CN1314809C - 编码甘蔗磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的核酸分子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用转基因技术改良C3植物的光合特性的核酸分子和方法，所述的核酸分子是编码甘蔗磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的核酸分子，所述的方法是将参与C4光合途径的酶—甘蔗磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的基因导入水稻等具有C3型光合途径的植物从而为该植物提供C4光合途径，使其具有更高的光合作用效率。还涉及用于转化C3植物的表达载体，用该方法转化的具有C4光合途径的植物组织和细胞及甘蔗PEPC基因在C3植物育种中的应用。

Description

编码甘蔗磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的核酸分子及其应用

技术领域

本发明涉及一种编码甘蔗pepc基因克隆、高效表达载体及其转化植物的方法，尤其是涉及将参与C₄光合途径的酶-甘蔗磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因导入到具有C₃型光合途径的植物从而为其提供C₄循环的方法。

背景技术

已知在高等植物中存在三种类型的光合途径，即C₃，C₄和CAM型。具有C₄型光合途径的植物(下文中有时称之为C₄植物)的叶组织含有叶肉细胞和存在于维管束周围的维管束鞘细胞，形成被称作克兰茨型解剖(Kranz-typeanatomy)的特殊的叶组织结构。C₄植物利用位于叶肉细胞胞质中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(下文中有时称之为PEPC)的作用将二氧化碳固定为C₄化合物，被固定的二氧化碳由维管束鞘细胞中的脱羧酶释放，增加了核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶附近的二氧化碳水平，所述酶是必不可少的二氧化碳固定所需的酶。通过位于叶肉细胞中的丙酮酸，正磷酸二激酶(PPDK)的作用，同时消耗ATP可将因维管束鞘细胞中的脱羧化作用产生的代谢物转移到叶肉细胞中并转化为PEPC的底物一磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。即C₄植物绿叶中两种类型的细胞在功能上有所分化；叶肉细胞是最初固定碳时C₄化合物形成的场所，也是PEPC底物重新产生的场所，而维管束鞘细胞是利用卡尔文-本森循环(Calvin-Bensoncycle)使C₄化合物脱羧和进行必要的一氧化碳固定的场所。

三个步骤构成了被称为C₄光合途径的循环反应系统，即由PEPC固定二氧化碳，在核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶附近释放二氧化碳，和消耗ATP的同时重新产生PEPC底物。所述途径使C₄植物积累二氧化碳的能力有所增强，并使光合效率不致于降低，否则，由于ATP的过量产生会使C₄植物在高光强度下的光合效率降低(避免了光抑制)。在具有规则的光合途径(C₃型光合作用)的C₃植物中未发现这些特性，因此，C₄植物未表现出如C₃植物中的光呼吸，故当置于干燥的空气，高光强度或高温下时，前者光合作用的效率比后者较不易恶化，因此C4植物在其进行光合作用的能力方面优于C₃植物。

预期利用杂交和育种可将C₄光合途径导入C₃植物。然而，具有C₄光合途径的大多数种和具有规则的C₃光合途径的种被分成不同的属或科，难以在它们之间进行杂交。另外，通过使C₃植物与选自相同属的C₄植物杂交来导入C₄植物之特性的尝试未能成功(Ohsugi，R.Nogyogijutsu(1995)vol.50，P30-36)。

1988年Tagu等(Protoplasma，1988，146(2-3)：101-105)用基因枪法将C₄植物高梁的pepc基因转入烟草，并检测到转入基因的mRNA，证明双子叶植物能够成功地表达单子叶植物的pepc基因；Matsuoka M等(1991，Mol Gen Genet.(1991)225(3)：411-419)也成功地将玉米的pepc基因转入烟草，随后Hudspeth等人(Hudspeth等，Plant Physiol.，(1992)98：458-464)观察到：导人受烟草叶绿素a/b结合蛋白基因启动子(cab启动子)控制的玉米pepc基因的转基因烟草的绿叶显示出倍增或PEPC活性以及苹果酸水平的增加。Kogami等人(Kogami等，转基因研究(1994)vol.3：287-296)观察到导入受花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)控制的玉米pepc基因的转基因烟草的绿叶所含的PEPC活性约为未转化烟草的2倍。Hudspeth等人和Kogami等人只观察到C₄化合物苹果酸的积累，而未进一步证实将pepc作为单个基因导入C₃植物烟草而导致的光合特性中的任何变化。上述这些研究都说明不同的单子叶植物pepc基因及不同的表达载体都能成功地在转基因研究的模式植物(烟草)中得到表达。Ku等(Ku，M.S.B.et al.，1999，Nat.Biotechnol.，17：76-80)将整个玉米的pepc基因用农杆菌导入水稻，获得了高表达的转基因植株。虽然甘蔗、玉米都属于光合C₄代谢，均利用PEPC固定CO₂，但两种作物分属两个属，在基因的启动子、基因表达的PEPC酶蛋白等方面都不同，甘蔗的光合效率和生物产量比玉米高许多，因此用甘蔗pepc基因作目的基因，转入C₃植物可能得到比玉米更好的结果。

综上所述，向C₃植物中导入C₄型pepc基因是提高水稻光合效率的一条有效途径，是实现加快超级稻品种选育的重要手段。有关甘蔗pepc基因遗传转化C₃植物研究未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用转基因技术改良C₃植物的光合特性的核酸分子和方法，具体地说，所述的核酸分子是编码甘蔗磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的核酸分子，所述的方法是将编码甘蔗磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的基因导入水稻等具有C₃型光合途径的植物，导入的pepc基因发挥作用从而为该植物提供C₄光合途径，使其具有更高的光合作用效率。本发明通过以下技术方案来实现。

本发明涉及编码甘蔗磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的核酸分子，其选自下组：

(a)编码具有SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的蛋白质的核酸分子；

(b)具有SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列或相应核糖核苷酸序列的核酸分子：

(c)核苷酸序列由于遗传密码子的简并行而与(a)或(b)的核酸分子序列不同的核酸分子；

(d)与(a)、(b)或(c)中的核酸分子序列互补的核酸分子。

在SEQ ID NO：1中描述的序列编码来自甘蔗的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，它能使甘蔗植物具有高光合效率。利用上述序列在转基因C₃植物中可能产生C₄光合途径，从而使C₃植物具有高光合效率。

在实施例中介绍了编码甘蔗磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的核酸分子的分离和测序，并对序列进行了分析。SEQ ID NO：1和2分别描述了分离出来的DNA序列和由它推测出来的氨基酸序列。虽然甘蔗、玉米都属于光合C4代谢，均利用PEPC固定CO₂，但两种作物分属两个属，用于本发明的甘蔗pepc基因在基因的启动子、基因表达的PEPC方面与玉米pepc基因均不同。本发明克隆的编码甘蔗磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的核酸分子自身带有完整启动子序列，其基因组pepc基因5’端1303bp(6781-8084)在玉米中没有发现，表明该基因有一定的专一性，1-6780bp中也有明显的单碱基突变(详见图1所示)。从基因编码的蛋白质比较看，两个基因也有明显不同，如玉米的PEPC蛋白缺失61-74个氨基酸(TNHRRRPFLLRPV)，甘蔗649-663缺失11个氨基酸(GRGGTVGRGGG)，在其他位置也发现少数单氨基酸不同(详见图2所示)。

本发明的核酸分子可以是DNA或RNA分子，DNA分子的例子有基因组DNA或cDNA分子。

本发明还涉及含有本发明核酸分子的载体，其可以是质粒、粘粒等遗传工程通用的载体，优选其是一种植物表达载体，该植物表达载体可使甘蔗pepc基因在C₃植物中有效表达。本发明的核酸分子可操作地与保证可翻译RNA在原核和/或真核细胞中转录和合成的调控元件相连。允许核酸分子在原核或真核细胞中表达的调控元件都是本领域技术人员所清楚的。

本发明的核酸分子在植物细胞中表达所需的调控元件原则上可以是任何在植物细胞中有活性的启动子、增强子、终止子等。可选择启动子使得发生组成性表达，启动子相对于植物可以是同源的或是异源的。组成型表达的适宜启动子有组成型表达的花椰菜花叶病毒的35S RNA启动子(见US 5352605)和遍在启动子(见US 5614399)。

外源基因导入受体植物能否有效表达，表达载体构建是关键因素之一。构建时选用表达载体的类型、目的基因插入位点、启动子和终止子等都有影响，其中较为关键的是启动子。35S启动子是很强的组成型表达启动子，对不同植物的基因表达都有调节作用，已广泛用于植物基因工程。MAGNIN N.C.等(PlantPhysiology，1997，1115(4)：1681-1689)研究表明，在pepc基因转化马铃薯时，无内含子的cDNA虽然能正确表达，但表达量低，即使强启动子或增强子能提高外源基因的表达能力，但PEPC活性与C₄植物中PEPC活性相比仍然很低，达不到提高光合效率的目的。本发明用于转化的甘蔗pepc基因带有完整的启动子，加上表达载体的35S启动子，能驱动C₄光合途径并明显改良C₃植物，特别是水稻的光合特性。

本发明的核酸分子和表达载体允许在多种植物，特别是在C₃植物中产生C₄光合途径，为C₃植物提供高光合效率。本发明的宿主包括用本发明的核酸分子转化的转基因植物细胞或来源于这种细胞的细胞及植物组织。通过本领域技术人员已知的方法，可用转基因植物细胞和植物组织再生整个植物。本发明的植物可以是任何一种具有C₃光合途径的植物，优选源于有农业用途的植物，优选是水稻。

本发明还涉及一种制备具有C₄型光合途径的植物的方法，所述方法是将本发明的核酸分子或含有该核酸分子的载体引入具有C₃型光合途径的植物，本发明的核酸分子自身带有甘蔗pepc基因的完整启动子，加上表达载体的启动子一起导入具有C₃型光合途径的植物，引入的导入的pepc基因发挥作用从而为该植物提供C₄光合途径，使其具有更高的光合作用效率。

根据标准方法，将基因导入的构建体导入选定C₃植物的细胞中。导入基因的一般性方法是本领域中已知的方法，如电穿孔，电注射，用如聚乙二醇(PEG)化学处理和基因轰击。其中优选使用农杆菌方法和基因枪法导入基因以转化C₃植物细胞。农杆菌属方法是本领域中熟知的方法，能转化双子叶植物(日本专利公开特许4330234)和单子叶植物(WO94/00977)。通过下文所述的方法可选择成功的转化体。

通过任何适当的常规的育种方法可固定转化体的表型，因此，被导入的基因可转移到转化体的后代中。

本发明的方法可适用于任何C₃植物，所述方法对如水稻，小麦，大麦，大豆，马铃薯，烟草，油菜等作物特别有利，而预期由于光合能力的提高会使每份干重的生产能力增加。优选本发明适用于单子叶植物，最优选适用于水稻。

本发明还涉及甘蔗pepc基因在高光合效率的C₃植物育种中的应用，特别是水稻育种中的应用。

附图说明

图1图示了甘蔗与玉米基因组pepc基因的比较。

图2图示了甘蔗与玉米pepc基因编码蛋白的比较。

图3甘蔗pepc基因的结构分析。

图4为中间载体pC30，pC30SN、pC20SN，pC21SN的酶切鉴定。其中，M为DNA Marker，泳道1为30S∥BamH I/HindIII，泳道2为30SN//EcoR I/HindIII，泳道3为20SN//EcoR I/HindIII，泳道4为21SN//EcoR I/HindIII。

图5显示植物表达载体pC30SNP和pC30SNPr的酶切鉴定。其中M为DNAMarker，泳道1为30SNP//EcoR I，泳道2为30SNPr//EcoR I。

图6显示高光效基因植物表达载体pC30SNP的构建过程。

图7显示pC30SNP，pC30SNPr，pC30SNr导入农杆菌LBA4404，A281的点杂交结果。其中泳道1为CK+pUCP，泳道2为CK-LBA4404，泳道3为C30SNP404，泳道4为C30SNP281，泳道5为C30SNPr404，泳道6为C30SNPr105，泳道7为pBSr，

泳道8为CK-A281，泳道9为C20SNr404，泳道10为C20SNr281。

具体实施方式

为了更详细地进一步阐明而不是为了限制本发明，给出了下列实施例。实施例1甘蔗pepc基因的克隆与测序

1.1甘蔗基因组文库的构建及甘蔗pepc基因的测序

采用CTAB法从甘蔗植株的幼嫩叶片中提取甘蔗基因组DNA。按照Trizol试剂盒说明书进行甘蔗总RNA的提取。按下述方法构建甘蔗基因组文库：

1)甘蔗基因组DNA用XbaI内切酶，37℃过夜完全酶切；

2)10-40％蔗糖梯度离心，收集9kb的含pepc基因的DNA片段组分；

3)将带有XbaI切点的片段连接到λFix II载体(实验操作按照美国Stratagene公司的λFixII文库构建指南)。

4)连接的DNA用Stratagene公司的GigapackIII Gold-4(产品号#200201)的包装蛋白包装(实验操作按照美国Stratagene公司的GigapackIII Gold-4的包装蛋白包装指南)。

5)以玉米pepc基因(ACCESSION：X15642)KpnI和EcoRI的酶切片段作为探针进行基因组文库杂交筛选(杂交筛选方法见J.Sambrrok，E.F.Fritsch and T.Maniatis.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^hd ed.)

6)从6×10⁵重组体中筛选6个克隆。

从4个中筛选出1个克隆，提取质粒DNA，经XbaI酶切，连接到pUC18克隆载体(pUCP)上进行测序。

1.2甘蔗pepc基因序列分析

甘蔗pepc基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，推导出的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，甘蔗pepc基因的结构分析见图3所示，其中pepc基因的启动子区如下所示。

pepc基因的启动子区(-1298bp)

CTAGAGATGTAATGGTGTTAGGACACGTGGTTAGCTACTAA

AATGTAA

GGTCAAAATTCGATGGTTTATTTTCTATTTTCAATTACCTAGCATTATCTCAT

TTCTAATTGTGTGATAACAAATGCATTAGACCATAATTCTGTAAATACGTACA

TTTAAGCACACAGTCTATATTTTAAAATTCTTCTTTTTGTGTGGATATCCCA

ACCCAAATCCACCTCTCTCCTCAATCCGTGTATCTTCACCGCTGCCAAGTGC

CAACAACACATCGCATCGTGCAAATCTTTGTTGGTTTGTGCACGGTCGGCG

CCAATGGAGGAGACACCTGTACGGTGCCCTTGGTAGAACAACATCCTTATC

CCTATATGTATGGTGCCCTTCGTAGAATGGCACCCCTTATCCCTACAATAGCC

ATGTATGCATACCAAGAATTAAA

CTTTTTCTTGAACCACAATAATTTAT

GCGGCACTTCTTGTTCTGGTTGAACACTTATTTGGAACAATAAAATC

CCGAGTTCCTAACCACAGGTTCACTTTTTTT CCTAGGAAACT

AAATTTTAAATTCATAAATTTAATTGAAATGTTAATGAAAACAAAAAAATTA

TCTACAAAGACGACTCTTAGCCACAGCCGCCTCACTGCACCCTCAACCAC

ATCCTGCAAACAGACACCCTCGCCACATCCCTCCAGATTCTTCCCTCCGA

TGCAGCCTACTTGCTAACAGACGCCCTCTCCACATCCTGCAAAGCATTCC

TCCAAATTCTTGCGATCCCCCGAATCCAGCATTAACTGCTAAGGGACGCCC

TCTCCACATCCTGCTACCCAATTAGCCAACGGAATAACACAAGAAGGCA

GGTGAGCAGTGACAAAGCACGTCAACAGCACCGAGCCAAGCCAAAAAGG

AGCAAGGAGGAGCAAGCCCAAGCCGCAGCCGCAGCTCTCCAGGTCCCCTT

GCGATTGCCGCCAGCAGTAGCAGACACCCCTCTCCACATCCCCTCCGGCC

GCTAACAGCAGCAAGCCAAGCCAAAAAGAAGCCTCAGCCACAGCCGGTT

CCGTTGCGGTTA CCGCCGATCACATGCCCAAGGCCGCGCCTTTCCAAACG

CCGAGGG CCGCCCGTTCCCGTGCACAGCCACACACACACCCGCCCGCCA

ACGACTCCCCATCCC

GAACCCACCCGCGCACTGCATTGATCA

CGCATCGCAGCAGCACGAGCAGCACGCCGTGCCGCTCCAACCGTCTCGC

TTCCCTGCTTAGCTTCCCGCCGCGCCATG(启始密码子)

上述的启动子区序列中包含TATA box，CCAAT box，光反应元件(CCTTATCCT)，Sp-1结合位点：CCGCCC；CCGCCG和直接重复序列CCCTCAACCACATCCTGC；GACACCCTCGCCACATCC；GACGCCCTCTCCACATCCTGC。

与玉米pepc基因(参见Ku，M.S.B.et al.，1999，Nat.Biotechnol.，17：76-80)相比，本发明克隆的甘蔗基因组pepc基因5’端1303bp(6781-8084)在玉米中没有发现，表明该基因有一定的专一性，1-6780bp中也有明显的单碱基突变(详见图1所示)。从基因编码的蛋白质比较看，两个基因也有明显不同，如玉米的PEPC蛋白缺失61-74个氨基酸(TNHRRRPFLLRPV)，甘蔗649-663缺失11个氨基酸(GRGGTVGRGGG)，在其他位置也发现少数单氨基酸不同(详见图2所示)。

实施例2植物表达载体pc30SNP和pc30SNPr的构建

1.1菌种转化及质粒提取

分别用1μL质粒pBI121(商业购买，农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点实验室活化保存)和pUCP(上述实施例1所克隆的含甘蔗PEPC基因的克隆载体)转化大肠杆菌XL1菌株，挑单菌落扩大培养，大量抽提纯化质粒。

1.2中间表达载体pC30SN的构建

由于pepc基因两端的酶切位点与植物表达载体的酶切位点不匹配，因而构建带有CaMV35S启动子和Nos终止子的中间表达载体pC30SN便于pepc基因的克隆。构建过程为：将pBI121(CLONTECH公司商业购买，农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点实验室活化保存)上的CaMV35S启动子插入pCAMBIA3300(简称pC3300)(CAMBIA公司商业购买、农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点实验室活化保存)多克隆位点的HindIII和BamH I之间，构建出pC30S中间载体；再将pBI121的Nos终止子插入pC30S的EcoR I和Sac I之间，构建出中间载体pC30SN。在pC30SN上有Xba I位点供pepc基因插入。

pC30SN的构建

用BamH I和HindIII分别酶切PBI121和pC3300

BamH I                    2μL

10×buf K                 5μL

PBI121/pC3300             5μL

ddH₂O                  38μL

Total Volume              50μL

30℃，温浴2-3h，75℃，水浴15min失活BamH I，再在该混合物中加入2μLHindIII，37℃下温浴2-3h，加1/10V的Loading buf，用1％的琼脂糖凝胶电泳，回收PBI121切下小片段(CaMV35S)和pC3300切下的大片段8.4kb，并在T₄-DNALigase下连接，连接产物转化XL1感受态。随机挑选重组子微量提取质粒，选滞后质粒用BamH I和HindIII双酶切鉴定。重组子命名为pC30S。经BamH I/HindIII双酶切鉴定，恰好切下约0.8kb(35Sp)大小的片段，证明pC30S确已将35Sp插入了预期的位置。酶切图谱见图4的第1泳道。

用Sac I和EcoR I分别酶切pC30S和pBI121：

Sac I                     2.5μL

EcoR I                    2.5μL

10×buf M                 5μL

pBI121/pC30S              5μL

ddH₂O                  35μL

Total Volume              50μL

37℃酶切3h，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，回收pBI121切下的小片段(0.33kb)和pC30S切下的大片段，用T₄-DNA Ligase连接，转化XL1感受态。随机挑选重组子微量提取质粒，选滞后质粒用EcoR I和HindIII双酶切重组质粒鉴定。重组子命名为pC30SN。

EcoR I                               1μL

HindIII                              1μL

pC30SN                               1μL

10×Multicore buf(Promega)           2μL

0.1％BSA                             2μL

ddH₂O                               13μL

Total Volume                         20μL

37℃，温浴2h，电泳检查酶切结果。用pC30SN直接克隆外源基因，便得到抗除草剂PPT的植物表达载体。由于Nost很小，只有0.33kb，电泳时，带很暗，因而鉴定pC30SN时，用EcoR I和HindIII双酶切，若Nos未连接上，则切下的是0.8kb带，若连接上，则切下的为1.13kb，酶切结果证明Nost已连上，又因采用定向粘端连接，Nost一定连在35Sp的后面。用EcoR I和HindIII双酶切pC30SN得到了一条明亮的1.13kb的带，说明pC30SN已构建成功。其酶切结果见图4。

1.3PEPC植物表达载体的构建

用Xba I分别酶切pUCP和pC30SN：

Xba I                     5μL

10×buf M                 5μL

pUCP/pC30SN               10μL

0.1％BSA                  5μL

ddH₂O                    25μL

Total Volume              50μL

37℃，酶切3-4h，电泳回收pUCP切下的大片段(PEPCase基因)和pC30SN切下的大片段。

将pC30SN/Xba I片段在CIAP作用下去磷酸化。方法如下：

pC30SN/Xba I                  20μL

10×buf CIAP                  5μL

CIAP(20μ/μL)                2μL

ddH₂O                        23μL

Total Volume                  50μL

37℃，温育30min，75℃处理10min，用苯酚/氯仿抽提2次，再用氯仿抽提1次后加入NaCl至终浓度150mmol/L和2.5V无水乙醇，沉淀DNA，沉淀溶于10μL ddH₂O中。

将去磷酸化的pC30SN/Xba I片段与回收的PEPCase基因片段连接，转化XL1感受态，重组子命名为pC30SNP，用EcoR I单酶切重组子鉴定，正向连接的为pC30SNP，反向连接的命名为pC30SNPr。即构建出PEPCase的正义和反义表达载体。

pUCP上的pepc基因为8.6kb，远比其克隆载体pUC19(2.69kb)大，载体片段9.5kb也较大，大片段间的连接更不容易。pUCP只能用Xba I单酶切才能切下完整的pepc基因，因pepc基因中有太多的酶切位点，无疑给构建带来一定的困难，但通过中间载体pC30SN，问题便迎刃而解。pC30SN的35Sp后正好有XbaI位点供PEPCase插入。为减轻载体自身连接和目的片段自身连接，对载体片段进行了去磷酸化处理，使载体自连的频率下降至少50倍。按此方法顺利地将pepc基因插在了pC30SN的Xba I位点上，目的片段以相同的粘性未端与载体连接可有两个方向，因而必须鉴定pepc基因的插入方向，若正向插入，则为正义表达载体pC30SNP，若反向连接，则为反义表达载体pC30SNPr。因此不能用Xba I单酶切来鉴定重组子。已知在pepc基因的3.2kb和4.2kb处有两个EcoR I位点，在pC30SN的Nost末端有一个EcoR I位点，若用EcoR I单酶切pC30SNP(正向连接)，应切下1.0kb，2.9kb和148kb三条带，若反向连接，应切下1.0kb，4.5kb和12.2kb三条带(如图5)，而未连上pepc基因的假转化子用EcoR I只能切成一个片段。最后的酶切结果与预期的一致，即已构建成功pepc的正义和反义植物表达载体pC30SNP和pC30SNPr。整个构建过程见图6。

实施例3将pC30SNP，pC30SNPr导入农杆菌

用直接转化法将pC30SNP，pC30SNPr分别导入农杆菌LBA4404和A281(Invitron，USA商业购买，农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点实验室活化保存)中，用pepc基因为探针，DIG标记，检测pepc基因是否导入农杆菌中。

1.1直接转化法

1.1.1农杆菌感受态细胞的制备

1)分别挑取农杆菌LBA4404(Str⁺，Rif⁺)，EHA105(Str⁺，Rif⁺)，A281(Str⁺，Rif⁺，Nal⁺)单菌落接种于5mL加有相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃，250r/m过夜培养。

2)取每种过夜培养物1mL接种于20mL加有抗生素YEP(Str 25mg/L，Rif 25mg/L，A281再加Nal 40mg/L)中，继续培养OD₆₀₀至0.5。

3)取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，冰预冷10min。

4)4℃，8000r/m离心1min，去上清液。

5)用0.05mol/L CaCl₂重悬菌体，冰浴15min。

6)4℃，8000r/m离心2min，收集菌体，去上清液。

7)用100μL冰预冷的0.05mol/L CaCl₂重悬即为感受态细胞。

1.1.2重组质粒转化农杆菌

1)将1μL重组质粒加入100μL农杆菌感受态细胞液中，混匀，冰浴20min。

2)28℃水浴5min。

3)冰浴1-2min。

4)加入500μL YEP液体培养基，28℃振荡培养2-3h。

5)取300μL转化液涂布于含有Km 50mg/L，Str 25mg/L，Rif 25mg/L或再加入Nal⁺50mg/L(A281)的YEP平板上。

6)28℃培养2-3天。

1.2转化农杆菌双元载体中Mini-Ti质粒的提取

双元载体中有两种质粒，一种是Mini-Ti质粒，含有目的基因，T-DNA边界及标记基因等；另一种是具有Vir区，缺失T-DNA的Helper-Ti质粒。本试验所得到的转化农杆菌含有双元载体，提取Mini-Ti质粒供质粒鉴定。

(1)挑取单菌落接种在5mL YEP液体培养基中，28℃，200r/m培养过夜。

(2)取1.5mL菌液置1.5mL离心管中，10000r/m离心2min，收集菌体。

(3)用STE溶液洗涤菌体2次。加入100μL Solution I，重悬菌体，室温放置5min。

(4)加入200μL新配制的SolutionII，混匀，室温放置10min。

(5)加入100μL SolutionIII，混匀，加入50μL 3mol/L乙酸钠混匀后，-20℃放置15min。

(6)12000r/m离心5min，将上清转入另一离心管中，加入2V冰冷的95％乙醇，-20℃放置30min。

(7)12000r/m离心5min，弃上清。沉淀中加入500μL 0.3mol/L NaAc悬浮沉淀，加入1mL 95％乙醇，颠倒离心管数次，-20℃放置15min。

(8)12000r/m离心5min，弃上清。加入1mL 70％乙醇漂洗沉淀，并干燥。

(9)加入50μL TE溶液溶解沉淀，电泳检测浓度。

1.3转化农杆菌的PCR检测

以合成的pepc特异引物P1，P2对经转化后长出的农杆菌菌落进行PCR检测，目的在于证实外源基因确已导入农杆菌中，并检测导入基因的完整性。以提取的农杆菌双元载体中Mini-Ti质粒DNA为模板，进行特异引物的PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，紫外灯下观察拍照。

根据pepc的序列，设计了一对扩增PEPC的特异引物

p1：AGACACGCTCATCCTCACC

p2：CCCAAAAAGACCCACTTCC

PCR反应及循环程序：PCR反应在PE公司2400型PCR仪上进行，循环程序为94℃，7min；94℃ 30s，60℃ 45s，72℃ 90s(40 cycles)；72℃ 7min。

1.4转化农杆菌的DIG标记杂交鉴定

对于经PCR检测为阳性的转化菌落，用地高辛标记检测，再次证实外源基因已导入农杆菌中。

1)制备DIG标记探针：按试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

●加入16μL回收的pepc PCR产物到0.5mL离心管中，在沸水中变性10min，立即置冰上。

●加入4μL DIG-High Prime Mix，混匀。

●37℃温育过夜。

●65℃加热10min终止反应，贮于-20℃备用。

2)DNA变性、固定：将PCR检测为阳性的转化农杆菌的Mini-Ti质粒取1μL，均匀点在尼龙膜上，每个质粒点一次，剪角作为标记，将点有DNA的尼龙膜于120℃烘30min后备用。

3)预杂交和杂交

●预热10mL预杂交液至42℃。加入盛有烘烤过膜的培养皿中，42℃轻摇30min。

●取10μL制备好的DNA探针于沸水中变性5min后，迅速冰浴冷却。

●将变性的探针加入预热的预杂交液中，混匀，将滤膜放入该培养皿中，于42℃温和杂交过夜。

4)洗膜与显色

●用足量的2×SSC，0.1％ SDS于室温洗膜两次，每次5min。

●用足量的0.1SSC，0.1％ SDS于68℃洗膜两次，每次15min。

●用马来酸缓冲液洗一次(1-5min)。

●用1×Blocking Solution浸膜30min。

●用1×Blocking Solution稀释anti-DIG-AP结合物至150mU/mL。用该溶液浸洗滤膜30min。

●用足量的马来酸溶液洗膜两次，每次15min。

●滤膜在检测溶液中浸泡2-5min。

●将滤膜取出放入10mL新配的显色液中显色，几分钟后有斑点出现，置于暗处，显色过夜。

●将显色充分的滤膜取出放入水中洗涤5min。观察并照相。

经杂交鉴定为阳性克隆的菌落穿刺保存和甘油超低温保存。

用直接转化法，成功地将pC30SNP和30SNPr导入了农杆菌LBA4404和A281两个菌株中。经点杂交证明pepc基因均已导入各自的农杆菌中，杂交结果见图7。

实施例4甘蔗pepc基因转导优质水稻

1.1、基因枪法转化水稻

1.1.1、转化材料的预处理：在微弹轰击前5h将水稻胚性愈伤组织接种于M1培养基+0.3mol/L山梨醇+0.3mol/L甘露醇(0.6mol/L的渗透剂)的培养基上作渗透处理，枪击后，材料继续在此培养基上培养16-20h。

1.1.2、微弹(Microprojectile or Microcarrier)的制备：根据基因枪说明书的操作步骤来制备微弹。

1.1.3、转化材料的轰击

1)将渗透处理5h的胚性愈伤组织集中在培养皿的中心6cm范围内。

2)用70％酒精提前消毒基因枪和装有基因枪的超净工作台；将可裂圆片微粒子弹载体，阻挡网，载槽包好，高压灭菌(121℃，20min)。

3)取6μL包被DNA的微弹悬浮液点于微粒子弹载体中心，在工作台上吹干。

4)将载有微弹的载体及阻挡网装入微弹发射装置。

5)将欲转化的胚性愈伤组织培养皿放在真空室的6cm样品距离的位置。

6)抽真空，并维持在真空度26 inches Hg，压力为1100Psi时，轰击，然后通气，取出材料，翻动一下，再轰击第二次。

7)换上新的微弹和受体材料，按上述操作继续轰击，直至结束。

1.1.4、转化材料的过渡培养和选择培养

枪击后的材料在渗透培养基上继续处理16-20h，转入M₁培养基上，于黑暗中过渡培养10天后，将胚性愈伤组织转入M₂培养基(内含一定浓度的Hyg，G418or PPT)中，于光下培养诱导胚状体及分化不定芽。当小植株在M₂培养基上长约2-3cm高时移入M₃培养基(含相应选择压力)上，诱导生根，以进一步筛选转化子。

1.2、农杆菌介导法转化水稻

1.2.1、农杆菌菌液的准备

挑取带目的基因的农杆菌单菌落接种到5mL YEP液体培养基(Km 100mg/L，Rif 25mg/L，Str 25mg/L or Nal 40mg/L)中，28℃，200r/m振摇培养过夜。取过夜培养液500μL接种至20mL含相同抗生素的YEP培养基中，培养至OD₆₀₀为0.5左右，转移到离心管中，4℃，5000r/m离心5min，去上清液，用含200μmol/LAS的等体积的MG₁，MG₂，MG₃和MG₄液体培养基重悬菌体，于28℃，200r/m培养2-3h，诱导Vir基因表达，作为感染转化材料的菌液原液。液体培养基的组成为：

MG₁：MS培养基+1mg/L 2，4-D+葡萄糖20mmol/L+蔗糖30g/L

MG₂：MS培养基+2，4-D 1mg/L+AS100μmol/L+葡萄糖20mmol/L+30g/L蔗糖

MG₃：1/2MS培养基+2，4-D 1mg/L+AS 100μmol/L+30g/L蔗糖

MG₄：1/5MS培养基+2，4-D 1mg/L+AS 150μmol/L+葡萄糖10mmol/L+果糖10mmol/L+30g/L蔗糖，PH5.8。

将上述菌液原液OD₆₀₀≈0.6-0.8分别用相应培养基(MG₁，MG₂，MG₃，MG₄)稀释至OD₆₀₀分别为0.2，0.4，0.6三个浓度，用于转化。

1.2.2、水稻愈伤组织的预处理

取接种外植体20天后的表面有黄白色颗粒突起的水稻胚性愈伤组织为转化受体材料，将其切成2mm的小块，在无菌滤纸上于超净工作台上吹干处理10min，30min，1h，1.5h和2h后，分别用于农杆菌感染。

1.2.3、农杆菌侵染及共培养

用菌液浸泡甘蔗愈伤组织10-20min，其间轻微摇动，侵染后的材料转移至滤纸上，吸干并吹干附在材料表面的菌液，转移到不含或含有100μmol/L AS的M1培养基中，分别共培养3天，4天，5天。共培养后先用无菌水洗涤3-4次，滤纸吸干，转置于筛选培养基即含有相应抗生素Car 500mg/L(Hyg 30mg/L orG418 20mg/L or PPT 0.75mg/L)的培养基上培养。

1.2.4、筛选培养及观察记载

每隔20天于筛选培养基上继代一次，发现有农杆菌污染出现，立即移出未污染的材料继续培养，并同时剔除褐化死亡的组织块，并将大组织块剥小，以保证足够的选择压力。分化芽长至2-3cm高时转入生根培养基M₃中，促发生根，同时加入相应的抗生素，未长农杆菌污染的苗不加Car。将长成的抗性试管苗移入花盆中。

1.3、转化植株的分子检测

基因枪法获得了33株抗性苗，农杆菌法获得了28株抗性苗，共61株。因大部分植株太小，选取较大的15株(其中基因枪法8株，农杆菌法7株)进行检测。

1.3.1、水稻总DNA的提取

采用CTAB法提取水稻的基因组DNA。结果表明，用CTAB法提取总DNA的电泳结果呈单一条带，分子量大，无RNA，纯度较高，但DNA含量偏低。

1.3.2、PCR检测

以15个抗性转化株的总DNA为模板，以P₁ ，P₂为特异引物，进行PCR扩增。PCR扩增程序如下：

结果表明：从5株中扩增出了与目的片段大小一致的条带，初步证明目的基因已整合到DNA中。

1.3.3、PCR产物点杂交：以PCR检测阳性的转化株DNA为检测样品。用Clean-up试剂盒回收其PCR产物，分别点样于尼龙膜上，以已制备好pepc基因片段为探针进行DNA斑点杂交，检测扩增出的PCR产物是否为插入的外源基因，有5株的杂交结果呈阳性。

1.3.4、Northern杂交：参照萨姆布鲁克《分子克隆》第三版制备杂交膜，参考DIGEasy Hyb(Roche)说明书进行杂交。将PCR和PCR-Southern杂交检测为阳性的植株，提取RNA并点在尼龙膜上，与pepc探针杂交，有3株的杂交结果呈阳性。

1.3.5显影定影：在暗室中，剪比杂交膜略大X-光胶片，放于暗盒中暴光5min；在显影液中浸泡5min；用自来水漂洗1～2min；定影液中定影10min；自来水冲洗，凉干。

1.4、转基因植株的PEPC活性检测：取水稻叶片，加入适量提取液(50mmol·L^-1Tris-HCl，pH7.5，1mmol·L^-1MgCl₂，5mmol·L^-1DTT，2％w/v不溶性PVP)研磨，滤液于13000g离心10min，取上清液测酶活性。反应总体积1ml，含50mmol·L^-1HEPES-KOH pH8.0的缓冲液，10mmol·L^-1NaHCO₃，5mmol·L^-1MgCl₂，0.2mmol·L^-1NADH，2mmol·L^-1PEP，1.5unit苹果酸脱氢酶，加适量提取液。加入PEP开始计时，记录340nm光密度的变化，测试温度为30℃，计算PEPC活性

由表1的结果看出，转甘蔗pepc基因的水稻可以表达高水平的PEPC活性，转基因材料的活性甚至比玉米还高，与甘蔗相当。

                表1甘蔗pepc基因转导水稻T1代PEPC酶活性表现

供试材料	PEPC酶活性(μmolPEP.mg-1chl.h-1)	与未转基因水稻相比	备注
				甘蔗	1846.5±67.4	86.7倍	水稻生长的三个不同时期(分蘖期、拔节期和孕穗期)，每个时期重复测定3次，取其平均值
玉米	1253.8±32.5	58.9倍
			未转基因水稻	21.3±18.7	/
转甘蔗pepc基因水稻植株1	1635.6±73.8	76.8倍
			转甘蔗pepc基因水稻植株2	1327.4±35.8	62.3倍
转甘蔗pepc基因水稻植株3	1934.8±63.4	90.8倍
			转甘蔗pepc基因水稻植株4	1532.6±54.4	72.0倍
转甘蔗pepc基因水稻植株5	1897.5±38.5	89.1倍

                       序列表

<110>福建农林大学

<120>编码甘蔗磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的核酸分子及其应用

<130>none

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2952

<212>DNA

<213>Saccharum sp.

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2952)

<223>

<400>1

atg gcg tcg acc aag gca ccc ggc cct ggc gag aag cac cac tcc atc    48

Met Ala Ser Thr Lys Ala Pro Gly Pro Gly Glu Lys His His Ser Ile

1               5                   10                  15

gac gcg cag ctc cgt cag ctg gtc cca ggc aag gtc tcc gag gac gac    96

Asp Ala Gln Leu Arg Gln Leu Val Pro Gly Lys Val Ser Glu Asp Asp

            20                  25                  30

aag ctc atc gag tac gat gcg ctg ctc gtc gac cgc ttc ctc aac atc    144

Lys Leu Ile Glu Tyr Asp Ala Leu Leu Val Asp Arg Phe Leu Asn Ile

        35                  40                  45

ctc cag gac ctc cac ggg ccc agc ctt cgc gaa ttt gta act aac cac    192

Leu Gln Asp Leu His Gly Pro Ser Leu Arg Glu Phe Val Thr Asn His

    50                  55                  60

cgc cgc cgc cca ttt ctt ctt cga ccg gtc cag gag tgc tac gag gtg    240

Arg Arg Arg Pro Phe Leu Leu Arg Pro Val Gln Glu Cys Tyr Glu Val

65                  70                  75                  80

tcg gcc gac tat gag ggc aaa gga gac acg acg aag ctg ggc gag ctc    288

Ser Ala Asp Tyr Glu Gly Lys Gly Asp Thr Thr Lys Leu Gly Glu Leu

                85                  90                  95

ggc gcc aag ctc acg ggg ctg gcc ccc gcc gac gcc atc ctc gtg gcg    336

Gly Ala Lys Leu Thr Gly Leu Ala Pro Ala Asp Ala Ile Leu Val Ala

            100                 105                 110

agc tcc atc ctg cac atg ctc aac ctc gcc aac ctg gcc gag gag gtg    384

Ser Ser Ile Leu His Met Leu Asn Leu Ala Asn Leu Ala Glu Glu Val

        115                 120                 125

cag atc gcg cac cgc cgc cgc aac agc aag ctc aag aaa ggt ggg ttc    432

Gln Ile Ala His Arg Arg Arg Asn Ser Lys Leu Lys Lys Gly Gly Phe

    130                 135                 140

gcc gac gag ggc tcc gcc acc acc gag tcc gac atc gag gag acg ctc    480

Ala Asp Glu Gly Ser Ala Thr Thr Glu Ser Asp Ile Glu Glu Thr Leu

145                 150                 155                 160

aag cgc ctc gtg tcc gag gtc ggc aag tcc ccc gag gag gtg ttc gag    528

Lys Arg Leu Val Ser Glu Val Gly Lys Ser Pro Glu Glu Val Phe Glu

                165                 170                 175

gcg ctc aag aac cag acc gtc gac ctc gtc ttc acc gcg cat ccc acg    576

Ala Leu Lys Asn Gln Thr Val Asp Leu Val Phe Thr Ala His Pro Thr

            180                 185                 190

cag tcc gcc cgc cgc tcg ctc ctg cag aaa aac gcc agg atc cgg aat    624

Gln Ser Ala Arg Arg Ser Leu Leu Gln Lys Asn Ala Arg Ile Arg Asn

        195                 200                 205

tgt ctg acc cag ctg aat gcc aag gac atc act gac gac gac aag cag    672

Cys Leu Thr Gln Leu Asn Ala Lys Asp Ile Thr Asp Asp Asp Lys Gln

    210                 215                 220

gag ctc gat gag gct ctg cag aga gag atc caa gca gcc ttc aga acc    720

Glu Leu Asp Glu Ala Leu Gln Arg Glu Ile Gln Ala Ala Phe Arg Thr

225                 230                 235                 240

gat gaa atc agg agg gca caa ccc acc ccc cag gac gaa atg cgc tat    768

Asp Glu Ile Arg Arg Ala Gln Pro Thr Pro Gln Asp Glu Met Arg Tyr

                245                 250                 255

ggg atg agc tac atc cat gag act gta tgg aag ggc gtg cct aag ttc    816

Gly Met Ser Tyr Ile His Glu Thr Val Trp Lys Gly Val Pro Lys Phe

            260                 265                 270

ttg cgc cgt gtg gat aca gcc ctg aag aat atc ggc atc aat gag cgc    864

Leu Arg Arg Val Asp Thr Ala Leu Lys Asn Ile Gly Ile Asn Glu Arg

        275                 280                 285

ctt ccc tac aat gtt tct ctc att cgg ttc tct tct tgg atg ggt ggt    912

Leu Pro Tyr Asn Val Ser Leu Ile Arg Phe Ser Ser Trp Met Gly Gly

    290                 295                 300

gac cgc gat gga aat cca aga gtt acc ccg gag gtg aca aga gat gta    960

Asp Arg Asp Gly Asn Pro Arg Val Thr Pro Glu Val Thr Arg Asp Val

305                 310                 315                 320

tgc ttg ctg gcc aga atg atg gat gca aac ttg tac atc gat cag att    1008

Cys Leu Leu Ala Arg Met Met Asp Ala Asn Leu Tyr Ile Asp Gln Ile

                325                 330                 335

gaa cag ctg atg ttt gag ctc tct atg tgg cgc tgc aac gat gag ctt    1056

Glu Gln Leu Met Phe Glu Leu Ser Met Trp Arg Cys Asn Asp Glu Leu

            340                 345                 350

cgt gtt cgt gcc gaa gag ctc cac agt tcg tct ggt tcc aaa gtt acc    1104

Arg Val Arg Ala Glu Glu Leu His Ser Ser Ser Gly Ser Lys Val Thr

        355                 360                 365

aag tat tac ata gaa ttc tgg aag caa att cct cca aac gag ccc tac    1152

Lys Tyr Tyr Ile Glu Phe Trp Lys Gln Ile Pro Pro Asn Glu Pro Tyr

    370                 375                 380

cgg gtg ata cta ggc cat gta agg gac aag ctg tac aac aca cgc gag    1200

Arg Val Ile Leu Gly His Val Arg Asp Lys Leu Tyr Asn Thr Arg Glu

385                 390                 395                 400

cgt gct cgc cat ctg ctg gct tct gga gtt tct gaa att tca gcg gaa    1248

Arg Ala Arg His Leu Leu Ala Ser Gly Val Ser Glu Ile Ser Ala Glu

                405                 410                 415

tcg tca ttt acc agt atc gaa gag ttc ctt gag cca ctt gag ctg tgc    1296

Ser Ser Phe Thr Ser Ile Glu Glu Phe Leu Glu Pro Leu Glu Leu Cys

            420                 425                 430

tac aaa tca ctg tgt gac tgc ggc gac aag gcc atc gcg gac ggg agc    1344

Tyr Lys Ser Leu Cys Asp Cys Gly Asp Lys Ala Ile Ala Asp Gly Ser

        435                 440                 445

ctc ctg gac ctc ctg cgc cag gtt ttc acg ttc ggg ctc tcc ctg gtg    1392

Leu Leu Asp Leu Leu Arg Gln Val Phe Thr Phe Gly Leu Ser Leu Val

    450                 455                 460

aag ctg gac atc cgg cag gag tcg gag cgg cac acc gac gtg atc gac    1440

Lys Leu Asp Ile Arg Gln Glu Ser Glu Arg His Thr Asp Val Ile Asp

465                 470                 475                 480

gcc atc acc acg cac ctc ggc atc ggg tcg tac cgc gag tgg tcc gag    1488

Ala Ile Thr Thr His Leu Gly Ile Gly Ser Tyr Arg Glu Trp Ser Glu

                485                 490                 495

gac aag cgg cag gag tgg ctg ctg tcg gag ctg cga ggc aag cgc ccg    1536

Asp Lys Arg Gln Glu Trp Leu Leu Ser Glu Leu Arg Gly Lys Arg Pro

            500                 505                 510

ctg ctg ccc ccg gac ctt ccc cag acc gag gag atc gcc gac gtc atc    1584

Leu Leu Pro Pro Asp Leu Pro Gln Thr Glu Glu Ile Ala Asp Val Ile

        515                 520                 525

ggc gcg ttc cac gtc ctc gcg gag ctc ccg ccc gac agc ttc ggc ccc    1632

Gly Ala Phe His Val Leu Ala Glu Leu Pro Pro Asp Ser Phe Gly Pro

    530                 535                 540

tac atc atc tcc atg gcg acg gcc ccc tcg gac gtg ctc gcc gtg gag    1680

Tyr Ile Ile Ser Met Ala Thr Ala Pro Ser Asp Val Leu Ala Val Glu

545                 550                 555                 560

ctc ctg cag cgc gag tgc ggc gtg cgc cag ccg ctg ccc gtg gtg ccg    1728

Leu Leu Gln Arg Glu Cys Gly Val Arg Gln Pro Leu Pro Val Val Pro

                565                 570                 575

ctg ttc gaa agg ctg gcc gac ctg cag tcg gcg ccc gcg tcc gtg gag    1776

Leu Phe Glu Arg Leu Ala Asp Leu Gln Ser Ala Pro Ala Ser Val Glu

            580                 585                 590

cgc ctc ttc tcg gtg gac tgg tac atg gac cgg atc aag ggc aag cag    1824

Arg Leu Phe Ser Val Asp Trp Tyr Met Asp Arg Ile Lys Gly Lys Gln

        595                 600                 605

cag gtc atg gtc ggt tac tcc gac tcc ggc aag gac gcc ggc cgc ctg    1872

Gln Val Met Val Gly Tyr Ser Asp Ser Gly Lys Asp Ala Gly Arg Leu

    610                 615                 620

tcc gcg gcg tgg cag ctg tac agg gcg cag gag gag atg gcg cag gtg    1920

Ser Ala Ala Trp Gln Leu Tyr Arg Ala Gln Glu Glu Met Ala Gln Val

625                 630                 635                 640

gcc aag cgc tac ggc gtc aag ctc acc ttg ttc cac ggc cgc gga ggc    1968

Ala Lys Arg Tyr Gly Val Lys Leu Thr Leu Phe His Gly Arg Gly Gly

                645                 650                 655

acc gtg ggc agg ggt ggc ggg ccc acg cac ctt gcc atc ctg tcc cag    2016

Thr Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro Thr His Leu Ala Ile Leu Ser Gln

            660                 665                 670

ccg ccg gac acc atc aac ggg tcc atc cgt gtg acg gtg cag ggc gag    2064

Pro Pro Asp Thr Ile Asn Gly Ser Ile Arg Val Thr Val Gln Gly Glu

        675                 680                 685

gtc atc gag ttc tgc ttc ggg gag gag cac ctg tgc ttc cag act ctg    2112

Val Ile Glu Phe Cys Phe Gly Glu Glu His Leu Cys Phe Gln Thr Leu

    690                 695                 700

cag cgc ttc acg gcc gcc acg ctg gag cac ggc atg cac ccg ccg gtc    2160

Gln Arg Phe Thr Ala Ala Thr Leu Glu His Gly Met His Pro Pro Val

705                 710                 715                 720

tct ccc aag ccc gag tgg cgc aag ctc atg gac gag atg gcg gtc gtg    2208

Ser Pro Lys Pro Glu Trp Arg Lys Leu Met Asp Glu Met Ala Val Val

                725                 730                 735

gcc acg gag gag tac cgc tcc gtc gtc gtc aag gag gcg cgc ttc gtc    2256

Ala Thr Glu Glu Tyr Arg Ser Val Val Val Lys Glu Ala Arg Phe Val

            740                 745                 750

gag tac ttc aga tcg gct aca ccg gag acc gag tac ggg agg atg aac    2304

Glu Tyr Phe Arg Ser Ala Thr Pro Glu Thr Glu Tyr Gly Arg Met Asn

        755                 760                 765

atc ggc agc cgg cca gcc aag agg agg ccc ggc ggc ggc atc acg acc    2352

Ile Gly Ser Arg Pro Ala Lys Arg Arg Pro Gly Gly Gly Ile Thr Thr

    770                 775                 780

ctg cgc gcc atc ccc tgg atc ttc tcg tgg acc cag acc agg ttc cac    2400

Leu Arg Ala Ile Pro Trp Ile Phe Ser Trp Thr Gln Thr Arg Phe His

785                 790                 795                 800

ctc ccc gtg tgg ctg gga gtc ggc gcc gca ttc aag ttc gcc atc gac    2448

Leu Pro Val Trp Leu Gly Val Gly Ala Ala Phe Lys Phe Ala Ile Asp

                805                 810                 815

aag gac gtc agg aac ttc cag gtc ctc aaa gag atg tac aac gag tgg    2496

Lys Asp Val Arg Asn Phe Gln Val Leu Lys Glu Met Tyr Asn Glu Trp

            820                 825                 830

cca ttc ttc agg gtc acc ctg gac ctg ctg gag atg gtt ttc gcc aag    2544

Pro Phe Phe Arg Val Thr Leu Asp Leu Leu Glu Met Val Phe Ala Lys

        835                 840                 845

gga gac ccc ggc att gcc ggc ttg tat gac gag ctg ctt gtg gca gaa    2592

Gly Asp Pro Gly Ile Ala Gly Leu Tyr Asp Glu Leu Leu Val Ala Glu

    850                 855                 860

gaa ctc aag ccc ttt ggg aag cag ctc agg gac aaa tac gtg gag aca    2640

Glu Leu Lys Pro Phe Gly Lys Gln Leu Arg Asp Lys Tyr Val Glu Thr

865                 870                 875                 880

cag cag ctt ctc ctc cag atc gct ggg cac aag gat att ctt gaa ggc    2688

Gln Gln Leu Leu Leu Gln Ile Ala Gly His Lys Asp Ile Leu Glu Gly

                885                 890                 895

gat cca ttc ctg aag cag ggg ctg gtg ctg cgc aac ccc tac atc acc    2736

Asp Pro Phe Leu Lys Gln Gly Leu Val Leu Arg Asn Pro Tvr Ile Thr

            900                 905                 910

acc ctg aac gtg ttc cag gcc tac acg ctg aag cgg ata agg gac ccc    2784

Thr Leu Asn Val Phe Gln Ala Tyr Thr Leu Lys Arg Ile Arg Asp Pro

        915                 920                 925

aac ttc aag gtg acg ccc cag ccg ccg ctg tcc aag gag ttc gcc gac    2832

Asn Phe Lys Val Thr Pro Gln Pro Pro Leu Ser Lys Glu Phe Ala Asp

    930                 935                 940

gag aac aag ccc gcc gga ctg gtc aag ctg aac ccg gcg agc gag tac    2880

Glu Asn Lys Pro Ala Gly Leu Val Lys Leu Asn Pro Ala Ser Glu Tyr

945                 950                 955                 960

ccg ccc ggc ctg gaa gac acg ctc atc ctc acc atg aag ggc atc gcc    2928

Pro Pro Gly Leu Glu Asp Thr Leu Ile Leu Thr Met Lys Gly Ile Ala

                965                 970                 975

gcc ggc atg cag aac act ggc tag                                    2952

Ala Gly Met Gln Asn Thr Gly

            980

<210>2

<211>983

<212>PRT

<213>Saccharum sp.

<400>2

Met Ala Ser Thr Lys Ala Pro Gly Pro Gly Glu Lys His His Ser Ile

1               5                   10                  15

Asp Ala Gln Leu Arg Gln Leu Val Pro Gly Lys Val Ser Glu Asp Asp

            20                  25                  30

Lys Leu Ile Glu Tyr Asp Ala Leu Leu Val Asp Arg Phe Leu Asn Ile

        35                  40                  45

Leu Gln Asp Leu His Gly Pro Ser Leu Arg Glu Phe Val Thr Asn His

    50                  55                  60

Arg Arg Arg Pro Phe Leu Leu Arg Pro Val Gln Glu Cys Tyr Glu Val

65                  70                  75                  80

Ser Ala Asp Tyr Glu Gly Lys Gly Asp Thr Thr Lys Leu Gly Glu Leu

                85                  90                  95

Gly Ala Lys Leu Thr Gly Leu Ala Pro Ala Asp Ala Ile Leu Val Ala

            100                 105                 110

Ser Ser Ile Leu His Met Leu Asn Leu Ala Asn Leu Ala Glu Glu Val

        115                 120                 125

Gln Ile Ala His Arg Arg Arg Asn Ser Lys Leu Lys Lys Gly Gly Phe

    130                 135                 140

Ala Asp Glu Gly Ser Ala Thr Thr Glu Ser Asp Ile Glu Glu Thr Leu

145                 150                 155                 160

Lys Arg Leu Val Ser Glu Val Gly Lys Ser Pro Glu Glu Val Phe Glu

                165                 170                 175

Ala Leu Lys Asn Gln Thr Val Asp Leu Val Phe Thr Ala His Pro Thr

            180                 185                 190

Gln Ser Ala Arg Arg Ser Leu Leu Gln Lys Asn Ala Arg Ile Arg Asn

        195                 200                 205

Cys Leu Thr Gln Leu Asn Ala Lys Asp Ile Thr Asp Asp Asp Lys Gln

    210                 215                 220

Glu Leu Asp Glu Ala Leu Gln Arg Glu Ile Gln Ala Ala Phe Arg Thr

225                 230                 235                 240

Asp Glu Ile Arg Arg Ala Gln Pro Thr Pro Gln Asp Glu Met Arg Tyr

                245                 250                 255

Gly Met Ser Tyr Ile His Glu Thr Val Trp Lys Gly Val Pro Lys Phe

            260                 265                 270

Leu Arg Arg Val Asp Thr Ala Leu Lys Asn Ile Gly Ile Asn Glu Arg

        275                 280                 285

Leu Pro Tyr Asn Val Ser Leu Ile Arg Phe Ser Ser Trp Met Gly Gly

    290                 295                 300

Asp Arg Asp Gly Asn Pro Arg Val Thr Pro Glu Val Thr Arg Asp Val

305                 310                 315                 320

Cys Leu Leu Ala Arg Met Met Asp Ala Asn Leu Tyr Ile Asp Gln Ile

                325                 330                 335

Glu Gln Leu Met Phe Glu Leu Ser Met Trp Arg Cys Asn Asp Glu Leu

            340                 345                 350

Arg Val Arg Ala Glu Glu Leu His Ser Ser Ser Gly Ser Lys Val Thr

        355                 360                 365

Lys Tyr Tyr Ile Glu Phe Trp Lys Gln Ile Pro Pro Asn Glu Pro Tyr

    370                 375                 380

Arg Val Ile Leu Gly His Val Arg Asp Lys Leu Tyr Asn Thr Arg Glu

385                 390                 395                 400

Arg Ala Arg His Leu Leu Ala Ser Gly Val Ser Glu Ile Ser Ala Glu

                405                 410                 415

Ser Ser Phe Thr Ser Ile Glu Glu Phe Leu Glu Pro Leu Glu Leu Cys

            420                 425                 430

Tyr Lys Ser Leu Cys Asp Cys Gly Asp Lys Ala Ile Ala Asp Gly Ser

        435                 440                 445

Leu Leu Asp Leu Leu Arg Gln Val Phe Thr Phe Gly Leu Ser Leu Val

    450                 455                 460

Lys Leu Asp Ile Arg Gln Glu Ser Glu Arg His Thr Asp Val Ile Asp

465                 470                 475                 480

Ala Ile Thr Thr His Leu Gly Ile Gly Ser Tyr Arg Glu Trp Ser Glu

                485                 490                 495

Asp Lys Arg Gln Glu Trp Leu Leu Ser Glu Leu Arg Gly Lys Arg Pro

            500                 505                 510

Leu Leu Pro Pro Asp Leu Pro Gln Thr Glu Glu Ile Ala Asp Val Ile

        515                 520                 525

Gly Ala Phe His Val Leu Ala Glu Leu Pro Pro Asp Ser Phe Gly Pro

    530                 535                 540

Tyr Ile Ile Ser Met Ala Thr Ala Pro Ser Asp Val Leu Ala Val Glu

545                 550                 555                 560

Leu Leu Gln Arg Glu Cys Gly Val Arg Gln Pro Leu Pro Val Val Pro

                565                 570                 575

Leu Phe Glu Arg Leu Ala Asp Leu Gln Ser Ala Pro Ala Ser Val Glu

            580                 585                 590

Arg Leu Phe Ser Val Asp Trp Tyr Met Asp Arg Ile Lys Gly Lys Gln

        595                 600                 605

Gln Val Met Val Gly Tyr Ser Asp Ser Gly Lys Asp Ala Gly Arg Leu

    610                 615                 620

Ser Ala Ala Trp Gln Leu Tyr Arg Ala Gln Glu Glu Met Ala Gln Val

625                 630                 635                 640

Ala Lys Arg Tyr Gly Val Lys Leu Thr Leu Phe His Gly Arg Gly Gly

                645                 650                 655

Thr Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro Thr His Leu Ala Ile Leu Ser Gln

            660                 665                 670

Pro Pro Asp Thr Ile Asn Gly Ser Ile Arg Val Thr Val Gln Gly Glu

        675                 680                 685

Val Ile Glu Phe Cys Phe Gly Glu Glu His Leu Cys Phe Gln Thr Leu

    690                 695                 700

Gln Arg Phe Thr Ala Ala Thr Leu Glu His Gly Met His Pro Pro Val

705                 710                 715                 720

Ser Pro Lys Pro Glu Trp Arg Lys Leu Met Asp Glu Met Ala Val Val

                725                 730                 735

Ala Thr Glu Glu Tyr Arg Ser Val Val Val Lys Glu Ala Arg Phe Val

            740                 745                 750

Glu Tyr Phe Arg Ser Ala Thr Pro Glu Thr Glu Tyr Gly Arg Met Asn

        755                 760                 765

Ile Gly Ser Arg Pro Ala Lys Arg Arg Pro Gly Gly Gly Ile Thr Thr

    770                 775                 780

Leu Arg Ala Ile Pro Trp Ile Phe Ser Trp Thr Gln Thr Arg Phe His

785                 790                 795                 800

Leu Pro Val Trp Leu Gly Val Gly Ala Ala Phe Lys Phe Ala Ile Asp

                805                 810                 815

Lys Asp Val Arg Asn Phe Gln Val Leu Lys Glu Met Tyr Asn Glu Trp

            820                 825                 830

Pro Phe Phe Arg Val Thr Leu Asp Leu Leu Glu Met Val Phe Ala Lys

        835                 840                 845

Gly Asp Pro Gly Ile Ala Gly Leu Tyr Asp Glu Leu Leu Val Ala Glu

    850                 855                 860

Glu Leu Lys Pro Phe Gly Lys Gln Leu Arg Asp Lys Tyr Val Glu Thr

865                 870                 875                 880

Gln Gln Leu Leu Leu Gln Ile Ala Gly His Lys Asp Ile Leu Glu Gly

                885                 890                 895

Asp Pro Phe Leu Lys Gln Gly Leu Val Leu Arg Asn Pro Tyr Ile Thr

            900                 905                 910

Thr Leu Asn Val Phe Gln Ala Tyr Thr Leu Lys Arg Ile Arg Asp Pro

        915                 920                 925

Asn Phe Lys Val Thr Pro Gln Pro Pro Leu Ser Lys Glu Phe Ala Asp

    930                 935                 940

Glu Asn Lys Pro Ala Gly Leu Val Lys Leu Asn Pro Ala Ser Glu Tyr

945                 950                 955                 960

Pro Pro Gly Leu Glu Asp Thr Leu Ile Leu Thr Met Lys Gly Ile Ala

                965                 970                 975

Ala Gly Met Gln Asn Thr Gly

            980

Claims (15)

1.编码甘蔗磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的核酸分子，其选自下组：

(a)编码SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的蛋白质的核酸分子；

(b)SEQ ID NO：1中所示脱氧核苷酸序列或相应核糖核苷酸序列的核酸分子；

(c)与(a)或(b)中的核酸分子序列互补的核酸分子。

2.权利要求1所述的核酸分子，它是DNA或RNA分子。

3.含有权利要求1或2所述的核酸分子的载体。

4.权利要求3所述的载体，其中核酸分子可操作地与保证可翻译RNA在原核或真核细胞中转录和合成的调控元件相连。

5.权利要求3或4所述的载体，其是一种植物表达载体，该植物表达载体可使甘蔗pepc基因在C₃植物中有效表达。

6.用权利要求3-5中任何一项所述的载体所转化的宿主细胞或来源于这种细胞的细胞。

7.用权利要求3-5中任何一项所述的载体所转化的植物细胞或来源于这种细胞的细胞，其中所述的细胞具有C₄光合途径。

8.权利要求7所述的植物细胞，其中所述的植物是水稻。

9.由权利要求1或2的核酸分子编码的甘蔗磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。

10.一种制备具有C₄型光合途径的植物的方法，其特征在于，将权利要求3-5中任何一项的载体引入具有C₃型光合途径的植物，引入的核酸分子发挥作用从而为该植物提供C₄光合途径，使其具有更高的光合作用效率。

11.权利要求10所述的方法，其中所述的核酸分子自身带有完整的甘蔗启动子区序列。

12.权利要求10或11所述的方法，其中所述的具有C₃型光合途径的植物是水稻。

13.权利要求10或11所述的方法，其中核酸分子的导入是通过基因枪法或农杆菌转化来实现的。

14.权利要求1或2的核酸分子在C₃植物育种中的应用，其特征在于，该核酸分子的表达使C₃植物具有高光合效率。

15.权利要求14所述的应用，其特征在于，所述的C₃植物是水稻。

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