CN1793371A - 罗布麻dna解旋酶基因apdh1序列及其克隆与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及罗布麻DNA解旋酶基因APDH1的克隆、重组、耐盐性功能分析及其转基因耐盐碱棉花的选育，属于分子生物学和生物技术领域。利用抑制差减杂交技术，构建盐胁迫和正常条件下罗布麻mRNA正向差减cDNA文库，对从差减文库中筛选的阳性cDNA克隆进行酶切、PCR与逆向Northern斑点杂交鉴定、DNA测序以及核苷酸序列同源性比较，获得一系列盐诱导表达的cDNA序列，其中有一段序列为DNA解旋酶基因的中间片段。然后进行3′和5′末端快速扩增获得编码罗布麻DNA解旋酶全长cDNA，将其命名为APDH1。进一步，构建正义表达载体，转化棉花。获得的转基因棉花植株可以在0.45％的盐碱地正常出苗、开花和吐絮，而非转基因棉花则不能出苗或者在生长过程中死亡。

Description

罗布麻DNA解旋酶基因APDH1序列及其克隆与应用

(一)技术领域

本发明涉及罗布麻DNA解旋酶基因APDH1的克隆、重组、耐盐性功能分析及其转基因耐盐碱棉花的选育，属于分子生物学和生物技术领域。

(二)背景技术

在我国耕地中，盐碱地分布广泛，另外，还有未被开发利用的盐碱荒地。由于灌溉地排水不良和海水入侵，耕地中次生盐碱地面积逐年扩大，仅黄淮海平原各种类型的盐碱地占耕地盐碱地的50％以上。对盐碱地的土壤进行改良耗资巨大，成本昂贵。选育耐盐碱作物品种，不仅经济有效的提高盐碱地作物产量，扩大作物种植面积，而且，可改良盐碱地、改善生态环境，这对实现我国资源节约型农业发展战略、降低农业成本、改善农业生态环境，具有十分重要意义。

盐胁迫可导致非盐生植物的原初危害是渗透胁迫和离子毒害，植物则通过两种途径减轻盐胁迫造成的危害，一是通过渗透调节基因(如甜菜碱脱氢酶基因)积累渗透调节物质，降低渗透胁迫；二是通过细胞膜离子通道基因(如Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因)维持细胞内外离子的平衡，减轻离子的毒害。目前，耐盐碱植物基因工程主要集中在这两个方面，通过转基因技术，获得了耐盐碱转基因植物，但是，这些转基因耐盐植物耐盐性提高是有限的，一方面是由于这些基因来自非盐生植物，其耐盐性功能低于盐生植物；另一方面，植物的耐盐是多基因参与的生物化学代谢过程，而目前应用的基因仅参与其中的一步生物化学代谢过程，因此，从盐生植物中克隆参与多种代谢途径的基因，转化非盐生的农作物，可进一步提高农作物的耐盐性。所以，本发明的目的就是从盐生植物-罗布麻中克隆参与多种代谢途径的基因，转化棉花，以提高转基因棉花的耐盐性。

罗布麻是我国特有的盐生植物，广泛分布于我国的西北内陆和滨海盐碱地，它可以在1％-1.5％的盐碱地正常生长，其耐盐性远远高于非盐生的农作物。在盐胁迫条件下，发明人利用抑制差减杂交技术，从罗布麻叶片中分离得到了一个盐诱导过量表达DNA解旋酶基因的中间片段，然后进行3′和5′末端快速扩增获得编码罗布麻DNA解旋酶全长cDNA，将其命名为APDH1。DNA解旋酶的作用是打开DNA的双螺旋结构，它参与DNA复制、修复、重组和转录等重要的过程，是一个参与多种代谢途径的基因。目前的研究表明，盐胁迫可影响DNA复制、修复、重组和转录，提高DNA解旋酶活性是盐生细菌(Briolat，V.& Reysset，G.，2002，J.Bacteriol.184，2333-2343.)和抗盐酵母(Liu & H.Y.Nefsky，等，2002，J.Biol.Chem.277，2637-2643.)适应盐胁迫的反应机制。因此，发明人进一步构建正义表达载体，转化棉花，结果获得的转基因棉花可以在0.45％的盐碱地正常出苗、开花和吐絮，而非转基因棉花则不能出苗或者在生长过程中死亡。

(三)发明内容

本发明从盐生植物罗布麻中克隆得到编码DNA解旋酶基因APDH1的全长cDNA，然后构建正义表达载体，通过花粉管通道转基因技术转化棉花，结果获得的转基因棉花可以在0.45％的盐碱地正常出苗、开花和吐絮。

该基因的全长cDNA为1621bp，它包含一个1218bp的开放阅读框，编码起始于序列的77位，终止于1294位，编码405个氨基酸，将此氨基酸序列与国际基因库中其它植物编码DNA解旋酶基因的氨基酸序列相比较表明，罗布麻DNA解旋酶与拟南芥、水稻、烟草和菜豆氨基酸的同源性分别为91％、89％、88％和86％，这说明利用抑制差减杂交技术、3′和5′末端快速扩增技术获得了编码罗布麻DNA解旋酶基因。该基因的序列如下：

序列表

(1)SEQ.ID.NO 1的信息

(a)序列特征

  *长度：1621碱基对

  *类型：核酸

  *链型：双链

  *拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：罗布麻

(f)序列描述：SEQ.ID.NO 1

1      attcttgtgc  gaaaaccttt  cttatccacc  ttatctatat  ctctccatcc  tcaacattat

61     agctcggtca  acaagcatgg  ccacaactac  ttcggggccg  gctaatcgta  ggggaaccgt

121    aatcgacgat  aagctggtct  ttgaaacgac  cgaaggagtc  gaggccatta  cctccttcaa

181    tggcatgggc  ataaaagagg  atttactccg  tggtatctat  gcttacggat  tcgaaaagcc

241    ttccgctata  caacagcgag  cggtaatgcc  tatcatacag  ggtcgagatg  taattgcaca

301    agctcaaagt  ggtacgggta  agaccagcat  gattgccctt  acagtatgcc  aggtagttga

361    tacttcggtg  cgtgaagtcc  aagcattaat  actgtcacct  actagagagc  tggcgactca

421    gacagaaaag  gtaattctgg  caattggtga  tcatataaat  attcaagctc  atgcatgcat

481    aggtggcaat  tctgtcggtg  aagatatacg  gaaactagag  catggtgtac  acgtcgtcag

541    tggaactcca  ggccgtgtgt  gtgacatgat  taaaaggcga  agtttgcgaa  ctcgagcaat

601     caagttactt  attctcgatg  aaagtgatga  aatgttaggc  agaggtttca  aagatcagat

661     atatgatgtc  tacagatatc  tgcctccgga  cctacaggta  tgcttgatat  cagctaccct

721     tccacatgaa  attctcgaga  tgacttccaa  gtttatgact  gaacctgtca  agatcctagt

781     gaaacgagat  gaattgactc  tggaggggat  caagcagttc  tttgtagccg  tagagaagga

841     agattggaag  tttgatacac  tctgtgacct  ctatgacaca  ctcacaataa  cactggcggt

901     gatattttgc  aatacgaagc  gtaaggtcga  ctggttaagt  gaaaaaatgc  gaagcaacaa

961     tttcacagtg  tctgtaatgc  acggagacat  gccacagaag  gagcgagatg  ctattatgaa

1021    tgaatttcga  tctggtgcaa  cccgagtttt  gattacaaca  gatgtatggg  caagagggct

1081    agatgttcaa  caggtatcac  ttgtaataaa  ttatgaccta  cctaataaca  gagagctcta

1141    catacatcgc  ataggaaggt  ctggtcgatt  tggtcgtaag  ggagtagcta  ttaattttgt

1201    aaagtccgac  gacatcaaga  ttctgagaga  tattgagcag  tattactcta  cgcagataga

1261    tgaaatgcct  atgaatgttg  ctgatctaat  ttaaaaaagg  ggcatgattt  cggatgggtt

1321    ttttgtgata  gtttagggtt  tttggccttt  ccttaggctt  aaaagggccc  ctttaagtct

1381    gtcagtctga  tcgtactagc  tttttaaggg  ccctttccgt  cgctgaatag  tctagtcagt

1441    gtgtcagtca  gtcgatcgta  gctagtcagt  catgtgttaa  taaaggttta  gtcgttgtta

1501    aacgtcgccc  ggttatatgc  taagtcatgt  ctaaaccacc  catttcccgg  cgcgctagct

1561    agtcagctat  agtcagtcat  cgttaaaaca  taaaaaaaaa  aaaaaaaaaa  aaaaaaaaaa

1621    a

(2)SEQ.ID.NO 2的信息

(a)序列特征

  *长度：405氨基酸

  *类型：氨基酸

  *链型：单链

  *拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ.ID.NO 2

1      MATTTSGPAN  RRGTVIDDKL  VFETTEGVEA  ITSFNGMGIK  EDLLRGIYAY  GFEKPSAIQQ

61     RAVMPIIQGR  DVIAQAQSGT  GKTSMIALTV  CQVVDTSVRE  VQALILSPTR  ELATQTEKVI

121    LAIGDHINIQ  AHACIGGNSV  GEDIRKLEHG  VHVVSGTPGR  VCDMIKRRSL  RTRAIKLLIL

181    DESDEMLGRG  FKDQIYDVYR  YLPPDLQVCL  ISATLPHEIL  EMTSKFMTEP  VKILVKRDEL

241    TLEGIKQFFV  AVEKEDWKFD  TLCDLYDTLT  ITLAVIFCNT  KRKVDWLSEK  MRSNNFTVSV

301    MHGDMPQKER  DAIMNEFRSG  ATRVLITTDV  WARGLDVQQV  SLVINYDLPN  NRELYIHRIG

361    RSGRFGRKGV  AINFVKSDDI  KILRDIEQYY  STQIDEMPMN  VADLI

将利用沙培6周的罗布麻幼苗，分别放入800mM的氯化钠水溶液和蒸馏水处理2天，然后提取叶片和根的总RNA做Northern杂交，结果(图1)表明：盐胁迫条件下，该基因在叶片和根的表达量大幅度增加。将罗布麻DNA解旋酶基因插入到表达载体pBI121的35S启动子下游，构建过量表达载体，利用改进的花粉管通道技术，导入陆地棉品种山农丰抗棉6号，在卡那霉素筛选的基础上，进行盐池、盐碱地筛选，在含盐量0.5％盐碱地中筛选出8株耐盐碱棉花(图2)，自交后代进一步筛选，结果获得稳定的耐盐碱棉花品系山农NO.3。在常规

地膜覆盖种植条件下，山农NO.3可在含盐量0.45％盐碱地上正常出苗、开花、结铃和吐絮，而山农丰抗棉6号则不能出苗(图3)。当利用水压碱，降低盐碱含量后，地膜覆盖种植，山农丰抗棉6号虽然可以出苗，但是，随着棉花生长发育，土壤盐碱含量上升而导致死亡，转罗布麻DNA解旋酶基因棉花山农NO.3则正常生长(图4)。

根据上述技术，从盐生植物罗布麻中克隆得到编码DNA解旋酶基因APDH1，将该基因导入棉花中，过量表达提高了转基因棉花的耐盐性。如果利用该基因转化小麦、玉米等其它非盐生农作物，将提高这些农作物的耐盐性，具有重要的经济效益和生态效益，因此该基因应用前景广阔。

(四)附图说明

图1：盐胁迫诱导罗布麻DNA解旋酶基因APDH1表达量的变化。每个加样孔为20ugRNA，与³²P标记的APDH1基因3′端片段进行杂交，溴化乙啶染色的rRNA作为总RNA上样标准。A，800mM的氯化钠处理；B，蒸馏水处理；1，3，根；2，4，叶片。

图2：在0.5％盐碱地进行筛选耐盐碱转基因植株。获得8株耐盐碱植株，杂草多为盐地碱蓬。

图3：在0.45％盐碱地常规地膜覆盖条件下种植的山农NO.3和山农丰抗棉6号，下方对照山农丰抗棉6号没有出苗。

图4：在0.45％盐碱地水压碱条件下种植的山农NO.3和山农丰抗棉6号。左行：山农NO.3；右行：山农丰抗棉6号。

(五)具体实施方式

实施例1：罗布麻DNA解旋酶基因APDH1的克隆

1.罗布麻幼苗的处理和总RNA的提取：将利用沙培6周的罗布麻幼苗的处理，分别放入800mM的氯化钠水溶液和蒸馏水处理2天，利用RNA easy Plant mini Kit(Promoga公司产品)试剂盒，分别提取盐胁迫处理和蒸馏水处理罗布麻幼苗叶片的总RNA。

2.抑制差减文库的构建和筛选：使用Clontech SMART PCR cDNA synthesis kit合成cDNA，以盐胁迫处理幼苗叶片cDNA为tester，蒸馏水处理幼苗叶片cDNA作为driver，按照Clontech PCR-Select complementary DNA subtraction试剂盒提供的方法，构建罗布麻盐胁迫抑制差减cDNA文库，对从差减文库中筛选的阳性cDNA克隆进行酶切、PCR与逆向Northern斑点杂交鉴定、DNA测序以及核苷酸序列同源性比较，获得一系列盐诱导表达的cDNA序列。

3.基因的克隆：利用BLAST软件，对一系列盐诱导表达的cDNA序列进行同源性比较，其中有一序列为DNA解旋酶基因的中间片段。然后，利用Clontech公司的SMARTRACE cDNAAmplication试剂盒，按照使用说明进行3′和5′序列的分离，结果获得全长罗布麻DNA解旋酶基因序列

4.序列的测定：本工作上海生工生物工程技术服务公司进行。

实施例2：罗布麻DNA解旋酶基因APDH1的序列如下：

(1)SEQ.ID.NO 1的信息

(a)序列特征

  *长度：1621碱基对

  *类型：核酸

  *链型：双链

  *拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：罗布麻

(f)序列描述：SEQ.ID.NO 1

1       attcttgtgc  gaaaaccttt  cttatccacc  ttatctatat  ctctccatcc  tcaacattat

61      agctcggtca  acaagcatgg  ccacaactac  ttcggggccg  gctaatcgta  ggggaaccgt

121     aatcgacgat  aagctggtct  ttgaaacgac  cgaaggagtc  gaggccatta  cctccttcaa

181     tggcatgggc  ataaaagagg  atttactccg  tggtatctat  gcttacggat  tcgaaaagcc

241     ttccgctata  caacagcgag  cggtaatgcc  tatcatacag  ggtcgagatg  taattgcaca

301     agctcaaagt  ggtacgggta  agaccagcat  gattgccctt  acagtatgcc  aggtagttga

361     tacttcggtg  cgtgaagtcc  aagcattaat  actgtcacct  actagagagc  tggcgactca

421     gacagaaaag  gtaattctgg  caattggtga  tcatataaat  attcaagctc  atgcatgcat

481     aggtggcaat  tctgtcggtg  aagatatacg  gaaactagag  catggtgtac  acgtcgtcag

541     tggaactcca  ggccgtgtgt  gtgacatgat  taaaaggcga  agtttgcgaa  ctcgagcaat

601     caagttactt  attctcgatg  aaagtgatga  aatgttaggc  agaggtttca  aagatcagat

661     atatgatgtc  tacagatatc  tgcctccgga  cctacaggta  tgcttgatat  cagctaccct

721     tccacatgaa  attctcgaga  tgacttccaa  gtttatgact  gaacctgtca  agatcctagt

781     gaaacgagat  gaattgactc  tggaggggat  caagcagttc  tttgtagccg  tagagaagga

841     agattggaag  tttgatacac  tctgtgacct  ctatgacaca  ctcacaataa  cactggcggt

901     gatattttgc  aatacgaagc  gtaaggtcga  ctggttaagt  gaaaaaatgc  gaagcaacaa

961     tttcacagtg  tctgtaatgc  acggagacat  gccacagaag  gagcgagatg  ctattatgaa

1021    tgaatttcga  tctggtgcaa  cccgagtttt  gattacaaca  gatgtatggg  caagagggct

1081    agatgttcaa  caggtatcac  ttgtaataaa  ttatgaccta  cctaataaca  gagagctcta

1141    catacatcgc  ataggaaggt  ctggtcgatt  tggtcgtaag  ggagtagcta  ttaattttgt

1201    aaagtccgac  gacatcaaga  ttctgagaga  tattgagcag  tattactcta  cgcagataga

1261    tgaaatgcct  atgaatgttg  ctgatctaat  ttaaaaaagg  ggcatgattt  cggatgggtt

1321    ttttgtgata  gtttagggtt  tttggccttt  ccttaggctt  aaaagggccc  ctttaagtct

1381    gtcagtctga  tcgtactagc  tttttaaggg  ccctttccgt  cgctgaatag  tctagtcagt

1441    gtgtcagtca  gtcgatcgta  gctagtcagt  catgtgttaa  taaaggttta  gtcgttgtta

1501    aacgtcgccc  ggttatatgc  taagtcatgt  ctaaaccacc  catttcccgg  cgcgctagct

1561    agtcagctat  agtcagtcat  cgttaaaaca  taaaaaaaaa  aaaaaaaaaa  aaaaaaaaaa

1621    a

(2)SEQ.ID.NO 2的信息

(a)序列特征

  *长度：405氨基酸

  *类型：氨基酸

  *链型：单链

  *拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ.ID.NO 2

1      MATTTSGPAN  RRGTVIDDKL  VFETTEGVEA  ITSFNGMGIK  EDLLRGIYAY  GFEKPSAIQQ

61     RAVMPIIQGR  DVIAQAQSGT  GKTSMIALTV  CQVVDTSVRE  VQALILSPTR  ELATQTEKVI

121    LAIGDHINIQ  AHACIGGNSV  GEDIRKLEHG  VHVVSGTPGR  VCDMIKRRSL  RTRAIKLLIL

181    DESDEMLGRG  FKDQIYDVYR  YLPPDLQVCL  ISATLPHEIL  EMTSKFMTEP  VKILVKRDEL

241    TLEGIKQFFV  AVEKEDWKFD  TLCDLYDTLT  ITLAVIFCNT  KRKVDWLSEK  MRSNNFTVSV

301    MHGDMPQKER  DAIMNEFRSG  ATRVLITTDV  WARGLDVQQV  SLVINYDLPN  NRELYIHRIG

361    RSGRFGRKGV  AINFVKSDDI  KILRDIEQYY  STQIDEMPMN  VADLI

实施例3：表达载体的构建和转化

1.基因分离：根据已克隆罗布麻DNA解旋酶基因APDH1的核苷酸序列，设计引物：

正向引物：5’-CCTTTCTTATCCACCTTATC-3’

反向引物：5’-GCCAAAAACCCTAAACTATCAC-3’

以盐胁迫叶片的总RNA反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链反应。

2.基因鉴定：取2μl PCR产物与pGEM-T easy Vector进行连接，方法按照Promega产品的说明进行，连接产物的转化DH5α细菌(购自上海生工生物工程公司)，转化菌在含有氨苄青霉素和/IPTG/-Gal的LB固体培养基培养，37℃倒置培养12-20小时，有的菌落为白色，有的变为蓝色。选取白色菌落，提取质粒DNA，进行酶切和PCR鉴定。

3.表达载体构建：用Xba I和Sal I两个限制性内切酶将该基因从pGEM-T easy载体上切下，与相同限制性内切酶酶切的pBI121载体进行连接，连接产物转化DH5α细菌，筛选方法如上述2描述的方法相同。

4.质粒提取：扩大繁殖连接正确的转化DH5α细菌，利用碱裂解法提取大量质粒DNA，供转化。

5.遗传转化：以山农丰抗棉6号为受体，参照“提高棉花花粉管通道导入基因转化率的方法”(专利申请号为200410036058.8，公开号为CN 1264125A)的技术，进行遗传转化，转基因种子在卡那霉素初步筛选的基础上，在盐池和盐碱地进行筛选。

实施例4：转基因耐盐碱棉花的筛选和鉴定

1.盐池筛选：转基因种子在卡那霉素初步筛选，获得167株抗卡那霉素植株，移栽到含盐量0.5％的盐池进一步筛选，有15株成活并开花，收获这15株自交的种子，结果得到1745粒成熟的种子。

2.盐碱地筛选：选择土壤的盐碱分布相对均匀、含盐量在0.4％--0.5％的盐碱地，按照当地常规大田植棉方式，在盐碱地种植上述种子，结果仅有8株耐盐碱棉花开花、结铃、吐絮(图2)，将这8株棉花分别编号为No.1、No.2......No.8，按照单株收获自交种子，形成株行。

3.转基因耐盐碱棉花品系山农No.3的选育和分子检测：第二年，在同一块盐碱地、采取同样的种植方法，每个单株种一行，形成株系。比较各株系，结果No.3株系内各植株生长一致、丰产性、纤维品质等综合性状表现最好。在No.3株系内选取28株，取叶片提取DNA，利用PCR-Southern杂交进行转基因植株的分子鉴定，结果表明No.3株系为插入单拷贝外源基因的纯合株系，将该系收获的种子命名为山农No.3。

实施例5：转基因耐盐碱棉花品系山农No.3的大田盐碱地种植

1.常规地膜覆盖种植：选择土壤的盐碱分布相对均匀、含盐量在0.4％--0.5％的盐碱地，将转基因耐盐碱棉花品系山农No.3和受体亲本山农丰抗棉6号相邻种植，结果(图3)山农丰抗棉6号不能正常出苗，而转基因耐盐碱棉花品系山农No.3生长正常。

2.降低盐碱后，地膜覆盖种植：选择土壤的盐碱分布相对均匀、含盐量在0.4％--0.5％的盐碱地，播种前，利用淡水压碱，使土壤盐碱含量降低到0.3％以下，将转基因耐盐碱棉花品系山农No.3和受体亲本山农丰抗棉6号相邻种植，虽然它们都可以出苗生长，但是，随着土壤盐碱含量的上升，山农丰抗棉6号植株死亡，而转基因耐盐碱棉花品系山农No.3正常出苗、开花和吐絮(图4)。

序列表

<110>山东农业大学

<120>罗布麻DNA解旋酶基因APDH1序列及其克隆与应用

<140>

<141>

<160>1

<170>patent In 3.1

<210>1

<211>1621

<212>cDNA

<213>Apocynum venetum L.

<221>1-1621

<400>1

1       attcttgtgc  gaaaaccttt  cttatccacc  ttatctatat  ctctccatcc  tcaacattat

61      agctcggtca  acaagcatgg  ccacaactac  ttcggggccg  gctaatcgta  ggggaaccgt

121     aatcgacgat  aagctggtct  ttgaaacgac  cgaaggagtc  gaggccatta  cctccttcaa

181     tggcatgggc  ataaaagagg  atttactccg  tggtatctat  gcttacggat  tcgaaaagcc

241     ttccgctata  caacagcgag  cggtaatgcc  tatcatacag  ggtcgagatg  taattgcaca

301     agctcaaagt  ggtacgggta  agaccagcat  gattgccctt  acagtatgcc  aggtagttga

361     tacttcggtg  cgtgaagtcc  aagcattaat  actgtcacct  actagagagc  tggcgactca

421     gacagaaaag  gtaattctgg  caattggtga  tcatataaat  attcaagctc  atgcatgcat

481     aggtggcaat  tctgtcggtg  aagatatacg  gaaactagag  catggtgtac  acgtcgtcag

541     tggaactcca  ggccgtgtgt  gtgacatgat  taaaaggcga  agtttgcgaa  ctcgagcaat

601     caagttactt  attctcgatg  aaagtgatga  aatgttaggc  agaggtttca  aagatcagat

661     atatgatgtc  tacagatatc  tgcctccgga  cctacaggta  tgcttgatat  cagctaccct

721     tccacatgaa  attctcgaga  tgacttccaa  gtttatgact  gaacctgtca  agatcctagt

781     gaaacgagat  gaattgactc  tggaggggat  caagcagttc  tttgtagccg  tagagaagga

841     agattggaag  tttgatacac  tctgtgacct  ctatgacaca  ctcacaataa  cactggcggt

901     gatattttgc  aatacgaagc  gtaaggtcga  ctggttaagt  gaaaaaatgc  gaagcaacaa

961     tttcacagtg  tctgtaatgc  acggagacat  gccacagaag  gagcgagatg  ctattatgaa

1021    tgaatttcga  tctggtgcaa  cccgagtttt  gattacaaca  gatgtatggg  caagagggct

1081    agatgttcaa  caggtatcac  ttgtaataaa  ttatgaccta  cctaataaca  gagagctcta

1141    catacatcgc  ataggaaggt  ctggtcgatt  tggtcgtaag  ggagtagcta  ttaattttgt

1201    aaagtccgac  gacatcaaga  ttctgagaga  tattgagcag  tattactcta  cgcagataga

1261    tgaaatgcct  atgaatgttg  ctgatctaat  ttaaaaaagg  ggcatgattt  cggatgggtt

1321    ttttgtgata  gtttagggtt  tttggccttt  ccttaggctt  aaaagggccc  ctttaagtct

1381    gtcagtctga  tcgtactagc  tttttaaggg  ccctttccgt  cgctgaatag  tctagtcagt

1441    gtgtcagtca  gtcgatcgta  gctagtcagt  catgtgttaa  taaaggttta  gtcgttgtta

1501    aacgtcgccc  ggttatatgc  taagtcatgt  ctaaaccacc  catttcccgg  cgcgctagct

1561    agtcagctat  agtcagtcat  cgttaaaaca  taaaaaaaaa  aaaaaaaaaa  aaaaaaaaaa

1621    a

Claims (3)

1.一种克隆的罗布麻DNA解旋酶基因APDH1，其特征在于它具有下述所示的核苷酸序列：

1    attcttgtgc gaaaaccttt cttatccacc ttatctatat ctctccatcc tcaacattat

61   agctcggtca acaagcatgg ccacaactac ttcggggccg gctaatcgta ggggaaccgt

121  aatcgacgat aagctggtct ttgaaacgac cgaaggagtc gaggccatta cctccttcaa

181  tggcatgggc ataaaagagg atttactccg tggtatctat gcttacggat tcgaaaagcc

241  ttccgctata caacagcgag cggtaatgcc tatcatacag ggtcgagatg taattgcaca

301  agctcaaagt ggtacgggta agaccagcat gattgccctt acagtatgcc aggtagttga

361  tacttcggtg cgtgaagtcc aagcattaat actgtcacct actagagagc tggcgactca

421  gacagaaaag gtaattctgg caattggtga tcatataaat attcaagctc atgcatgcat

481  aggtggcaat tctgtcggtg aagatatacg gaaactagag catggtgtac acgtcgtcag

541  tggaactcca ggccgtgtgt gtgacatgat taaaaggcga agtttgcgaa ctcgagcaat

601  caagttactt attctcgatg aaagtgatga aatgttaggc agaggtttca aagatcagat

661  atatgatgtc tacagatatc tgcctccgga cctacaggta tgcttgatat cagctaccct

721  tccacatgaa attctcgaga tgacttccaa gtttatgact gaacctgtca agatcctagt

781  gaaacgagat gaattgactc tggaggggat caagcagttc tttgtagccg tagagaagga

841  agattggaag tttgatacac tctgtgacct ctatgacaca ctcacaataa cactggcggt

901  gatattttgc aatacgaagc gtaaggtcga ctggttaagt gaaaaaatgc gaagcaacaa

961  tttcacagtg tctgtaatgc acggagacat gccacagaag gagcgagatg ctattatgaa

1021 tgaatttcga tctggtgcaa cccgagtttt gattacaaca gatgtatggg caagagggct

1081 agatgttcaa caggtatcac ttgtaataaa ttatgaccta cctaataaca gagagctcta

1141 catacatcgc ataggaaggt ctggtcgatt tggtcgtaag ggagtagcta ttaattttgt

1201 aaagtccgac gacatcaaga ttctgagaga tattgagcag tattactcta cgcagataga

1261 tgaaatgcct atgaatgttg ctgatctaat ttaaaaaagg ggcatgattt cggatgggtt

1321 ttttgtgata gtttagggtt tttggccttt ccttaggctt aaaagggccc ctttaagtct

1381 gtcagtctga tcgtactagc tttttaaggg ccctttccgt cgctgaatag tctagtcagt

1441 gtgtcagtca gtcgatcgta gctagtcagt catgtgttaa taaaggttta gtcgttgtta

1501 aacgtcgccc ggttatatgc taagtcatgt ctaaaccacc catttcccgg cgcgctagct

1561 agtcagctat agtcagtcat cgttaaaaca taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa

1621 a

2.根据权利要求1所述的一种克隆的罗布麻DNA解旋酶基因APDH1，其特征在于该基因编码下述所示的氨基酸序列：

1   MATTTSGPAN RRGTVIDDKL VFETTEGVEA ITSFNGMGIK EDLLRGIYAY GFEKPSAIQQ

61  RAVMPIIQGR DVIAQAQSGT GKTSMIALTV CQVVDTSVRE VQALILSPTR ELATQTEKVI

121 LAIGDHINIQ AHACIGGNSV GEDIRKLEHG VHVVSGTPGR VCDMIKRRSL RTRAIKLLIL

181 DESDEMLGRG FKDQIYDVYR YLPPDLQVCL ISATLPHEIL EMTSKFMTEP VKILVKRDEL

241 TLEGIKQFFV AVEKEDWKFD TLCDLYDTLT ITLAVIFCNT KRKVDWLSEK MRSNNFTVSV

301 MHGDMPQKER DAIMNEFRSG ATRVLITTDV WARGLDVQQV SLVINYDLPN NRELYIHRIG

361 RSGRFGRKGV AINFVKSDDI KILRDIEQYY STQIDEMPMN VADLI

3.根据权利要求1所述的一种克隆的罗布麻DNA解旋酶基因APDH1的用途，其特征在于该基因在棉花中过量表达，获得可在0.45％的盐碱地正常出苗、开花和吐絮转基因棉花品系。

Images