CN111471788B

CN111471788B - 转SbSNAC1基因玉米SbSNAC1-466的外源插入片段的旁侧序列及其应用

Info

Publication number: CN111471788B
Application number: CN202010294042.6A
Authority: CN
Inventors: 王天宇; 张登峰; 曾廷儒; 李永祥; 李春辉; 石云素; 宋燕春; 黎裕
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-04-15
Filing date: 2020-04-15
Publication date: 2022-09-13
Anticipated expiration: 2040-04-15
Also published as: CN111471788A

Abstract

本发明公开了转SbSNAC1基因玉米SbSNAC1‑466的外源插入片段的旁侧序列及其应用。本发明首先公开了转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1‑466的外源插入片段的5′端和3′端旁侧序列。本发明进一步提供了转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1‑466的检测方法。本发明根据5′端或3′端旁侧序列及其对应的外源插入片段的序列信息，设计多对引物并建立转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1‑466的检测方法，准确的检测出待测玉米是否为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1‑466，灵敏度高，特异性强，对于筛检转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1‑466有重要意义。

Description

转SbSNAC1基因玉米SbSNAC1-466的外源插入片段的旁侧序列及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及转SbSNAC1基因玉米SbSNAC1-466的外源插入片段的旁侧序列及其应用。

背景技术

干旱作为一个主要的环境压力严重的限制了作物的生长和产量。中国国土面积有一半为干旱、半干旱地区，常年旱灾面积达到耕地总面积的20％左右，近40年来每年仅因干旱造成的粮食减产达就达1000亿公斤以上。玉米是一种主要的粮食、饲料和燃料作物并且具有高产的潜力和营养价值。在过去的几十年里，全球玉米产量稳步增长，但是干旱、缺水和气候环境的波动对全球玉米生产造成了重大威胁。在中国，自2009年玉米已经成为第一大粮食作物。传统的玉米遗传育种对玉米抗旱性的改良起到了一定的作用，但想要进一步提高玉米对干旱的抗性需要应用新的生物技术手段。转基因技术可打破物种界限，对基因进行定向改造和重组转移，对现有品种的抗旱性进行改良，可以极大地提高玉米的抗旱性。发达国家，特别是美国培育、推广转基因玉米的实践也已经证明，转基因技术培育新品种可显著提高玉米抗旱能力，是大幅度提高产量和改善品质的最现实有效的途径，已经成为国际玉米育种发展的主要方向。2011年12月，美国农业部动植物卫生检疫局(APHIS)正式批准了孟山都转基因抗旱玉米MON87460，这意味着世界第一个转基因抗旱玉米可以在生产中大规模推广和利用。该抗旱玉米所转基因为CspB基因(CspB基因来自枯草芽孢杆菌，编码一种RNA伴侣蛋白)，在逆境条件下，该基因可以增强植物细胞的功能，在水分缺乏的条件下减少产量的损失。在干旱的情况下，转该基因的玉米自交系和杂交种可以显著地提高玉米的生物量和产量，在美国西部干旱地区的抗旱玉米田间试验已经达到甚至超过了6％至10％的增产目标。

SbSNAC1基因是中国农业科学院作物科学研究所从新疆一个耐旱的地方高粱品种XGL-1中克隆出的NAC家族基因。该基因在拟南芥中过量表达可以显著提高转基因拟南芥植株的耐旱性。

如今转基因成分检测受到越来越广泛的关注，根据转基因插入片段的旁侧序列设计转化体特异的检测引物是最为有效的检测方法。然而，在对现有的专利和文献的分析中发现，还没有任何关于转SbSNAC1基因玉米SbSNAC1-466的外源插入片段的旁侧序列及其应用的文章和专利报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测或辅助检测待测玉米是否为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466。

本发明所述转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466为保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.18331。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的外源插入片段的旁侧序列。

本发明转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的外源插入片段的旁侧序列为A1)和/或A2)：

A1)5′端旁侧序列；

A2)3′端旁侧序列；

其中，所述5′端旁侧序列为SEQ ID NO.3第1-599位所示的DNA分子；或包含在转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的基因组中至少含有SEQ ID NO.3第1-599位所示的DNA分子，并且沿着转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的基因组的方向向5′端延伸后所得的DNA分子；

所述3′端旁侧序列为SEQ ID NO.4第547-827位所示的DNA分子；或包含在转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的基因组中至少含有SEQ ID NO.4第547-827位所示的DNA分子，并且沿着转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的基因组的方向向3′端延伸后所得的DNA分子。

在本发明中，所述SEQ ID NO.3所示的DNA分子包括自5′末端起第1-599位共599bp的玉米基因组序列(即5′端旁侧序列)和第600-881位共282bp的外源插入片段(即载体片段)；

所述SEQ ID NO.4所示的DNA分子包括自5′末端起第1-546位共546bp的外源插入片段(即载体片段)和第547-827位共281位的玉米基因组序列(即3′端旁侧序列)。

上述旁侧序列在如下B1)或B2)中的应用也在本发明的保护范围之内：

B1)在检测或辅助检测待测玉米是否为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466中的应用；

B2)在制备检测或辅助检测待测玉米是否为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的引物对中的应用。

本发明进一步提供了用于检测或辅助检测待测玉米是否为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的引物对。

本发明用于检测或辅助检测待测玉米是否为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的引物对，包括引物对I和/或引物对II；

所述引物对I的上游引物根据转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的外源插入片段的5′端旁侧序列设计获得，下游引物根据所述外源插入片段的序列设计获得；

所述引物对II的上游引物根据转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的外源插入片段的序列设计获得，下游引物根据所述转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的外源插入片段的3′端旁侧序列设计获得。

在本发明中，所述引物对I为如下(1)-(3)所示引物对中的任一种：

(1)由SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子的上游引物和SEQ ID NO.6所示的单链DNA分子的下游引物组成的引物对；

(2)由SEQ ID NO.7所示的单链DNA分子的上游引物和SEQ ID NO.8所示的单链DNA分子的下游引物组成的引物对；

(3)由SEQ ID NO.9所示的单链DNA分子的上游引物和SEQ ID NO.10所示的单链DNA分子的下游引物组成的引物对。

在本发明中，所述引物对II为如下(4)-(6)所示引物对中的任一种：

(4)由SEQ ID NO.14所示的单链DNA分子的上游引物和SEQ ID NO.11所示的单链DNA分子的下游引物组成的引物对；

(5)由SEQ ID NO.14所示的单链DNA分子的上游引物和SEQ ID NO.12所示的单链DNA分子的下游引物组成的引物对；

(6)由SEQ ID NO.14所示的单链DNA分子的上游引物和SEQ ID NO.13所示的单链DNA分子的下游引物组成的引物对。

在本发明中，所述引物对中各单链DNA分子独立包装。

上述引物对在制备用于检测或辅助检测待测玉米是否为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的试剂盒中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明进一步还提供了用于检测或辅助检测待测玉米是否为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的试剂盒。

本发明用于检测或辅助检测待测玉米是否为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的试剂盒包含有上述引物对。

上述引物对或试剂盒在检测或辅助检测待测玉米是否为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明检测或辅助检测待测玉米是否为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的方法为C1)和/或C2)：

C1)包括如下步骤：

1)以所述待测玉米的基因组DNA为模板，采用上述引物对I进行PCR扩增，获得PCR产物；

2)若所述PCR产物中含有预期大小的DNA片段，则所述待测玉米为或候选为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466；若所述PCR产物中不含有预期大小的DNA片段，则所述待测玉米不为或候选不为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466；

C2)包括如下步骤：

1)以所述待测玉米的基因组DNA为模板，采用上述引物对II进行PCR扩增，获得PCR产物；

2)若所述PCR产物中含有预期大小的DNA片段，则所述待测玉米为或候选为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466；若所述PCR产物中不含有预期大小的DNA片段，则所述待测玉米不为或候选不为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466。

在本发明中，所述预期大小的DNA片段如下：若所述引物对I为由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的两条单链DNA分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA片段为195bp的DNA片段；若所述引物对I为由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的两条单链DNA分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA片段为338bp的DNA片段；若所述引物对I为由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的两条单链DNA分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA片段为472bp的DNA片段；

若所述引物对II为由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.11所示的两条单链DNA分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA片段为612bp的DNA片段；若所述引物对II为由SEQ IDNO.14和SEQ ID NO.12所示的两条单链DNA分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA片段为762bp的DNA片段；若所述引物对II为由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.13所示的两条单链DNA分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA片段为827bp的DNA片段。

本发明将SbSNAC1基因转入到玉米自交系郑58中，获得了一个抗旱转基因玉米SbSANC1-466。抗旱性鉴定显示，该转基因玉米SbSANC1-466较对照玉米自交系郑58抗旱性显著提高，在干旱条件下对照玉米自交系郑58较该转基因玉米SbSANC1-466叶片更加卷曲和萎蔫，转基因玉米植株的苗期存活率较对照玉米自交系郑58显著提高，在大田干旱条件下转基因玉米植株的平均单株籽粒产量较对照玉米自交系郑58明显提高。因此，该转基因事件SbSANC1-466今后有可以进入商业化种植。

本发明通过TAIL-PCR反应获得了转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的插入片段的5′端旁侧序列和3′端旁侧序列，根据这两个旁侧序列和外源插入片段的序列信息，设计多对特异性PCR引物并建立针对转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的检测方法，该方法能准确的检测出待测玉米是否为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466，且灵敏度高，特异性强，对于筛检转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466有重要意义，可广泛用于转基因玉米的安全评估和检测。

保藏说明

分类命名：玉米Zea mays

参椐的生物材料(株)：SbSNAC1-466

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2019年8月7日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18331

附图说明

图1为重组农杆菌的菌液PCR鉴定电泳图。其中，泳道1-7为各个重组农杆菌菌液；泳道8为以重组质粒35S::SbSNAC1为模板的阳性对照；泳道9为以H₂O为模板的阴性对照。

图2为SbSNAC1基因的PCR鉴定电泳图。其中，Marker为DL2000；泳道1、2、3、4、5、6、7依次为SbSNC1-382、SbSNAC1-383、SbSNAC1-389、SbSNAC1-466、SbSNAC1-467、SbSNAC1-471、SbSNAC1-474；泳道8为阳性对照；泳道9为阴性对照。

图3为Bar基因的PCR鉴定电泳图。其中，泳道M为Trans 2k plus II；泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9、10依次为SbSNC1-382、SbSNAC1-383、SbSNAC1-389、SbSNAC1-466、SbSNAC1-467、SbSNAC1-471、SbSNAC1-474、SbSNAC-479、SbSNAC1-480和SbSNAC1-484株系；泳道11为阳性对照；泳道12为阴性对照。

图4为SbSNAC1-466和阴性对照苗期温室抗旱性鉴定结果。其中，A为T₀代SbSNAC1-466和阴性对照干旱处理34天的表型；B为T₀代SbSNAC1-466和阴性对照干旱处理37天后复水24小时后的表型；466+代表T₀代SbSNAC1-466；466-代表阴性对照。

图5为SbSNAC1-466与对照玉米自交系郑58在田间旱区的生长情况。其中，郑58代表对照玉米自交系郑58。

图6为重组质粒35S::SbSNAC1的载体示意图。

图7为以SbSNAC1基因探针进行杂交的到SbSNAC1-466的Southern杂交检测结果图。其中，泳道1-4为Hind III酶切结果，其中1-3分别为SbSNAC1-466株系的T₃-T₅代植株，泳道4为对照玉米自交系郑58；泳道5-8为EcoR I酶切结果，其中泳道5-7为T₃-T₅代SbSNAC1-466，泳道8为对照玉米自交系郑58；泳道9为利用HindIII酶切的质粒对照；泳道10为TakaraDL15kb DNA marker。

图8为以Bar基因探针进行杂交的到SbSNAC1-466的Southern杂交检测结果图。其中，泳道1-4为Hind III酶切结果，其中泳道1-3分别为T₃-T₅代SbSNAC1-466，泳道4为对照玉米自交系郑58；泳道5-8为EcoR I酶切结果，其中泳道5-7分别为T₃-T₅代SbSNAC1-466，泳道8为对照玉米自交系郑58；泳道9为利用Hind III酶切的质粒对照；泳道10为Takara DL15kbDNA marker。

图9为SbSNAC1-466的5′端特异性PCR扩增的检测结果。其中，泳道1、3、5分别为引物466YZF9R9、466YZF10R10、466YZF11R11在SbSNAC1-466的扩增结果；泳道2、4、6分别为引物466YZF9R9、466YZF10R10、466YZF11R11在对照玉米自交系郑58的扩增结果；泳道7为水对照。

图10为引物S10分别与引物F21-32配对后的引物组的PCR扩增后的检测结果。其中，F21、F22、F24、F25、F28、F29、F30、F31、F32分别代表引物S10分别与引物F21、F22、F24、F25、F28、F29、F30、F31、F32对T₅代SbSNAC1-466的基因组DNA的扩增结果。

图11为引物S10分别与引物R6、R7和R8配对后的引物组的PCR扩增后的检测结果。其中，泳道1、3、5分别代表引物S10分别与引物R6、R7和R8对T₅代SbSNAC1-466的基因组DNA的扩增结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

下述实施例中用到的材料的来源如下：

高粱品种XGL-1，记载于非专利文献“Min Lu et al.,Expression of SbSNAC1,aNAC transcription factor from sorghum,confers drought tolerance to transgenicArabidopsis.2013,115:443-455,Plant Cell Tiss Organ Cult.”中，经作者同意后，公众可从中国农业科学作物科学研究所处获得该材料。

玉米自交系郑58，记载于非专利文献“堵存信，曹春景，曹青等，玉米杂交种郑单958的选育与应用。玉米科学，2006,14(6):43-45,49.”中，经作者同意后，公众可从中国农业科学作物科学研究所处获得该材料。

实施例1SbSNAC1基因的克隆

一、RNA的提取

取高粱品种XGL-1的叶片和根系进行混合，提取混合后的材料的RNA。

二、cDNA的制备

将步骤一提取得到的RNA反转录为cDNA，得到高粱品种XGL-1的cDNA。

三、基因的扩增

引物序列为：

正向引物：5′-TTTCCATGGGATTGCCGGTGAT-3′(下划线为限制性内切酶NcoI的识别位点)；

反向引物：5′-TTTGGTGACCAGCCTCAGAATGGCCCCAAC-3′(下划线为限制性内切酶BstEⅡ的识别位点)。利用上述设计的引物以步骤二所制备得到的高粱品种XGL-1的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

四、SbSNAC1基因的获得

将PCR扩增产物连入PMD18-T载体(TaKaRa，D101A)，得到重组质粒PMD18-SbSNAC1，转入感受态大肠杆菌，挑取单克隆，进行鉴定，提取重组质粒PMD18-SbSNAC1，进行测序。

测序结果表明，重组质粒PMD18-SbSNAC1含有具有如SEQ ID NO.1所示的DNA分子，命名为SbSNAC1，共966bp，编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，命名为蛋白质SbSNAC1，由321个氨基酸残基组成。

实施例2转SbSNAC1基因抗旱玉米及功能验证

一、重组质粒35S::SbSNAC1的构建

1、用限制性内切酶NcoI和BstEⅡ双酶切实施例1中的重组质粒PMD18-SbSNAC1，回收和纯化酶切产物。

2、用限制性内切酶NcoI和BstEⅡ双酶切质粒pCAMBIA3301(北京华越洋生物有限公司)，回收载体骨架(约9250bp)。

3、将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接，得到重组质粒35S::SbSNAC1。

将重组质粒35S::SbSNAC1进行测序，根据测序结果，对重组质粒35S::SbSNAC1进行结构描述如下：将质粒pCAMBIA3301的限制性内切酶NcoI和BstEⅡ识别序列间的小片段替换为SEQ ID NO.1所示的DNA分子，且保持质粒pCAMBIA3301的其它序列不变。重组质粒35S::SbSNAC1表达SEQ ID NO.2所示的蛋白质SbSNAC1。

二、转SbSNAC1基因抗旱玉米的获得

1、通过冻融法将重组质粒35S::SbSNAC1转化农杆菌EH105(北京华越洋生物有限公司)，得到重组农杆菌菌液。具体方法为：将农杆菌EH105置于冰上，加入1g质粒DNA(体积不宜超过10μl)，充分混匀，冰上放置30min；置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中，待其融化；接着冰浴2min，加入800ml不含抗生素的YEB液体培养基；28℃，175rpm摇培3hr后，涂在含50μg/ml Kanamycin的YEB平板上；28℃培养到形成单菌落，即得到重组农杆菌菌液。

分别以各个重组农杆菌菌液、重组质粒35S::SbSNAC1(阳性对照)和水(阴性对照)为模板通过PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，如果某个重组农杆菌菌液的PCR扩增产物中含有约966bp的目标基因片段，则该重组农杆菌为阳性重组农杆菌。

其中，PCR扩增引物为：

正向引物：5'-TTTCCATGGGATTGCCGGTGAT-3'；

反向引物：5'-TTTGGTGACCAGCCTCAGAATGGCCCCAAC-3'。

2、选取鉴定结果均为阳性的重组农杆菌进行接菌，28℃(200rmp)震荡至OD_550nm值为0.3-0.4，4℃离心10分钟，收集菌体，加入悬浮培养基重悬，使菌液浓度OD_550nm值到0.3-0.4，随后侵染授粉11-12天、大小为1-1.5mm左右的玉米自交系郑58的幼胚。然后在28℃共培养3天；28℃静息培养7天后；28℃进行选择培育，分别用含1.5mg/L，3mg/L的双丙胺膦的选择培养基上筛选四轮，筛选得到的愈伤；置于分化培养基，在28℃，光照条件(80-100μE/m²/s的光强，16：8的光周期)下培育，分化成苗，移栽到土中，得到T₀代拟转SbSNAC1基因玉米。

上述转化方法和各培养基的组分和配方参见(Frame B,Main M,Schick R andWang K.Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos.PlantEmbryo Culture:Methods and Protocls,Methods in Molecular Biology,2011,710:327-341)。

3、T₀代转SbSNAC1基因玉米的鉴定

1)、喷施除草剂Basta

分别向温室和田间生长的T₀代拟转SbSNAC1基因玉米喷施除草剂Basta(浓度为2‰)，以选择阳性植株(喷施除草剂三天后依然生长良好不会死亡的为阳性植株，萎蔫枯死的为阴性植株)，将初步鉴定为阳性植株的T₀代拟转SbSNAC1基因玉米的7个株系命名为SbSNC1-382、SbSNAC1-383、SbSNAC1-389、SbSNAC1-466、SbSNAC1-467、SbSNAC1-471、SbSNAC1-474。

2)、PCR检测

a、SbSNAC1基因的PCR检测方法，包括如下步骤：取T₀代拟转SbSNAC1基因玉米植株(SbSNC1-382、SbSNAC1-383、SbSNAC1-389、SbSNAC1-466、SbSNAC1-467、SbSNAC1-471、SbSNAC1-474)叶片，提取DNA作为模板，利用SbSNAC1基因上的特异性引物(SbSNAC1-F:5′-GACCGCAAGTACCCAAACGG-3′,SbSNAC1-R:5′-CACCCAGTCATCCAGCCTGAG-3′；其中，一条引物跨越两个外显子)进行PCR扩增(扩增条件：95℃，变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，34个循环；72℃延伸5分钟；15℃保存)，得到PCR扩增产物；

按照上述步骤，将模板替换为玉米自交系郑58叶片的基因组DNA，其它步骤均不变，作为阴性对照。

按照上述步骤，将模板替换为水，其它步骤均不变，作为水对照。

按照上述步骤，将模板替换为重组质粒35S::SbSNAC1，其它步骤均不变，作为阳性对照。

将各个PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，根据电泳结果进行如下判断：如果某株系的PCR扩增产物的扩增片段长度约为249bp，则该株系鉴定为T₀代转SbSNAC1基因玉米。

b、Bar基因的PCR检测方法，包括如下步骤：取拟转SbSNAC1基因玉米植株(SbSNC1-382、SbSNAC1-383、SbSNAC1-389、SbSNAC1-466、SbSNAC1-467、SbSNAC1-471、SbSNAC1-474)叶片，提取DNA作为模板，利用标记基因(Bar基因)的序列设计特异性引物(Bar-P1:GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC,Bar-P2:GTCTGCACCATCGTCAACC)进行PCR扩增(扩增条件：95℃，变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，34个循环；72℃延伸5分钟；15℃保存)，得到PCR扩增产物；

将各个PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，根据电泳结果进行如下判断：如果某株系的PCR扩增产物的扩增片段长度约为444bp，则该株系鉴定为T₀代转SbSNAC1基因玉米。

上述结果表明，SbSNC1-382、SbSNAC1-383、SbSNAC1-389、SbSNAC1-466、SbSNAC1-467、SbSNAC1-471、SbSNAC1-474均为T₀代转SbSNAC1基因玉米。

4、通过温室和田间抗旱性鉴定，筛选出了抗旱性较对照显著提高的SbSNAC1-466

SbSNAC1-466苗期温室抗旱性鉴定：将T₀代SbSNAC1-466和阴性对照(玉米自交系郑58)种植于花盆中，种植8个重复，每个重复种12株T₀代SbSNAC1-466、12株阴性对照，干旱处理37天，对T₀代SbSNAC1-466和阴性对照进行抗旱性鉴定，结果如图4中A所示，可见阴性对照叶片卷曲、出现萎蔫现象，而SbSNAC1-466叶片伸展、持绿性较好；将干旱处理37天的玉米复水24小时后，结果如图4中B所示，可见T₀代SbSNAC1-466大部分叶片恢复伸展，而阴性对照则大部分枯萎死亡，说明SbSNAC1-466抗旱性较阴性对照显著提高，结果表明SbSNAC1-466抗旱性较好。

T₃-T₅代SbSNAC1-466(每一代通过除草剂鉴定阳性植株后与自交系郑58回交，获得T₃-T₅代SbSNAC1-466)田间抗旱性鉴定：2015-2017年，连续三年分别将T₃-T₅代SbSNAC1-466及其对照玉米自交系郑58种植于新疆乌鲁木齐安宁渠试验场进行抗旱性鉴定。试验设置水、旱两个处理，每个材料种植6行，行长5米，重复3次，水处理滴灌7次，水量350方/亩，旱处理浇水150方/亩。灌浆期观测如图5所示，结果显示：在旱区，对照玉米自交系郑58较SbSNAC1-466株高明显下降，叶色较SbSNAC1-466明显退绿发黄。收获后测产结果如表1所示，在水区，SbSNAC1-466产量与对照玉米自交系郑58产量没有明显差异；而在旱区，SbSNAC1-466较对照玉米自交系郑58结实率显著提高，产量明显增加。结果表明，SbSNAC1-466较对照玉米自交系郑58的抗旱性显著提高。

表1SbSNAC1-466及其对照玉米自交系郑58在田间水、旱区的产量

注：表中数据为平均值±标准误差；平均单株产量为籽粒产量(水份14％)。

5、T₃-T₅代SbSNAC1-466遗传稳定性的检测

重组质粒35S::SbSNAC1的载体示意图如图6所示，大小为10.24kb，在该载体上只有一个Hind III和一个EcoR I酶切位点，因此分别利用这两个酶进行单酶切，可以得到一个10.24kb的线性片段。

分别用Hind III和EcoR I内切酶对T₃-T₅代SbSNAC1-466和玉米自交系郑58进行单酶切，使用SbSNAC1基因和Bar基因特异性探针分别进行杂交，结果显示T₃-T₅代SbSNAC1-466中SbSNAC1基因和Bar基因均为单拷贝，并且这两个单拷贝基因在转基因T₃-T₅代都可以稳定遗传。

具体如下：

1)利用SbSNAC1基因探针和Hind III、EcoR I内切酶进行单酶切的Southern杂交结果

在SbSNAC1基因上设计特异性探针引物(SbSNAC1-Probe-F1:5′-CGCGTGGGGTCAAGACGGACTG-3′，SbSNAC1-Probe-R1:5′-GGGAACGAGTCCAGCTCCGGGAAC-3′)，以重组质粒35S::SbSNAC1为模板，可以扩增得到长度为386bp的DNA片段，该片段即为SbSNAC1基因探针。

利用Hind III和EcoR I内切酶分别对T₃-T₅代SbSNAC1-466和对照玉米自交系郑58基因组DNA进行酶切，同时利用Hind III酶切的重组质粒35S::SbSNAC1作为阳性对照，以SbSNAC1基因探针进行杂交，结果如图7所示，如预期所料，用Hind III酶切的重组质粒35S::SbSNAC1杂交出10.24kb的片段。用Hind III酶切后，T₃-T₅代SbSNAC1-466相对于对照玉米自交系郑58在2.5-5kb之间有1条特异杂交条带。对照玉米自交系郑58株系存在内源性背景杂交条带，这些信号是由于探针与玉米基因组内同源序列的非特异性杂交产生，与插入无关。相同的杂交条带在SbSNAC1-466事件中也可观察到，因此为内源性背景杂交条带。利用EcoR I酶切T₃-T₅代SbSNAC1-466和对照玉米自交系郑58基因组DNA，杂交后同样显示T₃-T₅代SbSNAC1-466相对于对照玉米自交系郑58在10-15kb之间有1条特异杂交条带。对照玉米自交系郑58存在内源性背景杂交条带，这些信号是由于探针与玉米基因组内同源序列的非特异性杂交产生，与插入无关。相同的杂交条带在SbSNAC1-466事件中也可观察到，因此为内源性背景杂交条带。由于质粒载体pCAMBIA3301-SbSNAC1中只有一个Hind III和一个EcoR I酶切位点，因此转基因玉米基因组DNA分别用这两种酶进行酶切杂交的得到的特异条代数就代表插入的拷贝数。杂交结果显示SbSNAC1-466事件的插入序列有单拷贝的SbSNAC1基因。

2)利用Bar基因探针和Hind III、EcoR I内切酶进行单酶切的Southern杂交结果

利用Bar基因序列设计特异性探针引物(Bar-Probe-F1:5′-ATGAGCCCAGAACGACGCCCG-3′，Bar-Probe-R1:5′-TCAAATCTCGGTGACGGGCAGGAC-3′)，以重组质粒35S::SbSNAC1为模板，可以扩增得到长度为552bp的DNA片段，该DNA片段即为Bar基因探针。

利用Hind III和EcoR I内切酶分别对T₃-T₅代SbSNAC1-466和对照玉米自交系郑58基因组DNA进行酶切，同时利用Hind III酶切的重组质粒35S::SbSNAC1作为阳性对照，以Bar基因探针进行杂交，结果如图8所示，如预期所料，用Hind III酶切的重组质粒35S::SbSNAC1杂交出10.24kb的条带(由于质粒上样量较低，导致杂交条带较弱)。利用Hind III酶切Bar代SbSNAC1-466和对照玉米自交系郑58基因组DNA，杂交结果显示T₃-T₅代SbSNAC1-466在7.5-10kb有一条条带，而在对照玉米自交系郑58中没有出现条带。利用EcoR I酶切T₃-T₅代SbSNAC1-466和对照玉米自交系郑58基因组DNA，杂交结果显示T₃-T₅代SbSNAC1-466相在2.5-5kb有一条杂交条带，而在对照玉米自交系郑58中没有出现条带。由于质粒中只有一个Hind III和一个EcoR I酶切位点，因此SbSNAC1-466基因组DNA分别用这两种酶进行酶切杂交的得到的特异条代数就代表插入的拷贝数。杂交结果显示SbSNAC1-466事件的外源插入序列有1个拷贝的Bar基因。

通过上述Southern杂交结果表明，SbSNAC1-466事件T-DNA片段在玉米基因组上是单一位点插入，插入位点上有1个拷贝的SbSNAC1和Bar基因，并可在不同世代间稳定遗传。

本发明的发明人将该SbSNAC1-466株系于2019年8月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，参椐的生物材料(株)为SbSNAC1-466，建议的分类命名玉米Zea mays，其保藏编号为CGMCCNo.18331。

实施例3抗旱转基因玉米SbSNAC1-466事件插入位点的外源插入片段5′端旁侧序列和3′端旁侧序列的确定。

特定的转基因事件其旁侧序列是特异的。因此，应用旁侧序列可以特异的检测转基因事件。如用包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段的探针进行杂交，或设计用于特异性扩增包含至少部分旁侧序列和至少部分外源插入片段的引物，进行PCR扩增，检测特异性条带等。据在5′端旁侧序列设计上游特异性引物，根据外源插入片段(即外源插入的T-DNA)的序列设计下游特异性引物，扩增特异性片段；或可以根据外源插入片段的序列设计上游特异性引物，根据3′端旁侧序列设计下游特异性引物，扩增特异性片段。

一、5′端旁侧序列的获得和验证：

1、提取T₅代SbSNAC1-466的叶片基因组DNA，利用特异性引物和随机引物(特异性引物分别是zsp1：TATCCCTGGCTCGTCGCCGA；zsp2：AGGGCTTCAAGAGCGTGGTCGCT；zsp3：CCGTCACCGAGATTTGACTCGAGTTTC；随机引物为genome walking kit(TaKaRa，Code No.6108)试剂盒中提供的AD1-AD4)进行TAIL-PCR反应，获得如SEQ ID NO.3所示在玉米基因组整合位点的左边界881bp长的序列，包括自5′末端起第1-599位共599bp的玉米基因组序列(即5′端旁侧序列)和第600-881位共282bp的外源插入片段，即外源插入的T-DNA。

2、根据SEQ ID NO.3的自5′末端起第1-599位的玉米基因组序列信息设计特异性上游引物466YZ-F9(GGTTCTCCAACAACCAAACCAC，SEQ ID NO.5)、466YZ-F10(ACATGTTATCCAACGGCTTTGT，SEQ ID NO.7)、466YZ-F11(GTCAGCGTACCTTGACCACGC，SEQ IDNO.9)，根据序列表中如SEQ ID NO.3所示的自5′末端起第600-881位的外源插入片段的序列设计下游引物466YZ-R9(TACTAAAATCCAGATCCCCCGA，SEQ ID NO.6)、466YZ-R10(CGAGATTTGACTCGAGTTTCTCC，SEQ ID NO.8)、466YZ-R11(CCAGATCCCCCGAATTAATTC，SEQ IDNO.10)。

以T₅代SbSNAC1-466叶片的基因组DNA、玉米自交系郑58叶片的基因组DNA和水为模板，利用466YZ-F9和466YZ-R9引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图9所示，T₅代SbSNAC1-466扩增得到195bp的特异片段，而玉米自交系郑58叶片的基因组DNA和水中没有扩增得到195bp的片段；利用466YZ-F10和466YZ-R10引物，进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图9所示，T₅代SbSNAC1-466中扩增得到337bp的特异片段，而玉米自交系郑58叶片的基因组DNA和水中没有扩增得到337bp的片段；利用466YZ-F11和466YZ-R11引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图9所示，T₅代SbSNAC1-466的基因组DNA中扩增得到472bp的特异片段，而玉米自交系郑58叶片的基因组DNA和水中没有扩增得到472bp的片段。其中，扩增条件均为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，35cycles；72℃5min；15℃保存。

二、3′端旁侧序列的获得和验证：

根据5′端旁侧序列与玉米B73参考基因组对比，在5′端下游1000bp上按照设计12条引物F21-32(F21：GGCCACATCACATTAGAGAGGAGAG；F22：ACCATCAGCTCGGCCACATC；F23：TCGACAGACCCACTGTCTAGCTG；F24：CAGTATCGACTGAGCTGACAGGTC；F25：CCAATTATCCCGTGTACAGATCG；F26：CCAAACACCGGGGTGAATTTAGT；F27：GCTAACTACGCCACATTTTGCCTA；F28：GAACTGGGGGTGAGGGTGTAAAG；F29：TTGCTCGTGGAGTCATCAAAGGT；F30：ACAGCGGTCTCAGGATATTGTGT；F31：CGAGACCCGAGATACACCCAATG；F32：ACGAGCAGCACAAGTGAGCAATA)。根据外源插入片段(即外源插入的T-DNA)的序列设计上游引物S10(AGGGACCGCAAGTACCCAAAC，SEQ ID NO.14)，利用引物10分别与上述引物F21-32配对，分别以T₅代SbSNAC1-466的基因组DNA和玉米自交系郑58的基因组DNA进行扩增，获得扩增产物。电泳检测如图10所示，只有SbSNAC1-466株系中得到单一的电泳条带，而玉米自交系郑58没有扩增得到相应片段，另外，S10与F21-32配对的引物扩增的扩增产物为依次递增的单一条带。经测序为SbSNAC1-466株系的3′端旁侧序列，通过测序得到了准确的3′端旁侧序列后，设计引物进一步验证其旁侧序列。在3′端旁侧序列上设计了R6(TTAGAGTGGAGAAACGCCGAGGT，SEQ ID NO.11)；R7(TAGATTGGCAAGACGGTGGATAC，SEQ ID NO.12)；R8(AAATGAATCCAAACACCCCCTCC，SEQ ID NO.13)，利用S10引物分别与R6、R7和R8配对，以T₅代SbSNAC1-466的基因组DNA和玉米自交系郑58的基因组DNA进行扩增，获得扩增产物。结果如图11所示，利用S10和R6引物扩增T₅代SbSNAC1-466的基因组DNA得到612bp的特异片段，而玉米自交系郑58叶片的基因组DNA没有扩增得到相应片段；利用S10和R7引物扩增T₅代SbSNAC1-466的基因组DNA得到762bp的特异片段，而玉米自交系郑58叶片的基因组DNA没有扩增得到相应片段；利用S10和R8引物扩增T₅代SbSNAC1-466的基因组DNA得到827bp的特异片段，而玉米自交系郑58叶片的基因组DNA没有扩增得到相应片段。

以S10/R8引物对的扩增结果为准，通过扩增获得了如SEQ ID NO.4所示的在玉米基因组整合位点的右边界827bp长的序列，包括第1-546位共546bp的外源插入片段(即外源插入的T-DNA)和第547-827位共281位的玉米基因组序列(即3′端旁侧序列)。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 转SbSNAC1基因玉米SbSNAC1-466的外源插入片段的旁侧序列及其应用

<130> GNCFY201029

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 966

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggattgc cggtgatgag gagggagagg gacgcggagg cggagctgaa cctgccgccg 60

gggttccggt tccaccccac agacgacgag ctggtggagc actacctgtg ccggaaagcg 120

gcggggcagc gcctcccggt gcccatcatc gcggaggtgg acctatacaa gttcgacccc 180

tgggacctgc cggagcgcgc gctgttcggg gtcagggagt ggtacttctt cacgcccagg 240

gaccgcaagt acccaaacgg gtcccgcccc aaccgcgccg ccggcaacgg gtactggaag 300

gccaccggcg ccgacaagcc cgtcgcgccg cggggccgca cgctcgggat caagaaggcg 360

ctcgtcttct acgccgggaa ggcgccgcgt ggggtcaaga cggactggat catgcacgag 420

tacaggctcg cggacgccgg ccgcgcagcc gcctccaaga agggatcgct caggctggat 480

gactgggtgc tgtgccgcct gtacaataag aagaacgagt gggagaagat gcagctgggg 540

aaggagtccg ccgccggcgt cggcaccgcc aaggaggagg cgatggacat gaccacctcg 600

cactcgcact cccactcgca gtcgcactcg cactcgcact cgtggggcga gacgcgcacg 660

ccggagtcgg agatcgtgga caacgacccg ttcccggagc tggactcgtt cccggcgttc 720

caggacccgg cggcggcgat gatgatggtg cccaagaagg agcaggtgga cgacggcagc 780

gccgccgcca acgccgccaa gagcagcgac ctgttcgtgg accttagcta cgacgacatc 840

cagggcatgt acagcggcct cgacatgctg cccccgccag gggaggactt cttctcctcg 900

ctcttcgcgt cgcccagggt caaggggaac cagcccgccg gagccgccgg gttggggcca 960

ttctga 966

<210> 2

<211> 321

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Leu Pro Val Met Arg Arg Glu Arg Asp Ala Glu Ala Glu Leu

1 5 10 15

Asn Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Asp Glu Leu Val

20 25 30

Glu His Tyr Leu Cys Arg Lys Ala Ala Gly Gln Arg Leu Pro Val Pro

35 40 45

Ile Ile Ala Glu Val Asp Leu Tyr Lys Phe Asp Pro Trp Asp Leu Pro

50 55 60

Glu Arg Ala Leu Phe Gly Val Arg Glu Trp Tyr Phe Phe Thr Pro Arg

65 70 75 80

Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Pro Asn Arg Ala Ala Gly Asn

85 90 95

Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala Asp Lys Pro Val Ala Pro Arg Gly

100 105 110

Arg Thr Leu Gly Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Ala Gly Lys Ala

115 120 125

Pro Arg Gly Val Lys Thr Asp Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Ala

130 135 140

Asp Ala Gly Arg Ala Ala Ala Ser Lys Lys Gly Ser Leu Arg Leu Asp

145 150 155 160

Asp Trp Val Leu Cys Arg Leu Tyr Asn Lys Lys Asn Glu Trp Glu Lys

165 170 175

Met Gln Leu Gly Lys Glu Ser Ala Ala Gly Val Gly Thr Ala Lys Glu

180 185 190

Glu Ala Met Asp Met Thr Thr Ser His Ser His Ser His Ser Gln Ser

195 200 205

His Ser His Ser His Ser Trp Gly Glu Thr Arg Thr Pro Glu Ser Glu

210 215 220

Ile Val Asp Asn Asp Pro Phe Pro Glu Leu Asp Ser Phe Pro Ala Phe

225 230 235 240

Gln Asp Pro Ala Ala Ala Met Met Met Val Pro Lys Lys Glu Gln Val

245 250 255

Asp Asp Gly Ser Ala Ala Ala Asn Ala Ala Lys Ser Ser Asp Leu Phe

260 265 270

Val Asp Leu Ser Tyr Asp Asp Ile Gln Gly Met Tyr Ser Gly Leu Asp

275 280 285

Met Leu Pro Pro Pro Gly Glu Asp Phe Phe Ser Ser Leu Phe Ala Ser

290 295 300

Pro Arg Val Lys Gly Asn Gln Pro Ala Gly Ala Ala Gly Leu Gly Pro

305 310 315 320

Phe

<210> 3

<211> 881

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agaggagtag cataggcaat ggtaatggca gtggcagagg agggtgatgg ggatgggaga 60

tggcaggcag gcacattcat catcattcgg tgctactagt agtggtcgaa ctgccggcga 120

acgcggcggg acatggcagg cagtcagccg tgcgtgtgaa cgtgcccatt gacccgtggc 180

cgccactggt agcggcagct gcaggcgtga ggcattgtcg gtcagcgtac cttgaccacg 240

cggcgcgggc tgcagttgca gttgcaggtg atggaaatta aaaagatgag aacttgagaa 300

gggagggagg gagagggacg gcgcagctgg agcttgcttg cactggaggt cgcggcttac 360

ctgccgcatt tgcagtgcgc gcgcccaggg accaccgcac cagccgcgcg ctcggccttg 420

ccgtctcgtt tcggacggcc ccgcccgccg ggggagggag acgcgtttcc cactcgcagt 480

cgcagagcca aagcagaagc agccgcggtt ctccaacaac caaaccacgt gctccaccac 540

atgttatcca acggctttgt ttgcatcaag attcgtgcgg gtccacctaa tatattgtgg 600

tggagcacaa attgacgctt agacaactta ataacacatt gcggacgttt ttaatgtact 660

gaattaacgc cgaattaatt cgggggatct ggattttagt actggatttt ggttttagga 720

attagaaatt ttattgatag aagtatttta caaatacaaa tacatactaa gggtttctta 780

tatgctcaac acatgagcga aaccctatag gaaccctaat tcccttatct gggaactact 840

cacacattat tatggagaaa ctcgagtcaa atctcggtga c 881

<210> 4

<211> 827

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agggaccgca agtacccaaa cgggtcccgc cccaaccgcg ccgccggcaa cgggtactgg 60

aaggccaccg gcgccgacaa gcccgtcgcg ccgcggggcc gcacgctcgg gatcaagaag 120

gcgctcgtct tctacgccgg gaaggcgccg cgtggggtca agacggactg gatcatgcac 180

gagtacaggc tcgcggacgc cggccgcgca gccgcctcca agaagggatc gctcaggctg 240

gatgactggg tgctgtgccg cctgtacaat aagaagaacg agtgggagaa gatgcagctg 300

gggaaggagt ccgccgccgg cgtcggcacc gccaaggagg aggcgatgga catgaccacc 360

tcgcactcgc actcccactc gcagtcgcac tcgcactcgc actcgtgggg cgagacgcgc 420

acgccggagt cggagatcgt ggacaacgac ccgttcccgg agctggactc gttcccggcg 480

ttccaggacc cggcggcggc gatgatgatg gtgcccaaga aggagcaggt ggacgacggc 540

agcgcctgcg cgagatgcat gcatttttta tcgcgagaag ctattttcaa cctcggcgtt 600

tctccactct aatgtgatgt ggccgagctg agtggactgt tcggccagct agacaggtct 660

gtcgacctgt cagctcagtc gatactgact gttggagcta aaccagaccg atctgtacac 720

gggagaattg gtctggtttg tatccaccgt cttgccaatc taagtttttt taaaaaaata 780

acaaattcac cctatactat atatggaggg ggtgtttgga ttcattt 827

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggttctccaa caaccaaacc ac 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tactaaaatc cagatccccc ga 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acatgttatc caacggcttt gt 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgagatttga ctcgagtttc tcc 23

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtcagcgtac cttgaccacg c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccagatcccc cgaattaatt c 21

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttagagtgga gaaacgccga ggt 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tagattggca agacggtgga tac 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaatgaatcc aaacaccccc tcc 23

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agggaccgca agtacccaaa c 21

Claims

1.用于检测或辅助检测待测玉米是否为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的引物对，其特征在于：所述引物对包括引物对I和/或引物对II；

所述引物对I的上游引物根据转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的外源插入片段的5′ 端旁侧序列设计获得，下游引物根据所述外源插入片段的序列设计获得；

所述引物对II的上游引物根据转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的外源插入片段的序列设计获得，下游引物根据转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的外源插入片段的3′端旁侧序列设计获得；

所述引物对I为如下(1)-(3) 所示引物对中的任一种：

(1) 由SEQ ID NO.5所示的单链DNA 分子的上游引物和SEQ ID NO.6 所示的单链DNA分子的下游引物组成的引物对；

(2) 由SEQ ID NO.7所示的单链DNA 分子的上游引物和SEQ ID NO.8所示的单链DNA分子的下游引物组成的引物对；

(3) 由SEQ ID NO.9所示的单链DNA 分子的上游引物和SEQ ID NO.10所示的单链DNA分子的下游引物组成的引物对；

所述引物对II为如下(4)-(6) 所示引物对中的任一种：

(4) 由SEQ ID NO.14所示的单链DNA 分子的上游引物和SEQ ID NO.11所示的单链DNA分子的下游引物组成的引物对；

(5) 由SEQ ID NO.14所示的单链DNA 分子的上游引物和SEQ ID NO.12所示的单链DNA分子的下游引物组成的引物对；

(6) 由SEQ ID NO.14所示的单链DNA 分子的上游引物和SEQ ID NO.13所示的单链DNA分子的下游引物组成的引物对。

2.权利要求1所述的引物对在制备用于检测或辅助检测待测玉米是否为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的试剂盒中的应用。

3.用于检测或辅助检测待测玉米是否为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含有权利要求1所述的引物对。

4.权利要求1所述的引物对或权利要求3所述试剂盒在检测或辅助检测待测玉米是否为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466中的应用。

5.检测或辅助检测待测玉米是否为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466的方法，其特征在于；所述方法为C1）和/或C2）；

C1）包括如下步骤：

1）以所述待测玉米的基因组DNA为模板，采用权利要求1或权利要求3中任一所述引物对I进行PCR扩增，获得PCR 产物；

2）若所述PCR 产物中含有预期大小的DNA 片段，则所述待测玉米为或候选为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466；若所述PCR 产物中不含有预期大小的DNA 片段，则所述待测玉米不为或候选不为转SbSNAC1基因抗旱玉米SbSNAC1-466；

所述预期大小的DNA 片段如下：若所述引物对I为由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的两条单链DNA 分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA 片段为195bp 的DNA 片段；若所述引物对I为由SEQ ID NO.7 和SEQ ID NO.8所示的两条单链DNA 分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA 片段为338bp 的DNA 片段；若所述引物对I为由SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示的两条单链DNA 分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA 片段为472bp 的DNA片段；

C2）包括如下步骤：

1）以所述待测玉米的基因组DNA为模板，采用权利要求1或权利要求3中任一所述引物对II进行PCR扩增，获得PCR 产物；

所述预期大小的DNA 片段如下：若所述引物对II为由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.11所示的两条单链DNA 分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA 片段为612bp 的DNA 片段；若所述引物对II为由SEQ ID NO.14 和SEQ ID NO.12所示的两条单链DNA 分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA 片段为762bp 的DNA 片段；若所述引物对II为由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.13所示的两条单链DNA 分子组成的引物对，则所述预期大小的DNA 片段为827bp 的DNA 片段。