CN106868038A - 棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法。采用转基因方法获得细胞质雄性不育种质，继而与同源或异源保持系进行核置换回交，选育出质核同源和异源的雄性不育系。按照本发明方法选育的细胞质雄性不育系所用的外源基因为非全长Hcpdil5‑2a，来源于锦葵科木槿属植物红麻。由此选育的细胞质雄性不育系是由转基因雄性不育种质与非转基因的同源或异源保持系(或品种/系)进行核置换回交而成，因而其细胞核为非转基因，不含转基因质粒载体，与非转基因植物无异，不存在安全风险和市场风险；同时也极大地丰富了棉花雄性不育细胞质的遗传多样性，具有极为广阔的应用前景。

Description

棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法
技术领域
本发明涉及生物技术和植物育种技术领域，具体地说，涉及一种棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法。
背景技术
棉花，锦葵科棉属，是世界上最主要的农作物之一。它既是最重要的纤维作物，又是重要的油料作物，也是含高蛋白的粮食作物，还是纺织、精细化工原料和重要的战略物资。棉花表现出强大的杂种优势，其杂种优势率高达20％-30％。长期以来，棉花杂种优势利用是国内外棉花育种的重要内容。
棉花既可利用细胞核雄性不育系、也可利用细胞质雄性不育系生产杂交种子。虽然细胞核雄性不育系的利用易于找到恢复系和组配出强优势杂交组合，但不育系的繁殖存在问题，一般利用细胞核雄性不育两用系中分离出的雄性不育株(基因型为msms)与育性基因杂合的可育姊妹株(基因型为Msms)杂交的方法保持，从不育株上收的种子繁殖后代仍然表现不育株与可育株的1：1分离，因此，杂交制种田必须每年拔除母本区50％左右的雄性可育株，工作量集中，劳动强度大；且因群体中可育株与不育株分布的不均匀性，往往存在连续拔除多株可育株的问题，既浪费了土地空间，又增加了种子生产成本。
为解决此问题，四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所和四川诺亚生物科技有限公司，根据棉花在热带地区的多年生特性，于2007年申请了1项国家发明专利，发明名称为“利用棉花雄性不育系和恢复系进行宿根再生的杂交制种方法”(申请号：200710049843.0)。该发明公开了棉花植株能够越冬的制种区是冬季最低温度≥10℃，年日照时数1700-2100小时，日照百分率为50-60％，全年降雨量为800-1200mm的地区。从温度条件看，应属于中热带地区(盛承禹等编著.中国气候总论.科学出版社，1986，第406页)，但热带有旱季和雨季之分，雨季多台风，不利于棉花的杂交制种，所以，又要求其降雨量小于1200mm。因此，满足上述所有条件的地区是很少的，可能只有云南或云南与四川交界的部分地区具有这种小气候特征，而这些地区，大多比较偏远，交通不便，不利于棉花的规模化杂交制种。而且，该发明还没有解决不育系的繁殖问题，只是利用了不育系在热带地区可多年生长的特性。但由于一年生棉花根系入土浅，易早衰，就是在最适合生长的温度条件下一般也只能宿根栽培2-3年，又需要重新播种。
为解决棉花的宿生栽培问题，广西大学周瑞阳课题组研发了“一年生棉花的多年生杂交制种方法”(ZL200910078533.0)。其首先鉴定一年生棉花杂交亲本的自然越冬能力；对于不能自然越冬的一年生棉花杂交亲本，以棉属中能够自然越冬的多年生棉花种质资源为砧木进行嫁接，并宿根栽培所得嫁接植株；对于能够自然越冬的一年生棉花杂交亲本，直接种植并宿根栽培其实生植株，或以上述方法嫁接后宿根栽培；然后利用上述实生植株和/或嫁接植株进行杂交制种。本发明的杂交制种方法不需每年播种，不需每年耕整土地，不需每年去杂去劣，降低了雄性不育系的繁殖成本，简化了杂交种子生产程序，并可提高杂交制种的产量。但该发明存在嫁接大量用工的问题，且只能在华南南部实现多年生栽培，存在地域限制。
利用细胞质雄性不育系与保持系回交的方法虽能保持雄性不育特性，但前人选育细胞质雄性不育系多数具哈克尼西棉细胞质，其恢复系较少，且恢复系和杂交种对高温敏感，在夏季的高温条件下，恢复系和杂交种散粉困难，表现为半不育现象，难以在生产上大面积推广应用。
因此，尽管人工去雄存在投入大、成本高等问题，但由于没有更好的棉花杂交种子生产方法，几年前仍以人工去雄杂交制种为主，为降低种子生产成本，一般利用F2代。但由于劳动力成本的不断上升，棉花杂交种子生产企业已不堪重负，生产上已基本没有棉花杂交种推广应用。
在农业生产中，由单一细胞质雄性不育系组配的杂交种在生产中的大面积推广和长期利用可能成为某一病害生理小种的哺育品种，从而存在某一病害大流行的风险。解决这一问题的基本途径是获得多种细胞质来源的雄性不育系，而不同细胞质来源的雄性不育系的选育源于细胞质雄性不育种质的遗传多样性。但迄今为止，植物细胞质雄性不育种质一般源于自然突变或采用远缘杂交的方法获得，而自然突变几率很低，远缘杂交又难以成功，因此，许多作物因雄性不育种质的缺乏至今尚未选育出细胞质雄性不育系。若能采用转雄性不育相关基因的方法创造细胞质雄性不育种质将具有极重要的科学意义和广阔的利用前景。
发明内容
本发明的目的是针对现有棉花细胞质雄性不育种质创新方法的缺陷，提供一种棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法。
本发明人长期致力于植物雄性不育种质创新及其分子基础的研究工作。2008年，由周瑞阳教授指导的博士研究生李刚采用同重标签相对定量与绝对定量(简称iTRAQ)技术分析了红麻雄性不育系和保持系花药线粒体蛋白质组差异，发现了一个差异表达的PDIL(protein disulfide isomerase-like，类蛋白质二硫键异构酶，缩写为“PDIL”)蛋白。该蛋白质部分氨基酸残基的同源序列比对结果表明，其与AtPDIL5-2、OsPDIL5-2和OsPDIL5-3直系同源。2010年，由周瑞阳教授指导的另一位博士研究生金刚在此基础上，根据GenBank中公布的OsPDIL5-2、OsPDIL5-3、AtPDIL5-2及其他同源基因的cDNA序列，基于同源克隆和RACE技术，克隆了两个红麻PDIL同源基因，并通过全长cDNA的扩增加以验证。两个基因分别命名为Hcpdil5-2a和Hcpdil5-2b，在NCBI基因数据库中的登录号分别为HQ638208和HQ898859。同时，这两个基因在不育系开花期的不同组织器官的表达量存在差异，其中Hcpdil5-2a在各组织的表达均受到不育胞质的影响，而其Hcpdil5-2b的表达仅在营养器官中受到不育胞质的影响。说明Hcpdil-2a可能与雄性不育有关。然而，与雄性不育相关基因的发现，与细胞质雄性不育系的创制是两个截然不同的问题。
经过多年研究，本发明人采用花粉管通道法转红麻非全长Hcpdil5-2a基因，成功创造出了棉花细胞质雄性不育种质，继而转育成棉花细胞质雄性不育系。
为了实现本发明目的，本发明首先提供红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列在创制植物细胞质雄性不育系中的应用。其中，所述红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列为：
i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或
iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
本发明还提供一种基因表达盒，其包含红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列。
本发明还提供含有上述表达盒的载体。
本发明还提供含有上述表达盒或携带有该表达盒的载体的工程菌、宿主细胞及转基因细胞系。
本发明进一步提供一种棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法，包括以下步骤：
S1、重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的构建
将从红麻中克隆获得的Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列插入到PBI121-GFP载体的Xba I和Kpn I酶切位点之间，即构建得到重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP(图1)。
S2、转基因棉花植株的构建
采用花粉管通道法将重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP导入棉花植株中，收获转基因棉花植株的T0代种子。
S3、转基因棉花细胞质雄性不育种质资源的获得
播种上述T0代种子获得T1代植株，于开花期调查T1代植株育性，选择雄性不育株。如花药不能开裂即为雄性不育株，计算雄性不育株与总植株数的比率。
对于没有发现雄性不育株的群体，采用“一粒传”混合选择法于每株收获1～2个自交果实即为T1代种子；播种T1代单株种子获得T2代株系，调查每个株系的育性，选择雄性不育株。
将上述选出的雄性不育株作为棉花细胞质雄性不育种质资源。
S4、棉花转基因细胞质雄性不育系的选育
(1)转基因质核同源细胞质雄性不育系的选育方法之一：以上述转基因雄性不育种质资源为母本，以其野生型非转基因品种或品系回交，成熟期收获T1代种子，然后播种，观察T2代植株育性，如果仍表现为雄性不育，表明其为细胞质遗传的雄性不育，继续与原回交亲本进行核置换饱和回交所得的雄性不育系，即为质核同源细胞质雄性不育系，其野生型非转基因品种或品系即为该不育系的保持系；
(2)转基因质核同源细胞质雄性不育系的选育方法之二：以转基因质核异源细胞质雄性不育系选育过程中任一世代的雄性不育株为母本，与不育株原始来源相同的野生型非转基因品种或品系杂交，并与该亲本进行核置换回交，由此选育出的雄性不育系，也属于质核同源细胞质雄性不育系，其轮回亲本即为该不育系的保持系；
(3)转基因质核异源细胞质雄性不育系的选育：以上述转基因雄性不育种质或转基因质核同源细胞质雄性不育系选育过程中任一世代的雄性不育株为母本，与其异源保持系或常规品种或品系杂交，并与回交亲本进行核置换回交，由此选育出的雄性不育系，即为质核异源细胞质雄性不育系，其轮回亲本即为该不育系的保持系。
本发明中，所述异源保持系是指与转基因材料没有亲缘关系的雄性不育保持系或常规品种(系)。
本发明中，同源保持系是指与转基因材料为同一来源的非转基因野生型保持系或品种(系)。
前述的方法，步骤S2具体如下：
S21、选株：选取生长健壮、无病虫害的栽培品种棉花植株，将次日要开放的花蕾，用夹子将花蕾顶部夹住或使用线绳将花蕾顶部扎紧使其不能正常开放，以防外来花粉污染；
S22、微量注射重组表达载体：开花次日早上5-6点，花粉管通道已经形成，去掉夹子或线绳，使花瓣张开，拔掉柱头，同时用消毒的微量进样器吸取PBI121-Hcpdil5-2a-GFP质粒溶液，注入子房中；
S23、收获：待上述注入PBI121-Hcpdil5-2a-GFP质粒的棉花植株果实成熟后，收集的种子即为T0代种子。
前述的方法，步骤S4中在回交过程中，于每个世代选择性状与父本相似，且花药不开裂的雄性不育株继续回交，同时父本套袋自交。
在本发明中，所述核置换回交或核置换饱和回交的回交世代数不低于5～6代。
本发明所述所述栽培品种包括但不限于海岛棉DP353。所述异源保持系选自以下棉花品种：吉扎75、吉扎77、巴2365、鲁什涅、海新86225、DP744、海辐6号、陆地棉品种(系)等。
本发明中采用转基因方法获得细胞质雄性不育种质，继而与异源保持系进行核置换回交，选育出质核异源雄性不育系；在此基础上又与同源保持系进行核置换回交，或直接与同源保持系进行核置换回交，选育出质核同源细胞质雄性不育系。
本发明以栽培品种为转基因供体，由此选育的雄性不育系为栽培品种细胞质雄性不育系。由于栽培种的进化程度高于野生种，有利基因多，因此，以栽培品种细胞质雄性不育系有利于组配出制强优势组合；同时，也避免了农业生产上由于单一细胞质杂交种的大面积推广和长期利用可能可能导致的某一病害大流行的潜在风险。按照本发明方法选育的细胞质雄性不育系所用的外源基因为非全长Hcpdil5-2a，来源于锦葵科木槿属植物红麻。由此选育的细胞质雄性不育系是由转基因雄性不育种质与非转基因的同源或异源保持系(或品种/系)进行核置换回交而成，因而其细胞核为非转基因，不含转基因质粒载体，与非转基因植物无异，不存在安全风险和市场风险，具有极为广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的构建流程示意图。
图2为本发明实施例6中棉花转非全长Hcpdil5-2a基因创制细胞质雄性不育系的技术路线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列的获得
红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列为963bp(构建载体去掉终止密码子后长度为960bp)，为全长序列的一部分。红麻Hcpdil5-2a基因CDS全长序列为1521bp，两者相差558bp。具体序列见SEQ ID NO:1。
Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列的扩增方法如下：
提取红麻发育花药中总RNA，然后反转录获得cDNA第一链；然后根据cDNA序列设计带有酶切位点Xba I、Kpn I特异引物对Hcpdil5-2a-TY，通过RT-PCR方法扩增红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列。
所述特异引物对为Hcpdil5-2a-TY：
正向引物5’-TCTAGAATGTTGCTGTTCTCGATCTTGA-3’
反向引物5’-GGTACCTCAATCTTCTTTCTTCTCAGGTCTA-3’
PCR反应体系如下：
反应体系用双蒸水补足至总体积20μl。
其中，PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30s，51.7℃30s，72℃1min30s，30个循环；72℃终延伸10min。
利用天根凝胶回收试剂盒回收上述片段后，将其连入PMD-19T(simple)载体(购自宝生物工程有限公司)中，构建成测序中间载体，称为非全长pHcpdil5-2a，然后用该载体进行基因扩增和酶切验证，最后进行序列测定，验证克隆序列的正确性。
实施例2 重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的构建
本实施例中，重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP由红麻非全长基因Hcpdil5-2a的开放阅读框序列与植物表达载体PBI121构成。
具体方法如下：将上述获得的含有非全长Hcpdil5-2a编码区cDNA的pHcpdil5-2a中间测序载体经过Xba I和Kpn I双酶切后获得带有酶切粘性末端的Hcpdil5-2a基因CDS序列片段。PBI121-GFP载体也用同样的Xba I和Kpn I双酶切，回收带有CaMV35S启动子的载体片段。将Hcpdil5-2a基因CDS序列片段与载体片段用连接酶连接，得到以CaMV35S启动子驱动的红麻非全长Hcpdil5-2a的植物超量表达载体，称为PBI121-Hcpdil5-2a-GFP。超量表达载体的构建流程见图1。
实施例3 重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的导入
采用花粉管通道法进行，具体步骤如下：
(1)选株：选取生长健壮、无病虫害的棉花植株，将次日要开放的花蕾，用嫁接用塑料夹子将花蕾顶部夹住或使用棉线等将花蕾顶部扎紧使其不能正常开放，以防外来花粉污染。
(2)微量注射重组表达载体：开花次日早上5-6点，花粉管通道已经形成，可去掉塑料夹子或棉线等捆扎物，使花瓣张开，拔掉柱头，同时用经过严格消毒处理过的微量进样器吸取PBI121-Hcpdil5-2a-GFP植物表达载体质粒10μl(0.01μg/μl)，将针头沿着花粉管插入至子房中，并将质粒注入子房中即完成超表达载体的微量注射。
(3)收获：待上述注射PBI121-Hcpdil5-2a-GFP植物表达载体质粒的果实自然成熟后，单株上的同类种子合并编号，即获得T0代种子。
实施例4 转基因棉花细胞质雄性不育种质资源的获得
播种上述T0代即获得T1代植株，于开花期调查T1代植株育性，如花药不能开裂即为雄性不育株，计算雄性不育株与总植株数的比率；对于没有发现雄性不育株的群体，采用“一粒传”混合选择法于每株收获1～2个自交果实即为T1代种子；播种T1代单株种子获得T2代株系，调查每个株系的育性，选择雄性不育株。由此可获得棉花细胞质雄性不育种质资源。
实施例5 棉花转基因细胞质雄性不育系的选育
以实施例4中获得的细胞质雄性不育种质资源为材料，可选育出质核异源和质核同源雄性不育系：
(1)转基因质核同源细胞质雄性不育系的选育方法之一：以上述转基因雄性不育种质资源为母本，以其野生型非转基因品种/系回交，成熟期收获T1代种子，然后播种，观察T2代植株育性，如果仍表现为雄性不育，表明其为细胞质遗传的雄性不育，继续与原回交亲本进行核置换饱和回交所得的雄性不育系，即为质核同源细胞质雄性不育系，其野生型非转基因品种/系即为该不育系的保持系。
(2)转基因质核同源细胞质雄性不育系的选育方法之二：以转基因质核异源细胞质雄性不育系选育过程中任一世代的雄性不育株为母本，与不育株原始来源相同的野生型非转基因品种/系杂交，并与该亲本进行核置换回交，由此选育出的雄性不育系，也属于质核同源细胞质雄性不育系，其轮回亲本即为该不育系的保持系。
(3)转基因质核异源细胞质雄性不育系的选育：以上述转基因雄性不育种质或转基因质核同源细胞质雄性不育系选育过程中任一世代的雄性不育株为母本，与其异源保持系或常规品种(系)杂交，并与回交亲本进行核置换回交，由此选育出的雄性不育系，即为质核异源细胞质雄性不育系，其轮回亲本即为该不育系的保持系。
其中，所述异源保持系是指与转基因材料没有亲缘关系的雄性不育保持系或常规品种(系)。
在回交的同时，与多个恢复系测定配合力，每个世代选择配合力高、性状与父本相似，且花药不开裂的雄性不育株继续回交，同时父本套袋自交。所述核置换回交的回交世代数不低于5-6代。
实施例6 棉花转基因细胞质雄性不育系选育方法的具体应用
2010年10月，以棉花海岛棉品种DP353(引自中国农科院棉花所，编号为NH11-276)为材料，按照本发明的方法，于开花期用微量注射器将事先配制好的将携带有Hcpdil5-2a基因CDS序列片段的重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP注入供试材料子房中。2011年7月，在南宁的T1代群体中未发现雄性不育株，将自然交种子采用“一粒传”混合法收获种子；2012年4月种于广西大学农学院试验田，2012年7月，在南宁种植的自交T2代植株中发现2株雄性不育株，其中一株生命力较弱死亡，另一株生命力旺盛，命名为276s。遂以276s为母本与非转基因的DP353回交，形成276s/DP353BC1代种子。此后，继续以非转基因DP353为轮回亲本，进行核置换回交，于2015年已回交6代，选育出质核同源雄性不育系H276A。因其细胞质和细胞核均来源于同一品种DP353，故为质核同源雄性不育系。其轮回亲本DP353为其同源保持系H276B。
在进行上述质核同源雄性不育系选育的同时，以276s为细胞质供体，以DP353以外的海岛棉品种吉扎75、吉扎77、巴2365、鲁什涅、海新86225、DP744、海辐6号(均引自中国农业科学院棉花研究所)等为细胞核供体(轮回亲本)，进行核置换回交，于2016年选育出吉扎75A、吉扎77A、巴2365A、鲁什涅A、海新86225A、DP744A、海辐6号A等细胞质雄性不育系，其相应的轮回亲本即为该不育系的保持系。因其细胞质源于DP353的转基因雄性不育株276S，其细胞核源于DP353以外的海岛棉品种，故由此选育的细胞质雄性不育系属于海岛棉质核异源雄性不育系。
在进行上述海岛棉质核异源雄性不育系选育的同时，以‘金刚王’(购自湖北省种子公司)、‘中植棉2号’、‘中植棉5号’、‘中植棉8号’(‘中植棉’系列品种均引自中国农业科学院植物保护研究所)、‘农大棉7号新系’(引自河北农业大学)等10多个陆地棉品种/系为细胞核供体(轮回亲本)，进行核置换回交，于2016年选育出了C2P1A(以下凡是以276S为细胞质供体的不育系命名为“C2”,其细胞核供体为‘金刚王’，因品种编号为P1，故命名为C2P1A)、C2P2A(C2细胞质，植保所2号细胞核)、C2P5A(C2细胞质，植保所5号细胞核)、C2P7A(C2细胞质，‘农大棉7号新系’细胞核)、C2P8A(C2细胞质，植保所8号细胞核)等10多个陆地棉质核异源(海岛棉276S细胞质、陆地棉细胞核)雄性不育系，其相应的轮回亲本为其对应的保持系。
在选育上述转基因雄性不育系的回交过程中，于每个回交世代选择性状与父本相似，且花药不开裂的雄性不育株继续回交，同时父本套袋自交。
棉花转非全长Hcpdil5-2a基因创制细胞质雄性不育系的技术路线如图2所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 广西大学
<120> 棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法
<130> KHP161119329.4
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 963
<212> DNA
<213> 红麻
<400> 1
atgcatggag tttctatgga gtattctgga cctaggaaag cagacttact tgttcaatat 60
ctgaagaaat tcgttgctcc tgatgtgtct attcttagtt cagactctgc catcaatgat 120
tttgttgaag cagccgggac tttctttcct atatacatag gttttggctt gaatgagaca 180
gtggtatcta atttagctgt taagtacaag aaaaaggcat ggttttctgt ggcaaaggat 240
ttctcagatg atgccatggt gttgtatgac tttgacaaag ttccttcttt ggtagcactt 300
catccgagtt ataagcagca aagtgttttc tatggccctt ttgaagatac atttttgggt 360
gattttataa aacaaaattt gctccctttg gtggtgccct tgaaccatga tacactgaag 420
ctattgaaag atgaggacag gaaaattgtt ctgacaatca tagctgatga gaatgaagac 480
caatcacaga acttgatcaa gttattgaga gctgctgctt ctgcaaaccg tgatttggta 540
tttagttatg ttggagttaa gcaatgggaa gactttgctg ataaatttga ggccaacgag 600
aagtcaaagt tgccaaaaat gattgtctgg aatggagatg tggagtactt atcggttgtt 660
ggcgttgaaa gccttgataa tgaagatcag gggtctcaga tctcacgttt cctcgaagga 720
tatagagaag gaagaacaga aagaaaaaca gttaaagggc catcatttat ggacttcatc 780
cattcactaa tcggtatcag aagtgtctac ataattgtct ttattgttgc aataatgatg 840
cttatacaaa gcattgggaa agaagacgaa tctgtcaggg atggcagtcg tggtgcagtt 900
gatggtgccg agagcttcgg ggctgaaagc agtcggtata gacctgagaa gaaagaagat 960
tga 963

Claims (10)

1.红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列在创制植物细胞质雄性不育系中的应用，其中，所述红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列为：
i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或
iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
2.一种基因表达盒，其特征在于，包含红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列。
3.含有权利要求2所述表达盒的载体。
4.含有权利要求2所述表达盒或权利要求3所述载体的工程菌。
5.棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的构建
将从红麻中克隆获得的Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列插入到PBI121-GFP载体的XbaI和Kpn I酶切位点之间，即构建得到重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP；
S2、转基因棉花植株的构建
采用花粉管通道法将重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP导入棉花植株中，收获转基因棉花植株的T0代种子；
S3、转基因棉花细胞质雄性不育种质资源的获得
播种上述T0代种子获得T1代植株，于开花期调查T1代植株育性，选择雄性不育株；
对于没有发现雄性不育株的群体，采用“一粒传”混合选择法于每株收获1～2个自交果实即为T1代种子；播种T1代单株种子获得T2代株系，选择雄性不育株；
将上述选出的雄性不育株作为棉花细胞质雄性不育种质资源；
S4、棉花转基因细胞质雄性不育系的选育
(1)转基因质核同源细胞质雄性不育系的选育方法之一：以上述转基因雄性不育种质资源为母本，以其野生型非转基因品种或品系回交，成熟期收获T1代种子，然后播种，观察T2代植株育性，如果仍表现为雄性不育，表明其为细胞质遗传的雄性不育，继续与原回交亲本进行核置换饱和回交所得的雄性不育系，即为质核同源细胞质雄性不育系，其野生型非转基因品种或品系即为该不育系的保持系；
(2)转基因质核同源细胞质雄性不育系的选育方法之二：以转基因质核异源细胞质雄性不育系选育过程中任一世代的雄性不育株为母本，与不育株原始来源相同的野生型非转基因品种或品系杂交，并与该亲本进行核置换回交，由此选育出的雄性不育系，也属于质核同源细胞质雄性不育系，其轮回亲本即为该不育系的保持系；
(3)转基因质核异源细胞质雄性不育系的选育：以上述转基因雄性不育种质或转基因质核同源细胞质雄性不育系选育过程中任一世代的雄性不育株为母本，与其异源保持系或常规品种或品系杂交，并与回交亲本进行核置换回交，由此选育出的雄性不育系，即为质核异源细胞质雄性不育系，其轮回亲本即为该不育系的保持系；
其中，所述异源保持系是指与转基因材料没有亲缘关系的雄性不育保持系或常规品种或品系。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2具体如下：
S21、选株：选取生长健壮、无病虫害的栽培品种棉花植株，将次日要开放的花蕾，用夹子将花蕾顶部夹住或使用线绳将花蕾顶部扎紧使其不能正常开放，以防外来花粉污染；
S22、微量注射重组表达载体：开花次日早上5-6点，花粉管通道已经形成，去掉夹子或线绳，使花瓣张开，拔掉柱头，同时用消毒的微量进样器吸取PBI121-Hcpdil5-2a-GFP质粒溶液，注入子房中；
S23、收获：待上述注入PBI121-Hcpdil5-2a-GFP质粒的棉花植株果实成熟后，收集的种子即为T0代种子。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S4在回交过程中，于每个世代选择性状与父本相似，且花药不开裂的雄性不育株继续回交，同时父本套袋自交。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述核置换回交或核置换饱和回交的回交世代数不低于5～6代。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，S21中所述栽培品种包括海岛棉DP353。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤S4中所述异源保持系选自以下棉花品种：吉扎75、吉扎77、巴2365、鲁什涅、海新86225、DP744、海辐6号、陆地棉品种或品系。
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