CN101225435A

CN101225435A - 一种快速检测转基因大豆的方法

Info

Publication number: CN101225435A
Application number: CNA200710060309XA
Authority: CN
Inventors: 王永; 兰青阔; 程奕; 张丽华; 朱珠; 赵新
Original assignee: Central Laboratory of Tianjin Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Central Laboratory of Tianjin Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2007-12-18
Filing date: 2007-12-18
Publication date: 2008-07-23

Abstract

本发明公开了一种转基因大豆的快速检测方法。其原理是采用4条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在65℃左右对核酸进行扩增，短时间扩增效率可达到10⁹－10¹⁰个拷贝。其鉴定采用肉眼直接观察反应管内沉淀的混浊度或者通过紫外灯下SYBR Gold颜色变化判断扩增与否。本发明的检测方法具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点，为转基因作物的检测开辟了广阔的前景。

Description

一种快速检测转基因大豆的方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因产品的检测方法，更具体说是一种快速检测转基因大豆的方法及根据转基因时用的CaMV35s启动子序列及CP4-EPSPS设计的两套引物对其进行扩增，通过观察反应管浊度或紫外灯下观察SYBR Gold颜色变化或观察琼脂糖凝胶电泳来判断扩增情况。

背景技术

2006年全世界转基因作物种植面积为10200万公顷，与2005年转基因作物9000万公顷相比增长了13％，从1996年到2006年十年间转基因作物总的种植面积增加了60倍。目前，世界各国已进行田间试验的转基因作物超过5000种，批准商品化的转基因作物有160多种，包括玉米、大豆、油菜、番茄、马铃薯、甜椒、西葫芦、木瓜、甜菜、香石竹、矮牵牛、亚麻、烟草、西瓜、菊苣等。我国转基因生物研究始于20世纪80年代初期，主要是转基因抗虫棉。近年来，政府不断加大对生物技术研究的支持力度，积极促进农业生物技术的研究与产业化开发。

转基因作物安全性主要集中在转基因作物释放的环境安全性和由转基因作物生产出的食品的安全性上。包括对人和动物健康的风险、对生态环境与农业的风险、对非目标生物的风险。针对第一种风险，1993年，联合国经济发展与合作组织(OECO)提出了食品安全性评估的“实质等同性”原则。如果转基因作物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。

最早提出对转基因食品进行标识管理的是欧盟，1998年，欧盟在世界上签署第一个法案，要求对转基因产品进行标签说明；1999年，要求出口到欧盟的非转基因产品不得含有1％的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最低限量降低到0.9％。日本、澳大利亚、新西兰对转基因成分的最低含量做了不同规定，域值从1-5％不等。

我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目录，并于2002年3月20日起正式实施。

为了能够对转基因作物及其产品做出综合评价，除了需要各国政府和国际机构制定科学的安全评价体系以及严格的管理法规外，建立有效的方法体系对转基因作物进行检测也很重要，这是对转基因作物进行安全性评价和实施监管的基础，也是农产品国际贸易健康发展的重要保障。

转基因作物的检测主要是检测样品是否含有外源蛋白质(基因表达产物)和是否含有外源基因(DNA)(Luthy J.1999)。转基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫学原理的酶联免疫吸附法(ELISA)、试纸条检测、Western杂交等方法检测，主要从待测样品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基质，利用抗体与目的蛋白(抗原)特异结合的特性，通过偶联抗体与抗原抗体复合物的作用产生可检测的信号。转基因作物的核酸检测方法主要有两种：核酸分子杂交技术(Sourthern blot)，PCR检测技术。目前，PCR检测方法是最主要、最准确地检测转基因作物的方法，包括定性PCR方法、复合PCR方法、巢式PCR方法、竞争性定量PCR方法、荧光定量PCR方法等。国内外推广使用的是定性PCR和实时定量PCR检测方法：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。通过聚合酶的作用，在体外快速特异地扩增目的片段，使微量、特定的目的DNA片段在几小时内迅速扩增到百万倍。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后很容易观察，因而具有快速、灵敏等优点。

转基因作物及产品检测过程一般为：通过常用植物的内标准基因检测样品的来源，然后检测转基因样品中普遍存在的3种通用元件：启动子、终止子和标记基因。如果结果为阳性则进一步对外源结构基因进行检测。例如，根据35S启动子、NOS终止子、NPTII基因设计引物，检测大豆Roundup-Ready、抗虫Bt玉米种子及深加工产品，并采用了Southern blot和限制性内切酶酶切对实验结果进行证明(Vollenhofer S.et al.1999)。

实时荧光定量PCR的基本原理是在扩增反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR方法根据采用的荧光基团发光原理的不同又可以分很多种，例如SYBR Green I荧光染料、FRET技术、TaqMan探针、MolecμLar Beacon等。其中TaqMan荧光定量PCR方法由于其探针的简单和高度特异性得到最为广泛的应用。例如，利用TaqMan荧光定量PCR方法特异性检测GA21玉米品系(曹际娟等，2003)其他检测方法主要包括将蛋白、核酸两种方法的结合例如PCR-ELISA检测方法、免疫PCR方法和最新的基因芯片检测方法。

目前国际和国内转基因检测标准主要是定性PCR和实时荧光定量PCR检测。定性PCR方法技术成熟，稳定，但反应体系和操作过程比较复杂，需要专业人员；所需PCR仪价格在5万元左右，扩增时间2-3小时，扩增结果电泳时间需1小时左右；电泳常用染料EB是强致癌物，有较强毒性。实时荧光定量PCR技术先进，灵敏度更高，扩增时间在1小时左右，扩增结果实时在电脑上显示；能检测出样品中外源基因的数量信息(拷贝数)稳定性、体系和操作同定性PCR相当，但仪器和耗材价格较高；一台定量PCR在50万元左右，不宜大范围推广。

发明内容

本发明的目的在于公开一种快速检测转基因大豆的方法及根据转基因时用的Camv35s启动子序列及CP4-EPSPS设计两套引物对其进行扩增，通过肉眼观察浊度或加入SYBR Gold紫外灯下颜色的变化或观察琼脂糖凝胶电泳结果判断扩增情况。

本发明的技术方案如下：

一种用于检测转基因大豆的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因特异性引物，其特征在于设计2对套式引物，其中外引物正向序列为：GCCACCCATCTCGATCAC，反向序列为：GATCGGGAATTGGATCCGG；内引物正向序列为TCGTCCACCGTGACAGGGTTTTTTCATCGCCATGAGCTTCCTC，反向序列为AGTTCATGGACCTGATGGCCGTTTTTCATCAGGCAGCCTTCGTAT。

另外一种用于检测转基因大豆的花椰菜花叶病毒35S启动子特异性引物，其特征在于设计2对套式引物，其中外引物正向序列为：GCCCAGCTATCTGTCACTTC，反向序列为：TCCCTTACGTCAGTGGAGAT；内引物正向序列为CGGCAGAGGCATCTTGAACGATAAAAGGAAGGTGGCACCTAC，反向序列为ACAGTGGTCCCAAAGATGGACCTGCTTTGAAGACGTGGTTGG。

本发明采用上述两套引物进行快速检测转基因大豆的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：2×Buffer 2.5μL，FIP 4μL，BIP 4μL，F3 0.5μL，B3 0.5μL，dNTPs 3.5μL，模板DNA 1μL，用灭菌去离子水补齐到25μL；其中2×Buffer 2.5μL，表示的是2×缓冲液。

(3)扩增反应过程：在DNA循环仪上95℃条件下变性5min，加入BstDNA聚合酶大片段1μL，在60-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min，4℃，保存；

(4)扩增反应结束，取体系液10-25μL用不同的检测方法判断扩增与否。

其中的引物序列表如下：

Primer名称	序列(5′to3′)	碱基数
Primer名称	序列(5′to3′)	碱基数	CP4EPSPS-F3CP4EPSPS-B3CP4EPSPS-FIPCP4EPSPS-BIPCaMV35S-F3CaMV35S-B3CaMV35S-FIPCaMV35S-BIP	GCCACCCATCTCGATCACGATCGGGAATTGGATCCGGTCGTCCACCGTGACAGGGTTTTTTCATCGCCATGAGCTTCCTCAGTTCATGGACCTGATGGCCGTTTTTCATCAGGCAGCCTTCGTATGCCCAGCTATCTGTCACTTCTCCCTTACGTCAGTGGAGATCGGCAGAGGCATCTTGAACGATAAAAGGAAGGTGGCACCTACACAGTGGTCCCAAAGATGGACCTGCTTTGAAGACGTGGTTGG	1819434520204242

本发明所述的不同的检测方法判断扩增与否，包括：琼脂糖凝胶电泳，加入EB染色剂，在紫外灯下观察，各种片断长度的茎环结构的扩增产物；或直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Gold，通过紫外灯下颜色的变化观察有无扩增反应；或评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来观察有无扩增反应。

为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明。

1、原理

本方法应用一种新型的核酸扩增方法，其原理是采用4条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在65℃左右对核酸进行扩增，短时间扩增效率可达到10⁹-10¹⁰个拷贝。具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点。

2、引物设计

该引物设计较复杂。需要最少4条引物，分别是正向内引物FIP、正向外引物F3、反向内引物BIP、反向外引物B3。内引物长度通常超过40个碱基，外引物短些，为25个碱基左右。除了引物的长度、碱基组成外，还要考虑引物与靶序列的环状结构等。

本研究依据转基因大豆Roundup Ready Soybean启动子基因Camv35s和抗除草剂基因CP4-EPSPS设计两套引物。

表1引物序列表如下：

3、反应条件

反应试剂需要链置换型DNA聚合酶、dNTPs、引物和反应缓冲液。反应在恒温条件下进行，反应时间依据引物的效率和模板DNA质量变化，一般为1h或更少。模板DNA在进行恒温扩增前先要在95℃条件下变性5min，在60-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min而终止。这项技术的优点就是不需要热循环。由于扩增是在恒温条件下进行的，因此仅需要恒温水浴锅或金属加热块维持反应温度，不需要PCR仪等昂贵的仪器。材料与方法：

(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；筛选基因Camv35s引物；目标基因CP4-EPSPS引物；dNTPs；

(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：2×Buffer 2.5μL，FIP 4μL，BIP 4μL，F3 0.5μL，B3 0.5μL，dNTPs 3.5μL，模板DNA 1μL，用灭菌去离子水8.5μL；然后补齐到25μL。

(3)扩增反应过程：95℃条件下变性5min，加入Bst DNA聚合酶大片段1μL，在60-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min，4℃，保存；

4、扩增结果观察

有三种观察方法，适合不同情况下进行：

1)通过琼脂糖凝胶电泳，加入EB染色剂，在紫外灯下观察。反应会产生各种片断长度的茎环结构的扩增产物，因此在电泳图谱中显示为从点样孔处开始的弥散和条带现象。由于EB是致癌剂，因此该方法应用不是很广范。结果见图1。

2)由于反应形成大量扩增产物，可以直接向扩增管中加入嵌入剂SYBRGold，紫外灯下观察，无扩增反应的管子呈橙色，有扩增反应的管子将变为绿色。结果见图2。

3)检测还可以通过评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来进行。在反应中，在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物-焦磷酸镁沉淀。它有极高的特异性，可以用肉眼观察或浊度仪检测反应管中的沉淀浊度就能够判断扩增与否。

本发明的用于转基因大豆检测的扩增方法，具有许多迄今为止的扩增方法无法比拟的优点：

1)操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，只需一恒定温度就能反应，不需要预先进行双链DNA的变性。

2)高特异性：该技术由4条引物扩增靶序列的6个区段，并且这6个区段的顺序也有规定，因此具有高度特异性。

3)快速高效：整个扩增不到1h即可完成，产量可达到10⁹-10¹⁰个拷贝；

4)灵敏度高：扩增模板可仅为10拷贝甚至更少。

5)鉴定简便：可以用肉眼直接观察反应管内沉淀的混浊度或者通过SYBR Gold紫外灯下颜色变化判断扩增与否。

附图说明

图1为扩增产物的电泳分析图谱。自左向右依次为阳性Camv35s、CP4-EPSPS、阴性对照Camv35s、CP4-EPSPS和Marker。

图2为扩增产物加入SYBR Gold结果图。左边为阳性的Camv35s、CP4-EPSPS，右边为阴性对照Camv35s、CP4-EPSPS。

图3为扩增产物加入SYBR Gold紫外灯下观察的结果图。自左向右依次为1阳性Camv 35s、2阳性CP4-EPSPS、3阴性Camv35s、4阴性CP4-EPSPS。

图4为扩增产物的电泳分析图谱。自左向右依次为1阳性Camv35s、2阳性CP4-EPSPS、3阴性Camv35s、4阴性CP4-EPSPS。

图5为扩增产物加入SYBR Gold结果图。自左向右依次为1阳性Camv35s、2阳性CP4-EPSPS、3阴性Camv35s、4阴性CP4-EPSPS。

为了能更加清楚的说明本发明的种植方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明。

实施例1

1、转基因大豆DNA的提取：常规CTAB法提取(见附件)

2、扩增反应

(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：2×Buffer 2.5μL，FIP 4μL，BIP 4μL，F3 0.5μL，B3 0.5μL，dNTPs 3.5μL，模板DNA 1μL，用灭菌去离子水8.5μL；补齐到25μL。

(3)扩增反应过程：95℃条件下变性5min，加入Bst DNA聚合酶大片段1μL，在60℃进行45min，并且在80℃持续2min，4℃，保存；

(4)扩增反应结束，直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Gold，在紫外灯下观察。无扩增反应的管子没有荧光，有扩增反应的管子将变为绿色荧光。结果见图3。

实施例2

1、提取转基因大豆粉中的DNA：常规CTAB法提取(见附件)

2、扩增：

(3)扩增反应过程：95℃条件下变性5min，加入Bst DNA聚合酶大片段1μL，在65℃进行60min，并且在80℃持续2min，4℃，保存；

(4)扩增反应结束，取体系液10μL，通过琼脂糖凝胶电泳，加入EB染色剂，在紫外灯下观察。反应会产生各种片断长度的茎环结构的扩增产物，因此在电泳图谱中显示为从点样孔处开始的弥散和条带现象。结果见图4。

实施例3

1、提取转基因豆粕中的DNA：常规CTAB法提取(见附件)

2、扩增反应：

(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：2×Buffer 2.5μL(含Mg²⁺)，FIP 4μL，BIP 4μL，F3 0.5μL，B3 0.5μL，dNTPs 3.5μL，模板DNA 1μL，用灭菌去离子水8.5μL；补齐到25μL。

(3)扩增反应过程：95℃条件下变性5min，加入Bst DNA聚合酶大片段1μL，在63℃进行50min，并且在80℃持续2min，4℃，保存；产量可达到10¹⁰个拷贝；

(4)扩增反应结束，直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Gold，无扩增反应的管子呈橙色，有扩增反应的管子将变为绿色。结果见图5。

附件：常规CTAB法提取DNA

(1)取转基因大豆约100mg，放入研钵中，加入少量液氮迅速磨碎。液氮反复加入3～4次，磨碎成粉末为止。

(2)加入1.5mL预热至65℃的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样(依试样不同，可适当增加缓冲液的用量)，65℃保育30min，期间不停颠倒混匀；

(3)约12000g离心10min。转移上清至一新离心管，加入1倍体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；

(4)加入1倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；

(5)加入2倍体积CTAB沉淀缓冲液，室温静置保育60min；12000g离心15min，弃上清；加入350μL氯化钠溶液溶解沉淀；12000g离心10min，转移上清至一新离心管。

(6)加入0.6倍体积异丙醇，倒置离心管轻柔混合，室温放置20min。12000g离心15min。弃上清。加入500μL70％乙醇溶液，并颠倒离心管数次。12000g离心10min。弃上清。

(7)干燥DNA沉淀，加100μL水或TE缓冲液溶解DNA。

序列表

<110>天津市农业科学院中心实验室

<120>一种快速检测转基因大豆的方法

<160>8

<210>1

<211>18bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gccacccatc tcgatcac 18

<210>2

<211>19bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gatcgggaat tggatccgg 19

<210>3

<211>43bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tcgtccaccg tgacagggtt ttttcatcgc catgagcttc ctc 43

<210>4

<211>45bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

agttcatgga cctgatggcc gtttttcatc aggcagcctt cgtat 45

<210>5

<211>20bp

<212>DNA

<213>花椰菜花叶病毒启动子(cauliflower mosaic virus promoter)

<400>5

gcccagctat ctgtcact tc 20

<210>6

<211>20bp

<212>DNA

<213>花椰菜花叶病毒启动子(cauliflower mosaic virus promoter)

<400>6

tcccttacgt cagtggagat 20

<210>7

<211>42bp

<212>DNA

<213>花椰菜花叶病毒启动子(cauliflower mosaic virus promoter)

<400>7

cggcagaggc atcttgaacg ataaaaggaa ggtggcacct ac 42

<210>8

<211>40bp

<212>DNA

<213>花椰菜花叶病毒启动子(cauliflower mosaic virus promoter)

<400>8

acagtggtcc caaagatgga cctgctttga agacgtggtt gg 42

Claims

1.一种用于检测转基因大豆的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因特异性引物，其特征在于，设计2对套式引物，其中外引物正向序列为：GCCACCCATCTCGATCAC，反向序列为：GATCGGGAATTGGATCCGG；内引物正向序列为TCGTCCACCGTGACAGGGTTTTTTCATCGCCATGAGCTTCCTC，反向序列为AGTTCATGGACCTGATGGCCGTTTTTCATCAGGCAGCCTTCGTAT。

2.一种用于检测转基因大豆的花椰菜花叶病毒35S启动子特异性引物，其特征在于，设计2对套式引物，其中外引物正向序列为：GCCCAGCTATCTGTCACTTC，反向序列为：TCCCTTACGTCAGTGGAGAT；内引物正向序列为CGGCAGAGGCATCTTGAACGATAAAAGGAAGGTGGCACCTAC，反向序列为ACAGTGGTCCCAAAGATGGACCTGCTTTGAAGACGTGGTTGG。

3.一种快速检测转基因大豆的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：2×Buffer 2.5μL，FIP 4μL，BIP 4μL，F3 0.5μL，B3 0.5μL，dNTPs 3.5μL，模板DNA 1μL，用灭菌去离子水补齐到25μL；

(2)扩增反应程序：95℃条件下变性5min，加入Bst DNA聚合酶大片段1μL，在60-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min，4℃，保存；

(3)扩增反应结束，可以通过肉眼观察反应管浊度判断结果，无色透明为阴性，白色混浊为阳性；或通过加入1μL 1000×SYBR Gold紫外灯下判断结果，橙色为阴性，绿色为阳性；或通过琼脂糖凝胶电泳判断结果，无条带为阴性，有弥散及梯度条带为阳性；

(4)引物序列如下：

引物名称序列(5′to3′) 碱基数 CP4EPSPS-F3CP4EPSPS-B3CP4EPSPS-FIPCP4EPSPS-BIPCaMV35S-F3 GCCACCCATCTCGATCACGATCGGGAATTGGATCCGGTCGTCCACCGTGACAGGGTTTTTTCATCGCCATGAGCTTCCTCAGTTCATGGACCTGATGGCCGTTTTTCATCAGGCAGCCTTCGTATGCCCAGCTATCTGTCACTTC 1819434520

CaMV35S-B3CaMV35S-FIPCaMV35S-BIP TCCCTTACGTCAGTGGAGATCGGCAGAGGCATCTTGAACGATAAAAGGAAGGTGGCACCTACACAGTGGTCCCAAAGATGGACCTGCTTTGAAGACGTGGTTGG 204242

4.如权利要求3所述的检测方法，其中不同判断扩增与否的检测方法，包括：直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Gold的浓度和体积，通过颜色变化观察有无扩增反应；或评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来观察有无扩增反应；或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。