正向外引物NOS-F3（SEQID No.3）和正向内引物NOS-FIP（SEQ ID No.4）、反向环引物NOS-LbLNA（SEQ ID No.5）和正向环引物NOS-LfLNA（SEQ ID No.6），以SYBR GreenI为显色剂检测含有NOS终止子的转基因水稻待测样品的DNA，科丰6号、克螟稻（KMD1）、T2a-1和T1c-19与阳性对照Bt汕优63均发出强烈荧光，表明科丰6号、克螟稻（KMD1）、T2a-1和T1c-19包含NOS终止子，而作为阴性对照的非转基因水稻和空白对照则相对于阳性对照发出明显微弱的荧光。
该实验结果证明，使用反向外引物NOS-B3（SEQ ID No.1）、反向内引物NOS-BIP（SEQ ID No.2）、正向外引物NOS-F3（SEQ ID No.3）和正向内引物NOS-FIP（SEQ ID No.4）、反向环引物NOS-LbLNA（SEQ ID No.5）和正向环引物NOS-LfLNA（SEQ ID No.6），以SYBR Green I为显色剂可简单、快速、高特异性且高灵敏度地测定含有NOS终止子的转基因水稻。
实施例4.加环引物在实时浊度仪上检测转基因水稻
在本实施例中利用反向外引物NOS-B3（SEQ ID No.1）、反向内引物NOS-BIP（SEQ ID No.2）、正向外引物NOS-F3（SEQ ID No.3）、正向内引物NOS-FIP（SEQ ID No.4）、反向环引物NOS-LbLNA（SEQ ID No.5）和正向环引物NOS-LfLNA（SEQ ID No.6），首次通过LAMP法实现了在实时浊度仪上检测含有NOS终止子的转基因水稻。
在本实施例中检测的DNA样品分别来自科丰6号、克螟稻（KMD1）、T2a-1、T1c-19，同时还包括来自已知包含NOS终止子的Bt汕优63作为阳性对照，不含NOS终止子的非转基因水稻的DNA样品作为阴性对照和不含DNA的样品作为空白对照。
1.主要检测仪器：
同实施例1。
2.主要检测试剂：
所有引物均由上海英骏生物技术有限公司合成（具体序列见表3）；BstDNA聚合酶、10×ThermoPol Buffer、MgSO4购自NEB公司；dNTPs购自大连宝生物公司；甜菜碱购自北京东方嘉城生物公司。
3.主要检测步骤：
1）DNA提取
同实施例1。
2）样品总DNA浓度的测定
同实施例1。
3）进行LAMP检测，包括以下4个步骤：
操作流程包括以下4个步骤：
（A）LAMP检测方法体系配制
LAMP检测方法体系包括Bst DNA聚合酶、ThermoPol Buffer(10×)、MgSO4、dNTPs(4种dNTP各10mM)、甜菜碱、正向外引物、反向外引物、正向内引物、反向内引物、正向环引物、反向环引物、样品DNA等，具体浓度及用量见表5。
（B）对照设置
设置阴性对照、空白对照和阳性对照，阴性对照反应管中以20ng的非转基因水稻的DNA为模板，空白对照反应管中以纯水为模板，阳性对照反应管中以20ng的转基因水稻BT汕优63的DNA为模板。对照组LAMP检测体系的其余成分与表5相同。
（C）在实时浊度仪上进行LAMP检测反应
在将LAMP检测方法体系的所有成分加入反应管中后，将其混匀，然后放入实时浊度仪中，65℃保温60分钟。
（D）根据实时浊度曲线判定检测结果
实时浊度仪可实时读出反应体系的浊度，如浊度-时间曲线保持平整无突然跃升现象，则判断检测结果为阴性；如浊度-时间曲线出现典型的急剧跃升现象，则判断检测结果为阳性。
上述方法的检测结果见图4。如图4所示，使用反向外引物NOS-B3（SEQID No.1）、反向内引物NOS-BIP（SEQ ID No.2）、正向外引物NOS-F3（SEQID No.3）、正向内引物NOS-FIP（SEQ ID No.4）、反向环引物NOS-LbLNA（SEQ ID No.5）和正向环引物NOS-LfLNA（SEQ ID No.6）扩增待测样品的DNA，科丰6号、克螟稻（KMD1）、T2a-1和T1c-19与阳性对照Bt汕优63均显示急剧跃升的浊度-时间曲线，表明科丰6号、克螟稻（KMD1）、T2a-1和T1c-19包含NOS终止子，而作为阴性对照的非转基因水稻和空白对照则显示平整无突然跃升的浊度-时间曲线。
该实验结果证明，本发明的反向外引物NOS-B3（SEQ ID No.1）、反向内引物NOS-BIP（SEQ ID No.2）、正向外引物NOS-F3（SEQ ID No.3）、正向内引物NOS-FIP（SEQ ID No.4）、反向环引物NOS-LbLNA（SEQ ID No.5）和正向环引物NOS-LfLNA（SEQ ID No.6）可用于简单、快速、高特异性且高灵敏度地测定含有NOS终止子的转基因水稻。
Claims (10)
1.用于通过环介导等温扩增法检测含有NOS终止子的转基因水稻或其制品的引物，其中，所述引物的序列为SEQ ID NOs.1-4或SEQ ID NOs.1-6。
2.用于通过环介导等温扩增法检测含有NOS终止子的转基因水稻或其制品的试剂盒，其中所述试剂盒包括权利要求1所述的引物序列，并进一步包括甜菜碱。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其还包括用于提取转基因水稻DNA的试剂、用于环介导等温扩增的试剂、阳性对照、阴性对照、空白对照以及使用说明书。
4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其进一步包括可用于环介导等温扩增法的核酸用染色荧光剂和/或金属离子滴定指示剂。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其中所述核酸染色剂为SYBR Green I或Evagreen，所述金属离子滴定指示剂为羟基萘芬蓝或锰离子与钙黄绿素。
6.通过环介导等温扩增法检测含有NOS终止子的转基因水稻或其制品的方法，所述方法包括使用权利要求1所述的引物或者权利要求2-5中任一项所述的试剂盒。
7.如权利要求6所述的方法，所述方法包括如下步骤：
（a）从待测样品中提取DNA；和
（b）使用权利要求1所述的引物或权利要求2-5中任一项所述的试剂盒，通过环介导等温扩增的反应进行核酸扩增反应和扩增产物的检测。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述核酸扩增反应在实时浊度仪上进行。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述核酸扩增反应在恒温装置中进行。
10.权利要求1所述的引物或者权利要求2-5中任一项所述的试剂盒在检测含有NOS终止子的转基因水稻或其制品中的应用。
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| COR | Change of bibliographic data |
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