CN1920042A - 在低盐和高盐渗透胁迫下盐藻差异表达的标签、基因片段及其克隆方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在低盐和高盐渗透胁迫下杜氏盐藻(Dunlaliella virids)差异表达基因片段及其分离方法。本发明使用SAGE技术由极端模式生物盐藻(Dunaliellaviridis)中得到8个与盐胁迫相关的基因标签，通过PCR获得对应标签的基因片段，经RT－PCR验证这8个受盐胁迫诱导表达的基因片段SEQ ID NO：9～16，确实与盐胁迫相关基因。其中，SEQ ID NO：9～12所代表的4个基因在低盐渗透环境下高水平表达，在高盐渗透环境呈低水平表达；而SEQ ID NO：13～16所代表的4个基因在高盐渗透胁迫条件下高水平表达，低盐渗透胁迫条件下呈低水平表达。为进一步研究盐藻耐盐分子机制奠定了基础。

Description

在低盐和高盐渗透胁迫下盐藻差异表达 的标签、基因片段及其克隆方法

技术领域

本发明涉及在低盐和高盐渗透胁迫下盐藻差异表达的标签、基因片段及其克隆方法。

背景技术

植物对渗透胁迫的反应是一个多基因控制的复杂过程。不同植物对渗透胁迫的反应也不尽相同，具有丰富的多样性。但是，对渗透胁迫的细胞水平的反应则似乎在整个生物界都是保守的(Yancey等，1982)。已有相当多的例子表明，从高等植物中获得的一些基因，往往是间接利用了从动物、低等植物、甚至是酵母、细菌中发现的该类同源基因才分离出来的。实际上，这些同源基因也经常被直接应用于转基因作物遗传改良中。

同样的道理，盐藻(Dunaliella viridis)就是一个具有这样特性的真核单细胞绿藻(Cowan等，1992)。它的抗环境胁迫的能力异乎寻常，尤其是渗透胁迫，可以在从接近淡水(NaCl＜50mM)直到饱和盐水(NaCl＞5M)的环境中生长。因此，盐藻因其极强的耐受渗透胁迫和其它极端环境的能力被作为研究耐逆机制及其发掘抗逆基因的模式生物而倍受关注(Hans J.Bohnert等.2001)。

基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression，SAGE)技术(Velculescu，V.E.等，1995)是近年兴起并应用于细胞生殖、发育、分化、癌变等生命过程有关基因的差异表达以及相关基因的分子克隆的有效的方法之一(Desai S.等.2000)。

为了更好地从分子水平上对盐藻进行耐盐机制的研究和发掘可用于植物基因工程改良作物的抗逆基因资源，本领域迫切需要利用当前的分子生物学技术(如基因表达系列分析技术、基因芯片及生物信息学等)开发在盐胁迫过程中受到诱导和阻遏表达的基因。

发明内容

本发明的目的在于提供低盐和高盐渗透胁迫相关的基因片段。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

低盐和高盐渗透胁迫下盐藻差异表达的标签，其特征在于它包含4个在低盐环境下高表达的标签和4个在高盐条件下高表达的标签，该8个标签对应的序列为序列表中的SEQ ID No：1-8。

上述的低盐和高盐渗透胁迫下盐藻差异表达的标签克隆出的基因片断，其特征在于上述的8个标签对应的基因片断的碱基序列为序列表中的SEQ ID No：9-16。

上述的基因片断，其特征在于SEQ ID NO：9～12所代表的基因片段在低盐渗透胁迫环境下呈现高水平表达，高盐渗透环境下低水平表达，SEQ ID NO：13～16所代表的基因片段在高盐渗透胁迫条件下呈现高水平表达，低盐渗透条件下低水平表达。

上述的基因片段的克隆方法，其特征在于，该方法的具体步骤为：

a.取在分别含有0.5M NaCl和3M Nacl的DM培养基中稳定培养的盐藻细胞提取总RNA，利用基因表达系列分析建立SAGE文库，通过测序和生物信学分析分别得到受低盐诱导表达和受高盐诱导表达的标签；

b.根据步骤a所得的标签各设计一个引物，以cDNA文库为模板，再配合文库中载体上的引物M13(-20)Forward Primer进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的产物并克隆进T-Easy载体，再使用通用引物M13Reverse Primer进行测序，从而得到对应标签的基因片段。

本发明使用SAGE技术由极端模式生物盐藻(Dunaliella viridis)中得到8个与盐胁迫相关的基因标签，通过PCR获得对应标签的基因片段，经RT-PCR验证这8个分别在低渗和高渗胁迫条件下表达水平呈现极大差异的基因片段SEQ ID NO：9～16，确实与盐胁迫相关基因，为进一步研究盐藻耐盐分子机制奠定了基础。

附图说明

图1是盐藻在0.5M NaCl和3.0M NaCl胁迫环境下的总RNA。其中泳道1为0.5MNaCl，泳道2为3.0M NaCl。

图2是处于0.5M NaCl和3M NaCl环境下盐藻细胞内4个与低盐胁迫相关的基因表达情况。泳道1，3，5，7：分别是4个受低盐诱导基因在低盐环境下的RT-PCR，泳道2，4，6，8：分别是4个受低盐诱导基因在高盐环境下的RT-PCR。

图3是处于0.5M NaCl和3M NaCl环境下盐藻细胞4个与高盐胁迫相关的基因表达情况。泳道1，3，5，7：分别是4个受高盐诱导基因在低盐环境下的RT-PCR，泳道2，4，6，8：分别是4个受高盐诱导基因在高盐环境下的RT-PCR。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次从盐藻(Dunaliella viridis)中，利用基因表达系列分析方法结合生物信息学方法从极端耐盐的模式生物盐藻中克隆到8个与盐胁迫相关的基因标签。根据这8个标签克隆到对应的基因片断，通过RT-PCR对这8个基因在细胞内的表达水平进行验证。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件和Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)或植物分子生物学一实验手册(Plant Molecular Biology-ALaboratory Manual，Melody S.Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一：

1.与盐胁迫相关的基因标签的分离

为了分离盐藻中与盐胁迫相关的基因标签，在含有0.5mol/LNaCl和3mol/LNaCl的DM培养基(Sun Y.等，2005)中稳定培养的盐藻培养至10⁷细胞/ml，5,000g，4℃离心10分钟收集细胞，提取总RNA(Trizol kit，Invitrogen)，总RNA经变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析和定量。以总RNA为模板，利用基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression，SAGE)建立SAGE文库，采用通用引物M13Reverse Primer，双脱氧法(DYEnamic ET-Terminator Cycle Sequencing)，DNA序列分析仪(MegaBACE 4500)对文库进行测序。所得到序列经软件SAGE2000v45等分析，分别得到4个在低盐环境下高表达和4个在高盐条件下高表达的标签。

2.与盐胁迫相关的基因片断的分离

根据8个标签各设计一个引物，

L SEQ ID NO：1：CATGCATCAAATGCACATACA

L SEQ ID NO：2：AGTTTCACGCAGGAACCCATG

L SEQ ID NO：3：AGCAGGCCTGTGGCTACATG

L SEQ ID NO：4：GTTGTTTGTGCCTGCATCAT

H SEQ ID NO：5：CATGCTTAGGCGACCATTAGC

H SEQ ID NO：6：CTGTTGATCTGCCTCAGCATG

H SEQ ID NO：7：TTCTCACA GAAGAAGGCATG

H SEQ ID NO：8：CATGAAATGTACAAGAGTAGA

以cDNA文库(λ噬菌体文库)为模板，再配合文库中载体上的通用引物M13(-20)Forward Primer进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的产物并克隆进T-Easy载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含有氨卞青霉素的LB平板，37℃，培养14小时，挑取单克隆，液体培养14小时，37℃，250rpm，减法抽提质粒，酚抽提纯化，再使用通用引物M13 Reverse Primer双脱氧法(DYEnamicET-Terminator Cycle Sequencing)，DNA序列分析仪(MegaBACE 4500)进行测序。

实施例二：RT-PCR验证基因表达

分别以0.5M NaCl和3.0M NaCl胁迫环境下总RNA为模板，Oligo(dT)₁₆作引物进行反转录。根据上述8个基因片段的序列分别设计一对引物：

以稀释至1/20的反转录产物作模板进行PCR，PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析，证明了SEQ ID NO：9～12所代表的4个基因在低盐渗透环境下高水平表达，而SEQID NO：13～16所代表的4个基因在高盐渗透胁迫条件下高水平表达，这个结果与SAGE文库结果显示的一致。

实施例三：tBLASTx比对基因片段

分离出的4个在低盐渗透胁迫环境下呈高表达的盐藻基因片段，除了SEQ IDNO：10编码了一个已知的叶绿素a/b结合蛋白(chlorophyll a/b binding protein)，SEQ IDNO：12与水稻中有同源基因，但功能目前未知，其余2个基因在Genbank中无同源序列发现，可能是新的基因。

分离出的4个在高盐渗透胁迫条件下呈现高水平表的的盐藻基因片段，除了SEQID NO：13编码了一种新型的类胡萝卜素结合蛋白(novel carotenoid-binding protein)，SEQ ID NO：14与莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中磷转运蛋白(putativePi-transporter homologue B1)同源，其余2个基因在Genbank中无同源序列发现，可能是新的基因(表1)。

表1在低渗和高渗条件下呈现大差异的8个标签所对应的基因

SEQ ID NO	对应的基因
		SEQ ID NO：9SEQ ID NO：10SEQ ID NO：11SEQ ID NO：12SEQ ID NO：13SEQ ID NO：14SEQ ID NO：15SEQ ID NO：16	未知叶绿素a/b结合蛋白未知未知新型的类胡萝卜素结合蛋白磷转运蛋白未知未知

                   序列表

<110>上海大学

<120>在低盐和高盐渗透胁迫下盐藻差异表达的标签、基因片段及其克隆方法

<160>16

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

catgcatcaa atgcacatac a                                            21

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

agtttcacgc aggaacccat g                                            21

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

agcaggcctg tggctacatg                                              20

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

gttgtttgtg cctgcatcat g                                            21

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

catgcttagg cgaccattag c                                            21

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

ctgttgatct gcctcagcat g                                            21

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

ttctcacacg aagaaggcat g                                            21

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

catgaaatgt acaagaagtag a                                           21

<210>9

<211>742

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>9

ggagatctac taccctggag gaacccccga ggacactggc ctggagtctg agcaaatcgt gagcagcatt ttcaacaaca

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ctggacggag cgacctctta attcattctc aaagctgcat ttaatttggt ttatgcctgg atttcattta ttacttccgt

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atgtatgtgc atttgatgca tg                                                                   742

<210>10

<211>812

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>10

cctgagctac tgggcaaggc cggcatcatc cccgagtcca ctggcctgac ctggtttgag gcaggtggcc tggacagctc

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<210>11

<211>998

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>11

gcagcgctat caggattccc ctgatcaggt gtagtgtctg cctcagcctg gtattttggg gaagaaaacg gaatgggtgg

ttcctgatca ggtgcaatgc tttctgtctg cctctgcctg ggattttgtg gaagaaagcg ggatgggaat gtcaaagcaa

gttgaaatga ctcgtgtggc ctagtgtcca tgcgtgaata tgcgagaaga tctttggtca tgcgtctgtc agtccggttg

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gttgtggctt gctggctgtg gatcgcctgc tgtaatgcat cctgaaggct tacctgcatt gttgctgagt tgaacagtta

gttctgttag ctaatgtgtt tgctgtgttt gtttgttctg agtgtggctg cattattgag gtgtttgctc cttttggacc

tggctgcatt catgagtgca tgttcctcgg ttgttggtgg agaattttgt ccgaggaata agacctccga gtacctggct

aaacaggcgc tcacgaaaat actggtgtct ctcggctcag gaggctgcct tcccatcaag tgtggtgtag gcttggaaaa

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gtctttcttt tcgtgctact tcttttggtt ctctctacgt acaatcacag ccagcaggag aagcgagcct ttggtcggca

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acacacagac ttggtccccg tcttctcatg cttccta                                                   998

<210>12

<211>581

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>12

ggcagtctgc ctggggactt cggatgggat ccgctgcacc ttgcagacac caatgatcag gacaggctga acaacgcgat

gagcatgtcc tggctgtcat atgctgaggt catgcactgc cggtgggcca tgcttggcgc agcaggcgcc attgcgcctg

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cgctgccatg ggattcgcag agttcaggcg ctggcaggag tacaaggagc ctggatccgt ccaaaagcag tggttctttg

ggctggagaa actgacaccc agcagtgaac agcctcaata tccaggcggt ggcttcttca actttgcagg tctgggcacc

aaagatgaga aggccatgtt tgacctgaag acaaaggaga tcaggaacgg ccggctggct atgttggcct tcctgggctt

catgatgcag gcacaaacaa c                                                                    581

<210>13

<211>400

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>13

gagcgcgcgc cgtagggtga atagtggatc aaagaattcg gacgagcaaa actctcacac tctcaacacg agaacaccaa

gcacgatgca aatgatgctg aagcagaccc cgcaggtgct cggcattcgc cagcagagcc gtctgcagca

ggtgaagccg tgcgcccgcc tgcagcgcac agtggtgcgc gccgagggcg gtggcgaggg ccccaagaag

ctggaggaca tccctcctgc agagcgcaag ttctctgacc agcagtggga tgatgccatc aagtctgcct cccaatccag

tgcccccaag gcccccagcc aacccaagcc tgtgtccctg ggcgaagctt tcgcgttcag cggccccctg cctgagaagg

ctaatggtcg cctaagcatg                                                                      400

<210>14

<211>718

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>14

atgttgccaa cggtgtgggc cctcttgccg gtatctggga cacctacaac acctaccagt ctggcagtgg caaggcgtct

cagccccgct ggattctggt catcggtgct gctggcattg tgttcggcct ggccatgtac ggctaccgta tcattgcgac

cctgggtgtg gacttggtgg tcatgacccc cagccgcg gttacgcggtgg agctggcggg tgctgccatc attgccctag

cctccactta cggtctgccc gtctccacca cacaagtcat caccggcggt gaaatagggg tgggcatgtg cgagacctgg

aagatgacgg gcgtgaactg gctcctgttc atccgcacct tctggggctg ggtgggtgcc ctggtgaccg gcgccatcct

ctcggctctc ttcttctcca tcggtgtgta tggccccagc cgcaccgacc tggactacgt gacacactac cagagggcca

tgaagattga tatcgatgag tcaatggcgg ccctgctgga ccaatgcatg gagcttcaaa cagctggcgg gggcggatgt

gactacagtg acaacagctg ctcttgcaag caagccacac cctacaccat gggtgacctc aagggcctga aggctcaggc

tgatgggctg ttcaacttcg aggagaatgg ccagattaac gagtacaaca tgatgtacat gctgaggcag atcaacag

                                                                                          718

<210>15

<211>985

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>15

cctagcaaga aatgtgtgca cttgtggggt gcaagccgcc cccctcccct aagttttgat tttttacgcg ctgccgtgcg

cggatacatg tgccccctgg ttcacctggg agatactgcg actgagagta aggccgcagc aataagcagg ccctccagcc

ctgcctgcca tcttgtgtgg gtgctggatg ccaagagact atcatgcagc cacatgaatg gcaaaaaccg cacgaggcgc

aattggttgt taggggagta gcttactgag tgtcaatttg atgggagcac acttgaatag gcatgtgctt tgttgagcga

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<210>16

<211>447

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>16

tcttcgatgg ggacttctct cagtacgaga atgtgtctga gcagaccatg ccttgagctt ggcatctgtt ccttcggctg

tcttattatt tagtctccaa ttctttctgc tacatgtatt tttggctgcc tgagtggtca atcttgctag tgaaaattct tatttgatct

gcttttccat gattagaatc atgcagggat ctgtctgagc agttttgtca gctttgattc aggtttcatt attacgccta

agaccgcctg cttagtgcac tgtatggatg tattgtttag ttattgctcg gatcctcgtg caaagaggga atatgtgatg

tcttcttttt gtgcacaagc gaggaactca atttgatttc agtcttgaac tgtgatgtcc ttgaccaaga atgttgattg

tcctttgcgt aatccgtcta ctcttgtaca tttcatg                                                 447

Claims (4)

1.盐藻碳酸酐酶3基因DvCA3，其特征在于该基因具有SEQ NO 1所示的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的盐藻碳酸酐酶3基因DvCA3的编码蛋白，其特征在于该基因具有SEQ NO 2所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的盐藻碳酸酐酶3基因DvCA3的克隆方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.以DCA3(+)-2、DCA3(-)-2为引物，采用PCR方法从盐藻的BAC文库中筛选出一个不同于已知碳酸酐酶的盐藻基因组BAC克隆，该BAC克隆的大小为60kb；

b.将上述BAC克隆随机打断为2～4kb的小片段，装入测序载体，构建了该BAC克隆的鸟枪文库；

c.大通量提取鸟枪文库的质粒DNA，在MegaBACE 4500上进行序列的测定；每个鸟枪质粒利用M13正反向引物，进行双向测序；

d.在RedHat Linux平台的并联计算机群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所测序列，构建亚克隆并测序以填补出现在序列之中的缺口，最终得到盐藻碳酸酐酶3基因DvCA3的全长序列。

4.根据权利要求3所述的盐藻碳酸酐酶3基因DvCA3的克隆方法，其特征在于所述的筛选BAC克隆的PCR方法的程序为：

94℃ 5min；

94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 50s，30 cycles；

72℃ 10min；

引物序列：

DCA3(+)-2 ACG GTT GTT GGT GAT GGC AG

DCA3(-)-2 TTG AAC AAC TGC GCT GGG GA。

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