CN102676576B - 一种甘蓝型油菜耐湿性改良的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甘蓝型油菜耐湿性改良的方法，其步骤：A、构建含vgb的抗草胺磷表达载体：（1）目的片段获得；（2）PCR产物回收、转化及测序；（3）T-DNA制备；（4）Vector制备；（5）表达载体制备；（6）农杆菌菌液制备；B、选育耐湿甘蓝型油菜恢复系：通过农杆菌介导法将vgb转到R2中得到T0代恢复系，连续自交后得到T2代恢复系；C、选育耐湿甘蓝型油菜保持系：（a）通过农杆菌介导法将vgb转到6098B中得到T0代保持系，再自交得到T2代保持系；（b）以得到的T1代恢复系单株为父本与6098B杂交，再以6098B为轮回亲本连续回交得到BC3代，再自交得到T2代保持系；D、获得耐湿甘蓝型油菜不育系。方法易行，操作简便，效果明显，能够降低成本并缩短育种进程。
Description
技术领域
本发明属于油菜品质育种和油菜转基因育种领域，更具体涉及一种甘蓝型油菜耐湿性改良的方法，它适用于一种甘蓝型油菜耐湿性育种。
背景技术
土壤水分长时间处于饱和状态会极大影响作物生长。长江流域是中国油菜主要产区，约占全国油菜产量的3/4，但该区域雨水偏多，常超过油菜正常需水量，加之该地区油菜生产主要采用水旱轮作尤其是稻茬免耕的种植模式，土壤黏重，透气性差，排水困难，地下水位高，因此极易产生湿（渍）害，影响油菜正常生长，导致产量下降。前人研究表明，油菜在湿害胁迫下，株高、茎粗、根粗、根长、绿叶数、叶面积、干重等均明显降低，有效分枝数、单株角果数和粒数大幅下降，油菜因此可能减产17%-42.4%（ZhouW J,LinX Q(1995)Effectsof waterlogging at different growth stages on physiological characteristics and seed yield of winterrape(Brassica napus L.).Field Crops Research,44:103-110;Gutierrez B F H,Lavado R S,Porcelli C A(1996)Note on the effects of winter and spring waterlogging on growth,chemicalcomposition and yield ofrapeseed.Field Crops Research,47:175-179;Leul M,Zhou W J(1998)Alleviation of waterlogging damage in winter rape by application of uniconazole effects onmorphological characteristics,hormones and photosynthesis.Field Crops Research,59:121-127）。为减轻油菜湿害带来的产量损失，生产上一般采用开沟排水降低地下水位、土壤翻耕和中耕等农艺措施，但需要花费大量的劳动成本，随着以直播免耕为主的油菜轻简化栽培技术大力推广，为降低油菜生产成本，选育耐湿强的直播油菜品种成为重要的育种目标之一。
传统耐湿性育种依赖于准确可靠的耐湿性评价方法及鉴定指标，以分子标记辅助选择为基础的耐湿性育种依赖于耐湿性状的深入研究，包括耐湿性状遗传模式分析、定位群体构建、分子标记筛选、QTL定位、QTL克隆、候选基因功能分析及耐湿基因应用等。随着现代农业对油菜品种的要求的多元化，油菜耐湿性育种将成为研究热点，但是目前油菜耐湿性研究还远远不够，油菜耐湿性育种依然面临诸多困境，比如发芽期鉴定油菜耐湿性是否准确，耐湿性鉴定成本较大，QTL定位是否准确，分子标记能否利用等等。
转基因技术是现代生物技术的核心，运用该技术能够培育抗病虫、抗逆、优质、高产、高效等新品种。抗病、抗虫性育种方面，菲律宾国际水稻研究所，已育成一批抗稻瘟病、病毒病、白叶枯病、稻飞虱、稻叶蝉和二化螟等多抗品种，如IR36、IR64，美国孟山都公司通过转基因方法育成抗虫、抗旱和抗草胺磷玉米品种，我国广东育成的窄叶青水稻品种高抗稻瘟病，中国农科院利用转基因技术育成抗棉铃虫棉花品种。品质育种方面，美国培育出玉米品种“U-24”，蛋白质含量高达20%,赖氨酸含量达5%，菲律宾国际水稻研究所育成IR20、IR22、IR24等一批高产优质品种，蛋白质含量比一般品种提高2%，浙江省农业科学院应用反义PEP转基因技术育成双低、高油油菜新品系超油1号（47.4%）、超油2号（52.82%）。传统杂交育种技术只能在相同生物物种内进行基因转移，转基因技术则不受生物物种生殖隔离限制，可以在不同物种间转移基因，因此可以借助其他物种的某些特殊基因来改良农作物的品质，比如将鱼的抗寒蛋白基因转到农作物中提高抗寒性。
透明颤菌血红蛋白（Vitreoscilla hemoglobin,VHb）是在透明颤菌属（Vitreoscilla sp.C1）中产生的一种可溶性血红蛋白。研究显示，vgb（编码透明颤菌血红蛋白的基因）的表达能增强植株耐湿性。Mao等（2003）通过农杆菌介导方法将vgb转化到矮牵牛中，在大田条件下种植鉴定了转基因的矮牵牛植株，发现这些植株显示出了明显的耐涝性(Mao Z,Hu Y.Zhong J,Wang L,Guo J and Lin Z(2003)Improvement of hydroponic growth and watertolerance of Petunia by the introduction of vhb gene.Acta Botanica Sinica 45:205-210)。Li等（2005）用下胚轴和子叶柄作为浸染外植体，运用农杆菌介导法将vgb转移到卷心菜（Brassicaoleracea var.Cabitata）中，发现转基因种子比野生对照发芽快，并且转基因植株在持续淹水处理下显示一定忍耐力(Li X,Peng RH,Fan HQ,Xiaong AS,Yao QH,Cheng ZM,Li Y(2005)Vitreoscilla hemoglobin overexpression increases submergence tolerance in cabbage.Plant CellRep 23:710–715)。李义良等（2009）对导入vgb的银腺杂种杨进行耐涝性鉴定，结果表明，淹水胁迫下vgb的表达增强了银腺杂种杨叶绿素含量的积累，进而促进了转基因植株的生长，提高了转基因株系对淹水环境的忍受能力(李义良,苏晓华,张冰玉,黄秦军,张香华.转vgb银腺杂种杨的耐涝性.林业科学,2009,45(7):26-31)。Zelasco等(2006)将vgb转到白杨树中发现，植株生长、生物总量、淹水忍耐力和氧化压力、亚硝基应激压力的忍耐力不完全依赖VHb的特殊功能，于是认为转基因杨树中vgb表达的影响并不确定(Zelasco S,Reggi S,Calligari P，Balestrazzi A,Bongiorni C,Quattrini E,Delia G,Bisoffi S,Fogher C,Confalonieri M(2006)Expression of the Vitresocilla hemoglobin(VHb)encoding gene in transgenic white poplar:plant growth and biomass production,biochemical characterization and cell survival undersubmergence,oxidative and nitrosative stress conditions.Mol Breed 17:201-216)，因此vgb表达能否增强其他植物（包括油菜）的耐湿性还有待进一步研究。
尽管谭小力等曾将蓝细菌血红蛋白基因转入到甘蓝型油菜中（谭小力,孔凡明,张丽丽,李娟,陈松,戚存扣.蓝细菌血红蛋白基因的克隆及其向甘蓝型油菜中的转化.作物学报,2009,35(1):66-70），但并没有证实该基因能提高甘蓝型油菜耐湿性。目前国内外还没有vgb转入甘蓝型油菜方面的报道。鉴于油菜耐湿性研究现状及vgb在其他植物中的表达情况，我们通过农杆菌介导法将vgb转入甘蓝型油菜R2（见遗传资源表）中，对获得的转基因材料进行分析，结果证实vgb能明显提高耐湿性，从而开发出一种甘蓝型油菜耐湿性改良方法，可用于甘蓝型油菜耐湿性育种。
发明内容
本发明的在于提供了一种甘蓝型油菜耐湿性改良的方法，方法易行，操作简便，效果明显，操作简便。通过该方法能避开传统甘蓝型油菜耐湿性育种所需的复杂步骤，因而能够降低成本，缩短育种进程。
为了实现上述的，本发明采用以下技术措施：
通过在甘蓝型油菜中导入外源基因vgb可以提高甘蓝型油菜耐湿性。通过构建含NPTⅡ（卡那霉素抗性基因）表达元件、Bar（草胺膦抗性基因）表达元件和外源基因vgb（编码透明颤菌血红蛋白的基因）的表达载体将vgb导入甘蓝型油菜可以获得抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜恢复系、保持系和不育系，从而实现甘蓝型耐湿油菜三系配套。
一种甘蓝型油菜耐湿性改良的方法，其步骤是：
A、含vgb的抗草胺磷表达载体的构建：
1.片段获得：以NCBI网站上公布的序列（Genebank编号：GBEU363512.1）为模板设计引物，以质粒DNA（pPZV，见遗传资源表）为底物进行PCR扩增；
2.PCR产物回收、转化及测序：回收PCR扩增片断，将片段连入Simple-T vecter（TRANSGENE）中，转化大肠杆菌DH5α（从北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司购买）感受态细胞，通过篮白斑筛选获得阳性单克隆，挑选阳性克隆，繁殖菌液，送样测序；
3.T-DNA制备：与NCBI网站上公布的vgb序列的编码区做比较，挑选没有碱基差异的阳性单克隆菌液，抽取质粒DNA，双酶切后回收酶切片段得到T-DNA。
4.Vector制备：繁殖大肠杆菌DH5α菌液（P-BAR-F3，含NPTⅡ表达元件和Bar表达元件，见遗传资源表），抽取质粒DNA，双酶切后回收酶切片段得到Vector；
5.表达载体制备：连接步骤3得到的T-DNA和步骤4得到的Vector，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（从北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司购买），挑取单克隆，繁殖菌液，抽取质粒DNA；
6.农杆菌菌液制备：将步骤5得到的质粒DNA转化农杆菌LBA4404感受态细胞（从北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司购买），挑取单克隆，繁殖菌液，即得到后续工作中所需要的包含NPTⅡ表达元件、Bar表达元件和vgb的农杆菌菌液。
B、抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜恢复系的获得：
通过农杆菌介导法将vgb转化到R2（见遗传资源表）或R6（见遗传资源表）中得到T0代植株；室内分子标记（vhb5':5'CATCATCAAAGCCACTGTTCC3'；
vhb3':5'GCAATCACGCCATAAGCCT3'）鉴定或田间草胺磷鉴定得到阳性单株，自交得到T1代；室内功能鉴定后得到具有耐湿功能的T1代单株，自交得到T2代；室内分子标记鉴定或田间草胺磷鉴定获得vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜恢复系。
C、抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜保持系的获得：
在农杆菌介导法转化效率足够及人手充足的情况下优先采用途径（a），或在途径（a）无法实施的情况下采用途径（b）：
（a）通过农杆菌介导法将vgb转化到甘蓝型油菜6098B（见遗传资源表）或8908B（见遗传资源表）得到T0代植株；室内分子标记鉴定或田间草胺磷鉴定得到阳性单株，自交得到T1代；室内功能鉴定后得到具有耐湿功能的T1代单株，自交得到T2代；室内分子标记鉴定或田间草胺磷鉴定获得vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜保持系。
（b）以步骤B中得到的具有耐湿功能的T1代恢复系单株为父本与6098B或8908B杂交得到F1代，再以6098B或8908B为轮回亲本，回交至BC3代时可得到具有绝大部分保持系遗传背景的甘蓝型油菜，田间草胺磷筛选、考察中选单株表型、室内分析中选单株遗传背景后选出部分优良单株自交并与6098A或8908A杂交，观察后代育性分离情况，结合室内品质分析结果选出vgb位点杂合的优良T1代保持系单株；对T1代保持系单株自交得到的T2代保持系株系进行室内分子标记鉴定或田间抗草胺磷鉴定得到vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜保持系。
D、抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜不育系的获得：
将步骤C中得到的vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜保持系与6098A或8908A杂交即得到vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜不育系。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
本发明通过构建含NPTⅡ表达元件、Bar表达元件和基因vgb的表达载体，采用农杆菌介导法将vgb导入到甘蓝型油菜R2(或R6)、6098B（或8908B）和6098A（或8908A）中，获得抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜恢复系、保持系和不育系，从而实现甘蓝型耐湿油菜三系配套。传统甘蓝型油菜耐湿育种需要一系列复杂过程（包括耐湿性状遗传模式分析、定位群体构建、分子标记筛选、QTL定位、QTL克隆、候选基因功能分析及耐湿基因应用等），耗时长、人力及经济成本大而且研究结果具有不确定性。在甘蓝型油菜中导入vgb能提高甘蓝型耐湿性，该方法易操作，效果明显，因此能用于甘蓝型油菜耐湿性育种。通过本发明提供的方法完成甘蓝型耐湿油菜三系配套只需5或6年时间，能极大缩短育种进程并降低成本。
附图说明
图1为一种抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜三系选育路线示意图
图2为一种引物vhb5'/vhb3'在vgb/R2-②的T1代群体中的扩增结果示意图。
第一排共46个泳道，1～45为T1代群体，46为DL2000 Marker（从下至上共7条带，依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、1600bp、2000bp）；第二排共43个泳道，1～39为T1代群体，40、41、42为：阴性对照R2、阳性对照pPZV、空白对照ddH2O，43为DL2000 Marker（同上），有带∶无带=3:1，表明vgb已经以单拷贝的形式插入到受体材料基因组中
图3为一种引物vhb5'/vhb3'在①-3(a)和②-10(b)中的扩增结果示意图。
图a共29个泳道，1～25为T2代群体，26、27、28、29为阴性对照R2、阳性对照pPZV、空白对照ddH2O和DL2000 Marker（同上），图b与图a相同，表明已经得到vgb稳定遗传的转基因材料
图4为一种转基因植株的RT-PCR分析示意图。
从左至右共有6个泳道，依次为DL2000 Marker（同上）、ddH2O、pPZV、R2、①-3、②-10，表明vgb能在①-3和②-10中正常表达
图5为一种恢复生长8天（a）、11天（b）、14天（c）和20天（d）时对照材料（左）、①-3（中）和②-10（右）的生长情况示意图，表明①-3和②-10在淹水处理结束后显示出更强的恢复生长的能力（与对照相比）
图6为一种不同淹水时间（21h、24h、27h）处理下幼苗的发芽情况示意图，表明①-3和②-10在淹水处理结束后发芽更快（与对照相比）
具体实施方式
实施实例：
根据图1可知，对本发明做进一步详细描述。
一种甘蓝型油菜耐湿性改良的方法，具体步骤为：
A、构建含NPTⅡ（卡那霉素抗性基因）表达元件、Bar（草胺膦抗性基因）表达元件和目的基因vgb（编码透明颤菌血红蛋白的基因）的表达载体
1.以NCBI网站上公布的vgb序列（Genebank编号：GBEU363512.1）为模板设计引物（正向引物：5'GACGAGCTCATGTTAGACCAGCAAACCAT3'；反向引物：
5’GACATCTAGATTATTCAACCGCTTGAGCGT3’），以质粒DNA（pPZV，见遗传资源表）为底物进行PCR扩增。
PCR反应体系：总体积为50μL，其中含5μL底物DNA（50ng/μL），5μL 10×Taq Buffer（含Mg2+），1μL dNTPs（10mmol/L），1U EX-Taq DNA聚合酶（TaKaRa），正向及反向引物各100ng，不足部分用ddH2O补足。
PCR循环参数为：94℃(3min)；94℃(30s)，61℃(45s)，72℃(45s)，共计32个循环；72℃(5min)；72℃延伸10min；然后4℃保存。
2.PCR产物回收、转化及测序：使用E.Z.N.A GEL extraction kit试剂盒回收目标片断，用Simple-T vecter试剂盒（TRANSGENE）连接后于16℃放置2h，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（从北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司购买），通过篮白斑筛选获得阳性单克隆，挑选10-12个阳性克隆繁殖后，送样测序。
3.T-DNA制备：与NCBI网上公布的vgb序列的编码区做比较，挑选没有碱基差异的阳性单克隆菌液，抽取质粒DNA，用Xbal和SacⅠ（Ferments）进行双酶切，用E.Z.N.A GELextraction kit试剂盒回收酶切片段（命名为T-DNA）。
双酶切体系：总体积为60μL，Xbal和SacⅠ各3μL，回收片段30μL，Tango Buffer 6μL，不足部分用ddH2O补足。
4.Vector制备：繁殖菌液（P-BAR-F3，含在细菌中表达的NPTⅡ表达元件和在植物中表达的Bar表达元件，见遗传资源表），抽取质粒DNA，用Xbal和SacⅠ（Ferments）进行双酶切，用E.Z.N.A GEL extraction kit试剂盒回收酶切片段（命名为Vector）。
双酶切体系：总体积为60μL，Xbal和SacⅠ各3μL，质粒DNA20μL，Tango Buffer 6μL，不足部分用ddH2O补足。
5.表达载体制备：连接步骤3得到的T-DNA和步骤4得到的Vector，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（从北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司购买），挑取单克隆，繁殖菌液，抽取质粒DNA。
连接体系：总体积为10μL，6μLT-DNA，1μLVector，0.5μLT4Ligase（Ferments），1μLT4Ligase Buffer（Ferments），不足部分用ddH2O补足。
6.农杆菌菌液制备：将1ug质粒DNA（即步骤5得到的质粒DNA）和100ul农杆菌LBA4404感受态细胞（从北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司购买）混合于1.5mL无菌离心管中，混匀后迅速置于液氮中，然后将离心管放入37℃水浴锅中温育5min，温育结束后在无菌环境下往离心管中加入900μL液体LB培养基，28或29或30℃200rpm振荡孵育2h，离心收集菌体，再加100μL液体LB培养基混匀，均匀涂布于固体LB培养基（含50mg/mL卡那霉素）上，2或3天后挑取单克隆，繁殖菌液，即得到后续工作中所需要的包含NPTⅡ表达元件、Bar表达元件和目的基因vgb的农杆菌菌液。
B、选育抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜恢复系：
以得到的包含NPTⅡ表达元件、Bar表达元件和目的基因vgb的农杆菌菌液为基础配制浸染菌液，用农杆菌介导法将vgb转化到R2（见遗传资源表）或R6（见遗传资源表）中得到T0代植株；室内分子标记（vhb5':5'CATCATCAAAGCCACTGTTCC3'；
vhb3':5'GCAATCACGCCATAAGCCT3'）鉴定或田间草胺磷鉴定得到阳性单株，自交得到T1代；室内功能鉴定后得到具有耐湿功能的T1代单株，自交得到T2代；室内分子标记鉴定或田间草胺磷鉴定获得vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜恢复系。
农杆菌介导转化过程：选取籽粒饱满的甘蓝型油菜种子（R2或R6），消毒后[70%（酒精的体积和水的体积之比）酒精60s、0.1%（氯化高汞的质量和水的体积之比）升汞15min、无菌水洗3次]植入L0培养基上（1/2×MS，PH=5.85）生长4或5天（25℃、光16h/暗8h），切下长约0.7mm左右的茎段（即下胚轴）作为外植体。将外植体置于浸染菌液（将步骤A-6中得到农杆菌菌液离心收集菌体，于1/2×MS中稀释至OD600=0.08～0.10，PH=5.4）中，室温（20－25℃，上下相同）浸染5或6或7或8或9或10min，其间轻轻摇动，然后在无菌吸水纸上吸干菌液，转至L1培养基上（1×MS+1mg/L2,4-D+0.2mg/L 6-BA，PH=5.85），22℃暗培养2或3天，然后在L2培养基上（1×MS+4.5mg/L 6-BA+5mg/L AgNO3+500mg/L羧苄青霉素，PH=5.85）延迟培养5或6或7天（25℃、光16h/暗8h），再转到L3培养基上（1×MS+4.5mg/L 6-BA+5mg/LAgNO3+500mg/L羧苄青霉素+10mg/L草铵膦，PH=5.85）培养3或4周（25℃、光16h/暗8h），切下绿苗，植入L4培养基中（1×MS+0.2mg/L NAA+300mg/L羧苄青霉素，PH=5.85）培养2或3周（25℃、光16h/暗8h），待形成完整植株时，炼苗后移栽至花盘中遮荫保湿培养。
C、选育抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜保持系：
在农杆菌介导法转化效率足够及人手充足的情况下优先采用途径（a），或在途径（a）无法实施的情况下采用途径（b）：
（a）以得到的包含NPTⅡ表达元件、Bar表达元件和基因vgb的农杆菌菌液作为浸染菌液，用农杆菌介导法（方法同上）将vgb转化到甘蓝型油菜6098B（见遗传资源表）或8908B（见遗传资源表）得到T0代植株；室内分子标记鉴定或田间草胺磷鉴定得到阳性单株，自交得到T1代；室内功能鉴定后得到具有耐湿功能的T1代单株，自交得到T2代；室内分子标记鉴定或田间草胺磷鉴定获得vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜保持系。
（b）以步骤B中得到的具有耐湿功能的T1代恢复系单株为父本与6098B或8908B杂交得到F1代，F1代田间草胺磷筛选、考察中选单株表型、室内分析中选单株遗传背景后得到成功导入vgb的、具有部分保持系遗传背景的甘蓝型油菜，选出部分单株作为母本与非转基因保持系杂交得到BC1代；BC1代田间草胺磷筛选、考察中选单株表型、室内分析中选单株遗传背景后得到保留vgb的、具有部分保持系遗传背景的甘蓝型油菜，选出部分单株作为母本与非转基因保持系杂交得到BC2代；BC2代田间草胺磷筛选、考察中选单株表型、室内分析中选单株遗传背景后得到保留vgb的、具有大部分保持系遗传背景的甘蓝型油菜，选出部分单株作为母本与非转基因保持系杂交得到BC3代；BC3代田间草胺磷筛选、考察中选单株表型、室内分析中选单株遗传背景后得到具有绝大部分保持系遗传背景的甘蓝型油菜，选出部分优良单株自交并与6098A或8908A杂交，观察后代育性分离情况，结合室内品质分析结果选出vgb位点杂合的优良T1代保持系单株；对T1代保持系单株自交得到的T2代保持系株系进行室内分子标记鉴定或田间抗草胺磷鉴定得到vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜保持系。
D、选育抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜不育系
将步骤C中得到的vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜保持系与6098A或8908A杂交即得到vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜不育系。
Claims (1)
1.一种甘蓝型油菜耐湿性改良的方法，其步骤是：
A、含vgb的抗草胺磷表达载体的构建：
（1）目的片段获得：以NCBI网站上公布的vgb序列为模板设计引物，以质粒DNA为底物进行PCR扩增；
（2）PCR产物回收、转化及测序：回收PCR扩增片断，将片段连入Simple-Tvecter中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选获得阳性单克隆，挑选阳性克隆，繁殖菌液，送样测序；
（3）T-DNA制备：与NCBI网站上公布的vgb序列的编码区做比较，挑选没有碱基差异的阳性单克隆菌液，抽取质粒DNA，用Xbal和SacⅠ进行双酶切后回收酶切片段得到T-DNA；
（4）Vector制备：繁殖菌液：包含NPTⅡ表达元件、Bar表达元件的大肠杆菌菌液，抽取质粒DNA，用Xbal和SacⅠ进行双酶切后回收酶切片段得到Vector；
（5）表达载体制备：连接步骤（3）得到的T-DNA和步骤（4）得到的Vector，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆，繁殖菌液，抽取质粒DNA；
（6）农杆菌菌液制备：将步骤（5）得到的质粒DNA转化农杆菌LBA4404感受态细胞，挑取单克隆，繁殖菌液，即得到后续工作中所需要的包含NPTⅡ表达元件、Bar表达元件和vgb的农杆菌菌液；
B、抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜恢复系的获得：
通过农杆菌介导法将vgb转化到R2或R6中得到T0代植株；室内分子标：vhb5'/vhb3':5'GCAATCACGCCATAAGCCT3'鉴定或田间草胺磷鉴定得到阳性单株，自交得到T1代；室内功能鉴定后得到T1代单株，自交得到T2代；室内分子标记鉴定或田间草胺磷鉴定获得vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜恢复系；
C、抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜保持系的获得：
在农杆菌介导法转化效率足够及人手充足的情况下采用途径（a），或在途径（a）无法实施的情况下采用途径（b）：
（a）通过农杆菌介导法将vgb转化到甘蓝型油菜6098B或8908B得到T0代植株；室内分子标记鉴定或田间草胺磷鉴定得到阳性单株，自交得到T1代；室内功能鉴定后得到T1代单株，自交得到T2代；室内分子标记鉴定或田间草胺磷鉴定获得vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜保持系；
（b）以步骤B中得到T1代恢复系单株为父本与6098B或8908B杂交得到F1代，再以6098B或8908B为轮回亲本，回交至BC3代时得到保持系遗传背景的甘蓝型油菜，田间草胺磷筛选、考察中选单株表型、室内分析中选单株遗传背景后选出单株自交并与6098A或8908A杂交，观察后代育性分离情况，结合室内品质分析结果选出vgb位点杂合的优良T1代保持系单株；对自交得到的T2代保持系株系进行室内分子标记鉴定或田间抗草胺磷鉴定得到vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜保持系；
D、抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜不育系的获得：
将步骤C中得到的vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜保持系与6098A或8908A杂交得到vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜不育系。
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1386407A (zh) * | 2002-06-21 | 2002-12-25 | 武汉大学 | 透明颤菌血红蛋白基因在植物耐涝中的应用 |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1386407A (zh) * | 2002-06-21 | 2002-12-25 | 武汉大学 | 透明颤菌血红蛋白基因在植物耐涝中的应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
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| Improvement of the hydroponic growth and waterlogging tolerance of petunias by the introduction of vhb gene;Mao ZC等;《ACTA BOTANICA SINICA》;200302;第45卷(第2期);205-210 * |
| Mao ZC等.Improvement of the hydroponic growth and waterlogging tolerance of petunias by the introduction of vhb gene.《ACTA BOTANICA SINICA》.2003,第45卷(第2期),205-210. |
| 蓝细菌血红蛋白基因的克隆及其向甘蓝型油菜中的转化;谭小力等;《作物学报》;20090112;第35卷(第01期);66-70 * |
| 谭小力等.蓝细菌血红蛋白基因的克隆及其向甘蓝型油菜中的转化.《作物学报》.2009,第35卷(第01期),66-70. |
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| Publication number | Publication date |
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| CN102676576A (zh) | 2012-09-19 |
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