CN112899392B - 用于转基因抗虫抗草甘膦棉花的特异性鉴定分子标记的引物组及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于转基因抗虫抗草甘膦棉花的特异性鉴定分子标记的引物组及其应用。所述的引物组包括两对引物对，分别为引物对ZJG80LB和引物对ZJG80rb；引物对ZJG80LB的序列为如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；引物对ZJG80rb的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。本发明设计构建了引物对ZJG80LB和ZJG80rb，能特异性识别特定的抗虫抗草甘膦棉花ZJG80中的外源基因及其棉花种类。

Description

用于转基因抗虫抗草甘膦棉花的特异性鉴定分子标记的引物 组及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域的一种引物组及其应用，具体涉及了一个新型抗虫抗草甘膦棉花株系ZJG80及用于其鉴定的特异性分子标记。

背景技术

苏云芽孢杆菌(Bacillus thuringeinsis，Bt)合成的昆虫内毒素可以专门破坏棉铃虫等鳞翅目害虫的消化系统，而对人畜无害。因此，通过基因工程，我国早在1995年自主研制成功了抗虫棉，目前Bt抗虫棉在我国推广已有20余年。然而近年来，有研究相继报道目标昆虫产生Bt抗性，新型抗虫棉研发势在必行。不同类型的抗虫基因叠加技术是提高抗虫性的有效方法之一，国外已经开始了多基因堆叠的第二代转基因作物开发。

Bt蛋白作为一类生物杀虫剂，由于其残留少、对靶标昆虫的专一性以及对非靶标生物的安全性等优越性能被广泛应用于农业生产中。Bt菌在不同的生长阶段可以分泌出不同类型的杀虫毒素。在孢子形成期和平台生长期，Bt菌合成并分泌晶体蛋白(Crystalproteins,Cry)和细胞裂解素(Cytolytic proteins,Cyt)；而在营养生长期，则合成营养期杀虫蛋白(Vegetative insecticidal proteins,Vips)和分泌型杀虫蛋白(Secretedinsecticidal proteins,Sips)。根据Bt毒素命名委员会的统计，目前发现并命名的Bt毒素家族成员已超过300个，且每年在不断增加。目前已有几十种Cry和Cyt蛋白被报道具有杀虫活性，而应用较广的Vip3蛋白单Vip3Aa型就超过60种。Bt蛋白种类之繁多，不同类型的蛋白在氨基酸序列、蛋白质分子量大小、蛋白质形态上和杀虫谱等的差异之大，是植物抗虫基因工程丰富的资源库。

草甘膦是一种广谱性的传导型低毒除草剂，可经茎叶吸收，后传导至植物的其它部位，能有效杀除一年生或多年生的单、双子叶杂草和灌木等。与铝、铁等金属离子结合可使其失活，因此对土壤中的种子和土壤微生物没有不良影响。草甘膦对动物低毒，在动物体内不蓄积，在试验条件下，未见三致作用(致畸、致突变、致癌)。由于草甘膦结构简单，生产成本不高，且对环境安全，使得它成为目前国际上使用最为广泛的除草剂之一。在基因工程实践中，抗草甘膦基因代替抗生素筛选标记已成为一种高效的阳性植株的筛选方式，在拟南芥等模式植物中早有应用。棉花是一种草甘膦不耐的经济作物。早在1994年美国孟山都公司就培育出了抗草甘膦的转基因棉花，而我国在转基因抗草甘膦棉花的自主研发上依旧存在很大空缺。

对于转基因作物而言，其外源基因的插入位置是基因组重组后重要的分子特征。明确外源基因的插入位点，开发特异性识别插入位点的分子标记，是转基因安全评价的一个重要内容，也是品种鉴定的一个重要手段。

综上所述，自主研发多基因叠加的下一代抗虫抗草甘膦棉花将在我国棉花产业的发展中发挥重要作用，而开发特异性的分子鉴定标记用于我国自主知识产权的保护工作亦刻不容缓。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种用于鉴定抗虫抗草甘膦棉花ZJG80株系的特异性分子标记的引物组及其鉴定方法。

本发明所采用的技术方案是：

利用已鉴定到的ZJG80株系中的外源基因的插入位置信息，通过生物信息学和分子生物学方法设计出了能特异性识别该株系的两对引物对，使用这两对引物对棉花DNA进行聚合酶链式反应，反应产物经琼脂糖凝胶成像鉴定后，可直观区分ZJG80株系。

所述的引物组包括两对引物对，分别为引物对ZJG80LB和引物对ZJG80rb；

引物对ZJG80LB的序列为：5’-TGAAGCAATCCATCATCTCTTAGAA-3’和5’-CTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAG-3’，分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

引物对ZJG80rb的序列为5’-TGACATGCGCTAACCATCCT-3’和5’-GAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTT-3’，分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

本发明的引物组能用于在特异性鉴定新型抗虫抗草甘膦棉花的分子标记。

所述的转基因抗虫抗草甘膦棉花具体为抗虫抗草甘膦棉花ZJG80，抗虫抗草甘膦棉花ZJG80是在棉花的基因组中转入两个外源基因而获得，两个外源基因分别抗草甘膦基因Gh1174D和抗虫融合基因，分别如SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6。

所述的抗虫融合基因是由抗虫基因Cry1Ac和抗虫基因Vip3Da连接融合构成的融合基因。

本发明的分子标记是指两个外源基因插入到棉花的基因组中的位置。

两个外源基因插入到棉花的基因组中的位置为棉花D亚组13号染色体第46719962nt处。

所述的引物对ZJG80LB用于识别外源基因插入位置左侧的核苷酸序列，插入位置左侧的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

所述的引物对ZJG80rb用于识别外源基因插入位置右侧的核苷酸序列，插入位置右侧的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明基于现有组培技术和分子生物学技术，将三个外源基因导入陆地棉，形成新型抗虫抗草甘膦棉花品系，命名为ZJG80。

本发明的棉花ZJG80也是一种新型的基因叠加的抗虫抗草甘膦棉花，是一种下一代抗虫抗草甘膦棉种，也提供了新的种质资源。

本发明的有益效果在于：

两对分子标记ZJG80LB和ZJG80rb能特异性识别新型抗虫抗草甘膦棉花ZJG80。ZJG80LB可特异性识别外源基因在ZJG80基因组中插入位置的左侧信息，ZJG80rb可特异性识别外源基因在ZJG80基因组中插入位置的右侧信息，两对分子标记同时使用可鉴定出材料中外源基因的完整性，为今后抗虫抗草甘膦棉的育种提供了可靠便捷的分子鉴定方法；此外，任何含有这两对或其中一对分子标记的材料，均可视为ZJG80株系后代，为棉花种质资源的溯源提供了分子标签。

附图说明

图1为重组质粒示意图；

图2为棉花ZJG80目的基因PCR鉴定；Z49为非转基因棉花对照；1，2，3代表三个不同单株；

图3为A图Gh1174D基因的southern blot结果，基因组为HindIII单酶切；B图是Cry1AcVip3Da融合基因southern blot结果，基因组为EcoR I单酶切；M：Marker；1：阳性质粒；2：阴性对照；3：ZJG80株系；4-9：同批次的其他转基因株系；

图4为ZJG80株系叶片中外源基因的相对表达量结果图；

图5为目标蛋白抗体试纸条测试结果示意图；

图6为为分子标记ZJG80LB和ZJG80rb特异性鉴定棉花ZJG80株系图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式来进一步说明本发明。

本发明的实施例如下：

1、转基因棉花的获得

1.1)载体构建和转化

a)先将抗虫基因Cry1Ac和Vip3da通过重叠PCR将两个基因融合获得抗虫融合基因CVBt，再将抗虫融合基因CVBt和抗草甘膦基因Gh1174D通过酶切连接的方法，连接至pCAMBIA-1300载体(启动子分别为CaMV35s和nsCsVMV)，从而获得重组表达载体(见图1)。抗草甘膦基因Gh1174D、抗虫融合基因CVBt的两个外源基因序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

b)将以上构建好的重组表达载体转化农杆菌(EHA105)，经组培技术由农杆菌介导转化入受体棉花G.hirsutum Z49，形成抗虫抗草甘膦棉花ZJG80。具体实施中但不限于棉花G.hirsutum Z49。

同时以不转入任何外源基因的受体棉花G.hirsutum Z49作为对照组，称为受体Z49。

1.2)转基因棉花ZJG80株系基因组鉴定

转基因成苗先通过喷施草甘膦的方法鉴定出抗草甘膦ZJG80的株系，然后分别提取抗性苗的DNA，并进行Gh1174D、Cry1Ac和Vip3da三个基因PCR鉴定。

如图2所示，选取ZJG80株系的3个单株和受体陆地棉(Z49)的3个单株分别进行目的基因PCR，并以陆地棉UBQ管家基因作为内参，结果表明ZJG80株系中含有Gh1174D、Cry1Ac和Vip3da三个基因，而对照组受体Z49中均不含有。使用地高辛标记探针进行Southernblotting(图3)，表明ZJG80株系含有单拷贝目标外源插入基因。

1.3)ZJG80株系外源基因表达情况

对ZJG80株系叶片进行目标基因表达的定量检测，并以Z49为阴性对照，UBQ为内参基因。在ZJG80株系中，三个外源基因Gh1174D、Cry1Ac和Vip3da均表达，尤其Gh1174D表达量显著高于其他两个基因。而在对照组受体Z49中三个基因基本不表达(图4)。

进一步使用抗体试纸条检测目标蛋白的表达情况，结果显示抗草甘膦蛋白和抗虫蛋白均在ZJG80中表达，而在对照组受体Z49中均检测不到(图5)。

2、外源基因插入位点侧翼序列的鉴定及特异性分子标记的设计

要设计针对ZJG80株系的特异性分子标记，首先要弄清楚ZJG80中外源基因插入的位置。本发明采用FPNI-PCR(fusion primer and nested integrated PCR)技术对ZJG80外源基因插入位点侧翼序列进行鉴定。

经核苷酸测序确定，ZJG80株系中外源基因的插入位点位于棉花D亚组13号染色体第46719962nt处，并且经过数次重复实验和多代实验，该插入位点位置唯一。

根据外源基因两侧序列以及ZJG80株系基因组上插入位点的侧翼序列，利用本发明设计的插入位点两侧的特异性引物对ZJG80LB和ZJG80rb特异性识别棉花ZJG80株系，同时也对非转基因对照组(Z49)和其他类型的转基因株系ZJB75(另一个含有和本发明相同外源基因的转基因抗虫抗草甘膦棉株系，但插入位点不同)进行特异性识别处理。

特异性识别鉴定的过程具体为：

(1)使用CTAB法分别提取ZJG80、ZJB75和Z49的叶片DNA

(2)使用引物对ZJG80LB和ZJG80rb对以上DNA分别进行PCR扩增，并以UBQ为内参基因监测DNA质量。扩增体系为50μL体系中包含50ng DNA、每种dNTP各0.2mM、每条引物各0.4μM、0.2U Taq DNA polymerase(TaKaRa,Japan)。扩增条件为94℃预变性3min，热循环体系为94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延申30s，循环数为30个，最后72℃延申2min。

(3)PCR扩增产物使用1％琼脂糖凝胶进行电泳，经GelRed核酸染料浸染后，由凝胶成像仪紫外曝光显色，并拍照。

通过实验发现，引物对ZJG80LB和ZJG80rb对ZJG80株系基因组处理后能扩增出目的片段，对非转基因对照组(Z49)和其他类型的转基因株系ZJB75不能扩增出目的片段(图6)。从而可以针对待测株系实现是否为转基因抗虫抗草甘膦棉株系ZJG80的识别和鉴定。

引物对ZJG80LB识别外源基因插入位置左侧的核苷酸序列(SEQ ID NO.7)，引物对ZJG80rb识别外源基因插入位置右侧的核苷酸序列(SEQ ID NO.8)。

本发明涉及的基因核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.1

名称：引物对ZJG80LB的引物一基因序列

来源：人工合成

tgaagcaatccatcatctcttagaa

SEQ ID NO.2

名称：引物对ZJG80LB的引物二基因序列

来源：人工合成

ctcatgtgttgagcatataagaaacccttag

SEQ ID NO.3

名称：引物对ZJG80rb的引物一基因序列

来源：人工合成

tgacatgcgctaaccatcct

SEQ ID NO.4

名称：引物对ZJG80rb的引物二基因序列

来源：人工合成

gaagaggcccgcaccgatcgccctt

SEQ ID NO.5

名称：抗草甘膦基因Gh1174D

来源：耐辐射奇球菌(Deinococcus Radiodurans)

ctcgagtcaacacaacatatacaaaacaaacgaatctcaagcaatcaagcattctacttctattgcagcaatttaaatcatttcttttaaagcaaaagcaattttctgaaaattttcaccatttacgaacgatagccatggctcaagttagcagaatctgcaatggtgtgcagaacccatctcttatctccaatctctctaaatccagtcaaaggaaatctcccttatcggtttctctgaagactcagcagcatccacgagcttatccaatttcttcatcttggggattgaagaagagtgggatgactttaattggctctgagcttcgtcctcttaaggtcatgtcttctgtttccacggcggagaagggatccgacgctcttccagctaccttcgacgttatcgtgcatccagctagagaactcagaggtgaacttagagcacagccatccaagaactacaccactagatacctcctcgccgctgctctcgctgagggtgaaaccagagttgttggtgtggctacctctgaggatgccgaagctatgctcagatgcctcagagattggggtgctggtgttgagcttgttggtgatgacgccgtgatcagaggtttcggtgctagaccacaggctggtgttacccttaacccaggtaacgctgctgcggtggccagactccttatgggtgttgctgctctcacctctggtacaactttcgttaccgattaccctgattcccttggtaagagacctcagggtgaccttcttgaagccctcgaaagacttggtgcttgggtgtcctccaacgatggtagactccctatctccgtttccggtccagttagaggtggtacagtggaggtttccgccgaaagatcctcccagtacgcttccgccttatgttcctcggtcctcttcttcctgacggactcgaacttagactcaccggtgatatcaagtcccacgctcctcttagacagacacttgacaccctctctgatttcggtgttagagctactgcctccgatgaccttagaagaatctccatccctggtggtcagaagtacagaccaggtagagtgctcgttcctggtgattaccctggttccgctgctatccttaccgccgctgctcttctcccaggtgaggttagactttctaaccttagagaacacgacctccagggtgagaaggaagctgtgaacgttcttagagagatgggtgctgatatcgttagagaaggtgatacccttaccgtgagaggtggtagacctctccacgctgttactagagatggtgattccttcaccgacgccgtgcaagctcttaccgctgctgctgccttcgctgagggtgataccacctgggaaaacgttgctactcttagactcaaggaatgcgatagaatctctgacaccagagctgagcttgaaagacttggtcttagagcaagagagaccgccgattctctctccgttactggttctgctcaccttgctggtggtatcaccgctgatggtcacggtgaccacagaatgatcatgcttctcacccttcttggtctcagagcagatgctccacttagaatcaccggtgcacaccacatcagaaagtcctaccctcagttcttcgctcaccttgaagctcttggtgctagattcgaatacgctgaggctaccgcctaataggagctcgag

SEQ ID NO.6

名称：抗虫融合基因

来源：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

ggatccatggacaacaacccaaacatcaacgaatgcattccatacaactgcttgagtaacccagaagttgaagtacttggtggagaacgcattgaaaccggttacactcccatcgacatctccttgtccttgacacagtttctgctcagcgagttcgtgccaggtgctgggttcgttctcggactagttgacatcatctggggtatctttggtccatctcaatgggatgcattcctggtgcaaattgagcagttgatcaaccagaggatcgaagagttcgccaggaaccaggccatctctaggttggaaggattgagcaatctctaccaaatctatgcagagagcttcagagagtgggaagccgatcctactaacccagctctccgcgaggaaatgcgtattcaattcaacgacatgaacagcgccttgaccacagctatcccattgttcgcagtccagaactaccaagttcctctcttgtccgtgtacgttcaagcagctaatcttcacctcagcgtgcttcgagacgttagcgtgtttgggcaaaggtggggattcgatgctgcaaccatcaatagccgttacaacgaccttactaggctgattggaaactacaccgaccacgctgttcgttggtacaacactggcttggagcgtgtctggggtcctgattccagagattggattagatacaaccagttcaggagagaattgaccctcacagttttggacattgtgtctctcttcccgaactatgactccagaacctaccctatccgtacagtgtcccaacttaccagagaaatctatactaacccagttcttgagaacttcgacggtagcttccgtggttctgcccaaggtatcgaaggctccatcaggagcccacacttgatggacatcttgaacagcataactatctacaccgatgctcacagaggagagtattactggtctggacaccagatcatggcctctccagttggattcagcgggcccgagtttacctttcctctctatggaactatgggaaacgccgctccacaacaacgtatcgttgctcaactaggtcagggtgtctacagaaccttgtcttccaccttgtacagaagacccttcaatatcggtatcaacaaccagcaactttccgttcttgacggaacagagttcgcctatggaacctcttctaacttgccatccgctgtttacagaaagagcggaaccgttgattccttggacgaaatcccaccacagaacaacaatgtgccacccaggcaaggattctcccacaggttgagccacgtgtccatgttccgttccggattcagcaacagttccgtgagcatcatcagagcacctatgttctcttggatacatcgtagtgctgagttcaacaacatcatcgcatccgatagtattactcaaatccctgcagtgaagggaaactttctcttcaacggttctgtcatttcaggaccaggattcactggtggagacctcgttagactcaacagcagtggaaataacattcagaatagagggtatattgaagttccaattcacttcccatccacatctaccagatatagagttcgtgtgaggtatgcttctgtgacccctattcacctcaacgttaattggggtaattcatccatcttctccaatacagttccagctacagctacctccttggataatctccaatccagcgatttcggttactttgaaagtgccaatgcttttacatcttcactcggtaacatcgtgggtgttagaaactttagtgggactgcaggagtgattatcgacagattcgagttcattccagttactgcaacacttgaggctgagtacaaccttgagagagcccagaaggctgtgaacgccctctttacctccaccaatcagcttggcttgaaaactaacgttactgactatcacattgaccaagtgggtcccgggggtaaaggaaacaacaccaagctgaacgctagaactcttcctagtttcatcgactacttcaacggcatctacggtttcgctacaggtatcaaggacatcatgaacatgatcttcaagactgacacaggtggcaaccttactctggacgagatcctgaagaaccagcagcttctgaacgagatcagtggcaagctggacggtgtgaacggcagtctgaacgatctgatcgctcagggcaatctgaacacagagctttccaaagagattctgaagatcgctaacgagcagaaccaagttctgaacgacgttaacaacaagctggacgctatcaacactatgctgcacatctacctgcctaagatcacatctatgctgagtgacgtgatgaagcagaactacgctctgagtcttcaggttgagtacctgagtaaacagctgaaggagatcagtgacaagctcgacgtgatcaacgtgaacgtgctgatcaatagcactctgactgagatcacacctgcctaccagagaatcaagtacgtgaacgagaagttcgaagagctgaccttcgctactgagacaactctgaaagtgaagaaggacagttctcctgcagacatcctggacgagctgactgagctgactgagctggccaaaagcgtgactaagaacgacgttgatggcttcgagttctacctgaacaccttccacgacgtgatggttggtaataacctgttcggcaggagtgctctgaagaccgcaagcgagctgatcgctaaggagaacgtgaagacaagtggtagtgaggttggtaacgtgtacaacttcctgatcgtgctgacagctctgcaggctaaggccttcctgaccctgacaacttgcaggaagctgctgggtctggcagatatcgactacaccagcatcatgaacgagcacctgaataaggagaaggaagagttcagggtgaacatcctgcctactctgagtaacacattcagcaacccaaactacgctaaggtgaagggcagtgacgaggacgctaagatgatcgtggaggctaagccaggtcacgctctggttggcttcgagatcagtaacgacagcatgacagttctgaaagtgtatgaggcaaagctgaagcagaactatcaggttgacaaggacagtctgtctgaggtcatctactctgacatggacaagctgctgtgtcctgaccagagtgagcagatctactacaccaacaacatcgtgttcccgaacgagtacgtgatcaccaagatcgacttcaccaagaagatgaagactctgaggtacgaggtgactgccaacagctacgacagtagcactggtgagatcgacctgaacaagaagaaggtggagagcagtgaggctgagtacaggactctgagtgcaaacaacgacggtgtgtacatgccactgggtgtgatcagcgagaccttcctgacaccgatcaacggtttcggtctgcaggctgacgagaacagcagactgatcactctgacatgcaagagttacctgagagagcttctgcttgctacagaccttagcaacaaggagactaagctgatcgttcctcctatcagcttcatcagcaacatcgtggagaacggtaacctggagggcgagaacctggagccttggatcgctaacaacaagaacgcttacgtggaccacacaggaggcatcaacggtactaaggtgctgtacgttcacaaggatggtgagttcagccagttcgtgggtggcaagctgaagagtaagacagagtacgtgatccagtacatcgtgaagggtaaggcaagcatctacctgaaggacgagaacacaggttacatccactacgaagacaccaataacaacctggaggactaccagaccatcaacaagaggttcaccacaggaaccgacctgaaaggcgtttacctgatcctgaagagtcagaacggtgacgaggcctggggagacaacttcatcatcctggagatcagtccaagcgagaagctgctgagcccagagctgatcaacaccaacaactggacaagtaccggtagcaccaacatcagtggcaacacactgacactgtaccagggtggcagaggaatcctgaagcagaacctgcagcttgacagcttcagcacctacagagtgtacttcagtgttagcggtgacgctaacgttaggatcaggaacagtagggaggttctgttcgagaagaggtacatgagtggtgctaaggacgttagtgagatgttcaccaccaagttcgagaaggacaacttctacatcgagcttagccagggcaacaacctgtacggtggaccaatcgtgcacttctacgacgttagcatcaagtga

SEQ ID NO.7

名称：ZJG80LB识别外源基因插入位置左侧的核苷酸序列

来源：ZJG80株系基因组

tgaagcaatccatcatctcttagaagatagaagttttaattgcaagcatacttggacaattagcataaaatcatagttacaaggaaacaattcttacgttaacattgatcaataattcattaagtttacatagaggttttactagcattgcattattgtaatttgtaaattagttatataattattttaacacaaacaaaattagtataaagtcatcacgtttacgtatactaagggaaaatgtttggtttataaggtgggtccattgtacaacttaataacacattgcggacgtttttaatgtactgaattaacgccgaattaattcgggggatctggattttagtactggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaagtattttacaaatacaaatacatactaagggtttcttatatgctcaacacatgag

SEQ ID NO.8

名称：ZJG80rb识别外源基因插入位置右侧的核苷酸序列

来源：ZJG80株系基因组

gaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgctagagcagcttgagcttggatcagattgtcgtttcccgccttcagtttaaactatcagtgttatgacaaatcccagaactttgattttaaaccattatcttgtattttctttttggttatatgaggaatttgattccttttcagatgtgcccagatggaaagactattgaagctgaagcagcccatggcacagttacccgccactaccgtgttcataaaacaggaggtgaaactagcactaacagcatagcatcaatttttgcttggtcacgaggccttgcacacaggtattgacttgttattcttaatctagttattgaatgtatgtagtttattttctgaaaagcttggaatccttatgatggtggtgttttaagtctgggctaacttctcttggaaactaggaactcttgatgaacaataatgtgaaggaaaatacacaataatgtaaatccttgcatttggaatcatttgcaatttttcatggaaaataattttcctaggcttttggacccacattttagaaaataggatggttagcgcatgtca。

序列表

<110> 浙江大学（Zhejiang University）

<120> 用于转基因抗虫抗草甘膦棉花的特异性鉴定分子标记的引物组及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgaagcaatc catcatctct tagaa 25

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcatgtgtt gagcatataa gaaaccctta g 31

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgacatgcgc taaccatcct 20

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaagaggccc gcaccgatcg ccctt 25

<210> 5

<211> 1699

<212> DNA

<213> 耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)

<400> 5

ctcgagtcaa cacaacatat acaaaacaaa cgaatctcaa gcaatcaagc attctacttc 60

tattgcagca atttaaatca tttcttttaa agcaaaagca attttctgaa aattttcacc 120

atttacgaac gatagccatg gctcaagtta gcagaatctg caatggtgtg cagaacccat 180

ctcttatctc caatctctct aaatccagtc aaaggaaatc tcccttatcg gtttctctga 240

agactcagca gcatccacga gcttatccaa tttcttcatc ttggggattg aagaagagtg 300

ggatgacttt aattggctct gagcttcgtc ctcttaaggt catgtcttct gtttccacgg 360

cggagaaggg atccgacgct cttccagcta ccttcgacgt tatcgtgcat ccagctagag 420

aactcagagg tgaacttaga gcacagccat ccaagaacta caccactaga tacctcctcg 480

ccgctgctct cgctgagggt gaaaccagag ttgttggtgt ggctacctct gaggatgccg 540

aagctatgct cagatgcctc agagattggg gtgctggtgt tgagcttgtt ggtgatgacg 600

ccgtgatcag aggtttcggt gctagaccac aggctggtgt tacccttaac ccaggtaacg 660

ctgctgcggt ggccagactc cttatgggtg ttgctgctct cacctctggt acaactttcg 720

ttaccgatta ccctgattcc cttggtaaga gacctcaggg tgaccttctt gaagccctcg 780

aaagacttgg tgcttgggtg tcctccaacg atggtagact ccctatctcc gtttccggtc 840

cagttagagg tggtacagtg gaggtttccg ccgaaagatc ctcccagtac gcttccgcct 900

tatgttcctc ggtcctcttc ttcctgacgg actcgaactt agactcaccg gtgatatcaa 960

gtcccacgct cctcttagac agacacttga caccctctct gatttcggtg ttagagctac 1020

tgcctccgat gaccttagaa gaatctccat ccctggtggt cagaagtaca gaccaggtag 1080

agtgctcgtt cctggtgatt accctggttc cgctgctatc cttaccgccg ctgctcttct 1140

cccaggtgag gttagacttt ctaaccttag agaacacgac ctccagggtg agaaggaagc 1200

tgtgaacgtt cttagagaga tgggtgctga tatcgttaga gaaggtgata cccttaccgt 1260

gagaggtggt agacctctcc acgctgttac tagagatggt gattccttca ccgacgccgt 1320

gcaagctctt accgctgctg ctgccttcgc tgagggtgat accacctggg aaaacgttgc 1380

tactcttaga ctcaaggaat gcgatagaat ctctgacacc agagctgagc ttgaaagact 1440

tggtcttaga gcaagagaga ccgccgattc tctctccgtt actggttctg ctcaccttgc 1500

tggtggtatc accgctgatg gtcacggtga ccacagaatg atcatgcttc tcacccttct 1560

tggtctcaga gcagatgctc cacttagaat caccggtgca caccacatca gaaagtccta 1620

ccctcagttc ttcgctcacc ttgaagctct tggtgctaga ttcgaatacg ctgaggctac 1680

cgcctaatag gagctcgag 1699

<210> 6

<211> 4332

<212> DNA

<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 6

ggatccatgg acaacaaccc aaacatcaac gaatgcattc catacaactg cttgagtaac 60

ccagaagttg aagtacttgg tggagaacgc attgaaaccg gttacactcc catcgacatc 120

tccttgtcct tgacacagtt tctgctcagc gagttcgtgc caggtgctgg gttcgttctc 180

ggactagttg acatcatctg gggtatcttt ggtccatctc aatgggatgc attcctggtg 240

caaattgagc agttgatcaa ccagaggatc gaagagttcg ccaggaacca ggccatctct 300

aggttggaag gattgagcaa tctctaccaa atctatgcag agagcttcag agagtgggaa 360

gccgatccta ctaacccagc tctccgcgag gaaatgcgta ttcaattcaa cgacatgaac 420

agcgccttga ccacagctat cccattgttc gcagtccaga actaccaagt tcctctcttg 480

tccgtgtacg ttcaagcagc taatcttcac ctcagcgtgc ttcgagacgt tagcgtgttt 540

gggcaaaggt ggggattcga tgctgcaacc atcaatagcc gttacaacga ccttactagg 600

ctgattggaa actacaccga ccacgctgtt cgttggtaca acactggctt ggagcgtgtc 660

tggggtcctg attccagaga ttggattaga tacaaccagt tcaggagaga attgaccctc 720

acagttttgg acattgtgtc tctcttcccg aactatgact ccagaaccta ccctatccgt 780

acagtgtccc aacttaccag agaaatctat actaacccag ttcttgagaa cttcgacggt 840

agcttccgtg gttctgccca aggtatcgaa ggctccatca ggagcccaca cttgatggac 900

atcttgaaca gcataactat ctacaccgat gctcacagag gagagtatta ctggtctgga 960

caccagatca tggcctctcc agttggattc agcgggcccg agtttacctt tcctctctat 1020

ggaactatgg gaaacgccgc tccacaacaa cgtatcgttg ctcaactagg tcagggtgtc 1080

tacagaacct tgtcttccac cttgtacaga agacccttca atatcggtat caacaaccag 1140

caactttccg ttcttgacgg aacagagttc gcctatggaa cctcttctaa cttgccatcc 1200

gctgtttaca gaaagagcgg aaccgttgat tccttggacg aaatcccacc acagaacaac 1260

aatgtgccac ccaggcaagg attctcccac aggttgagcc acgtgtccat gttccgttcc 1320

ggattcagca acagttccgt gagcatcatc agagcaccta tgttctcttg gatacatcgt 1380

agtgctgagt tcaacaacat catcgcatcc gatagtatta ctcaaatccc tgcagtgaag 1440

ggaaactttc tcttcaacgg ttctgtcatt tcaggaccag gattcactgg tggagacctc 1500

gttagactca acagcagtgg aaataacatt cagaatagag ggtatattga agttccaatt 1560

cacttcccat ccacatctac cagatataga gttcgtgtga ggtatgcttc tgtgacccct 1620

attcacctca acgttaattg gggtaattca tccatcttct ccaatacagt tccagctaca 1680

gctacctcct tggataatct ccaatccagc gatttcggtt actttgaaag tgccaatgct 1740

tttacatctt cactcggtaa catcgtgggt gttagaaact ttagtgggac tgcaggagtg 1800

attatcgaca gattcgagtt cattccagtt actgcaacac ttgaggctga gtacaacctt 1860

gagagagccc agaaggctgt gaacgccctc tttacctcca ccaatcagct tggcttgaaa 1920

actaacgtta ctgactatca cattgaccaa gtgggtcccg ggggtaaagg aaacaacacc 1980

aagctgaacg ctagaactct tcctagtttc atcgactact tcaacggcat ctacggtttc 2040

gctacaggta tcaaggacat catgaacatg atcttcaaga ctgacacagg tggcaacctt 2100

actctggacg agatcctgaa gaaccagcag cttctgaacg agatcagtgg caagctggac 2160

ggtgtgaacg gcagtctgaa cgatctgatc gctcagggca atctgaacac agagctttcc 2220

aaagagattc tgaagatcgc taacgagcag aaccaagttc tgaacgacgt taacaacaag 2280

ctggacgcta tcaacactat gctgcacatc tacctgccta agatcacatc tatgctgagt 2340

gacgtgatga agcagaacta cgctctgagt cttcaggttg agtacctgag taaacagctg 2400

aaggagatca gtgacaagct cgacgtgatc aacgtgaacg tgctgatcaa tagcactctg 2460

actgagatca cacctgccta ccagagaatc aagtacgtga acgagaagtt cgaagagctg 2520

accttcgcta ctgagacaac tctgaaagtg aagaaggaca gttctcctgc agacatcctg 2580

gacgagctga ctgagctgac tgagctggcc aaaagcgtga ctaagaacga cgttgatggc 2640

ttcgagttct acctgaacac cttccacgac gtgatggttg gtaataacct gttcggcagg 2700

agtgctctga agaccgcaag cgagctgatc gctaaggaga acgtgaagac aagtggtagt 2760

gaggttggta acgtgtacaa cttcctgatc gtgctgacag ctctgcaggc taaggccttc 2820

ctgaccctga caacttgcag gaagctgctg ggtctggcag atatcgacta caccagcatc 2880

atgaacgagc acctgaataa ggagaaggaa gagttcaggg tgaacatcct gcctactctg 2940

agtaacacat tcagcaaccc aaactacgct aaggtgaagg gcagtgacga ggacgctaag 3000

atgatcgtgg aggctaagcc aggtcacgct ctggttggct tcgagatcag taacgacagc 3060

atgacagttc tgaaagtgta tgaggcaaag ctgaagcaga actatcaggt tgacaaggac 3120

agtctgtctg aggtcatcta ctctgacatg gacaagctgc tgtgtcctga ccagagtgag 3180

cagatctact acaccaacaa catcgtgttc ccgaacgagt acgtgatcac caagatcgac 3240

ttcaccaaga agatgaagac tctgaggtac gaggtgactg ccaacagcta cgacagtagc 3300

actggtgaga tcgacctgaa caagaagaag gtggagagca gtgaggctga gtacaggact 3360

ctgagtgcaa acaacgacgg tgtgtacatg ccactgggtg tgatcagcga gaccttcctg 3420

acaccgatca acggtttcgg tctgcaggct gacgagaaca gcagactgat cactctgaca 3480

tgcaagagtt acctgagaga gcttctgctt gctacagacc ttagcaacaa ggagactaag 3540

ctgatcgttc ctcctatcag cttcatcagc aacatcgtgg agaacggtaa cctggagggc 3600

gagaacctgg agccttggat cgctaacaac aagaacgctt acgtggacca cacaggaggc 3660

atcaacggta ctaaggtgct gtacgttcac aaggatggtg agttcagcca gttcgtgggt 3720

ggcaagctga agagtaagac agagtacgtg atccagtaca tcgtgaaggg taaggcaagc 3780

atctacctga aggacgagaa cacaggttac atccactacg aagacaccaa taacaacctg 3840

gaggactacc agaccatcaa caagaggttc accacaggaa ccgacctgaa aggcgtttac 3900

ctgatcctga agagtcagaa cggtgacgag gcctggggag acaacttcat catcctggag 3960

atcagtccaa gcgagaagct gctgagccca gagctgatca acaccaacaa ctggacaagt 4020

accggtagca ccaacatcag tggcaacaca ctgacactgt accagggtgg cagaggaatc 4080

ctgaagcaga acctgcagct tgacagcttc agcacctaca gagtgtactt cagtgttagc 4140

ggtgacgcta acgttaggat caggaacagt agggaggttc tgttcgagaa gaggtacatg 4200

agtggtgcta aggacgttag tgagatgttc accaccaagt tcgagaagga caacttctac 4260

atcgagctta gccagggcaa caacctgtac ggtggaccaa tcgtgcactt ctacgacgtt 4320

agcatcaagt ga 4332

<210> 7

<211> 444

<212> DNA

<213> ZJG80株系基因组(人工序列Artificial Sequence)

<400> 7

tgaagcaatc catcatctct tagaagatag aagttttaat tgcaagcata cttggacaat 60

tagcataaaa tcatagttac aaggaaacaa ttcttacgtt aacattgatc aataattcat 120

taagtttaca tagaggtttt actagcattg cattattgta atttgtaaat tagttatata 180

attattttaa cacaaacaaa attagtataa agtcatcacg tttacgtata ctaagggaaa 240

atgtttggtt tataaggtgg gtccattgta caacttaata acacattgcg gacgttttta 300

atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga ttttagtact ggattttggt 360

tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac atactaaggg 420

tttcttatat gctcaacaca tgag 444

<210> 8

<211> 606

<212> DNA

<213> ZJG80株系基因组(人工序列Artificial Sequence)

<400> 8

gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatgctag 60

agcagcttga gcttggatca gattgtcgtt tcccgccttc agtttaaact atcagtgtta 120

tgacaaatcc cagaactttg attttaaacc attatcttgt attttctttt tggttatatg 180

aggaatttga ttccttttca gatgtgccca gatggaaaga ctattgaagc tgaagcagcc 240

catggcacag ttacccgcca ctaccgtgtt cataaaacag gaggtgaaac tagcactaac 300

agcatagcat caatttttgc ttggtcacga ggccttgcac acaggtattg acttgttatt 360

cttaatctag ttattgaatg tatgtagttt attttctgaa aagcttggaa tccttatgat 420

ggtggtgttt taagtctggg ctaacttctc ttggaaacta ggaactcttg atgaacaata 480

atgtgaagga aaatacacaa taatgtaaat ccttgcattt ggaatcattt gcaatttttc 540

atggaaaata attttcctag gcttttggac ccacatttta gaaaatagga tggttagcgc 600

atgtca 606

Claims (2)

1.一种用于转基因抗虫抗草甘膦棉花的特异性鉴定分子标记的引物组，其特征在于：

所述的引物组包括两对引物对，分别为引物对ZJG80LB和引物对ZJG80rb；

引物对ZJG80LB的序列为：5’-TGAAGCAATCCATCATCTCTTAGAA-3’和5’-CTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAG-3’，分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

引物对ZJG80rb的序列为5’-TGACATGCGCTAACCATCCT-3’和5’-GAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTT-3’，分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

2.权利要求1所述引物组的应用，其特征在于：在特异性鉴定新型抗虫抗草甘膦棉花的分子标记中的应用。

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