CN110144349A - 一种大豆叶特异启动子GmNR1(Glyma14g33480)及其分离方法和应用 - Google Patents

一种大豆叶特异启动子GmNR1(Glyma14g33480)及其分离方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大豆叶特异启动子GmNR(Glyma14g33480),具有SEQ ID NO 1所示的多核苷酸序列,大豆基因GmNR1能够在大豆叶中特异表达,在别的组织部位几乎不表达,大豆叶特异启高动子GmNR1在预防病虫害侵染大豆叶部中的应用。本发明提供的大豆叶特异启动子GmNR1可以在拟南芥叶中高效表达,在别的组织中几乎不表达;本发明提供的大豆叶特异启动子GmNR1在大豆根中不表达;本发明提供的大豆叶特异启动子GmNR1可以驱动抗病基因在模式植物拟南芥叶中高效表达,减少转基因对植株可食用部分的影响。

Description

一种大豆叶特异启动子GmNR1(Glyma14g33480)及其分离方法 和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种大豆叶特异启动子 GmNR1及其分离方法和应用。
背景技术
大豆作为重要的粮食作物,已有五千年栽培历史,广泛栽培于世界各地。大豆种子含有丰富的植物蛋白质、脂肪和多种营养元素,常用来做各种豆制品,豆油,酿造酱油等。大豆的生长环境比较恶劣,常常会遭受严重的外界病原微生物,害虫,营养缺乏和其他非生物胁迫,使其正常生长发育严重受到影响,甚至死亡,导致产量下降,品质恶化。例如,大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)病严重影响大豆的产量和种子的品质,在自然条件下每年可导致我国大豆 8-50%的产量损失。然而,目前尚没有开发出有效且经济的方法来对付这些疾病,并且不同的病虫害会侵害大豆的不同组织,组成型启动子会使毒性蛋白在可食用也有部分表达。
发明内容
为了更有针对性地应对病虫害,需要在侵入组织表达目的基因,本发明的目的是提供一种大豆叶特异启动子GmNR1及其分离方法和应用。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种大豆叶特异启动子GmNR1,具有SEQ ID NO 1所示的多核苷酸序列。
与所述的大豆叶特异启动子GmNR1互补的多核苷酸序列SEQ ID NO 2。
上述大豆叶特异启动子GmNR1能够在拟南芥叶中特异表达,在别的组织部位几乎不表达,并且不能在大豆根中表达。
本发明还提供一种大豆叶特异启动子GmNR1的分离方法,包括以下操作步骤:
(1)根据已发表的大豆转录组数据,挑选出在叶表达量较高,而其他组织中表达量很低或根本没有表达的的基因;
(2)根据候选基因的基因号在植物全基因组信息数据库 Phytozome中查找到基因序列,并用Primer5软件设计RT-PCR引物,设计完成的引物在NCBI网站上进行比对,取只能比对到大豆mRNA数据库中一条模板的引物为最终采用的引物序列;
(3)根据基因的基因编号,在植物全基因组信息数据库 Phytozome中查找到候选基因上游2500bp的序列作为启动子的备选序列,对各序列进行酶切位点分析后,设计特异性引物扩增该启动子区,使最终克隆得到的启动子片段在2000bp,在正向引物和反向引物的5’端分别引入Pst I酶切位点和BamH I酶切位点以及保护碱基。
本发明提供了大豆叶特异启动子GmNR1在预防病虫害侵染大豆根部中的应用。
由以上的技术方案可知,本发明的有益效果是:
1.本发明提供的大豆叶特异启动子GmNR1可以在大豆叶中高效表达,在别的组织中几乎不表达;
2.本发明提供的大豆叶特异启动子GmNR1在大豆根中不表达;
3.本发明提供的大豆叶特异启动子GmNR1可以驱动抗病基因在大豆叶中高效表达,减少转基因对植株可食用部分的影响;
4.本发明提供的大豆叶特异启动子GmNR1还可以用来调整期望的大豆性状,并开发对各种胁迫具有耐受性,增强的营养价值和先进的生产力的大豆品种。
附图说明
图1RT-PCR验证候选基因的表达模式,ACT11作对照;
图2为大豆叶特异启动子GmNR1转化载体结构图谱;
图3为转基因T1代拟南芥植株抗除草剂检测;
图4为拟南芥转基因植株GUS染色情况;
图5为大豆毛状根GUS染色情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不能用来限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据厂家的条件作进一步调整,未说明的实施条件通常为常规实验条件。
实施例
1、根据已发表的大豆转录组数据,挑选出在叶表达量较高,而其他组织中表达量很低或根本没有表达的的基因,如表1所示:
表1 各基因在不同组织的表达量
表2 启动子序列的长度
启动子编号 序列长度(bp)
GmNR1(Glyma14g33480) 2070
2.RT-PCR验证大豆组织特异表达基因的表达模式
根据候选基因的基因号在植物全基因组信息数据库Phytozome中查找到基因序列(https://www.phytozome.net/),并用Primer5软件设计RT-PCR引物,设计完成的引物在NCBI网站 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)上进行比对,取只能比对到大豆mRNA数据库中一条模板的引物为最终采用的引物序列,如图2所示;
3.根据基因的基因编号,在植物全基因组信息数据库Phytozome 中查找到候选基因上游2500bp的序列作为启动子的备选序列,对各序列进行酶切位点分析后,设计特异性引物扩增该启动子区,使最终克隆得到的启动子片段在2000bp左右,在正向引物和反向引物的5’端分别引入Pst I酶切位点和BamH I酶切位点以及保护碱基,得到的大豆叶特异启动子GmNR1转化载体结构图谱如图3所示;
4.将根癌农杆菌感受态细胞从-80℃的冰箱中取出,置于冰上融化;取1μg质粒加入100uL农杆菌感受态细胞,在冰上放置30min;立即放入液氮中2min,37℃水浴5min;再放于冰上2min;在超净工作台中准备好无菌的2mL离心管,加入700μL未添加抗生素的LB液体培养基和农杆菌感受态;于28℃,200rpm的摇床中振荡培养4h;将菌液涂布于添加卡那霉素、壮观霉素和利福平的LB平板中,菌液晾干后,封盖倒置于28℃的培养箱中培养2天,直至长出单菌落。
每种质粒挑取10个单菌落并用启动子特异性引物检测,检测正确的阳性克隆进行繁殖扩增,先放入20mL液体LB培养基中小摇,而后放在200mL液体培养基中大量繁殖(培养基中均已加入Kan,Rif, Spect抗性);当菌液浓度达到OD600为1.5-3.0(菌液呈橙黄色)时,可将200mL菌液分装到4个无菌的50mL离心管中,室温下5000rpm 离心10min,倒掉上清,保留菌体沉淀,用拟南芥侵染液(含 0.02%silwet)吹打稀释菌液,至OD600为0.8-1.0左右,即可用于侵染,侵染前一天将待用的野生型拟南芥苗浇足量的水;每种质粒转化10株左右的野生型拟南芥,选取足量的花序形成至初花期的野生型拟南芥,将待侵染的植物剪去已长出的果荚和开放的花;将带有菌体的侵染液倒入小烧杯中,把拟南芥的地上部分浸入侵染液,侵染 3min,取出后立即用保鲜膜包裹住植株,并平放遮光,待18h后即可将保鲜膜揭开(最好不要超过20h,以防植株萎蔫),正常条件下继续培养即可。
5.采用北京酷来博科技有限公司的GUS染色试剂盒对植物进行 GUS组织化学染色,将1mLGUS染色浓缩液(50×)加入50mL的GUS 染色缓冲液中(即稀释50倍),混合均匀即配成GUS染液;将植物组织材料取出,并清洗干净,尤其注意植物根系的清洗,需用水缓慢将泥土冲洗干净,注意轻柔操作,以免伤及植物根系,将清洗好的植株放入平皿中;将90%丙酮加入平皿中,液面覆盖植物即可,在4℃中放置20min,固定材料,防止GUS信号扩散;倒掉丙酮,用GUS清洗液洗掉丙酮,重复清洗两次;将培养皿中的清洗液倒掉,加入GUS 染色液,使染色液没过植物材料,用锡纸将培养皿包好,放入37℃培养箱中,经常观察植物染色情况,如果染上色了即可以进行脱色,也可以染色过夜;将染色液倒出,用移液枪吸净残留的染色液,加入 70%乙醇,进行脱色,刚开始脱色要勤于更换乙醇,至少更换3-5次直至脱色完全(阴性对照材料呈白色);脱色完成后,用镊子将植物材料取出,放在玻璃片上,滴加少量水分,将植株铺平在一个平面上,用肉眼或显微镜观察,白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点,拍照并用Photoshop软件修图,拟南芥转基因植株GUS染色情况如图4 所示;
6.(1)挑选适量没有斑点及破裂,饱满且颜色黄润的大豆WS82 种子;
(2)把挑选好的种子放入培养皿中,大豆种子不宜过多,平铺一层即可,否则豆子堆叠在一起会使豆子灭菌不彻底),将培养皿盖打开,置于密封罐中;用50mL离心管装40mL次氯酸钠溶液(NaClO),也放置于密封罐中,向次氯酸钠溶液中滴入1.6mL浓盐酸,产氯气用来灭菌(2HCl+NaClO=Cl2+NaCl+H2O),盖好密封罐,用保鲜膜封住罐子口,密闭18-20h,注意在通风橱中操作。当天配制GM培养基,倒平板过夜,并将镊子灭菌,备用;
(3)打开密封罐,迅速盖上培养皿盖,取出培养皿并放入无菌操作台中吹30min,去掉氯气的味道,将灭过菌的镊子在酒精灯外焰上再次灼烧灭菌,待镊子降温后,夹起种子,种脐朝下,种在GM培养基中,注意种子要稍微插进培养基中,每个培养皿种10粒种子;
(4)将种好种子的培养皿放在纸箱子内,25℃,暗培养五天,期间每天检查一次种子的状态,及时将污染的种子取出;
(5)期间将目的质粒转入发根农杆菌K599感受态细胞,具体转化步骤同上述2.2.6,涂Kan抗性平板,并且挑取单克隆,小摇获取菌液,PCR验证,取验证正确的菌液100uL涂布于Kan抗性平板上, 28℃倒置培养1天;
(6)准备几把镊子,刀,蓝枪头,剪好的滤纸(放在培养皿中),适量培养皿和50mL离心管,121℃,20min灭菌备用;
(7)将LCCM(HYQ-CCM1,500ML)倒入无菌的50mL离心管中(每种质粒转化的农杆菌需要一个离心管),用枪头将2-4mL LCCM吸到涂有菌液的平板上,将菌吹打均匀,放入50mL离心管中,做好标记;
(8)取萌发5-6d的大豆种子,自下胚轴0.3-0.5cm处切下(放在灭过菌的平皿的盖子上切,可以垫一张灭菌滤纸),将子叶一分为二切开(一粒分成两瓣),去除顶芽,用刀片在子叶节处轻轻划5-7 处伤口,在子叶表面也划几处伤口,即为外植体;
(9)把50mL带菌的侵染液LCCM倒在灭好的培养皿中,把切好的外植体放里面泡20-30min,期间注意要经常晃动平皿,防止菌液沉淀到底部,把SCCM培养基的盖子打开,在盖子上和培养基上分别铺一张滤纸,将转染后的子叶节先放在盖子的滤纸上阴干水分,然后接种到附加一层无菌滤纸的SCCM上(每个平皿放10瓣种子),培养皿用封口膜封口,放在纸箱子内,25℃,暗培养5天;
(10)期间配制好足量的液体和固体发根培养基,并将镊子,刀,蓝枪头,剪好的滤纸(放在培养皿中),适量的锥形瓶,灭菌待用;
(11)将豆子用灭菌后的镊子夹出,放在锥形瓶或敞口瓶内,用发根培养基(液体,加入Cef和Carben抗性)洗掉种子上的菌,共洗三次,前两遍摇晃涮净即可,第三遍泡半小时,期间经常摇晃锥形瓶,洗净后将豆子夹出,放在灭菌的滤纸上晾干,并切掉新长出的下胚轴(只保留大约0.5cm即可),将晾干切好的豆子下胚轴朝下,倾斜着插入固体发根培养基,每个发根培养基中插入5瓣种子;
(12)将发根培养基封口,放入25℃培养箱中,16h/d光照,8h/d 黑暗条件下培养,15-20天长出毛状根,最后对大豆毛状根进行GUS 染色,染色结果如图5所示。
当然,上述说明并非是对本发明的限制,本发明也并不限于上述举例,本技术领域的普通技术人员,在本发明的实质范围内,作出的变化、改变、添加或替换,都应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种大豆叶特异启动子GmNR1,其特征在于,具有SEQ ID NO 1所示的多核苷酸序列。
2.与权利要求1所述的大豆叶特异启动子GmNR1互补的多核苷酸序列SEQ ID NO 2。
3.根据权利要求1所述的一种大豆叶特异启动子GmNR1,其特征在于,所述大豆叶特异启动子GmNR1能够在拟南芥叶中特异表达,在别的组织部位几乎不表达,并且不能在大豆根中表达。
4.一种如权利要求1所述的大豆叶特异启动子GmNR1的分离方法,其特征在于,包括以下操作步骤:
(1)根据已发表的大豆转录组数据,挑选出在叶表达量较高,而其他组织中表达量很低或根本没有表达的的基因;
(2)根据候选基因的基因号在植物全基因组信息数据库Phytozome中查找到基因序列,并用Primer5软件设计RT-PCR引物,设计完成的引物在NCBI网站上进行比对,取只能比对到大豆mRNA数据库中一条模板的引物为最终采用的引物序列;
(3)根据基因的基因编号,在植物全基因组信息数据库Phytozome中查找到候选基因上游2500bp的序列作为启动子的备选序列,对各序列进行酶切位点分析后,设计特异性引物扩增该启动子区,使最终克隆得到的启动子片段在2000bp,在正向引物和反向引物的5’端分别引入Pst I酶切位点和BamH I酶切位点以及保护碱基。
5.权利要求1所述的一种大豆叶特异启动子GmNR1在预防病虫害侵染大豆叶部中的应用。
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