CN1295248C - 一种小盐芥钠氢泵蛋白基因tnhx1及其抗盐应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小盐芥钠氢泵蛋白基因TNHX1及其抗盐应用。本发明所述的TNHX1基因是通过构建经盐处理后的小盐芥cDNA文库,然后对文库进行耐盐性筛选后所得到的一个抗盐克隆基因。该基因的全长2461bp,CDS长1638bp,5’UTR长476bp,3’UTR长347bp,编码546aa的蛋白。用SMART程序分析预测,该蛋白含有12个跨膜区。用农杆菌介导的真空法进行转基因实验,实验结果证明TNHX1基因可以提高植物的抗盐能力,有着巨大的经济价值和应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域,具体地说涉及一种小盐芥钠氢泵蛋白基因及其应用。
背景技术
土壤盐渍化是当今全世界普遍关注的热点之一。全球大约有1/3的土地存在着不同程度的盐渍化,我国盐渍地大约有250多万公顷。随着社会发展和人类不断繁衍,对粮食作物的需求越来越多;如何合理使用这些盐渍地,将它们变废为宝,在它们上面种上各种粮食作物来满足人们的生存需要,这是一个造福人类的重大研究。
土壤中的盐分含量过高时会对植物产生盐胁迫,危害植物的正常生长和发育,主要表现在二个方面:其一,土壤中较高的溶质浓度导致的水分亏缺;其二,植物吸收水分的同时吸收了过多的盐离子所带来的离子毒害,特别是Na+毒害。盐生植物虽然能适应高盐环境,但是其胞质内的酶并不能适应高Na+水平,而表现出与甜土植物酶同样的Na+敏感性,因此,外界Na+浓度升高时,植物反应的最终结果就是保持胞质内较低的Na+浓度。
植物消除Na+毒害的策略包括:降低Na+的吸收、Na+的外排和Na+的区隔化。Na+吸收是一个复杂的过程。Na+的外排和区隔化是间接的主动运输过程,主要由钠氢泵蛋白(Na+/H+antiporter)来调节。虽然钠氢泵蛋白是在生物界普遍存在的负责Na+/H+交换的一种跨膜运输蛋白,但在植物中扮演着重要的角色:细胞内过多的Na+从质膜向细胞外排放和Na+在液泡中的区域化分别是由位于质膜和液泡膜上的钠氢泵蛋白完成的,来保持植物细胞内的低Na+水平,是植物耐盐的关键因子。
高等植物的排Na+机制主要与质膜钠氢泵蛋白有关,质膜H+一ATPase用水解ATP的能量把H+从细胞质中泵出细胞,产生跨质膜的H+电化学势梯度,提供能量,驱动质膜上的钠氢泵蛋白,使H+顺其电化学势进入细胞,同时Na+逆其电化学势排出细胞。现在,钠氢泵蛋白活性已在许多高等植物和藻类中检测到。质膜上的钠氢泵蛋白基因最初由酵母克隆得到。啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,质膜Na+-ATPase主要在碱性条件下起作用,可直接利用水解ATP的能量把Na+泵到细胞外。而在酸性条件下S.cerevisiae则利用质膜钠氢泵蛋白把Na+排出细胞外,在筛选NaCl耐性菌株时鉴定到该蛋白是由NHA1基因编码的。在植物中,Shi等从拟南芥中克隆到SOS1基因(SaltOverly Sensitivel),它编码的蛋白与细菌和真菌的质膜钠氢泵蛋白具有非常高的同源性,拟南芥sos1突变体对盐超敏感,表明sos1在植物耐盐机制中起重要作用。
钠氢泵蛋白是位于膜上的逆向转运蛋白,用SMART程序预测到有12个跨膜区域。在对已发现的所有钠氢泵蛋白序列进行分析,发现其跨膜区高度保守,对钠氢泵蛋白担负Na+/H+转运的功能非常重要。
近年来在研究盐生植物种类中发现生长在华东地区海滩盐土生长的本土植物种类小盐芥(Thellungiella halophila),它符合作为遗传研究模式系统的各种标准,是一种不可忽视的非常有价值的自然资源。以小盐芥作为模式耐盐植物来研究抗盐的分子机理还刚刚起步。
发明内容
本发明的目的在于针对植物的耐盐能力提供一种能够提高植物抗盐能力的蛋白质或其在小盐芥中的功能类似蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,也包括与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有70%~100%的同源性,也包括在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸生成的功能相似的衍生物
本发明的另一个目的在于提供一种编码上述蛋白质的小盐芥钠氢泵蛋白基因TNHX1。
本发明的另一个目的在于提供含有上述小盐芥钠氢泵蛋白基因TNHX1的重组质粒。
本发明的另一个目的在于提供含有上述重组质粒的宿主细胞。
本发明的另一个目的在于提供上述蛋白质或其在小盐芥中的功能类似蛋白在提高植物的耐盐能力上的应用。
本发明的技术方案如下:
本发明所述的TNHX1基因是通过构建经盐处理后的小盐芥cDNA文库,然后对文库进行耐盐性筛选后所得到的一个抗盐克隆。具体实验步骤:用热酚法分别提取经400mM的NaCl处理0,0.5,1,3,6,12小时后的小盐芥的总RNA,再进一步分离出总mRNA,构建盐处理后的小盐芥cDNA文库。将cDNA片段克隆到大肠杆菌与酵母的pGAD-GH的穿梭载体中后先在大肠杆菌中扩增后再转化到对盐敏感的酵母菌株G19中,
在含有不同浓度NaCl的培养基上筛选抗盐的cDNA克隆。通过首次筛选及重复筛选后,确认第39号克隆携带抗盐基因。将该携带抗盐基因的cDNA从酵母中分离出来,经过测序,结果发现该cDNA是拟南芥NHX1基因的同源体,故我们将其命名为TNHX1。
该基因的全长2461bp,CDS长1638bp,5’UTR长476bp,3’UTR长347bp,编码546aa的蛋白。用SMART程序分析预测,该蛋白含有12个跨膜区。用农杆菌介导的真空法进行转基因实验,实验结果证明TNHX1基因可以提高不耐盐植物的抗盐性能。
本发明的有益效果:本发明首次从小盐芥中克隆到钠氢泵蛋白基因,并通过转基因实验证实了该基因能够提高植物的抗盐能力。利用分子生物学手段来研究该基因,将其转移到非抗盐的农作物中,以培育出抗盐的转基因作物新品种,使其能够正常生长在盐渍土地上,这对于拥有5亿多亩盐荒地的我国来说,有着巨大的经济价值和应用前景。
附图说明
图1为SMART程序预测的TNHX1蛋白的结构域,该蛋白含有12个跨膜区;
图2为500mM NaCl处理5天前后野生型拟南芥和小盐芥的生长情况;
图3为350mM NaCl处理5天后野生型拟南芥和转P35S-TNHX1的拟南芥生长情况。
具体实施方式
植物培养及生长条件:
用来做野生型(wt)、和转TNHX1基因实验的拟南芥(Arabdopsisthaliana)的生态型是Columbia(Col.T),用来盐处理和建库的是小盐芥(Thellungiella halophila,T.halo)。
小盐芥和拟南芥的种子采用表面灭菌法,70%酒精表面杀菌3-5分钟后,用10%Bleach浸泡灭菌10-15分钟后,用无菌水洗3-4次,铺在1/2MS的平板上,拟南芥在4℃春化3天,而小盐芥在4℃春化21天,然后在22℃的温室中培养,每天16小时的光周期。两星期后移入土中,在同样的条件下生长。
实施例1野生型拟南芥、小盐芥的耐盐能力比较
将在22℃培养相同天数的野生型拟南芥、小盐芥同时从1/2MS平板上转移到含有500mM NaCl的1/2MS平板上,继续培养5天后观察,结果发现野生型拟南芥全部白化、死亡,而野生型小盐芥的只有少数叶片白化,且正常生长,如图2所示。这说明小盐芥的耐盐能力比拟南芥好。
实施例2盐处理的小盐芥cDNA文库的构建和筛选
当野生型小盐芥植物在土里生长到8~10片叶子时,用400mM的NaCl进行处理,分别在处理后的0,0.5,1,3,6,12小时后取样,用热酚法法提取总RNA,再用poly(T)结合的纤维素柱进一步分离出总mRNA,用cDNA文库构建试剂盒(购自Stratagene公司)来构建经过盐处理后的小盐芥cDNA文库。将cDNA片段克隆到大肠杆菌与酵母的pGAD-GH的穿梭载体中后先在大肠杆菌中扩增后再转化到对盐敏感的酵母菌株G19中筛选抗盐的cDNA克隆。通过首次筛选及重复筛选确认第39号克隆携带抗盐基因。将该携带抗盐基因的cDNA从酵母中分离出来,经过测序后得到该片段的序列。
实施例3转TNHX1基因植物的耐盐性能
将TNHX1基因克隆到双子叶植物的启动子35S驱动的的表达载体中,用农杆菌介导的真空法转化不耐盐的野生型拟南芥,得到转基因的植株。将转P35S-TNHX1的拟南芥种子在MS平板上生长到6片叶子的幼苗和野生型的拟南芥幼苗一起转移到含有350mM NaCl的MS培养基上继续生长5天。结果如图3所示,发现作为对照的野生型拟南芥植物的叶片发白,甚至死亡;而转P35S-TNHX1的植物的生长没有受到明显的影响。这说明小盐芥钠氢泵蛋白基因TNHX1跟植物的耐盐能力有重要关系。
SEQUENCE LISTING
<110>中山大学
<120>一种小盐芥钠氢泵蛋白基因TNHX1及其抗盐应用
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>2461
<212>DNA
<213>小盐芥Thellungiella halophila
<220>
<221>CDS
<222>(477)..(2111)
<400>1
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tggtcttcga atcgcgtctc tgttctcttg ttttactctt gaagctcgaa cacggtcgtg 180
tagaagaatc tcaggcttta gcttcggagc ttcgatctcc gtattgattt ttgttctcgt 240
gagctttgac tttattattc gccttcttaa caattagaag ttcttcctgg agataatcag 300
atcacgcgga agcagctgag gaattgtttc aatggacagc acggaaagat aagagatttc 360
cgatttgctg atccaaaatc tgaatgttgt acttgttgat gtctcaatag ttgttgtgta 420
ctctcgttcg gttatatatt ctgggagggc aacacggaat ttggtggatc tagaag atg 479
Met
1
gca atg ctg gca tca tat ttc gat tct ttt ata tct aaa atg ccg tca 527
Ala Met Leu Ala Ser Tyr Phe Asp Ser Phe Ile Ser Lys Met Pro Ser
5 10 15
tta tcg acc tct gat cac gcc tct gtg gtt tcg ttg aat ctc ttt gtt 575
Leu Ser Thr Ser Asp His Ala Ser Val Val Ser Leu Asn Leu Phe Val
20 25 30
gca ctt ctt tgt gct tgt att gtg ctt ggc cat ctt ttg gag gag aac 623
Ala Leu Leu Cys Ala Cys Ile Val Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Asn
35 40 45
cga tgg atg aac gaa tcc atc aca gcg ttg ttg att ggg ctt gcc act 671
Arg Trp Met Asn Glu Ser Ile Thr Ala Leu Leu Ile Gly Leu Ala Thr
50 55 60 65
ggt gtt gtc att ttg ttg att agt aaa gga aaa agc tca cat ctt ctg 719
Gly Val Val Ile Leu Leu Ile Ser Lys Gly Lys Ser Ser His Leu Leu
70 75 80
gtc ttc agt gaa gat ctt ttc ttc ata tat ctc ttg cca ccc ata ata 767
Val Phe Ser Glu Asp Leu Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Pro Pro Ile Ile
85 90 95
LLc aat gca ggg ttt caa gta aaa aag aag caa ttt ttc cgc aat ttc 815
Phe Asn Ala Gly Phe Gln Val Lys Lys Lys Gln Phe Phe Arg Asn Phe
100 105 110
gtg act att atg ctt ttt ggt gct att gga act gtt atc tct tgc act 863
Val Thr Ile Met Leu Phe Gly Ala Ile Gly Thr Val Ile Ser Cys Thr
115 120 125
gtc ata act tta ggt gta acg cag ttc ttt aag aaa ctg gat att ggg 911
Val Ile Thr Leu Gly Val Thr Gln Phe Phe Lys Lys Leu Asp Ile Gly
130 135 140 145
acc ttt gac ttg ggt gat tat ctt gca att ggt gct ata ttt gct gca 959
Thr Phe Asp Leu Gly Asp Tyr Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ala Ala
150 155 160
aca gat tct gtg tgc act ctg cag gtt ctg aat caa gat gag aca cct 1007
Thr Asp Ser Val Cys Thr Leu Gln Val Leu Asn Gln Asp Glu Thr Pro
165 170 175
ttg cta tac agt ctt gta ttc gga gag ggt gtt gtg aat gat gcc aca 1055
Leu Leu Tyr Ser Leu Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr
180 185 190
tcg gtt gtt gtc ttc aac gca att cag agc ttt gac ctc acc cac ctt 1103
Ser Val Val Val Phe Asn Ala Ile Gln Ser Phe Asp Leu Thr His Leu
195 200 205
aac cat gaa gct gct ttt cat ctt ctt gga aac ttc ttg tat ttg ttt 1151
Asn His Glu Ala Ala Phe His Leu Leu Gly Asn Phe Leu Tyr Leu Phe
210 215 220 225
ctt ctg agc aca ttg ctt ggt gtt gca acc ggt ctg ata agt gcc tat 1199
Leu Leu Ser Thr Leu Leu Gly Val Ala Thr Gly Leu Ile Ser Ala Tyr
230 235 240
gtc atc aaa aaa cta tat ttt gga aga cac tca act gat cga gag gtt 1247
Val Ile Lys Lys Leu Tyr Phe Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Val
245 250 255
gcc ctc atg atg ctt atg gcg tat ctg tct tat atg ctt gct gag ctt 1295
Ala Leu Met Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Met Leu Ala Glu Leu
260 265 270
ttc gac ttg agt ggt att ctc acc gtg ttt ttc tgt ggg att gtg atg 1343
Phe Asp Leu Ser Gly Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile Val Met
275 280 285
tcc cat tac acc tgg cac aac gta acc gag agc tcg aga ata act aca 1391
Ser His Tyr Thr Trp His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg Ile Thr Thr
290 295 300 305
aag cat acc ttt gca act ttg tcg ttt ctt ggg gag aca ttt att ttc 1439
Lys His Thr Phe Ala Thr Leu Ser Phe Leu Gly Glu Thr Phe Ile Phe
310 315 320
tta tat gtc gga atg gat gcc ttg gat att gac aag tgg aga tcc gtg 1487
Leu Tyr Val Gly Met Asp Ala Leu Asp Ile Asp Lys Trp Arg Ser Val
325 330 335
agt gac agc ccg gga aca tca gtc gca gtg agc tca atc cta ata ggc 1535
Ser Asp Ser Pro Gly Thr Ser Val Ala Val Ser Ser Ile Leu Ile Gly
340 345 350
ttg ctc atg ctt gga aga gca gcc ttc gtc ttt cca tta tca ttt ctg 1583
Leu Leu Met Leu Gly Arg Ala Ala Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu
355 360 365
tca aac tta gcc aag aag aac gaa agc gag aaa atc aac ttt aag atg 1631
Ser Asn Leu Ala Lys Lys Asn Glu Ser Glu Lys Ile Asn Phe Lys Met
370 375 380 385
caa gtt gtc att tgg tgg gct ggt ctc atg aga ggt gct gta tca atg 1679
Gln Val Val Ile Trp Trp Ala Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Met
390 395 400
gct ctt gca tac aac aag ttt aca agg gcc ggg cac act gat tta cgc 1727
Ala Leu Ala Tyr Asn Lys Phe Thr Arg Ala Gly His Thr Asp Leu Arg
405 410 415
ggg aac gca atc atg atc acc agt act ata acc gtc tgt ctt ttt agc 1775
Gly Asn Ala Ile Met Ile Thr Ser Thr Ile Thr Val Cys Leu Phe Ser
420 425 430
acc gtg gtg ttt ggt atg ctg acc aaa ccg ctc ata aga cac cta tta 1823
Thr Val Val Phe Gly Met Leu Thr Lys Pro Leu Ile Arg His Leu Leu
435 440 445
ccg cac cag aaa gcc acc acg agc atg tta tct gat gac aac aat acc 1871
Pro His Gln Lys Ala Thr Thr Ser Met Leu Ser Asp Asp Asn Asn Thr
450 455 460 465
cca aaa tca atc cag atc cca ttg ctg gac caa gac tcg ttt att gag 1919
Pro Lys Ser Ile Gln Ile Pro Leu Leu Asp Gln Asp Ser Phe Ile Glu
470 475 480
ttc gca ggg aac cac aat gtg cct cgg cct gac agt ata cgt ggc ttc 1967
Phe Ala Gly Asn His Asn Val Pro Arg Pro Asp Ser Ile Arg Gly Phe
485 490 495
ttg aca cgg cca act aga acg gtg cat tac tac tgg aga caa ttt gat 2015
Leu Thr Arg Pro Thr Arg Thr Val His Tyr Tyr Trp Arg Gln Phe Asp
500 505 510
gac tcc ttc atg cga cct gtc ttt gga ggt cgt ggc ttt gtt ccc ttc 2063
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515 520 525
gtc cct ggt tct cca act gag aga gac cct cct gat ctc agc aaa gct 2111
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530 535 540 545
tgagaggaaa atgtggaagg agaaaagctt tttgtagaaa gaaaaaaagg tgattgaaat 2171
ttgtgcgtct tgtgtaaatt atccatccac ttgtaatatt gtttgtgagg atagatagtt 2231
gtcctacgtt ttgagagcag aaagcaaaaa catggaaatg aactcccgaa tggatttgat 2291
tgatgtcatc tttgttttgt tgtaacaaaa cgatactaca tttgttttat atgtgtctga 2351
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tgattttgga tgattggaat aaagaaccaa aaaaaaaaaa aaaaaaagta 2461
<210>2
<211>545
<212>PRT
<213>小盐芥Thellungiella halophila
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Leu Val Phe Ser Glu Asp Leu Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Pro Pro lle
85 90 95
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195 200 205
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Ala
545
Claims (6)
1、一种小盐芥钠氢泵蛋白基因TNHX1,其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2、权利要求1所述基因编码的蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3、一种含有权利要求1所述基因的重组质粒。
4、一种含有权利要求3所述重组质粒的宿主细胞。
5、如权利要求4所述的宿主细胞,其特征在于所述宿主细胞为大肠杆菌、农杆菌、酵母或植物细胞。
6、权利要求2所述蛋白在提高植物的耐盐能力上的应用。
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