CN101250524B - 甘蓝型油菜自交不亲和保持系的分子标记及制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜自交不亲和保持系的显性SCAR分子标记。其特征是，利用报道的引物SP11a扩增甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300和甘蓝型油菜自交不亲和保持系04P63外-52的基因组DNA，分别得到一个扩增的DNA片段，然后对所扩增的两个DNA片段进行克隆、测序，进行核苷酸序列比对，根据序列的差异设计引物SP11b，PCR扩增，得到甘蓝型油菜自交不亲和保持系的显性SCAR分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。本发明还公开了制备所述分子标记的方法及应用。
Description
技术领域
本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及创造一种甘蓝型油菜自交不亲和保持系的分子标记及制备方法与应用。
背景技术
自交不亲和性是甘蓝型油菜杂种优势利用的一种重要途径。与甘蓝型油菜当前杂种优势利用的主要途径—细胞质雄性不育相比，自交不亲和杂种具有选育周期短、恢复系多、无不良胞质效应、制种产量高等优点，近年来成为国内外育种学家研究的热点之一。自交不亲和材料自交不能结实，目前缺乏大量繁殖自交不亲和系的方法，因此限制了自交不亲和杂种的生产和应用。当前，繁殖自交不亲和系的方法主要有剥蕾授粉法、喷施盐水法、电助授粉法、热助授粉法、CO2处理法等，但是这些方法费工费时成本高，效果不好。自交不亲和保持系与自交不亲和系杂交得到的F1植株表现为自交不亲和，可以繁殖自交不亲和系。目前已筛选到双低(低芥酸、低硫苷)的甘蓝型油菜自交不亲和系保持系，可以基本上解决甘蓝型油菜自交不亲和系难以大量繁殖的问题，但从经济性状和生育期等方面考虑，这些保持系还不能直接用于杂种生产，需要进行改良。
甘蓝型油菜自交不亲和性的遗传机制十分复杂，环境和外界因素影响较大，表现不稳定。亲和指数法是当前鉴定亲和性的常用方法，具有简单、方便、可大量操作等特点，但是容易受到环境条件影响，存在许多缺点。分子标记辅助选择是一种高效的育种方法，它可在任何生长期进行，不受环境条件影响，具有快速、经济，效率高、准确性高等优点。在甘蓝型油菜自交不亲和保持系改良过程中利用分子标记技术与回交育种相结合，不但可以借助分子标记对自交不亲和基因型进行直接而快速地选择，以排除环境和外界因素的影响，同时对保持系背景进行选择，加快遗传背景恢复速度，缩短育种年限。Zhang等(Zhang等，MolecularBreeding，Development of SCAR markers linked to self-incompatibility in Brassica napus L.，2008，21：305-315)利用同源序列法发展了甘蓝型油菜自交不亲和系和甘蓝型油菜自交不亲和恢复系的SCAR分子标记。
迄今为止尚未见甘蓝型油菜自交不亲和保持系的分子标记及制备方法与应用的报道。
发明内容
本发明的目的在于发展一种适用于甘蓝型油菜自交不亲和保持系的分子标记，为甘蓝型油菜自交不亲和保持系的改良提供一种简单、快速和有效的方法。
本发明的目的还包含利用本发明的分子标记组装一种鉴别甘蓝型油菜自交不亲和保持系的试剂盒。
本发明是通过以下方案实现：
申请人通过试验获得一种适用于甘蓝型油菜自交不亲和保持系的显性SCAR分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。
制备适用于甘蓝型油菜自交不亲和保持系的显性SCAR分子标记的方法，按照以下步骤：
利用报道的引物SP11a扩增甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300和甘蓝型油菜自交不亲和保持系04P63外-52基因组DNA，得到两个DNA扩增片段，然后对所述的DNA扩增片段进行克隆、测序，其中从S-1300中扩增得到如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，从04P63外-52中扩增得到如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，在SEQ ID NO：1的第174-175位，第287-295位碱基处分别有2bp和9bp的缺失突变；根据SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列差异设计引物SP11b，PCR扩增，得到甘蓝型油菜自交不亲和保持系的显性SCAR分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在上述方法中，所用引物的核苷酸序列如下所示：
(1)SP11a：
正向引物5′-CATAAGTCATGAGATATGCTAC-3′，
反向引物5′-CCGTCGTATATTGCATAGAGTA-3′。
(2)SP11b：
正向引物5′-CAGAAGTCATGAGATATGCTAC-3′，
反向引物5′-ATTAGTAACATTCGGTCCG-3′。
一种适用于甘蓝型油菜自交不亲和保持系检测的试剂盒，该试剂盒含有以下组分：
1PCR Buffer；
MgCl2 1.35mM；
dNTPs 0.08mM；
Taq DNA聚合酶 1.0U；
DNA 100ng；
正反向引物各 0.45μM；
ddH2O 补充至终体积20μl；
所述引物的核苷酸序列如下：
正向引物：5′-CAGAAGTCATGAGATATGCTAC-3′；
反向引物：5′-TAACATTCGGTCCGAAGTG-3′。
更详细的技术方案参见《具体实施方式》。
本发明的积极效果：
本发明成功得到甘蓝型油菜自交不亲和保持系的显性SCAR分子标记，运用该标记进行甘蓝型油菜自交不亲和保持系的辅助选择可以克服传统育种中依靠表型进行选择的缺点，减少育种工作量，缩短育种年限，加快了改良甘蓝型油菜自交不亲和保持系的步伐。
附图说明
图1：利用报道的引物SP11a和SRKa在甘蓝型油菜品种S-1300和04P63外-52以及F1的基因组DNA中的扩增结果。图中：P1代表S-1300；P2代表04P63外-52；F1代表S-1300×04P63外-52；M代表DNA marker(片段大小依次为3000，2000，1000，750，500，250和100bp)。
图2：利用报道的引物SP11a在S-1300和04P63外-52基因组中的扩增的DNA片段序列比对，图中：三角形表示序列的第174-175bp和第287-295bp位碱基的缺失突变；设计的引物位置(即引物SP11b的反向引物的反向互补序列)参见下划线处。
图3：本发明设计的引物SP11b在甘蓝型油菜品种S-1300和04P63外-52以及F1的基因组DNA中的扩增结果。图中：P1代表S-1300；P2代表04P63外-52；F1代表S-1300×04P63外-52；M代表DNAmarker(片段大小依次为3000，2000，1000，750，500，250和100bp)。
图4：本发明获得的多重PCR标记分析甘蓝型油菜(S-1300×04P63外-52)F2群体的结果。图中：P1代表S-1300；P2代表04P63外-52；F1代表S-1300×04P63外-52；5和14代表纯合自交不亲和单株；3，4，6，7，10和12代表纯合自交亲和单株；1，2，8，9，11和13代表杂合自交不亲和单株；箭头所示分子量大小。
图5：是本发明的技术流程图。
具体实施方式
实施例1
1、生产甘蓝型油菜自交不亲和杂种F1
以甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300(见文献：马朝芝等，甘蓝型油菜双低自交不亲和系的选育，华中农业大学学报，1998，17(3)：211-213)为母本，以甘蓝型油菜自交不亲和保 持系04P63外-52(该品系于2007年9月20日保藏在湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(英文简称：CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO：P200704，该品种的分类命名为：Brassica napus)为父本进行杂交，得到F1种子。
2、筛选甘蓝型油菜自交不亲和分离群体
将上述步骤得到的F1种子在自然条件下播种，得到甘蓝型油菜自交不亲和F1植株。在F1 植株上剥蕾自交得到(S-1300×04P63外-52)F2种子，同时取F1植株的花粉分别与上述步骤所述的甘蓝型油菜的父母本回交，获得两份BC1种子。将获得的3份种子(其中包括两份BC1种子和1份F2种子)，在自然条件下种植，得到三个分离群体。共获得(S-1300×04P63外-52)F2群体436个单株，(S-1300×04P63外-52)×S-1300群体116个单株，(S-1300×04P63外-52)×04P63外-52分132个单株。
3、提取甘蓝型油菜基因组DNA
从上述步骤获得的三个分离群体以及双亲(即上述步骤所述的甘蓝型油菜自交不亲和的父母本)的鲜嫩叶片中提取基因组DNA，具体制备方法参照李佳等(李佳等，一种有效提取油菜叶片总DNA的方法，华中农业大学学报，1994，13(5)：521-523)报道的方法进行，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并用紫外分光光度计(型号：Pharmacia Biotech，GeneQuant II)检测DNA浓度。
4、甘蓝型油菜自交不亲和表型的鉴定
调查上述步骤中得到的三个甘蓝型油菜分离群体的自交不亲和表型，具体方法如下：当甘蓝型油菜植株的主枝上有3～5朵花开放时，摘除主枝上已开放的花朵和花序中心的小蕾以限制主枝无限生长，然后用硫酸钠纸袋套住主枝和2～3个侧枝，每隔一天把纸袋向上抽提，在抽提的过程中用手轻拍纸袋进行人工辅助授粉。大约10天后，依结籽情况对甘蓝型油菜植株的自交不亲和性做出初步判断。对初步判断为自交不亲和的单株要尽可能多的在侧枝上进行剥蕾自交以繁殖种子。油菜成熟收获后，脱粒、考察套袋自交结实情况，按照公式计算亲和指数：亲和指数＝籽粒数/花朵数。参见李春艳等(李春艳等，甘蓝型油菜自交不亲和临保性及其连锁AFLP标记，作物学报，2007，33(9)：1452-1457)和Zhang等(Zhang等，Developmentof SCAR markers linked to self-incompatibility in Brassica napus L，Molecular Breeding，2008，21：305-315)对甘蓝型油菜亲和指数的分类标准，以指数2为标准，凡亲和指数＜2的单株定为自交不亲和，亲和指数≥2的单株定为自交亲和。
调查的3个甘蓝型油菜分离群体中自交不亲和的表型分离结果见表1。对甘蓝型油菜自交不亲和的表型分离数据进行适合性(x2)测验，测验方法参见南京农业大学主编，田间试 验和统计方法，中国农业出版社，1985，第二版。其结果是，(S-1300×04P63外-52)F2群体共获得436个单株，包括331个自交不亲和单株和105个自交亲和单株，自交不亲和与自交亲和的比值符合3∶1的分离比例。(S-1300×04P63外-52)×S-1300群体中，全部116个单株的亲和指数都小于2，表现为自交不亲和。(S-1300×04P63外-52)×04P63外-52群体有132个单株，包括63个自交不亲和单株和69个自交亲和单株，自交不亲和与自交亲和的比值符合1∶1的分离比例。这些数据说明甘蓝型油菜自交不亲和的表型分离受单个遗传位点控制，自交不亲和性对自交亲和性为显性。
为了便于本发明的描述，将甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300中控制自交不亲和表型的显性遗传位点命名为A，基因型为AA。甘蓝型油菜自交不亲和保持系04P63外-52控制自交不亲和表型的隐性遗传位点命名为a，基因型为aa。F1植株具有杂合位点，基因型为Aa，表现为自交不亲和。根据该命名，分离群体中纯合自交不亲和单株基因型为AA，杂合自交不亲和单株基因型为Aa，纯合亲和单株基因型为aa。表1是本发明中3个甘蓝型自交不亲和油菜分离群体的自交不亲和的表型分离结果。
表1本发明中3个甘蓝型自交不亲和油菜分离群体的自交不亲和的表型分离
| 分离群体 | 总株数 | 自交不亲和 | 自交亲和 | 期望比值 | x2 | P值 |
| (S-1300×04P63外-52)F2 | 436 | 331 | 105 | 3∶1 | 0.15 | 0.50-0.75 |
| (S-1300×04P63外-52)×S-1300 | 116 | 116 | 0 | 1∶0 | 0 | 1 |
| (S-1300×04P63外-52)×04P63外-52 | 132 | 63 | 69 | 1∶1 | 0.19 | 0.50-0.75 |
5、利用报道的引物SP11a和SRKa扩增分析双亲和F1的基因组DNA
利用Zhang等(Zhang等，Development of SCAR markers linked to self-incompatibility inBrassica napus L，Molecular Breeding，2008，21：305-315)发表的引物SP11a和SRKa(引物序列见表2)来扩增分析甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300、甘蓝型油菜自交不亲保持系04P63外-52和F1的基因组DNA。
PCR反应体系如下：1×PCR buffer，1.35mM MgCl2，0.08mM dNTPs，1.0U Taq DNA聚合酶(四者均购自MBI Fermentas，Lithuania公司)，100ng DNA，正、反向引物各0.45μM，ddH2O补充至终体积20μl。热循环参数为：94℃ 3min；94℃ 30sec，复性温度45℃ sec，72℃60sec，38个循环；72℃ 10min，1个循环；4℃保存，反应是在PTC-225 PCR仪上完成。三个材料均进行两次重复。扩增产物在水平电泳槽上1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用1×TAE缓冲液(0.04M Tris-acetate，0.001M EDTA，pH 8.0)，电压3V/cm，电泳1.5h左右。电泳完毕， 凝胶成像系统(UVP)拍照保存。
本发明中引物SP11a在双亲和F1的基因组DNA中扩增产物均为430bp左右的单一亮带，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测片段长度无差异(见图1)。引物SRKa在S-1300和F1的基因组DNA中扩增出预期大小的DNA片段即1058bp，但在04P63外-52的基因组DNA中无扩增产物。
表2本发明中使用的引物DNA序列
6、回收、克隆、测序引物SP11a在双亲中扩增的DNA片段
回收上述步骤中获得的引物SP11a在甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300、甘蓝型油菜自交不亲和保持系04P63外-52中扩增的DNA片段。操作程序按UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(购自上海生物工程公司)说明书提供的方法：用刀片从1.2％的琼脂糖胶上挖出扩增的DNA片段，放入1.5ml的离心管，加入Bing Buffer II，置于50-60℃水浴中加热10min，每隔2min混匀一次；将融化的胶溶液转移至套在收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min，8,000rpm离心1min；倒掉收集管中的废液，加入500μl Wash Solution，8,000rpm室温离心1min，此步骤重复一次；倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12,000rpm离心15sec；将UNIQ-10柱放入一根新的1.5ml的离心管中，在柱子膜中央加30μl ElutionBuffer，室温放置2min；12,000rpm离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。
取上述回收的目标DNA片段2μl作模板，用引物SP11a按照上述步骤进行PCR扩增，在1.2％的琼脂糖胶检测扩增的DNA片段。如果扩增的DNA片段长度与上述步骤中扩增的结果不相同，需要重新扩增回收；如果扩增的DNA片段长度与上述步骤中扩增的结果相同，说明回收得到的DNA片段即是目标DNA片段，可用于下一步的T-A克隆。
将回收的目标DNA片段连接在pMDT-18载体上(该载体购自TaKaRa公司，大连宝生物公司代理)。操作程序按该试剂盒说明书提供的方法：试剂在使用前先短暂离心将其收集在 管底部；在0.5ml的离心管中进行连接反应，连接反应体系为DNA2.0μl，pMDT-18载体0.5μl和Solution I 2.5μl。用移液管来回吸几次混匀，置4℃冰箱进行过夜连接反应；准备LB液体培养基和LB固体培养基(含100mg/ml氨苄青霉素，24mg/ml的异丙基-硫代β-D-半乳糖苷和20mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷)；从-70℃冰箱中取出感受态细胞放在冰上待它慢慢解冻(大约5min)；离心收集连接反应液，取2μl反应液加入到一个已经灭菌的1.5ml离心管(放在冰上预冷)；用手指轻弹装有感受态细胞的管底以混匀，取50μl感受态细胞加入装有2μl连接反应液的1.5ml离心管，用手指轻弹混匀，放在冰上20min；在42℃水浴中热激90sec(勿摇动)，然后在冰上放置2min；加500μl的LB液体培养基后在37℃振荡培养1.5h(150rmp/min)；吸取振荡培养后的转化液100μl涂在无菌的LB固体培养基上，在37℃放置16-24h；进行蓝、白斑筛选，挑选12个阳性克隆进行编号，并在无菌的液体LB培养基(含50ug/ml的氨苄青霉素)振荡培养16-24h；取振荡培养后的菌液2μl作PCR模板，用M13作引物(正向引物：5′-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3′；反向引物：5′-CGGATAACAATTTCACACAGGA-3′)扩增，PCR反应如上述步骤所述。扩增结果在1.2％的琼脂糖凝胶上检测。如果所得的DNA片段比目标DNA片段大200bp左右，说明转化成功，选3份转化成功的菌液各吸取300μl送上海生物工程有限公司进行序列测定。剩余200μl浑浊菌液加200μl 50％无菌的甘油在1.5ml无菌的离心管中于-70℃编号保存。
本发明中，引物SP11a在S-1300和04P63外-52中的扩增片段各3次重复测序，序列结果一致。引物SP11a在S-1300中的扩增DNA片段长435bp，与Zhang等(Zhang等，Development of SCAR markers linked to self-incompatibility in Brassica napus L，MolecularBreeding，2008，21：305-315)克隆的该片段核苷酸序列完全相同，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。引物SP11a在04P63外-52中的扩增DNA片段长度为424bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
7、制备甘蓝型油菜自交不亲和保持系的SCAR标记
对上述步骤得到的引物SP11a在S-1300和04P63外-52中的DNA片段用报道的ClustalX软件进行序列比对。比对结果显示，除部分单碱基差异外，04P63外-52中的DNA片段在第174-175bp位碱基有一个2bp的缺失突变，缺失碱基是TA，在第287-295bp位碱基有一个9bp的缺失突变，缺失碱基为AAGTTGAGG(见图2)。
根据引物SP11a在04P63外-52中扩增DNA片段的核苷酸序列(如序列表SEQ ID NO：1所示)，利用报道的Primer 3软件(http://redb.croplab.org/modules/redbtools/primer3.php)，在序列SEQ ID NO：1中的第277-305bp之间的位置设计一条反向引物。设计时要求引物 长度为17～22bp，复性温度55～62℃，GC含量为40～50％。筛选得到一条目标引物(序列见表2中SP11b的反向引物，位置见图2中下划线所示)，引物长度为19bp，复性温度为60℃，GC含量为45％。将该引物与SP11a的正向引物相结合，并将其命名为SP11b，预期在甘蓝型油菜自交不亲和保持系04P63外-52的基因组DNA中扩增出303bp的片段，而在甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300的基因组DNA中无任何扩增产物。
本发明利用上述步骤设计的引物进行PCR，PCR反应体系同上所述，复性温度60℃。扩增结果在1.2％的琼脂糖胶上检测。该引物在甘蓝型油菜自交不亲和保持系04P63外-52和F1的基因组DNA中扩出303bp的目标片段，而在甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300的基因组DNA中无任何扩增产物(见图3)，因此该扩增片段可作为甘蓝型油菜自交不亲和保持系的显性SCAR分子标记。
8、甘蓝型油菜自交不亲和保持系的显性SCAR标记的验证
利用上述步骤得到的甘蓝型油菜自交不亲和保持系的SCAR标记分析本发明中的三个分离群体(见表3)。在(S-1300×04P63外-52)F2群体中，所有105个自交亲和单株和219个自交不亲和单株出现与04P63外-52一样的303bp的DNA片段，112个自交不亲和单株与自交不亲和系S-1300一样无任何扩增产物。在(S-1300×04P63外-52)×S-1300群体中，54个自交不亲和单株出现与04P63外-52一样的DNA片段，而62个单株无任何扩增产物。在(S-1300×04P63外-52)×04P63外-52群体中，所有单株都出现04P63外-52一样的扩增片段，包括63个自交不亲和单株和69个自交亲和单株。这些数据说明该标记是与甘蓝型油菜自交不亲和保持系共分离的，本发明对该标记又做了更进一步的验证。
表3本发明的显性SCAR标记在三个甘蓝型油菜自交不亲和分离群体中的分析
说明：表3中的“+”表示具有与04P63外-52一样的扩增片段的单株。
将上述步骤中获得的甘蓝型油菜自交不亲和保持系的显性SCAR标记SP11b与甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300的显性SCAR标记SRKa结合，来发展同时区分三种基因型的多重PCR标记。具体操作如下：在同一PCR反应体系中，以100ng DNA为模板，1×PCR buffer，1.35mmol/L MgCl2，0.08mmol/L dNTPs，1.0U Taq DNA聚合酶(四者均购自MBI Fermentas， Lithuania公司)，SCAR引物SP11b正反向引物各0.30μmol/L，SCAR引物SRKa的正反向引物各0.45μmol/L，ddH2O补充至终体积20μl。热循环参数为：94℃ 3min；94℃ 30s，59℃1min，72℃ 90s，35个循环；72℃ 10min，1个循环；4℃保存。该多重PCR标记能够同时区分三种基因型：纯合自交不亲和基因型(AA)，杂合自交不亲和基因型(Aa)以及纯合自交亲和基因型(aa)，本发明的效果见图4所示。
用该多重PCR标记分析三个分离群体中各个单株的基因型，并验证与上述步骤中调查的自交不亲和表型是否吻合。根据多重PCR扩增结果，凡是出现与母本S-1300一样的单一带型的单株，判定其基因型为AA，表现型为自交不亲和；凡是出现与04P63外-52一样的单一带型的单株，判定其基因型为aa，表现型为自交亲和；凡是出现与F1一样的两条带型的单株，判定其有基因型为Aa，表现型为自交不亲和。结果发现根据多重PCR结果推测的基因型和调查的自交不亲和表现型完全吻合，说明本发明获得了用于辅助选择甘蓝型油菜自交不亲和保持系的显性SCAR分子标记。
表4本发明中三个甘蓝型油菜自交不亲和分离群体中的基因型和基因频率
序列表
Claims (4)
1.一种适用于甘蓝型油菜自交不亲和保持系的显性SCAR分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。
2.用于扩增权利要求1所述分子标记的特异引物SP11b，它的核苷酸序列如下：
正向引物5′-CAGAAGTCATGAGATATGCTAC-3′；
反向引物5′-TAACATTCGGTCCGAAGTG-3′。
3.一种甘蓝型油菜自交不亲和保持系显性SCAR分子标记的制备方法，按照以下步骤：
利用报道的引物SP11a扩增甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300和甘蓝型油菜自交不亲和保持系04P63外-52基因组DNA，得到两个DNA扩增片段，然后对所述的DNA扩增片段进行克隆、测序，其中从S-1300中扩增得到如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，从04P63外-52中扩增得到如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，在SEQ ID NO：1的第174-175位，第287-295位碱基处分别有2bp和9bp的缺失突变；根据SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列差异设计引物SP11b，PCR扩增，得到甘蓝型油菜自交不亲和保持系的显性SCAR分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
其中：
所述的引物SP11a的核苷酸序列如下所示：
正向引物5′-CATAAGTCATGAGATATGCTAC-3′，
反向引物5′-CCGTCGTATATTGCATAGAGTA-3′；
所述的引物SP11b的核苷酸序列如下所示：
正向引物5′-CAGAAGTCATGAGATATGCTAC-3′，
反向引物5′-ATTAGTAACATTCGGTCCG-3′。
4.权利要求1所述的分子标记在甘蓝型油菜自交不亲和保持系辅助选择中的应用。
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