CN103704124A - 非洲栽培稻细胞质雄性不育系的选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种非洲栽培稻细胞质雄性不育系的选育方法，其步骤：首先以非洲栽培稻为母本与普通栽培稻籼稻品种进行远缘杂交，获得种间杂交F1种子；再以种间F1植株为母本与选定的籼稻品种（轮回亲本）进行回交；此后通过连续多代性状选择和核置换回交，获得了遗传稳定的非洲栽培稻细胞质雄性不育系，轮回亲本即为其保持系；通过远缘杂交选育和测交筛选获得强恢复系，实现籼型非洲栽培稻细胞质雄性不育系、保持系和恢复系三系配套。本发明选育的非洲栽培稻细胞质不育系花粉败育彻底、雄性不育性稳定、可恢复性好，适用于三系杂交水稻的种子生产，有利于进一步扩大三系杂交水稻的细胞质遗传多样性，从而避免专化性病害爆发的潜在风险。

Description

非洲栽培稻细胞质雄性不育系的选育方法

技术领域

本发明属于杂交水稻遗传育种领域，更具体涉及一种非洲栽培稻细胞质雄性不育系的选育方法，通过两个栽培稻种间远缘杂交和核置换回交获得新细胞质雄性不育系。

背景技术

细胞质雄性不育被广泛应用于商业化作物杂交种子生产。然而，在生产上长期大面积应用相同细胞质的杂交种有可能导致病害的爆发，例如1970年美国大面积推广T型细胞质雄性不育系配制的杂交玉米，由于玉蜀黍平脐蠕孢菌（Helminthosporium maydis）T小种的专化性侵染而造成玉米小斑病大流行。因此各种主要农作物细胞质雄性不育系的细胞质来源多样化研究一直受到广泛重视。中国籼型三系杂交稻大面积利用野败型不育细胞质历史长达30余年，近年在生产上虽逐渐增加了新资源细胞质雄性不育系的应用，但籼型三系杂交稻中野败型杂交稻的面积仍最大。长期大面积种植同一类型细胞质的杂交稻存在巨大的潜在风险，因此研究利用新遗传类型的细胞质雄性不育一直受到广泛重视。

目前生产上利用的水稻细胞质雄性不育系统的细胞质来源包括两个物种，即普通野生稻（Oryza rufipogon）和普通栽培稻（Oryza sativa）。前者如野败型、矮败型、红莲型等，是以普通野生稻为母本与普通栽培稻品种杂交和核置换回交育成的不育系，例如以野生稻雄性不育株为母本，早籼品种珍汕97为父本，进行杂交和核置换回交育成的珍汕97A等野败型不育系，其不育细胞质来源于普通野生稻；后者如冈型、D型、印尼水田谷型、K型、BT型等，是以普通栽培稻籼稻或粳稻为母本与籼稻或粳稻父本进行杂交和核置换回交育成不育系，例如以原产西非的普通栽培稻籼型品种冈比亚卡为母本，中国矮秆籼稻为父本，经过杂交、复交和核置换回交育成冈型朝阳1号A等冈型不育系，其不育细胞质来源于普通栽培稻。

普通栽培稻和非洲栽培稻（Oryza glaberrima）是水稻仅有的两个栽培种，目前全球范围（包括非洲）水稻生产主要是普通栽培稻品种，而非洲栽培稻仅在其原产地西非尚有零星种植。非洲栽培稻有许多特异的优良性状，如耐旱、与杂草竞争力强等。西非水稻研究所通过两个栽培稻的中间杂交培育出非洲新稻（NERICA），国内外还有一些利用非洲栽培稻进行水稻性状遗传改良的研究，如试图将非洲栽培稻的长柱头、抗病性和杂草竞争力等性状的基因导入普通栽培稻。迄今尚无育成遗传稳定的非洲栽培稻细胞质雄性不育系的报道。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种非洲栽培稻细胞质雄性不育系的选育方法，增加三系杂交水稻的雄性不育细胞质来源的多样性，使细胞质来源由两个物种增加到三个物种，有利于进一步扩大三系杂交水稻的细胞质遗传多样性，避免大规模种植单一细胞质的杂交种爆发专化性侵染病害的潜在风险。非洲稻细胞质雄性不育系的选育方法与一般细胞质雄性不育系选育的主要不同之处在于，该方法需要利用非洲栽培稻种质资源为细胞质供体，需要克服种间远缘杂交的生殖障碍，同时由于两个物种之间存在核基因控制的不亲和性，低世代（B₅F₁代以前）的不育株系测交难于找到恢复系。本发明选育的非洲栽培稻细胞质不育系的花粉败育彻底、雄性不育性稳定、开花习性好、可恢复性好，适用于三系杂交水稻的种子生产。

本发明通过以下技术方案得以实现：

本发明的技术方法以非洲栽培稻为细胞质供体，通过两个栽培稻种之间的种间杂交和核置换回交育成具有非洲栽培稻细胞质的籼型雄性不育系，如非金A和非中A等，使水稻细胞质雄性不育系及三系杂交稻的不育细胞质来源由原有的两个物种增加到三个物种，进一步丰富了细胞质遗传多样性，有利于避免专化性侵染病害爆发的潜在风险。

非洲栽培稻细胞质雄性不育系的选育方法，首先以热带地区（纬度18°32′11″N以南，年平均温度25℃左右）短日照季节抽穗的非洲栽培稻为母本人工去雄，以同期抽穗的籼稻品种为父本饱和授粉，获得发育不完全的杂交种子；继后在热带地区短日照季节种植感光性强的种间F₁代植株保障正常抽穗，再以雄性不育的种间F₁为母本，选择籼稻品种为父本（轮回亲本）进行回交，此后在温带地区（纬度30°28′17″N左右，年平均温度16℃左右）和热带地区穿梭育种，经连续多代单株选择和核置换回交至B₈F₁代以上，获得遗传稳定的非洲栽培稻细胞质雄性不育系。

一种非洲栽培稻细胞质雄性不育系的选育方法，其步骤如下：

（1）通过大量人工饱和授粉杂交克服非洲栽培稻与普通栽培稻种间远缘杂交的高度不孕性，获得种间F₁代种子：在热带地区（纬度18°32′11″N以南，年平均温度25℃左右）的冬-春季种植非洲栽培稻和普通栽培稻籼稻品种等各类亲本材料，以热带地区春季短日照条件下抽穗的非洲栽培稻为母本，温汤去雄（水温45℃，处理时间5min），以同期抽穗的籼稻品种为父本饱和授粉，杂交配组1000对以上，每组合5个杂交袋，每袋2-3穗。约1.8%以上的组合可获得F₁代种子（不同组合种子数1-40粒，其中90%以上为发育不完全的皱缩干瘪种子，少数种子较为饱满充实）；

（2）在温带地区（纬度30°28′17″N左右，年平均温度16℃左右）初夏播种上季收获的种间F₁代种子，约45%以上组合的种子可发芽成苗，种间杂种F₁植株生长旺盛，但在温带地区夏秋相对较长日照的生长季节均不能抽穗；

（3）将种间杂种F₁稻蔸移栽到热带地区，再生的种间杂种F₁植株在热带地区春季短日照条件下抽穗，所有植株均为雄性不育，以这些不育的种间F₁植株为母本与选定的籼稻品种进行回交，获得回交一代（B₁F₁）种子；

（4）在温带地区种植B₁F₁代，植株出现性状和育性分离，选择在安全齐穗期前正常抽穗、综合性状较好的不育株为母本，与轮回亲本回交，获得回交二代（B₂F₁）种子；

（5）继后，分别在热带地区和温带地区种植B₂F₁及以后的回交世代，在各代均选择综合性状趋近轮回亲本的完全不育株为母本，轮回亲本自交后代株系中的单株为父本，进行成对回交；

（6）通过在热带地区和温带地区穿梭育种，经连续多代单株选择和核置换回交至B₈F₁代以上，最终育成群体遗传性状稳定的非洲栽培稻细胞质雄性不育系。

（7）通过种间远缘杂交选育和测交筛选获得强恢复系，实现籼型非洲栽培稻细胞质雄性不育系、保持系和恢复系的三系配套。

结合田间试验和分子标记技术（AFLP、SSR）的应用，研究非洲栽培稻细胞质雄性不育及其育性恢复的遗传特异性。

所述的方法和步骤选育的细胞质雄性不育系为非洲栽培稻细胞质雄性不育系，其花粉败育彻底、雄性不育性稳定、开花习性好、可恢复性好，适用于三系杂交水稻的种子生产；其不同于其他类型细胞质雄性不育系的遗传特征是具有非洲栽培稻的细胞质，可用AFLP分子标记检测鉴定。

本发明的优点：

（1）非洲栽培稻细胞质雄性不育系进一步丰富了三系杂交水稻不育系的细胞质来源，推广应用非洲栽培稻细胞质雄性不育系组配的杂交稻品种，有利于避免三系杂交水稻细胞质来源单一化的潜在风险；

（2）非洲栽培稻细胞质雄性不育系的败育花粉为典败类型，花粉败育时期早，雄性不育性稳定（1000株以上群体不育株率100%，自交结实率为0）；有利于保障杂交稻制种的种子纯度；

（3）非洲栽培稻细胞质源雄性不育系与其他同核异质不育系相比，柱头外露率较高（高达84.2%），抽穗包颈度较轻（低至1.83%），开花习性较好，有利于提高杂交稻制种的种子产量；

（4）非洲栽培稻细胞质雄性不育系与野败型等孢子体雄性不育系的恢保关系一致，可共享恢复系，有利于选配强优势杂交组合，也便于其在杂交水稻种子生产中的应用。

附图说明

图1为一种AFLP分析获得的非洲栽培稻细胞质雄性不育系特异引物示意图。

图2为一种非洲栽培稻细胞质雄性不育恢复基因的SSR标记多态性示意图。

1-10为可育单株，11为可育池，12为父本，13为母本，14为不育池，15-24为不育单株。

具体实施方式

实施例1:

一种非洲栽培稻细胞质雄性不育系的选育方法，其步骤如下：

（1）2005年3月以在热带地区（海南陵水）短日照季节抽穗的19个非洲栽培稻作为母本，温汤去雄（水温45℃，处理时间5min），以138个籼稻品种为父本进行人工饱和授粉杂交，共完成种间杂交配组约1200对，每组合5个杂交袋，每袋2-3穗。从其中9个非洲栽培稻品系与16个籼稻品种杂交的22个组合中获得了F₁代种子（不同组合种子数1-40粒，其中90%以上为发育不完全的皱缩干瘪种子，少数种子较为饱满充实）；

（2）2005年5月在温带地区（武汉）播种22个种间杂交组合F₁代种子，其中10个组合的种子发芽成苗，种间杂种F₁植株生长旺盛，但在温带地区夏秋相对较长日照的生长季节均不能抽穗；

（3）2005年11月将10个组合的F₁稻蔸移栽到热带地区，再生F₁植株2006年春短日照条件下抽穗，均为雄性不育，以其中4个种间组合（母本分别为4个非洲栽培稻品系RAM3、RAM54、RAM131和RAM152，请见遗传资源表）F₁不育植株为母本与选定的籼稻品种进行回交，获得回交一代（B₁F₁）种子；

（4）2006年夏，在温带地区种植B₁F₁代，植株出现性状和育性分离，选择在安全齐穗期前正常抽穗、综合性状较好的不育株为母本，与轮回亲本回交，获得回交二代（B₂F₁）种子；

（5）继后，2007年至2011年，分别在热带地区和温带地区种植B₂F₁及以后世代，在各回交代均选择综合性状趋近轮回亲本的完全不育株为母本，轮回亲本自交后代株系中的单株为父本，成对回交；

（6）通过在热带地区和温带地区穿梭育种，经连续多代单株选择和核置换回交，育成群体遗传性状稳定的非洲栽培稻细胞质雄性不育系（2012年已至BC₁₂F₁代），轮回亲本即为其保持系；

（7）籼型非洲栽培稻细胞质雄性不育系花粉败育彻底、雄性不育性稳定、开花习性好、可恢复性好；通过种间远缘杂交选育和测交筛选获得强恢复系，实现不育系、保持系和恢复系的三系配套。

实施例2:

一种非洲栽培稻细胞质雄性不育系遗传特性的考察方法，其步骤如下：

1、非洲栽培稻细胞质雄性不育系的恢保关系测定：

通过恢保关系的测定，确定非洲栽培稻细胞质雄性不育系非金A和非中A的恢保关系和遗传类型。分别选用22个父本（保持系、恢复系、常规品种和非洲栽培稻基因渗入系）与野败型、印尼水田谷型、红莲型和非洲栽培稻细胞质不育系进行杂交，其恢保关系测定结果如表1所示。对获得的杂种F₁代进行育性调查，结果表明非洲栽培稻细胞质雄性不育系与属于孢子体雄性不育的野败型和印尼水田谷型不育系的恢保关系一致，而与属于配子体雄性不育的红莲型不育系的恢保关系不同。

表2非洲栽培稻细胞质雄性不育系的恢保关系鉴定.

说明：S表示不育，F表示可育，PF表示部分可育，-表示数据缺失，ILR表示非洲栽培稻基因渗入系

2、非洲栽培稻细胞质雄性不育系的AFLP分子标记分析：

（1）从非洲栽培稻细胞质雄性不育系非金A和非中A、野败型金23A和其保持系金23B，印尼水田谷型中9A和其保持系中9B，共六种材料中分别提取基因组DNA，并对基因组DNA进行AFLP分子标记分析，获得一些非洲栽培稻细胞质雄性不育系特有的标记，如表2所示。

①基因组DNA的提取：（参照张涛等（2007）的CTAB提取方法）

A.分别取0.1g供试材料的水稻嫩叶，剪碎后放入研钵中，加入50-100mL液氮研磨成粉，装入一1.5ml离心管中，加入700μL CTAB提取液和20μL β-巯基乙醇，65℃水浴45min。

B.在水浴后的离心管中加入500μL氯仿:异戊醇（24:1），充分混匀，离心机上10000rpm离心10min，取上清转移至另一1.5mL离心管。

C.加入2/3体积的异丙醇，充分混匀，-20℃或冰上放置30min，10000rpm离心3min，倒掉上清液；

D.以75%（V/V）乙醇对DNA沉淀洗涤2-3次，随后以无水乙醇脱水漂洗一次，10000rpm离心1-2min；弃上清，将离心管倒置10min使酒精滤干，然后溶于60μL TE，-20℃保存；使用时稀释至20ng/μL。

②AFLP反应：（方法参照Maheswaran et al.(1997)）

A.样品DNA双酶切反应：

EcoRI酶切：反应体系20μL中，含模板DNA400ng，内切酶EcoRI 5U，10×Bufferl 2μL,加超纯水至20μL稍离心混匀去除气泡，37℃下l-6h；MseI酶切：反应体系20μL,含EcoRI酶切液17μL,内切酶MseI 5U，10×Buffer 2μL,加超纯水至20μL稍离心混匀去除气泡，65℃下1-16h，再80℃下20min；

B.酶切后取2μL产物于1%（g/mL）琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果；

C.酶切DNA片段与接头的连接反应（20μL体系）：

酶切液10μL，EcoRI接头0.2μM 0.4μL，MseI接头1μM 2μL，T₄-DNA连接酶2U 0.4μL，10×Buffer 2μL，50%（g/mL）PEG 2μL，ddH₂O 3.2μL，稍离心混匀去除气泡，于22℃下连接过夜，再65℃下10min。接头准备：10μM EcoRI接头准备：10μL的100μM接头F+10μL的100μM接头R+80μL ddH₂O，稍离心混匀去除气泡，在PCR仪上90℃加热2min，冷却至室温（20-25℃），-20℃存放；10μM MseI接头准备：40μL的100μM接头F+40μL的100μM接头R+320μL ddH₂O，稍离心混匀去除气泡，在PCR仪上90℃加热2min，冷却至室温，-20℃存放；

D.预扩增反应(20μL体系)：

连接液2.5μL用2.5μL ddH₂O作对照，10×PCR Buffer 2μL，EcoRI预扩增引物0.75μM 1.5μL，MseI预扩增引物0.75μM 1.5μL，Mg₂ ⁺1.5mM 1.2μL，dNTP 0.2mM 0.4μL，Taq酶1U 0.2μL，去离子甲酞胺2%0.4μL，ddH₂O至20μL，稍离心混匀去除气泡。PCR仪上扩增：94℃变性3min;94℃变性30s，56℃退火60s，72℃延伸60s，共20个循环；72℃延伸10min；预扩后在1%（g/mL）琼脂糖凝胶电泳检测效果，预扩产物用0.1×TE稀释10倍后，于-20℃保存备用；

E.选择性扩增反应（20μL体系）：

稀释后预扩产物3μL，10×PCR Buffer 2μL，EcoRI选择扩增引物0.5μM 1μL，MseI选择扩增引物lμM 2μL，Mg₂ ⁺1.5mM 1.2μL，dNTP 0.2mM 0.4μL，Taq酶1U 0.2μL，ddH₂O至20μL，稍离心混匀去除气泡。在PCR仪上扩增：94℃变性3min；94℃变性30s，65℃退火30s（每个循环降低0.7℃），72℃延伸60s，共12个循环；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共23个循环；72℃延伸10min，扩增产物4℃保存备用；

③PCR反应产物检测：（操作步骤参考Sambrook J.等著《分子克隆实验指南》，北京，科学出版社，2002）

A.玻璃板清洗：将两块玻璃板洗干净，再用吸水纸擦干，用酒精仔细擦一遍。干燥后，U形板光面均匀涂上剥离硅烷400μL，方玻璃板均匀涂上800μL的0.5%（V/V）亲和硅烷液；

B.玻璃板组装：将两根压条和梳子清洗干净，将已处理好的玻璃板组装，两端压条处用夹子夹好；

C.配胶：分别加入6%（g/mL）的胶液60mL，过硫酸铵400μL，催化剂TEMED 50μL，用玻璃棒将胶混匀，立即开始灌胶；

D.胶板的制备：调整玻璃板水平，将混匀好的胶液慢慢注入两玻璃夹缝中，等胶液完全注满时，将梳子的背端缓慢插入凹槽中。待胶聚合约2个小时后，重新插入梳子，然后将胶板固定在电泳槽上，做好预电泳的准备；

E.预电泳：加入1×TBE电泳缓冲液，调节电压至1600V，电流至100mA，功率70W，恒电压下预电泳30min；

F.样品变性：向选择性扩增产物中加入1/2体积的变性上样缓冲液，稍离心混匀，95℃变性5min后，拿出置于冰浴上，防止复性；

G.点样：预电泳约30min后，暂停电泳，用移液枪清除点样孔中的杂质、气泡等，有利于样品在点样孔的沉降。用移液枪吸取5μL左右的变性样品点样，点样应迅速完成。

H.电泳：重新开始电泳，电泳仪参数与预电泳一致，电泳1.5-2h，直到第二条指示剂二甲苯氰（绿色带）接近下方边缘时停止电泳。回收电泳液，卸下玻璃板，用小刀撬开两块玻璃板。

I.银染：染色：将带胶玻璃板放入加有染色液的塑料盆中，缓慢摇动染色约30-40min；蒸馏水冲洗：染色后用蒸馏水快速冲洗胶板一至两次，稍微沥干；显影：把玻璃板快速转移到装有预冷的显影液的塑料盆中，缓慢摇动，直至出现带纹，避免背景颜色过深；冲洗：用蒸馏水冲洗掉残留的显影液；干燥：将胶板放置在室内垂直自然晾干；电泳结果的记录分析，拍照。

④AFLP结果分析：

通过156对EcoRI/MseI引物组合检测，有27对引物在六个材料间产生了特异性，5对引物只在非洲栽培稻细胞质雄性不育系非金A和非中A中产生特异带型。这些特异片段大小在125bp至720bp之间，表明非洲栽培稻细胞质雄性不育系是不同于其它质源雄性不育系的。

表2非洲栽培稻细胞质雄性不育系的AFLP分析特异标记

说明：﹢﹢表示强带，﹢表示弱带，﹣表示无带。

（2）从非洲栽培稻细胞质雄性不育系非金A和非中A及其对应保持系，共四种材料中分别提取线粒体DNA，并对线粒体DNA进行AFLP分子标记分析，获得一些非洲栽培稻细胞质雄性不育系细胞质特有的标记，如表3所示，具体步骤如下：

①线粒体DNA的提取

A.取不育系、保持系种子，用10%（g/mL）的次氯酸钠消毒30min。将种子置于30℃培养箱中浸种、催芽、培养黄化苗，暗培养10-12天，每天换蒸馏水；

B.取培养的黄化苗10g，用20%（g/mL）次氯酸钠消毒10min，然后用预冷无菌水冲洗后并吸干水。用剪刀将黄化苗截成小段，加入3倍体积的匀浆缓冲液A，用预冷的高速组织匀浆捣碎机破碎组织，10min后加入2倍体积缓冲液C静置20min，经4层纱布过滤，离心管收集滤液；

C.将滤液离心10min(2000rpm，4℃)，去沉淀，收集上清。将上清离心20min(18000rpm，4℃)，弃上清。

D.向沉淀中加入悬浮液B，用毛笔轻刷沉淀使之充分悬浮，将悬浮液离心10min(1000rpm，4℃)，去沉淀。将上清离心20min(18000rpm，4℃)，得到粗线粒体沉淀。

E.然后向沉淀中加入2mL缓冲液C，加入MgCl₂终浓度为0.01mol/L，DNaseI终浓度为150μg/mL，4℃冰浴1.5-2h，并且每隔20min轻摇一次。加入EDTA至终浓度20mmol/L，静置10min中止DNaseI反应。

F.将此溶液小心铺在6mL 0.6mol/L蔗糖溶液介质D上，4℃18000rpm离心20min，所得的沉淀为较纯的线粒体。

G.按照0.1g/mL鲜重加入适量的裂解液，待沉淀悬浮后加入预热的蛋白酶K至终浓度为100μg/mL，将反应液转入到2mL的离心管中，65℃水浴反应1h，期间每隔15分钟轻摇一次。

H.加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)进行抽提，缓慢轻轻的摇匀，放置10min后于4℃下12000rpm离心5min。

I.用剪过的枪头小心吸取上清，再加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1）抽提一次，重复步骤H。

J.吸取上清，加入预冷的两倍体积的无水乙醇，-20℃静置2h或过夜，12000rpm 4℃离心10min。

K.离心后去废液，将沉淀用70%（V/V）的无水乙醇洗涤，冰浴静置30min，重复一次。

L.将沉淀烘干，加入20μL的TE溶解，-20℃保存。

②AFLP反应：此方法同上步骤2-(1)-②。

③PCR反应产物检测：此方法同上步骤2-(1)-③。

④AFLP结果分析：

通过270对EcoRI/MseI引物组合检测，有27对引物在四个材料中产生了特异性片段，2对引物只在非洲栽培稻细胞质雄性不育系非金A和非中A中产生特异带型。这些特异片段大小在175bp至720bp之间，表明非洲栽培稻细胞质雄性不育系的细胞质特异性。

表3非洲栽培稻细胞质雄性不育系线粒体DNA的差异片段

说明：﹢﹢表示强带，﹢表示弱带，﹣表示无带。

3、不同细胞质对不育系农艺性状影响比较：

通过用不同细胞质不育系及其保持系交叉配组杂交，即A₁（不育系）×B₂（保持系）与A₂×B₁构建同核异质组合对，对其杂交F₁代部分异交性状比较。结果表明：非洲栽培稻细胞质不育系柱头外露率高于其他孢子体CMS，同时抽穗包颈程度较轻，开花习性较好（表4）。

表4非洲栽培稻细胞质不育系二元系的异交性状

说明：*表示5%的显著水平，**表示1%的显著水平。

4、非洲栽培稻细胞质雄性不育恢复基因的SSR标记分析：

选以非洲稻栽培稻细胞质雄性不育系为母本并完全可育性的F₁代单株自交种子构建F₂代群体，利用SSR标记在非洲栽培稻细胞质雄性不育系F₂代群体及亲本中筛选多态性引物。

①基因组DNA的提取：此方法同上步骤2-(1)-①。

提取F₂代群体中极端可育株、不育株及亲本的DNA，构建可育基因池和不育基因池。

②SSR标记筛选：

A.PCR反应体系：总体积为20μL，其中2×EasyTaq PCR SuperMix 10μL，20ng/μL的DNA模板4μL，10μmol/L的前后引物各2μL，加ddH₂O至20μL。

B.扩增程序：94℃预变性4min；扩增循环为：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸8分钟，最后转入4℃保存。

C.PCR反应产物检测：此方法同上步骤2-(1)-③。

③SSR结果分析：

结果表明，35个SSR标记在基因池、亲本和F₂代单株中筛选特异标记，发现有三个引物RM6100、RM258和RM304与恢复基因连锁，通过分析将非洲栽培稻细胞质雄性不育恢复基因定位于第10染色体的长臂端。

Claims (1)

1.一种非洲栽培稻细胞质雄性不育系的选育方法，其步骤是：

（1）通过人工饱和授粉杂交克服非洲栽培稻与普通栽培稻种间远缘杂交的高度不孕性，获得种间F1代种子：以热带地区春季短日照条件下抽穗的非洲栽培稻为母本，温汤去雄:水温45℃，处理时间5min，以同期抽穗的籼稻品种为父本饱和授粉，杂交配组1000对，每组合5个杂交袋，每袋2-3穗，1.8%以上的组合可获得F1代种子；

（2）在温带地区初夏播种上季收获的种间F1代种子，45%组合的种子发芽成苗，种间杂种F1植株营养生长旺盛，在温带地区夏秋相对较长日照的生长季节均不能抽穗；

（3）将种间杂种F1稻蔸移栽到热带地区，再生的种间杂种F1植株在热带地区春季短日照条件下抽穗，所有植株均为雄性不育，以不育的种间F1植株为母本与籼稻品种父本进行回交，获得回交一代B1F1种子；

（4）在温带地区种植B1F1代，植株出现性状和育性分离，选择在安全齐穗期前正常抽穗、综合性状好的不育株为母本，与轮回亲本回交，获得回交二代B2F1种子；

（5）继后，分别在热带地区和温带地区种植 B2F1及以后的回交世代，在各回交代均选择综合性状趋近轮回亲本的不育株为母本，轮回亲本自交后代株系中的单株为父本，成对回交；

（6）通过在热带地区和温带地区穿梭育种，经连续多代单株选择和核置换回交至B8F1代以上，育成群体遗传性状稳定的非洲栽培稻细胞质雄性不育系；

（7）通过种间远缘杂交选育和测交筛选获得强恢复系，实现籼型非洲栽培稻细胞质雄性不育系、保持系和恢复系三系配套。

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