CN1296382C

CN1296382C - 玉米bZIP类转录因子及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN1296382C
Application number: CNB038178079A
Authority: CN
Inventors: 赵军; 王磊; 范云六
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2002-07-30
Filing date: 2003-07-28
Publication date: 2007-01-24
Anticipated expiration: 2023-07-28
Also published as: CN1273483C; CN1472223A; WO2004011493A1; US7323339B2; US20060021091A1; US20080060098A1; CN1671738A; AU2003257774A1; US20080060097A1

Abstract

本发明公开了玉米bZIP类转录因子、其编码基因及其应用。该类转录因子ABP2、ABP4、ABP9，它们的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2、4、6所示。其编码基因ABP2、ABP4、ABP9的碱基序列分别如SEQ ID NO：1、3、5所示。本发明的基因对培育抗非生物逆境植物品种，提高植物对非生物逆境的抵抗能力具有重要意义。

Description

玉米bZIP类转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域中的转录因子及其编码基因与应用，特别是玉米bZIP类转录因子、及其编码基因与应用。

背景技术

在干旱、高盐和低温等非生物逆境条件下，植物并不仅仅是被动的接受，而是积极地调动体内的防卫体系来对抗外来的逆境，这时在植物体内发生很多变化，如新蛋白质的合成，代谢的转变，抗逆境物质的积累等等(Hans J.Plant cell.1995，7：1099-1111)。其中很多蛋白参与了植物对非生物逆境的反应(Ashwani Pareek.Current Science.1998，75：1170-1174)，它们协同调节植物生理生化以及代谢的变化，提高植物对非生物逆境的抗性。研究表明植物对非生物逆境的抵抗并不是依靠某一两个功能基因就能完成的。

在非生物逆境条件下，植物体内被诱导产生的蛋白中有许多与植物抗逆境密切相关，其中的一些蛋白的编码基因已被克隆(Anil Grover.CurrentScience.1998，75：689-695)。为了提高植物的抗寒、抗旱和抗盐等非生物逆境的能力，许多其它不同来源的抗逆相关基因被克隆，并转化到植物中(Shavindra Bajaj.Molecular Breeding.1999，5：493-503)。其编码的蛋白可分为三类：1)合成渗透调节因子的酶类：如向烟草转入来自E.coli的mtlD基因，可提高植物的甘露醇含量；向烟草、水稻转入P5CS，可提高植物的脯氨酸含量；向拟南芥、水稻转入codA，可提高植物甜菜碱的含量(Sakamoto A.PMB.1998，38：1011-1019)。2)LEA及其相关蛋白：如向拟南芥转入cor15a基因(Steponkus PL.PNAS.1998，95：14570-14575)。3)氧化逆境相关蛋白：如向苜蓿中转入Mn-SOD(Mckersic BD.Plant Physiol.1999，111：1177-1181)；向烟草中转入GST。这些功能基因转入到植物体后，在实验室条件下，植株在某一方面的抗逆性有所提高，但所取得的效果并不理想。最近，有人向拟南芥中转入抗逆相关的转录因子CBF1(C-repeat Binding Factor)的基因，CBF1可调控一系列抗寒相关基因的表达，与上述单功能基因相比，CBF1明显提高拟南芥的抗寒性能(Kirsten R.Science.1998，280：104-106)。同样，向拟南芥转入DREB1A因子的基因，可调控与抗非生物逆境相关的多个基因的表达，明显提高了植株的抗盐、抗寒、抗旱的能力(Mie Kasuga.Nature Biotechnology.1999，17：287-291)。

已有研究表明在干旱、盐渍和低温等逆境条件下，植物体内会产生大量的活性氧，形成氧化逆境(Zhu J K..Trends Plant Sci.2001，6：66-71)。由于活性氧具有非常活泼的化学性质，它会对细胞造成严重的伤害，如损伤细胞膜、使重要的酶类失活及DNA断裂等，因此活性氧的及时清除对植物抗非生物逆境能力的提高具有重要意义。在活性氧的清除过程中，过氧化氢酶CAT1起着重要作用，但在逆境条件下，植物本身的抗氧化系统受诱导表达的能力比较弱，不能及时地清除体内的活性氧，影响了植物抗逆性的进一步提高。因此，克隆调控Cat1表达的转录因子编码基因不仅有助于对ROS信号传导路径的理解，而且对培育具有抗旱、抗盐、抗寒等逆境能力的作物具有重要的指导意义，因为这样的反式因子不仅能够调控Cat1基因的表达，还能调控其它一系列的抗氧化基因和抗非生物逆境基因的表达。

ABRE是存在于许多逆境响应基因启动子区的ABA响应元件(ABAResponsive elelment)，其特征序列是(C/G/T)ACGTG(G/T)(A/C)(Chen WQ.Plant Cell.2001，14：559-574)。Cat1基因的启动子区含有与逆境相关的重要的顺式调控元件ABRE1和ABRE2，缺失分析表明ABRE2(5’-GAAGTCCACGTGGAGGTGG)是Cat1基因响应ABA调控所必需的顺式元件。在玉米幼胚的发育过程中，随着ABA含量的升高，Cat1基因的表达也随之增强。胚发育的过程就是有机物质不断积累、细胞不断脱水的过程，也是细胞抗逆境能力不断提高的过程。研究表明在玉米幼胚的发育过程中，细胞中存在着能够与ABRE2相互作用的反式因子，可分为两类：一类是依赖于ABA的能够与Cat1基因ABRE2元件相互作用的反式因子(命名为Cat1promoter Binding Factor 1，CBF1)，另一类是不依赖于ABA的能够与Cat1基因ABRE2元件相互作用的反式因子(命名为Cat1 promoter Binding Factor 2，CBF2)(Lingqing M.Guan.The Plant Journal.2000，22(2)：87-95)。目前还没有关于这两类重要调控因子的报道。

发明公开

本发明的目的是提供玉米bZIP类转录因子及其编码基因。

本发明所提供的玉米bZIP类转录因子来源于玉米，分别命名为ABRE结合蛋白ABP2、ABP4、ABP9(ABRE Binding Protein)，它们分别是具有序列表中序列2、4、6的氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2、4、6的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2、4、6的氨基酸残基序列相同活性的由序列2、4、6衍生的蛋白质。

ABP2优选的是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，由351个氨基酸残基组成。

ABP4优选的是具有序列表中序列4氨基酸残基序列的蛋白质，由360个氨基酸残基组成。

ABP9优选的是具有序列表中序列6氨基酸残基序列的蛋白质，由385个氨基酸残基组成。

把本发明所得到的ABP2、ABP4、ABP9的蛋白序列输入到GenBank中进行BLAST分析，结果表明ABP2、ABP4、ABP9属于bZIP类转录因子，与已报道的bZIP类转录因子相比，ABP2、ABP4、ABP9与它们之间的同源性均很低。

本发明以Not I adapter：5’-pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T)₁₅-3’为引物构建了玉米授粉后17天(17dpp)幼胚的cDNA文库，该文库的库容量为5.2×10⁶cfu。

本发明设计合成了下述引物：

用于反转录的引物：ABP2 rv2：5’-GCG ACA GCG ACG ACA GAT CA-3’

ABP4 rv2：5’-AGC GCC AGA AGC GGA GGC CA-3’

ABP9 rv2：5’-CCT TCA CCA GGA AGT CCT CCA-3’

用于PCR的引物：AUAP fw：5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3’

ABP2 rv3：5’-AGG AAC TCC TCC AGA GTC AT-3’

ABP4 rv3：5’-TCG TCG AAC GTC AAC GAG TAG-3’

ABP9 rv3：5’-AAC CAA TCC TCC GTT CTC ACC-3’

通过RT-PCR及RACE方法从玉米幼胚中克隆玉米bZIP类转录因子基因。

玉米bZIP类转录因子ABP2、ABP4、ABP9的编码基因ABP2、ABP4、ABP9，分别是与序列表中SEQ ID №：1、3、5限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

ABP2优选的是序列表中序列1的DNA序列，由1485bp碱基组成，该基因的读码框为自5’端第114位到第1056位碱基的DNA序列。

ABP4优选的是序列表中序列3的DNA序列，由1835bp碱基组成，该基因的读码框为自5’端第93位到第1175位碱基的DNA序列。

ABP9优选的是序列表中序列5的DNA序列，由1510bp碱基组成，该基因的读码框为自5’端第45位到第1202位碱基的DNA序列。

将所克隆的ABP2、ABP4、ABP9基因分别构建到酵母表达载体pPC86上，研究了ABP2、ABP4、ABP9与ABRE的体内结合特异性，结果表明ABP2、ABP4、ABP9基因产物在酵母体内具有ABRE结合特异性。

将所克隆的ABP2、ABP4、ABP9基因分别构建到原核表达载体pGEX4T-1上，研究了ABP2、ABP4、ABP9与ABRE的体外结合特异性，结果表明ABP2、ABP4、ABP9基因产物在体外具有ABRE结合特异性，能够特异作用于含有核心元件序列为(C/G/T)ACGTG(G/T)(A/C)的ABRE顺式元件。

将所克隆的ABP2、ABP4、ABP9基因分别构建到酵母表达载体YepGAP和植物表达载体pBI121上，研究了ABP2、ABP4、ABP9在酵母体内和玉米细胞中的ABRE结合特异性及转录激活功能。结果表明ABP2、ABP4、ABP9基因产物在酵母和玉米悬浮细胞中均具有ABRE结合特异性和转录激活功能。因此，ABP2、ABP4、ABP9基因产物是具有ABRE结合特异性和转录激活功能的转录因子。且ABP2、ABP4、ABP9基因受到盐、干旱、过氧化氢、ABA等逆境条件的诱导表达。

把ABP2、ABP4、ABP9基因构建到植物转化载体pBI121及pZP212上得到pZP212-ABP2、pZP212-ABP4、pBI121-ABP9，并转化到农杆菌中，用农杆菌转化拟南芥并获得了转基因植株。对转基因植株在不同的逆境条件下进行处理，结果证明ABP2、ABP4、ABP9能够提高转基因植物的抗寒、抗盐和抗旱等非生物逆境的能力。

含有本发明ABP2、ABP4、ABP9基因的表达载体和细胞系，以及含有该类基因的抗非生物逆境植物品种均为本发明的保护范围。

本发明成功地从玉米中分离、克隆到了具有ABRE结合特异性的转录调控因子的编码基因ABP2、ABP4、ABP9，不仅有助于对ROS信号传导路径的理解，而且对培育具有抗旱、抗盐、抗寒等逆境能力的作物具有重要的指导意义。由该类基因表达的调控因子可作用于多个抗非生物逆境相关基因启动子区的ABRE顺式作用元件，调控抗非生物逆境相关基因的表达，提高植物对非生物逆境的抵抗能力。

附图说明

图1为酵母的生长情况，显示ABP2、ABP4、ABP9与ABRE的体内结合特异性。

图2为非变性聚丙烯酰胺电泳图谱，显示ABP2、ABP4、ABP9与ABRE的体外结合特异性。

图3为酵母的生长情况，显示ABP2、ABP4、ABP9在酵母体内的ABRE结合特异性及转录激活功能。

图4为转化的玉米悬浮细胞，显示ABP2、ABP4、ABP9在玉米细胞中的ABRE结合特异性及转录激活功能。

图5为PCR结果的电泳图谱，显示ABP2、ABP4、ABP9在盐、干旱、过氧化氢、ABA、低温等逆境条件下的表达。

图6为ABP2、ABP4、ABP9转基因表达载体的构建示意物理图谱。

图7为转ABP2、ABP4、ABP9基因拟南芥的抗盐试验结果。

图8为转ABP2、ABP4、ABP9基因拟南芥的抗寒试验结果。

图9为转ABP2、ABP4、ABP9基因拟南芥的抗旱试验结果。

实施发明的最佳方式

实施例1、玉米bZIP类转录因子编码基因的克隆与筛选

材料与方法

1)玉米材料：玉米选用齐319授粉后17天(17dpp)的幼胚。

2)菌种：大肠杆菌E.coli DH5α，DH10B、JM109及酵母菌株yWAM2(Leu^-，His^-，Trp^-)。

3)载体：pBSK+、pRS315及pPC86。

4)工具酶和修饰酶：各种限制性内切酶和修饰酶购自Promega公司，New England Biolab公司和Gibco公司。

5)化学试剂：酵母培养用试剂均购自Sigma公司和Oxford公司；其它化学药品均为国产分析纯。

6)试剂盒：质粒DNA提取用Promega公司的Wizard^TM Minipreps DNAPurification System和Wizard^TM Maxipreps DNA Purification System；回收DNA用鼎国公司的DNA片段快速纯化/回收试剂盒；RNA提取用Promega公司的RNAgents Total RNA Isolation System kit和PolyATtract mRNAIsolation System；文库构建用GibcoBRL公司的SuperScript^TM Plasmid Systemfor cDNA Synthesis and Plasmid Cloning kit。

7)引物合成：由北京赛百盛生物工程公司和上海博亚生物技术有限公司合成。

8)测序：由上海博亚生物技术有限公司完成。

实验步骤

1)总RNA的提取和mRNA的分离：

总RNA的提取和mRNA的分离分别按Promega公司的RNAgents TotalRNA Isolation System kit和PolyATtract mRNA Isolation System进行。取玉米17dpp幼胚1g，提取总RNA2.834mg，共分离出mRNA 43.7μg。取玉米21dpp幼胚1g，提取总RNA 2.427mg，共分离出mRNA 41.6μg。

2)玉米幼胚17dpp、21dpp cDNA文库的构建：

按GibcoBRL公司的SuperScript^TM Plasmid System for cDNA Synthesisand Plasmid Cloning kit进行。取出5μg 17dpp的mRNA用于cDNA文库构建，反转录引物用：

Not I adapter：5’-pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T)15-3’，

双链合成后加Sal I adapter：5’-TCGACCCACGCGTCCG-3’；

3’-GGGTGCGCAGGCp-5’；

再用Not I酶切，构建到经Sal I和Not I酶切纯化后的pPC86载体上(Trp⁺)。转化E.coli.DH10B，得到库容量为5.2×10⁶cfu的cDNA文库。

3)cDNA文库的扩增：

配2×LB培养基4L(Bacto-胰蛋白胨，20g/L，Bacto-酵母膏10g/L，NaCl10g/L，SeaPrep琼脂糖3g/L，pH 7.0)，121℃灭菌30min后，37℃温育2小时；加入氨苄青霉素至终浓度200mg/L；加入文库至10⁶cfu/L；混匀后，分装20～30mL到50mL的培养管中；冰浴1小时；30℃培养40小时；8000rpm离心10min，收集菌体；弃上清，加入200mL 2×LB(含甘油12.5％)悬浮细胞，分装成10mL一份于-70℃保存备用。

4)4mer ABRE诱饵载体及4mer mutant ABRE(mABRE)挽救载体的构建

合成引物ABRE(+)：5′GAAGTCCACGTGGAGGTGG3′和ABRE(-)：5′TCCCACCTCCACGTGGACT3′，各取20μl(1μg/μl)的ABRE(+)和ABRE(-)，混匀，加4μl 3M的NaOAc和100μl的无水乙醇，-20℃，30分钟后12000rpm离心，沉淀DNA，70％乙醇洗一次，干燥，加6.5μl无菌水，1μl 10×的T4多核苷酸激酶缓冲液，退火：条件是88℃，2min；65℃，10min；37℃，10min；25℃，5min；加1.5μl 20mM的ATP和1μl T4多核苷酸激酶，37℃反应2小时，加苯酚-氯仿和氯仿各抽提一次，用无水乙醇沉淀DNA。再加2μl 10×连接酶缓冲液，1μl连接酶(5units/μl)，17μl无菌水，16℃连接过夜，用2％的琼脂糖电泳，分离大小约为80bp的DNA片段，克隆到pBSK+载体上(经Spe I酶切，补平)，测序，获得pA4质粒。

合成引物mABRE(+)：5′-GAAGTAACATGTTCGGTGG-3′；

mABRE(-)：5′TCCCACCGAACATGTTACT 3′，方法同上，获得pmA4质粒。

pRS315His(Leu⁺)载体及pA4和pmA4质粒均用BamH I、Xba I双切后纯化，把4mer ABRE和4mer mABRE克隆到pRS315His，得到诱饵载体pRSA4(Leu⁺)和挽救载体pRSmA4(Leu⁺)质粒。

5)玉米幼胚17dpp cDNA文库的筛选：

制备yWAM2感受态细胞，把pRSA4转化到酵母菌株yWAM2(Leu^-，His^-，Trp^-)中，转化方法参照Two Hybrid System TRAFO Protocol进行。获得含有pRSA4的酵母菌株yA4(His^-，Trp^-)。用含有诱饵载体的yA4酵母对文库进行筛选，转化方法同上，将转化细胞涂到His^-选择培养基上，28℃培养3～5天。待酵母长出后，提酵母质粒，提取方法参照Method I：Quick Plasmid DNAPreparations from Yeast(Christine Guthrie 1991)。将酵母质粒转化E.Coli DH5α，从中提取质粒，酶切分析，测序可知所获得的阳性克隆的DNA序列，再对序列进行分析。

6)ABP2、ABP4、ABP9全长cDNA序列的获得：

采用5′RACE的方法得到了ABP2、ABP4、ABP9基因的全长cDNA序列，按GibcoBRL公司5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version2.0 kit操作。

用于反转录的引物：ABP2 rv2：5’-GCGACAGCGACGACAGATCA-3’

ABP4 rv2：5’-AGCGCCAGAAGCGGAGGCCA-3’

ABP9 rv2：5’-CCTTCACCAGGAAGTCCTCCA-3’

用于PCR的引物：AUAP fw：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’

ABP2 rv3：5’-AGGAACTCCTCCAGAGTCAT-3’

ABP4 rv3：5’-TCGTCGAACGTCAACGAGTAG-3’

ABP9 rv3：5’-AACCAATCCTCCGTTCTCACC-3’

PCR条件是：94℃，3min；94℃，30sec；60℃，30sec；72℃，1min，35个循环；72℃，5min。把扩增出DNA片段用1％的琼脂糖胶分离、回收并连接到pGEM-T easy vector，转化E.coli.JM109，酶切鉴定后测序，获得ABP2、ABP4、ABP9基因的全长cDNA序列，分别为序列表中的序列1、3、5，根据cDNA序列推测出其蛋白序列为序列2、4、6。

实施例2、ABP2、ABP4、ABP9的ABRE体内结合特异性分析

将yA4和ymA4转化到yWAM2酵母中，得到yA4和ymA4菌株，把筛库得到的ABP2、ABP4、ABP9质粒分别转化yA4和ymA4酵母，28℃在His^-选择培养基上培养3～5天，只有用ABP2、ABP4、ABP9质粒转化的yA4酵母能够生长，而ABP2、ABP4、ABP9质粒转化的ymA4酵母不能够生长，说明ABP2、ABP4、ABP9在酵母体内能够特异结合ABRE元件，激活了报告基因HIS3基因的表达，故能够在His^-选择培养基上生长(图1B)，相反由于ABP2、ABP4、ABP9不能与mABRE结合，不能激活报告基因HIS3基因的表达，在His^-选择培养基上也不能生长(图1A)，因此，ABP2、ABP4、ABP9在酵母体内具有ABRE结合特异性。

实施例3、ABP2、ABP4、ABP9的ABRE体外结合特异性分析(EMSA实验)

1)ABP2、ABP4、ABP9蛋白的纯化：

把ABP2、ABP4、ABP9的全长基因克隆到pGEX4T-1原核表达载体上，然后转化到BL21菌株中，用37℃，0.3mM IPTG诱导表达2～3小时，SDS-PAGE电泳，有特异的ABP2、ABP4、ABP9表达条带。ABP2、ABP4、ABP9蛋白纯化的操作方法按照Pharmacia公司的MicroSpin^TM GST Purification ModuLeprotocol进行，纯化的蛋白用于EMSA实验。

2)同位素标记ABRE和mABRE：

采用Promega公司的DNA 5′End-Labeling System，反应体系是：ABRE(或mABRE)1μl，T₄ PNK 10×buffer 5μl，γ-³²P-ATP 3μl，T₄ PNK(10U/μl)2μl，H₂O 39μl；37℃20分钟；加2μl 0.5M EDTA，68℃10分钟灭活；37℃10分钟；4℃保存备用。

3)ABP2、ABP4、ABP9蛋白与DNA结合反应：

5×binding buffer(125mM HEPES-KOH pH7.6；50％甘油；250mM KCl)4μl；ABP2、ABP4、ABP9和GST蛋白各约4μg(9μl)；1M DTT 1μl；上述标记的ABRE(或mABRE)探针1μl；H₂O 4μl；冰上结合30分钟，加3μl上样缓冲液(含0.025％溴酚蓝的无菌水)，进行聚丙烯酰胺电泳分析。

4)非变性聚丙烯酰胺电泳：

配制聚丙烯酰胺胶(5.4％)：30％丙烯酰胺9ml；10×电泳缓冲液5ml(甘氨酸142.7g/L，EDTA 3.92g/L，Tris 30.28g/L)；50％甘油2.5ml；去离子水33ml；10％APS 400μl；TEMED 25μl。待胶凝后，用1×电泳缓冲液电泳，预电泳10分钟(300V)；上样，电泳1小时(300V)；用滤纸粘下胶，保鲜膜封好后，压X光片1小时；洗片，显影2分钟，定影5分钟。结果表明有明显的被ABP2、ABP4、ABP9蛋白阻滞ABRE的电泳条带(图2)，相反，mABRE则不被阻滞，说明ABP2、ABP4、ABP9基因产物在体外同样具有ABRE结合特异性。

实施例4、ABP2、ABP4、ABP9在酵母和玉米细胞中的ABRE结合特异性及转录激活功能

1)酵母细胞中转录激活试验

把ABP2、ABP4、ABP9构建到YepGAP(Trp⁺)载体上，得到含有ABP2、ABP4、ABP9基因全长cDNA的酵母表达载体YepGAPABP-2、YepGAPABP-4、YepGAPABP-9质粒，将其转化到yA4和ymA4酵母中，在His^-选择培养基上28℃培养3~5天，结果表明用YepGAPABP-2、YepGAPABP-4、YepGAPABP-9质粒转化的yA4能够生长(图3B、D、F)，而ymA4不能生长(图3A、C、E)，因此ABP2、ABP4、ABP9在酵母细胞内不但具有ABRE结合特异性，而且具有转录激活功能。图3中，A：ymA4+ABP2；B：yA4+ABP2；C：ymA4+ABP4；D：yA4+ABP4；E：ymA4+ABP9；F：yA4+ABP9。

2)玉米细胞中的转录激活功能试验

报告载体的构建：pIG46载体用Xho I酶切，T4 DNA聚合酶补平，pBluescript II SK+载体上的4mer ABRE用Sma I、Ecl136 II酶切，回收约80bp的DNA片段与载体连接，转化E.coli DH5α，提质粒，酶切鉴定，测序表明ABRE已连在35S mini启动子上游。

ABP2、ABP4、ABP9瞬时表达载体的构建：把ABP2、ABP4、ABP9(XbaI，Xho I)基因的全长cDNA构建到植物瞬时表达载体pBI221上，得到pBI221-ABP2、ABP4、ABP9质粒，采用基因枪的方法共转化报告质粒和目的基因，转化材料为玉米悬浮细胞，转化方法参照B.R.格利克和J.E.汤普森主编的《植物分子生物学及生物技术的实用方法》，结果表明单独转化pIG46质粒，没有报告基因的表达(图4A)，把pIG46和pBI221-ABP2、ABP4、ABP9共转化时，有明显的报告基因的表达(图4B、C、D)，因此ABP2、ABP4、ABP9在玉米细胞内不但具有ABRE结合特异性，而且具有转录激活功能。

实施例5、ABP2、ABP4、ABP9在非生物逆境条件下的表达特异性分析

1)玉米材料的处理：取玉米种子，吸胀24hr，种植于花盆中，28℃，12hr光照培养约20天，待长出三叶一芯，进行不同条件的处理。

①冷害处理：将玉米苗置于2℃培养箱，12hr光照培养48hr，取出并洗去根上的土，用液氮速冻，-80℃保存备用。

②盐渍处理：分别将玉米苗置于0.6％，0.8％，1％的NaCl溶液中，12hr光照培养3天，取出并洗去根上的土，用液氮速冻，-80℃保存备用。

③干旱处理：分别将玉米苗置于含水量为8％(混和920g干土和80mL水)，10％，13％的土壤中12hr光照培养3天，取出并洗去根上的土，用液氮速冻，-80℃保存备用。

④ABA处理：分别将玉米苗置于10^-4M、10^-5M、10^-6M的ABA溶液中(取5mgABA用0.1N KOH溶解后，定容至95mL水中即为10^-4M)，12hr光照培养24hr，取出并洗去根上的土，用液氮速冻，-80℃保存备用。

⑤H₂O₂处理：分别将玉米苗置于10mM H₂O₂(1.13ml 30％H₂O₂/l)，60mMH₂O₂(6.78mL 30％H₂O₂/L)，150mM H₂O₂(14.95mL 30％H₂O₂/L)的水溶液中，12hr光照培养24hr，取出并洗去根上的土，用液氮速冻，-80℃保存备用。

⑥水处理：将玉米苗直接置于水中12hr光照培养24hr，-80℃冻存。

⑦对照的处理：直接取未经任何处理的苗-80℃冻存作为对照。

2)RNA的提取及DNA的去除：

①取约200mg处理的玉米材料，液氮研磨，提取RNA的方法按照Promega公司的RNAgents Total RNA Isolation System kit进行。

②将RNA溶于85μl水中，加入10×buffer 10μl和5μl RQ1 RNA FreeDNase(1U/μl)，37℃，15min，以去除DNA的污染。

③加入100μl的酚氯仿抽提一次，取上清，用等体积的异丙醇沉淀RNA，70％的乙醇洗一次，溶于50μl的水中。

④定量RNA的浓度为1μg/μl。

3)RT-PCR：

取Oligo dT₁₈ 1μl(0.5μg/μl)，RNA 5μl(1μg/μl)，dNTP 1μl(10mM)，H₂O 27μl；65℃，5min；0℃，2min；加入5×buffer 10μl，DTT(100mM)5μl，RNase Inhibitor 10U(40U/μl)；42℃，2～5min；加入SuperScipt II 1μl(200u/μl)；42℃，50min；70℃，15min灭活，备用。

模板cDNA的相对定量及内标引物的设计：根据GenBank上登录的玉米肌动蛋白基因(Maize Actin1 gene：Accession NO.J01238)设计如下引物：

mAct1 F：5’-CACCTTCTACAACGAGCTCCG-3’

mAct1 R：5’-TAATCAAGGGCAACGTAGGCA-3’

用该引物进行扩增，如果是cDNA可扩增出405bp的条带，如果是基因组DNA可扩增出512bp的条带(有107bp的内含子)。

PCR反应体系：模板1μl，2×PCR缓冲液10μl，10mM dNTP 1μl，10μM mAct1 F 1μl，10μM mAct1 R 1μl，Taq 1U，灭菌水6μl。

PCR条件：94℃，2min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，30sec；30cycle；72℃，5min。

根据PCR产物的电泳结果对模板DNA进行稀释，调整模板DNA的用量，直到用mAct1 F和mAct1 R引物扩增出的DNA条带的量基本一致，使每微升溶液中模板cDNA的含量基本一致。

4)ABP2、ABP4、ABP9基因的PCR扩增：

(①ABP2，设计PCR扩增的引物如下(扩增548bp)：

FW1 5’-TGATCTGTCGTCGCTGTCGC-3’

RV 5’-ACTCCAGGTTACTTGCATTAT-3’

PCR体系：模板1μl，2×PCR缓冲液10μl，10mM dNTP 1μl，10uMmAct1 F 1μl，10uM mAct1 R 1μl，Taq 1U，灭菌水6μl。

②ABP4，设计PCR扩增的引物如下(扩增632bp)：

W1R 5’-TCGGTTATTCCCAATACACA-3’

W2F 5’-AGCAGCGGTGAACCAGCTTG-3’

PCR体系：模板1μl，2×PCR buffer 10μl，10mM dNTP 1μl，10uMmAct1 F 1μl，10uM mAct1 R 1μl，Taq 1U，灭菌水6μl。

③ABP9，设计PCR扩增的引物如下(扩增937bp)：

FW1 5’-CATGACGCTGGAGGACTTCCT-3’

RV 5’-TTGACGAAAACACAGAGC-3’

PCR条件：94℃，2min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，50sec；30cycle；72℃，5min。电泳结果表明ABP2、ABP4、ABP9基因受盐渍(图5A、B、C)、干旱(图5J、K)、ABA(L、M、N)、过氧化氢(F、G)等逆境条件的诱导表达。图5中，A：CK1 B：1％NaCl C：0.8％NaCl D：0.6％NaCl E：150mM H₂O₂ F：60mMH₂O₂ G：10mM H₂O₂ H：H₂O I：13％H₂O J：10％H₂O K：8％H₂O L：10^-6MABA M：10^-5MABA N：10^-4MABA O：4℃ P：CK2

实施例6、ABP2、ABP4、ABP9转基因表达载体的构建

1)ABP2、ABP4、ABP9基因的拟南芥转化：

拟南芥的培养：拟南芥种子在4℃进行2-3天的春化处理，每盆播种7～10粒种子(营养土和蛭石按2∶1)；放于温室中培养(22℃，光照16h)；待拟南芥抽出初生苔后，剪去初生苔，待其抽出更多的次生苔，且少数开始结荚时，可用于转化。

农杆菌的培养：挑农杆菌单菌落接种在3mlYEB(Kan50mg/L，利福平50mg/l)，28℃，250rpm培养30小时；按1∶400转接入200ml新鲜的YEB(Kan50mg/l，利福平50mg/L)中，28℃，250rpm培养约14小时，测OD600≈1.5；7500rpm，4℃，10min离心收集菌体；重悬菌体于二倍体积(400ml)的渗透液(1/2MS盐+5％蔗糖，pH5.7，121℃，15min灭菌；用之前加6-BA至终浓度为0.044uM，VB6终浓度为1mg/l，VB1终浓度为10mg/l，SILWET 0.02％。

①载体构建及农杆菌转化：把ABP2、ABP4、ABP9构建到pBI121及pZP212载体上得到pZP212-ABP2、pZP212-ABP4、pBI121-ABP9(图6)，转化JM109，提质粒，酶切鉴定，挑出所需克隆，测序，并将其转化到农杆菌LBA4404中。

②拟南芥转化：把拟南芥的花蕾浸入渗透液中，抽真空(25IN Hg，保持5分钟)；转化完毕后，花盆外套上塑料袋，水平放置，使其在低光强度下生长24-48小时后，即可正常培养。

③收集种子，进行筛选：称25-30mg种子放入1.5mL离心管，加1ml 75％的乙醇(含0.05％Tween 20)，于摇床上摇10分钟(300rpm)，离心，去上清；加1ml 95％的乙醇洗一次，离心，去上清；重复一次；在超净台中加0.3ml的100％乙醇，移到无菌滤纸上，吹干；把吹干的种子撒到1/2MS平板(Kan50mg/l)上；4℃，放2天后，22℃，16h光照培养；将阳性植株(T0代)移栽到盆中培养，并收集种子进行T1代筛选。

2)转基因拟南芥基因组DNA的提取：

①在液氮中研磨0.1-0.2g植物叶片，转移至1.5ml离心管中。

②加入0.7ml CTAB(Tris 100mM，NaCl 1.4M，20mM EDTA，CTAB 2％，巯基乙醇0.1％)，60℃，30分钟。每隔10分钟，颠倒一次。

③加0.7ml酚∶氯仿(1∶1)，颠倒几次，10000rpm离心5分钟，转移上清至一新的离心管，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，10000rpm离心5分钟。转移上清至一新的离心管。

④加等体积的异丙醇，颠倒混匀，10000rpm离心10分钟，除去上清，70％乙醇洗一次，抽干，溶于50μl的无菌水中，用于PCR检测。

3)转基因拟南芥PCR检测：

正向引物：35S启动子：5’-TCTGCCGACAGTGGTCCCAA-3’

反向引物：ABP2 rv3：5’-AGG AAC TCC TCC AGA GTC AT-3’

ABP4 rv3：5’-TCG TCG AAC GTC AAC GAG TAG-3’

ABP9 rv3：5’-AAC CAA TCC TCC GTT CTC ACC-3’

反应体系(20μl)：转基因植株DNA 1μl(20ng～50ng)；10×buffer 2μl；MgCl₂(2.5mM)2μl；Taq酶0.2μl；dNTP(2.5mM)2μl；引物各加10μM；加无菌水至20μl。

反应条件：94℃，5分钟；94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，45秒；35个循环；72℃延伸5分钟。筛选出PCR阳性植株。

实施例7、ABP2、ABP4、ABP9转基因植株的生理分析实验

1)抗寒实验：把转基因植株与未转基因植株置于-6℃，保持6小时；转移到正常的生长条件下继续培养，结果表明：转基因植株的存活率为80％，未转基因的植株存活率为10％，ABP2、ABP4、ABP9能够明显提高植株的抗寒性能，结果如图7所示。

2)抗盐实验：把转基因植株与未转基因植株置于600mM的NaCl中浸泡3小时；22℃，光照培养24小时；转移到拟南芥正常的生长条件下继续培养，结果表明：转基因植株的存活率为80％，未转基因的植株存活率为15％，ABP2、ABP4、ABP9能够明显提高植株的抗盐性能，结果如图8所示。

3)抗旱实验：把转基因植株与未转基因植株置于拟南芥正常的生长条件下不给水连续培养15～20天。结果表明：转基因植株的存活率为90％，未转基因的植株存活率为5％，ABP2、ABP4、ABP9能够明显提高植株的抗旱性能，结果如图9所示，其中A为未转基因的植株，B为转基因植株。

工农业应用

本发明成功地克隆到了玉米bZIP类转录因子ABP2、ABP4、ABP9的编码基因，并成功地将其导入拟南芥中，得到了抗非生物逆境的拟南芥，对于培育抗非生物逆境植物品种具有重要的理论及现实意义。

序列表

<160>6

<210>1

<211>1485

<212>DNA

<213>玉米种玉米属(Zea mays L)

<400>1

atccgccctc tggtttttca gagcagcagt ccaggcgcgg aattgaattc cggtaggatt 60

tgagagcgga gcggagcgga gaggagaggg gaagaaggcg gtaggcgggg aagatggaga 120

tgccggcagg gagcggggcc ccagcgctgg cgcggcaggg ctcggtctac tcgctcacgt 180

tcgacgagtt ccagaccacg ctcggcggcg ccagcaagga cttcggctcc atgaacatgg 240

acgagctgct gcgcaacatc tggacagccg aggagtctaa cgccatggct gcggccgccc 300

cggccacggc cacggccacg gcggccgcat ccgtggacgc gcacgcgcag cagcagcagc 360

agcagcagca cggggcgccc atccagcgcc agggctcctt cacgctgccc cgcacactca 420

gccagaagac ggtcgacgag gtctggcgcg agatcgtgag cctcaccagc ggcgaggacg 480

cgcagcaggt tgcggctccc gctcccgctc ccgcgcccga gcccgagccc gcgcccgcgc 540

ccgcgccgct gccggcgcag gcgcaggcgc agcagacgct ggggtccatg actctggagg 600

agttcctggt acgcgccggc gtggttcgtg aggacatggg ggggcaccag accctcctgc 660

tgcagccgca cgcgcagggg cttttctccc aggggaatgc ggtcgcgccg cagaccctgc 720

agctgggaaa cgggatggtg gccggggtcg tcgggcaggg cctcggagga ggggtgacgg 780

tggcggctcc gacgacgccg gtcgtgttca acgggttggg aaaggtggag gcgggtgatc 840

tgtcgtcgct gtcgccggtg ccgtatccgt tcgacactgc gctgaggatg cggaagggac 900

ccaccgtcga gaaggtggtg gagaggaggc agcgccgcat gatcaagaac agggagtcgg 960

ccgccaggtc gcgtgcgagg aagcaggcgt acataatgga gctggaagct gaggtggcaa 1020

aactcaagga ccagaatgag gagttgcaga aaaagcaggt tgaaatgcta aagaagcaaa 1080

aggatgaggt cctggagcga atcaacagcc aacatggacc aaaggcaaag aagctttgcc 1140

tgcgccgcac cctgactggc ccatggtagc ctgctgaagc ttgcacaaaa ttgaccgaag 1200

tcaagatcgt cgggccagat gtgcccgtgt gtatatatca gatgaagtca agagtactga 1260

gtaccccgtt acccctgtag accgccgcta cttcagagct gccgttcttg ttctgtgacg 1320

tgggtagtct gcgcctgaca gttcgctgtt taggttcggt tgcgcgatcc tcacatgaac 1380

aatgaggcgt gccatctaat ttgtttatta actcactcct atctatggtg agataatgca 1440

agtaacctgg agtaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1485

<210>2

<211>351

<212>PRT

<213>玉米种玉米属(Zea mays L)

<220>(2)

<223>Xaa＝Lys或Glu

<400>2

Met Xaa Met Pro Ala Gly Ser Gly Ala Pro Ala Leu Ala Arg Gln

1 5 10 15

Gly Ser Val Tyr Ser Leu Thr Phe Asp Glu Phe Gln Thr Thr Leu

20 25 30

Gly Gly Ala Ser Lys Asp Phe Gly Ser Met Asn Met Asp Glu Leu

35 40 45

Leu Arg Asn Ile Trp Thr Ala Glu Glu Ser Asn Ala Met Ala Ala

50 55 60

Ala Ala Pro Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Ala Ala Ser Val Asp

65 70 75

Ala His Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Gly Ala Pro Ile

80 85 90

Gln Arg Gln Gly Ser Phe Thr Leu Pro Arg Thr Leu Ser Gln Lys

95 100 105

Thr Val Asp Glu Val Trp Arg Glu Ile Val Ser Leu Thr Ser Gly

110 115 120

Glu Asp Ala Gln Gln Val Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro

125 130 135

Glu Pro Glu Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Leu Pro Ala Gln Ala

140 145 150

Gln Ala Gln Gln Thr Leu Gly Ser Met Thr Leu Glu Glu Phe Leu

155 160 165

Val Arg Ala Gly Val Val Arg Glu Asp Met Gly Gly His Gln Thr

170 175 180

Leu Leu Leu Gln Pro His Ala Gln Gly Leu Phe Ser Gln Gly Asn

185 190 195

Ala Val Ala Pro Gln Thr Leu Gln Leu Gly Asn Gly Met Val Ala

200 205 210

Gly Val Val Gly Gln Gly Leu Gly Gly Gly Val Thr Val Ala Ala

215 220 225

Pro Thr Thr Pro Val Val Phe Asn Gly Leu Gly Lys Val Glu Ala

230 235 240

Gly Asp Leu Ser Ser Leu Ser Pro Val Pro Tyr Pro Phe Asp Thr

245 250 255

Ala Leu Arg Met Arg Lys Gly Pro Thr Val Glu Lys Val Val Glu

260 265 270

Arg Arg Gln Arg Arg Met Ile Lys Asn Arg Glu Ser Ala Ala Arg

275 280 285

Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Tyr Ile Met Glu Leu Glu Ala Glu

290 295 300

Val Ala Lys Leu Lys Asp Gln Asn Glu Glu Leu Gln Lys Lys Gln

305 310 315

Val Glu Met Leu Lys Lys Gln Lys Asp Glu Val Leu Glu Arg Ile

320 325 330

Asn Ser Gln His Gly Pro Lys Ala Lys Lys Leu Cys Leu Arg Arg

335 340 345

Thr Leu Thr Gly Pro Trp

350 351

<210>3

<211>1834

<212>DNA

<213>玉米种玉米属(Zea mays L)

<400>3

gtcttgaggc tttgagctct cctcacctcg tatccgtgtc tttctggtgc tgagctgagt 60

ctgagagaca ggtaaggagg aggagggtgg agatggaatt caagaactgc gggtcgtcgt 120

cgcagccccg gccggcggtg gtagtgggcg aggaggcggc gttggcgaga cagggatcag 180

tctactcgtt gacgttcgac gaattccaga gcgcgctcgg cggggccgcc accggcggtg 240

gcggtggcgg cagcatcccc aaggatttcg gttccatgaa catggacgaa ctgctccgga 300

gcatctggac cgcggaggag acccaggcca tggcctccgc ttctggcgct ggagcgggtg 360

cggggatgcc gccaacgtcg ctgcagcggc aagggtcgtc gctcacactg ccccgcacgc 420

tcagcaccaa gacggtcgac gaggtgtggc gcaatctcgt gcgcgacgag ccgctgcagg 480

gggcggacgg cggcgggcac cagcagcacc accgccagtc gacgctcggg gagatgactc 540

tggaggagtt cttggtcaga gctggcgtgg tcagggagaa ccccgctccg gctcctccag 600

caccaccacc catgatcccg ccgcggccgg tacctgtcgc ccctaaaagc tccgcctttt 660

tcgggaattt accgggtgcc gacgccgaca ccgccgcagc tgcggcagcg ctggggtttg 720

caccggtcgg catgggggat ctggcccaaa taccgcccag ggcagcaggc atgggaggcg 780

gcgccatggc tgtgcaagca gcggtgaacc agcttgattc tggcgggaag gggtacagcg 840

acctgtcgtc gccgacggag ccgctcccgt tttcgtttga ggggatgatt cgagggagga 900

ggcatggggg cggagtagag aaagtggtgg agaggcggca gaggaggatg atcaagaaca 960

gggagtccgc cgccaggtcc cgagcgcgca aacaggctta tactatggag ttagaagctg 1020

aagttcagaa actcaaggag cagaatcagg aactggagag gaaacaggca gagattatgg 1080

aaatgcagaa gaacgagcta ccagaaatgt tgaaggatcc attcggacgg aagaagcgtc 1140

tgtgcttgcg aagaacattg actgggcctt ggtgatgact atctgaaaca gcagacgagt 1200

cgcgctgcat acctgcagtg gtgcttggga tctgtacaca atttgtctcc tatagactag 1260

cgatggacgt agtggggatg attgtactgt taccgcttag ggcttgttcg gttagctctc 1320

aatccatgtg gattgagcgg gattggatgg gtttgaatcc caaacaagtc aaacttcttc 1380

acaatttttt ccaatcccat ccaatccatg tgtattggga ataaccgaac aagcccttat 1440

agtggagtcg gaaactgaca catgtagatt atgttagtag agaaccaaat ggagtgaagc 1500

cggccgcgca agactcgggc ttcagccatc ctccagagct tgtgtagagt tgcctagctt 1560

tgcatcttgc cagagccagc acgtcgtgta gagattggac ggttttaaaa gatcggtggc 1620

tgggtgtaag taggttggtg ggattacaag catgggcatg gcgacgttca ggatgcaacc 1680

ggcttgacga ctgtacgtac atctgatggc tgtagagctg tagtatgcaa actgtcccgc 1740

tgctgcttgt gtgtaatggt gaaaccagat gaatcggtta tttgtgtatt acttagcaaa 1800

tatgctcaca aggatttcaa aaaaaaaaaa aaaa 1834

<210>4

<211>360

<212>PRT

<213>玉米种玉米属(Zea mays L)

<400>4

Met Glu Phe Lys Asn Cys Gly Ser Ser Ser Gln Pro Arg Pro Ala

1 5 10 15

Val Val Val Gly Glu Glu Ala Ala Leu Ala Arg Gln Gly Ser Val

20 25 30

Tyr Ser Leu Thr Phe Asp Glu Phe Gln Ser Ala Leu Gly Gly Ala

35 40 45

Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ile Pro Lys Asp Phe Gly

50 55 60

Ser Met Asn Met Asp Glu Leu Leu Arg Ser Ile Trp Thr Ala Glu

65 70 75

Glu Thr Gln Ala Met Ala Ser Ala Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ala

80 85 90

Gly Met Pro Pro Thr Ser Leu Gln Arg Gln Gly Ser Ser Leu Thr

95 100 105

Leu Pro Arg Thr Leu Ser Thr Lys Thr Val Asp Glu Val Trp Arg

110 115 120

Asn Leu Val Arg Asp Glu Pro Leu Gln Gly Ala Asp Gly Gly Gly

125 130 135

His Gln Gln His His Arg Gln Ser Thr Leu Gly Glu Met Thr Leu

140 145 150

Glu Glu Phe Leu Val Arg Ala Gly Val Val Arg Glu Asn Pro Ala

155 160 165

Pro Ala Pro Pro Ala Pro Pro Pro Met Ile Pro Pro Arg Pro Val

170 175 180

Pro Val Ala Pro Lys Ser Ser Ala Phe Phe Gly Asn Leu Pro Gly

185 190 195

Ala Asp Ala Asp Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Phe Ala

200 205 210

Pro Val Gly Met Gly Asp Leu Ala Gln Ile Pro Pro Arg Ala Ala

215 220 225

Gly Met Gly Gly Gly Ala Met Ala Val Gln Ala Ala Val Asn Gln

230 235 240

Leu Asp Ser Gly Gly Lys Gly Tyr Ser Asp Leu Ser Ser Pro Thr

245 250 255

Glu Pro Leu Pro Phe Ser Phe Glu Gly Met Ile Arg Gly Arg Arg

260 265 270

His Gly Gly Gly Val Glu Lys Val Val Glu Arg Arg Gln Arg Arg

275 280 285

Met Ile Lys Asn Arg Glu Ser Ala Ala Arg Ser Arg Ala Arg Lys

290 295 300

Gln Ala Tyr Thr Met Glu Leu Glu Ala Glu Val Gln Lys Leu Lys

305 310 315

Glu Gln Asn Gln Glu Leu Glu Arg Lys Gln Ala Glu Ile Met Glu

320 325 330

Met Gln Lys Asn Glu Leu Pro Glu Met Leu Lys Asp Pro Phe Gly

335 340 345

Arg Lys Lys Arg Leu Cys Leu Arg Arg Thr Leu Thr Gly Pro Trp

350 355 360

<210>5

<211>1510

<212>DNA

<213>玉米种玉米属(Zea mays L)

<400>5

taaaaggagt ctttgcagtt gcaggtcgag tgtctagata tgatatggcg tcggagacga 60

ccaagaacgt gaaggccacc ctcgacgagc aggaggtaac ctcgcatcag cgcgaccaga 120

gcgctgccga ggaggaggag gtggtggtag tggtggatcc gctggcgcgg cagtcgtccg 180

tcatgtcgct tacgctggag gagctgcaga gctcgctctg cgagccgggg cgcaacttcg 240

ggtccatgaa catggacgag ttcatggcca acatatggaa cgccgaggag ttccaggccg 300

ccaccgccac cgccaccggc ggctgcagca agcaggaggg cacgcagcgg gagccgatga 360

tgcccgtggc gaatggaaca ggtgagaacg gaggattggt tcggcaggcc aacgcggcgg 420

cgcaggccgt ggtgcagccc cagatgggga gcggcggtgg cggcggcggc gtcgccgcca 480

gcgggcggca gcaggtgacg ctggccgaca tgacgctgga ggacttcctg gtgaaggctg 540

gcgtcgtgcg aggagccttc gccggccacg gccacgcggt cgtcggcatg gccccaatcc 600

cagccgggcg gatgggcatc cagcagcagc acgcggctcc cacgatgtcg taccaagtgg 660

cagcgccggc gcccaacgcc gtgtacccgg ttatgggcaa cggcacgggg taccacaacg 720

ggtaccccag ggccatcgcg gtggtgccgc cgtctcagtg cgtgacggcc gccgtgagcc 780

cggggtcgtc ggacggggtg agcgcgatga cgcaggcgga gatgatgagc tgcattggca 840

acgaaggggc agggacggtc cggaactacg gcggcggcgg cggcggcggc agcgcgcgga 900

agcgcgactc ccccgaggac gcgtgcaccg agaagaccgt ggagcgccgg cagcggcgga 960

tgatcaagaa ccgtgagtcc gcggcccggt cacgcgccag gaagcaggcg tatacggtgg 1020

agctcgaagc tgaactgaac cacctcaaag aggagaacga tcgcctcaga gcagagcaga 1080

agacgattct gctatcgaag aaaaagaagc tggtggagaa gatggtggag caggcaaggg 1140

agaatgtgag cgccaagaag ggcggtcgcg ggctgcgccg ctcgggcagc gccatgtggt 1200

gaactgtgac gactgacgag tgtctcgaat tgtgcagttc cagtccgctt gcttagttgc 1260

ttgtatggga aaaaaagtcc tgtacctgtc ggtagcagcaccgttagtaa cagtatgcca 1320

tgtggtcgac acaaacgtct gcgagggacg atatggggca tgggcgagag cttccgcgtt 1380

ggcctgctgc tgttcatgag cctgggttgt acaaacaata aagcaactgt aagatagtag 1440

taattaaaca caaagctctg tgttttcgtc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500

aaaaaaaaaa

1510

<210>6

<211>385

<212>PRT

<213>玉米种玉米属(Zea mays L)

<400>6

Met Ala Ser Glu Thr Thr Lys Asn Val Lys Ala Thr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Gln Glu Val Thr Ser His Gln Arg Asp Gln Ser Ala Ala Glu Glu

20 25 30

Glu Glu Val Val Val Val Val Asp Pro Lau Ala Arg Gln Ser Ser

35 40 45

Val Met Ser Leu Thr Leu Glu Glu Leu Gln Ser Ser Leu Cys Glu

50 55 60

Pro Gly Arg Asn Phe Gly Ser Met Asn Met Asp Glu Phe Met Ala

65 70 75

Asn Ile Trp Asn Ala Glu Glu Phe Gln Ala Ala Thr Ala Thr Ala

80 85 90

Thr Gly Gly Cys Ser Lys Gln Glu Gly Thr Gln Arg Glu Pro Met

95 100 105

Met Pro Val Ala Asn Gly Thr Gly Glu Asn Gly Gly Leu Val Arg

110 115 120

Gln Ala Asn Ala Ala Ala Gln Ala Val Val Gln Pro Gln Met Gly

125 130 135

Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Ser Gly Arg Gln Gln

140 145 150

Val Thr Leu Ala Asp Met Thr Leu Glu Asp Phe Leu Val Lys Ala

155 160 165

Gly Val Val Arg Gly Ala Phe Ala Gly His Gly His Ala Val Val

170 175 180

Gly Met Ala Pro Ile Pro Ala Gly Arg Met Gly Ile Gln Gln Gln

185 190 195

His Ala Ala Pro Thr Met Ser Tyr Gln Val Ala Ala Pro Ala Pro

200 205 210

Asn Ala Val Tyr Pro Val Met Gly Asn Gly Thr Gly Tyr His Asn

215 220 225

Gly Tyr Pro Arg Ala Ile Ala Val Val Pro Pro Ser Gln Cys Val

230 235 240

Thr Ala Ala Val Ser Pro Gly Ser Ser Asp Gly Val Ser Ala Met

245 250 255

Thr Gln Ala Glu Met Met Ser Cys Ile Gly Asn Glu Gly Ala Gly

260 265 270

Thr Val Arg Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Arg

275 280 285

Lys Arg Asp Ser Pro Glu Asp Ala Cys Thr Glu Lys Thr Val Glu

290 295 300

Arg Arg Gln Arg Arg Met Ile Lys Asn Arg Glu Ser Ala Ala Arg

305 310 315

Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Tyr Thr Val Glu Leu Glu Ala Glu

320 325 330

Leu Asn His Leu Lys Glu Glu Asn Asp Arg Leu Arg Ala Glu Gln

335 340 345

Lys Thr Ile Leu Leu Ser Lys Lys Lys Lys Leu Val Glu Lys Met

350 355 360

Val Glu Gln Ala Arg Glu Asn Val Ser Ala Lys Lys Gly Gly Arg

365 370 375

Gly Leu Arg Arg Ser Gly Ser Ala Met Trp

380 385

Claims

1、玉米bZIP类转录因子ABP2、ABP4、ABP9，它们的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2、4、6所示。

2、玉米bZIP类转录因子ABP2、ABP4、ABP9的编码基因ABP2、ABP4、ABP9，其碱基序列分别如SEQ ID NO：1、3、5所示。

3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述玉米bZIP类转录因子ABP2、ABP4、ABP9的编码基因ABP2、ABP4、ABP9的读码框分别为自SEQ IDNO：1的5’端第114位到第1056位碱基、自SEQ ID NO：3的5’端第93位到第1175位碱基、自SEQ ID NO：5的5’端第45位到第1202位碱基的DNA序列。

4、含有权利要求2所述基因的表达载体。

5、根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为pBI121-ABP9。

6、含有权利要求2所述基因的细胞系。

7、权利要求2所述基因在培育抗非生物逆境植物品种中的应用。

8、根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述非生物逆境为寒害、旱害和盐害。