CN1308344C - 紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的编码基因，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中的SEQ ID NO：1；2)编码序列表中SEQ ID NO：2氨基酸序列的多核苷酸。本发明的基因将在苜蓿耐盐分子机制研究、豆科植物耐盐性状改良中发挥重要作用。

Description

紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

盐胁迫主要是由Na⁺引起，细胞质中过高的Na⁺浓度引起的离子毒害、渗透胁迫以及K⁺/Na⁺比率的不平衡使得植物新陈代谢异常，从而对大多数器官造成伤害。而Na⁺在植物细胞中区隔化是植物抵御盐分胁迫、提高耐盐性的一种重要机制。大量研究显示盐生植物以及较耐盐的甜土植物液泡膜上Na⁺/H⁺逆向转运蛋白具有催化Na⁺和H⁺的跨膜逆向运输功能，从而可以将细胞质中过多Na⁺区隔在液泡里。而液泡膜上H⁺移位酶即H⁺-ATPase和H⁺-PPiase产生跨膜的H⁺电化学势梯度为Na⁺/H⁺逆向转运蛋白提供驱动力。

Na⁺在液泡中累积一方面可以使过多的Na⁺离开代谢位点，减轻Na⁺对酶类和膜系统的伤害；另一方面，植物可以利用累积在液泡内的Na⁺作为渗透调节剂，降低细胞水势，抵抗盐份造成的渗透胁迫，变害为利。同时盐分在液泡中累积还是维持细胞质中较高的K⁺/Na⁺比的最有效的机制之一。

既然液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白对植物的耐盐性起重要的作用，因此对于植物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的克隆、表达、结构与功能的分析，有利于在分子水平上详细了解该基因，从而促进植物耐盐基因工程的进展。目前编码该蛋白的基因在许多盐生植物以及一些甜土植物都已克隆出来，并且经过功能分析显示，其表达水平的高低对植物的耐盐性具有重要的调节作用。在拟南芥、芸苔、西红柿中过表达拟南芥的液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白(AtNHX1)，获得的转基因植株在盐胁迫条件，液泡中累积Na⁺能力水平大大上调，其耐盐性大幅度地提高。而在非盐胁迫条件下，转基因植株长势良好，没表现出明显的生长缺陷。目前含有AtNHX1基因西红柿在美国已经开始大面积的推广。

紫花苜蓿作为一种较为耐盐的甜土植物，也具有将细胞质中过高浓度Na⁺区隔到液泡中的功能。研究显示，其悬浮培养细胞的液泡中Na⁺、Cl^-含量分别占到原生质体Na⁺、Cl^-总量的73.8％-91.2％和74％-89.4％。

发明内容

本发明的目的是提供一种紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白及其编码基因。

本发明所提供的紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

紫花苜蓿Na⁺/H⁺向转运蛋白的编码基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2氨基酸序列的多核苷酸。

序列表中序列1由2232个碱基组成，其读码框为自5’端第336到第1961位碱基；序列表中序列2由541个氨基酸残基组成。

含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。

扩增紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的编码基因将为苜蓿耐盐分子机制研究，以及对植物耐盐性状的改良打下坚实的基础，具有重要意义。

附图说明

图1为中间片段扩增产物凝胶电泳图谱

图2为3’端扩增产物凝胶电泳图谱

图3为5’端扩增产物凝胶电泳图谱

图4为紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白与其它植物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白同源性分析

图5为紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白与其他植物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白疏水性比较

图6示PBINHX表达载体的构建

图7为200mM的NaCl胁迫下野生型和转基因拟南芥Na⁺含量的直方图

具体实施方式

实施例1、紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白编码基因的获得

1.1简并引物设计：

通过比较现已公开的植物液泡膜上Na⁺/H⁺逆向转运蛋白氨基酸的序列，寻找保守区域，并根据保守区域序列设计一对简并引物：

MsNHX1：5’-CCACCCAT(AT)AT(AT)TT(CT)AATGC(AGC)GG(AG)TT-3’

MsNHX2：5’-TAAC(AT)ACACC(CG)TC(AG)CC(AG)AAGAC(AG)AG(AC)CT-3’

1.2材料处理：紫花苜蓿品种中苜一号(Medicago sativa L.)种子在24℃下催芽2d后，

在26℃光照培养，每天光照12h，至两叶一心期开始用1％(170mmol/L)NaCl胁迫处理6h，提取总RNA。

1.3 RNA的提取

RNA提取参照张劲松等人的方法进行(张劲松，等.中国科学，B辑，1995，25(5)：659～669)，苜蓿叶片在液氮中研碎，悬于抽提液(4mol/L硫氰酸胍中钠，5g/l十二烷基肌氨酸，25mmol/L柠檬酸钠，0.1mol/Lβ巯基乙醇)，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀总RNA，再经4mol/LLiCl悬浮RNA沉淀、氯仿抽提1次，然后用乙酸钠/乙醇沉淀总RNA，最后将RNA溶于水中，贮存于-20℃备用，用0.8％的琼脂糖检测RNA的完整性。

1.4中间片段的扩增

苜蓿cDNA合成按Promega公司M-MLV Reverse Transcriptase说明书(Promega，Cat.No.

M1701)的实验程序合成cDNA第一链，反应体系为：，2ug制备的RNA模板，1.0ulOligo(dT)18，5ul5×RT缓冲液，1.25uldNTP(10mmol/L)，1ulRNA酶蛋白质抑制剂(RNAasin)，1ul逆转录酶，42℃反应60min，70℃变性5min，合成的cDNA贮存于-20℃备用。

中间片段的扩增体系为25ul，反应条件：94℃变性4分钟；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环40次；72℃延伸5min。取5μl反应液，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。获得一300bp左右的DNA片段(如图1所示)。

1.5A/T克隆：回收纯化的PCR产物5ul，pMD-18T载体1ul，连接缓冲液5ul，16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5α。经菌体PCR、质粒酶切鉴定含有目的片段的阳性克隆，由上海生工测序，测序结果得到SEQ ID №：3。

1.5该基因cDNA全序列的获得

以获得的cDNA片段序列为基础，设计用于扩增3’端和5端’特异引物

GSP1：5’-ATAACCACGGGTGCTACTTTTGC-3’

GSP2：5’-CATAGGCACTGAGCAGACCTGTCACAACG-3’

按照SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech，Cat.no.K1811-1)的方法作RT-PCR。3’端的扩增的循环参数为：94℃变性5s，68℃退火10s，72℃延伸2min，35个循环。产物经琼脂糖凝胶电泳检测扩出一1500bp左右的DNA片断(如图2所示)。5’端的扩增循环参数为：94℃变性5s，72℃延伸3min，5个循环；94℃变性5s，70℃退火10s，72℃延伸3min，5个循环；94℃变性5s，68℃退火10s，72℃延伸2min，25个循环。产物经琼脂糖凝胶电泳检测扩出一1000bp左右的DNA片段(如图3所示)。产物回收纯化，连接，转化，测序，测序结果3’端序列为SEQ ID №：4，5’端序列为SEQ ID №：5。

借助DNA拼接软件contig，获得该基因的cDNA的完整序列，该序列全长为2232bp，具有SEQ ID №：1的DNA序列，336-1961bp为其完整编码区域，编码的蛋白含有541个氨基酸残基，具有SEQ ID №：2的氨基酸残基序列。

实施例2、紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的功能分析

2.1序列比较分析：

用BLAST和DNAMAN软件对克隆出紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的序列进行比较分析，结果表明紫花苜蓿液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白与拟南芥、水稻、小麦、大麦、冰叶日中花、裂叶牵牛、碱篷等液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运器具有极大的同源性(如图4所示)。其中与裂叶牵牛InNHX1(BAB16380)有78％的同源性，与拟南芥的AtNHX1(AAD16946)有77％的同源性，与碱篷的SsNHX1(AAP15178)有77％的同源性，与冰叶日中花的AgNHX1(BAB11940)有77％的同源性，与水稻的OsNHX1(BAA83337)有74％的同源性，与大麦的HvNHX2(AAO91943)有73％的同源性，与小麦的TaNHX(AAK76737)有70％的同源性。另外，如图5所示，蛋白的疏水性分析显示紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白与这些植物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白具有类似的疏水结构，具有多个跨膜结构。说明其与这些的植物液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白具有类似功能。

2.2转基因分析：

2.2.1表达载体的构建

设计引物2对引物用于构建植物表达载体

A1：5’-CG GAGTCCACCGATTCATCATCACGC-3’

A2：5’-TTT GAGCTCCGTTGAATGACTTTTCACAAATC-3’

B1：5’-atggctattgaaatgtcttctattg-3’，

B2：5’-gcTCAACCCCATTGATTACCATTGCGT-3’，(其中下划线分别表示BamH I，Sac I酶切位点)。

PBINHX表达载体的构建过程如图6所示，提取苜蓿的总RNA，用oligo(dT)₁₈作反转录。反转录产物用引物A1，A2进行PCR，得到MsNHX1的全长cDNA，连接到pMD-18T载体上，获得重组克隆载体，命名为pMD-NHX。以载体pMD-NHX为摸板，用引物B1和B2进行PCR扩增。用BamH I和Sac I分别双酶切PCR产物和PBI121载体，回收、纯化酶切产物。按照载体∶插入片段为1∶3的比例，取适量线性化载体PBI121和MsNHX1的cDNA片段混合，用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，从而获得含有MsNHX1编码序列的重组表达载体，命名为PBINHX。

2.2.2农杆菌感受态细胞制备及重组载体对其转化

挑取农杆菌LBA4404单菌落接种到2ml YEB液体培养基(含链霉素125ug/ml)中，28℃振荡培养过夜。将过夜培养物500ul接种于50ml的YEB液体培养基中，285000g，4℃离心5min，收集菌体200rmp振荡培养至OD600为0.5左右。5000g，4℃离心5min，收集菌体。于冰上加入10ml 0.15M的Nacl溶液悬浮细胞。5000g，4℃离心5min，收集菌体。加入预冷的1ml 20mMCaCl重悬。取200ul感受太细胞，加入1ug表达载体DNA，冰浴30min，液氮中冻1min。37℃热激。加入1ml的YEB液体培养基，28℃振荡培养4h，10000g离心30s，加入100ul的YEB重悬细胞。菌液涂布于含有100ug/mlkan和125ug/ml链霉素的YEB固体选择培养基平板上，28℃培养过夜。

2.2.3真空渗透法转化拟南芥

(1)待萌发植物培养至茎高3-10cm时，去其顶生花序，避免伤及腋生花序，刺激腋生花序的生长。继续生长7-9天后，即可转化。

(2)农杆菌在4ml YEB中活化48小时，然后将菌液倒入250ml YEB中继续培养至OD600 1.2-1.8(约需48小时)。

(3)5000rpm离心10分钟，收集菌液，用渗透培养基悬浮菌液至OD600＝0.8。

(4)将农杆菌悬液倒在搪瓷盘中，将生有植物的培养杯倒扣其间，保证植物包括基生叶以上部分都浸没在菌液中，中间不能有大气泡，放入真空箱中，0.05Ba，抽真空10分钟。

(5)放气后，取出转化的植物，横放在一个塑料盘内，用塑料盖好，以保持湿度，闭光恒温培养2天后，竖立培养。

(6)荚果变黄后，小心收集种子。

2.2.4阳性植株的筛选

(1)制备MS(0.43％ MS盐，3％蔗糖，1％琼脂，用KOH调pH至5.7)选择培养基。

(2)T1代种子表面消毒(2min in 70％乙醇，10min in 0.5％次氯酸钠，无菌水2min×5次)。

(3)平铺于含相应抗生素(40μg/ml Kan和50μg/ml的羧苄西啉钠)的MS选择培养基中，密度为1000-2000粒种子/皿。

(4)4℃春化3天，移入生长箱中(22℃恒温，24小时光照，光强为30-40μmol.m-2.s-1)。

(5)7天后挑选转化体，表现为真叶健康呈深绿色，根伸长至培养基中。

(6)将转化体转至正常的MS培养基中，10天后转入土壤。

(7)收获T2代种子，备用观察，并做生理生化鉴定。

2.2.5转基因植耐盐性的鉴定：

(1)植株根弯勾法耐盐性生理鉴定

将野生型T2代种子经表面消毒后，播种子正常MS培养基中，22℃恒温，24小时光照，光强为30-40μmol.m^-2.s^-1生长5天，根长约2厘米。从中随机选取四棵，转移到另一MS培养基中，倒置培养，继续生长5天，此组为对照组。随机选取另外四棵，转到含100mM NaCl的MS培养基中，180°倒置培养，继续生长5天，此组为转化组。

(2)转基因植株的盐胁迫处理鉴定

将野生型和T3转基因拟南芥代种子分别在1/4MS，和含100ug/ml Kan的抗性平板上萌发，在抗性平板上生长两周后，将幼苗载入土中，在室温中培养两周后进行NaCl胁迫处理，用0、10Mm、100mM、200mM的NaCl浇灌植株，两天浇灌一次。两周后观察表型。并将上述材料从培养土中取出，取地上部分测鲜重、干重。同时，取上述材料在70℃烘烤至恒重后称干重，并用Z5300型原子吸收光谱仪进行Na⁺含量的测定。

2.2.6结果分析

(1)以根弯勾生长方法做植物耐盐性生理鉴定，在对照组中，对于野生型和转基因，植株倒置培养5天后，野生型植株根平均伸长2.1厘米，转基因植株植株根平均伸长2.0厘米，野生型植株和转基因植株差别并不明显，除具有一定弯曲长度的主根外，都有比较发达的侧根出现。而在100mM NaCl培养基中倒置生长5天后，野生型植株根平均伸长0.4厘米，几乎不表现弯曲，也无明显的侧根出现；转基因植株植株根平均伸长1.9厘米，弯曲明显，且有明显的侧根出现，与对照组差别不大。说明，转基因植株的耐盐能力得到了部分提高。

(2)对T3转基因拟南芥和对照拟南芥进行盐处理两周后，在0、10mM的NaCl盐胁迫下，无论是野生型还是转基因拟南芥植株长势都很正常。但是在100mM，200mM的NaCl处理下，野生型拟南芥的根生长受到抑制，且变短变粗、分叉减少，叶片变黄，基部叶片脱落并伴有坏死。但转基因拟南芥的根的生长情况优于对照，没有受到明显的生长限制。

在盐胁迫下，转基因拟南芥地上部分的鲜重、干重明显高于野生型；如在100mM的NaCl处理下，与未经盐处理的相比，野生型拟南芥的鲜重下降了42％，而转基因拟南芥却仅下降约21％。

另外，在200mM的NaCl胁迫下，对照和转基因拟南芥地上部分的Na⁺含量都升高，但转基因植株中Na⁺含量升高更为显著，结果如图6所示。说明克隆出来的紫花苜蓿液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白与基因可以增强植物的耐盐性，可以作为植物耐盐基因工程的侯选基因加以应用，用来改良植物的耐盐性状。

                       序列表

<160>5

<210>1

<211>2232

<212>DNA

<213>紫花苜蓿(Medicago sativa)

<220>

<221>CDS

<222>(336)..(1961)

<400>1

acgcggggaa tccaacccat tgtataacaa caactaccgg agatatataa tatctctctc     60

ctctaaatag aatatcgaca gagtgactca acaagattat taggagtgat aatcttccac    120

ggcagctcaa aaacaaacaa catccgattc atcatcacgc gttgctcgag agatacttgt    180

gttgatgaga tcagaaggtt cttaaaatgg acagctcaga aacataaata tctgggattc    240

attattacta ctggactttg aaatttggaa attcagcaat aatctcaatt tgttcttaaa    300

tctgcttttg aaatttgtgg agggtggacg acatc atg gct att gaa atg tct       353

                                       Met Ala Ile Glu Met Ser

                                       1               5

tct att gtt tca aaa cta tca atg tta tcc act tcc gat cat gct tct      401

Ser Ile Val Ser Lys Leu Ser Met Leu Ser Thr Ser Asp His Ala Ser

            10                  15                  20

gtt gtt tct atg aac ttg ttt gtg gca ctt ctg tgt gct tgt att gtc      449

Val Val Ser Met Asn Leu Phe Val Ala Leu Leu Cys Ala Cys Ile Val

        25                  30                  35

ctt ggt cat ctt ctc gag gag aat cga tgg atg aat gaa tcc atc act      497

Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Asn Arg Trp Met Asn Glu Ser Ile Thr

    40                  45                  50

gcc ctt ttg att ggt att tgc act ggt gta gtg att ttg ctg ttt agt      545

Ala Leu Leu Ile Gly Ile Cys Thr Gly Val Val Ile Leu Leu Phe Ser

55                  60                  65                  70

ggt gga aaa agt tcg cat att ctt gtt ttc agt gaa gat ctt ttc ttt      593

Gly Gly Lys Ser Ser His Ile Leu Val Phe Ser Glu Asp Leu Phe Phe

                75                  80                  85

ata tac ctt ctg ccg cct att ata ttc aat gcc ggg ttt caa gta aag      641

Ile Tyr Leu Leu Pro Pro Ile Ile Phe Asn Ala Gly Phe Gln Val Lys

            90                  95                  100

aaa aag cag ttt ttt gtc aac ttc atg act atc aca tca ttt gga gct      689

Lys Lys Gln Phe Phe Val Asn Phe Met Thr Ile Thr Ser Phe Gly Ala

        105                 110                 115

att ggc aca tta ata tct tgt gtc att ata acc acg ggt gct act ttt      737

Ile Gly Thr Leu Ile Ser Cys Val Ile Ile Thr Thr Gly Ala Thr Phe

    120                 125                 130

gct ttt aag agg atg gat att ggg cca ctg gaa atc ggc gat tat cta      785

Ala Phe Lys Arg Met Asp Ile Gly Pro Leu Glu Ile Gly Asp Tyr Leu

135                 140                 145                 150

gct att gga gca ata ttt gcc gca aca gac tct gtt tgc aca ttg cag      833

Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Val Cys Thr Leu Gln

                155                 160                 165

gtg cta aat cag gat gag aca cct tta ttg tat agt ctt gta ttt ggg      881

Val Leu Asn Gln Asp Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ser Leu Val Phe Gly

            170                 175                 180

gaa ggt gtt gtg aat gat gct acc tca gtg gtt ctt ttc aat gca att      929

Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser Val Val Leu Phe Asn Ala Ile

        185                 190                 195

caa agc ttt gat ctt aac caa ctg aac cct tca att gca ttg cat ttc      977

Gln Ser Phe Asp Leu Asn Gln Leu Asn Pro Ser Ile Ala Leu His Phe

    200                 205                 210

ttg ggc aac ttc ctg tat ttg ttt gta gca agc aca ctc ctt ggc gtt      1025

Leu Gly Asn Phe Leu Tyr Leu Phe Val Ala Ser Thr Leu Leu Gly Val

215                 220                 225                 230

gtg aca ggt ctg ctc agt gcc tat gtt att aaa aag ctg tac att ggc      1073

Val Thr Gly Leu Leu Ser Ala Tyr Val Ile Lys Lys Leu Tyr Ile Gly

                235                 240                 245

agg cac tcc aca gat cgt gag gtt gct ctt atg atg cta atg gca tac     1121

Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Val Ala Leu Met Met Leu Met Ala Tyr

            250                 255                 260

ctc tcc tat atg ctg gct gag tta acc tat ctg agt ggc att ctt acc     1169

Leu Ser Tyr Met Leu Ala Glu Leu Thr Tyr Leu Ser Gly Ile Leu Thr

        265                 270                 275

gta ttc ttt tgt ggt att gtt atg tct cat tat act tgg cat aat gtg     1217

Val Phe Phe Cys Gly Ile Val Met Ser His Tyr Thr Trp His Asn Val

    280                 285                 290

acg cag agt tca aga atc act acc aag cat tct ttt gct acc ttg tcc     1265

Thr Gln Ser Ser Arg Ile Thr Thr Lys His Ser Phe Ala Thr Leu Ser

295                 300                 305                 310

ttt gtt gct gag atc ttt atc ttc ctt tat gtt ggt atg gat gcc ctg     1313

Phe Val Ala Glu Ile Phe Ile Phe Leu Tyr Val Gly Met Asp Ala Leu

                315                 320                 325

gac att gaa aaa tgg aag ttt gtt agt gat agt cct gga aca tct ata     1361

Asp Ile Glu Lys Trp Lys Phe Val Ser Asp Ser Pro Gly Thr Ser Ile

            330                 335                 340

gct gca agt tca gta ttg ttg ggt cta ata ctt ctt gga aga gca gcg     1409

Ala Ala Ser Ser Val Leu Leu Gly Leu Ile Leu Leu Gly Arg Ala Ala

        345                 350                 355

ttt gtt ttt ccc tta tcc ttc tta tcc aac ttg act aaa aaa tca caa     1457

Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser Asn Leu Thr Lys Lys Ser Gln

    360                 365                 370

cat cag aag att tcc ttc aga cag caa gtt ate att tgg tgg gct ggt     1505

His Gln Lys Ile Ser Phe Arg Gln Gln Val Ile Ile Trp Trp Ala Gly

375                 380                 385                 390

ctt atg aga ggt gct gtt tca atg gca ctt gcg tat aat cag ttc acc     1553

Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Met Ala Leu Ala Tyr Asn Gln Phe Thr

                395                 400                 405

atg tcg ggg cat act caa cta cgt agc aat gca atc atg ata acc agc      1601

Met Ser Gly His Thr Gln Leu Arg Ser Asn Ala Ile Met Ile Thr Ser

            410                 415                 420

acc atc act gtt gtc ctt ttc agc aca gtg gtg ttt ggt ttg ctg act      1649

Thr Ile Thr Val Val Leu Phe Ser Thr Val Val Phe Gly Leu Leu Thr

        425                 430                 435

aag cca ctc ata agg ctt cta cta cct cat cct aaa atc aca agc agc      1697

Lys Pro Leu Ile Arg Leu Leu Leu Pro His Pro Lys Ile Thr Ser Ser

    440                 445                 450

atg aca acc aca gaa tcg act act cca aaa tca ttc att gtc cca ctt      1745

Met Thr Thr Thr Glu Ser Thr Thr Pro Lys Ser Phe Ile Val Pro Leu

455                 460                 465                 470

cta gga gat tcc cga gat tct gaa gct gat ctt gaa ggc cat gaa att      1793

Leu Gly Asp Ser Arg Asp Ser Glu Ala Asp Leu Glu Gly His Glu Ile

                475                 480                 485

cac cga ccg aac agc ctt cgt gct tta cta tca act cca act cac act      1841

His Arg Pro Asn Ser Leu Arg Ala Leu Leu Ser Thr Pro Thr His Thr

            490                 495                 500

gtt cat cga tta tgg cga aag ttt gat gat tca ttc atg cgt cct gtt      1889

Val His Arg Leu Trp Arg Lys Phe Asp Asp Ser Phe Met Arg Pro Val

        505                 510                 515

ttt ggt ggc aga ggt ttt gtt cct gta gaa cct ggc tca cca agt gaa      1937

Phe Gly Gly Arg Gly Phe Val Pro Val Glu Pro Gly Ser Pro Ser Glu

    520                 525                 530

cgc aat ggt aat caa tgg ggt tga gaaaagaagc catgaaatgt gtaatatgtg     1991

Arg Asn Gly Asn Gln Trp Gly

535                 540

ttgtatacta cgtatgattt gtgaaaagtc atgcaacgtg tgtataatgt atttattgca    2051

taagaaccta gtagtgaaat ttttctttaa aaaaaaacct cgtagtgaaa ttttgttgag    2111

ctgtttgagt agctagtatg agatggcttg ccatctctct gtctattatg taaactacaa    2171

tattttttag attctctgag ccattacatg tttgtgtatg tgtccaaaaa aaaaaaaaaa    2231

a                                                                    2232

<210>2

<211>541

<212>PRT

<213>紫花苜蓿(Medicago sativa)

<400>2

Met Ala Ile Glu Met Ser Ser Ile Val Ser Lys Leu Ser Met Leu Ser

1               5                   10                  15

Thr Ser Asp His Ala Ser Val Val Ser Met Asn Leu Phe Val Ala Leu

            20                  25                  30

Leu Cys Ala Cys Ile Val Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Asn Arg Trp

        35                  40                  45

Met Asn Glu Ser Ile Thr Ala Leu Leu Ile Gly Ile Cys Thr Gly Val

    50                  55                  60

Val Ile Leu Leu Phe Ser Gly Gly Lys Ser Ser His Ile Leu Val Phe

65                  70                  75                  80

Ser Glu Asp Leu Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Pro Pro Ile Ile Phe Ash

                85                  90                  95

Ala Gly Phe Gln Val Lys Lys Lys Gln Phe Phe Val Asn Phe Met Thr

            100                 105                 110

Ile Thr Ser Phe Gly Ala Ile Gly Thr Leu Ile Ser Cys Val Ile Ile

        115                 120                 125

Thr Thr Gly Ala Thr Phe Ala Phe Lys Arg Met Asp Ile Gly Pro Leu

    130                 135                 140

Glu Ile Gly Asp Tyr Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ala Ala Thr Asp

145                 150                 155                 160

Ser Val Cys Thr Leu Gln Val Leu Asn Gln Asp Glu Thr Pro Leu Leu

                165                 170                 175

Tyr Ser Leu Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser Val

            180                 185                 190

Val Leu Phe Asn Ala Ile Gln Ser Phe Asp Leu Asn Gln Leu Asn Pro

        195                 200                 205

Ser Ile Ala Leu His Phe Leu Gly Asn Phe Leu Tyr Leu Phe Val Ala

    210                 215                 220

Ser Thr Leu Leu Gly Val Val Thr Gly Leu Leu Ser Ala Tyr Val Ile

225                 230                 235                 240

Lys Lys Leu Tyr Ile Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Val Ala Leu

                245                 250                 255

Met Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Met Leu Ala Glu Leu Thr Tyr

            260                 265                 270

Leu Ser Gly Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile Val Met Ser His

        275                 280                 285

Tyr Thr Trp His Asn Val Thr Gln Ser Ser Arg Ile Thr Thr Lys His

    290                 295                 300

Ser Phe Ala Thr Leu Ser Phe Val Ala Glu Ile Phe Ile Phe Leu Tyr

305                 310                 315                 320

Val Gly Met Asp Ala Leu Asp Ile Glu Lys Trp Lys Phe Val Ser Asp

                325                 330                 335

Ser Pro Gly Thr Ser Ile Ala Ala Ser Ser Val Leu Leu Gly Leu Ile

            340                 345                 350

Leu Leu Gly Arg Ala Ala Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser Asn

        355                 360                 365

Leu Thr Lys Lys Ser Gln His Gln Lys Ile Ser Phe Arg Gln Gln Val

    370                 375                 380

Ile Ile Trp Trp Ala Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Met Ala Leu

385                 390                 395                 400

Ala Tyr Asn Gln Phe Thr Met Ser Gly His Thr Gln Leu Arg Ser Asn

                405                 410                 415

Ala Ile Met Ile Thr Ser Thr Ile Thr Val Val Leu Phe Ser Thr Val

            420                 425                 430

Val Phe Gly Leu Leu Thr Lys Pro Leu Ile Arg Leu Leu Leu Pro His

        435                 440                 445

Pro Lys Ile Thr Ser Ser Met Thr Thr Thr Glu Ser Thr Thr Pro Lys

    450                 455                 460

Ser Phe Ile Val Pro Leu Leu Gly Asp Ser Arg Asp Ser Glu Ala Asp

465                 470                 475                 480

Leu Glu Gly His Glu Ile His Arg Pro Asn Ser Leu Arg Ala Leu Leu

                485                 490                 495

Ser Thr Pro Thr His Thr Val His Arg Leu Trp Arg Lys Phe Asp Asp

            500                 505                 510

Ser Phe Met Arg Pro Val Phe Gly Gly Arg Gly Phe Val Pro Val Glu

        515                 520                 525

Pro Gly Ser Pro Ser Glu Arg Asn Gly Asn Gln Trp Gly

    530                 535                 540

<210>3

<211>289

<212>DNA

<213>紫花苜蓿(Medicago sativa)

<400>3

ccacccatca tcttcaatgc agggtttcaa gtaaagaaaa agcagttttt tgtcaacttc     60

atgactatca catcatttgg agctattggc acattaatat cttgtgtcat tataaccacg    120

ggtgctactt ttgcttttaa gaggatggat attgggccac tggaaatcgg cgattatcta    180

gctattggag caatatttgc cgcaacagac tctgtttgca cattgcaggt gctaaatcag    240

gatgagacac ctttattgta cagtctggtc ttcggtgagg gtgttgtta                289

<210>4

<211>1516

<212>DNA

<213>紫花苜蓿(Medicago sativa)

<400>4

ataaccacgg gtgctacttt tgcttttaag aggatggata ttgggccact ggaaatcggc    60

gattatctag ctattggagc aatatttgcc gcaacagact ctgtttgcac attgcaggtg     120

ctaaatcagg atgagacacc tttattgtat agtcttgtat ttggggaagg tgttgtgaat     180

gatgctacct cagtggttct tttcaatgca attcaaagct ttgatcttaa ccaactgaac     240

ccttcaattg cattgcattt cttgggcaac ttcctgtatt tgtttgtagc aagcacactc     300

cttggcgttg tgacaggtct gctcagtgcc tatgttatta aaaagctgta cattggcagg     360

cactccacag atcgtgaggt tgctcttatg atgctaatgg catacctctc ctatatgctg     420

gctgagttaa cctatctgag tggcattctt accgtattct tttgtggtat tgttatgtct     480

cattatactt ggcataatgt gacgcagagt tcaagaatca ctaccaagca ttcttttgct     540

accttgtcct ttgttgctga gatctttatc ttcctttatg ttggtatgga tgccctggac     600

attgaaaaat ggaagtttgt tagtgatagt cctggaacat ctatagctgc aagttcagta     660

ttgttgggtc taatacttct tggaagagca gcgtttgttt ttcccttatc cttcttatcc     720

aacttgacta aaaaatcaca acatcagaag atttccttca gacagcaagt tatcatttgg     780

tgggctggtc ttatgagagg tgctgtttca atggcacttg cgtataatca gttcaccatg     840

tcggggcata ctcaactacg tagcaatgca atcatgataa ccagcaccat cactgttgtc     900

cttttcagca cagtggtgtt tggtttgctg actaagccac tcataaggct tctactacct     960

catcctaaaa tcacaagcag catgacaacc acagaatcga ctactccaaa atcattcatt    1020

gtcccacttc taggagattc ccgagattct gaagctgatc ttgaaggcca tgaaattcac    1080

cgaccgaaca gccttcgtgc tttactatca actccaactc acactgttca tcgattatgg    1140

cgaaagtttg atgattcatt catgcgtcct gtttttggtg gcagaggttt tgttcctgta    1200

gaacctggct caccaagtga acgcaatggt aatcaatggg gttgagaaaa gaagccatga    1260

aatgtgtaat atgtgttgta tactacgtat gatttgtgaa aagtcatgca acgtgtgtat    1320

aatgtattta ttgcataaga acctagtagt gaaatttttc tttaaaaaaa aacctcgtag    1380

tgaaattttg ttgagctgtt tgagtagcta gtatgagatg gcttgccatc tctctgtcta    1440

ttatgtaaac tacaatattt tttagattct ctgagccatt acatgtttgt gtatgtgtcc    1500

aaaaaaaaaa aaaaaa                                                    1516

<210>5

<211>541

<212>PRT

<213>紫花苜蓿(Medicago sativa)

<400>5

acgcggggaa tccaacccat tgtataacaa caactaccgg agatatataa tatctctctc     60

ctctaaatag aatatcgaca gagtgactca acaagattat taggagtgat aatcttccac    120

ggcagctcaa aaacaaacaa catccgattc atcatcacgc gttgctcgag agatacttgt     180

gttgatgaga tcagaaggtt cttaaaatgg acagctcaga aacataaata tctgggattc     240

attattacta ctggactttg aaatttggaa attcagcaat aatctcaatt tgttcttaaa     300

tctgcttttg aaatttgtgg agggtggacg acatcatggc tattgaaatg tcttctattg     360

tttcaaaact atcaatgtta tccacttccg atcatgcttc tgttgtttct atgaacttgt     420

ttgtggcact tctgtgtgct tgtattgtcc ttggtcatct tctcgaggag aatcgatgga     480

tgaatgaatc catcactgcc cttttgattg gtatttgcac tggtgtagtg attttgctgt     540

ttagtggtgg aaaaagttcg catattcttg ttttcagtga agatcttttc tttatatacc     600

ttctgccgcc tattatattc aatgccgggt ttcaagtaaa gaaaaagcag ttttttgtca     660

acttcatgac tatcacatca tttggagcta ttggcacatt aatatcttgt gtcattataa     720

ccacgggtgc tacttttgct tttaagagga tggatattgg gccactggaa atcggcgatt     780

atctagctat tggagcaata tttgccgcaa cagactctgt ttgcacattg caggtgctaa     840

atcaggatga gacaccttta ttgtatagtc ttgtatttgg ggaaggtgtt gtgaatgatg     900

ctacctcagt ggttcttttc aatgcaattc aaagctttga tcttaaccaa ctgaaccctt     960

caattgcatt gcatttcttg ggcaacttcc tgtatttgtt tgtagcaagc acactccttg    1020

gcgttgtgac aggtctgctc agtgcctatg                                     1050

Claims (8)

1、一种紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2、紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的编码基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2氨基酸序列的多核苷酸。

3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的编码基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的编码基因的读码框为SEQ ID NO：1自5’端第336到第1961位碱基。

5、含有权利要求2所述紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的编码基因的表达载体。

6、含有权利要求2所述紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的编码基因的细胞系。

7、权利要求2所述紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的编码基因在苜蓿耐盐分子机制研究中的应用。

8、权利要求2所述紫花苜蓿Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的编码基因在植物耐盐性状改良中的应用。

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