JP2001017012A - 鉄欠乏耐性イネの創製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、鉄欠乏地帯での生育が可能な鉄欠
乏耐性を有するイネ科植物を提供する。より詳細には、
本発明は、イネ科植物のムギネ酸類の生合成経路上の酵
素の遺伝子をイネ科植物に導入することにより、石灰質
アルカリ土壌などでも旺盛に生育する鉄欠乏耐性を有す
るイネ科植物を提供する。 【解決手段】 本発明は、イネ科植物にムギネ酸類生合
成経路中の酵素、好ましくはニコチアナミンアミノ基転
移酵素（ＮＡＡＴ）をコードする遺伝子を導入して、鉄
吸収性が改善されたイネ科植物を製造する方法に関す
る。また、本発明は前記した方法により製造され得るイ
ネ科植物、前記鉄吸収性が改善されたイネ科植物を育成
する方法及び当該育成により得られる作物に関する。即
ち、本発明は鉄欠乏耐性を有する新規なイネ科植物の創
製に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、鉄欠乏耐性を有す
るイネ科植物を製造する方法、その方法により得られた
イネ科植物並びに当該イネ科植物を育成する方法及びそ
の方法で得られた作物に関する。より詳細には、本発明
は、イネ科植物にムギネ酸類生合成経路中の酵素をコー
ドする遺伝子、好ましくは当該酵素がニコチアナミン・
アミノ基転移酵素である遺伝子を導入して鉄欠乏耐性を
有するイネ科植物の創製に関する。

【０００２】

【従来の技術】地球上の９０％近くの土壌は、何らかの
問題を抱える不良土壌であると言われている。不良土壌
では一般的に、植物の生育に必須な元素を質的または量
的に欠いているために植物の生育が阻害されたり、ある
いは重金属等を多く含む土壌による生育障害などが起こ
る。不良土壌の代表として、乾燥地塩類集積土壌があ
る。これは、人為的な過剰潅漑や、長年にわたる乾燥気
候により、土壌上層にＮａＣｌやＮａ_２ＣＯ_３が集積し
たものと、ＣａＣＯ_３やＣａＳＯ_４が集積したものとが
ある。ナトリウムの集積した土壌では、塩類濃度障害を
引き起こし、石灰質の土壌では、鉄欠乏障害を引き起こ
す。

【０００３】地球上の耕地土壌の約３０％は、潜在的な
鉄欠乏地帯と言われている(Wallence et al. 1960)。半
乾燥地域の石灰質土壌では、毛管現象により母材から溶
出した石灰質成分が地表に集積する。このような土壌で
は、ｐＨが上昇しアルカリ性を示すため土壌中の鉄がＦ
ｅ（ＯＨ）_３の形で存在し、溶解度が極めて低くなる。
このような土壌に生育した植物は、可溶性の鉄が少な
いことにより、鉄欠乏クロロシスとなり、生育が阻害さ
れるか、または枯死する。

【０００４】高等植物の鉄獲得機構は、ストラテージ−
Ｉ（Strategy-I）とストラテージ−II（Strategy-II）
という２つに区分される。ストラテージ−Ｉは、イネ科
を除く高等植物の鉄獲得機構である。土壌中の三価の不
溶態鉄を根の細胞表面に存在する三価鉄還元酵素により
還元し、二価鉄のトランスポーターで吸収する機構であ
る。この機構を有する植物の中には、根圏にプロトンを
放出し、根圏のｐＨを下げることで三価鉄還元酵素の活
性を増加させる機構を有しているものや、フェノール系
化合物を根圏に放出し、形成されたＦｅ(III)-フェノー
ル系化合物キレートが細胞膜表面に存在する三価鉄還元
酵素にＦｅ(III)を供給する機構を持っているものが存
在する。最近の研究で、シロイヌナズナの根に特異的に
発現する二価鉄のトランスポーターＩＲＴ１(Eide et a
l. 1996)や、シロイヌナズナの三価鉄還元酵素の遺伝子
が単離された(Robinson et al. 1997)。

【０００５】ストラテージ−IIは、単子葉植物の中のイ
ネ科植物にのみ見られる鉄獲得機構である。イネ科植物
は鉄欠乏条件下で、三価鉄キレート活性を有するムギネ
酸類を根圏に放出し、「Ｆｅ(III)-ムギネ酸」錯体とし
て根から鉄を吸収する(Takagi et al. 1984 )。ムギネ
酸類（ＭＡｓ）は、ムギネ酸（ＭＡ）、２’−デオキシ
ムギネ酸（ＤＭＡ）、３−ヒドロキシムギネ酸（ＨＭ
Ａ）、３−エピヒドロキシムギネ酸（ｅｐｉＨＭＡ）、
アベニン酸（ＡＶＡ）、ディスティコン酸，エピヒドロ
キシデオキシムギネ酸（ｅｐｉＨＤＭＡ）の７つが知ら
れており、ムギネ酸類（ＭＡｓ）は全て図１に示すよう
にメチオニンを前駆体として合成される(Shojima et a
l. 1990，Ma et al.1998)。ムギネ酸の分泌には概日リ
ズムが存在し(Takagi et al. 1984)、日の出後にその分
泌量が最大となり、夜には分泌されなくなる。また、鉄
欠乏のオオムギ根で分泌前に膨らんでいた顆粒が、分泌
後にしぼむ現象が観察され(Nishizawa et al. 1987)、
この顆粒内でムギネ酸が合成されていると考えられてい
る。これらのことから、イネ科植物の鉄欠乏応答は、ム
ギネ酸合成のみならず、鉄欠乏シグナルの伝達、根の形
態変化など複雑な制御系により成立していることが示唆
される。

【０００６】ムギネ酸合成経路に関わる酵素として、ニ
コチアナミン合成酵素の遺伝子が単離され、鉄欠乏によ
り誘導されていることが報告された(Higuchi et al. 19
99)。また、ニコチアナミンアミノ基転移酵素（ＮＡＡ
Ｔ）の遺伝子が単離され、鉄欠乏により誘導されていた
(Takahashi et al. 1997)。また、鉄欠乏オオムギ根、
コントロールのオオムギ根から抽出したｍＲＮＡを用い
たディファレンシャルスクリーニングにより、鉄欠乏条
件下で特異的に誘導される遺伝子Ｉｄｓ１、Ｉｄｓ２、
Ｉｄｓ３が単離された。Ｉｄｓ１は、メタロチオネイン
様タンパク質をコードする遺伝子である(Okumura et a
l. 1991)。Ｉｄｓ２は、その遺伝子配列から予測される
アミノ酸配列が、水酸化酵素に相同性をもつ遺伝子であ
り(Okumura et al. 1994)、Ｉｄｓ３もまた、その遺伝
子配列から予測されるアミノ酸配列が、水酸化酵素に相
同性をもつ遺伝子であった(Nakanishi et al. 1993)。
エピヒドロキシムギネ酸合成経路には、水酸化反応が２
カ所存在し、この遺伝子がこの反応を触媒する酵素をコ
ードしているものと考えられている。

【０００７】また、オオムギ根において鉄欠乏により誘
導されるタンパク質として、ＩＤＳ３タンパク質、アデ
ニンリボースリン酸転移酵素(板井, 1999)、ギ酸脱水素
酵素(Suzuki et al. 1998)、そして３６ｋＤａタンパク
質(入船, 1991)などが挙げられる。イネ科植物は、鉄欠
乏条件で、ムギネ酸を生合成するが、このとき根に含ま
れるメチオニンが減少するためにメチオニンサイクルで
メチオニンを合成すると共に、生じたアデニンをＡＭＰ
に変換するためにアデニンリボースリン酸転移酵素が誘
導されていると考えられている(板井, 1999)。ギ酸脱水
素酵素は、メチオニンサイクルで生じたギ酸を分解す
る。また鉄欠乏のイネの根では、ミトコンドリアの形態
変化と電子伝達系のエネルギーチャージの減少(Mori et
al. 1991)が報告されており、ギ酸脱水素酵素は、鉄欠
乏により生じた嫌気条件により誘導され、エネルギー源
としてのＮＡＤＨの供給をしているものと考えられてい
る。

【０００８】一方、人工の増加に伴って食糧の増産が今
後の人類の生存の条件として大きな問題となってきてい
る。イネは人類の古来からの重要な食糧のひとつである
が、鉄欠乏地帯でのイネの生育は難しいのが現状であ
る。鉄欠乏地帯でイネの生育が可能となれば食糧の増産
も可能となり、食糧増産の問題の解決策のひとつとして
注目されている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、鉄欠乏地帯
での生育が可能な鉄欠乏耐性を有するイネ科植物を提供
することを目的としている。より詳細には、本発明は、
イネ科植物のムギネ酸類の生合成経路上の酵素の遺伝子
をイネ科植物に導入することにより、石灰質アルカリ土
壌などでも旺盛に生育する鉄欠乏耐性を有するイネ科植
物を提供することを目的としている。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、イネ科植物に
ムギネ酸類生合成経路中の酵素をコードする遺伝子を導
入して、鉄吸収性が改善されたイネ科植物を製造する方
法、より詳細には、当該酵素がニコチアナミンアミノ基
転移酵素（ＮＡＡＴ）であり、それをコードする遺伝子
naatを導入する鉄吸収性が改善されたイネ科植物を製造
する方法に関する。

【００１１】また、本発明は前記した方法により製造さ
れ得るイネ科植物に関する。より詳細には本発明は、イ
ネ科植物にムギネ酸類生合成経路中の酵素をコードする
遺伝子を導入してなる鉄吸収性が改善されたイネ科植
物、さらに詳細には、当該酵素がニコチアナミンアミノ
基転移酵素（ＮＡＡＴ）であり、それをコードする遺伝
子naatが導入されてなる鉄吸収性が改善されたイネ科植
物に関する。さらに、本発明は、前記鉄吸収性が改善さ
れたイネ科植物を育成する方法及び当該育成により得ら
れる作物に関する。

【００１２】単子葉植物の中のイネ科植物にのみ見られ
る鉄獲得機構である前記したストラテージ−IIは、ムギ
ネ酸類を生合成し、これを放出することにより鉄を獲得
する方法であることから、ムギネ酸類の生合成経路（図
１参照）における酵素の強化方法について検討した。本
発明者らは、ムギネ酸合成経路上の酵素としてニコチア
ナミンアミノ基転移酵素（ＮＡＡＴ）にまず着目し、そ
の遺伝子naatを導入してみたところ、驚くべきことに、
遺伝子が導入されたイネは石灰質アルカリ土壌でも旺盛
に生育することを見出した。

【００１３】ニコチアナミンアミノ基転移酵素（ＮＡＡ
Ｔ）の遺伝子ｎａａｔ−ＡのｃＤＮＡを、ｐＩＧ１２１
ＨｍにＸｂａＩ及びＳａｃＩ部位を使って組み込んで、
図２に示すバイナリーベクターを作成した。得られたベ
クターをアグロバクテリウムに導入し形質転換に用い
た。イネの形質転換はヒエイら（Hieiら（1994））の方
法に従い、材料に「つきのひかり」を用い、胚盤から誘
導したカルスを前記した形質転換したアグロバクテリウ
ム懸濁液に浸し感染させて、再生体（Ｔ１植物）を得、
この種子から最終的に３４系統の形質転換イネを得た。

【００１４】導入された遺伝子の検出をサザンハイブリ
ダイゼーション法により行った。結果を図３に示す。図
３のＷＴは野生種のイネの場合を示し、ｃｏｎｔｒｏｌ
はベクターのみを導入した対照のイネの場合を示し、１
−５、１−６、１−７、８−１及び１５−２は３５Ｓプ
ロモーターを有する形質転換体を示す。図３に示される
ように形質転換体はいずれもｎａａｔ−Ａを過剰発現し
ていることがわかる。また、３５Ｓ形質転換イネのう
ち、８−１、１５−２には少なくともそれぞれ５コピ
ー、２コピーのｎａａｔが導入されたことが分かった。
遺伝子ｎａａｔを導入することにより、野生種やベクタ
ーのみを導入したものに比べてニコチアナミンアミノ基
転移酵素（ＮＡＡＴ）が過剰に発現され、その結果とし
てムギネ酸合成経路が活性化され、鉄の取り込みに必要
とされるムギネ酸類が多量に産生されていることが推察
される。

【００１５】そこで、まずこれらの種のＮＡＡＴ活性を
検討した。発芽後３週間の幼植物（Ｔ２）を鉄存在（＋
Ｆｅ）及び鉄欠乏（−Ｆｅ）の水耕液でそれぞれ２週間
栽培し、それぞれの根におけるＮＡＡＴの活性を測定し
た結果を図４に示す。図４の白抜き部分は＋Ｆｅの場合
を示し、斜線部分は−Ｆｅの場合を示す。ＷＴは野生種
のものを示し、１−５、１−６及び１−７は形質転換体
のものを示す。この結果、＋Ｆｅ、−Ｆｅのいずれにお
いても形質転換していない野生種（ＷＴ）よりも形質転
換したもののほうが比活性が高く、−Ｆｅの時さらに比
活性が高くなることがわかった。このことは遺伝子の導
入により、ＮＡＡＴの活性が高くなることを示している
のみならず、形質転換体は鉄欠乏状態又は鉄の不溶態化
した状態においてＮＡＡＴ活性が非常に亢進されること
を示している。即ち、鉄欠乏状態又は鉄の不溶態化した
状態において強い耐性を有する種となっていることが推
察された。

【００１６】以上のことにより、遺伝子ｎａａｔを導入
することによりＮＡＡＴ活性が亢進されることがわかっ
たが、これらの形質転換体が実際の鉄欠乏土壌で生育で
きるかどうかを検討した。３５Ｓ−ｎａａｔ−Ａ形質転
換イネを鉄の不溶態化したアルカリ土壌に移植すると、
移植後２週間目までは葉が黄化してくるが、その後の４
〜５週間目に新葉が濃い緑になり回復し始めた。図５の
アルカリ土壌に移植後８週目の生育状況の写真を挙げ
る。図５のコントロール（control）は、ベクターのみ
を移植した対照のイネを示し、その右側のイネは形質転
換したものである。コントロールのものに比べて形質転
換体のものの発育が格段に優れていることがわかる。ま
た、アルカリ土壌移植後の草丈の変化を図６に示す。図
６のグラフの縦軸は草丈（ｃｍ）であり、横軸はアルカ
リ土壌移植後の日数（日）を示す。黒丸印は形質転換体
１５−２を示し、黒四角印は形質転換体８−１を示し、
白丸印はｃｏｎｔｒｏｌとして用いたベクターのみを移
植した対照のイネを示す。

【００１７】前述したように、３５Ｓ形質転換イネ８−
１には少なくとも５コピーのｎａａｔ遺伝子が、また、
３５Ｓ形質転換イネ１５−２には少なくとも２コピーの
ｎａａｔ遺伝子が導入されており、図６の草丈からみれ
ば遺伝子のコピー数には余り関係無く、遺伝子が導入さ
れていればイネに鉄欠乏耐性が付与できることが示され
たことになる。このように、イネのムギネ酸合成経路の
なかの酵素の活性を、その遺伝子の導入により高めるこ
とができ、さらにそれにより鉄欠乏耐性が与えられるこ
とがわかった。

【００１８】本発明のイネのムギネ酸合成経路のなかの
酵素としては、図１に示すムギネ酸類の生合成経路の中
の酵素であって、当該酵素をコードする遺伝子を導入す
ることによりその活性が高められるものであればよい
が、前記したようにその中のニコチアナミンアミノ基転
移酵素（ＮＡＡＴ）やニコチアナミン合成酵素が好まし
い。本発明のイネのムギネ酸合成経路のなかの酵素をコ
ードする遺伝子としては、ｃＤＮＡであってもゲノム由
来のものであってもよい。後述するようにゲノムの使用
も本発明の好ましい例である。したがって、本発明のイ
ネ科植物としては、ストラテージIIの機構により鉄を吸
収することが可能な植物であればよく、学術上のイネ科
植物に限定されるものではない。本発明の好ましいイネ
科植物の例としては、イネ、トウモロコシ、ソルガム、
小麦，大麦、エンバクなどが挙げられる。これらのイネ
科植物はその品種に関係なく、広く本発明の方法を適用
することができ、目的とする遺伝子が導入されたイネ科
植物を製造することができる。

【００１９】本発明のプロモーターとしては、目的の酵
素を発現させることができるものであれば特に制限はな
く、３５Ｓプロモーター、より具体的にはＣａＭＶ３５
Ｓプロモーターなどを用いることができる。本発明のベ
クターとしては、形質転換において好適に使用すること
ができるものであれば、特に制限はない。本発明の形質
転換法としては、前記したアグロバクテリウムを用いる
方法に限定されるものではなく、ファージなどを用いた
各種の形質転換法を採用することもできる。また、形質
転換されるイネ科植物の細胞としては、前記したカルス
からの細胞に限定されるものではなく、各種の細胞を使
用することもできるが、通常はカルス由来のものが好ま
しい。本発明の鉄欠乏とは、鉄分が欠乏している状態で
あってもよいが、好ましくは植物が吸収することができ
る状態の鉄分が欠乏している状態であり、植物の種類に
応じて鉄欠乏状態であるか否かを決めることもできる。
したがって、本発明における鉄欠乏耐性とは、目的とす
る植物がその土壌においては鉄分を吸収するのが困難な
状態に対する耐性であるということもできる。

【００２０】次に本発明者らは、ｎａａｔのｃＤＮＡに
代えてオオムギのゲノムｎａａｔの導入を試みた。ゲノ
ムｎａａｔは、オオムギ(Horudeum vulgare L. var. Ig
ri)より抽出したゲノムＤＮＡを用いて作成されたライ
ブラリー（SRTRATAGENE社製）を用いた。このライブラ
リーは、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分的に切断され、λ
ＦＩＸＩＩベクターのＸｈｏＩサイトに導入されたもの
である。プローブとしては、先に単離したｎａａｔ−Ａ
ｃＤＮＡの全長を用いた。ホストとしては、大腸菌XL
1-Blue MRA（E. coli XL1-Blue MRA (P2)）を使用し
た。

【００２１】スクリーニングの結果、５つのファージが
得られ、これらについてそれぞれファージＤＮＡの単離
を行い、それぞれについて制限酵素地図を作製したとこ
ろ、すべて同じ断片を含むことが解った。すなわち、得
られた５つのファージは同じゲノムの部分から由来する
ものであることが解った。また、これらはプローブに使
用したｎａａｔを含むことが予想された。そこで、図７
に示すこのうちの１つについて塩基配列の決定を行っ
た。

【００２２】図７に示したファージＤＮＡを、１０ｋｂ
以上の断片を挿入でき、かつアグロバクテリウムを用い
たイネの形質転換を行うことのできるプラスミドベクタ
ーｐＢＩＧＲＺ１のＮｏｔＩサイトに挿入した（図８参
照）。さらに、図７に示した断片について１１．０ｋｂ
までを、Ａ〜Ｄまでの４つに分け、これらをプラスミド
ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＥｃｏ
ＲＩサイト（Ｂ、Ｃ）、またはＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩサ
イト（Ａ、Ｄ）に導入した。Ａ〜Ｄの各断片についてプ
ラスミド上の配列を元にしたプライマー（Ｍ１３フォワ
ードプライマー，Ｍ１３リバースプライマー）にて断片
の両端から塩基配列を決定した。塩基配列の決定には島
津製作所社製ＤＮＡシーケンサＤＳＱ−２０００Ｌを使
用した。配列決定の詳細は後述する実施例に記載されて
いる。

【００２３】決定した１０，９６６ｂｐの塩基配列を配
列表の配列番号１示す。また、全配列を図９〜図１２
（塩基番号なし）に示した。得られた塩基配列から、こ
の１０，９６６ｂｐの遺伝子は、これまで得られていた
ｎａａｔ−Ａとｎａａｔ−Ｂをコードするオオムギゲノ
ムの断片であることがわかった。順序はｎａａｔ−Ｂ、
ｎａａｔ−Ａの順であった。図１３〜図１９にｃＤＮＡ
と比較して決定したｎａａｔ−Ａとｎａａｔ−Ｂの５’
上流、エキソン、イントロン、３’下流を示した。図１
３〜図１９において大文字がｃＤＮＡに転写されていた
エキソン部分を示し、小文字がそれ以外の部分を示して
いる。エキソン部分の塩基番号はそれぞれ以下のように
なる。

【００２４】この模式図を、図２０に示した。エキソン
部分を斜線で塗った部分で示してある。両遺伝子ともに
６つのイントロン、７つのエキソンで形成されている。
また、イントロンの挿入位置は、各遺伝子ともに相同の
位置であった。ｃＤＮＡのどの位置にどの大きさのイン
トロンが挿入されているかを図２１に示した。このゲノ
ムから予想されるｎａａｔ−Ａ及びｎａａｔ−Ｂのアミ
ノ酸配列を図２２及び図２３にそれぞれ示した。

【００２５】得られたオオムギのゲノムｎａａｔを導入
したイネの形質転換法は、前述した３５Ｓの形質転換イ
ネの形質転換法に準じて行った。次に得られたゲノムｎ
ａａｔを導入したイネの鉄欠乏耐性の検定を行った。得
られた再生体（Ｔ１）のうち３９個体とベクターのみを
導入したコントロール（control）１５個体を用いて３
５Ｓの形質転換植物と同様に検定を行った。移植後５週
目から、１週間または２週間ごとに草丈の測定を行っ
た。４−５週間ごとに２回土壌サイズを増やしたポット
に移し変えた。

【００２６】ゲノムｎａａｔで形質転換されたイネは、
アルカリ土壌に移植後２週間目までに葉が黄化し４〜５
週間目に新葉が濃い緑になり回復し始め、俄然旺盛な生
育を示すようになった。これに対してベクターのみを入
れた対照区は永く黄化葉が続き、８週目あたりから新葉
の緑化が始まった。図２４は、アルカリ土壌に移植後１
０週間目の生育の状況を移した写真である。図２４のｃ
ｏｎｔｒｏｌは、ベクターのみを移植した対照のイネを
示す。右側のイネはゲノムｎａａｔで形質転換したもの
である。アルカリ土壌移植後の草丈の変化を図２５に示
す。図２５のグラフの縦軸は草丈（ｃｍ）であり、横軸
はアルカリ土壌移植後の日数（日）を示す。図２５の左
側はゲノムｎａａｔで形質転換したイネであり、右側は
ベクターのみを移植した対照のイネである。これによ
り、ゲノムｎａａｔの導入によりイネに鉄欠乏耐性が付
与できたことがわかった。

【００２７】

【実施例】次に、具体例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるもので
はない。

【００２８】実施例１（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターで
ｎａａｔを過剰発現するイネの形質転換法） 図２に示すバイナリーベクターを、遺伝子ｎａａｔのｃ
ＤＮＡをｐＩＧ１２１ＨｍにＸｂａＩ及びＳａｃＩ部位
を使って組み込んで作成した。これをアグロバクテリウ
ムに導入し形質転換に用いた。イネの形質転換はヒエイ
ら（Hiei, et al., （1994））の方法に従い、材料に
は「つきのひかり」を用いた。まず、籾を取り除いた種
子を滅菌して、Ｎ６無機塩 Ｎ６ビタミン ３０ｇ／
Ｌ、スクロース（sucrose） ２ｍｇ／Ｌ、２，４−Ｄ
２ｇ／Ｌゲルライト（gelrite）からなるカルス誘導
培地（ｐＨ ５．８）に播種し、６０μｍｏｌ／ｍ２ｓ
で、１６時間明期／８時間暗期の条件で２５℃、３週間
培養して胚盤からカルスを誘導した。新しい培地に移
し、２５℃明所で３日間培養した後、アグロバクテリウ
ム懸濁培地（ｐＨ５．８）（ＡＡ無機塩 アミノ酸 Ｂ
_５ビタミン ２０ｇ／Ｌ、スクロース（sucrose） ２
ｍｇ／Ｌ、２，４−Ｄ ０．２ｍｇ／Ｌ、キネチン（ki
netin） １０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴン（acetosyring
one））でアグロバクテリウム懸濁液に浸し、ペーパー
タオルで水を切った後、共存培養培地（ｐＨ５．２）
（Ｎ_６無機塩 Ｎ_６ビタミン ３０ｇ／Ｌ、スクロース
（sucrose） １０ｇ／Ｌ、グルコース（glucose） ２
ｍｇ／Ｌ、２，４−Ｄ １０ｍｇ／Ｌ アセトシリンゴ
ン（acetosyringone） ２ｇ／Ｌゲルライト（gelrit
e））で２８℃暗黒下で３日間感染させた。

【００２９】その後、５００ｍｇ／Ｌでクラフォランを
入れた滅菌水洗浄液でカルスを洗ってアグロバクテリウ
ムを除去し、５０ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含む選
抜培地（ｐＨ５．８）（Ｎ_６無機塩 Ｎ_６ビタミン ３
０ｇ／Ｌ、スクロース（sucrose） ２ｍｇ／Ｌ、２，
４−Ｄ ２ｇ／Ｌ、ゲルライト（gelrite） ５００ｍ
ｇ／Ｌ、クラフォラン ５０ｍｇ／Ｌ、ハイグロマイシ
ン（hygromycin））上に置床して２５℃明所で３週間培
養した。培養後、再分化培地（ｐＨ５．８）（ＭＳ無機
塩 ＭＳビタミン ３０ｇ／Ｌ、スクロース（sucros
e） ３０ｇ／Ｌ、ソルビトール（sorbitol） ２ｇ／
Ｌ、カサミノ酸類（casamino acids） １ｍｇ／Ｌ、Ｎ
ＡＡ ２ｍｇ／Ｌ、ＢＡＰ５００ｍｇ／Ｌ、クラフォラ
ン ５０ｍｇ／Ｌ、ハイグロマイシン（hygromycin）
４ｇ／Ｌ、ゲルライト（gelrite））に移し３〜５週間
で再分化してきた再生体（Ｔ１植物）を検定培地に移し
た。検定培地（ｐＨ５．８）は、ＭＳ無機塩 ＭＳビタ
ミン ３０ｇ／Ｌ、スクロース（sucrose） ５０ｍｇ
／Ｌ、ハイグロマイシン（hygromycin） ８ｇ／Ｌ、寒
天（agar）からなっている。

【００３０】シャーレ一杯に大きくなった植物体を４〜
５日間馴化させた後、合成培土（ボンソル１号、住友化
学）とバーミキュライトを１：１にまぜた土に移植して
種子をとった。最終的に３４系統の形質転換イネを得
た。

【００３１】実施例２（導入された遺伝子のサザンハイ
ブリダイゼーション法による検出） 実施例１で得られたＴ１植物の葉を磨砕し、Ｃ−ＴＡＢ
法の改変によりゲノムを抽出した。抽出したゲノムをＨ
ｉｎ ｄＩＩＩで処理し、０．８％アガロースゲルを用
いた電気泳動で分離した。これをナイロンメンブレンに
ブロッティングした。プローブにｎａａｔの内部配列で
作成したプライマーを用いてＰＣＲによって^３２Ｐでラ
ベルしたものを用いてハイブリダイゼーションを行った
後、ＢＡＳ２０００（フジフィルム）によってバンドを
検出した。このサザンハイブリダイゼーションの結果を
図３に示す。図３のＷＴは野生型のイネの場合を示し、
ｃｏｎｔｒｏｌはべくたーのみを導入した対照のイネの
場合を示し、１−５、１−６、１−７、８−１及び１５
−２は３５Ｓプロモーターでｎａａｔ−Ａを過剰発現す
るイネの場合を示す。図３に示す結果より、３５Ｓ形質
転換イネのうち、８−１、１５−２には少なくともそれ
ぞれ５コピー、２コピーのｎａａｔが導入されたことが
分かった。

【００３２】実施例３（アルカリ土壌を用いた鉄欠乏耐
性の検定） 供試土壌として、次の構成成分からなる貝化石土壌を用
いた。 この土壌の可溶性の鉄濃度は２２ｐｐｍであり、ｐＨは
８．７８であり、電気抵抗は０．０３ｍΩであった。

【００３３】３５Ｓの形質転換植物の検定には、最初に
得られた形質転換植物の再生体（Ｔ１）の種子を５０ｍ
ｇ／Ｌのハイグロマイシンを含むＭＳ固形培地上に播種
して選抜、馴化後、２０〜２５ｃｍになった幼植物（Ｔ
２）を用いた。３４系統のうちの１６系統２７種につい
て耐性の検定を行った。検定法はプラスチックの黒ポッ
ト（０．５Ｌ）の底にペーパータオルとろ紙を円形に切
ってしき、アルカリ土壌を入れたものに植物を移植し、
水耕液（春日井氏液；７×１０ ^−４Ｍ Ｋ_２ＰＯ_４，１
×１０^−４Ｍ ＫＣｌ，１×１０^−４Ｍ ＫＨ_２Ｐ
Ｏ_４，２×１０^−３Ｍ Ｃａ（ＮＯ_３）_２，５×１０
^−４Ｍ ＭｇＳＯ_４，１×１０ ^−５Ｍ Ｈ_３ＢＯ_３，５
×１０^−７Ｍ ＭｎＳＯ_４，５×１０^−７Ｍ ＺｎＳＯ
_４，２×１０^−４Ｍ ＣｕＳＯ_４，１×１０^−８Ｍ
（ＮＨ_４）_３ＭｏＯ_２４，１．５×１０^−４Ｍ Ｆｅ−
ＥＤＴＡ）をポットの底から２〜３ｃｍ浸し、昼３０
℃、夜２５℃の温室で栽培した。アルカリ土壌は３〜４
週間後にポットのサイズを１Ｌにし、８〜９週間後に２
Ｌと一回りづつ大きくして植え替えた。移植後２週目か
ら、１週間または２週間ごとに草丈の測定を行った。

【００３４】＋Ｆｅ（鉄存在）又は−Ｆｅ（鉄欠乏）の
水耕液で育てた形質転換イネ（３５Ｓｎａａｔ イネ）
のＮＡＡＴ比活性の測定を次のようにして行った。発芽
後３週間の幼植物（Ｔ２）を＋Ｆｅ、−Ｆｅの水耕液で
２週間栽培しそれぞれの根におけるＮＡＡＴ活性を測定
した。その結果を図４に示す。図４の白抜き部分は＋Ｆ
ｅの場合を示し、斜線部分は−Ｆｅの場合を示す。ＷＴ
は野生種のものを示し、１−５、１−６及び１−７は形
質転換体のものを示す。＋Ｆｅ、−Ｆｅのいずれにおい
ても形質転換していない野生種（ＷＴ）よりも形質転換
したもののほうが比活性が高く、−Ｆｅの時さらに比活
性が上乗せされた（図４参照）。

【００３５】実施例４（アルカリ土壌による鉄欠乏耐性
の検定） ３５Ｓ−ｎａａｔ−Ａ形質転換イネをアルカリ土壌に移
植して、その生育を観察した。３５Ｓ−ｎａａｔ−Ａ形
質転換イネは、移植後２週間目までに葉が黄化し４〜５
週間目に新葉が濃い緑になり回復し始め、ｎａａｔの導
入によりイネに鉄欠乏耐性が付与できたことがわかっ
た。移植後８週目の生育状況の写真を図５に示す。図５
のｃｏｎｔｒｏｌは、ベクターのみを移植した対照のイ
ネを示す。右側のイネは形質転換したものである。アル
カリ土壌移植後の草丈の変化を図６に示す。図６のグラ
フの縦軸は草丈（ｃｍ）であり、横軸はアルカリ土壌移
植後の日数（日）を示す。黒丸印は形質転換体１５−２
を示し、黒四角印は形質転換体８−１を示し、白丸印は
ｃｏｎｔｒｏｌとして用いたベクターのみを移植した対
照のイネを示す。遺伝子ｎａａｔの導入によりイネに鉄
欠乏耐性が付与できたことがわかった（図５、図６）。

【００３６】実施例５（ｎａａｔ−Ａ及びＢゲノミック
クローンの単離） スクリーニングの手順は主に「クローニングとシーケン
ス」（農村文化社）によった。ライブラリーとして、ス
トラタジーン（SRTRATAGENE）社より購入したλＦＩＸ
ＩＩライブラリーを用いた。これはオオムギ（Horudeum
vulgare L. var. Igri）より抽出したゲノムＤＮＡを
用いて作成されたものである。ゲノムＤＮＡは、制限酵
素Ｓａｕ３ＡＩで部分的に切断され、λＦＩＸＩＩベク
ターのＸｈｏＩサイトに導入されたものである。ライブ
ラリーのインサートサイズは９〜２３ｋｂである。

【００３７】（１） ＮＺＣＹＭ液体培地（ＮＺアミン
１０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、カサミノ酸 １ｇ、バクト
イースト抽出物（Bacto-yeast extract） ５ｇ、Ｍｇ
ＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ２ｇ、及び、１Ｎ ＮａＯＨ 約６
ｍＬを蒸留水で１Ｌにし（ｐＨ７．５）オートクレーブ
で殺菌したもの。）で一晩培養した大腸菌（Ｅ． ｃｏ
ｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＡ （Ｐ２））を遠心し
た後、１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４溶液２０ｍＬに懸濁した。 （２） この大腸菌懸濁液１００ｍＬとファージ希釈液
（スクリーニング用プレート（９ｃｍｘ１３ｃｍ）に２
５，０００プラークを形成する量）１００ｍＬとを混
ぜ、３７℃２０分静置後、８ｍＬの５０℃ ０．７％ト
ップアガー（１００ｍＬあたり０．７ｇのアガロースを
加えたもの）と混ぜ、スクリーニング用プレート（９ｃ
ｍｘ１３ｃｍ）にまいた。プレートは３７℃に静置し、
プラークのサイズが０．５ｍｍになるまで培養した。

【００３８】（３） ナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ
−Ｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）をプレートのサイズに切り
取り、トップアガロースの上に３０秒間おいた。これを
変性液（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）を
含ませた濾紙の上にプラークと接触した面を上にして置
いた。２枚目のメンブレンをトップアガロース上に置
き、１分間放置した。同様に変性液をしみこませた濾紙
上においた。５分間放置した後、２枚のメンブレンを中
和液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０、
１．５Ｍ ＮａＣｌ）をしみこませた濾紙上に移した。
５分間放置後、２ｘＳＳＰＥ（０．０２Ｍ ＮａＨ_２Ｐ
Ｏ_４ ｐＨ７．４、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤ
ＴＡ）液で２回よく洗い、乾燥させた。

【００３９】（４） 先に単離したｎａａｔ−ＡのｃＤ
ＮＡ全長をプローブとして使用するために、プラスミド
ベクターｐＹＨ２３のＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩサイ
トに入っているものを同サイトで切り出し、精製した。
これをランダムプライマーＤＮＡラベリングキット第２
版（Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2（宝酒
造））を用いて［α−^３２Ｐ］ｄＡＴＰでラベル化し
た。一方、メンブレンを予め６５℃に加温しておいた３
０ｍＬのハイブリダイゼーションバッファー（６ｘＳＳ
ＰＥ、５ｘデンハルト溶液、０．１％ ＳＤＳ、１００
ｍｇ／ｍＬ変性サケ精巣ＤＮＡ）でプレハイブリダイゼ
ーションを６５℃で１時間行い、ハイブリダイゼーショ
ンバッファーを交換した（２５ｍＬ）。

【００４０】これに、前記で調製したプローブを加え、
６５℃で１２時間ハイブリダイゼーションを行った。メ
ンブレンの洗浄は予め６５℃に加温しておいた洗浄液
（５ｘＳＳＰＥ）で６５℃で１０分間を２回、ハイスト
リージェント（high stringent）洗浄液（２ｘＳＳＰ
Ｅ、０．１％ ＳＤＳ）６５℃で１回を行った。メンブ
レンをサランラップで包み、イメージングプレート（フ
ジフィルム）に一晩感光させ、イメージングアナライザ
ー（フジフィルム）で結果を得た。試薬は、２０ｘＳＳ
ＰＥ（０．２Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４ ｐＨ７．４、３Ｍ
ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）、５０ｘデンハルト溶
液、５ｇ フィコール４００、５ｇ ポリビニルピロリ
ドン（ＭＷ ３６０，０００）、５ｇ 仔ウシ血清アル
ブミンを５００ｍＬの蒸留水に溶解し、０．４５ｍｍの
フィルターで濾過したものを使用した。

【００４１】（５） 二枚のメンブレンに共通して現れ
たものをポジティブとして、この場所に対応するプラー
クを元のシャーレから打ち抜いた。打ち抜いたものはＳ
Ｍ液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．
１Ｍ ＮａＣｌ、７ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．０１％ ゼ
ラチン）にとり、４℃で保存した。その後、このファー
ジ液を使って同様に２次、３次スクリーニングを行っ
た。最終的に５つのファージが得られた。

【００４２】上記で得られた５つのファージについてそ
れぞれファージＤＮＡの単離を行った。それぞれについ
て制限酵素地図を作製したところ、すべて同じ断片を含
むことが解った。すなわち、得られた５つのファージは
同じゲノムの部分から由来するものであることが解っ
た。また、これらはプローブに使用したｎａａｔを含む
ことが予想された。そこで、このうちの１つ（図７参
照）について塩基配列の決定を行うこととした。図７中
のＥはＥｃｏＲＩを、ＨはＨｉｎｄIIIを、ＢはＢａｍ
ＨＩを、ＮはＮｏｔＩをそれぞれ示す。両端のＮｏｔＩ
サイトはλＦＩＸＩＩのアームにあるＮｏｔＩである。

【００４３】実施例６（サブクローニングと塩基配列の
決定） （１） 図７に示したファージＤＮＡを、１０ｋｂ以上
の断片を挿入でき、かつアグロバクテリウムを用いたイ
ネの形質転換を行うことのできるプラスミドベクターｐ
ＢＩＧＲＺ１に挿入した。図７で示したファージＤＮＡ
のはじめのＮｏｔＩサイトから１１．０ ｋｂにあるＮ
ｏｔＩサイトまでの断片１１．０ｋｂｐを切り出し、ｐ
ＢＩＧＲＺ１のＮｏｔＩサイトに挿入した（図８参
照）。図８のＮＰＴIIはカナマイシン耐性遺伝子を、Ｈ
ＰＴはハイグロマイシン耐性遺伝子を、ＧＵＳはイント
ロン入りβグルクロニダーゼ遺伝子を、ＬａｃＺはβガ
ラクトシダーゼ遺伝子を、３５Ｐは３５Ｓプロモーター
を、ＮＰはＮＯＳプロモーターを、ＮＴはＮＯＳターミ
ネーターを、ＭＣＳはマルチクローニングサイトを、Ｒ
ｉｏｒｉはＲｉプラスミド複製起点をそれぞれ示してい
る。すなわち、塩基配列の決定を行ったのは、この１
１．０ｋｂについてである。後のイネの形質転換にはこ
の作成したコンストラクトを使用した。

【００４４】（２） ｐＢＩＧＲＺ１は大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ ＸＬ１−ｂｌｕｅ）内で安定に保持される。こ
のコンストラクトを持った大腸菌を培養し、ここからプ
ラスミドをプラスミド調整器ＰＩ−５０α（倉敷紡績株
式会社）により抽出した。 （３） 図７に示した断片について１１．０ｋｂまで
を、Ａ〜Ｄまでの４つに分け、これらをプラスミドベク
ターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のＥｃｏＲＩ
サイト（Ｂ、Ｃ）、またはＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩサイト
（Ａ、Ｄ）に導入した。 （４） Ａ〜Ｄの各断片についてプラスミド上の配列を
元にしたプライマー（Ｍ１３フォワードプライマー，Ｍ
１３リバースプライマー）にて断片の両端から塩基配列
を決定した。塩基配列の決定には島津製作所社製ＤＮＡ
シーケンサＤＳＱ−２０００Ｌを使用した。

【００４５】（５） 各断片について塩基配列の決定さ
れた部分からさらに先を読むためのプライマーとそこま
で読めた配列を逆方向から確認するためのプライマーを
作成し、順次塩基配列を決定した。最終的には全ての断
片について、５’方向からと３’方向から両方向につい
て配列決定を行った。各断片の塩基配列を決定するのに
使用したプライマーの配列を以下に示す。これらのプラ
イマーは、ＤＳＱ−２０００Ｌでの使用のため５’末端
にフルオレセインイソチオシアネート(fluorescein iso
thiocyanate, ＦＩＴＣ）でラベルした。

【００４６】断片Ａ用のプライマー 名称:配列 F-A1F: FITC-5'-gct act agt agt att cct
ggt gta g 名称:配列 F-A1R: FITC-5'-gga gta cta cta gac tac
acc agg a 名称:配列 F-A2F: FITC-5'-aca tgc gca tgc atg aat
tgc cg 名称:配列 F-A2R: FITC-5'-caa ttc atg cat gcg cat
gtg cc

【００４７】断片Ｂ用のプライマー 名称:配列 F-B1F: FITC-5'-ggt caa gta tgc agt atg
ttg gaa c 名称:配列 F-B1R: FITC-5'-gtt cca aca tac tgc ata
ctt gac c 名称:配列 F-B2F: FITC-5'-cta gaa gcc tat gga tgt
ttc ttt tgg 名称:配列 F-B2R: FITC-5'-cca aaa gaa aca tcc ata
ggc ttc tag 名称:配列 F-B3F: FITC-5'-agt tct tat caa ttt ccg
aga tga c 名称:配列 F-B3R: FITC-5'-ata gtc atc tcg gaa att
gat aag a 名称:配列 F-B4F: FITC-5'-agt ggt cac cat gcg gac
caa cac c 名称:配列 F-B4R: FITC-5'-ggt gtt ggt ccg cat ggt
gac cac t

【００４８】断片Ｃ用のプライマー 名称:配列 F-C1F: FITC-5'-cac cgg cca gtt caa ctg
cta cgc 名称:配列 F-C1R: FITC-5'-gcg tag cag ttg aac tgg
ccg gtg 名称:配列 F-C2F: FITC-5'-ttt gga gga gat cca tga
cga cat a 名称:配列 F-C2R: FITC-5'-tat gtc gtc atg gat ctc
ctc caa a 名称:配列 F-C3F: FITC-5'-tct tct cat atg cta ctg
tgg gga t 名称:配列 F-C3R: FITC-5'-tga cat gca aca cag gga
cat gag c

【００４９】断片Ｄ用のプライマー 名称:配列 F-D1F: FITC-5'-cat gct gac gaa gag cga
ggt cat a 名称:配列 F-D1R: FITC-5'-ccc agg ata tga cct tag
tgg ttg g

【００５０】（６） 上で完全に配列決定ができなかっ
た部分について新たに下に示すプライマーを合成し、パ
ーキンエルマージャパン社製自動ＤＮＡシーケンサABI
PRISMTM 310 genetic Analyzerを使用して、完全に塩基
配列を決定した。 断片Ｂ用のプライマー 名称:配列 B5F: 5'-gaa tgg caa act ggg tcc gca tta
c 名称:配列 B5R: 5'-gta atg cgg acc cag ttt gcc att
c 名称:配列 B6F: 5'-ctg gtt gtt gtg gcc tgg acg aaa
c 名称:配列 B6R: 5'-gtt tcg tcc agg cca caa caa cca
g 名称:配列 B7F: 5'-agc aca aac cct acc tat gtt agg
c 名称:配列 B7R: 5'-gcc taa cat agg tag ggt ttg tgc
t

【００５１】断片Ｃ用のプライマー 名称:配列 C4F: 5'-tgg aat ttc gcc cgg ggc aag gac 名称:配列 C4R: 5'-ccc tgt gac aag tgc tct gct acg 名称:配列 C5F: 5'-tct ggg atc tca gtg cat cca aca 名称:配列 C5R: 5'-gaa gca tat atc agt caa aca taa
cc

【００５２】また、断片Ａと断片Ｂ、断片Ｂと断片Ｃの
つなぎ目部分を確定するために以下のプライマーを作成
して、（１）で作成したコンストラクトをパーキンエル
マージャパン社製自動ＤＮＡシーケンサABI PRISMTM 31
0 genetic Analyzerを使用して、塩基配列を決定した。 断片Ａと断片Ｂの境目 名称：配列 A-eF: 5'-cac atc ctt tgc ctt gct gaa t
at gg 名称：配列 B-tR: 5'-cag tag tac taa tta atc acc t
ta gta gc 断片Ｂと断片Ｃの境目 名称：配列 B-eF: 5'-cac gat caa cca aag aat gtc c
tc c 名称：配列 C-tR: 5'-tac ttg tat atg cag ctc cag c
ac （７） 決定した１０，９６６ｂｐの塩基配列を配列表
の配列番号１示す。また、全配列を図９〜図１２（塩基
番号なし）に示した。

【００５３】得られた塩基配列から、この１０，９６６
ｂｐの遺伝子は、これまで得られていたｎａａｔ−Ａと
ｎａａｔ−Ｂをコードするオオムギゲノムの断片である
ことがわかった。順序はｎａａｔ−Ｂ、ｎａａｔ−Ａの
順であった。図１３〜図１９にｃＤＮＡと比較して決定
したｎａａｔ−Ａとｎａａｔ−Ｂの５’上流、エキソ
ン、イントロン、３’下流を示した。図１３〜図１９に
おいて大文字がｃＤＮＡに転写されていたエキソン部分
を示し、小文字がそれ以外の部分を示している。エキソ
ン部分の塩基番号はそれぞれ以下のようになる。

【００５４】ｎａａｔ−Ｂ 第１エキソン ５７９−１
２９９ （開始コドン ６５１８） 第２エキソン １４８３−１８２５ 第３エキソン １９２２−２１４０ 第４エキソン ２２４４−２３０３ 第５エキソン ２７６１−２９１６ 第６エキソン ３２６３−３３５６ 第７エキソン ３７３５−４０３３（終始コドン ３８
６８）

【００５５】ｎａａｔ−Ａ 第１エキソン ６４５７−
６８９７（開始コドン ６５１８） 第２エキソン ７０２９−７３７１ 第３エキソン ７４７９−７６９７ 第４エキソン ７７８４−７８４３ 第５エキソン ８２８５−８４４０ 第６エキソン ８７３８−８８３１ 第７エキソン ９４１４−９７３２（終始コドン ９５
４７）

【００５６】この模式図を、図２０に示した。エキソン
部分を斜線で塗った部分で示してある。両遺伝子ともに
６つのイントロン、７つのエキソンで形成されている。
また、イントロンの挿入位置は、各遺伝子ともに相同の
位置であった。ｃＤＮＡのどの位置にどの大きさのイン
トロンが挿入されているかを図２１に示した。このゲノ
ムから予想されるｎａａｔ−Ａ及びｎａａｔ−Ｂのアミ
ノ酸配列を図２２及び図２３にそれぞれ示した。

【００５７】実施例７（オオムギのゲノムnaatを導入し
たイネの形質転換法） 前記した実施例６で得られたオオムギのゲノムｎａａｔ
を導入したイネの形質転換法は、以下に示す（１）〜
（３）の点を除いては３５Ｓの形質転換イネのときと同
様に形質転換を行った。 （１）カルス誘導を２８℃暗所で行い、カルス誘導培地
を、Ｎ６無機塩 Ｎ６ビタミン ０．３ｇ／Ｌ、カサミ
ノ酸（casamino acid） ３０ｇ／Ｌ、スクロース（suc
rose） ２ｍｇ／Ｌ、２，４−Ｄ ２．８ｇ／Ｌ、プロ
リン ４ｇ／Ｌ、ゲルライト（gelrite）（ｐＨ５．
８）とした。 （２）アグロバクテリウムによる感染を２５℃で行い、
共存培養培地を、Ｎ６無機塩 Ｎ６ビタミン ３０ｇ／
Ｌ、スクロース（sucrose） １０ｇ／Ｌ、グルコース
（glucose） １ｇ／Ｌ、カサミノ酸（casamino acid）
２ｍｇ／Ｌ、２，４−Ｄ ２０ｍｇ／Ｌ、アセトシリ
ンゴン（acetosyringone） ２ｇ／Ｌ、ゲルライト（ge
lrite）（ｐＨ５．２）とし、ろ紙を敷いて行った。

【００５８】（３）選抜は、はじめの１週間を１０ｍｇ
／Ｌ、次の１週間を３０μｇ／Ｌ、最後の２週間を５０
ｍｇ／Ｌのハイグロマイシンを含む選抜培地を使い、暗
所２８℃で培養した。選抜培地として、Ｎ６無機塩 Ｎ
６ビタミン １ｇ／Ｌ、カサミノ酸（casamino aci
d）、３０ｇ／Ｌ スクロース（sucrose）、２ｍｇ／Ｌ
２，４−Ｄ、２５０ｍｇ／Ｌ クラフォラン、１０−
５０ｍｇ／Ｌ ハイグロマイシン（hygromycin）、２ｇ
／Ｌ ゲルライト（gelrite）（ｐＨ５．８）を用い、
再分化培地として、ＭＳ無機塩 ＭＳビタミン ３０ｇ
／Ｌ スクロース（sucrose）、３０ｇ／Ｌ ソルビト
ール（sorbitol）、２ｇ／Ｌ カサミノ酸（casamino a
cid）、１．１ｇ／Ｌ ＭＥＳ、２ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、
１ｍｇ／Ｌ キネチン（kinetin）、２５０ｍｇ／Ｌ
クラフォラン、５０ｍｇ／Ｌ ハイグロマイシン（hygr
omycin）、４ｇ／Ｌ ゲルライト（gelrite）（ｐＨ
５．８）を用い、２８℃で培養を行った。

【００５９】実施例８（ゲノムｎａａｔを導入したイネ
の鉄欠乏耐性の検定） ゲノムｎａａｔを導入したイネの鉄欠乏耐性の検定は、
得られた再生体（Ｔ１）のうち３９個体とベクターのみ
を導入したコントロール（control）１５個体を用いて
３５Ｓの形質転換植物と同様に検定を行った。移植後５
週目から、１週間または２週間ごとに草丈の測定を行っ
た。４−５週間ごとに２回土壌サイズを増やしたポット
に移し変えた。

【００６０】ゲノムｎａａｔで形質転換されたイネは、
アルカリ土壌に移植後２週間目までに葉が黄化し４〜５
週間目に新葉が濃い緑になり回復し始め、俄然旺盛な生
育を示すようになった。これに対してベクターのみを入
れた対照区は永く黄化葉が続き、８週目あたりから新葉
の緑化が始まった。これによりｎａａｔの導入によりイ
ネに鉄欠乏耐性が付与できたことがわかった（図２４及
び図２５参照）。図２４は、アルカリ土壌に移植後１０
週間目の生育の状況を移した写真である。図２４のｃｏ
ｎｔｒｏｌは、ベクターのみを移植した対照のイネを示
す。右側のイネはゲノムｎａａｔで形質転換したもので
ある。アルカリ土壌移植後の草丈の変化を図２５に示
す。図２５のグラフの縦軸は草丈（ｃｍ）であり、横軸
はアルカリ土壌移植後の日数（日）を示す。図２５の左
側はゲノムｎａａｔで形質転換したイネであり、右側は
ベクターのみを移植した対照のイネである。これによ
り、ゲノムｎａａｔの導入によりイネに鉄欠乏耐性が付
与できたことがわかった。

【００６１】

【発明の効果】本発明は、鉄欠乏耐性を有する新規なイ
ネ科植物を提供するものであり、鉄欠乏耕地においても
生育可能な新規なイネ科植物を提供するものである。ま
た、本発明は、イネ科植物に、ムギネ酸類生合成経路中
の酵素をコードする遺伝子を導入することにより、鉄吸
収性が改善されたイネ科植物をえることができるという
新規な知見を提供するものである。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science And Technology Corporation <110> Mori, Satoshi <120> Creation of the transgenic graminaceous plants tolerant to Fe-deficiency in calcareous soils <130> PA900517 <160> 1 <210> 1 <211> 10966 <212> DNA <213> Horudeum vulgare L. var. Igri <400> 1 10 20 30 40 50 60 ctcgatccca ttgcaatggt atgattagct atcaaacgaa agaaagagat ggcatgtgcc 70 80 90 100 110 120 ctgtgtgtca tccctcactg gcttggcgaa tggcgatacc gagttaggta gagtgttttt 130 140 150 160 170 180 ttagcatgat gtctgccggc actgccaaga aaactgcgtg cagcggactg caggagagtt 190 200 210 220 230 240 gagcgatgca tgctttgtga tgagcggagc tgagtgggtg tcactaactg aacccaatca 250 260 270 280 290 300 gcattgggtg agtcgagtcg agaagcatca tgcttcctgc gtcccgatcc gcttatcttt 310 320 330 340 350 360 ttctcccaaa ttattaaaga gggatagatg atggtgtgct gggttgggta gagtacgtgc 370 380 390 400 410 420 atagaaccaa agcgaggcgc cgaaaatatg ccggggataa tggtggcagg ccgcaacggc 430 440 450 460 470 480 cacgcccgtc agctggcagc ggcgtgccag agcgtgccag agcgtgcgcg cgtgcgtgct 490 500 510 520 530 540 tcttgctgcc ggccccggtt cgtgtgcggt cagagcaacg gctatatagg accgtcaatc 550 560 570 580 590 600 accgctactc aatccgtccc caactcgttt cctattaccg ctactagtag tattcctggt 610 620 630 640 650 660 gtagtctagt agtactcctc ctcctccttc tcctcctacc cgtttcctca tggccaccgt 670 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6940 6950 6960 acatttacag cttcaccgta atgtatgcgt gagcatgcat gcgccggttt acttacgtgc 6970 6980 6990 7000 7010 7020 ccgccgctgt tcttccccgg tgcgttcaaa attttaacct tctataagta ccttataaaa 7030 7040 7050 7060 7070 7080 acaaacagcg ccgtagcaga gcacttgtca cagggcgtgc cctacaagct atcggccgac 7090 7100 7110 7120 7130 7140 gacgtcttcc tcaccgccgg cggaactcag gcgatcgaag tcataatccc ggtgctggcc 7150 7160 7170 7180 7190 7200 cagactgccg gcgccaacat actgcttccc cggccaggct atccaaatta cgaggcgcga 7210 7220 7230 7240 7250 7260 gcggcattca acaagctgga ggtccggcac ttcgacctca tccccgacaa ggggtgggag 7270 7280 7290 7300 7310 7320 atcgacatcg actcgctgga atccatcgcc gacaagaaca ccaccgcgat ggtcatcata 7330 7340 7350 7360 7370 7380 aacccaaaca atccgtgcgg cagcgtttac tcctacgacc atctggccaa ggttttgcat 7390 7400 7410 7420 7430 7440 ccatgcatcc tctgcctcgt tgatcgaccg gtctgtttga acatagtata tggattgcgt 7450 7460 7470 7480 7490 7500 ttgctaatcg tgtgctgatg atgctgtttg gttatcaggt cgcggaggtg gcaaggaagc 7510 7520 7530 7540 7550 7560 tcggaatatt ggtgatcgct gacgaggttt acggcaaact ggttctgggc agcgccccgt 7570 7580 7590 7600 7610 7620 ttatcccgat gggcgtcttt gggcacattg ccccggtctt gtccattgga tctctgtcca 7630 7640 7650 7660 7670 7680 agtcgtggat agtgcctgga tggcgacttg gatgggtggc ggtgtacgac cccacaaaga 7690 7700 7710 7720 7730 7740 ttttagagaa aactaaggta gctttagctc cctatcattc ttctcatatg ctactgtggg 7750 7760 7770 7780 7790 7800 gattagtatt tttgctaaat ttgtactgcc tttgtttatt cagatctcta cgtctattac 7810 7820 7830 7840 7850 7860 gaattacctt aatgtctcaa cggacccagc aaccttcgtt caggttagtc tttggttctt 7870 7880 7890 7900 7910 7920 gccctatttt gctcatgtcc ctgtgttgca tgtcaaatga ccggcttcaa gttagtatat 7930 7940 7950 7960 7970 7980 agagtttttg ttaagtgtga atgtcgaagt ccaacatgat ggaagaaaga tacatctatt 7990 8000 8010 8020 8030 8040 tttagtcatt cccctttgtt tgtttgattc cataaaataa ataaacacaa agccagaacc 8050 8060 8070 8080 8090 8100 aactattgaa tagaactatt tttcttagaa aatatacatt gtattttgag catgccatat 8110 8120 8130 8140 8150 8160 tcttttcgat caagtatgca atatattaaa acttgcattg tactacgagt ataccatgtt 8170 8180 8190 8200 8210 8220 gttaagaatt tctttaccta caacaccttg tctcgcatct tcatattttg atatccttga 8230 8240 8250 8260 8270 8280 cattattgtt ctcttatgat tcacacaact taattatgga tttttgtgct atcaaattgt 8290 8300 8310 8320 8330 8340 ttaggaagct cttcctaaaa ttcttgagaa cacaaaagca gatttcttta agaggattat 8350 8360 8370 8380 8390 8400 tggtctacta aaggaatcat cagagatatg ttatagggaa ataaaggaaa acaaatatat 8410 8420 8430 8440 8450 8460 tacgtgtcct cacaagccag aaggatcgat gtttgtaatg gtaagctaag catagactta 8470 8480 8490 8500 8510 8520 ctttttaagg ttaatctggg atctcagtgc atccaacaaa caatcaaatc aaaatataat 8530 8540 8550 8560 8570 8580 tatgttttgc tatggatctt tttgaagatg catgcatttg aagaataatg aagagagttg 8590 8600 8610 8620 8630 8640 aaattatttt aggactaatc ttcctgatat catttgtcca tttttttgtt attactgtaa 8650 8660 8670 8680 8690 8700 attggtaaca ctcaaatcat attacaaaaa gtttcctccc atttttagta agattgactt 8710 8720 8730 8740 8750 8760 cctttctata accatgtatt aacttccatg taaacaggtc aaactaaact tacatctttt 8770 8780 8790 8800 8810 8820 ggaggagatc catgacgaca taaatttttg ctgcaagctc gcaaaggaag aatctgtaat 8830 8840 8850 8860 8870 8880 tttatgtcca ggtaggaatg tatatggcca ttttaaagga aaactatatg gaataataat 8890 8900 8910 8920 8930 8940 atcttcttgt tatactaaac aatacttcct ccatcctaaa ataaatgtct tacacttagc 8950 8960 8970 8980 8990 9000 acaattttat actagatcta gtacaaagtt gaaacagtta ttttgggaca gagggagtag 9010 9020 9030 9040 9050 9060 tatatattgt gtgagaacat aaggttatgt ttgactgata tatgcttctt aaatgtgaaa 9070 9080 9090 9100 9110 9120 catgttctct tatgtttttt gattgtatac gaagttctta tcagtttccg agatgactac 9130 9140 9150 9160 9170 9180 acataaatga ttaccatatc attgtcagaa aatgtattac cacattagaa tattctttct 9190 9200 9210 9220 9230 9240 ttttatgcaa agactagcat ggcatgtact tttccttgta cctatgtgtc tttttttttc 9250 9260 9270 9280 9290 9300 tcgttacatg tttgtgcttc tcacaaaaat aataatacca agcacatgtt ccaaatgatt 9310 9320 9330 9340 9350 9360 attaataatt ttgaggtgtt tttcaaccaa cttatatact ttcatagttc taaaaaaacc 9370 9380 9390 9400 9410 9420 gtatatatgg ttaactctaa caaaaactta tatatgtttt ctctctaata cagggagtgt 9430 9440 9450 9460 9470 9480 tcttggaatg gaaaattggg tccgtattac ttttgcctgc gttccatctt ctcttcaaga 9490 9500 9510 9520 9530 9540 tggactcgaa agggtcaaat cattctgtca aaggaacaag aagaagaatt ctataaatgg 9550 9560 9570 9580 9590 9600 ttgttagttg tacacacccc tagttgtaca tctgactgaa gctgtaaatc atttctagtt 9610 9620 9630 9640 9650 9660 atccccattt atatatttca ataaaacata ttgtaatggt tctgttgtag ctgtccaagt 9670 9680 9690 9700 9710 9720 catgtactct actttttgat gtatttggcc tcattgcctt gcatcagttt caataaaaat 9730 9740 9750 9760 9770 9780 ggttgtgtac acaatgatga tgtagaggcg aggtgttttg accacctttt caacaaaaat 9790 9800 9810 9820 9830 9840 ctatatcttt caacaaatga aaccttgagt tccctttgag tagaagtcaa catactcctt 9850 9860 9870 9880 9890 9900 gaatatgcta tggtttccat ggtctggatg aaacatgatg aatagaagtg aagttatatc 9910 9920 9930 9940 9950 9960 catgtcaaag ttttttaatg tttaatttca ttatgagaac tttgatatta cttctagcac 9970 9980 9990 10000 10010 10020 acattctctg aagtaattgt cagtttggta cttgaaggga cctatatttt tcctattggg 10030 10040 10050 10060 10070 10080 gggggggggt gaataggcgg tttataacca attgtatatt tgagaatatc ttaatgtgga 10090 10100 10110 10120 10130 10140 attaaactag gtgaatattt tttccaataa agggtgcttt tattgactca caatgtacca 10150 10160 10170 10180 10190 10200 tcaagggata caatcataat gagtacacaa tcgacatcta cataatcagg ttgcatacgg 10210 10220 10230 10240 10250 10260 ccaacacaca cacacgcaca cacacattca cacacacaaa tcatgctgac gaagagcgaa 10270 10280 10290 10300 10310 10320 gtcatacaag atcaaaacta tgcctaggcg gaggaagaat agaaaaacat gaagaaatga 10330 10340 10350 10360 10370 10380 aaaaccgtga ctgacaacat actgaccatc gacgacaaac atctgtagac aacacaaaaa 10390 10400 10410 10420 10430 10440 ctgcgagaaa agttctataa aactggcgcc ttcgagaagg aaacgacgtg caagagttgc 10450 10460 10470 10480 10490 10500 catcatcgga tccaaccact aaggtcatat cctgggtttt catcctgaag atcaaatccg 10510 10520 10530 10540 10550 10560 agcaaactcc gagtaatgtc tttattaggg taacgattca aaaaatgcca caatcatgag 10570 10580 10590 10600 10610 10620 ttatgaccaa ttagaccaga cctaggattt ttatccaaag ctcgagacgg gtactctaga 10630 10640 10650 10660 10670 10680 agtaccatcc aattgaagtc atcccacttg cctcaataca aatagttgca tagatgcacg 10690 10700 10710 10720 10730 10740 gtccatatgg cgagtaatgg acatgagcgc gcatgtgtag gttaacgtga cgtgacaaga 10750 10760 10770 10780 10790 10800 gcctgtcgcc accactcgac gaagtgtttg atggggagga agaagtatgg ctccaccaac 10810 10820 10830 10840 10850 10860 atcccaagtt tgaaacattc tagagcccct taccatactc acaaagcgac aattgatgac 10870 10880 10890 10900 10910 10920 tatctgtatc agacgacaaa tccatgtccg tcactcgctc tatcttggtc attgacatac 10930 10940 10950 10960 10970 10980 tacctggcaa aggcggattc aagccccaga cagcctgggc ggccgc.... ..........

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、鉄欠乏オオムギ根のムギネ酸類生合成
経路と根圏環境を図示したものである。

【図２】図２は、ｎａａｔ−ＡのｃＤＮＡを挿入したイ
ネ科形質転換用のバイナリーベクターｐＩＧ１２１Ｈｍ
の遺伝子の配列を示したものである。

【図３】図３は、導入された遺伝子の検出をサザンハイ
ブリダイゼーション法により行った結果を示す図面に代
わる写真である。図３のＷＴは野生種のイネの場合を示
し、コントロールはベクターのみを導入した対照のイネ
の場合を示し、１−５、１−６、１−７、８−１及び１
５−２は３５Ｓプロモーターを有する形質転換体を示
す。

【図４】図４は、鉄存在（＋Ｆｅ）及び鉄欠乏（−Ｆ
ｅ）の水耕液で栽培した根におけるＮＡＡＴの活性を測
定した結果を示すものである。図４の白抜き部分は＋Ｆ
ｅの場合を示し、斜線部分は−Ｆｅの場合を示す。ＷＴ
は野生種のものを示し、１−５、１−６及び１−７は形
質転換体のものを示す。

【図５】図５は、アルカリ土壌に移植後８週目の各イネ
の生育状況を示す図面に代わる写真である。図５のコン
トロール（control）は、ベクターのみを移植した対照
のイネを示し、その右側のイネは形質転換したものであ
る。

【図６】図６は、アルカリ土壌移植後の各イネの草丈の
変化をグラフにして示したものである。黒丸印は形質転
換体１５−２を示し、黒四角印は形質転換体８−１を示
し、白丸印はコントロールとして用いたベクターのみを
移植した対照のイネを示す。

【図７】図７は、単離されたゲノムｎａａｔを含むファ
ージＤＮＡのひとつの制限酵素地図を示すものである。
図７中のＥはＥｃｏＲＩを、ＨはＨｉｎｄIIIを、Ｂは
ＢａｍＨＩを、ＮはＮｏｔＩをそれぞれ示す。両端のＮ
ｏｔＩサイトはλＦＩＸＩＩのアームにあるＮｏｔＩで
ある。

【図８】図８は、ＮＡＡＴゲノム断片を挿入したイネ科
形質転換用のバイナリーベクターｐＢＩＧＲＺ１の遺伝
子の配列を示したものである。図８のＮＰＴIIはカナマ
イシン耐性遺伝子を、ＨＰＴはハイグロマイシン耐性遺
伝子を、ＧＵＳはイントロン入りβグルクロニダーゼ遺
伝子を、ＬａｃＺはβガラクトシダーゼ遺伝子を、３５
Ｐは３５Ｓプロモーターを、ＮＰはＮＯＳプロモーター
を、ＮＴはＮＯＳターミネーターを、ＭＣＳはマルチク
ローニングサイトを、ＲｉｏｒｉはＲｉプラスミド複製
起点をそれぞれ示している。

【図９】図９は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配列を
示した４枚のうちの１枚目の図である。

【図１０】図１０は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配
列を示した４枚のうちの２枚目の図である。

【図１１】図１１は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配
列を示した４枚のうちの３枚目の図である。

【図１２】図１２は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配
列を示した４枚のうちの４枚目の図である。

【図１３】図１３は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配
列とｃＤＮＡと比較して決定したｎａａｔ−Ａとｎａａ
ｔ−Ｂの５’上流、エキソン、イントロン、３’下流を
示した７枚のうちの１枚目の図である。図１３において
大文字がｃＤＮＡに転写されていたエキソン部分を示
し、小文字がそれ以外の部分を示している。

【図１４】図１４は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配
列とｃＤＮＡと比較して決定したｎａａｔ−Ａとｎａａ
ｔ−Ｂの５’上流、エキソン、イントロン、３’下流を
示した７枚のうちの２枚目の図である。図１４において
大文字がｃＤＮＡに転写されていたエキソン部分を示
し、小文字がそれ以外の部分を示している。

【図１５】図１５は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配
列とｃＤＮＡと比較して決定したｎａａｔ−Ａとｎａａ
ｔ−Ｂの５’上流、エキソン、イントロン、３’下流を
示した７枚のうちの３枚目の図である。図１５において
大文字がｃＤＮＡに転写されていたエキソン部分を示
し、小文字がそれ以外の部分を示している。

【図１６】図１６は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配
列とｃＤＮＡと比較して決定したｎａａｔ−Ａとｎａａ
ｔ−Ｂの５’上流、エキソン、イントロン、３’下流を
示した７枚のうちの４枚目の図である。図１６において
大文字がｃＤＮＡに転写されていたエキソン部分を示
し、小文字がそれ以外の部分を示している。

【図１７】図１７は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配
列とｃＤＮＡと比較して決定したｎａａｔ−Ａとｎａａ
ｔ−Ｂの５’上流、エキソン、イントロン、３’下流を
示した７枚のうちの５枚目の図である。図１７において
大文字がｃＤＮＡに転写されていたエキソン部分を示
し、小文字がそれ以外の部分を示している。

【図１８】図１８は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配
列とｃＤＮＡと比較して決定したｎａａｔ−Ａとｎａａ
ｔ−Ｂの５’上流、エキソン、イントロン、３’下流を
示した７枚のうちの６枚目の図である。図１８において
大文字がｃＤＮＡに転写されていたエキソン部分を示
し、小文字がそれ以外の部分を示している。

【図１９】図１９は、得られたゲノムｎａａｔの塩基配
列とｃＤＮＡと比較して決定したｎａａｔ−Ａとｎａａ
ｔ−Ｂの５’上流、エキソン、イントロン、３’下流を
示した７枚のうちの７枚目の図である。

【図２０】図２０は、得られたゲノム断片のもし葛を示
す。図２０中のＥはＥｃｏＲＩを、ＨはＨｉｎｄIII
を、ＢはＢａｍＨＩを示す。

【図２１】図２１は、ｎａａｔ−Ａ及びｎａａｔ−Ｂの
ｃＤＮＡにおけるイントロンの挿入位置とイントロンの
サイズをしめしたものである。

【図２２】図２２は、ゲノムから予想されるｎａａｔ−
Ａのアミノ酸配列をアミノ酸の１文字表記で示したもの
である。

【図２３】図２３は、ゲノムから予想されるｎａａｔ−
Ｂのアミノ酸配列をアミノ酸の１文字表記で示したもの
である。

【図２４】図２４は、ゲノムｎａａｔを導入したイネの
アルカリ土壌に移植後１０週間目の生育の状況を示した
図面に代わる写真である。図２４のコントロールは、ベ
クターのみを移植した対照のイネを示す。右側のイネは
ゲノムｎａａｔで形質転換したものである。

【図２５】図２５は、ゲノムｎａａｔを導入したイネの
アルカリ土壌移植後の草丈の変化をグラフにして示した
ものである。図２５の左側はゲノムｎａａｔで形質転換
したイネであり、右側はベクターのみを移植した対照の
イネである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高橋 美智子 東京都文京区小日向３−18−４ (72)発明者 西澤 直子 東京都文京区白山１−37−９−705 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD06 CD10 CD13 CD17 CD21 4B024 AA08 AA11 BA10 CA03 CA04 DA01 EA05 FA02 FA13 GA11 HA14 HA20 4B050 CC03 DD13 LL10 4B065 AA11X AA88Y AA89X AB01 AC10 AC20 BA02 CA29 CA53

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 イネ科植物にムギネ酸類生合成経路中の
   酵素をコードする遺伝子を導入して、鉄吸収性が改善さ
   れたイネ科植物を製造する方法。
2. 【請求項２】 酵素がニコチアナミンアミノ基転移酵素
   （ＮＡＡＴ）であり、それをコードする遺伝子がnaatで
   ある請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓである請
   求項１又は２に記載の方法。
4. 【請求項４】 導入される遺伝子がゲノム遺伝子である
   請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 【請求項５】 ゲノムがオオムギのゲノムnaatである請
   求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 遺伝子の塩基配列が、配列表の配列番号
   １で示される塩基配列、若しくは当該塩基配列にストリ
   ージェントな条件でハイブリダイズ可能でかつニコチア
   ナミンアミノ基転移酵素（ＮＡＡＴ）活性を有する蛋白
   質を発現し得る塩基配列、又はそれらに相補的な塩基配
   列である請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれかの方法で製造さ
   れ得る鉄欠乏耐性を有するイネ科植物。
8. 【請求項８】 請求項７に記載のイネ科植物の種子。
9. 【請求項９】 請求項７に記載のイネ科植物の細胞。
10. 【請求項１０】 請求項７に記載のイネ科植物を鉄欠乏
    耕地で育成する方法。
11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の方法により得られ
    たイネ科植物の作物。