CN1298853C

CN1298853C - 耐缺铁性稻类的构建

Info

Publication number: CN1298853C
Application number: CNB008100047A
Authority: CN
Inventors: 森敏; 中西启仁; 高桥美智子; 西泽直子
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1999-07-05
Filing date: 2000-07-04
Publication date: 2007-02-07
Anticipated expiration: 2020-07-04
Also published as: US7259292B1; AU772529C; WO2001001762A1; KR20020009604A; JP2001017012A; EP1197139A1; EP1197139B1; EP1197139A4; AU772529B2; KR100454083B1; JP4084502B2; AU5572800A; CN1360466A

Abstract

本发明公开了即使在缺铁地区仍可生长的耐缺铁性禾本科植物，更具体而言，耐缺铁性且即使在石灰性碱性土壤中仍能旺盛生长的禾本科植物，其是通过将禾本科植物中麦根酸生物合成途径中的酶的基因转移到禾本科植物中来构建的。本发明还公开了构建具有改善的铁吸收性的禾本科植物的方法，其包括将麦根酸生物合成途径中的酶(优选烟酰胺氨基转移酶；NAAT)的基因转移到禾本科植物中。本发明亦公开了由上述方法构建的禾本科植物；栽培上述具有改善的铁吸收性的禾本科植物的方法；通过所述栽培获得的作物。即，耐缺铁性的新禾本科植物的构建。

Description

耐缺铁性稻类的构建

技术领域

本发明涉及耐缺铁性禾本科植物的生产方法、经此法获得的禾本科植物、种植所述禾本科植物的方法以及经此法获得的作物。

更具体而言，本发明涉及通过引入基因来生产耐缺铁性禾本科植物，其中所述基因编码禾本科植物的麦根酸(mugineic acid)合成途径中的酶，更优选所述酶是烟酰胺氨基转移酶。

背景技术

地球上90％的土壤是存在某种问题的不良土壤。通常，不良土壤根本性地和在一定程度上缺乏植物生长所必需的元素，因此，植物生长受阻，或者因土壤含有大量重金属而发生生长紊乱。典型的不良土壤是旱地盐积土(salt accumulated soil)。在这种土壤中，因人为漫灌或长期干旱而积聚了NaCl和Na₂CO₃，或者在表土层中积聚了CaCO₃或CaSO₄。盐成土引起盐密度紊乱，石灰性土壤引起缺铁紊乱。

地球上约30％的耕作土壤据说是潜在的缺铁地区(Wallence等(1960))。半干旱地区的石灰性土壤具有因毛细管效应从地心物质中洗脱出的石灰质成分，其积聚到地表面上。在此土壤中，pH升高成碱性，因此，土壤中的铁以Fe(OH)₃的形式存在并具有极低的溶解度。

在这些土壤中生长的植物由于低溶性铁具有缺铁失绿症，其生长受阻或者死亡。

高等植物的获铁体系分为两类：策略I体系和策略II体系。策略I体系是除禾本科植物外的高等植物的获铁体系，其中，土壤中不可溶的三价铁被存在于根部细胞表面上的三价铁还原酶还原，然后被二价铁转运蛋白吸附。在具有该体系的那些植物中，有些具有如下体系，其释放质子到根围中，通过降低根围的pH来增加三价铁还原酶的活性；有些具有如下体系，其释放酚类化合物到根围中，并通过Fe(III)-酚化合物螯合物来向细胞表面上的三价铁还原酶提供Fe(III)。近期的研究分离了二价铁转运蛋白IRT1(Eibe等(1996))，其特异性地出现在arabidopsis thaliana的根部，并分离了arabidopsis thaliana的三价铁还原酶的基因(Robinson等(1997))。

策略II体系是仅在单子叶植物中的禾本科植物中观察到的获铁体系。禾本科植物释放出在缺铁环境中具有三价铁螯合活性的麦根酸，并从根吸收作为“Fe(III)-麦根酸”复合体的铁(Takagi等(1984))。已知有7种麦根酸类(MA)：麦根酸(MA)、2’-脱氧麦根酸(DMA)、3-羟基麦根酸(HMA)、3-表羟基麦根酸(epiHMA)、燕麦蛋白酸(aveninacid；AVA)、distichon acid和表羟基脱氧麦根酸(epiHDMA)。如图1所示，所有这些麦根酸(MA)都是用甲硫氨酸作为前体合成的(Shojima等(1999)，Ma等(1998))。

麦根酸的分泌具有昼夜节律(Takagi等，同上)，在日出后其分泌达到顶峰，而在夜间不分泌。此外，观察到在缺铁性大麦根中在分泌前颗粒膨胀，在分泌后颗粒萎缩(Nishizawa等(1987))。因此相信，麦根酸是在所述颗粒中合成的。这些事实说明禾本科植物对缺铁作出的反应不仅是通过麦根酸的合成来形成的，而且还是通过一种复杂系统来形成的，所述复杂系统例如为缺铁信号的传递和根部形状的变化。

据报道，烟酰胺合成酶的基因已被分离且该基因是受缺铁诱导的，所述烟酰胺合成酶是一种与麦根酸合成途径相关的酶。(Higuchi等(1999))。此外，烟酰胺氨基转移酶(NAAT)基因已被分离且其是受缺铁诱导的(Takahashi等(1997))。

此外，通过使用从缺铁大麦根和对照大麦根中提取的mRNA进行示差筛选，分离了专一地在缺铁条件下被诱导出的基因Ids1、Ids2和Ids3。Ids1是编码金属硫蛋白的基因(Okumura等(1991))。Ids2是一个这样的基因，其中从其遗传序列推出的氨基酸序列与氢氧化酶是同源的(Okumura等(1994))。Ids3也是这样一个基因，其中从其遗传序列推出的氨基酸序列与氢氧化酶是同源的(Nakanishi等(1993))。在表羟基麦根酸合成途径中存在两种氢氧化物反应，相信催化该反应的酶是由此基因编码的。

此外，由大麦根缺铁所诱导的蛋白的例子是IDS3蛋白、腺嘌呤-核糖-磷酸转移酶(Itai等(1999))、甲酸脱氢酶(Suzuki等(1998))和36kDa蛋白(Irifune(1991))。禾本科植物在缺铁条件下生物合成麦根酸。此时，相信根部所含的甲硫氨酸减少，以便在甲硫氨酸循环中合成了甲硫氨酸，同时为了将产生的腺嘌呤转化成AMP，诱导出腺嘌呤-核糖-磷酸转移酶(Itai等，同上)。

甲酸脱氢酶分解在甲硫氨酸循环中产生的甲酸。据报道，缺铁性禾本科植物的根部中的线粒体变形，电子传输系统的能量降低(Mori等(1991))。相信甲酸脱氢酶是受缺铁产生的厌氧条件所诱导的，NADH是作为能量来源而被提供的。

随着人口的增加，食物增产是未来人类生存条件的一个重要的问题。从古代以来，禾本科植物就是最重要的食物之一，但是，事实上，禾本科植物很难在缺铁地区生长。如果有可能在缺铁地区种植禾本科植物，食物增产将是可能的，因此，其作为一种增加食物产量的办法已受到人们的关注。

发明公开

本发明的一个目的是提供可在缺铁地区生长的耐缺铁性禾本科植物。

更具体而言，本发明的一个目的是通过将禾本科植物的麦根酸生物合成途径中的一种酶的基因导入禾本科植物中来提供耐缺铁性禾本科植物，所述禾本科植物即使在石灰性碱性土壤中仍旺盛地生长。

本发明涉及通过将编码麦根酸生物合成途径中的酶的基因导入禾本科植物来生产具有改善的铁吸收性的禾本科植物的方法，更具体而言，涉及通过导入基因naat来生产具有改善的铁吸收性的禾本科植物的方法，其中所述酶是烟酰胺(nicotianamine)氨基转移酶(NAAT)。

此外，本发明涉及可通过上述方法生产的禾本科植物。具体而言，本发明涉及通过将编码麦根酸生物合成途径中的酶的基因导入禾本科植物而具有改善的铁吸收性的禾本科植物，更具体而言，涉及通过导入编码该酶的基因naat而具有改善的铁吸收性的禾本科植物，其中所述酶是烟酰胺氨基转移酶(NAAT)。

此外，本发明还涉及所述具有改善的铁吸收性的禾本科植物的生长方法，以及经所述生长获得的作物。

附图简述

图1显示了缺铁大麦根的麦根酸生物合成途径及其根围环境。

图2显示了用于禾本科植物转化的双元载体pIG121Hm的遗传序列，其中插入了naat-A的cDNA。

图3是照片而非图片，其中显示了通过Southern杂交方法检测所导入的基因的结果。图3中的WT显示了野生型禾本科植物的情况，对照显示了其中仅导入载体的对照禾本科植物。1-5、1-6、1-7、8-1和15-2显示了具有35S启动子的转化子。

图4显示了测量在水培溶液中在含铁(+Fe)和缺铁(-Fe)条件下培育的根中的NAAT活性的结果。在图4中，透明部分显示了+Fe的情况，阴影部分显示了-Fe的情况。WT显示了野生型禾本科植物，1-5、1-6和1-7显示的是转化子的情形。

图5是照片而非图片，其中显示了移植至碱性土8周后的各禾本科植物的生长状态，图5中的对照显示了其中仅导入载体的对照禾本科植物，右边的禾本科植物是被转化的禾本科植物。

图6是显示移植至碱性土后的各禾本科植物的高度变化过程的图。黑点显示了转化子15-2，黑正方形显示了转化子8-1，白点显示了其中仅导入载体的对照禾本科植物。

图7显示了包括分离的基因组naat的噬菌体DNA的限制性酶图谱。在图7中，E表示EcoRI，H表示HindIII，B表示BamHI，N表示NotI。在两个位置处的NotI位点是位于λFIXII臂上的NotI。

图8显示了用于禾本科植物转化的双元载体pBIGRZ1的遗传序列，其中插入了NAAT基因组的片段。在图8中，NPTII是卡那霉素抗性基因，HPT是潮霉素抗性基因，GUS是具有内含子的β葡糖醛酸糖苷酶基因，LacZ是β半乳糖苷酶基因，35P是35S启动子，NP是NOS启动子，NT是NOS终止子，MCS是多克隆位点，Riori是Ri质粒复制起点。

图9是显示所得基因组naat的碱基序列的图。

图10是显示通过比较naat cDNA序列和naat基因组序列而确定的naat碱基序列、naat-A和naat-B的5’上游、外显子、内含子和3’下游的碱基序列的图。在图10中，大写字母显示了在cDNA上转录的外显子部分，小写字母显示了其余的部分。

图11是所得基因组片段的示意图。在图11中，E是EcoRI，H是HindIII，B是BamHI。

图12显示了naat-A和naat-B的cDNA中的内含子的位置和大小。

图13显示了以单字母密码表示的从cDNA推定的NAAT-A的氨基酸序列的氨基酸。

图14显示了以单字母密码表示的从cDNA推定的NAAT-B的氨基酸序列的氨基酸。

图15是照片而非图片，其显示了移植至碱性土后10周的导入了基因组naat的各禾本科植物的生长状态，在图15中，对照是其中仅导入了载体的对照禾本科植物，右边的禾本科植物是用基因组naat转化的禾本科植物。

图16是显示移植至碱性土后的其中导入了基因组naat的各禾本科植物的高度变化过程的图。在图16中，左边的禾本科植物是用基因组naat转化的禾本科植物，右边的禾本科植物是其中仅导入了载体的对照禾本科植物。

发明的最佳实施方案

所述策略II是在单子叶植物中仅在禾本科植物中观察到获铁体系，其利用了生物合成并释放麦根酸的方法来获得铁。因此，研究了提高麦根酸生物合成途径(参见图1)中的酶的方法。

本发明人首先注意到了作为麦根酸合成途径中的一个酶的烟酰胺氨基转移酶(NAAT)，然后努力导入基因naat。奇迹般地发现导入了所述基因的禾本科植物即使在石灰性碱性土中仍能旺盛生长。

利用XbaI和SacI位点，将烟酰胺氨基转移酶(NAAT)naat-A的cDNA整合到pIG121Hm中，制备了图2中所示的双元载体。通过导入到农杆菌中，所得载体被用于转化。

禾本科植物的转化按照Hiei等的方法进行(Hiei等(1994))，并将“Tsukinohikari”用作所述材料。从胚盘中诱导出的愈伤组织沉浸入所述转入的农杆菌悬浮液中并在其中感染，获得再生体(T1植物)。最后，从种子获得34株经转化的禾本科植物。

通过Southern杂交方法检测所导入的基因。结果如图3所示。在图3中，WT显示了野生型禾本科植物的情况，对照显示了其中仅导入载体的对照禾本科植物。1-5、1-6、1-7、8-1和15-2显示了具有35S启动子的转化子。如图3所示，所有转化子具有过表达的naat-A。此外，发现在这些35S转化的禾本科植物中，8-1和15-2分别具有所导入naat的至少5个拷贝和2个拷贝。

与野生型和其中仅导入载体的禾本科植物相比，导入了基因naat的禾本科植物被认为存在烟酰胺氨基转移酶(NAAT)的过度释放，由此，麦根酸合成途径被激活，从而大量产生对于铁摄取所必需的麦根酸。

因此，首先研究了这些植物种中的NAAT活性。发芽后3周的幼苗(T2)在水培溶液中在含铁(+Fe)和缺铁(-Fe)条件下培育2周。NAAT活性的测量结果如图4所示。在图4中，透明部分显示了+Fe的情况，阴影部分显示了-Fe的情况。WT显示了野生型禾本科植物的情况，1-5、1-6和1-7显示了转化子的情况。

结果，对于+Fe和-Fe两种情况，经转化的禾本科植物比非转化的野生型禾本科植物(WT)具有较高的比活，此外，还发现在-Fe条件下所述比活进一步增加。这说明基因导入不仅导致了高NAAT活性，而且在缺铁条件或不可溶性铁的条件下转化子的NAAT活性得以显著促进。换言之，认为它已成为对缺铁环境或不可溶性铁的环境具有高耐受性的物种。

基于以上描述，发现基因naat的导入提高了NAAT的活性。尽管如此，仍调查了这些转化子是否能在实际缺铁土壤中生长。当将35S-naat-A转化的禾本科植物移植至不溶性铁条件的碱性土后，其叶子在移植后至多2周内变黄，然而，在4-5周后，新叶子变成暗绿色并开始恢复。图5是显示移植至碱性土8周后的生长状态的照片。在图5中，对照显示了其中仅导入载体的对照禾本科植物，右边的禾本科植物是经转化的禾本科植物。发现与对照相比，经转化的禾本科植物具有显著较好的生长。此外，在图6中显示了移植至碱性土后的各禾本科植物的高度变化过程。在图6中，Y轴显示植物的高度(cm)，X轴显示其移植至碱性土后的天数。黑点显示转化子15-2，黑正方形显示转化子8-1，白点显示其中仅导入载体的对照禾本科植物。

如上所述，35S转化的禾本科植物8-1具有所导入naat基因的至少5个拷贝，35S转化的禾本科植物15-2具有所导入naat基因的至少2个拷贝。从图6中的植物高度判断，基因的拷贝数是不相关的，表示只要导入了所述基因，禾本科植物就获得了耐缺铁性。

如上所述，所述基因的导入提高了禾本科植物的麦根酸合成途径中的酶的活性，此外还发现由此附加了耐缺铁性。

对于在本发明麦根酸合成途径中的酶，只要其是图1所示麦根酸生物合成途径中的酶且编码所述酶基因的导入增加其活性，就是可接受的。如上所述，在候选物中，烟酰胺氨基转移酶(NAAT)和烟酰胺合成酶是可取的。编码本发明禾本科植物的麦根酸合成途径中的酶的基因是cDNA或从基因组衍生的基因。如下文所述，基因组的应用是本发明的优选实例。

因此，对于本发明的禾本科植物，只要其是可经策略II体系吸收铁的植物就是可接受的，且不限于理论意义上的禾本科植物。本发明禾本科植物的优选实例是稻类植物、玉米、高粱、小麦、大麦和燕麦。这些禾本科植物可应用本发明的方法而不论其品种，并可生产出具有所导入的靶基因的禾本科植物。

本发明的启动子不受限制，只要其可产生靶酶。可使用35S启动子，更具体而言，可使用CaMV35S启动子。

本发明的载体不受具体的限制，只要其可在转化过程中被优选使用。本发明转化方法不限于所述使用农杆菌方法的方法，可使用多种(例如，使用粒子枪)的转化方法等。所形成的禾本科植物的细胞不限于来自所述愈伤组织的细胞，可使用各种细胞，但是，通常优选使用来自愈伤组织的细胞。

本发明所述及的缺铁性可以是其中缺乏铁的一种状态，但是优选其是这样一种状态，其中铁的存在形式很难被植物吸收，根据植物的类型，可确定其缺铁与否。因此，本发明中的耐缺铁性的定义是指受测植物对很难吸收土壤中的铁这一困难环境的抵抗力。

然后，本发明人努力将大麦的基因组naat代替naat的cDNA来进行导入。

对于基因组naat，使用利用从大麦(Horudeum vulgare L.var.Igri)中提取的基因组DNA来制备的文库(由Stratagen Corp.生产)。利用限制性酶Sau3AI部分切割所述文库，并将其导入λFIXII载体的XhoI位点。对于探针，使用提前分离的naat-A的完整cDNA。将大肠杆菌XL1-Blue MRA(大肠杆菌XL1-Blue MRA(P2))用作宿主。

作为筛选的结果，获得了5个噬菌体。从中分离了各噬菌体DNA，并进行限制性酶作图。发现在所有情况下相同的片段增加。即，发现所得的5个噬菌体来自基因组的相同部分。其被认为含有在探针中使用的naat。因此，测定其中之一的碱基序列，如图7所示。

图7所示的噬菌体DNA被插入到质粒载体pBIGRZ1的NotI位点，其中可插入10kb或更大的片段，可使用农杆菌进行禾本科植物的转化(参见图8)。

此外，将图7所示的至多11.0kb的片段分成4部分，即A-D，将它们导入质粒载体pBluescript SK(-)的EcoRI位点(B、C)或NotI和EcoRI位点(A、D)。

对于片段A-D，使用基于质粒上的序列的引物(M13正向引物，M13反向引物)从片段的两端确定了碱基序列。为了确定DNA碱基序列，使用Shimadzu，Ltd.的DNA测序仪DSQ-2000L。

序列测定详见实施例。

序列表中的SEQ ID NO：1显示了所确定的10966bp碱基序列。此外，完整序列如图9所示(无碱基编号)。

基于所得的碱基序列，该10966bp基因被发现是编码所获得的naat-A和naat-B的大麦基因组的片段。其位次为naat-B、naat-A。

图10中显示了通过cDNA比较确定的naat-A和naat-B的5’上游、外显子、内含子和3’下游。在图10中，大写字母显示了在cDNA上转录的外显子部分，小写字母显示了其余的部分。外显子部分的碱基编号见下。

图11是所得基因组片段的示意图。外显子部分以阴影部分表示。两个基因均包含6个内含子和7个外显子。此外，内含子的插入位置对于各基因是同源的。图12显示了内含子在cDNA中的位置和内含子的大小。

由cDNA推定的naat-A和naat-B的氨基酸序列分别如图13和14所示。

按照所述35S转化的禾本科植物的转化方法来进行禾本科植物的转化，其中将所得的大麦基因组naat导入。

然后，对导入所得基因组naat的禾本科植物的耐缺铁性进行检查。在所得的再生体(T1)中，使用了39个植株和15个其中仅导入载体的对照，以与35S转化的植物相似的方法进行检查。从移植后第5周起，每周或隔周测量植物的高度。每4-5周将它们两次移植至其中土壤尺寸渐增的罐中。

到移植至碱性土后第2周，经转化的具有基因组naat的禾本科植物的叶子变黄，但在第4-5周，新叶子变成暗绿色并开始恢复，然后他们开始旺盛生长。与此相比，其中仅导入载体的对照组在很长的时间内带有黄叶，从约第8周，新叶开始变绿。

图15是显示移植至碱性土后第10周的禾本科植物的生长状态的照片。图15中的对照显示的是其中仅导入了载体的对照禾本科植物。右边的禾本科植物是用基因组naat转化的禾本科植物。

图16显示移植至碱性土后的禾本科植物的高度变化过程。在图16中，Y轴显示植物的高度(cm)，X轴显示其移植至碱性土后的天数。在图16中，左边的禾本科植物是用基因组naat转化的禾本科植物，右边的禾本科植物是其中仅导入了载体的对照禾本科植物。

基于以上描述，发现基因组naat的导入使得禾本科植物具有附加的耐缺铁性。

实施例

使用以下实施例对本发明进行详细地描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例I：禾本科植物的转化方法，其中存在具有CaMV35S启动子的过表达的Naat。

图2所示的双元载体是通过使用XbaI和SacI位点将遗传naat的cDNA整合到pIGl21Hm中来制备的。将这些载体导入农杆菌中用于转化。

禾本科植物的转化按照Hiei等的方法进行(Hiei等(1994))，并将“Tsukinohikari”用作所述材料。首先，带壳种子灭菌，在包含N6无机盐、30g/L N6维生素、2mg/L蔗糖，2，4-D和2g/L脱乙酰吉兰糖胶的愈伤组织诱导性培养基(pH 5.8)上的种子在25℃下在60μmol/m²s和16小时光照/8小时避光条件下培养3周，从胚盘中诱导出愈伤组织。

在愈伤组织移植到新的培养基中在25℃下在光亮处培养3天后，用农杆菌悬浮液培养基(pH5.8)(20g/L AA无机盐、氨基酸、B5维生素、2mg/L蔗糖、0.2mg/L 2，4-D、10mg/L细胞分裂素和乙酰丁香酮)使愈伤组织沉浸入农杆菌悬浮液中。然后，在用纸巾使其变干后，其在共存培养基(pH5.2)(30g/L N6无机盐和N6维生素、10g/L蔗糖、2mg/L葡萄糖、10mg/L 2，4-D和2g/L乙酰丁香酮脱乙酰吉兰糖胶)中在暗处于28℃感染3天。

然后，通过用含500mg/L Claforan的无菌洗涤溶液漂洗来去除农杆菌，将愈伤组织放置到含50mg/L潮霉素(pH5.8)的选择性培养基中(30g/L N6无机盐和N6维生素、2mg/L蔗糖、2g/L 2，4-D、500mg/L脱乙酰吉兰糖胶、50mg/L Claforan和潮霉素)，并在25℃下在光亮处培养3周。

培养后，将其转移到再分化培养基(pH5.8)中(30g/L MS无机盐和MS维生素、30g/L蔗糖、2g/L山梨糖醇、1mg/L水解酪蛋白氨基酸、2mg/L NAA、500mg/L BAP、50mg/L Claforan、4g/L潮霉素和脱乙酰吉兰糖胶)，将在3-5周内被再分化的再生体(T1植物)转移至检查培养基。检查培养基(pH5.8)包含30g/L MS无机盐和MS维生素、50mg/L蔗糖、8g/L潮霉素和琼脂。

将生长至充满培养皿的植物定植(establish)4-5天，转移至混有1∶1比例的合成培养土(BONSOL 1，Sumitomo Chemical Co.，Ltd.)和蛭石的土壤中，获取种子。从而获得34株经转化的禾本科植物。

实施例2：使用Southern杂交方法检测所导入的基因

研磨在实施例1中获得的T1植物的叶子，通过改进的C-TAB方法提取基因组。用Hind III处理所提取的基因组，通过使用0.8％琼脂糖凝胶电泳来进行分离。将这些印迹到尼龙膜上。使用在探针上的naat内部序列产生的引物，以及通过PCR用³²P标记的探针，进行杂交。然后使用BAS 2000(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)检测条带。

Southern杂交方法的结果如图3所示。在图3中，WT显示野生型禾本科植物，对照显示其中仅导入载体的对照禾本科植物。1-5、1-6、1-7、8-1和15-2是其中具有35S启动子的naat-A过表达的禾木科植物的情况。

基于图3所示的结果，发现在35S转化的禾本科植物中，至少5个naat拷贝和至少2个naat拷贝被分别引入到8-1和15-2中。

实施例3：使用碱性土检查耐缺铁性

使用包括以下组合物的古壳层土(fossil shell soil)作为样品土。

水含量 0.48％

总磷酸盐 0.12％

总钾 0.12％

总硅酸盐 22.79％

总石灰 37.82％

总镁 0.91％

总锰 0.018％

总硼 0.003％

碱 38.80％

盐酸不溶性物质 28.88％

氧化铁 0.99％

氧化铝 5.59％

锌 0.002％

所述土壤中的可溶性铁含量是2.2ppm，pH是8.78，电阻是0.03mΩ。

如下进行对35S转化的植物的检查，首先，从该转化的植物的再生体(T1)获得的种子播种在含50mg/L的MS固体培养基上并进行筛选，在它们定植后，使用生长到20-25cm的幼苗植物(T2)。

对27个品种的34株植物中的16个进行耐缺铁性检查。检查方法如下：将纸巾和滤纸剪成圆形，并放置到塑料黑罐(0.5L)的底部，用碱性土添满。将植物转移到罐中，然后从罐底部放入位于罐底2-3cm处的水培溶液(Kasugai溶液：7×10^-4M K₂PO₄，1×10^-4M KCl，1×10^-4M KH₂PO₄，2×10^-3M Ca(NO₃)₂，5×10^-4M MgSO₄，1×10^-5M H₃BO₃，5×10^-7M MnSO₄，5×10^-7M ZnSO₄，2×10^-4M CuSO₄，1×10^-8M(NH₄)₃MoO₂₄，1.5×10^-4M Fe-EDTA)中，在温室中生长，白天30℃，夜晚25℃。将碱性土在3-4周后增加至1L，在8-9周后增加至2L并转移。从移植后第2周，每周或隔周测量植物高度。

对在+Fe(铁存在)或-Fe(缺铁)水培溶液中生长的经转化的禾本科植物(35S-naat禾本科植物)的NAAT比活的测量如下进行。发芽后3周的幼苗植物(T2)在+Fe和-Fe水培溶液中生长两周，测量各植物根部的NAAT活性。结果如图4所示。在图4中，透明部分显示了+Fe的情况，阴影部分显示了-Fe的情况。WT显示了野生型禾本科植物的情况，1-5、1-6和1-7显示了转化子的情况。

对于+Fe和-Fe两种情况，经转化的禾本科植物比非转化的野生型(WT)禾本科植物具有较高的比活，在-Fe条件下其比活甚至更高(参见图4)。

实施例4：使用碱性土检查耐缺铁性

将35S-naat-A转化的禾本科植物转移至碱性土并观察其生长情况。

35S-naat-A转化的禾本科植物叶子变黄，直至移植后第二周，然而，在第4-5周，新叶子变成暗绿色并开始恢复。因此发现naat的导入使禾本科植物具有耐缺铁性。

图5是显示移植至所述土壤8周后的禾本科植物的生长状态的照片。在图5中，对照显示了其中仅导入载体的对照禾本科植物，右边的禾本科植物是经转化的禾本科植物。

图6是显示移植至碱性土后的禾本科植物的高度变化过程的图。在图6中，Y轴显示植物的高度(cm)，X轴显示其移植至碱性土后的天数。黑点显示转化子15-2，黑正方形显示转化子8-1，白点显示其中仅导入载体的对照禾本科植物。

发现通过导入基因naat，可给禾本科植物添加耐缺铁性(参见图5和6)。

实施例5：分离naat-A和B基因组克隆

按照“Cloning and Sequence”(Nosonbunka)进行筛选。

将从Srtratagene Corp.购买的λFIXII文库用作文库。其是使用从大麦(Horudeum vulgare L.var.Igri)提取的基因组DNA制备的。基因组DNA用限制性酶Sau3AI部分切割并导入λFIXII载体的XhoI位点。文库的插入片段大小是9-23kb。

(1)大肠杆菌(XL1-BLUE MRA(P2))在NZCYM液体培养基(10gNZ胺、5g NaCl、1g水解酪蛋白氨基酸、5g细菌用酵母抽提物、2gMgSO₄7H₂O和约6mL 1N NaOH用1L蒸馏水(pH 7.5)稀释并用高压灭菌)中培养过夜，然后离心，然后悬浮在20mL 10mM MgSO₄溶液中。

(2)100mL的该大肠杆菌悬浮液和100mL的噬菌体稀释液(其量在筛选平板(9cm×13cm)上产生25,000个噬斑进行混合，37℃放置20分钟，然后与8mL的50℃0.7％上层琼脂(每100mL加入0.7g琼脂糖)混合，并播种到筛选板上(9cm×13cm)。板放置在37℃，然后培养直至噬斑大小达到0.5mm。

(3)将尼龙膜HYBOND-N(Amersham Corp.)剪成板的大小，然后放置到上层琼脂糖的上部30秒。将其放到用变性液(0.5M NaOH、1.5MNaCl)浸过的滤纸上，并使表面与噬斑的上面接触。将另一膜放置到上层琼脂上，放置1分钟。类似地，将其放到用变性液浸过的滤纸上。在放置5分钟后，将第二个膜移至用中和液(0.5M Tris-HCl，pH 8.0，1.5MNaCl)浸过的滤纸上。在放置5分钟后，用2xSSPE(0.02M NaH₂PO₄ pH7.4、0.3M NaCl、2mM EDTA)充分洗涤两次，然后干燥。

(4)为了使用提前分离的naat-A的全长cDNA作为探针，将位于质粒载体pYH23的HindIII位点和NotI位点上的那些切下并纯化。使用随机引物DNA标记试剂盒VER.2(Takara Shuzo CO.，Ltd))用[α^-32P]dATP对其进行标记。

用预热至65℃的30mL杂交缓冲液(6x SSPE、5x Denhart溶液、0.1％SDS、100mg/mL已变鲑精DNA)在65℃进行预杂交1小时，然后更换为杂交缓冲液(25mL)。

将上述探针加入该溶液中，在65℃杂交12小时。膜用预热至65℃的清洗液(5x SSPE)清洗两次，共10分钟，用65℃的高度严格清洗液(2XSSPE、0.1％SDS)清洗一次。膜用莎伦包装膜包裹，过夜显影至成像板(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)，用影像分析仪(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)获得结果。

使用的试剂为20X SSPE(0.2M NaH₂PO₄ pH 7.4、3M NaCl和20mM EDTA)、50x denhart溶液、5g FICOLL 400、5g聚乙烯吡咯烷酮(MW 360,000)和5g小牛血清白蛋白，其溶解在500mL蒸馏水中，用0.45mm滤器过滤。

(5)将在两种膜上均出现噬斑的情况确定为阳性，将与所述位置相符的噬斑从培养皿中切下。将切下的噬斑放入SM溶液(50mM Tris-HClpH7.5、0.1M NaCl、7mM MgSO₄和0.01％明胶)，并在4℃下保存。然后，使用该噬菌体溶液以相似的方法进行第二和第三次筛选。最后，得到5个噬菌体。

分离上述获得的5个噬菌体中的每一个的DNA，并进行限制性酶作图。发现对于所有情况，相同的片段增加。即，发现所得的5个噬菌体来自基因组的相同部分。此外，其被认为含有用于探针的naat。因此，测定其中之一的碱基序列，如图7所示。在图7中，E表示EcoRI，H表示HindIII，B表示BamHI，N表示NotI。在两个位置处的NotI位点是位于λFIXII臂上的NotI。

实施例6：亚克隆化和碱基序列的确定

(1)图7所示的噬菌体DNA被插入到质粒载体pBIGRZ1的NotI位点，其中可插入10kb或更大的片段，可使用农杆菌进行禾本科植物的转化。将第1个NotI位点至图7所示噬菌体DNA 11.0kb处的NotI位点的11.0kbp片段切下并插入质粒载体pBIGRZ1的NotI位点(参见图8)。在图8中，NPTII是卡那霉素抗性基因，HPT是潮霉素抗性基因，GUS是具有内含子的β葡糖醛酸糖苷酶基因，LacZ是β半乳糖苷酶基因，35P是35S启动子，NP是NOS启动子，NT是NOS终止子，MCS是多克隆位点，Riori是Ri质粒复制起点。

换言之，确定了该11.0kb片段的碱基序列。对于其余禾本科植物的转化，使用由此产生的构建体。

(2)pBIGRZ1稳定地维持在大肠杆菌(XL1-BLUE)中。对含有该构建体的大肠杆菌进行培养，使用质粒调节剂PI-50α(KurashikiBoseki Co.，Ltd.)从中提取质粒。

(3)将图7所示至多11.0kb的片段分成4部分，即A-D，将它们导入质粒载体pBluescript SK(-)的EcoRI位点(B、C)或NotI和EcoRI位点(A、D)。

(4)对于片段A-D，使用基于质粒上的序列的引物(M13正向引物，M13反向引物)从片段的两端确定碱基序列。使用Shimadzu，Ltd.的DNA测序仪DSQ-2000L来确定DNA碱基序列。

(5)对各片段确定对碱基序列的上述部分进行进一步读码的引物并制备该引物，制备用于证实已读序列的反向引物，依次确定碱基序列。最后，从5’和3’端双向确定所有片段的序列。用于确定各片段碱基序列的引物序列如下所示。

为应用于DSQ-2000L，用异硫氰酸荧光素FITC在5’端标记这些引物。

片段A的引物

名称：序列F-A1F：FITC-5′-gct act agt agt att cct ggt gta g

名称：序列F-A1R：FITC-5′-gga gta cta cta gac tac acc agg a

名称：序列F-A2F：FITC-5′-aca tgc gca tgc atg aat tgc cg

名称：序列F-A2R：FITC-5′-caa ttc atg cat gcg cat gtg cc

片段B的引物

名称：序列F-B1F：FITC-5′-ggt caa gta tgc agt atg ttg gaa c

名称：序列F-B1R：FITC-5′-gtt cca aca tac tgc ata ctt gac c

名称：序列F-B2F：FITC-5′-cta gaa gcc tat gga tgt ttc ttt tgg

名称：序列F-B2R：FITC-5′-cca aaa gaa aca tcc ata ggc ttc tag

名称：序列F-B3F：FITC-5′-agt tct tat caa ttt ccg aga tga c

名称：序列F-B3R：FITC-5′-ata gtc atc tcg gaa att gat aag a

名称：序列F-B4F：FITC-5′-agt ggt cac cat gcg gac caa cac c

名称：序列F-B4R：FITC-5′-ggt gtt ggt ccg cat ggt gac cac t

片段C的引物

名称：序列F-C1F：FITC-5′-cac cgg cca gtt caa ctg cta cgc

名称：序列F-C1R：FITC-5′-gcg tag cag ttg aac tgg ccg gtg

名称：序列F-C2F：FITC-5′-ttt gga gga gat cca tga cga cat a

名称：序列F-C2R：FITC-5′-tat gtc gtc atg gat ctc ctc caa a

名称：序列F-C3F：FITC-5′-tct tct cat atg cta ctg tgg gga t

名称：序列F-C3R：FITC-5′-tga cat gca aca cag gga cat gag c

片段D的引物

名称：序列F-D1F：FITC-5′-cat gct gac gaa gag cga ggt cat a

名称：序列F-D1R：FITC-5′-ccc agg ata tga cct tag tgg ttg g

(6)对于不能完全确定的序列部分，使用ABI PRISMTM 310基因分析仪，新合成了以下引物，所述分析仪是PerkinElmer Japan，Inc.的自动DNA测序仪。

片段B的引物

名称：序列B5F：5′-gaa tgg caa act ggg tcc gca tta c

名称：序列B5R：5′-gta atg cgg acc cag ttt gcc att c

名称：序列B6F：5′-ctg gtt gtt gtg gcc tgg acg aaa c

名称：序列B6R：5′-gtt tcg tcc agg cca caa caa cca 9

名称：序列B7F：5′-agc aca aac cct acc tat gtt agg c

名称：序列B7R：5′-gcc taa cat agg tag ggt ttg tgc t

片段C的引物

名称：序列C4F：5′-tgg aat ttc gcc cgg ggc aag gac

名称：序列C4R：5′-ccc tgt gac aag tgc tct gct acg

名称：序列C5F：5′-tct ggg atc tca gtg cat cca aca

名称：序列C5R：5′-gaa gca tat atc agt caa aca taa cc

此外，为确定片段A和B间以及片段B和C间的连接区，制备了以下引物。使用PerkinElmer Japan，Inc.的自动DNA测序仪ABIPRISMTM 310基因分析仪确定了在(1)中所制备的构建体的碱基序列。

对于片段A和B间的边界区

名称：序列A-eF：5′-cac atc ctt tgc ctt gct gaa tat gg

名称：序列B-tR：5′-cag tag tac taa tta atc acc tta gta gc

对于片段B和C间的边界区

名称：序列B-eF：5′-caC gat caa cca aag aat gtc ctc c

名称：序列C-tR：5′-tac ttg tat atgcag ctc cag cac

(7)已确定的10,966bp碱基序列在序列表中SEQ ID NO：1已显示。完整的序列参见图9(无碱基编号)。

基于所得的碱基序列，发现这10,966bp基因是迄今获得的编码naat-A和naat-B的大麦基因组的片段。次序是naat-B和naat-A。

图10中显示了通过与所示cDNA比较得以确定的naat-A和naat-B的5’上游、外显子、内含子和3’下游。在图10中，大写字母表示在cDNA上转录的外显子，小写字母代表其余的部分。外显子部分的碱基编号如下。

naat-B

第1外显子579-1299(起始密码子6518)

第2外显子1483-1825

第3外显子1922-2140

第4外显子2244-2303

第5外显子2761-2916

第6外显子3263-3356

第7外显子3735-4033(终止密码子3868)

naat-A

第1外显子6457-6897(起始密码子6518)

第2外显子7029-7371

第3外显子7479-7697

第4外显子7784-7843

第5外显子8285-8440

第6外显子8738-8831

第7外显子9414-9732(终止密码子9547)

示意图如图11所示。阴影部分为外显子部分。两个基因均是由6个内含子和7个外显子形成的。此外，内含子的插入位置是同源的。图12显示了在cDNA中插入内含子的位置和插入内含子的大小。图13和14显示了由cDNA推定的naat-A和naat-B的氨基酸序列。

实施例7：导入大麦基因组naat的禾本科植物的转化方法

除了以下(1)至(3)点之外，以与35S转化的禾本科植物相似的方式实施上述实施例6中获得的大麦基因组naat导入禾本科植物的转化方法。

(1)愈伤组织的诱导在28℃在暗处进行，愈伤组织诱导培养基包含0.3g/L N6无机盐和N6维生素、30g/L水解酪蛋白氨基酸、2mg/L蔗糖、2.8g/L 2，4-D、4g/L脯氨酸和脱乙酰吉兰糖胶(pH5.8)。

(2)其用农杆菌在25℃感染，共存培养基包含30g/L N6无机盐和N6维生素、10g/L蔗糖、1g/L葡萄糖、2mg/L水解酪蛋白氨基酸、20mg/L

2，4-D、2g/L乙酰丁香酮和脱乙酰吉兰糖胶(pH5.2)。该过程是通过滤纸敷在上面而进行。

(3)选择时，使用选择培养基，第1周含10mg/L潮霉素，第2周含30μg/L潮霉素，最后2周含50mg/L潮霉素，在28℃下在暗处培养。

使用包含1g/L N6无机盐和N6维生素、水解酪蛋白氨基酸、30g/L蔗糖、2mg/L 2，4-D、250mg/L Claforan、10-50mg/L潮霉素和2g/L脱乙酰吉兰糖胶(pH5.8)的选择培养基，使用包含30g/L MS无机盐和MS维生素、30g/L蔗糖、30g/L山梨糖醇、2g/L水解酪蛋白氨基酸、1.1g/LMES、2mg/L NAA、1mg/L细胞分裂素、250mg/L CLAFORAN、50mg/L潮霉素和4g/L脱乙酰吉兰糖胶(pH5.8)的再分化培养基，在28℃培养。实施例8：检查具有所导入的基因组Naat的禾本科植物的耐缺铁性

以与35S转化的植物相似的方式，对所得再生体(T1)中具有所导入的基因组Naat的禾本科植物的39个植株和15个仅导入载体的对照进行检查，检查它们的耐缺铁性。从移植后的第5周起，每周或隔周测量植物的高度。每4-5周将它们两次转移到土壤尺寸渐增的罐中。

到移植至碱性土后第2周，经转化具有基因组naat的禾本科植物的叶子变黄，但在第4-5周，新叶子变成暗绿色并开始恢复，然后他们开始旺盛生长。与此相比，其中仅导入载体的对照组在很长的时间内带有黄叶，从约第8周，新叶开始变绿。基于这一事实，发现naat的导入使禾本科植物具有耐缺铁性(参见图15和16)。

图15是显示移植至碱性土后第10周的禾本科植物的生长状态的照片。

图15中的对照显示了其中仅导入了载体的对照禾本科植物。右边的禾本科植物是用基因组naat转化的禾本科植物。

图16显示移植至碱性土后的禾本科植物的高度变化过程。在图16中，Y轴显示植物的高度(cm)，X轴显示其移植至碱性土后的天数。在图16中，左边的禾本科植物是用基因组naat转化了的禾本科植物，右边的禾本科植物是其中仅导入了载体的对照禾本科植物。

基于这一事实，发现naat的导入使禾本科植物的耐缺铁性增强。

工业实用性

本发明提供了具有耐缺铁性的新禾本科植物，并提供了可在缺铁栽培区生长的新禾本科植物。

此外，本发明提供了可通过向禾本科植物中导入编码麦根酸合成途径中的酶的基因来获得的具有改善的铁吸收性的禾本科植物的新技术。

序列表

<110>科学技术振兴事业团(Japan Science and Technology Corporation)

<120>耐缺铁性稻类的构建(Construction of rice tolerant to iron deficiency)

<130>SCT011604-09

<140>PCT/JP00/04425

<141>2000-07-04

<150>JP11-190318

<151>1999-07-05

<160>37

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>461

<212>PRT

<213>Hordeum vulgare

<220>

<221>

<223>NAAT-A

<400>1

Met Val His Gln Ser Asn Gly His Gly Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala

1 5 10 15

Asn Gly Lys Ser Asn Gly His Ala Ala Ala Ala Asn Gly Lys Ser Asn

20 25 30

Gly His Ala Ala Ala Ala Ala Val Glu Trp Asn Phe Ala Arg Gly Lys

35 40 45

Asp Gly Ile Leu Ala Thr Thr Gly Ala Lys Asn Ser Ile Arg Ala Ile

50 55 60

Arg Tyr Lys Ile Ser Ala Ser Val Glu Glu Ser Gly Pro Arg Pro Val

65 70 75 80

Leu Pro Leu Ala His Gly Asp Pro Ser Val Phe Pro Ala Phe Arg Thr

85 90 95

Ala Val Glu Ala Glu Asp Ala Val Ala Ala Ala Leu Arg Thr Gly Gln

100 105 110

Phe Asn Cys Tyr Ala Ala Gly Val Gly Leu Pro Ala Ala Arg Ser Ala

115 120 125

Val Ala Glu His Leu Ser Gln Gly Val Pro Tyr Lys Leu Ser Ala Asp

130 135 140

Asp Val Phe Leu Thr Ala Gly Gly Thr Gln Ala Ile Glu Val Ile Ile

145 150 155 160

Pro Val Leu Ala Gln Thr Ala Gly Ala Asn Ile Leu Leu Pro Arg Pro

165 170 175

Gly Tyr Pro Asn Tyr Glu Ala Arg Ala Ala Phe Asn Lys Leu Glu Val

180 185 190

Arg His Phe Asp Leu Ile Pro Asp Lys Gly Trp Glu Ile Asp Ile Asp

195 200 205

Ser Leu Glu Ser Ile Ala Asp Lys Asn Thr Thr Ala Met Val Ile Ile

210 215 220

Asn Pro Asn Asn Pro Cys Gly Ser Val Tyr Ser Tyr Asp His Leu Ala

225 230 235 240

Lys Val Ala Glu Val Ala Arg Lys Leu Gly Ile Leu Val Ile Ala Asp

245 250 255

Glu Val Tyr Gly Lys Leu Val Leu Gly Ser Ala Pro Phe Ile Pro Met

260 265 270

Gly Val Phe Gly His Ile Ala Pro Val Leu Ser Ile Gly Ser Leu Ser

275 280 285

Lys Ser Trp Ile Val Pro Gly Trp Arg Leu Gly Trp Val Ala Val Tyr

290 295 300

Asp Pro Thr Lys Ile Leu Glu Lys Thr Lys Ile Ser Thr Ser Ile Thr

305 310 315 320

Asn Tyr Leu Asn Val Ser Thr Asp Pro Ala Thr Phe Val Gln Glu Ala

325 330 335

Leu Pro Lys Ile Leu Glu Asn Thr Lys Ala Asp Phe Phe Lys Arg Ile

340 345 350

Ile Gly Leu Leu Lys Glu Ser Ser Glu Ile Cys Tyr Arg Glu Ile Lys

355 360 365

Glu Asn Lys Tyr Ile Thr Cys Pro His Lys Pro Glu Gly Ser Met Phe

370 375 380

Val Met Val Lys Leu Asn Leu His Leu Leu Glu Glu Ile His Asp Asp

385 390 395 400

Ile Asp Phe Cys Cys Lys Leu Ala Lys Glu Glu Ser Val Ile Leu Cys

405 410 415

Pro Gly Ser Val Leu Gly Met Glu Asn Trp Val Arg Ile Thr Phe Ala

420 425 430

Cys Val Pro Ser Ser Leu Gln Asp Gly Leu Glu Arg Val Lys Ser Phe

435 440 445

Cys Gln Arg Asn Lys Lys Lys Asn Ser Ile Asn Gly Cys

450 455 460

<210>2

<211>551

<212>PRT

<213>Hordeum vulgare

<220>

<221>

<223>NAAT-B

<400>2

Met Ala Thr Val Arg Gln Ser Asp Gly Val Ala Ala Asn Gly Leu Ala

1 5 10 15

Val Ala Ala Ala Ala Asn Gly Lys Ser Asn Gly His Gly Val Ala Ala

20 25 30

Ala Val Asn Gly Lys Ser Asn Gly His Gly Val Asp Ala Asp Ala Asn

35 40 45

Gly Lys Ser Asn Gly His Gly Val Ala Ala Asp Ala Asn Gly Lys Ser

50 55 60

Asn Gly His Ala Glu Ala Thr Ala Asn Gly His Gly Glu Ala Thr Ala

65 70 75 80

Asn Gly Lys Thr Asn Gly His Arg Glu Ser Asn Gly His Ala Glu Ala

85 90 95

Ala Asp Ala Asn Gly Glu Ser Asn Glu His Ala Glu Asp Ser Ala Ala

100 105 110

Asn Gly Glu Ser Asn Gly His Ala Ala Ala Ala Ala Glu Glu Glu Glu

115 120 125

Ala Val Glu Trp Asn Phe Ala Gly Ala Lys Asp Gly Val Leu Ala Ala

130 135 140

Thr Gly Ala Asn Met Ser Ile Arg Ala Ile Arg Tyr Lys Ile Ser Ala

145 150 155 160

Ser Val Gln Glu Lys Gly Pro Arg Pro Val Leu Pro Leu Ala His Gly

165 170 175

Asp Pro Ser Val Phe Pro Ala Phe Arg Thr Ala Val Glu Ala Glu Asp

180 185 190

Ala Val Ala Ala Ala Val Arg Thr Gly Gln Phe Asn Cys Tyr Pro Ala

195 200 205

Gly Val Gly Leu Pro Ala Ala Arg Ser Ala Val Ala Glu His Leu Ser

210 215 220

Gln Gly Val Pro Tyr Met Leu Ser Ala Asp Asp Val Phe Leu Thr Ala

225 230 235 240

Gly Gly Thr Gln Ala Ile Glu Val Ile Ile Pro Val Leu Ala Gln Thr

245 250 255

Ala Gly Ala Asn Ile Leu Leu Pro Arg Pro Gly Tyr Pro Asn Tyr Glu

260 265 270

Ala Arg Ala Ala Phe Asn Arg Leu Glu Val Arg His Phe Asp Leu Ile

275 280 285

Pro Asp Lys Gly Trp Glu Ile Asp Ile Asp Ser Leu Glu Ser Ile Ala

290 295 300

Asp Lys Asn Thr Thr Ala Met Val Ile Ile Asn Pro Asn Asn Pro Cys

305 310 315 320

Gly Ser Val Tyr Ser Tyr Asp His Leu Ser Lys Val Ala Glu Val Ala

325 330 335

Lys Arg Leu Gly Ile Leu Val Ile Ala Asp Glu Val Tyr Gly Lys Leu

340 345 350

Val Leu Gly Ser Ala Pro Phe Ile Pro Met Gly Val Phe Gly His Ile

355 360 365

Thr Pro Val Leu Ser Ile Gly Ser Leu Ser Lys Ser Trp Ile Val Pro

370 375 380

Gly Trp Arg Leu Gly Trp Val Ala Val Tyr Asp Pro Arg Lys Ile Leu

385 390 395 400

Gln Glu Thr Lys Ile Ser Thr Ser Ile Thr Asn Tyr Leu Asn Val Ser

405 410 415

Thr Asp Pro Ala Thr Phe Ile Gln Ala Ala Leu Pro Gln Ile Leu Glu

420 425 430

Asn Thr Lys Glu Asp Phe Phe Lys Ala Ile Ile Gly Leu Leu Lys Glu

435 440 445

Ser Ser Glu Ile Cys Tyr Lys Gln Ile Lys Glu Asn Lys Tyr Ile Thr

450 455 460

Cys Pro His Lys Pro Glu Gly Ser Met Phe Val Met Val Lys Leu Asn

465 470 475 480

Leu His Leu Leu Glu Glu Ile Asp Asp Asp Ile Asp Phe Cys Cys Lys

485 490 495

Leu Ala Lys Glu Glu Ser Val Ile Leu Cys Pro Gly Ser Val Leu Gly

500 505 510

Met Ala Asn Trp Val Arg Ile Thr Phe Ala Cys Val Pro Ser Ser Leu

515 520 525

Gln Asp Gly Leu Gly Arg Ile Lys Ser Phe Cys Gln Arg Asn Lys Lys

530 535 540

Arg Asn Ser Ser Asp Asp Cys

545 550

<210>3

<211>10966

<212>DNA

<213>Hordeum vulgare

<220>

<221>外显子

<222>(578)..(1299)

<223>NAAT-B的第1外显子

<220>

<221>外显子

<222>(1483)..(1825)

<223>NAAT-B的第2外显子

<220>

<221>外显子

<222>(1922)..(2140)

<223>NAAT-B的第3外显子

<220>

<221>外显子

<222>(2244)..(2303)

<223>NAAT-B的第4外显子

<220>

<221>外显子

<222>(2761)..(2916)

<223>NAAT-B的第5外显子

<220>

<221>外显子

<222>(3263)..(3356)

<223>NAAT-B的第6外显子

<220>

<221>外显子

<222>(3735)..(4033)

<223>NAAT-B的第7外显子

<220>

<221>外显子

<222>(6457)..(6897)

<223>NAAT-A的第1外显子

<220>

<221>外显子

<222>(7029)..(7371)

<223>NAAT-A的第2外显子

<220>

<221>外显子

<222>(7479)..(7697)

<223>NAAT-A的第3外显子

<220>

<221>外显子

<222>(7784)..(7843)

<223>NAAT-A的第4外显子

<220>

<221>外显子

<222>(8285)..(8440)

<223>NAAT-A的第5外显子

<220>

<221>外显子

<222>(8738)..(8831)

<223>NAAT-A的第6外显子

<220>

<221>外显子

<222>(9414)..(9732)

<223>NAAT-A的第7外显子

<400>3

ctcgatccca ttgcaatggt atgattagct atcaaacgaa agaaagagat ggcatgtgcc 60

ctgtgtgtca tccctcactg gcttggcgaa tggcgatacc gagttaggta gagtgttttt 120

ttagcatgat gtctgccggc actgccaaga aaactgcgtg cagcggactg caggagagtt 180

gagcgatgca tgctttgtga tgagcggagc tgagtgggtg tcactaactg aacccaatca 240

gcattgggtg agtcgagtcg agaagcatca tgcttcctgc gtcccgatcc gcttatcttt 300

ttctcccaaa ttattaaaga gggatagatg atggtgtgct gggttgggta gagtacgtgc 360

atagaaccaa agcgaggcgc cgaaaatatg ccggggataa tggtggcagg ccgcaacggc 420

cacgcccgtc agctggcagc ggcgtgccag agcgtgccag agcgtgcgcg cgtgcgtgct 480

tcttgctgcc ggccccggtt cgtgtgcggt cagagcaacg gctatatagg accgtcaatc 540

accgctactc aatccgtccc caactcgttt cctattaccg ctactagtag tattcctggt 600

gtagtctagt agtactcctc ctcctccttc tcctcctacc cgtttcctc atg gcc acc 658

Met Ala Thr

1

gta cgc cag agc gac gga gtc gcc gcg aac ggc ctt gcc gtg gcc gca 706

Val Arg Gln Ser Asp Gly Val Ala Ala Asn Gly Leu Ala Val Ala Ala

5 10 15

gcc gcg aac ggc aag agc aac ggc cat ggc gtg gct gcc gcc gtg aac 754

Ala Ala Asn Gly Lys Ser Asn Gly His Gly Val Ala Ala Ala Val Asn

20 25 30 35

ggc aag agc aac ggc cat ggc gtg gat gcc gac gcg aac ggc aag agc 802

Gly Lys Ser Asn Gly His Gly Val Asp Ala Asp Ala Asn Gly Lys Ser

40 45 50

aac ggc cat ggc gtg gct gcc gac gcg aac ggc aag agc aac ggc cat 850

Asn Gly His Gly Val Ala Ala Asp Ala Asn Gly Lys Ser Asn Gly His

55 60 65

gcc gag gcc act gcg aac ggc cac ggc gag gcc act gcg aac ggc aag 898

Ala Glu Ala Thr Ala Asn Gly His Gly Glu Ala Thr Ala Asn Gly Lys

70 75 80

acc aac ggc cac cgc gag agc aac ggc cat gct gag gcc gcc gac gcg 946

Thr Asn Gly His Arg Glu Ser Asn Gly His Ala Glu Ala Ala Asp Ala

85 90 95

aac ggc gag agc aac gag cat gcc gag gac tcc gcg gcg aac ggc gag 994

Asn Gly Glu Ser Asn Glu His Ala Glu Asp Ser Ala Ala Asn Gly Glu

100 105 110 115

agc aac ggg cat gcg gcg gcg gcg gca gag gag gag gag gcg gtg gag 1042

Ser Asn Gly His Ala Ala Ala Ala Ala Glu Glu Glu Glu Ala Val Glu

120 125 130

tgg aat ttc gcg ggt gcc aag gac ggc gtg ctg gcg gcg acg ggg gcg 1090

Trp Asn Phe Ala Gly Ala Lys Asp Gly Val Leu Ala Ala Thr Gly Ala

135 140 145

aac atg agc atc cgg gcg ata cgg tac aag atc agc gcg agc gtg cag 1138

Asn Met Ser Ile Arg Ala Ile Arg Tyr Lys Ile Ser Ala Ser Val Gln

150 155 160

gag aag ggg ccg cgg ccc gtg ctg ccg ctg gcc cac ggg gac ccg tcc 1186

Glu Lys Gly Pro Arg Pro Val Leu Pro Leu Ala His Gly Asp Pro Ser

165 170 175

gtg ttc ccg gcc ttc cgc acg gcc gtc gag gcc gag gac gcc gtc gcc 1234

Val Phe Pro Ala Phe Arg Thr Ala Val Glu Ala Glu Asp Ala Val Ala

180 185 190 195

gcc gcg ctg cgc acc ggc cag ttc aac tgc tac ccc gcc ggc gtc ggc 1282

Ala Ala Leu Arg Thr Gly Gln Phe Asn Cys Tyr Pro Ala Gly Val Gly

200 205 210

ctc ccc gcc gca cga ag gtaacaacaa caacaacaca agaacaattt 1329

Leu Pro Ala Ala Arg Ser

215

ccttttcgcg tgtcgtgtcg cgcggcaatc catgcatgcg catgtgccgc tttcacgtgt 1389

ccgtccgtcc gtccaccgtt ccttcctcct ccctacgccc atgagaaatc tgaccttctc 1449

ccaccttata ccaaacaaaa caaaaaaaca cag c gcc gtg gca gag cac ctg 1501

Ala Val Ala Glu His Leu

220

tcg cag ggc gtg ccg tac atg cta tcg gcc gac gac gtc ttc ctc acc 1549

Ser Gln Gly Val Pro Tyr Met Leu Ser Ala Asp Asp Val Phe Leu Thr

225 230 235

gcc ggc ggg acc cag gcg atc gag gtc ata atc ccg gtg ctg gcc cag 1597

Ala Gly Gly Thr Gln Ala Ile Glu Val Ile Ile Pro Val Leu Ala Gln

240 245 250 255

acc gcc ggc gcc aac att ctg ctc ccc agg cca ggc tac cca aac tac 1645

Thr Ala Gly Ala Asn Ile Leu Leu Pro Arg Pro Gly Tyr Pro Asn Tyr

260 265 270

gag gcg cgc gcc gcg ttc aac agg ctg gag gtc cgg cat ttc gac ctc 1693

Glu Ala Arg Ala Ala Phe Asn Arg Leu Glu Val Arg His Phe Asp Leu

275 280 285

atc ccc gac aag ggg tgg gag atc gac atc gac tcg ctg gaa tcc atc 1741

Ile Pro Asp Lys Gly Trp Glu Ile Asp Ile Asp Ser Leu Glu Ser Ile

290 295 300

gcc gac aag aac acc acc gcc atg gtc atc ata aac ccc aac aac ccg 1789

Ala Asp Lys Asn Thr Thr Ala Met Val Ile Ile Asn Pro Asn Asn Pro

305 310 315

tgc ggc agc gtt tac tcc tac gac cat ctg tcc aag gtttcacatc 1835

Cys Gly Ser Val Tyr Ser Tyr Asp His Leu Ser Lys

320 325 330

ctttgccttg ctgaatatgg attcagttca gtgcacctgc tgaattcttt ttgccaatcg 1895

catactgact gatgttgctc aattag gtc gcg gag gtg gcg aaa agg ctc gga 1948

Val Ala Glu Val Ala Lys Arg Leu Gly

335 340

ata ttg gtg att gct gac gag gta tac ggc aag ctg gtt ctg ggc agc 1996

Ile Leu Val Ile Ala Asp Glu Val Tyr Gly Lys Leu Val Leu Gly Ser

345 350 355

gcc ccg ttc atc cca atg gga gtg ttt ggg cac atc acc cct gtg ctg 2044

Ala Pro Phe Ile Pro Met Gly Val Phe Gly His Ile Thr Pro Val Leu

360 365 370

tcc ata ggg tct ctg tcc aag tca tgg ata gtg cct gga tgg cgg ctt 2092

Ser Ile Gly Ser Leu Ser Lys Ser Trp Ile Val Pro Gly Trp Arg Leu

375 380 385

gga tgg gta gcg gtg tac gac ccc aga aag atc tta cag gaa act aag 2140

Gly Trp Val Ala Val Tyr Asp Pro Arg Lys Ile Leu Gln Glu Thr Lys

390 395 400

gtacttaaat ctctatatca ttcttttcaa atgctactaa ggtgattaat tagtactact 2200

gtacaatata tttgctaaat ttgtactgac atttttgtgg tag atc tct aca tca 2255

Ile Ser Thr Ser

405

att acg aat tac ctc aat gtc tcg aca gac cca gca acc ttc att cag 2303

Ile Thr Asn Tyr Leu Asn Val Ser Thr Asp Pro Ala Thr Phe Ile Gln

410 415 420

gtcagtcttt ggtatttacc tcgtttcaag aaataaagtc tttggtattt actcctcctt 2363

gtcctatttt gctccggtcc ctatgttgta ggcagcccac gtgcatgtca agtgaccgtt 2423

ttttcacatt aagtttgaaa gtcaaagtca gacacataca cttgtagtta ttttaccttt 2483

gtttgctttg atccgataaa ataaaaaaat acaaaaactg aacctactgt tgaatataac 2543

cactgttctt acaagatata catgattgca ctatgggcat gccatattct tttgggtcaa 2603

gtatgcagta tgttggaacc tcttttagaa aatagataca ttgtactatg agtataccat 2663

tttattaaga atttcatatt ttgatatcct tgatggtatt gttctcttgt gattcacacg 2723

atttacttgt ggttttttgt actatcaaat tgttcag gca gct ctt cct cag att 2778

Ala Ala Leu Pro Gln Ile

425 430

ctt gag aac aca aag gaa gat ttc ttt aag gcg att att ggt ctg cta 2826

Leu Glu Asn Thr Lys Glu Asp Phe Phe Lys Ala Ile Ile Gly Leu Leu

435 440 445

aag gaa tca tca gag ata tgc tac aaa caa ata aag gaa aac aaa tac 2874

Lys Glu Ser Ser Glu Ile Cys Tyr Lys Gln Ile Lys Glu Asn Lys Tyr

450 455 460

att aca tgt cct cac aag cca gaa gga tca atg ttt gtc atg 2916

Ile Thr Cys Pro His Lys Pro Glu Gly Ser Met Phe Val Met

465 470 475

gtaagcctat tttgtgaagt aaaaaaatct tagggagtgt cagtaatcat aaacttattt 2976

atataggatt aatctgggac cgaaatgcat ccaacataat tacttcaaat tcaaattcaa 3036

attacattct tccgtacata tttttgaaga tgcatgtatt ttaagaataa tgacgagagc 3096

taaagttatg ctacgactaa tcatctggat atcctttgtc catctttttg ttatactgtg 3156

gaatgttaat ggtcaaatca tattacacaa atatccatgc tagtttctag aaagattgat 3216

tatttttctg taaccatgaa ctccgtatta acttccatgt aaacag gtg aaa ctg 3271

Val Lys Leu

aac tta cat ctt ttg gag gaa ata gac gat gac att gat ttt tgc tgc 3319

Asn Leu His Leu Leu Glu Glu Ile Asp Asp Asp Ile Asp Phe Cys Cys

480 485 490 495

aag ctc gca aaa gaa gaa tca gta atc tta tgc cca g gtaggaatcc 3366

Lys Leu Ala Lys Glu Glu Ser Val Ile Leu Cys Pro

500 505

attgttgatt tttgactgta tatgaagttc ttatcaattt ccgagatgac tatacatata 3426

aatgattacc atattatggt cagaaattgt ataacagtgt tagaatattc tgtgaagact 3486

tttttaacac aatattctgt gaagactaga tatcatgtac ttctccttgt tttcttgacc 3546

tgatgtcctt cgtcacatgt tgtgctcctc acaaaaaaat agcaagcaca tgtttcaaat 3606

aattgttaat aatataattt agcctttaat ttatatggtt ctattttgag atatttttgt 3666

agtccaactt atatatttgt gactattctc aaaaacaaaa cttatatatg tgtgcctctc 3726

aaatgtag gg agt gtt ctt gga atg gca aac tgg gtc cgc att act ttt 3775

Gly Ser Val Leu Gly Met Ala Asn Trp Val Arg Ile Thr Phe

510 515 520

gct tgt gtt cca tct tct ctt caa gat ggt ctc gga agg atc aaa tca 3823

Ala Cys Val Pro Ser Ser Leu Gln Asp Gly Leu Gly Arg Ile Lys Ser

525 530 535

ttc tgt caa agg aac aag aag aga aat tcg agc gat gat tgc tag 3868

Phe Cys Gln Arg Asn Lys Lys Arg Asn Ser Ser Asp Asp Cys

540 545 550

ttgtatatct gactgaagct gtaaatcatt cccagtatcc ccatctatat ctttcaataa 3928

aatggaactt ttagttctct atgaatagaa gtcaacatct ccttgaatat gttctggttg 3988

ttgtggcctg gacgaaacat agtgaatgtt atgttagtga agttacattg gcgtcgaaga 4048

tctttgaagt tttttttttt ttttgggggg gggggggggg ggtgctttga tattactctt 4108

aagtacacgt tctctcaagt tatgtcaaag cactttgtaa acaattgtag atttggtatc 4168

atgatatgga ttaaactagt cagatacttg gtaagcacaa accctaccta tgttaggctc 4228

actaaggtgg cgtttggttc gagagagagg aaggatcagt tgatgatatc cccaatcatc 4288

gaagtaaatc atgtgttgtt gctaccactt ttctacaatc ctagtagctg catgcgttga 4348

gctactgatc aacaccactg cacaaccata ttctctgtgc aaaatcggca cccaaagatt 4408

acatctcaca gctgaagcaa ccaccaaatt tgaagagagg aaccctcaca aagacctttg 4468

agtgcccccc acaatgcatg gttaggccgc cgtcgcaggc cggagtggtc accatgcgga 4528

ccaacaccaa ctccaacggg ggagcacgtc accgattact gaaattcccc aaacaattct 4588

taatttgtga acaaaattta aaaacaggaa caatttttga atttgtgaac aaatttttta 4648

aacgggtatt cctgaacatt tttcaaaatt gtgatcaaaa ttttaaaacg acttctttct 4708

caaatttgag caatatttaa aattataaaa aagttcaaca attttgaact ttttaaaaat 4768

tagcgagaac attttgaaat tctaaatatt ttcgaatttg gaacattttt tctatttctg 4828

aacaaaaatt gaaaatacga acgtaatttg gaataaattt tggaaaatgc gattttttga 4888

aatttctgaa catattttga aaaacaaaaa aactttaaaa ggtaaaataa aaataaaata 4948

aaaatagaaa cataaaaata agcaaaaaaa taaaagaaat ccgagaaaag ccaactggga 5008

atagcacatg gaaaaaccca gccgtccgcc gcactgtgta aagctataag tgagccggcc 5058

caagcctcgt cgtctcatca taccctgtgc gaaaccccga caattcgttg cactatgcgg 5128

cgaataggct tttccaggag ctcctgtctt ccggttatgg gtcatttgca cacccctcct 5188

ccacttgggc caggctatta tacttttttt ccttctttcg acctcacgtt actacgccag 5248

tttagttttt ggaagcgacc aaccggtttt gtgaaggttc tagaaactca accatttttg 5308

ggaagcttct agaagcctat gaatgtttct tttggacatg tattatttgt gttttttctt 5368

tttcaaattg cacaatcttt tttcaaattc atgatttttg tgaaacttgt gattttttga 5428

atccgtgatt ttttttccta aatccgtgtt ttgaaaaaaa ctgtggactt ttccgaaatt 5488

aatgaacatt tgtttgcaag atcgatgatc cttttcaaat gagcgatttt tttctaaaat 5548

atccacatat ttttcatatt cataagcttt ccttttaatc gtgaactatc ttagcatttg 5608

gtgaactttt attaattttc tttataaaat gatttttttt caaaagccaa cggttaacgg 5668

ttgaccgctg aaccacaacc acaaaccggg gaaaccattg actcgctgaa cagggcaggg 5728

ctttcatatg attgggtggt ctaataccag cgcccctgac tactaaacga aggaattgca 5788

aattttacca accactacta tggtaaaaaa tgaatatcac gataaaaaag gggaaaaaaa 5848

actataccct gaaaatccct ctgtttctaa atatttgttg ttggggagaa ctaatctgaa 5908

agaactaatc tagttctccg caataacaaa tattatgatt cggggggagt ataactatta 5968

cacgatcaac caaagaatgt cctccaagaa aaacccaaag aaagtgctag agttttgttt 6028

tcaaggaccg aaagatagag atagcattct gaattaggtc catctttttc ccaaggattg 6088

aaagaaagag atagaattct gaattaggtg cggagatatc atttctggat taggtacaat 6148

tgttttgccg gcacagccaa accccgcagt ggagccggaa ttggaattga gtgggtggag 6208

tcgagaagca tggttcatgc gttctcaaag agtgtagcca gtagtgtgtg ctccttggtg 6268

ctggagctgc atatacaagt acataaaaca aagacgatca gctggcagcg tgcctgcatg 6328

cgtgcttctt gctgccgccc cggaagcccc ggttgatgtg cgcaggcgag tggcgacggg 6388

accgacggct ataaagcacg gccaagcacc gccgccgttc tcaatccatc catcccttag 6448

ctgatttgat tgactagcta gttcattccc tgccacactg ctagtactcc tcctcgtttc 6508

ctcgtggca atg gta cac cag agc aac ggc cac ggc gag gcc gcc gcc gcc 6559

Met Val His Gln Ser Asn Gly His Gly Glu Ala Ala Ala Ala

555 560 565

gcc gcc aac ggc aag agc aac ggg cac gcc gcc gcc gcg aac ggc aag 6607

Ala Ala Asn Gly Lys Ser Asn Gly His Ala Ala Ala Ala Asn Gly Lys

570 575 580

agc aac ggg cac gcg gcg gcg gcg gcg gtg gag tgg aat ttc gcc cgg 6655

Ser Asn Gly His Ala Ala Ala Ala Ala Val Glu Trp Asn Phe Ala Arg

585 590 595

ggc aag gac ggc atc ctg gcg acg acg ggg gcg aag aac agc atc cgg 6703

Gly Lys Asp Gly Ile Leu Ala Thr Thr Gly Ala Lys Asn Ser Ile Arg

600 605 610

gcg ata cgg tac aag atc agc gcg agc gtg gag gag agc ggg ccg cgg 6751

Ala Ile Arg Tyr Lys Ile Ser Ala Ser Val Glu Glu Ser Gly Pro Arg

615 620 625

ccc gtg ctg ccg ctg gcc cac ggt gac ccg tcc gtg ttc ccg gcc ttc 6799

Pro Val Leu Pro Leu Ala His Gly Asp Pro Ser Val Phe Pro Ala Phe

630 635 640 645

cgc acg gcc gtc gag gcc gag gac gcc gtc gcc gcc gcg ctg cgc acc 6847

Arg Thr Ala Val Glu Ala Glu Asp Ala Val Ala Ala Ala Leu Arg Thr

650 655 660

ggc cag ttc aac tgc tac gcc gcc ggc gtc ggc ctc ccc gcc gca cga 6895

Gly Gln Phe Asn Cys Tyr Ala Ala Gly Val Gly Leu Pro Ala Ala Arg

665 670 675

ag gtaacattta cagcttcacc gtaatgtatg cgtgagcatg catgcgccgg 6947

Ser

tttacttacg tgcccgccgc tgttcttccc cggtgcgttc aaaattttaa ccttctataa 7007

gtaccttata aaaacaaaca g c gcc gta gca gag cac ttg tca cag ggc gtg 7059

Ala Val Ala Glu His Leu Ser Gln Gly Val

680 685

ccc tac aag cta tcg gcc gac gac gtc ttc ctc acc gcc ggc gga act 7107

Pro Tyr Lys Leu Ser Ala Asp Asp Val Phe Leu Thr Ala Gly Gly Thr

690 695 700

cag gcg atc gaa gtc ata atc ccg gtg ctg gcc cag act gcc ggc gcc 7155

Gln Ala Ile Glu Val Ile Ile Pro Val Leu Ala Gln Thr Ala Gly Ala

705 710 715 720

aac ata ctg ctt ccc cgg cca ggc tat cca aat tac gag gcg cga gcg 7203

Asn Ile Leu Leu Pro Arg Pro Gly Tyr Pro Asn Tyr Glu Ala Arg Ala

725 730 735

gca ttc aac aag ctg gag gtc cgg cac ttc gac ctc atc ccc gac aag 7251

Ala Phe Asn Lys Leu Glu Val Arg His Phe Asp Leu Ile Pro Asp Lys

740 745 750

ggg tgg gag atc gac atc gac tcg ctg gaa tcc atc gcc gac aag aac 7299

Gly Trp Glu Ile Asp Ile Asp Ser Leu Glu Ser Ile Ala Asp Lys Asn

755 760 765

acc acc gcg atg gtc atc ata aac cca aac aat ccg tgc ggc agc gtt 7347

Thr Thr Ala Met Val Ile Ile Asn Pro Asn Asn Pro Cys Gly Ser Val

770 775 780

tac tcc tac gac cat ctg gcc aag gttttgcatc catgcatcct ctgcctcgtt 7401

Tyr Ser Tyr Asp His Leu Ala Lys

785 790

gatcgaccgg tctgtttgaa catagtatat ggattgcgtt tgctaatcgt gtgctgatga 7461

tgctgtttgg ttatcag gtc gcg gag gtg gca agg aag ctc gga ata ttg 7511

Val Ala Glu Val Ala Arg Lys Leu Gly Ile Leu

795 800

gtg atc gct gac gag gtt tac ggc aaa ctg gtt ctg ggc agc gcc ccg 7559

Val Ile Ala Asp Glu Val Tyr Gly Lys Leu Val Leu Gly Ser Ala Pro

805 810 815

ttt atc ccg atg ggc gtc ttt ggg cac att gcc ccg gtc ttg tcc att 7607

Phe Ile Pro Met Gly Val Phe Gly His Ile Ala Pro Val Leu Ser Ile

820 825 830 835

gga tct ctg tcc aag tcg tgg ata gtg cct gga tgg cga ctt gga tgg 7655

Gly Ser Leu Ser Lys Ser Trp Ile Val Pro Gly Trp Arg Leu Gly Trp

840 845 850

gtg gcg gtg tac gac ccc aca aag att tta gag aaa act aag 7697

Val Ala Val Tyr Asp Pro Thr Lys Ile Leu Glu Lys Thr Lys

855 860 865

gtagctttag ctccctatca ttcttctcat atgctactgt ggggattagt atttttgcta 7757

aatttgtact gcctttgttt attcag atc tct acg tct att acg aat tac ctt 7810

Ile Ser Thr Ser Ile Thr Asn Tyr Leu

870

aat gtc tca acg gac cca gca acc ttc gtt cag gttagtcttt ggttcttgcc 7863

Asn Val Ser Thr Asp Pro Ala Thr Phe Val Gln

875 880 885

ctattttgct catgtccctg tgttgcatgt caaatgaccg gcttcaagtt agtatataga 7923

gtttttgtta agtgtgaatg tcgaagtcca acatgatgga agaaagatac atctattttt 7983

agtcattccc ctttgtttgt ttgattccat aaaataaata aacacaaagc cagaaccaac 8043

tattgaatag aactattttt cttagaaaat atacattgta ttttgagcat gccatattct 8103

tttcgatcaa gtatgcaata tattaaaact tgcattgtac tacgagtata ccatgttgtt 8163

aagaatttct ttacctacaa caccttgtct cgcatcttca tattttgata tccttgacat 8223

tattgttctc ttatgattca cacaacttaa ttatggattt ttgtgctatc aaattgttta 8283

g gaa gct ctt cct aaa att ctt gag aac aca aaa gca gat ttc ttt aag 8332

Glu Ala Leu Pro Lys Ile Leu Glu Asn Thr Lys Ala Asp Phe Phe Lys

890 895 900

agg att att ggt cta cta aag gaa tca tca gag ata tgt tat agg gaa 8380

Arg Ile Ile Gly Leu Leu Lys Glu Ser Ser Glu Ile Cys Tyr Arg Glu

905 910 915

ata aag gaa aac aaa tat att acg tgt cct cac aag cca gaa gga tcg 8428

Ile Lys Glu Asn Lys Tyr Ile Thr Cys Pro His Lys Pro Glu Gly Ser

920 925 930

atg ttt gta atg gtaagctaag catagactta ctttttaagg ttaatctggg 8480

Met Phe Val Met

935

atctcagtgc atccaacaaa caatcaaatc aaaatataat tatgttttgc tatggatctt 8540

tttgaagatg catgcatttg aagaataatg aagagagttg aaattatttt aggactaatc 8600

ttcctgatat catttgtcca tttttttgtt attactgtaa attggtaaca ctcaaatcat 8660

attacaaaaa gtttcctccc atttttagta agattgactt cctttctata accatgtatt 8720

aacttccatg taaacag gtc aaa cta aac tta cat ctt ttg gag gag atc 8770

Val Lys Leu Asn Leu His Leu Leu Glu Glu Ile

940 945

cat gac gac ata aat ttt tgc tgc aag ctc gca aag gaa gaa tct gta 8818

His Asp Asp Ile Asn Phe Cys Cys Lys Leu Ala Lys Glu Glu Ser Val

950 955 960

att tta tgt cca g gtaggaatgt atatggccat tttaaaggaa aactatatgg 8871

Ile Leu Cys Pro

965

aataataata tcttcttgtt atactaaaca atacttcctc catcctaaaa taaatgtctt 8931

acacttagca caattttata ctagatctag tacaaagttg aaacagttat tttgggacag 8991

agggagtagt atatattgtg tgagaacata aggttatgtt tgactgatat atgcttctta 9051

aatgtgaaac atgttctctt atgttttttg attgtatacg aagttcttat cagtttccga 9111

gatgactaca cataaatgat taccatatca ttgtcagaaa atgtattacc acattagaat 9171

attctttctt tttatgcaaa gactagcatg gcatgtactt ttccttgtac ctatgtgtct 9231

ttttttttct cgttacatgt ttgtgcttct cacaaaaata ataataccaa gcacatgttc 9291

caaatgatta ttaataattt tgaggtgttt ttcaaccaac ttatatactt tcatagttct 9351

aaaaaaaccg tatatatggt taactctaac aaaaacttat atatgttttc tctctaatac 9411

ag gg agt gtt ctt gga atg gaa aat tgg gtc cgt att act ttt gcc 9457

Gly Ser Val Leu Gly Met Glu Asn Trp Val Arg Ile Thr Phe Ala

970 975 980

tgc gtt cca tct tct ctt caa gat gga ctc gaa agg gtc aaa tca ttc 9505

Cys Val Pro Ser Ser Leu Gln Asp Gly Leu Glu Arg Val Lys Ser Phe

985 990 995

tgt caa agg aac aag aag aag aat tct ata aat ggt tgt tag 9547

Cys Gln Arg Asn Lys Lys Lys Asn Ser Ile Asn Gly Cys

1000 1005 1010

ttgtacacac ccctagttgt acatctgact gaagctgtaa atcatttcta gttatcccca 9607

tttatatatt tcaataaaac atattgtaat ggttctgttg tagctgtcca agtcatgtac 9667

tctacttttt gatgtatttg gcctcattgc cttgcatcag tttcaataaa aatggttgtg 9727

tacacaatga tgatgtagag gcgaggtgtt ttgaccacct tttcaacaaa aatctatatc 9787

tttcaacaaa tgaaaccttg agttcccttt gagtagaagt caacatactc cttgaatatg 9847

ctatggtttc catggtctgg atgaaacatg atgaatagaa gtgaagttat atccatgtca 9907

aagtttttta atgtttaatt tcattatgag aactttgata ttacttctag cacacattct 9967

ctgaagtaat tgtcagtttg gtacttgaag ggacctatat ttttcctatt gggggggggg 10027

ggtgaatagg cggtttataa ccaattgtat atttgagaat atcttaatgt ggaattaaac 10087

taggtgaata ttttttccaa taaagggtgc ttttattgac tcacaatgta ccatcaaggg 10147

atacaatcat aatgagtaca caatcgacat ctacataatc aggttgcata cggccaacac 10207

acacacacgc acacacacat tcacacacac aaatcatgct gacgaagagc gaagtcatac 10267

aagatcaaaa ctatgcctag gcggaggaag aatagaaaaa catgaagaaa tgaaaaaccg 10327

tgactgacaa catactgacc atcgacgaca aacatctgta gacaacacaa aaactgcgag 10387

aaaagttcta taaaactggc gccttcgaga aggaaacgac gtgcaagagt tgccatcatc 10447

ggatccaacc actaaggtca tatcctgggt tttcatcctg aagatcaaat ccgagcaaac 10507

tccgagtaat gtctttatta gggtaacgat tcaaaaaatg ccacaatcat gagttatgac 10567

caattagacc agacctagga tttttatcca aagctcgaga cgggtactct agaagtacca 10627

tccaattgaa gtcatcccac ttgcctcaat acaaatagtt gcatagatgc acggtccata 10687

tggcgagtaa tggacatgag cgcgcatgtg taggttaacg tgacgtgaca agagcctgtc 10747

gccaccactc gacgaagtgt ttgatgggga ggaagaagta tggctccacc aacatcccaa 10807

gtttgaaaca ttctagagcc ccttaccata ctcacaaagc gacaattgat gactatctgt 10867

atcagacgac aaatccatgt ccgtcactcg ctctatcttg gtcattgaca tactacctgg 10927

caaaggcgga ttcaagcccc agacagcctg ggcggccgc 10966

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-A1F

<400>4

gctactagta gtattcctgg tgtag 25

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-A1R

<400>5

ggagtactac tagactacac cagga 25

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-A2F

<400>6

acatgcgcat gcatgaattg ccg 23

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-A2R

<400>7

caattcatgc atgcgcatgt gcc 23

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-B1F

<400>8

ggtcaagtat gcagtatgtt ggaac 25

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-B1R

<400>9

gttccaacat actgcatact tgacc 25

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-B2F

<400>10

ctagaagcct atggatgttt cttttgg 27

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-B2R

<400>11

ccaaaagaaa catccatagg cttctag 27

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-B3F

<400>12

agttcttatc aatttccgag atgac 25

<210>13

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-B3R

<400>13

atagtcatct cggaaattga taaga 25

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-B4F

<400>14

agtggtcacc atgcggacca acacc 25

<210>15

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-B4R

<400>15

ggtgttggtc cgcatggtga ccact 25

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-C1F

<400>16

caccggccag ttcaactgct acgc 24

<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-C1R

<400>17

gcgtagcagt tgaactggcc ggtg 24

<210>18

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-C2F

<400>18

tttggaggag atccatgacg acata 25

<210>19

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-C2R

<400>19

tatgtcgtca tggatctcct ccaaa 25

<210>20

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-C3F

<400>20

tcttctcata tgctactgtg gggat 25

<210>21

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-C3R

<400>21

tgacatgcaa cacagggaca tgagc 25

<210>22

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-D1F

<400>22

catgctgacg aagagcgagg tcata 25

<210>23

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物F-D1R

<400>23

cccaggatat gaccttagtg gttgg 25

<210>24

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物B5F

<400>24

gaatggcaaa ctgggtccgc attac 25

<210>25

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物B5R

<400>25

gtaatgcgga cccagtttgc cattc 25

<210>26

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物B6F

<400>26

ctggttgttg tggcctggac gaaac 25

<210>27

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物B6R

<400>27

gtttcgtcca ggccacaaca accag 25

<210>28

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物B7F

<400>28

agcacaaacc ctacctatgt taggc 25

<210>29

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物B7R

<400>29

gcctaacata ggtagggttt gtgct 25

<210>30

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物C4F

<400>30

tggaatttcg cccggggcaa ggac 24

<210>31

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物C4R

<400>31

ccctgtgaca agtgctctgc tacg 24

<210>32

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物C5F

<400>32

tctgggatct cagtgcatcc aaca 24

<210>33

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物C5R

<400>33

gaagcatata tcagtcaaac ataacc 26

<210>34

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物A-eF

<400>34

cacatccttt gccttgctga atatgg 26

<210>35

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物B-tR

<400>35

cagtagtact aattaatcac cttagtagc 29

<210>36

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物B-eF

<400>36

cacgatcaac caaagaatgt cctcc 25

<210>37

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物C-tR

<400>37

tacttgtata tgcagctcca gcac 24

Claims

1.生产耐缺铁性转基因禾本科植物的方法，包括用编码烟酰胺氨基转移酶的基因转化禾本科植物，所述基因携带在双元载体上，所述载体包含在农杆菌中复制用的ori，nos启动子和nos终止子。

2.权利要求1的方法，其中双元载体进一步包括启动子CaMV35S。

3.权利要求1的方法，其中酶是大麦烟酰胺氨基转移酶。

4.权利要求3的方法，其中酶选自：

(A)具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的酶；

(B)具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的酶；

(C)由碱基序列SEQ ID NO：3编码的酶。

5.一种由权利要求1-4任一项的方法生产的转基因禾本科植物的转化细胞。

6.一种在缺铁地区耕作的方法，其中将由权利要求1-4任一项的方法生产的转基因禾本科植物种植在缺铁地区。