CN106317214B - 小麦耐热相关蛋白TaXPD及其编码基因与应用 - Google Patents

小麦耐热相关蛋白TaXPD及其编码基因与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106317214B
CN106317214B CN201610804152.6A CN201610804152A CN106317214B CN 106317214 B CN106317214 B CN 106317214B CN 201610804152 A CN201610804152 A CN 201610804152A CN 106317214 B CN106317214 B CN 106317214B
Authority
CN
China
Prior art keywords
taxpd
protein
sequence
uvh6
heat resistance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610804152.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106317214A (zh
Inventor
孙其信
胡兆荣
马俊华
郑美
倪中福
姚颖垠
彭惠茹
辛明明
李慧敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN201610804152.6A priority Critical patent/CN106317214B/zh
Publication of CN106317214A publication Critical patent/CN106317214A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106317214B publication Critical patent/CN106317214B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了植物耐热相关蛋白TaXPD及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质为如下a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物耐热性相关的蛋白质。实验证明，向拟南芥突变体uvh6‑1中导入所述蛋白质的编码基因，得到存活率增加和/或下胚轴伸长长度增加和/或离子渗漏率降低的转基因植物。因此，本发明提供的蛋白质对培育耐热性增加的植物，具有重要的理论意义和实用价值。

Description

小麦耐热相关蛋白TaXPD及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及植物耐热相关蛋白TaXPD及其编码基因与应用。
背景技术
随着温室效应的加剧，高温胁迫对作物的威胁日趋严重。据估计，在干燥的季节里，夜间的温度每升高1℃会使水稻减产10％。温度升高对小麦、玉米、大麦等主要作物也产生了严重的影响，从1981年到2002年这20年间，温度的升高已使得世界范围内小麦、玉米、大麦每年减产约4000万吨，相当于50亿美元的经济损失。2013年夏，我国东部及南部出现了极端的高温天气，对包括小麦、玉米、水稻在内的多种作物造成了严重影响。
小麦是我国主要的粮食作物，同时小麦也是喜凉的C3作物，且生育期较长，易受到冷害、冻害、高温等胁迫的影响。小麦灌浆期适宜的温度为20-24℃，相对湿度为70％左右，但在这一时期经常遇到连续的高温(温度为32℃以上)，且相对湿度小于30％，使小麦提早成熟、产量下降、品质降低，亦称干热风危害。因此，培育抗高温(即耐热)的小麦品种具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的耐热性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质。
本发明所提供的蛋白质，可为如下a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物耐热性相关的蛋白质。
其中，序列表中序列2可由758个氨基酸残基组成。
为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)十字花科植物；c4)拟南芥；c5)拟南芥突变体uvh6-1。
所述耐热性可为耐32℃以上的温度，具体可为40℃或45℃。
编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。
编码所述蛋白质的核酸分子，具体可为如下(b1)或(b2)或(b3)所示的DNA分子：
(b1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
(b2)与(b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
序列表中序列1由2277个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
所述重组载体为向载体插入所述核酸分子得到的重组质粒。
所述载体具体可为pEASY-Blunt Cloning Vector或pB2GW7 vector。pEASY-BluntCloning Vector为北京全式金生物技术有限公司的产品。pB2GW7 vector为Invitrogen公司的产品。
所述重组载体具体可为重组质粒甲。所述重组质粒甲可为向pEASY-BluntCloning Vector插入序列表中序列1所示的DNA分子。
所述重组载体具体可为重组质粒pB2GW7-TaXPD。所述重组质粒pB2GW7-TaXPD中含有序列表中序列1所示的DNA分子，表达序列表中序列2所示的蛋白质。
所述重组微生物为将所述重组载体导入出发微生物得到的重组菌。
所述重组微生物具体可为将所述重组质粒pB2GW7-TaXPD导入出发微生物得到的重组菌。
所述出发微生物可为根癌农杆菌。
所述根癌农杆菌具体可为根癌农杆菌GV3101。
所述转基因细胞系均不包括繁殖材料。
d1)或d2)的应用也属于本发明的保护范围：
d1)所述蛋白质，或，所述核酸分子，或，含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控植物耐热性中的应用；
d2)所述蛋白质，或，所述核酸分子，或，含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育耐热性改变的转基因植物中的应用。
上述应用中，所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)十字花科植物；c4)拟南芥；c5)拟南芥突变体uvh6-1。
上述应用中，所述耐热性可为耐32℃以上的温度，具体可为40℃或45℃。
为解决上述技术问题，本发明还提供了培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将编码所述蛋白质的核酸分子导入出发植物，得到耐热性高于所述出发植物的转基因植物。
所述编码所述蛋白质的核酸分子，具体可为如下b1)或b2)或b3)所示的DNA分子：
(b1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
(b2)与(b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质的DNA分子；
(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
序列表中序列1由2277个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。
所述“将编码所述蛋白质的核酸分子导入出发植物”可通过向出发植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向载体插入编码所述蛋白质的核酸分子得到的重组质粒。所述重组载体具体可为重组质粒pB2GW7-TaXPD。所述重组质粒pB2GW7-TaXPD中含有序列表中序列1所示的DNA分子，表达序列表中序列2所示的蛋白质。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种植物育种方法。
本发明所提供的植物育种方法，可包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质的含量或活性，从而增加植物的耐热性。
上述方法中，所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)十字花科植物；c4)拟南芥；c5)拟南芥突变体uvh6-1。
上述方法中，所述耐热性可为耐32℃以上的温度，具体可为40℃或45℃。
所述蛋白质，或，编码所述蛋白质的核酸分子，或，上述任一所述方法，在植物育种中的应用也属于本发明的保护范围。
上文中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述核酸分子转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖所述核酸分子，也可用常规育种技术将所述核酸分子转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
上问中，所述耐热性的增加具体可体现为：存活率增加和/或下胚轴伸长长度增加和/或离子渗漏率降低。
实验证明，利用本发明提供的蛋白质及其编码基因能调控植物的耐热性：向拟南芥突变体uvh6-1中导入蛋白质的编码基因，得到存活率增加和/或下胚轴伸长长度增加和/或离子渗漏率降低的转基因植物，进一步表现为耐热性增加。因此，本发明提供的蛋白质对培育耐热性增加的植物，即抗高温的植物，具有重要的理论意义和实用价值。
附图说明
图1为实施例2的实验结果。
图2为转基因拟南芥的Basta筛选和分子鉴定。
图3为转基因拟南芥高温胁迫下的存活率。
图4为转基因拟南芥高温胁迫下的下胚轴伸长长度。
图5为转基因拟南芥高温胁迫下的离子渗漏率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
根癌农杆菌GV3101为BioVector中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心的产品，货号为Biovector-375。
小麦品种中国春记载于如下文献中：Sears，E.R.，and T.E.Miller.The historyof Chinese Spring wheat.Cereal Research Communication(1985)：261-263.在下文中，小麦品种中国春简称为小麦。
TRNzol总RNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的产品。M-MLV反转录酶为Promega公司的产品。pEASY-Blunt Cloning Vector为北京全式金生物技术有限公司的产品。SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒为TaKaRa公司的产品。pEMTRTM Directional TOPOCloning Kits为Invitogen公司的产品。Basta为BBI Life Sciences公司的产品，产品目录号为B714229-100ml。pB2GW7 vector为Invitrogen公司的产品。
30％PEG8000/30mM MgCl2Solution为BP ClonaseTMII Enzyme Mix中的组件。BP ClonaseTM II Enzyme Mix为Invitogen公司的产品，产品目录号为11789-020。
哥伦比亚生态型拟南芥为Arabidopsis Biological Resource Center的产品，详细网址为http：//abrc.osu.edu/。在下文中，哥伦比亚生态型拟南芥简称为野生型拟南芥或WT。
拟南芥突变体uvh6-1记载于如下文献中：Jenkins M E，Harlow G R，Liu Z，etal..Radiation-sensitive mutants of Arabidopsis thaliana.Genetics，1995，140(2)：725-732.在下文中，拟南芥突变体uvh6-1简称拟南芥突变体或uvh6。
下述实施例中所述高温是指温度为32℃以上。
实施例1、蛋白TaXPD的编码基因的克隆
从小麦中克隆出蛋白TaXPD的编码基因，即TaXPD基因。具体步骤如下：
1、采用TRNzol总RNA提取试剂盒提取小麦新鲜叶片的总RNA，然后利用M-MLV反转录酶反转录出第一链cDNA。
2、人工合成引物F：5’-ATGAAGTTCGATCTTGAAGG-3’和R：5’-TCACATCTCCATGGCGTCCC-3’。
3、完成步骤1和2后，以步骤1提取的cDNA为模板，以F和R为引物进行PCR扩增，得到约2300bp的双链DNA分子。
4、将双链DNA分子和pEASY-Blunt Cloning Vector连接，得到重组质粒甲。
根据测序结果，重组质粒甲中含有序列表中序列1所示的DNA分子(以下简称TaXPD基因)，表达序列表中序列2所示的蛋白质(以下简称蛋白质TaXPD或蛋白TaXPD)。
实施例2、实时定量检测高温处理不同时间的条件下小麦样本中TaXPD基因的相对表达量
进行三次重复试验，每次重复试验的步骤均如下：
(1)获得样本
将生长至10天的小麦幼苗置于22℃条件下处理3h，然后取叶片，放入液氮中保存，得到样本1(作为对照)。
将生长至10天的小麦幼苗置于40℃条件下处理1h，然后取叶片，放入液氮中保存，得到样本2。
按照上述方法，将1h分别替换为2h、3h、6h和12h，其它步骤均不变，依次获得样本3、样本4、样本5和样本6。
(2)实时定量检测高温条件下处理不同时间的小麦样本中TaXPD基因的相对表达量
采用TRNzol总RNA提取试剂盒提取步骤(1)中样本(样本1、样本2、样本3、样本4、样本5或样本6)的总RNA，将该总RNA用M-MLV反转录酶反转录为cDNA，获得cDNA溶液，cDNA溶液中DNA的浓度为1000ng/μL。
以该cDNA溶液为模板，采用Bio-Rad C1000 Cycler real time PCR system实时定量检测样本中TaXPD基因的相对表达量(以TaActin基因作为内参基因)。反应条件：95℃预变性3min；95℃15s，58℃15sec，72℃15s，40个循环；65-95℃绘制溶解曲线。
鉴定TaXPD基因的引物为5’-TGATCCTGGTGTTGTGAGGA-3’和5’-GTCAAGGGCCAATGTTGTTT-3’。鉴定TaActin基因的引物为actin-F：5’-ACTCATCATACTCGCCCTTCG-3’和actin-R：5’-CAAGCAGCATGAAGATCAAGGT-3’。
其中荧光定量PCR上样体系按照SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒的说明书上样，反应体系为共10μl，包括5μL SYBR Premix Ex Taq(2×)；1μL正向引物(正向引物的浓度为2μM)、1μL反向引物(反向引物的浓度为2μM)、0.2μL ROX Reference Dye II(50×)，0.7μLcDNA溶液和2.1μL ddH2O。SYBR Premix Ex Taq(2×)和ROXReference Dye II(50×)均为SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒中的组件。
采用比较阈值法对实验结果进行分析，设置荧光阈值，确定在该荧光阈值下的循环数Ct值，根据Ct平均值计算基因的相对表达量。实验结果见图1(CK为样本1，1h为样本2，2h为样本3，3h为样本4，6h为样本5，12h为样本6)，结果表明，随着胁迫时间的增加，TaXPD基因逐步上调表达，40℃胁迫3h时表达量达到最高，之后下调表达。因此，TaXPD基因的表达受高温胁迫的诱导。
实施例3、转基因拟南芥的获得及鉴定
一、重组质粒pB2GW7-TaXPD和GV3101/pB2GW7-TaXPD的获得
1、重组质粒pB2GW7-TaXPD的获得
利用Gateway技术构建过表达载体，具体步骤如下：
(1)目标基因的获得
根据TaXPD基因的开放阅读框序列设计引物如下：
TaXPD-TOPOF：5’-CACCATGAAGTTCGATCTTGAAGG-3’
TaXPD-TOPOR：5’-TCACATCTCCATGGCGTCCC-3’。
采用TRNzol总RNA提取试剂盒提取小麦新鲜叶片的总RNA，然后利用M-MLV反转录酶反转录出第一链cDNA，获得cDNA溶液，cDNA溶液中DNA的浓度为1000ng/μL。
以该cDNA溶液为模板，以TaXPD-TOPOF和TaXPD-TOPOR为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
(2)纯化的PCR扩增产物的获得
①将步骤(1)获得的PCR扩增产物用ddH2O稀释至4倍体积，得到PCR扩增产物稀释液。
②向PCR扩增产物稀释液中加入1/2倍体积的30％PEG8000/30mM MgCl2Solution，涡旋混匀，然后10000rpm离心15min。
③完成步骤②后，弃上清，晾干后加入30μL ddH2O溶解，得到去除引物二聚体的PCR扩增产物，即纯化的PCR扩增产物。
(3)BP反应
按pEMTRTMDirectional TOPO Cloning Kits说明书自带操作步骤，将步骤(2)得到的纯化的PCR扩增产物和TOPO vector(pEMTRTMDirectional TOPO Cloning Kits中的组件)进行BP重组反应，得到BP反应产物。
(4)转化
将步骤(3)得到的BP反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到的克隆即为入门克隆，该入门克隆中的质粒为入门质粒，将该入门质粒命名为TOPO-TaXPD，将入门质粒送测序，测序结果表明该入门质粒含有序列表中序列1所示的DNA分子。
(5)LR反应
将步骤(4)得到的TOPO-TaXPD和pB2GW7 vector进行LR重组反应，得到LR反应产物。
(6)转化
将步骤(5)得到的LR反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到的克隆即为目标克隆，该目标克隆中的质粒为目标质粒，将该目标质粒命名为重组质粒pB2GW7-TaXPD，测序结果表明，重组质粒pB2GW7-TaXPD中含有序列表中序列1所示的DNA分子，表达序列表中序列2所示的蛋白质TaXPD。
2、GV3101/pB2GW7-TaXPD的获得
将重组质粒pB2GW7-TaXPD导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/pB2GW7-TaXPD。
3、GV3101/pB2GW7的获得
将pB2GW7 vector导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/pB2GW7。
二、转基因拟南芥的获得
1、采用拟南芥花序浸花转化法(记载于如下文献中Clough，S.J.，andBent，A.F..Floraldip：asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJ.(1998)16，735-743.)，将步骤一中1制备的GV3101/pB2GW7-TaXPD转至野生型拟南芥中，获得T1代转TaXPD基因的野生型拟南芥的种子。
2、将步骤1获得的T1代转TaXPD基因野生型拟南芥的种子播种于含有50mg/LBasta的MS培养基上，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为T1代转TaXPD基因阳性苗，T1代转TaXPD基因阳性苗收到的种子即为T2代转TaXPD基因的野生型拟南芥的种子。
3、将步骤2筛选出的不同株系的T2代转TaXPD基因的野生型拟南芥的种子播种于含有50mg/L Basta的MS培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3∶1，则该株系为TaXPD基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T3代转TaXPD基因的野生型拟南芥的种子。
4、将步骤3筛选出的T3代转TaXPD基因的野生型拟南芥的种子再次播种于含有50mg/L Basta的MS培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T3代纯合转TaXPD基因的野生型拟南芥。将其中12个T3代纯合转TaXPD基因的野生型拟南芥的株系依次命名为p35S：TaXPD/WT-1至p35S：TaXPD/WT-12，并进行后续实验。
按照上述方法，将GV3101/pB2GW7-TaXPD替换为GV3101/pB2GW7，其它步骤均相同，得到T3代纯合转空载体的野生型拟南芥的植株，简称转空载体的野生型拟南芥。
按照上述方法，将野生型拟南芥替换为uvh6，其它步骤均相同，得到T3代纯合转TaXPD基因的uvh6，将其中6个T3代纯合转TaXPD基因的uvh6的株系依次命名为p35S：TaXPD/uvh6-1至p35S：TaXPD/uvh6-6，并进行后续实验。
按照上述方法，将GV3101/pB2GW7-TaXPD替换为GV3101/pB2GW7，野生型拟南芥替换为uvh6，其它步骤均相同，得到T3代纯合转空载体的拟南芥突变体的植株，简称转空载体的拟南芥突变体。
T3代纯合转TaXPD基因的野生型拟南芥的Basta筛选具体见图2中A(箭头所指为野生型拟南芥，作为对照)。T3代纯合转TaXPD基因的uvh6的Basta筛选具体见图2中B(箭头所指为uvh6，作为对照)。
三、转基因拟南芥的分子鉴定
1、分别取p35S：TaXPD/WT-1至p35S：TaXPD/WT-12的T3代种子和p35S：TaXPD/uvh6-1至p35S：TaXPD/uvh6-6的T3代种子，种植于营养土中，25℃培养4周，依次得到p35S：TaXPD/WT-1至p35S：TaXPD/WT-12的幼苗和p35S：TaXPD/uvh6-1至p35S：TaXPD/uvh6-6的幼苗。
2、分别提取步骤1获得的幼苗的叶片的基因组DNA并以其作为模板，以5’-ATGAAGTTCGATCTTGAAGG-3’和5’-TCACATCTCCATGGCGTCCC-3’为引物进行PCR扩增，然后进行电泳。
按照上述方法，将步骤1获得的幼苗的叶片的基因组DNA替换为水，其它步骤均相同，作为阴性对照。
按照上述方法，将步骤1获得的幼苗叶片的基因组DNA替换为重组质粒pB2GW7-TaXPD，其它步骤均相同，作为阳性对照。
按照上述方法，将步骤1获得的幼苗叶片的基因组DNA去掉(即PCR反应体系中没有模板)，其它步骤均相同，作为空白对照。
实验结果如图2中C(泳道1-12为p35S：TaXPD/WT-1至p35S：TaXPD/WT-12，泳道13-17为p35S：TaXPD/uvh6-1至p35S：TaXPD/uvh6-5，M为Marker，泳道18为阴性对照，泳道19为阳性对照，泳道20-23为空白对照)。结果表明，p35S：TaXPD/WT-1、p35S：TaXPD/WT-2、p35S：TaXPD/WT-4至p35S：TaXPD/WT-12和p35S：TaXPD/uvh6-1至p35S：TaXPD/uvh6-5均可扩增得到2300bp的条带。结果表明，p35S：TaXPD/WT-1、p35S：TaXPD/WT-2、p35S：TaXPD/WT-4至p35S：TaXPD/WT-12均为转TaXPD基因阳性的野生型拟南芥，p35S：TaXPD/uvh6-1至p35S：TaXPD/uvh6-5均为转TaXPD基因阳性的拟南芥突变体。
四、转基因拟南芥的耐热性鉴定
1、存活率鉴定
实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：
(1)将p35S：TaXPD/WT-1的T3代种子、WT的种子、拟南芥突变体的种子、转空载体的野生型拟南芥、转空载体的拟南芥突变体或p35S：TaXPD/uvh6-1的T3代种子播种于1/2MS培养基，置于温室中培养5天(温度为20±2℃，湿度为55-65％，光照周期为16h光照和8h黑暗)。
(2)完成步骤(1)后，置于黑暗条件下，45℃处理2h。
(3)完成步骤(2)后，置于温室中培养2天(温度为20±2℃，湿度为55-65％，光照周期为16h光照和8h黑暗)，统计拟南芥幼苗的存活率。拟南芥幼苗的存活率＝存活的拟南芥幼苗株数/种植的拟南芥种子个数×100％。
将p35S：TaXPD/WT-1的T3代种子、WT的种子、拟南芥突变体的种子、转空载体的野生型拟南芥、转空载体的拟南芥突变体或p35S：TaXPD/uvh6-1的T3代种子播种于1/2MS培养基，置于温室中培养7天(温度为22℃，湿度为55-65％)，统计拟南芥幼苗的存活率，作为对照。
实验结果见图3(A为对照的表型，B为45℃胁迫后的表型，C为拟南芥幼苗的存活率，p35S：TaXPD/uvh6为p35S：TaXPD/uvh6-1，p35S：TaXPD/WT为p35S：TaXPD/WT-1)。结果表明，经高温胁迫处理后，拟南芥突变体的存活率最低，而p35S：TaXPD/uvh6-1的存活率有所提高，p35S：TaXPD/uvh6-1和野生型拟南芥的存活率无显著差异，转空载体的拟南芥突变体和拟南芥突变体的存活率无显著差异，转空载体的野生型拟南芥和野生型拟南芥的存活率无显著差异。因此，TaXPD基因在耐热调控中发挥着重要的作用。但是与野生型拟南芥相比，p35S：TaXPD/WT-1的存活率无显著提高，推测可能是由于植物耐热调控网络复杂，尽管TaXPD基因在耐热性上发挥着重要作用，但在高温胁迫下只增加一个基因的表达量不足以抵抗高温对植物体造成的损伤，因此仅仅通过提高野生型拟南芥中TaXPD的表达量不能显著的提高其耐热性。
2、下胚轴伸长长度的测量
下胚轴伸长长度是衡量耐热性的一个重要指标，为了进一步验证TaXPD基因是否参与可耐热性调控，对下胚轴伸长长度进行了测量。实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：
(1)将p35S：TaXPD/WT-1的T3代种子、WT的种子、拟南芥突变体的种子、转空载体的野生型拟南芥、转空载体的拟南芥突变体或p35S：TaXPD/uvh6-1的T3代种子播种于MS培养基，用锡箔纸保住培养基，在温室中竖直放置培养2.5天(温度为22℃，湿度为55-65％)。
(2)完成步骤(1)后，45℃处理2h。
(3)完成步骤(2)后，置于温室中竖直放置培养2.5天(温度为22℃，湿度为55-65％)，测量下胚轴伸长长度。
将p35S：TaXPD/WT-1的T3代种子、WT的种子、拟南芥突变体的种子、转空载体的野生型拟南芥、转空载体的拟南芥突变体或p35S：TaXPD/uvh6-1的T3代种子播种于MS培养基，置于温室中竖直放置培养5天(温度为22℃，湿度为55-65％，光照周期为16h光照和8h黑暗)，测量下胚轴伸长长度，作为对照。
实验结果见图4(A中左图为对照的表型，A中右图为45℃胁迫后的表型，B为下胚轴伸长长度，p35S：TaXPD/uvh6为p35S：TaXPD/uvh6-1，p35S：TaXPD/WT为p35S：TaXPD/WT-1)。结果表明，无论在正常生长条件下(22℃)还是在高温胁迫条件下(45℃)，拟南芥突变体和转空载体的拟南芥突变体的下胚轴伸长长度无显著差异，但均均显著低于其它材料，且其它材料间的下胚轴伸长长度均无显著差异。因此，丧失了TaXPD基因的拟南芥突变体的耐热性降低，TaXPD基因可恢复拟南芥突变体的耐热性。
3、离子渗漏率的测定
离子渗漏率是衡量耐热性的一个重要指标，为了进一步验证TaXPD基因是否参与可耐热性调控，对离子渗漏率进行了测定。实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：
(1)将p35S：TaXPD/WT-1的T3代种子、p35S：TaXPD/WT-2的T3代种子、p35S：TaXPD/WT-3的T3代种子、WT的种子、拟南芥突变体的种子、转空载体的野生型拟南芥、转空载体的拟南芥突变体、p35S：TaXPD/uvh6-1的T3代种子、p35S：TaXPD/uvh6-2的T3代种子或p35S：TaXPD/uvh6-3的T3代种子播种于MS培养基，置于温室中培养4周(温度为22℃，湿度为55-65％，光照周期为16h光照和8h黑暗)。
(2)完成步骤(1)后，用打孔器(直径为1cm)从莲座叶上取样(取样时需尽量避开主叶脉)，然后用蒸馏水冲洗3次并晾干，得到样品。
(3)完成步骤(2)后，随机选取6个样品置于50mL试管中，加入12mL蒸馏水，然后42℃水浴1h，室温放置24h后测定电导率值，记为T1。
(4)完成步骤(3)后，取所述试管，121℃灭菌15min，室温放置24h后测定电导率值，记为T2。
根据步骤(3)和(4)测定的电导率值，计算离子渗漏率。
离子渗漏率(％)＝T1/T2×100％。
实验结果见图5。结果表明，拟南芥突变体和转空载体的拟南芥突变体的离子渗漏率均达到90％以上，对高温胁迫极其敏感；野生型拟南芥和转空载体的野生型拟南芥的离子渗漏率无显著差异；p35S：TaXPD/uvh6-1的离子渗漏率虽未完全降低到野生型拟南芥的水平，但较拟南芥突变体降低明显，达到了显著水平。离子渗漏率的测定结果与上述结果一致，进一步说明了TaXPD基因在耐热调控中发挥着重要作用。

Claims (3)

1.如下1）-3）任一所述在提高拟南芥突变体uvh6-1耐热性中的应用；
1）蛋白质，氨基酸序列如序列表中序列2所示；
2）编码1)所述蛋白质的核酸分子；
3）含有2)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述核酸分子为的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
3.一种提高拟南芥突变体uvh6-1的耐热性方法，包括如下步骤：增加植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，从而提高拟南芥突变体uvh6-1的耐热性。
CN201610804152.6A 2016-09-05 2016-09-05 小麦耐热相关蛋白TaXPD及其编码基因与应用 Active CN106317214B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610804152.6A CN106317214B (zh) 2016-09-05 2016-09-05 小麦耐热相关蛋白TaXPD及其编码基因与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610804152.6A CN106317214B (zh) 2016-09-05 2016-09-05 小麦耐热相关蛋白TaXPD及其编码基因与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106317214A CN106317214A (zh) 2017-01-11
CN106317214B true CN106317214B (zh) 2019-09-13

Family

ID=57788136

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610804152.6A Active CN106317214B (zh) 2016-09-05 2016-09-05 小麦耐热相关蛋白TaXPD及其编码基因与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106317214B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109371038B (zh) * 2018-11-19 2021-01-26 华南农业大学 一个控制亚非稻杂种不育的基因s1a4及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1793371A (zh) * 2005-11-16 2006-06-28 山东农业大学 罗布麻dna解旋酶基因apdh1序列及其克隆与应用
CN101456906A (zh) * 2008-12-18 2009-06-17 杭州市农业科学研究院 水稻蛋白OsSRM及其编码基因与应用
CN104136631A (zh) * 2011-12-29 2014-11-05 牛津纳米孔技术公司 使用xpd解旋酶表征多核苷酸的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1793371A (zh) * 2005-11-16 2006-06-28 山东农业大学 罗布麻dna解旋酶基因apdh1序列及其克隆与应用
CN101456906A (zh) * 2008-12-18 2009-06-17 杭州市农业科学研究院 水稻蛋白OsSRM及其编码基因与应用
CN104136631A (zh) * 2011-12-29 2014-11-05 牛津纳米孔技术公司 使用xpd解旋酶表征多核苷酸的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Arabidopsis UVH6, a Homolog of Human XPD and Yeast RAD3 DNA Repair Genes, Functions in DNA Repair and Is Essential for Plant Growth;Zongrang Liu;《Plant Physiol》;20031231;第132卷;第1405-1414页 *
PREDICTED: DNA repair helicase UVH6-like [Brachypodium distachyon];Sequence: XP_003568958.1;《GenBank》;20151208;序列 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106317214A (zh) 2017-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6133275B2 (ja) 有用な特徴を有する植物および関連する方法
WO2017092110A1 (zh) 芝麻花序有限基因Sidt1及其SNP标记
CN107475210B (zh) 一种水稻白叶枯病抗性相关基因OsABA2及其应用
CN108103219A (zh) 一种用于鉴别杨梅雌雄的分子标记、引物对及其应用
CN106811462B (zh) 与番茄抗灰叶斑病基因Sm连锁的Indel标记及其扩增引物与应用
CN110468150B (zh) Rgs1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性中的应用
CN104404061A (zh) 水稻黄绿叶突变基因ygl6及其编码的蛋白和应用
CN108003227B (zh) 一种水稻早花时相关蛋白及其编码基因
CN116769796B (zh) ZmENR1及其编码蛋白在玉米育性控制中的应用
CN109735648A (zh) 一种筛选不同千粒重小麦的方法及其专用试剂盒
CN106317214B (zh) 小麦耐热相关蛋白TaXPD及其编码基因与应用
CN110698550B (zh) 一种快速鉴定真梅/杏梅品系的分子检测方法
CN109971763A (zh) 花期调控基因cmp1和相关的载体及其应用
CN116218876A (zh) 一种调控水稻垩白的基因OsB12D3及其编码蛋白和应用
CN105175519B (zh) 蛋白srl2在培育叶卷曲水稻中的应用
CN104805100B (zh) 水稻基因OsSμBP‑2在延缓植物叶片衰老中的应用
CN106916213A (zh) 一种蛋白AsT及其编码基因以及在植物耐逆性中的应用
WO2018184333A1 (zh) 蛋白质nog1在调控植物产量和穗粒数中的应用
CN105950598B (zh) 一个水稻休眠性相关蛋白及其编码基因与应用
CN111471788B (zh) 转SbSNAC1基因玉米SbSNAC1-466的外源插入片段的旁侧序列及其应用
CN105732785B (zh) 蛋白质GhDHN1在调控植物抗逆性中的应用
CN106811448B (zh) 棉花酪氨酸蛋白磷酸酶GhPTP1及其编码基因和应用
CN110229801B (zh) 一种控制水稻叶片衰老的基因及其编码的蛋白质
CN108795949A (zh) 一种水稻叶色调控相关基因OsWSL6及其编码蛋白质和应用
CN116814846B (zh) 与东乡普通野生稻耐盐基因qSST4相连锁的分子标记及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant