CN111926097A - 抗虫抗除草剂玉米转化事件及其创制方法和检测方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了抗虫抗除草剂玉米转化事件及其创制方法和检测方法。本申请提供了创制抗虫抗除草剂玉米转化事件的方法，同时还提供了插入至玉米基因组的核酸分子及其侧翼核酸分子，基于此建立了检测玉米转化事件的方法，并可将其用于玉米育种中。

Description

抗虫抗除草剂玉米转化事件及其创制方法和检测方法

技术领域

本申请涉及植物生物技术和植物育种领域。具体地，本申请涉及抗虫抗除草剂核酸分子，由其创制的植物转化事件及其创制方法和检测方法。

背景技术

玉米作为中国种植面积最大的农作物，长期自给有余，但自2010年以来，进口量逐年增加。

玉米螟(Ostrinia nubilalis)俗称玉米钻心虫，其危害是造成玉米常年减产的重要生物灾害之一，严重影响玉米的产量和质量。中国是亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)的多发区和重发区，几乎每两年就大发生一次，其中一般年份玉米受玉米螟危害减产10％-15％，大发生年减产可达30％以上，甚至绝收。因玉米螟的危害，每年损失的玉米就达600-900万吨。玉米螟不仅直接造成玉米产量损失，而且还诱发和加重玉米穗腐病的发生，使玉米的品质下降。

目前防治玉米螟的主要方式还是以农药防治为主。农药的大量使用，既增加种植成本，又破坏生态环境。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)的杀虫晶体蛋白对包括玉米螟在内的不同昆虫(如鳞翅目、鞘翅目、双翅目等)和无脊椎动物有特异毒杀作用。通过培育转基因Bt抗虫玉米，能够有效的防治玉米虫害，减少农药使用，挽回产量损失，增加农民收入，降低环境危害。

田间杂草与作物竞争水、肥、光能及生长空间，同时又是危害作物病菌及害虫的中间寄主，是作物增产重要的生物限制因子之一。我国常年受杂草严重危害的农作物面积高达12亿亩，其中玉米1.9亿亩。随着农村人口往城市迁移速度的加快，玉米种植的规模化和机械化是一个可预见的趋势。

当前，广泛采用的选择性除草剂施用量大，且残留期长、容易影响下茬作物的正常生长。草甘膦和草铵膦等灭生性除草剂具有高效、低毒、易降解、无残留等特点，但它们除草没有选择性，不能直接用在作物的生长期。通过转基因技术培育耐灭生性除草剂的玉米可以克服这一难题，即在玉米生育期喷施1-2次就能解决所有杂草问题，减少了除草剂的用量及投入成本。

因此，通过转基因技术提高玉米对虫害、草害的抗性挽回产量损失，增加玉米单产、降低生产成本和风险，对于缓解我国玉米日趋偏紧的供需形势、维护国家粮食安全至关重要。

植物转基因育种技术具有目的性强、周期短、效率高，能够实现不同物种间优良基因的转化等优点，自1996年第一个转基因作物商业化以来，这项技术已经为全球农业带来了巨大的改变。2013年全球转基因作物种植面积达到1.75亿公顷，比2012年增加了500万公顷，是1996年种植面积的100倍。

就转基因玉米而言，以防治鳞翅目玉米螟虫的cry1Ab、cry1F等基因为主，已有多个具有鞘翅目抗性的品系如MON88017等，以及利用cry3类基因获得抗玉米根部鞘翅目害虫品系，如MON863等，已投入商业化生产。这表明抗虫基因选择逐渐拓宽了靶标昆虫的范围，加大了对基因抗虫谱的选择。

随着基因改造技术的应用，如MON810、MON89034等利用密码子优化的转Bt基因抗虫玉米也进入了商业生产。另外，先正达公司研发的MIR162抗虫玉米成功地利用了vip3A基因，并率先进入商业生产。复合性状转基因玉米，如TC1507等兼具抗虫和抗除草剂，逐渐成为转基因玉米研发及应用的主流。世界范围内，1996年至今已有40余种转Bt基因抗虫玉米被26个国家批准投入商业化生产或饲料食品加工。

发明内容

一方面，本申请提供了核酸分子，其包含螟虫抗性基因cry1C，草铵膦抗性基因bar和草甘膦抗性基因epsps，或其片段或其变体或其互补序列。

在一实施方案中，本申请所提供的核酸分子包含SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的核苷酸序列，或其片段或其变体或其互补序列。

另一方面，本申请提供了表达载体，其包含螟虫抗性基因cry1C，草甘膦抗性基因epsps和草铵膦抗性基因bar，或其片段或其变体或其互补序列。

在一实施方案中，本申请所提供的表达载体包含SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的核苷酸序列，或其片段或其变体或其互补序列。

又一方面，本申请提供了宿主细胞，其包含上述核酸分子，或者上述表达载体。

在任选实施方案中，所述宿主细胞选自植物细胞或微生物细胞，例如玉米或农杆菌。

再一方面，本申请提供了创制玉米转化事件的方法，其包括将上述核酸分子作为外源插入序列导入玉米的基因组中，或者采用上述表达载体来转化玉米，或者用上述宿主细胞来转化玉米。

在一具体实施方案中，本申请提供的创制玉米转化事件的方法包括以下步骤：1)改造草铵膦抗性基因bar；2)人工合成草铵膦抗性基因bar和螟虫抗性基因cry1C；3)将步骤2)中合成的基因与草甘膦抗性基因epsps一起构建到同一表达载体中；4)将步骤3)中构建的表达载体通过农杆菌介导的转化方法导入到玉米中；以及5)对步骤4)中获得的玉米转化体进行分子鉴定，选取单拷贝插入的植株，即为包含所述玉米转化事件的植株。

进一步地，本申请还提供了通过上述创制玉米转化事件的方法获得的玉米植株及其后代。

在本申请提供的创制转化事件的方法以及由其所获得的玉米植株中，所述玉米选自种子、花粉、种子、花粉、雌蕊、叶、根、或茎。

另一方面，本申请提供了玉米转化事件外源插入核酸分子的侧翼核酸分子，其包含选自SEQ ID No:3或SEQ ID No:4所示的核苷酸序列，或其片段或其变体或其互补序列。

又一方面，本申请提供了用于检测玉米转化事件的引物或探针，其选自特异性识别SEQ ID No:1和/或SEQ ID No:2所示的核苷酸序列或其片段或其变体或其互补序列的引物或探针，以及特异性识别SEQ ID No:3和/或SEQ ID No:4所示的核苷酸序列或其片段或其变体或其互补序列的引物或探针。

在一实施方案中，本申请所提供的用于检测玉米转化事件的引物或探针选自SEQID No:5和SEQ ID No:6以及SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的核苷酸序列或其互补序列。

再一方面，本申请提供了用于检测玉米转化事件的试剂盒或微阵列，其包含上述引物或探针。

进一步地，本申请还提供了上述引物或探针或者上述试剂盒或微阵列在检测玉米转化事件中的应用。

还一方面，本申请还提供了检测玉米转化事件的方法，其包括采用上述引物或探针或者采用上述试剂盒或微阵列来检测待测样品中是否存在所述玉米转化事件。

在一具体实施方案中，所述检测玉米转化事件的方法包括以下步骤：1)提取待测样品的总DNA；2)以步骤1)提取的总DNA为模板，采用权利要求7所述的引物或探针或者采用权利要求8所述的试剂盒或微阵列来进行PCR扩增、实时PCR扩增、或Southern杂交；3)分析步骤2)的PCR扩增产物，实时PCR扩增曲线或Southern杂交结果，以确定待测样品中是否存在所述玉米转化事件。

此外，本申请还提供了对玉米进行育种的方法，所述方法包括以下步骤：1)利用上述创制玉米转化事件的方法获得包含转化事件的玉米；2)将步骤1)所获得的玉米与另一玉米品系进行杂交和/或回交；3)对步骤2)所获得的植株进行抗除草剂和抗虫鉴定，并利用上述检测玉米转化事件的方法来检测其中是否存在所述玉米转化事件。

进一步地，本申请还提供了通过上述对玉米进行育种的方法获得的玉米植株及其后代。

在本申请提供的上述对玉米进行育种的方法以及由其所获得的玉米植株中，所述玉米选自种子、花粉、雌蕊、叶、根、或茎。

此外，本申请还提供了利用上述玉米转化事件进行杂草控制和害虫防治目的方法。

综上，本申请提供了一种优质的玉米转化事件M00595A006a，其通过以下方式获得：利用Vector NTI软件对草铵膦抗性基因bar基因编码序列进行玉米密码子偏好性优化，并在5’端添加表达增强元件omega序列。利用优化后的bar基因，构建了包含草铵膦抗性基因bar、抗螟虫基因cry1C和和草甘膦抗性基因epsps的遗传转化载体pZHZH35005，通过农杆菌介导的遗传转化方法，以双丙胺膦作为筛选剂，成功地将pZHZH35005的T-DNA区单拷贝整合到玉米基因组中，并培育出抗虫(例如，抗玉米螟，抗性级别为1-5级)和抗除草剂(如，草铵膦或草甘膦，其耐受浓度范围为0.18％-0.72％)且农艺性状优良的转基因玉米转化事件M00595A006a。

此外，本申请还明确了外源T-DNA的插入位置并设计了特异性检测方法。具体地，本申请获得玉米转化事件M00595A006a的侧翼序列，并由此建立了对该玉米转化事件进行特异性检测的方法，可以有效的检测特定转化事件的存在，从而确定有性杂交的子代中是否含有目的基因，同时这种测定特定转化事件的检测方法将有助于遵守转基因安全管理条例，如要求源于转基因作物的商业化种植，加工品的销售等的许可和标识条例，能够更好的对转基因玉米事件、亲本、子代及其制品进行监督管理。

附图说明

图1是转化载体pZHZH35005的结构示意图。

图2是玉米转化事件M00595A006a基因组的实时PCR扩增曲线，其中IVR为内参基因扩增曲线；cry1C为草甘膦基因扩增曲线；Ori为载体骨架扩增曲线。

图3是玉米转化事件M00595A006a基因组DNA的Southern印迹检测结果图片。

图4是玉米转化事件M00595A006a的草铵膦抗性表现照片，其中A为转基因玉米叶片；B为敏感材料叶片对照。

图5是玉米转化事件M00595A006a的玉米螟抗性表现照片，其中A为转基因玉米叶片；B为非转基因受体材料；C为非转基因敏感材料对照。

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

如本文所用，“转化事件”是指通过遗传转化的方法将外源基因及其表达盒成功整合入受体材料的细胞核基因组中，通过组织培养、筛选、鉴定从而创制形成具有应用价值的转基因株系。另一方面，“转化事件”也是指由外源基因在基因组插入位点的上下游侧翼区和外源基因构成的分子结构。

本技术领域人员所熟知，外源基因在植物体内的表达具有位置效应，即受到插入的染色体位置的影响，这种影响可能是由于染色质的结构或整合位点附近的转录调节元件的影响近造成的。因此，通常需要生产成百上千个不同的转化事件，并从这些事件中筛选出外源基因表达水平及模式符合预期要求的优质转化事件，以达到商业化应用的目的。优质的转化事件通过传统的育种方法即有性杂交的方式将外源基因渐渗到其它遗传背景的种质中，其子代保持了原始转化体的转基因表达特性。这种策略已广泛应用于具有一定生态适应性的优良品种中以达到增加优良性状的目的。可通过本技术领域熟知的核酸检测方法，包括但不限于使用多核苷酸引物进行PCR扩增或使用核酸探针的DNA杂交来检测转化事件的存在。

在一具体实施方案中，本申请涉及玉米转化事件M00595A006a，其是将包含草铵膦抗性基因bar、抗螟虫基因cry1C和和草甘膦抗性基因epsps的遗传转化载体pZHZH35005的T-DNA区单拷贝整合到玉米基因组中，并培育出抗虫和抗除草剂且农艺性状优良的转化事件。

本申请涉及的转化事件M00595A006a是以玉米自交系祥249为受体经过转基因过程得到的，同时该转化事件也适用于同样的T-DNA(转移的DNA)片段插入到同样基因组位置的利用其他受体品种改良而获得的植株。

如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(plantclumps)和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。

如本文所用，“核苷酸序列”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，核苷酸序列以5’至3’方向从左向右书写。

在一实施方案中，本申请涉及的核酸分子包含螟虫抗性基因cry1C，草铵膦抗性基因bar和草甘膦抗性基因epsps,或其片段或其变体或其互补序列。

在另一实施方案中，本申请涉及的核酸分子包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其片段或其变体或其互补序列，其中SEQ ID No:1包含表达盒Pubi-epsps-Tnos，SEQ ID No:2包含表达盒P35S-barsyn-Tnos和Prbcs-cry1C-Tnos。

在一些实施方案中，可以对本申请的核酸分子或其片段进行改变，以进行保守氨基酸替换。在某些实施方案中，可以依照单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本申请还涉及核酸分子或其片段的变体。一般来讲，特定核酸分子或其片段的变体将与该特定核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互补序列。这样的变体序列包括一个或多个核酸残基的添加、缺失或替换，从而可以导致相应的氨基酸残基的添加、移除或替换。通过本领域内已知的序列比对程序包括杂交技术确定序列同一性。实施方案的核苷酸序列变体与本申请的序列的差异可以少至1-15个核苷酸、少至1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4、3、2或甚至1个核苷酸。

在一实施方案中，本申请还涉及表达载体，其包含螟虫抗性基因cry1C，草甘膦抗性基因epsps和草铵膦抗性基因bar，或其片段或其变体或其互补序列。

在另一实施方案中，本申请提供的表达载体包含SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的核苷酸序列，或其片段或其变体或其互补序列。

在一实施方案中，本申请还涉及宿主细胞，其包含上述核酸分子，即包含螟虫抗性基因cry1C，草铵膦抗性基因bar和草甘膦抗性基因epsps，或其片段或其变体或其互补序列的核酸分子。

在另一实施方案中，本申请提供的宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含螟虫抗性基因cry1C，草甘膦抗性基因epsps和草铵膦抗性基因bar的表达载体，或其片段或其变体或其互补序列；或者所述表达载体包含SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的核苷酸序列或其片段或其变体或其互补序列。

在具体实施方案中，所述宿主细胞选自植物细胞或微生物细胞，例如玉米或农杆菌。

进一步地，本申请还涉及创制玉米转化事件的方法。

在一实施方案中，本申请提供的创制玉米转化事件的方法包括将本申请的核酸分子作为外源插入序列导入玉米的基因组中，即将包含螟虫抗性基因cry1C，草甘膦抗性基因epsps和草铵膦抗性基因bar的核酸分子或其片段或其变体或其互补序列，或者包含SEQ IDNo:1和SEQ ID No:2所示的核苷酸序列或其片段或其变体或其互补序列的核酸分子作为外源插入序列导入玉米的基因组中。

在另一实施方案中，本申请提供的创制玉米转化事件的方法包括采用本申请的表达载体来转化玉米，所述表达载体为包含螟虫抗性基因cry1C，草甘膦抗性基因epsps和草铵膦抗性基因bar的表达载体，或其片段或其变体或其互补序列；或者包含SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的核苷酸序列或其片段或其变体或其互补序列的表达载体。

在又一实施方案中，本申请提供的创制玉米转化事件的方法包括采用本申请的宿主细胞来转化玉米，所述宿主细胞为包含螟虫抗性基因cry1C，草甘膦抗性基因epsps和草铵膦抗性基因bar的表达载体的宿主细胞，或者包含SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的核苷酸序列或其片段或其变体或其互补序列的表达载体的宿主细胞。

在具体实施方案中，本申请提供的创制玉米转化事件的方法包括以下步骤：1)改造草铵膦抗性基因bar；2)人工合成草铵膦抗性基因bar和螟虫抗性基因cry1C；3)将步骤2)中合成的基因与草甘膦抗性基因epsps一起构建到同一表达载体中；4)将步骤3)中构建的表达载体通过农杆菌介导的转化方法导入到玉米中；以及5)对步骤4)中获得的玉米转化体进行分子鉴定，选取单拷贝插入的植株，即为包含所述玉米转化事件的植株。

如本文所用，“侧翼核酸分子”或“侧翼序列”可以包含天然存在于例如植物的生物体中的基因组DNA或通过转化过程引入的外源(异源)DNA，例如与转化事件相关的片段。因此，侧翼序列可以包括天然和外源DNA的组合。

在一实施方案中，本申请涉及的玉米转化事件的侧翼序列的非限制性实例如SEQID No:3所示的左(5’)侧翼核酸分子和如SEQ ID No:4所示的右(3’)侧翼核酸分子，或其片段或其变体或其互补序列。

如本文所用，“探针”是附加了常规可检测的标记或报告分子例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶的分离的多核苷酸，其与靶多核苷酸的链是互补的。

如本文所用，“引物”是分离的多核苷酸，其通过核酸杂交形成引物和靶DNA链之间的杂交体而与互补靶DNA链退火，然后凭借例如DNA聚合酶的聚合酶沿着靶DNA链伸展。引物对涉及其靶多核苷酸扩增用途，例如通过聚合酶链反应(PCR)或其他常规核酸扩增方法。

在一些实施方案中，本申请涉及的引物或探针具有足够的核苷酸长度以结合SEQID NO:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3或SEQ ID No:4所示的核苷酸序列并特异性地检测和/或鉴定玉米转化事件M00595A006a。

因而，在具体实施方案中，本申请提供了用于检测玉米转化事件的引物或探针，其选自特异性识别SEQ ID No:1和/或SEQ ID No:2所示的核苷酸序列或其片段或其变体或其互补序列的引物或探针，以及特异性识别SEQ ID No:3和/或SEQ ID No:4所示的核苷酸序列或其片段或其变体或其互补序列的引物或探针。例如，本申请所提供的用于检测玉米转化事件的引物或探针选自SEQ ID No:5和SEQ ID No:6以及SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的核苷酸序列或其互补序列。如本文所用，“试剂盒”或“微阵列”是指用于生物样品中玉米转化事件M00595A006a的鉴定和/或检测的目的的试剂组或芯片。为质量控制(例如种子批的纯度)、植物材料中或包含植物材料或来源于植物材料的材料例如但不限于食品或饲料产品中事件M00595A006a的检测的目的，可以使用试剂盒或芯片，并且其组分可以具体地调整。

在一实施方案中，本申请提供了用于检测玉米转化事件的试剂盒或微阵列，其包含选自特异性识别SEQ ID No:1和/或SEQ ID No:2所示的核苷酸序列或其片段或其变体或其互补序列的引物或探针，以及特异性识别SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列或其片段或其变体或其互补序列的引物或探针；或者选自SEQ ID No:5和SEQ ID No:6以及SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的核苷酸序列或其互补序列。

进一步地，本申请还提供了本申请的引物或探针或者本申请的试剂盒或微阵列在检测玉米转化事件中的应用。

因而，本申请还涉及检测玉米转化事件的方法。

在一实施方案中，所述检测玉米转化事件的方法包括采用本申请的引物或探针或者采用本申请的试剂盒或微阵列来检测待测样品中是否存在所述玉米转化事件。

在具体实施方案中，所述检测玉米转化事件的方法包括以下步骤：1)提取待测样品的总DNA；2)以步骤1)提取的总DNA为模板，采用权利要求7所述的引物或探针或者采用权利要求8所述的试剂盒或微阵列来进行PCR扩增、实时PCR扩增、或Southern杂交；3)分析步骤2)的PCR扩增产物，实时PCR扩增曲线或Southern杂交结果，以确定待测样品中是否存在所述玉米转化事件。

此外，本申请还提供了对玉米进行育种的方法。

在一实施方案中，本申请提供对玉米进行育种的方法包括以下步骤：1)利用本申请创制玉米转化事件的方法来获得包含转化事件的玉米；2)将步骤1)所获得的玉米与另一玉米品系，例如野生型玉米自交系或其他玉米转化事件，进行杂交和回交；3)对步骤2)所获得的植株进行抗除草剂和抗虫鉴定，并利用本申请的检测玉米转化事件的方法来检测其中是否存在所述玉米转化事件。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例所涉及的玉米品种材料均由中国种子集团提供，其中玉米自交系祥249为玉米品种长城799的母本，是以国外引进的玉米种质资源为材料，用系谱法自交分离和严格选择，经过10个世代，于1996年选育而成；玉米自交系郑58为玉米优势品种郑单958(审定编号为国审玉20000009)的母本；玉米自交系A188为引自美国的自交系，因其较高的愈伤组织诱导能力而被广泛应用于玉米遗传转化。

实施例1玉米转化事件M00595A006a的获得及分子检测

剥取授粉10天左右，大小约为1mm的玉米自交系祥249幼胚，用含有所构建的转化载体pZHZH35005的农杆菌侵染后共培养3天，休息6天。接下来，分别用含5mg/L、8mg/L双丙胺膦的培养基各筛选1轮。筛选得到的抗性愈伤分化成苗，生根后转入土中生长并取样进行分子检测。

分子检测结果显示，送样编号为2334的T0代转化苗外源基因cry1C的RQ值为0.62，而野生型对照样品的RQ值为0，骨架元件Ori扩增的Ct值为30，因此该转化苗为阳性，低拷贝，无骨架的优质转化事件，实时PCR的扩增曲线如图2所示。进一步地，以epsps基因设计探针，用限制性内切酶HindIII酶切样品基因组，进行Southern杂交，结果显示杂交条带为单一条带。理论上，HindIII酶切杂交获得的条带应该大于3.6Kb，实际获得的杂交条带大小为10Kb左右，符合预期，因此可以确认该转化事件为单位点单拷贝插入，如图3所示。由此，获得玉米转化事件M00595A006a。在智能化温室中完成栽培管理和授粉工作，3个月后收获T1代种子。

具体操作流程如下：

1、基因优化

利用Vector NTI软件对bar基因编码序列进行玉米密码子偏好性优化，并在5’端添加表达增强元件omega sequence，改造后的DNA序列命名为barsyn；委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成barsyn序列，5’端添加SalI，BamHI酶切位点，3’端添加SacI，XhoI酶切位点，合成好的序列克隆在Puc57simple载体上，命名为pZZ01148。

2、载体构建

构建含Tocs片段(5’端带有EcoRI位点，3’端带有PmeI，EcoRI位点)的载体，命名为pZZ01132。EcoRI单酶切处理pZZ01132，T4-DNA聚合酶补平酶切产生的粘末端，将获得的Tocs片段连入XhoI单酶切和T4-DNA聚合酶处理后的pZZ01148的切口处，获得含有barsyn-Tocs的载体，命名为pZZ01145。

构建含35s启动子(5’端带有SalI，HindIII位点，3’端带有BamHI位点)的载体，命名为pZZ01143。SalI+BamHI处理pZZ01143获得35s启动子片段。

SalI+BamHI处理pZZ01145，切口处连入35s启动子，获得含有35s-barsyn-Tocs的载体，命名为pZZ01146。

构建以pCambia3300(带有Ubi-epsps-T35spolyA元件)为骨架，带有HindIII，PmeI单酶切位点的骨架载体pZZ00002。

HindIII+PmeI处理pZZ01146载体，获得35S-barsyn-Tocs片段。HindIII+PmeI处理pZZ00002载体，切口处连入35S-barsyn-Tocs，获得含有35S-barsyn-Tocs和Ubi-epsps-T35spolyA两个表达元件的表达载体，命名为pZHZH35004。

构建含有Rbcs-cry1C-Tocs(5’端带有PacI位点，3’端带有PmeI位点)的载体pZZ01125。PacI+PmeI处理pZZ01125获得Rbcs-cry1C-Tocs片段，T4-DNA聚合酶补平酶切产生的粘末端。PmeI处理pZHZH35004，切口处连入Rbcs-cry1C-Tnos。获得含有Rbcs-cry1C-Tocs，35S-barsyn-Tocs和Ubi-epsps-T35spolyA三个表达元件的转化载体，命名为pZHZH35005，该载体为本发明首次成功构建的，其结构示意图如图1所示。

以下遗传转化方法、分子鉴定方法及Southern印迹检测的具体操作步骤可参见中国专利申请CN104745622A，在此简述如下。

3、遗传转化

将转化载体pZHZH35005通过电击法转入农杆菌EHA105-中。

将新鲜剥取的自交授粉后10天的玉米自交系祥249幼胚放入悬浮液的塑料离心管中；吸去悬浮液后加入农杆菌悬浮液侵染，倒入共培养基上于23℃黑暗共培养3天。

共培养后，将幼胚转移到休息培养基中，于28℃黑暗培养6天后，放至含双丙胺膦的培养基筛选一个月。

将抗性愈伤组织转移至分化培养基中；将分化出的小苗转移至生根培养基上，光照培养至生根；将小苗转入小盆中生长，同时取样用于分子检测。

4、分子鉴定

T0代转化苗的分子检测包括阳性、拷贝数和骨架检测。

采用天根试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)对玉米基因组DNA进行抽提。实时PCR反应体系如下表所示，其中内参基因IVR的正向和反向引物如SEQ ID No:9和SEQ ID No:10所示；目标基因cry1C的正向和反向引物如SEQ ID No:11和SEQ ID No:12所示；骨架片段ORI的正向和反向引物如SEQ ID No:13和SEQ ID No:14所示。PCR反应在ABI7900上进行，反应程序：如下：95℃预变性10min；95℃变性10s；60℃复性与延伸55s，30个循环。

实时PCR反应完成后，根据仪器生成的内参基因和目标基因的平均Ct(扩增循环数)值，根据公式RQ＝2^-ΔCt计算对应样本的RQ值。内参基因IVR为玉米单拷贝基因，根据RQ值，可以计算出目的基因的相对拷贝数。对高世代的转化事件进行基因分型的方法同上，单拷贝杂合RQ值为0.5左右，双拷贝纯合RQ值为1.0左右。

5、Southern印迹检测

Southern杂交探针标记及杂交与显影采用Roche公司的DIG High Primer DNALabeling and Detection Starter Kit I。具体实验方法如下：

步骤1.CTAB法抽提转化植株总基因组DNA。

取叶片0.5-1g，放入预冷的研钵中，加入液氮快速将叶片研磨成粉末，倒入2mL离心管中。加入700uL预热至65℃的1.5％CTAB提取液并摇匀，65℃水浴保温30-60min，期间摇动几次；室温冷却后，加入700uL氯仿，摇匀后，颠倒轻摇10min，室温下8000rpm离心10min；移上清至另一离心管，加入等体积的沉淀液(异丙醇)，-20℃下沉淀30分钟，室温下8000rpm离心10min；用700μL 75％乙醇漂洗2-3次，风干后溶于50μL TE中-20℃保存备用。

步骤2.基因组DNA的酶切。

选用限制性内切酶Hind III酶来酶切总基因组DNA，酶切反应体系如下表，混匀后37℃酶切24h左右，酶切后先取少量进行预电泳检测酶切效果，然后用酶切好的总DNA在1％的琼脂糖凝胶中进行低电压(30-40V)电泳过夜，使DNA充分分开。

步骤3.转膜。

将凝胶修整后切去右下角作为标记，浸泡在0.25mol/L HCl至溴酚蓝变黄，蒸馏水洗两次；碱变性液[1.5M NaCl，0.5M NaOH]中变性45min，去离子水漂洗；中和液[1M Tris-HCl(PH7.4)，1.5M NaCl]中漂洗30min，更换中和液漂洗15min；置于搭好的转膜台上，用10×SSC溶液作为转膜液，Hybond-N+尼龙膜漂洗于去离子水液面，直至完全湿润，浸入转移缓冲液中；用10×SSC溶液进行毛细管法转移16-20h，将胶上的DNA转移到尼龙膜上。转移结束后，将尼龙膜用2×SSC溶液简单漂洗后，紫外交联仪上交联1min后，室温晾干，用保鲜膜将膜包好，4℃下保存备用。

步骤4.探针扩增与标记。

探针扩增：以epsps基因设计探针，引物序列如SEQ ID No:15和SEQ ID No:16，所示，探针长度为856bp，探针序列如SEQ ID No:17所示。

探针标记：取1μg或者(10ng-3μg)回收的探针DNA，加灭菌ddH₂O至16μl；PCR仪95℃，10分钟，迅速放冰上；加入4μl DIG-HighPrime短暂离心；37℃PCR仪或水浴1h或者过夜；65℃，10分钟或者加入2μl 0.2mol/L EDTA(PH 8.0)以终止反应。

步骤5.探针效率检测。

将已完成标记的探针，稀释成8个浓度梯度；每个稀释度各取1μl点于尼龙膜上，120℃下烘30分钟；将膜放入杂交管，在杂交管中加入20ml马来酸，杂交炉里室温转动2分钟；倒掉马来酸，加入10ml 1×封闭液，室温转动30分钟；倒掉1×封闭液，加入10ml抗体溶液(Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments)，室温转动30分钟；倒掉抗体溶液，加入20ml洗涤液，室温转动15分钟；倒掉洗涤液，加入10ml检测缓冲液，室温转动2-5分钟；随后将膜用镊子轻轻取出，放入封口袋，在袋中加入2ml显影液(NBT/BCIP Stock Solution)，5-10分钟暗处显影，忌摇动。显色适时，将膜放于TE或ddH₂O中浸泡冲洗。

步骤6.杂交。

加热杂交液DIG Easy Hyb(10ml/100cm²)，在杂交炉中42℃下预杂交30分钟；95℃下变性探针(25ng/ml)，5分钟后置于冰上；将变性探针加入到预先加热的DIG Easy Hyb中(3.5ml/100cm²)，混匀；倒掉预杂交液，加入含有变性探针的杂交液；杂交炉中42℃下杂交14小时。

步骤7.洗膜与显色。

倒掉杂交液，然后用2×SSC，0.1％SDS室温下洗涤两次，每次5分钟；最后用0.5×SSC，0.1％SDS，65℃下洗涤两次，每次15分钟。显色方法同探针效率检测操作。

实施例2玉米转化事件M00595A006a的繁育及田间表现

如实施例1所述，本实施例转化事件的受体材料为玉米自交系祥249，在获得T0代的转化事件(单拷贝插入且无载体骨架污染)后，种植管理，开花期以该转化事件为母本，优良骨干野生型玉米自交系郑58为父本，杂交获得T1代的F1种子。之后，将T1代种子发芽，喷施草铵膦，选取草铵膦抗性和敏感植株符合孟德尔遗传规律的株系，取样检测基因型，选取目标单株与作为父本的郑58回交，收获T2代的BC1F1种子；之后，将T2代种子种植，在心叶期鉴定对玉米螟的抗性，选取抗虫性好且农艺性状接近轮回亲本的株系与作为母本的郑58回交，收获T3代的BC2F1种子。

也就是说，将玉米转化事件M00595A006a在温室大棚中连续繁育3代，依据玉米植株对草铵膦的耐性表现考察其分离比情况。考察结果显示，连续3个世代的分离比均接近1:1，卡方检验显示符合孟德尔遗传规律；同时，每个世代的RQ值均接近0.5(如表1所示)。可见，玉米转化事件M00595A006a为单拷贝且遗传稳定的优质事件。

表1.玉米转化事件M00595A006a T1-T3代草铵膦耐性分离比值与RQ值

草铵膦涂抹实验显示，所获得的玉米转化事件M00595A006a具有耐受推荐田间浓度(有效成分为18％草铵膦可溶液剂稀释100倍)的效力。田间除草剂耐性及敏感表现型如图4所示，其中A为玉米转化事件M00595A006a的T3代阳性分离单株(转基因玉米)的叶片；B为玉米转化事件M00595A006a的T3代阴性分离单株(敏感材料)的叶片。图片显示，阳性株在草铵膦涂抹5天后未见明显变化，生长正常，而阴性单株叶片在涂抹处干枯，出现明显药害症状。

玉米螟活体接虫试验显示，玉米转化事件M00595A006a的食叶级别均值为3.1，为玉米螟抗性转化事件(如图5A所示)；对照转化受体祥249的食叶级别均值为5.4，为中抗玉米自交系(如图5B所示)；对照野生型玉米自交系A188的食叶级别均值为9.0，为高感玉米自交系(如图5C所示)。方差分析显示3个样本的食叶级别差异达极显著水平(p＝9.27E-21)，方差分析数据见表2。

表2.玉米转化事件和对照材料食叶级别的方差分析

具体操作步骤如下：

步骤1.草铵膦耐性鉴定。喷施所用除草剂保试达为拜耳作物科学(中国)有限公司生产，有效成分为18％草铵膦可溶液剂，生产批号为20111122781。草铵膦耐受性鉴定浓度的确定：该除草剂的推荐用量为150-300ml/亩(兑水30-40公斤)，即稀释100-267倍，因此本实施例采用100倍稀释的保试达溶液涂抹心叶期(6～8片完全展开叶)玉米转化事件的倒二叶(剪去叶尖作为考察标记)。4-5天后观察并记录除草剂耐性表现。

步骤2.分离比考察。依据除草剂草铵膦的耐性表现，考察并记录转化事件除草剂耐性和敏感分离情况，通过卡方检验确定分离比是否符合孟德尔遗传与分离规律。

步骤3.玉米螟抗性鉴定。在玉米植株生长发育至心叶中期进行接虫，每个转化事件接虫10-20株。将2块黑头期卵块放入离心管中，用脱脂棉塞住管口。将离心管放入28℃、湿度80％的培养箱中，或置于室温条件下盖上湿毛巾保湿，待卵块孵化后将脱脂棉拔掉，投放入心叶丛中。接虫2-3周后逐株调查植株心叶的被害程度，根据被害叶片上的虫孔大小和多少划分受害等级，称为食叶级别。目前国际上大多采用国际玉米螟协作组制定的9级分级标准(表3)。逐株调查食叶级别，以各株平均值作为供鉴定品系的食叶级别，在收获前调查蛀孔，并根据表3的评价标准确定其抗螟性级别。

表3玉米抗螟性田间鉴定评价标准

注：*蛀茎隧道2.5cm为1个孔。

**HR：高抗；R：抗；MR：中抗；S：感；HS：高感

实施例3玉米转化事件M00595A006a的左(5’)和右(3’)侧翼序列的分离

一般而言，检测转基因植物的DNA引物序列和方法简单并且一致，这些检测方法通常集中在频繁使用的基因表达元件，如启动子、终止子和标记基因，因为对于许多转化载体而言，编码序列区是可互换的。因此，这些方法并不能用于区分仅编码序列不同的构建体，也不能用于区分不同的转化事件，特别是那些使用相同的转化载体产生的事件，除非与插入的异源DNA相邻的染色体DNA即“侧翼DNA”的序列已知。

为此，本实施例通过Adaptor-PCR分离并鉴定了玉米转化事件00595A006a的5’侧翼序列。

经基因组DNA抽提、酶切、接头连接、两轮PCR以及PCR产物的T克隆测序以后，获得玉米转化事件M00595A006a的5’侧翼玉米基因序列105bp，转化载体序列267bp，共计372bp如SEQ ID No.3所示。MaizeGDB数据库分析显示，该插入位点位于玉米第9号染色体的116244682处(chr9:116244787-116244682；evalue＝1.7e-46)。进一步分析显示，插入位点位于功能基因GRMAM2G013002(chr9:116241684-116244580)下游103bp处和功能基因GRMZM2G313963(chr9:116247701-116250993)上游3020bp处，推断对玉米功能基因无影响。

进一步地，根据已获得的左侧(5’)基因组DNA序列，并结合MaizeGDB数据库分析结果，设计引物扩增右侧(3’)基因组DNA序列。其右侧(3’)基因组DNA序列如SEQ ID No:4所示，其引物序列如SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示。分离和鉴定5’侧翼或3’侧翼序列的具体步骤如下：

步骤1.用2mL离心管法制备基因组DNA备用。

步骤2.用ddH2O将接头引物SP1(如SEQ ID No:18所示)和SP2(如SEQ ID No:19所示)分别稀释到100μmol/L，等体积混合，94℃水浴变性4min，自然冷却至室温后即为50μmol/L的接头。

步骤3.在灭菌的0.5mL离心管中加入下列反应体系，室温(25℃)孵育16h：反应结束后65℃水浴10min终止反应。

步骤4.以步骤3中的酶切连接产物作为第一轮PCR反应的模板，反应体系如下表，epsps156为分离T-DNA左端侧翼序列的引物(如SEQ ID No.20所示)。反应程序为：94℃，5min；(94℃，30sec；72℃，3min)×7个循环；(94℃，30sec；67℃，3min)×32个循环；67℃，7min；25℃，10min。

步骤5.以步骤4中相应的PCR产物为模板对T-DNA左端的侧翼序列进行第二轮PCR扩增，反应体系如下表，epsps 27为分离T-DNA左端侧翼序列的引物(如SEQ ID No:21所示)。反应程序为：94℃，5min；(94℃，30sec；72℃，3min)×5个循环；(94℃，30sec；67℃，3min)×20个循环；67℃，7min；25℃，10min。

步骤6.取5μL第二轮PCR的产物于1％(w/v)0.5×TBE琼脂糖凝胶中电泳检测，挑选有250bp以上DNA片段的PCR产物用双脱氧链终止法进行测序。

步骤7.在MaizeGDB数据库中(http://www.maizegdb.org/)用测序结果对玉米基因组序列进行同源搜索，以最好的匹配结果为插入位点。

实施例4玉米转化事件M00595A006a侧翼序列的应用

根据插入序列及其5’和3’侧翼玉米基因组序列设计特异性检测引物。

经筛选，采用如SEQ ID No:5和SEQ ID No:6以及SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的特异性引物进行PCR扩增时，水、非转基因植株、非该转化事件的样品均无扩增条带，只有转化事件M00595A006a亲本、杂种F1和后代及其叶片、种子的DNA扩增序列分别有特异性621和705bp目的条带，其核苷酸序列如SEQ IDNo:22和SEQ IDNo:23所示。

测序验证并与MaizeGDB数据库比对发现：SEQ IDNo:22的1-211bp与插入的表达载体pZHZH35005左边界225-17bp区间序列同源性为100％,212-621bp与玉米9号染色体116244680-116245091bp区间序列同源性为100％；SEQ IDNo:23的1-362bp与插入的表达载体pZHZH35005右边界576-940bp区间序列同源性为99％(右边界缺失47bp),363-705bp与玉米9号染色体116244652-116244309bp区间序列同源性为99％。

本实施例表明，利用转化事件M00595A006a的5’和/或3’侧翼序列进行PCR检测，可以特异性地检测该转化事件的亲本、杂种F1和后代及其制品。

侧翼序列的检测具体步骤如下：

利用玉米转化事的侧翼基因组序列和外源片段中的epsps和Cry1C序列设计3-5对引物，建立该转化事件及其衍生产品的定性PCR鉴定方法。

依据转化事件M00595A006a外源片段整合位点5’端玉米基因组设计的引物为5’-TATAGGGTTTCGCTCATGTG-3’(SEQ ID No:5)，依据epsps序列设计的引物为5’-TGGGCAATTCATGAAGATCA-3’(SEQ ID No:6)。玉米基因组DNA采用CATB法提取。PCR反应程序为95℃5min，(94℃30s，55℃30s，72℃1min)35个循环，72℃7min。

依据转化事件M00595A006a外源片段整合位点3’端玉米基因组设计的引物为5’-TCAATTTCAAAAGTGCCCC-3’(SEQ ID No:7)，依据epsps序列设计的引物为5’-ATACAAACAAGAAGTGGGCA-3’(SEQ ID No:8)。玉米基因组DNA采用CATB法提取。PCR反应程序为95℃5min，(94℃30s，60℃30s，72℃1min)35个循环，72℃7min。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.核酸分子，其包含选自SEQ ID No：3或SEQ ID No：4所示的核苷酸序列或其互补序列。

2.用于检测玉米转化事件的引物或探针，其选自特异性识别SEQ ID No：1和/或SEQ IDNo：2所示的核苷酸序列的引物或探针，以及特异性识别SEQ ID No：3和/或SEQ ID No：4所示序列的引物或探针。

3.如权利要求2所述的引物或探针，其中所述引物或探针选自SEQ ID No：5和SEQ IDNo：6以及SEQ ID No：7和SEQ ID No：8所示的核苷酸序列或其互补序列。

4.用于检测玉米转化事件的试剂盒或微阵列，其包含权利要求2或3所述的引物或探针。

5.权利要求2或3所述的引物或探针或者权利要求4所述的试剂盒或微阵列在检测玉米转化事件中的应用。

6.检测玉米转化事件的方法，其包括采用权利要求2或3所述的引物或探针或者采用权利要求4所述的试剂盒或微阵列来检测待测样品中是否存在所述玉米转化事件。

7.如权利要求6所述的方法，其包括以下步骤：

1)提取待测样品的总DNA；

2)以步骤1)提取的总DNA为模板，采用权利要求2或3所述的引物或探针或者采用权利要求4所述的试剂盒或微阵列来进行PCR扩增、实时PCR扩增、或Southern杂交；

3)分析步骤2)的PCR扩增产物，实时PCR扩增曲线或Southern杂交结果，以确定待测样品中是否存在所述玉米转化事件。

8.对玉米进行育种的方法，所述方法包括以下步骤：

1)利用创制玉米转化事件的方法获得包含转化事件的玉米，所述创制玉米转化事件的方法包括将核酸分子作为外源插入核酸分子导入玉米的基因组中，所述核酸分子包含SEQID No：1和SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，或其互补序列；

2)将步骤1)所获得的玉米与另一玉米品系进行杂交和回交；

3)对步骤2)所获得的植株进行抗除草剂和抗虫鉴定，并利用权利要求6或7所述的方法来检测其中是否存在所述转化事件。

9.如权利要求8所述的方法，其包括采用包含所述核酸分子的表达载体，优选如图1所示的表达载体，或包含所述核酸分子或所述表达载体的宿主细胞，优选微生物细胞，更优选农杆菌来获得所述包含转化事件的玉米。

10.如权利要求8或9所述的方法，其中所述创制玉米转化事件的方法包括以下步骤：

1)改造草铵膦抗性基因bar；

2)人工合成草铵膦抗性基因bar和螟虫抗性基因cry1C；

3)将步骤2)中合成的基因与草甘膦抗性基因epsps一起构建到同一表达载体中；

4)将步骤3)中构建的表达载体通过农杆菌介导的转化方法导入到玉米中；

5)对步骤4)中获得的玉米转化体进行分子鉴定，选取单拷贝插入的植株，

任选地，在步骤4)中，将步骤3)中构建的表达载体通过农杆菌介导的转化方法导入玉米的种子、花粉、雌蕊、叶、根、或茎中。

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