CN100344759C

CN100344759C - 小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA序列

Info

Publication number: CN100344759C
Application number: CNB2005100159536A
Authority: CN
Inventors: 王振英; 孔照胜; 王少峡; 薛志娟; 彭永康
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin Normal University
Priority date: 2005-11-08
Filing date: 2005-11-08
Publication date: 2007-10-24
Anticipated expiration: 2025-11-08
Also published as: CN1793363A

Abstract

本发明公开了小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA序列，属于农业生物基因工程领域。该基因用小麦基因组DNA及同源克隆的方法获得，属于小麦中脱水应答因子CBF4家族中的一个新成员。该基因cDNA序列全长936bp，有一个长130bp的5’UTR和长89bp的3’UTR以及长717bp的开放阅读框，其编码框为第131-847位核苷酸，编码一个长238aa多肽链。该发明利用农杆菌介导的基因转化法，将克隆到的基因编码序列构建到植物表达载体pROKⅡ中，并转化到拟南芥，转化了该基因的拟南芥抗盐性和抗寒性明显提高。本发明从克隆转录因子基因入手，进而实行转基因研究，为提高小麦抗逆性提供了有效的方法和途径。

Description

小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA序列

技术领域：

本发明属于农业生物基因工程领域，涉及栽培小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA编码序列。

技术背景：

DREB(Dehydration Responsive Element Binding)基因元件的发现是近年来植物抗逆研究方面最具突破性的进展。Liu Qiang等(Plant Cell，1998，10：1391~1406)从拟南芥中分离到5个AP2/EREBP类转录因子基因，分属两个亚家族，分别命名为DREB1A、DREB1B、DREB1C和DREB2A、DREB2B。后来发现与Stockinger等(1997)分离到的CBF(C-repeat/DRE-Binding Factor)家族有对应关系，DREB1A即是CBF3，DREB1B即是CBF1，DREB1C即是CBF2。有证据表明CBF1，CBF2，CFB3作为一个基因簇位于拟南芥的第IV号染色体上，CBF2和CBF3分别存在于CBF1基因上游的3Kb和7Kb处。比较CBF1，CBF2，CBF3的核苷酸序列时，可以发现它们的阅读框(ORF)中没有内含子插入(Joaquin Medina等，1999)。我们使用BLAST程序在Genbank数据库中搜索到的目前已知的所有DREB转录因子家族成员，发现与抗逆特性相关的转录因子的研究，主要集中在拟南芥、大麦、黑麦、水稻、油菜等植物上，对小麦转录因子基因的研究则很少，尤其尚未见对小麦DREB家族成员研究的报道。

植物对非生物胁迫逆境抗性性状是一种数量性状，是由多种基因控制的综合反应，通过单基因改良的方式很难提高植物的抗逆性，尤其对基因组来源复杂的栽培小麦的抗逆性研究更为困难。由于一个DREB转录因子可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐受性有关的功能基因的表达，从而提高植物对环境胁迫的整体抗性，因此对小麦的抗逆性研究，从克隆转录因子基因入手，进而实行转基因研究，是提高小麦抗逆性更为有效的方法和途径。

发明内容：

一种小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA序列，属于小麦CBF4基因家族的一个成员，cDNA全长936bp；该基因有一个长130bp的5’UTR和长89bp的3’UTR以及长717bp的开放阅读框，其编码框为第131-847位核苷酸，编码一个长238aa多肽链。该基因的全长cDNA序列为：

5’TGAGCACCGGGGACCCTACATGGGACTGAAGGGGTAGGGAAAAAACACCATCGTTC

AAGGTGCTCAACCCTCTTCACTAGCTTTCGAATCAGATGGACGTCGCCGACGCTGCCT

CCAAGTCCCGGCCAGC

AGCAGGGTCACAGGACGGTGTCGTGGGATCCCCCAAAG

CGGCCGGCGGGGCGGACCAAGTTCCACGAGACGCGCCACCCGCTGTACCGGGGCGTT

CGGCGCCGTGGCCGGGTCGGGCAGTGGGTGTGCGAGGTGCGCGTGCGCGGCACCAAT

GAGACAAGGCTCTGGCTCGGCACCTTCCACACCGCCGAGATGGCGGCGCGAGCGCAC

GACTCCGCCTCGCTCGCTCTCTCCGGAAGCGCCGCCTGCCTCAACTTCGCCGACTCCG

CATGGCGGATGCTGCCCGTGCTTGCGGCCGGATCGTTCGGCTTCGGCAGCGCGCGGGA

GATCAAGCTTGCCGTCGCCGTTGCCGTCGTTGCGTTCCAGCAGCAGCAGATTATTCTTC

CAGTCGCGTGTCCAACGGTGGAGGCGGCCGCCAGCCCGAGCAACTCTCTGTTTTACAT

GTCGTCCGTCGACTTGCTGGAGCTCGACGAGGAGCAGTGGTTTGGCGGCATGGACGC

TGGGTCGTACTACGAGAGCTTGGCGCAGGGGATGCTCGTGGCGCCGCCGGACGACAG

AGCGAGGCGGGAGGACGCCGAGCAGACCGGCGTCGAGACACCGACGCCGTTATGGA

GCTATTTGTTTGACTAATTCAGCACGCAGTGTAAAGTTGTCGATAGTTGCGTTGTGTTCT

TCCCAATTTGGGAACGAACAGAGTAGGCAGTTTTTTTTT

AGGTTGTAGTAGGCAG

TTTGAAGTTCCCGGTTTCTACTTTTGTGAGAAATGGACCCTAGATTGCTTATCGCAAAA

AAAAAAAAAAAAAA3’(SEQ ID NO.1)

需要说明的是：

以上序列中的阴影部分，分别为基因的起始密码子和终止密码子，下画线部分为编码区；

717bp长的基因编码区，编码一个长238aa多肽链，多肽链的氨基酸序列为：MSRVTGRCRGIPQSGRRGGPSSTRRATRCTGAFGAVAGSGSGCARCACAAPMRQGSGSAPSTPPRWRRERTTPPRSLSPEAPPASTSPTPHGGCCPCLRPDRSASAARGRSSLPSPLPSLRSSSSRLFFQSRVQRWRRPPARATPSTCWSSTRSSGLAALCFTCRWTLGRTTRAWRRGCSWRRRTTERGGRTPSRPASRHRRRYGAICLTNSARSVKLSIVALCSSQFGNEQSRQFFF(SEQ ID NO.2)

小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA序列在改善抗逆特性方面的应用，利用农杆菌介导的基因转化法将克隆到的基因编码序列构建到植物表达载体pROKII中，并转化到拟南芥，该基因明显改善了拟南芥的抗盐性和抗寒性。

其具体制备方法如下：

有文献报道(Joaquin Medina，1999)，DREB基因中不含内含子。本发明根据已发表的黑麦DREB基因的保守序列设计相互重叠的两对引物，利用同源克隆的方法，以小麦基因组DNA为模板，经PCR扩增，首先获得292bp(Wheat Jing411292bp，WtJ₂₉₂)和161bp(Wheat Jing411 161bp，WtJ₁₆₁)两片段，克隆并测序，BLASTn比对后发现WtJ₂₉₂与一个大麦DREB基因有90％的同源性。WtJ₁₆₁与一个大麦DREB基因有85％的同源性。将两片段拼接(Wheat Jing411 426bp，WtJ₄₂₆)，再根据该拼接片段序列设计引物，以4℃冷胁迫2小时的小麦黄化苗总体RNA为模板，做cDNA3’末端和5’末端快速扩增，获得了该基因的3’端和5’端，该基因全长cDNA长936bp。BLASTn和BLASTx综合分析，发现该基因与大麦、小麦、水稻、黑麦以及拟南芥等多个CBF基因的同源性均在百分之八十以上，同源性最高的为大麦的CBF4D基因，核苷酸(AY785852.1)同源性为89％，氨基酸(AAX23696.1)的同源性为83％。另外还与大麦CBF4A：核苷酸(AY785849.1)同源性为88％，氨基酸(AAX28949.1)的同源性为82％；大麦CBF4B核苷酸(AY785848.1)同源性为88％，氨基酸(AAX28950.1)同源性为82％；与小麦的CBF9(AY785905.1)同源性虽为88％，但氨基酸(AAX28966.1)的同源性较低，为61％。因此，本发明所获得的基因系小麦中脱水应答因子CBF4家族中的一个新成员。为了验证该基因的功能，我们利用农杆菌介导的基因转化法将该基因的编码序列构建到植物表达载体pROK II并转化拟南芥，发现该基因明显改善了拟南芥的抗盐性和抗寒性。

有益效果：

由于一个DREB转录因子可以调控多个与植物干旱、高盐及低温耐受性有关的功能基因的表达，从而提高植物整体的抗性。我们将克隆到的基因编码序列构建到植物表达载体pROK II中，转化到拟南芥，发现拟南芥的抗逆特性明显改善，转基因的拟南芥可以在1.5％的NaCl(W/V)中正常生长，而非转基因的拟南芥在1.5％的NaCl(W/V)中生长明显受抑，并很快萎蔫，3天根部开始变褐、变硬、易断，7天出现死苗；转基因的拟南芥在4℃冷胁迫下正常生长，而非转基因的拟南芥在4℃冷胁迫下生长缓慢。转化了该基因的拟南芥抗盐性和抗寒特性明显提高。

附图说明：

图1：本发明的小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA序列；

图2：本发明的小麦脱水应答转录因子DREB基因编码的氨基酸序列；

图3本发明的小麦脱水应答转录因子基因与大麦CBF4D基因的比对；

图4本发明的小麦脱水应答转录因子基因与大麦CBF4A基因的比对；

图5本发明的小麦脱水应答转录因子基因与大麦CBF4B基因的比对。

具体实施方式：

实施例1：

(一)植物材料及处理：

栽培小麦京411种子经10％安替福民消毒、去离子水浸泡处理后于23℃避光培养6～10天收获叶片用于DNA提取。冷处理样品小麦幼苗提取RNA之前置于4℃冷胁迫2小时。

(二)小麦京411基因组DNA的提取

取0.2g黄化苗于液氮中研磨至粉末状；加入2mlDNA提取缓冲液(500mM NaCl、100mMTris·HCl、50mM EDTA)，65℃水浴15分钟，冰浴10分钟，3,000rpm 4℃离心15分钟，除组织块；取上清，加等体积酚3,000rpm 4℃离心10分钟；取上清，加等体积酚仿3,000rpm 4℃离心10分；取上清，加等体积仿3,000rpm 4℃离心10分钟；取上清，加2倍体积冷无水乙醇-20℃沉淀2小时以上；12,000rpm 4℃离心20分钟，使DNA完全沉淀；弃上清，75％乙醇洗沉淀2～3次，除Tris和EDTA中的盐；晾干，溶于100μl TE(50mM EDTA、100mM Tris·HCl)溶液；加1μl 1mg/ml RNase，37℃水浴保温1小时；加等体积酚仿，3,000rpm 4℃离心10分钟；取上清，加等体积仿3,000rpm 4℃离心10分钟；取上清，加2倍冷无水乙醇-20℃沉淀过夜；12,000rpm4℃离心5分钟，使DNA沉淀；75％乙醇洗沉淀2次，晾干，视样品的多少溶于20～50μl TE中；用紫外分光光度法检测DNA样品的浓度及纯度，并用0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。

实施例2：

(一)小麦京411 DREB基因片段(WtJ₂₉₂)的PCR扩增

1、WtJ₂₉₂片段的PCR扩增

1)引物的设计

在GenBank上查询到已发表的黑麦的三个DREB基因序列(gi|17148646，gi|17148648，gi|17148650)，并进行多序列对比，利用引物设计软件Primer 5.0在保守序列中查找并合成(以下所有引物均委托上海生工合成)引物如下：

Forward1：5’TGC CTC AAC TTC GCC GAC TCC3’(SEQ ID NO.3)

Reverse1：5’CGA GCA TCC CCT GCG CCA AG3’(SEQ ID NO.4)

2)PCR扩增反应体系：10×Buffer 2.5μl，MgCl₂(25mM)1.5μl，dNTP(10mM)0.5μl，Forward1(10μM)0.25μl，Reverse1(10μM)0.25μl，DNA Template 100ng，Taq(5U/μl)0.25μl，ddH₂O补齐到25μl。PCR参数：95℃预变性2分钟；95℃变性1分钟，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环；再72℃延伸7分钟。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳检测扩增片段的大小。用低熔点琼脂糖凝胶纯化回收PCR产物用于克隆。

3)扩增片段的克隆

主要参阅pGEM-T easy Vector System(Promega公司)说明书：按下列顺序在冰上加入以下成分，建立连接反应：2×Buffer 5μl，pGEM-T easy vector(50mg/ml)1μl，加A尾的PCR产物2μl，T4连接酶(3U/μl)1μl，无菌双蒸H₂O补齐10μl；轻轻吹吸混匀，4℃连接过夜。将连接产物2μl转化到100μl感受态细胞DH5α中，筛选出阳性克隆子，委托上海生工生物工程公司测序。

4)测序

WtJ₂₉₂序列：

5’CGAGCATCCCCTGCGCCAAGCTCTCGTAGTACGACCCAGCGTCCATGCCGCCAAACC

ACTGCTCCTCGTCGAGCTCCAGCAAGTCGACGGACGACATGTAAAACAGAGAGTTGC

TCGGGCTGGCGGCCGCCTCCACCGTTGGACACGCGACTGGAAGAATAATCTGCTGCTG

CTGGAACGCAACGACGGCAACGGCGACGGCAAGCTTGATCTCCCGCGCGCTGCCGAA

GCCGAACGATCCGGCCGCAAGCACGGGCAGCATCCGCCATGCGGAGTCGGCGAAGTT

GAGGCA 3’(SEQ IDNO.5)

(二)小麦京411 DREB基因片段(WtJ₁₆₁)的PCR扩增

1、WtJ₁₆₁片段的PCR扩增

1)引物设计

在GenBank上查询到已发表的三个黑麦DREB基因序列(gi|17148646，gi|17148648，gi|17148650)，并进行多序列对比，利用引物设计软件Primer 5.0在保守序列中查找并合成引物如下：

Forward2：5’TCG GGC AGT GGG TGT GCG AGG3’(SEQ ID NO.6)

Reverse2：5’CCA GGC GGA GTC GGC GAA GTT3’(SEQ ID NO.7)

2)PCR扩增反应、WtJ₁₆₁片段的PCR产物纯化回收、克隆、测序同WtJ₂₉₂以下为WtJ₁₆₁序列：

5’TCGGGCAGTGGGTGTGCGAGGTGCGCGTGCGCGGCACCAATGAGACAAGGCTCTGG

CTCGGCACCTTCCACACCGCCGAGATGGCGGCGCGAGCGCACGACTCCGCCTCGCTC

GCTCTCTCCGGAAGCGCCGCCTGCCTCAACTTCGCCGACTCCGCCTGG3’(SEQ ID

NO.8)

(三)WtJ₄₂₆拼接：由于Forward1/Reverse1与Forward2/Reverse2在引物设计时是相互重叠的，所以可以将WtJ₂₉₂和WtJ₁₆₁两片段拼接在一起，为WtJ₄₂₆：

5’TCGGGCAGTGGGTGTGCGAGGTGCGCGTGCGCGGCACCAATGAGACAAGGCTCTGGCT

CGGCACCTTCCACACCGCCGAGATGGCGGCGCGAGCGCACGACTCCGCCTCGCTCGCTCT

CTCCGGAAGCGCCGCCTGCCTCAACTTCGCCGACTCCGCCTGGCGGATGCTGCCCGTGCT

TGCGGCCGGATCGTTCGGCTTCGGCAGCGCGCGGGAGATCAAGCTTGCCGTCGCCGTTGC

CGTCGTTGCGTTCCAGCAGCAGCAGATTATTCTTCCAGTCGCGTGTCCAACGGTGGAGGCG

GCCGCCAGCCCGAGCAACTCTCTGTTTTACATGTCGTCCGTCGACTTGCTGGAGCTCGACG

AGGAGCAGTGGTTTGGCGGCATGGACGCTGGGTCGTACTACGAGAGCTTGGCGCAGGGGA

TGCTCG3’(SEQ ID NO.9)

实施例3：小麦总体RNA的提取

采取酸性异硫氰酸胍法提取小麦总体RNA：称取0.2克小麦黄化幼苗，灭菌双蒸水洗干净，灭菌滤纸吸干，剪碎入预冷过的研钵；加液氮研磨至粉末状，加入2ml的SolutionD，与粉末研至澄清；(以下各步在冰上操作)倒入7ml离心管中，加入200μl 2mol/L的NaAC(PH4.0)颠倒数次混匀置冰上；加入等体积的水饱和酚，用力振荡混匀；加入400μl氯仿-异戊醇(49∶1)，用力振荡混匀；冰浴30分钟，期间颠倒数次，以不出现分层为宜；11,000rpm 4℃离心15分钟；取上清，加入等体积的酚仿，再抽提一次，11,000rpm 4℃离心15分钟；取上清，加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀1小时以上；12,000rpm 4℃离心15分钟，弃上清；75％乙醇洗2次，除去盐类和其他杂质，离心弃上清，每次12,000rpm 4℃离心8分钟；自然干燥10分钟，加入40μl的DEPC处理过的灭菌ddH₂O。4℃保存备用；用紫外分光光度法检测RNA样品的浓度及纯度，并用1％的变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

实施例4：WtJ₄₂₆ 3’末端的快速扩增

1、引物设计：根据为WtJ₄₂₆测序结果并利用专业引物设计软件Primer 5.0设计引物如下：

3RACE-RT：5’CCA CGC GTC GAC TAG TAC TTT TTT TTT TTT TTT TT3’(SEQ ID NO.10)

3RACEF1：5’GCT CCA GAA GCA GCA GAT 3’(SEQ ID NO.11)

3RACER：5’CCA CGC GTC GAC TAG TAC 3’(SEQ ID NO.12)

3RACEF2：5’TCC AGA AGC AGC AGA TTA TT3’(SEQ ID NO.13)

2、反转录：取小麦总体RNA 1μg至无RNA酶的PCR小管中，65℃水浴2分钟后，放到冰上。加入以下组分：5×AMV buffer 2.5μl，dNTP(10mM)0.5μl，3RACE-RT(50μM)1μl，RNASIN(40U/μl)0.5μl，AMV反转录酶(5U/μl)1μl，Nuclease-FreeWater补齐20μl。混匀离心，室温放置10分钟，42℃保温1小时，70℃保温15分钟。反转录产物经1％琼脂糖电泳检测cDNA片段的质量后，放入-20℃冰箱冻存备用。

3、3’RACE产物PCR：反应体系：10×Buffer 2.5μl，MgCl₂(25mM)1.5μl，dNTP(10mM)0.5μl，3RACEF1(10μM)0.25μl，3’RACER(10μM)0.25μl，反转录产物1μl，Taq(5U/μl)0.25μl，ddH₂O补齐25μl。

PCR参数：95℃预变性2分钟；95℃变性1分钟，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环后，72℃延伸7分钟。3’RACE一次PCR产物稀释100倍后作为模板进行巢式二次PCR。

4、3’RACE巢式PCR：反应体系：10×Buffer 2.5μl，MgCl₂(25mM)1.5μl，dNTP(10mM)0.5μl，3RACEF2(10μM)0.25μl，3RACER(10μM)0.25μl，稀释产物1μl，Taq(5U/μl)0.25μl，ddH₂O补齐25μl。

PCR参数：95℃预变性2分钟；95℃变性1分钟，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环后，72℃延伸7分钟。

PCR产物经1.5％琼脂糖电泳检测扩增片段的大小，并纯化回收后进行克隆测序，3’RACE序列为：

TCCAGAAGCAGCAGATTATTCTTCCAGTCGCGTGTCCAACGGTGGAGGCGGCCGCCAGC

CCGAGCAACTCTCTGTTTTACATGTCGTCCGTCGACTTGCTGGAGCTCGACGAGGAGCA

GTGGTTTGGCGGCATGGACGCTGGGTCGTACTACGAGAGCTTGGCGCAGGGGATGCTCA

TGGCGCCGCCGGACGACAGAGCGAGGCGGGAGGACGCCGAGCAGACCGGCGTCGAGA

CACCGACGCCGTTATGGAGCTATTTGTTTGACTAATTCAGCACGCAGTGTAAAGTTGTCG

ATAGTTGCGTTGTGTTCTTCCCAATTTGGGAACGAACAGAGTAGGCAGTTTTTTTTTTGA

AGGTTGTAGTAGGCAGTTTGAAGTTCCCGGTTTCTACTTTTGTGAGAAATGGACCCTAGA

TTGCTTATCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTACTAGTCGACGCGTG(SEQ ID NO.14)

实施例5：WtJ₄₂₆片段的5’末端快速扩增

主要参阅5’-Full RACE Core Set试剂盒(TaKaRa公司)说明书。

1、引物的设计

根据WtJ₄₂₆测序结果并利用专业引物设计软件Primer 5.0设计引物如下：

5RACEF：5’CAT GCG GAG TCG GCGAAG T 3’(SEQ ID NO.15)

5RACER：5’GAC GAG GAG CAG TGG TTT GG3’(SEQ ID NO.16)

5RACERT：5’p GAG CAT CCC CTG CGC 3’(SEQ ID NO.17)

2、第一链cDNA的合成、Hybrid RNA的分解、单链cDNA环化严格按照试剂盒说明进行。

PCR扩增反应体系：10×Buffer 2.5μl，MgCl₂(25mM)1.5μl，dNTP(10mM)0.5μl，5RACEF(10μM)0.25μl，5RACER(10μM)0.25μl，连接反应产物1μl，Taq(5U/μl)0.25μl，ddH₂O补齐25μl。PCR参数：95℃预变性2分钟；95℃变性1分钟，60℃退火30秒，72℃延伸45秒，30个循环，72℃延伸7分钟。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳检测扩增片段的大小，并纯化回收后进行克隆测序。5’RACE测序结果为：

5’TGAGCACCGGGGACCCTACATGGGACTGAAGGGGTAGGGAAAAAACAC

CATCGTTCAAGGTGCTCAACCCTCTTCACTAGCTTTCGAATCAGATGGACG

TCGCCGACGCTGCCTCCAAGTCCCGGCCAGCATGAGCAGGGTCACAGGAC

GGTGTCGTGGGATCCCCCAAAGCGGCCGGCGGGGCGGACCAAGTTCCACG

AGACGCGCCACCCGCTGTACCGGGGCGTTCGGCGCCGTGGCCGGG3’(SEQ

ID NO.18)

用NCBI(www.ncbi.nlm.nig.gov)的Align two sequences对WtJ₄₂₆及其5’RACE、3’RACE获得的序列进行拼接，获得该基因的全长序列，共936bp，命名为WtJ₉₃₆。

5’TGAGCACCGGGGACCCTACATGGGACTGAAGGGGTAGGGAAAAAACACCATCGTTC

AAGGTGCTCAACCCTCTTCACTAGCTTTCGAATCAGATGGACGTCGCCGACGCTGCCT

CCAAGTCCCGGCCAGC

AGCAGGGTCACAGGACGGTGTCGTGGGATCCCCCAAAG

CGGCCGGCGGGGCGGACCAAGTTCCACGAGACGCGCCACCCGCTGTACCGGGGCGTT

CGGCGCCGTGGCCGGGTCGGGCAGTGGGTGTGCGAGGTGCGCGTGCGCGGCACCAAT

GAGACAAGGCTCTGGCTCGGCACCTTCCACACCGCCGAGATGGCGGCGCGAGCGCAC

GACTCCGCCTCGCTCGCTCTCTCCGGAAGCGCCGCCTGCCTCAACTTCGCCGACTCCG

CATGGCGGATGCTGCCCGTGCTTGCGGCCGGATCGTTCGGCTTCGGCAGCGCGCGGGA

GATCAAGCTTGCCGTCGCCGTTGCCGTCGTTGCGTTCCAGCAGCAGCAGATTATTCTTC

CAGTCGCGTGTCCAACGGTGGAGGCGGCCGCCAGCCCGAGCAACTCTCTGTTTTACAT

GTCGTCCGTCGACTTGCTGGAGCTCGACGAGGAGCAGTGGTTTGGCGGCATGGACGC

TGGGTCGTACTACGAGAGCTTGGCGCAGGGGATGCTCGTGGCGCCGCCGGACGACAG

AGCGAGGCGGGAGGACGCCGAGCAGACCGGCGTCGAGACACCGACGCCGTTATGGA

GCTATTTGTTTGACTAATTCAGCACGCAGTGTAAAGTTGTCGATAGTTGCGTTGTGTTCT

TCCCAATTTGGGAACGAACAGAGTAGGCAGTTTTTTTTT

AGGTTGTAGTAGGCAG

TTTGAAGTTCCCGGTTTCTACTTTTGTGAGAAATGGACCCTAGATTGCTTATCGCAAAA

AAAAAAAAAAAAAA3’(SEQ ID NO.1或图1)

(注：阴影部分分别为基因的起始密码子和终止密码子，下画线部分为编码区)

将该全长基因序列进行tBLASTx分析后发现，该基因有一个长130bp的5’UTR和长89bp的3’UTR以及长717bp的开放阅读框，其编码框为第131-847个核苷酸，编码一个长238aa多肽链。

Frame

MSRVTGRCRGIPQSGRRGGPSSTRRATRCTGAFGAVAGSGSGCARCACAAPMRQGSGSA

PSTPPRWRRERTTPPRSLSPEAPPASTSPTPHGGCCPCLRPDRSASAARGRSSLPSPLPSLRS

SSSRLFFQSRVQRWRRPPARATPSTCWSSTRSSGLAALCFTCRWTLGRTTRAWRRGCSW

RRRTTERGGRTPSRPASRHRRRYGAICLTNSARSVKLSIVALCSSQFGNEQSRQFFF(SEQ

ID NO.2或图2)

BLASTn和BLASTx综合分析，发现该基因与大麦、小麦、水稻、黑麦以及拟南芥等多个CBF基因的同源性均在百分之八十以上，同源性最高的为大麦的CBF4D基因，核苷酸(AY785852.1)同源性为89％(图3)，氨基酸(AAX23696.1)的同源性为83％。另外还与大麦CBF4A：核苷酸(AY785849.1)同源性为88％(图4)，氨基酸(AAX28949.1)的同源性为82％；大麦CBF4B核苷酸(AY785848.1)同源性为88％(图5)，氨基酸(AAX28950.1)同源性为82％；与小麦的CBF9(AY785905.1)同源性虽为88％，但氨基酸(AAX28966.1)的同源性较低，为61％。因此，本发明所获得的基因系小麦中脱水应答因子CBF4家族中的一个新成员。

实施例6：基因功能分析

为了验证该基因的功能，我们首先根据WtJ₉₃₆的编码区域设计引物扩增该基因的编码区，然后将该编码区构建到植物表达载体pROKII中，利用农杆菌介导的基因转化法将该基因的编码序列转化拟南芥，发现该基因明显改善了拟南芥的抗盐性和抗寒性。具体方法为：

根据WtJ₉₃₆序列设计用于扩增编码区序列的引物为：

Forward 5’ATGAGCAGGGTCACAGGACGGTGTC3’(SEQ ID NO.19)

Reverse 5’TCAAAAAAAAAACTGCCTACT3’(SEQ ID NO.20)

以小麦总体DNA为模板，进行基因编码区的扩增，反应体系为：10×Buffer2.5μl，MgCl₂(25mM)1.5μl，dNTP(10mM)0.5μl，Forward(10μM)0.25μl，Reverse(10μM)0.25μl，DNA Template 100ng，Taq(5U/μl)0.25μl，ddH₂O补齐到25μl。PCR参数：95℃预变性2分钟；95℃变性1分钟，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环；再72℃延伸7分钟。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳检测扩增片段的大小。用低熔点琼脂糖凝胶纯化回收PCR产物，用于表达载体的构建。

我们将扩增到的基因编码区构建到植物表达载体pROK II中，利用农杆菌介导的基因转化法转化拟南芥，分别在高盐和低温胁迫下，比较分析转基因拟南芥和非转基因拟南芥的生长情况，发现转基因拟南芥的抗逆特性明显改善：转基因的拟南芥可以在1.5％的NaCl(W/V)中正常生长，而非转基因的拟南芥在1.5％的NaCl(W/V)中生长明显受抑，并很快萎蔫，3天根部开始变褐、变硬、易断，7天出现死苗；转基因的拟南芥在4℃冷胁迫下正常生长，而非转基因的拟南芥在4℃冷胁迫下生长缓慢。转化了该基因的拟南芥抗盐性和抗寒特性明显提高。

SEQUENCE LISTING

<110>天津师范大学

<120>小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA序列

<130>0510

<160>20

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>936

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>5′UTR

<222>(1)..(130)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(131)..(847)

<223>

<220>

<221>3′UTR

<222>(848)..(936)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(1).(936)

<223>

<400>1

tga gca ccg ggg acc cta cat ggg act gaa ggg gta ggg aaa aaa cac

48

Ala Pro Gly Thr Leu His Gly Thr Glu Gly Val Gly Lys Lys His

1 5 10 15

cat cgt tca agg tgc tca acc ctc ttc act agc ttt cga atc aga tgg

96

His Arg Ser Arg Cys Ser Thr Leu Phe Thr Ser Phe Arg Ile Arg Trp

20 25 30

acg tcg ccg acg ctg cct cca agt ccc ggc cag cat gag cag ggt cac

144

Thr Ser Pro Thr Leu Pro Pro Ser Pro Gly Gln His Glu Gln Gly His

35 40 45

agg acg gtg tcg tgg gat ccc cca aag cgg ccg gcg ggg cgg acc aag

192

Arg Thr Val Ser Trp Asp Pro Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys

50 55 60

ttc cac gag acg cgc cac ccg ctg tac cgg ggc gtt cgg cgc cgt ggc

240

Phe His Glu Thr Arg His Pro Leu Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly

65 70 75

cgg gtc ggg cag tgg gtg tgc gag gtg cgc gtg cgc ggc acc aat gag

288

Arg Val Gly Gln Trp Val Cys Glu Val Arg Val Arg Gly Thr Asn Glu

80 85 90 95

aca agg ctc tgg ctc ggc acc ttc cac acc gcc gag atg gcg gcg cga

336

Thr Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe His Thr Ala Glu Met Ala Ala Arg

100 105 110

gcg cac gac tcc gcc tcg ctc gct ctc tcc gga agc gcc gcc tgc ctc

384

Ala His Asp Ser Ala Ser Leu Ala Leu Ser Gly Ser Ala Ala Cys Leu

115 120 125

aac ttc gcc gac tcc gca tgg cgg atg ctg ccc gtg ctt gcg gcc gga

432

Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg Met Leu Pro Val Leu Ala Ala Gly

130 135 140

tcg ttc ggc ttc ggc agc gcg cgg gag atc aag ctt gcc gtc gcc gtt

480

Ser Phe Gly Phe Gly Ser Ala Arg Glu Ile Lys Leu Ala Val Ala Val

145 150 155

gcc gtc gtt gcg ttc cag cag cag cag att att ctt cca gtc gcg tgt

528

Ala Val Val Ala Phe Gln Gln Gln Gln Ile Ile Leu Pro Val Ala Cys

160 165 170 175

cca acg gtg gag gcg gcc gcc agc ccg agc aac tct ctg ttt tac atg

576

Pro Thr Val Glu Ala Ala Ala Ser Pro Ser Asn Ser Leu Phe Tyr Met

180 185 190

tcg tcc gtc gac ttg ctg gag ctc gac gag gag cag tgg ttt ggc ggc

624

Ser Ser Val Asp Leu Leu Glu Leu Asp Glu Glu Gln Trp Phe Gly Gly

195 200 205

atg gac gct ggg tcg tac tac gag agc ttg gcg cag ggg atg ctc gtg

672

Met Asp Ala Gly Ser Tyr Tyr Glu Ser Leu Ala Gln Gly Met Leu Val

210 215 220

gcg ccg ccg gac gac aga gcg agg cgg gag gac gcc gag cag acc ggc

720

Ala Pro Pro Asp Asp Arg Ala Arg Arg Glu Asp Ala Glu Gln Thr Gly

225 230 235

gtc gag aca ccg acg ccg tta tgg agc tat ttg ttt gac taa ttc agc

768

Val Glu Thr Pro Thr Pro Leu Trp Ser Tyr Leu Phe Asp Phe Ser

240 245 250

acg cag tgt aaa gtt gtc gat agt tgc gtt gtg ttc ttc cca att tgg

816

Thr Gln Cys Lys Val Val Asp Ser Cys Val Val Phe Phe Pro Ile Trp

255 260 265 270

gaa cga aca gag tag gca gtt ttt ttt ttg aag gtt gta gta ggc agt

864

Glu Arg Thr Glu Ala Val Phe Phe Leu Lys Val Val Val Gly Ser

275 280 285

ttg aag ttc ccg gtt tct act ttt gtg aga aat gga ccc tag att gct

912

Leu Lys Phe Pro Val Ser Thr Phe Val Arg Asn Gly Pro Ile Ala

290 295 300

tat cgc aaa aaa aaa aaa aaa aaa

936

Tyr Arg Lys Lys Lys Lys Lys Lys

305

<210>2

<211>238

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>CHAIN

<222>(1)..(238)

<223>

<400>2

Met Ser Arg Val Thr Gly Arg Cys Arg Gly Ile Pro Gln Ser Gly Arg

1 5 10 15

Arg Gly Gly Pro Ser Ser Thr Arg Arg Ala Thr Arg Cys Thr Gly Ala

20 25 30

Phe Gly Ala Val Ala Gly Ser Gly Ser Gly Cys Ala Arg Cys Ala Cys

35 40 45

Ala Ala Pro Met Arg Gln Gly Ser Gly Ser Ala Pro Ser Thr Pro Pro

50 55 60

Arg Trp Arg Arg Glu Arg Thr Thr Pro Pro Arg Ser Leu Ser Pro Glu

65 70 75 80

Ala Pro Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Pro His Gly Gly Cys Cys Pro

85 90 95

Cys Leu Arg Pro Asp Arg Ser Ala Ser Ala Ala Arg Gly Arg Ser Ser

100 105 110

Leu Pro Ser Pro Leu Pro Ser Leu Arg Ser Ser Ser Ser Arg Leu Phe

115 120 125

Phe Gln Ser Arg Val Gln Arg Trp Arg Arg Pro Pro Ala Arg Ala Thr

130 135 140

Pro Ser Thr Cys Trp Ser Ser Thr Arg Ser Ser Gly Leu Ala Ala Leu

145 150 155 160

Cys Phe Thr Cys Arg Trp Thr Leu Gly Arg Thr Thr Arg Ala Trp Arg

165 170 175

Arg Gly Cys Ser Trp Arg Arg Arg Thr Thr Glu Arg Gly Gly Arg Thr

180 185 190

Pro Ser Arg Pro Ala Ser Arg His Arg Arg Arg Tyr Gly Ala Ile Cys

195 200 205

Leu Thr Asn Ser Ala Arg Ser Val Lys Leu Ser Ile Val Ala Leu Cys

210 215 220

Ser Ser Gln Phe Gly Asn Glu Gln Ser Arg Gln Phe Phe Phe

225 230 235

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tgcctcaact tcgccgactc c 21

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cgagcatccc ctgcgccaag 20

<210>5

<211>292

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cgagcatccc ctgcgccaag ctctcgtagt acgacccagc gtccatgccg ccaaaccact

60

gctcctcgtc gagctccagc aagtcgacgg acgacatgta aaacagagag ttgctcgggc

120

tggcggccgc ctccaccgtt ggacacgcga ctggaagaat aatctgctgc tgctggaacg

180

caacgacggc aacggcgacg gcaagcttga tctcccgcgc gctgccgaag ccgaacgatc

240

cggccgcaag cacgggcagc atccgccatg cggagtcggc gaagttgagg ca

292

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

tcgggcagtg ggtgtgcgag g

21

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ccaggcggag tcggcgaagt t 21

<210>8

<211>161

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

tcgggcagtg ggtgtgcgag gtgcgcgtgc gcggcaccaa tgagacaagg ctctggctcg

60

gcaccttcca caccgccgag atggcggcgc gagcgcacga ctccgcctcg ctcgctctct

120

ccggaagcgc cgcctgcctc aacttcgccg actccgcctg g

161

<210>9

<211>426

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

tcgggcagtg ggtgtgcgag gtgcgcgtgc gcggcaccaa tgagacaagg ctctggctcg

60

gcaccttcca caccgccgag atggcggcgc gagcgcacga ctccgcctcg ctcgctctct

120

ccggaagcgc cgcctgcctc aacttcgccg actccgcctg gcggatgctg cccgtgcttg

180

cggccggatc gttcggcttc ggcagcgcgc gggagatcaa gcttgccgtc gccgttgccg

240

tcgttgcgtt ccagcagcag cagattattc ttccagtcgc gtgtccaacg gtggaggcgg

300

ccgccagccc gagcaactct ctgttttaca tgtcgtccgt cgacttgctg gagctcgacg

360

aggagcagtg gtttggcggc atggacgctg ggtcgtacta cgagagcttg gcgcagggga

420

tgctcg

426

<210>10

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ccacgcgtcg actagtactt tttttttttt ttttt

35

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

gctccagaag cagcagat

18

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

ccacgcgtcg actagtac

18

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

tccagaagca gcagattatt

20

<210>14

<211>460

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

tccagaagca gcagattatt cttccagtcg cgtgtccaac ggtggaggcg gccgccagcc

60

cgagcaactc tctgttttac atgtcgtccg tcgacttgct ggagctcgac gaggagcagt

120

ggtttggcgg catggacgct gggtcgtact acgagagctt ggcgcagggg atgctcatgg

180

cgccgccgga cgacagagcg aggcgggagg acgccgagca gaccggcgtc gagacaccga

240

cgccgttatg gagctatttg tttgactaat tcagcacgca gtgtaaagtt gtcgatagtt

300

gcgttgtgtt cttcccaatt tgggaacgaa cagagtaggc agtttttttt ttgaaggttg

360

tagtaggcag tttgaagttc ccggtttcta cttttgtgag aaatggaccc tagattgctt

420

atcgcaaaaa aaaaaaaaaa aaagtactag tcgacgcgtg

460

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

catgcggagt cggcgaagt

19

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

gacgaggagc agtggtttgg

20

<210>17

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

gagcatcccc tgcgc

15

<210>18

<211>244

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

tgagcaccgg ggaccctaca tgggactgaa ggggtaggga aaaaacacca tcgttcaagg

60

tgctcaaccc tcttcactag ctttcgaatc agatggacgt cgccgacgct gcctccaagt

120

cccggccagc atgagcaggg tcacaggacg gtgtcgtggg atcccccaaa gcggccggcg

180

gggcggacca agttccacga gacgcgccac ccgctgtacc ggggcgttcg gcgccgtggc

240

cggg

244

<210>19

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

atgagcaggg tcacaggacg gtgtc

25

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

tcaaaaaaaa aactgcctac t

21

Claims

1、一种小麦脱水应答转录因子DREB基因cDNA，其特征在于属于小麦CBF4基因家族的一个成员，cDNA全长936bp；该基因有一个长130bp的5’UTR和长89bp的3’UTR以及长717bp的开放阅读框，编码框为第131-847位核苷酸，编码一个长238aa多肽链；DREB基因的全长cDNA序列为：

5’TGAGCACCGGGGACCCTACATGGGACTGAAGGGGTAGGGAAAAAACACCATCGTTCAAGGTGCTCAACCCTCTTCACTAGCTTTCGAATCAGATGGACGTCGCCGACGCTGCCTCCAAGTCCCGGCCAGC

AGCAGGGTCACAGGACGGTGTCGTGGGATCCCCCAAAG CGGCCGGCGGGGCGGACCAAGTTCCACGAGACGCGCCACCCGCTGTACCGGGGCGTT CGGCGCCGTGGCCGGGTCGGGCAGTGGGTGTGCGAGGTGCGCGTGCGCGGCACCAAT GAGACAAGGCTCTGGCTCGGCACCTTCCACACCGCCGAGATGGCGGCGCGAGCGCAC GACTCCGCCTCGCTCGCTCTCTCCGGAAGCGCCGCCTGCCTCAACTTCGCCGACTCCG CATGGCGGATGCTGCCCGTGCTTGCGGCCGGATCGTTCGGCTTCGGCAGCGCGCGGGA GATCAAGCTTGCCGTCGCCGTTGCCGTCGTTGCGTTCCAGCAGCAGCAGATTATTCTTC CAGTCGCGTGTCCAACGGTGGAGGCGGCCGCCAGCCCGAGCAACTCTCTGTTTTACAT GTCGTCCGTCGACTTGCTGGAGCTCGACGAGGAGCAGTGGTTTGGCGGCATGGACGC TGGGTCGTACTACGAGAGCTTGGCGCAGGGGATGCTCGTGGCGCCGCCGGACGACAG AGCGAGGCGGGAGGACGCCGAGCAGACCGGCGTCGAGACACCGACGCCGTTATGGA GCTATTTGTTTGACTAATTCAGCACGCAGTGTAAAGTTGTCGATAGTTGCGTTGTGTTCT TCCCAATTTGGGAACGAACAGAGTAGGCAGTTTTTTTTT

AGGTTGTAGTAGGCAGTTTGAAGTTCCCGGTTTCTACTTTTGTGAGAAATGGACCCTAGATTGCTTATCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAA3’；

以上序列中的阴影部分，分别为基因的起始密码子和终止密码子，下画线部分为编码区，编码多肽链的氨基酸序列为：

MSRVTGRCRGIPQSGRRGGPSSTRRATRCTGAFGAVAGSGSGCARCACAAPMRQGSGSAPSTPPRWRRERTTPPRSLSPEAPPASTSPTPHGGCCPCLRPDRSASAARGRSSLPSPLPSLRSSSSRLFFQSRVQRWRRPPARATPSTCWSSTRSSGLAALCFTCRWTLGRTTRAWRRGCSWRRRTTERGGRTPSRPASRHRRRYGAICLTNSARSVKLSIVALCSSQFGNEQSRQFFF。