KR20020009604A

KR20020009604A - 철 결핍내성의 벼 창제

Info

Publication number: KR20020009604A
Application number: KR1020017013876A
Authority: KR
Inventors: 모리사토시; 나카니시히로미; 다카하시미치코; 니시자와나오코
Original assignee: 마쯔오 미쯔요시; 카가쿠키쥬쯔 신코지교단
Priority date: 1999-07-05
Filing date: 2000-07-04
Publication date: 2002-02-01
Also published as: EP1197139B1; CN1360466A; EP1197139A1; JP4084502B2; EP1197139A4; AU5572800A; US7259292B1; AU772529C; AU772529B2; KR100454083B1; WO2001001762A1; CN1298853C; JP2001017012A

Abstract

본 발명은 철 결핍지대에서 생육가능한 철 결핍내성을 가지는 벼과 식물을 제공한다. 더 상세하게 본 발명은 벼과 식물의 뮤지네이산류의 합성경로 상의 효소의 유전자를 벼과 식물에 도입하는 것에 의해, 석회질 알칼리토양 등에서도 왕성하게 생육하는 철 결핍내성을 가지는 벼과 식물을 제공한다.

본 발명은 벼과 식물에 뮤지네이산류 합성경로 중의 효소, 바람직하게는 니코티아나민 아미노그룹전이효소(NAAT)를 코딩하는 유전자를 도입하여, 철 흡수성이 개선된 벼과 식물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기한 방법에 의해 제조되어 얻는 벼과 식물, 상기 철 흡수성이 개선된 벼과 식물을 육성하는 방법 및 이 육성에 의해 얻어지는 작물에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 철 결핍내성을 가지는 신규의 벼과 식물의 창제에 관한 것이다.

Description

철 결핍내성의 벼 창제{Construction of rice tolerant to iron deficiency}

지구상의 90%에 가까운 토양은, 어떤 형태로든지 약간의 문제를 가지고 있는 불량토양이라고 이야기되고 있다. 불량토양에는 일반적으로, 식물의 생육에 필수적인 원소가 질적 또는 양적으로 결핍되어 있기 때문에 식물 생육이 저해되거나, 중금속 등을 많이 포함하는 토양에 의해 생육장해 등이 일어난다. 불량토양의 대표적인 예로, 건조 지염류 집적토양이 있다. 이것은 인위적인 과잉관개 또는 장기간에 걸친 건조기후에 의해, 토양 상층에 NaCl 또는 Na₂CO₃가 집적한 것 및 CaCO₃또는 CaSO₄가 집적한 것이 있다. 나트륨이 집적된 토양에서는, 염류 농도장해를 불러일으키고, 석회질 토양에서는 철 결핍장해를 불러 일으킨다.

지구상의 경지토양의 약 30%는, 잠재적인 철 결핍지대라고 한다(Wallence et al. 1960). 반 건조지대의 석회질 토양에서는, 모관현상에 의해 모재에서 용출된 석회질 성분이 지표에 집적된다. 이와 같은 토양에서는 pH가 상승하여 알칼리성을 나타내기 때문에 토양 중의 철이 Fe(OH)₃의 형태로 존재하여 용해도가 매우 낮게 된다.

이와 같은 토양에서 생육하는 식물은 가용성의 철이 적기 때문에 철 결핍 백화화(chlorosis)되어, 생육이 저해되거나, 또는 고사한다.

고등식물의 철 획득기구는 스트래티지-Ⅰ(Strategy-Ⅰ) 및 스트래티지 -Ⅱ(Stratety-Ⅱ)의 2가지로 구분된다. 스트래티지-Ⅰ은 벼과를 제외한 고등식물의 철 획득기구이다. 토양 중의 3가 불용태철을 뿌리의 세포표면에 존재하는 3가 철환원효소에 의해 환원하고, 2가철의 트랜스포터(transporter)로 흡수하는 기구이다. 이 기구를 가지는 식물 중에는, 근권(rhizosphere)의 pH를 낮춤으로써 3가 철환원효소의 활성을 증가시키는 기구를 가지고 있는 것과, 페놀계 화합물을 근권으로 방출하고, 형성된 Fe(III)-페놀계 화합물 킬레이트가 세포막 표면에 존재하는 3가 철환원효소에 Fe(III)를 공급하는 기구를 가지고 있는 것이 존재한다. 최근의 연구에서, 아라비돕시스 탈리아(Arabidopsis thaliana)의 뿌리에 특이적으로 발현하는 2가 트랜스포터IRT1(Eide et al. 1996) 및 아라비돕시스 탈리아(Arabidopsis thaliana)의 3가 철환원효소의 유전자를 분리하였다(Robinson et al. 1997).

스트래티지-Ⅱ는 단자엽 식물 중의 벼과 식물에만 보이는 철 획득기구이다. 벼과 식물은 철 결핍 조건하에서 3가 철 킬레이트 활성을 가지는 뮤지네이산류를 근권으로 방출하고 「Fe(III)- 뮤지네이산」착체(complex)로서 뿌리에서 철을 흡수한다(Takagi et al. 1984). 뮤지네이산류(MAs)로는 뮤지네이산(MA), 2'-디옥시뮤지네이산(DMA), 3-하이드록시뮤지네이산(HMA), 3-에피하이드록시뮤지네이산(epi-HMA), 아베닌산(avenin acid(AVA)), 디스티콘산, 에피하드록시디옥시뮤지네이산 (epiHDMA)의 7 가지가 공지되어 있다. 뮤지네이산류(MAs)는 모두 도 1에 나타낸 바와 같이 메티오닌을 전구체로서 합성된다(Shojima et al. 1990. Ma et al. 1998).

뮤지네이산의 분비에는 일주기 리듬이 존재하고(Takagi et al. 1984), 일출 후에는 그 분비량이 최대가 되고, 밤에는 분비되지 않게 된다. 또한, 철 결핍의 대맥(보리)뿌리에서 분비액에 팽창하고 있던 과립이 분비 후에 오그라드는 현상이 관찰(Nishizawa et al. 1987)되었고 이 과립 내에서 뮤지네이산이 합성되고 있다고 생각되어지고 있다. 이러한 점에서, 벼과 식물의 철 결핍 응답은, 뮤지네이산 합성뿐만 아니라, 철 결핍 시그널의 전달, 뿌리의 형태변화 등 복잡한 제어계에 의해 성립하고 있다는 것을 시사하고 있다.

뮤지네이산 합성경로에 관계되는 효소로서 니코티아나민 합성효소의 유전자가 단리되고, 철 결핍에 의해 유도되고 있다는 것이 보고되었다(Higuchi et al. 1999). 또한, 니코티아나민 아미노그룹전이효소(니코티아나민 아미노트랜스퍼라아제)(NATT)의 유전자가 단리되어, 철 결핍에 의해 유도되고 있었다(Takahashi et al. 1997).

또한, 철 결핍 대맥뿌리, 대조군의 대맥뿌리에서 추출한 mRNA를 이용한 분별 스크리닝(diffierential screening)에 의해 철 결핍 조건하에서 특이적으로 유도되는 유전자Ids1,Ids2,Ids3를 단리하였다.Ids1는 메탈로티오네인성 (Metallothionain-like) 단백질을 코딩하는 유전자이다(Okumura et al. 1991).Ids2는 그 유전자 서열에서 예측되는 아미노산 서열이 수산화 효소에 상동성을 갖는 유전자이며(Okumura et al. 1994),Ids3 또한 그 유전자 서열에서 예측되는 아미노산 서열이 수산화 효소에 상동성을 갖는 유전자였다(Nakanishi et al. 1993). 에피하이드록시뮤지네이산 합성경로에는 수산화 반응이 2곳 존재하고, 이 유전자가 이 반응을 촉매하는 효소를 코딩하고 있는 것이라고 생각되어 지고 있다.

또한, 대맥뿌리에 있어서 철 결핍에 의해 유도되는 단백질로서 IDS3 단백질, 아데닌리보오스인산 전이효소(Matsui, 1999), 개미산 탈수효소(Suzuki et al. 1998), 그리고 36kDa 단백질(Iribune, 1991) 등이 포함된다. 벼과 식물은 철 결핍조건하에서 뮤지네이산을 합성하지만, 이때 뿌리에 함유되는 메티오닌이 감소하기 때문에 메티오닌 사이클로 메티오닌을 합성하는 동시에, 생성한 아데닌을 AMP로 변환하기 위해서 아데닌리보오스인산 전이효소가 유도되고 있다고 생각되어 지고 있다(Matsui, 1999).

개미산 탈수효소는 메티오닌 사이클에서 생성한 개미산을 분해한다. 또한 철 결핍의 벼 뿌리에서는 미토콘드리아의 형태 변화와 전자전달계의 에너지 차지의 감소가 보고되고 있고(Nori et al, 1991), 개미산 탈수효소는 철 결핍에 의해 생성한 혐기조건에 의해 유도되며 에너지원으로서의 NADH를 공급을 하고 있는 것이라고 생각되어 지고 있다.

한편, 인구가 증가함에 따라 식량증산이 향후의 인류생존의 조건으로서 크게 문제시 되고 있다. 벼는 인류 고래부터 중요한 식량의 하나이지만, 철 결핍지대에서의 벼의 생육은 어려운 것이 현상이다. 철 결핍지대에서 벼의 생육이 가능하게 된다면 식량증산도 가능하게 되어, 식량증산의 문제 해결책의 하나로서 주목받게 될 것이다.

본 발명은 철 결핍내성을 가지는 벼과 식물을 제조하는 방법, 그 방법에 의해 얻어진 벼과 식물 및 해당 벼과 식물을 육성하는 방법 및 그 방법으로 얻어진 작물에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 벼과 식물에 뮤지네이산(mugineic acid)류 생합성 경로중의 효소를 코딩하는 유전자, 바람직하게는 해당 효소가 니코티아나민 ·아미노그룹전이효소인 유전자를 도입하여 철 결핍내성을 가지는 벼과 식물의 창제에 관한 것이다.

도 1은 철 결핍 대맥뿌리의 뮤지네이산류 합성경로와 근권 환경을 도시한 것이다.

도 2는natt-A의 cDNA를 삽입한 벼과 형질전환용 이원벡터 pIG121Hm 유전자 서열을 나타낸 것이다.

도 3은 도입된 유전자의 검출을 서던 혼성화법(Southern Hybridization Mtehod)에 의해 실시한 결과를 나타내는 도면을 대신하는 사진이다. 도 3의 WT는 야생종 벼의 경우를 나타내고, 대조군은 벡터만을 도입한 대조벼의 경우를 나타내며, 1-5, 1-6, 1-7, 8-1 및 15-2는 35S 프로모터(promoter)를 가지는 형질전환체를 나타낸다.

도 4는 철 존재(+Fe) 및 철 결핍(-Fe)의 수경액에서 재배한 뿌리에 있어서의 NAAT의 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 4의 하얀부분은 +Fe 경우를 나타내고, 사선부분은 -Fe 경우를 나타낸다. WT는 야생종의 것을 나타내며, 1-5, 1-6 및 1-7 은 형질전환체를 나타낸다.

도 5는 알칼리 토양에 이식한 후 8주째의 각 벼의 생육 상황을 나타낸 도면을 나타낸 사진이다. 도 5의 대조군은 벡터만을 이식한 대조벼를 나타내며, 그 우측 벼는 형질전환한 것이다.

도 6은 알칼리 토양 이식 후의 각 벼의 잎 길이의 변화를 그래프로 나타낸 것이다. 흑색 원표시는 형질전환체 15-2를 나타내며, 흑색 사각 표시는 형질전환체 8-1를 나타내고, 흰색 원표시는 대조군으로 이용한 벡터만을 이식한 대조벼를 나타낸다.

도 7은 단리된 게놈natt를 포함하는 파지 DNA의 하나의 제한효소지도를 나타내는 것이다. 도 7중의 E는EcoRI를, H는HindIII를, B는BamHI를, N은NotI를 각각 나타낸다. 양단의NotI 사이트는 λFIXII의 아암에 있는NotI이다.

도 8은 NAAT 게놈 단편을 삽입한 벼과 형질전환용 이원벡터 pBIGRZ1의 유전자 서열을 나타내는 것이다. 도 8의 NPTII는 카나마이신 내성 유전자를, HPT는 하이그로마이신 내성 유전자를, GUS는 인트론 함유 β글루크로니다아제 유전자를, LacZ는 β갈락토시다아제 유전자를, 35P는 34S 프로모터를, NP는 NOS 프로모터를, NT는 NOS 터미네이터(terminator)를, MCS는 멀티클로닝 사이트(multi cloing site)를, Riori는 Ri 플라스미드 복제 기점을 각각 나타내고 있다.

도 9는 수득한 게놈naat의 염기 서열을 나타내는 도이다.

도 10은 수득한 게놈naat의 염기 서열과 cDNA와 비교하여 결정한naat-A와naat-B의 5' 상류, 엑손, 인트론, 3' 하류를 나타낸 도이다. 도 10에서 대문자는 cDNA에 전자되어 있던 엑손부분을 나타내고 소문자는 그것 이외의 부분을 나타내고 있다.

도 11은 게놈 게놈 단편의 모식도를 나타낸다. 도 11중의 E는EcoRI를, H는HindIII를, B는BamHI를 나타낸다.

도 12는naat-A및naat-B의 cDNA에서의 인트론의 삽입 위치와 인트론 사이즈를 나타내는 것이다.

도 13은 cDNA에서 예측되는 NAAT-A의 아미노 서열을 아미노산을 1문자 표기로 나타낸 것이다.

도 14는 cDNA에서 예측되는 NAAT-B의 아미노 서열을 아미노산의 1문자 표기로 나타낸 것이다.

도 15는 게놈naat를 도입한 벼를 알칼리 토양에 이식한 후 10주째의 생육 상황을 나타내는 도면을 나타낸 사진이다. 도 15의 대조군은 벡터만을 이식한 대조벼를 나타낸다. 우측 벼는 게놈naat로 형질전환한 것이다.

도 16은 게놈naat를 도입한 벼를 알칼리 토양 이식 후의 잎길이 변화를 그래프로 나타낸 것이다. 도 16의 좌측은 게놈naat로 형질전환한 벼이고, 우측은 벡터만을 이식한 대조벼이다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

단자엽 식물 중의 벼과 식물에서만 볼 수 있는 철 획득기구인 상기한 스트래티지-II는 뮤지네이산류를 합성하고, 이것을 방출하여 철을 획득하는 방법이라는 점에서 뮤지네이산류의 생합성 경로(도 1 참조)에서 효소의 강화 방법에 대해서 검토했다.

본 발명자들은 뮤지네이산 합성경로 상의 효소로 니코티아나민 아미노그룹 전이효소(NAAT)에 우선 착목하고 그 유전자naat를 도입해 보았더니, 놀랍게도, 유전자가 도입된 벼는 석회질 알칼리 토양에서도 왕성하게 생육하는 것을 발견하였다.

니코티아나민 아미노그룹전이효소(NAAT)의 유전자naat-A의 cDNA를, pIG121Hm에XbalI 및SacI 부위를 사용하여 편입하고, 도 2에 나타내는 이원벡터를 작성하였다. 수득된 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium)에 도입하여 형질전환에 이용하였다.

벼의 형질전환은 히에이(Hiei, 1994)들의 방법에 따라, 재료로 「츠키노히카리」를 이용하여, 배반에서 도입한 캘러스(callus)를 상기한 형질전환한 아그로박테리움(Agrobacterium) 현택액에 적시어 감염시키고, 재생체(T1 식물)를 수득하고, 이 종자에서 최종적으로 34 계통의 형질전환 벼를 얻었다.

도입된 유전자의 검출을 서던 혼성화법에 의해 실시하였다. 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3의 WT는 야생종 벼의 경우를 나타내고, 대조군은 벡터만을 도입한 대조벼의 경우를 나타내며, 1-5, 1-6, 1-7, 8-1 및 15-2 는 35S 프로모터를 가지는 형질전환체를 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이 형질전환체는 전부naat-A를 과잉발현하고 있다는 것을 알 수 있었다. 또한, 35S 형질전환 벼중 8-1, 15-2에는 적어도 각각 5 카피, 2 카피의naat가 도입되었다는 것을 알 수 있었다.

유전자naat의 도입으로 야생종이나 벡터만을 도입한 것에 비해서 니코티아나민 아미노그룹전이효소(NAAT)가 과잉하게 발현되고 그 결과 뮤지네이산 합성경로가 활성화되어, 철의 흡수에 필요한 뮤지네이산류가 다량으로 생산되고 있는 것이 추측된다.

따라서, 우선 이들 종의 NAAT 활성을 검토하였다. 발아 후 3주의 유식물(T2)을 철존재(+Fe) 및 철결핍(-Fe)의 수경액으로 각각 2주간 재배하고 각각의 뿌리에서 NAAT의 활성을 측정한 결과를 도 4에 나타냈다. 도 4의 흰색부분은 +Fe 경우를 나타내고, 사선부분은 -Fe 경우를 나타낸다. WT는 야생종의 것을 나타내며, 1-5, 1-6 및 1-7은 형질전환체의 것을 나타낸다.

그 결과 +Fe, -Fe 양쪽 모두 형질전환되지 않은 야생종(WT)보다도 형질전환한 것이 비활성이 높으며, -Fe 시에 더욱 비활성이 높아진다는 것을 알 수 있었다. 이 점은 유전자의 도입에 의해 NAAT의 활성이 높아지는 것을 나타내고 있을 뿐만 아니라, 형질전환체는 철 결핍상태 또는 철의 불용태화한 상태에서 NAAT 활성이 매우 항진되는 것을 나타내고 있다. 즉, 철 결핍상태 또는 철의 불용태화한 상태에서 강한 내성을 가지는 종이 되었다고 추측된다.

이상의 점에서, 유전자naat를 도입하는 것에 의해 NAAT활성이 항진되는 것을 알 수 있었지만, 이들 형질전환체가 실제로 철 결핍 토양에서 생육할 수 있는지를 검토하였다. 35S-naat-A형질전환 벼를 철의 불용태화된 알칼리 토양에 이식하자, 이식 후 2주째까지는 잎이 황화되었지만, 그 후 4∼5주째에 새로운 잎이 짙은 녹색이 되어 회복하기 시작하였다. 알칼리 토양에 이식한 후 8주째의 생육 상황을 나타낸 사진을 도 5에 올렸다. 도 5의 대조군은 벡터만을 이식한 대조벼를 나타내며, 그 우측 벼는 형질전환된 것이다. 대조군의 것에 비해서 형질전환체의 것의 발육이 현저하게 우수하다는 것을 알 수 있다. 또한, 알칼리 토양 이식 후의 잎 길이 변화를 도 6에 나타냈다. 도 6의 그래프의 종축은 잎 길이(cm)이고, 횡축은 알칼리토양 이식 후의 일수(일)을 나타낸다. 흑색 원표시는 형질전환체 15-2를 나타내며,흑색 사각표시는 형질전환체 8-1를 나타내고, 흰색 원표시는 대조군으로 이용한 벡터만을 이식한 대조벼를 나타낸다.

상기 언급한 바와 같이, 35S 형질전환 벼 8-1에는 적어도 5카피의naat유전자가, 또한, 35S 형질전환 벼 15-2에는 적어도 2카피의naat유전자가 도입되어 있다. 도 6의 잎 길이에서 보면, 유전자 카피 수와는 무관하고, 유전자가 도입되어 있으면 벼에 철 결핍내성이 부여할 수 있다는 것을 나타낸 것이 된다.

이와 같이 그 유전자의 도입에 의해 벼의 뮤지네이산 합성경로 중의 효소활성을 높일 수가 있으며, 또한, 그것에 의해 철 결핍내성을 부여할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 벼의 뮤지네이산 합성경로 중의 효소로서는, 도 1에 나타내는 뮤지네이산류의 합성경로 중의 효소로, 해당 효소를 코딩하는 유전자를 도입하는 것에 의해 그 활성을 높일 수 있는 것이라면 바람직하다. 상기한 바와 같이, 그 중의 니코티아나민 아미노그룹전이효소(NAAT)나 니코티아나민 합성효소가 바람직하다. 본 발명의 벼의 뮤지네이산 합성경로 중의 효소를 코딩하는 유전자로서는, cDNA 및 게놈에서 유래된 것이라도 좋다. 하기 언급되는 바와 같이 게놈의 사용도 본 발명이 바람직한 예이다.

따라서, 본 발명의 벼과 식물로서는, 스트래티지-II 기구에 의해 철을 흡수할 수 있는 식물이 바람직하고 학술상의 벼과 식물에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 벼과 식물의 예로서는, 벼, 옥수수, 수수(Sorghum), 소맥(밀), 대맥(보리), 귀리(oats) 등을 포함할 수 있다. 이들 벼과 식물은 그 품종에 관계없이, 본 발명의 방법을 넓게 적용될 수 있으며, 목적하는 유전자가 도입된 벼과 식물을 작출할 수 있다.

본 발명의 프로모터로서 목적하는 효소를 발현할 수 있는 것이라면 특정의 것으로 제한하지 않고 35S 프로모터, 더 구체적으로는 CaMV35S 프로모터 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 벡터로서 형질전환에서 바람직하게 사용할 수 있는 한 특정의 것으로 제한하지 않는다. 본 발명의 형질전환법으로서 상기한 아그로박테리움 (Agrobacterium)을 이용하는 방법에 한정되는 것이 아니라, 입자총(Particle Gun) 등을 이용한 각종 형질전환법을 사용할 수도 있다. 또한, 형질전환되는 벼과 식물의 세포로서, 상기한 캘러스로부터의 세포로 제한하지 않고, 각종 세포를 사용할 수도 있지만, 통상적으로캘러스에서 유래된 것이 바람직하다.

본 발명의 철 결핍이란, 철분이 결핍되어 있는 상태일 수 있고, 바람직하게는 식물이 흡수할 수 있는 상태의 철분이 결핍되어 있는 상태를 말하며, 식물의 종류에 따라 철 결핍상태인지 아닌지를 결정할 수도 있다. 따라서, 본 발명에서 철 결핍내성이란, 목적하는 식물이 그 토양에 있어서는 철분을 흡수하는 것이 곤란한 상태에 대한 내성이라고 할 수도 있다.

다음에 본 발명자들은naat의 cDNA를 대신하여 대맥 게놈naat의 도입을 시험하였다.

게놈 naat는 대맥(Horudum vulgare L. var. Igri)에서 추출한 게놈 DNA를 이용하여 작성된 라이브러리(SRTRATAGENE사 제)를 이용하였다. 이 라이브러리는 제한효소Sau3AI로 부분적으로 절단되고, λFIXII 벡터의XhoI 사이트에 도입된 것이다. 프로브(probe)로서는 앞에서 단리한 전체 길이의naat-AcDNA를 사용하였다. 숙주로서 대장균 XL1-Blue MRA(E. coliXL1-Blue MRA(P2))를 사용하였다.

스크리닝 결과 5가지의 파지를 수득할 수 있었으며, 이것들에 대해서 각각 파지 DNA의 단리를 실시하여, 각각에 대하여 제한효소지도를 작제함으로써 모두 동일 단편을 포함하고 있음을 알 수 있었다. 따라서 수득된 5개의 파지는 동일 게놈 부분에서 유래하는 것이라는 것을 알 수 있었다. 또한, 이것들은 프로브로 사용한naat를 포함할 것으로 예측되었다. 따라서, 도 7에 나타낸 것중 하나에 대하여 염기 서열의 결정을 실시하였다.

도 7에 나타낸 파지 DNA, 10 kb이상의 단편을 삽입할 수 있으며, 또한 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용하여 벼의 형질전환을 실시할 수 있는 플라스미드 벡터 pBIGRZ1 의NotI 사이트에 삽입하였다(도 8 참조).

또한, 도 7에 나타낸 단편에 대해서 11.0 kb 까지를, A∼D까지의 4가지로 나누고, 이것들을 플라스미드 벡터 pBluescript SK(-1)의EcoRI 사이트(B,C), 또는NotI,EcoRI 사이트(A,D)에 도입하였다.

A∼D의 각 단편에 대해서 플라스미드 상의 서열을 원래로 한 프라이머(M13 포워드 프라이머, M13 리바스프라이머)로 단편의 양끝에서 염기서열을 결정하였다. 염기서열의 결정에는 시마즈제작소사 제품의 DNA 시퀀서 DSQ-2000L 을 사용하였다.

서열결정의 상세내용은 하기 언급하는 실시예에 기재하고 있다.

결정한 10,966 bp 의 염기서열을 서열표의 서열번호 1에 나타낸다. 또한, 전체 서열을 도 9(염기번호 없이)에 나타냈다.

수득된 염기 서열에서 이 10,966 bp 유전자는 지금까지 수득하고 있었던naat-A와naat-B를 코딩하는 대맥게놈의 단편이라는 것을 알았다. 순서는naat-B,naat-A순이었다.

도 10에 cDNA와 비교하여 결정한naat-A와naat-B의 5' 상류, 엑손, 인트론, 3' 하류를 나타냈다. 도 10에 있어서 대문자는 cDNA에 전사되어 있던 엑손부분을 나타내고, 소문자는 그것 이외의 부분을 나타내고 있다. 엑손부분의 염기번호는 각각 하기와 같다.

이 모식도를 도 11에 나타냈다. 엑손부분은 사선으로 칠한 부분을 나타낸다. 두개의 유전자 모두 6개의 인트론, 7개의 엑손으로 형성되어 있다. 또한, 인트론의 삽입위치는 각 유전자 모두 상동위치였다. cDNA의 어느위치에 어떤 크기의 인트론이 삽입되어 있는지를 도 12에 나타냈다.

cDNA에서 예측되는naat-A및naat-B의 아미노산 서열을 도 13 및 도 14에 각각 나타냈다.

수득된 대맥의 게놈naat를 도입한 벼의 형질전환법은 상기 언급한 35S의 형질전환 벼의 형질전환법에 준해서 실시하였다.

다음에 수득된 게놈naat를 도입한 벼의 철 결핍내성의 검정을 실시하였다. 수득된 재생체(T1) 가운데 39 개체와 벡터만을 도입한 대조군 15 개체를 이용하여 35S의 형질전환 식물과 동일하게 검정을 실시하였다. 이식 후 5주째부터, 1주 또는 2주 단위로 잎 길이 측정을 실시하였다. 4 - 5 주 단위로 2회 토양사이즈를 증가시킨 포트로 옮겼다.

게놈naat로 형질전환된 벼는 알칼리 토양에 이식한 후 2주째까지 잎이 황화하고 4∼5주째에 새로운 잎이 짙은 녹색으로 회복하기 시작하여, 갑자기 왕성한 생육을 보이게 되었다. 이것에 대해서 벡터만을 넣은 대조군은 오랫동안 황화잎이 계속되고, 8주째부터 새로운 잎의 녹화가 시작되었다.

도 15 는 알칼리 토양에 이식한 후 10주째의 생육 상황을 촬영한 사진이다.

도 15의 대조군은 벡터만을 이식한 대조벼를 나타낸다. 우측 벼는 게놈naat로 형질전환된 것이다.

알칼리 토양 이식 후의 잎 길이 변화를 도 16에 나타낸다. 도 16의 그래프 종축은 잎 길이(cm)이고, 횡축은 알칼리 토양 이식 후의 일수(일)를 나타낸다. 도 16 좌측은 게놈 naat의 도입에 의해 벼에 철 결핍내성이 부여될 수 있다는 것을 나타낸다.

본 발명은 철 결핍지대에서 생육이 가능한 철 결핍내성을 가지는 벼과 식물을 제공하는 것을 목적으로 하고 있다.

보다 상세하게는, 본 발명은 벼과 식물의 뮤지네이산류의 합성 경로상의 효소 유전자를 벼과 식물에 도입하여 석회질 알칼리토양 등에서도 왕성하게 생육하는 철 결핍내성을 가지는 벼과 식물을 제공하는 것을 목적으로 하고 있다.

본 발명은 벼과 식물에 뮤지네이산 합성경로 중의 효소를 코딩하는 유전자를 도입하여 철 흡수성이 개선된 벼과 식물을 제조하는 방법, 보다 상세하게는, 해당 효소가 니코티아나민 아미노그룹전이효소(NAAT)이며, 그것을 코딩하는 유전자naat를 도입하는 철 흡수성이 개선된 벼과 식물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기한 방법에 의해 제조된 벼과 식물에 관한 것이다. 보다 상세하게 본 발명은 벼과 식물에 뮤지네이산류 합성경로 중의 효소를 코딩하는 유전자를 도입하여 이루어진 철 흡수성이 개선된 벼과 식물, 더욱 상세하게는, 해당 효소가 니코티아나민 아미노그룹전이효소(NAAT)이고, 그것을 코딩하는 유전자naat가 도입되어 이루어진 철 흡수성이 개선된 벼과 식물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 철 흡수성이 개선된 벼과 식물을 육성하는 방법 및 해당 육성에 의해 얻어지는 작물에 관한다.

이하, 구체적으로 본 발명을 더 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이것들의 구체적인 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: CaMV35S 프로모터로 naat 를 과잉발현시키는 벼의 형질전환법

도 2에 나타내는 이원벡터를 유전자naat의 cDNA를 pIG121Hm에XbaI 및SacI 부위를 사용하여 편입시켜 작성하였다. 이것을 아그로박테리움(Agrobacterium)에 도입하여 형질전환에 이용하였다.

벼의 형질전환은 히에이(Hiei, et al., (1994))들의 방법에 따르고, 재료로「츠키노히카리」를 사용하였다. 우선, 겨를 제거한 종자를 멸균하고, N6무기염 N6비타민 30g/ℓ, 수크로오스 2mg/ℓ, 2,4-D 2g/ℓ겔라이트(gelrite)로 이루어지는 유도배지(pH 5.8)에 파종하고, 60μ㏖/㎡s로 16시간 명기/8시간 암기의 조건하에서, 3주간 배양하여 배반에서 캘러스를 유도하였다.

새로운 배지에 옮기고, 25℃에서 3일간 배양한 후, 아그로박테리움 (Agrobacterium)현탁배지(pH 5.8)(AA무기염 아미노산 B5비타민 20g/ℓ, 수크로오스(sucrose) 2mg/ℓ, 2,4-D 0.2mg/ℓ, 키네틴(kinetin) 10mg/ℓ아세토실리곤 (acetosyringone))으로 아그로박테리움(Agrobacterium) 현탁액에 적시고, 종이 타올로 물기를 제거한 후, 공존 배양배지(pH 5.2)(N6무기염 N6비타민 30g/ℓ, 수크로오스 10g/ℓ, 글루코오스(glucose) 2mg/ℓ, 2,4-D 10mg/ℓ의 아세토실리곤 (acetosyringone) 2g/ℓ겔라이트(gelrite))로 28℃ 함흑하에서 3일간 감염시켰다.

그후, 500mg/ℓ의 클라포란(claforan)을 넣은 멸균수 세정액으로 캘러스를 세척하고 아그로박테리움(Agrobacterium)을 제거하고, 50mg/ℓ의 하이그로마이신을 함유하는 선택배지(pH 5.8)(N6무기염 N6비타민 30g/ℓ, 수크로오스 2mg/ℓ, 2,4-D 2g/ℓ, 겔라이트 (gelrite) 500mg/ℓ, 클라포란 50mg/ℓ, 하이그로마이신 (hygromycin)) 위에 올려 놓고 25℃ 밝은 곳에서 3시간 배양하였다.

배양 후, 재분화 배지(pH 5.8)(MS무기염 MS비타민 30g/ℓ, 수크로오스 (sucrose) 30g/ℓ, 소르비톨(sorbitol) 2g/ℓ, 카사미노산(casamino acids) 1mg/ℓ, NAA 2mg/ℓ, BAP 500mg/ℓ, 클라포란 50mg/ℓ, 하이그로마이신(hygromycin) 4g/ℓ, 겔라이트(gelrite)로 이동하고 3∼5주 사이에서 재분화해 온 재생체(T1식물)를 검정배지로 이동시켰다. 검정배지(pH 5.8)는 MS무기염 MS비타민 30g/ℓ, 수크로오스 (sucrose) 50mg/ℓ, 하이그로마이신(hygromycin) 8g/ℓ, 한천(agar)으로 되어 있다.

실험접시 가득하게 자란 식물체를 4∼5일간 순화시킨 후, 합성배토(폰솔1호 스미토모화학)과 질석을 1 : 1 로 혼합한 흙으로 이식하여 종자를 채취했다. 최종적으로 34계통의 형질전환 벼를 얻었다.

실시예 2 : 도입된 유전자의 서던 혼성화법에 의한 검출

실시예 1에서 수득한 T1식물의 잎을 마찰 파쇄하고, C-TAB 법의 개변에 의해 게놈을 추출하였다. 추출한 게놈을HindIII로 처리하고, 0.8% 아가로스겔을 이용한 전기영동으로 분리하였다. 이것을 나일론박막(nylon membrane)에 블로팅 (blotting)하였다. 프로브에naat의 내부 서열로 작성한 프라이머를 이용하여 PCR에 의해서³²P로 라벨링한 것을 이용하여 혼성화를 실시한 후, BAS 2000(후지필름)에 의해서 밴드를 검출하였다.

이 서던 혼성화의 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3의 WT는 야생형 벼의 경우를 나타내며, 대조군은 벡터만을 도입한 대조벼의 경우를 나타내고, 1-5, 1-6, 1-7, 8-1 및 15-2 는 35S 프로모터로naat-A를 과잉발현시킨 벼의 경우를 나타낸다.

도 3에 나타내는 결과에 의해, 35S 형질전환 벼 가운데, 8-1, 15-2 에는 적어도 각각 5카피, 2카피의naat가 도입된 것임 알 수 있었다.

실시예 3 : 알칼리 토양을 이용한 철 결핍내성의 검정

샘플 토양으로서 하기 성분으로 구성된 조개 화석토양을 이용하였다.

구성성분(%)
수분	0.48
인산 전량	0.12
칼리 전량	0.12
규산 전량	22.79
석회 전량	37.82
마그네시아 전량	0.91
망간 전량	0.018
붕소 전량	0.003
알칼리분	38.80
염산불용해물	28.88
산화철	0.99
산화알루미늄	5.59
아연	0.002

이 토양의 가용성 철농도는 2.2ppm 이고, pH 는 8.78이고, 전기저항은 0.03 mΩ이었다.

50mg/ℓ의 하이그로마이신을 함유하는 MS 고형배지 위에 최초에 수득된 형질전환 식물의 재생체(T1)의 종자를 파종하고 선발, 순화 후, 20∼25cm이 된 유식물(幼植物)(T2)을 35S의 형질전환 식물의 검정에 이용하였다.

34 계통 가운데 16계통 27종에 대해서 내성 검정을 실시하였다. 검정법은 플라스틱의 검은 포트(0.5ℓ)의 바닥에 종이타올과 여과지를 원형으로 잘라서 깔고, 알칼리 토양을 넣은 것에 식물을 이식하고, 수경액(춘일정지액; 7×10^-4M K₂PO₄, 1×10^-4M KC1, 1×10^-4M KH₂PO₄, 2×10^-3M Ca(NO₃)₂, 5×10^-4M MgSO₄, 1×10^-5M H₃BO₃, 5×10^-7M MnSO₄, 5×10^-7M ZnSO₄, 2×10^-4M CuSO₄, 1×10^-8M (NH₄)₃MoO₂₄, 1.5×10^-4M Fe-EDTA)을 포트의 바닥에서 2∼3 cm 정도로 잠기게 하고, 낮에는 30℃, 밤에는 25℃의 온실에서 재배하였다. 알칼리 토양은 3∼4주 후에 포트의 사이즈를 1ℓ로 하고, 8∼9주 후에 2ℓ의 사이즈로 옮겨 심었다. 이식후 2주째부터 1주 또는 2주 단위로 잎 길이 측정을 실시하였다.

+Fe(철 존재) 또는 -Fe(철 결핍)의 수경액으로 육성한 형질전환 벼(35S-naat벼)의 NAAT 비(比)활성의 측정을 하기와 같이 실시하였다. 발아 후 3주간의 유식물(T2)을 +Fe, -Fe의 수경액에서 2주동안 재배하고 각각의 뿌리에서 NAAT 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4의 흰색부분은 +Fe 경우를 나타내며, 사선부분은 -Fe 경우를 나타낸다. WT는 야생종의 것을 나타내며, 1-5, 1-6 및 1-7 은 형질전환체의 것을 나타낸다.

+Fe, -Fe 어느 경우에서나 형질전환한 것이 형질전환되지 않은 야생종(WT)보다도 비활성이 높고, -Fe 시에 한층 더 비활성이 높았다(도 4 참조).

실시예 4 : 알칼리 토양에 의한 철 결핍내성의 검정

35S-naat-A형질전환 벼를 알칼리 토양에 이식하고, 그 생육을 관찰하였다.

35S-naat-A형질전환 벼는 이식 후 2주째까지 잎이 황화하고 4∼5주째에 새로운 잎이 진한 녹색이 되어 회복하기 시작하고,naat의 도입에 의해 벼에 철 결핍내성을 부여할 수 있다는 것을 알았다.

이식 후 8주째의 생육 상황의 사진을 도 5에 나타낸다. 도 5의 대조군은 벡터만을 이식한 대조벼를 나타낸다. 우측 벼는 형질전환된 것이다.

알칼리 토양 이식 후의 잎 길이 변화를 도 6에 나타낸다. 도 6의 그래프의 종축은 잎 길이(cm)이고, 종축은 알칼리 토양 이식 후의 일수(일)를 나타낸다. 흑색 원표시는 형질전환체 15-2를 나타내고, 흑색 사각표시는 형질전환체 8-1를 나타내며, 흰색 원표시는 대조군으로 이용한 벡터만을 이식한 대조벼를 나타낸다.

유전자naat의 도입에 의해 벼에 철 결핍내성을 부여할 수 있다는 것을 알 수 있었다(도 5,6 참조).

실시예 5 : naat-A 및 naat-B 게놈 클론의 단리

스크리닝 순서는 주로 「클로닝과 시퀀스」(농촌문화사)를 따랐다.

라이브러리로서, SRTRATAGENE사에서 구입한 λFIXIII 라이브러리를 사용하였다. 이것은 대맥(Horudeum vulgare L. var. Igri)에서 추출한 게놈 DNA를 이용하여 작성된 것이다. 게놈 DNA는 제한효소Sau3AI로 부분적으로 절단되고, λFIXII 벡터의 XhoI 사이트에 도입된 것이다. 라이브러리의 삽입사이즈는 9∼23 kb이다.

(1) NZCYM 액체 배지(NZ아민, 10g, NaC1 5g, 카자미노산 1g, 박토-이스트 추출물(Bacto-yeast extract) 5g, MgSO₄·7H₂O 2g, 및 1N NaOH 약 6㎖를 증류수로 1ℓ로 하고(pH 7.5) 오토클레이브(autoclave)로 살균한 것)에서 하룻밤 배양한 대장균(E. coliXL1-Blue MRA(P2))을 원심한 후, 10mM MgSO₄용액 20㎖로 현탁하였다.

(2) 이 대장균 현탁액 100㎖와 파지 희석액(스크리닝용 플레이트(9cm ×13cm)에 25,000 플라크(plaques)를 형성하는 양) 100㎖를 혼합하고, 37℃ 20분간 조용한 장소에 둔 후, 8㎖의 50℃의 0.7% 탑 아가(top agar)(100㎖당 0.7g의 아가로스를 추가한 것)와 혼합하고, 스크리닝용 플레이트(9cm ×13cm)에 뿌렸다. 플레이트는 37℃로 조용한 곳에 두고, 플라크(plaques) 사이즈가 0.5 mm 이 될때까지배양하였다.

(3) 나일론박막 Hybond-N(Amersham사)을 플레이트 사이즈로 절단하고, 탑 아가로스(top agarose)상에 30초간 두었다. 이것을 변성액(0.5M NaOH, 1.5M NaCl)을 함유하는 여지 위에 플라크와 접촉한 면을 위로 하여 두었다. 2장째의 박막을 탑 아가로스상에 올려 놓고 1분간 방치하였다. 동일하게 변성액을 스며들게 한 여지 위에 두었다. 5분간 방치한 후 2장째의 박막을 중화액(0.5M Tris-HC1 pH 8.0, 1.5M NaCl)을 스며들게 한 여지 위로 이동시켰다. 5분 방치 후, 2×SSPE(0.02M NaH₂PO₄pH 7.4, 0.3M NaCl, 2mM EDTA)액으로 2회 세정하고 건조시켰다.

(4) 미리 단리한naat-A의 cDNA 전체길이를 프로브로 사용하기 위해서, 플라스미드 벡터 pYH23의HindIII 및NotI 사이트에 들어가 있는 것을 동일한 사이트로 잘라내고 정제하였다. 이것을 무작위(random) 프라이머 DNA 라벨링 키트 제 2 판(Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2 (다카라슈조))을 사용하여 [α-³²P]dATP로 라벨링하였다.

한편, 박막을 미리 65℃로 가온해 둔 30 ㎖의 혼성화 완충액(6×SSPE, 5×Denhardt's용액, 0.1% SDS, 100mg/㎖ 변성연어정소 DNA)중에 사전 혼성화를 65℃에서 1시간 실시하고, 혼성화 완충액(25㎖)을 교환하였다.

여기에, 상기에서 조제한 프로브를 추가하고, 65℃에서 12시간 혼성화를 하였다. 박막의 세정은 미리 65℃로 가온 해 둔 세정액(5×SSPE)으로 10분간을 2회 실시하고, 매우 엄격한 조건하에서 세정액(2×SSPE, 0.1% SDS)으로 65℃에서 1회실시하였다. 박막을 사란랩으로 싸고, 이미지플레이트(후지필름)에 하루저녁 감광시키고, 이미지분석기(후지필름)로 결과를 얻었다.

시약은 20×SSPE(0.2M NaH₂PO₄pH 7.4, 3M Nacl, 20mM EDTA), 50×Denhardt's 용액, 5g Ficolls 400, 5g 폴리비닐필로리돈(MW 360,000), 5g 송아지 혈청알부민을 500㎖의 증류수에 용해하고, 0.45mm의 필터로 여과한 것을 사용하였다.

(5) 2장의 박막에 공통으로 나타난 것을 양성으로 하고, 이 장소에 대응하는 플라크를 원래의 실험접시에서 본을 떴다. 본을 뜬 것은 SM액(50mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1M NaCl, 7mM MgSO₄, 0.01% 젤라틴)으로 취해서 4℃로 보존하였다. 그후, 이 파지액을 사용하여 동일하게 2차, 3차 스크리닝을 실시하였다. 최종적으로 5개의 파지를 수득하였다.

상기에서 수득된 5개의 파지에 대해서 각각 파지 DNA의 단리를 실시하였다. 각각에 대해서 제한효소지도를 제작함으로써 전부 동일 단편을 포함하고 있다는 것을 알 수 있었다. 즉, 수득된 5개의 파지는 동일 게놈 부분에서 유래하는 것이라는 것을 알 수 있었다. 또한, 이들은 프로브로 사용한naat를 포함하는 것이 예측된다. 따라서, 이 중 하나(도7 참조)에 대해서 염기서열의 결정을 실시하기로 하였다. 도 7중의 E는EcoRI를, H는HindIII를, B는BamHI를, N는NotI를 각각 나타낸다. 양끝의NotI 사이트는 λFIXII의 암에 있는NotI이다.

실시예 6 : 서브클로닝과 염기서열의 결정

(1) 도 7에 나타낸 파지 DNA를 10kb 이상의 단편을 삽입할 수 있으며, 또한 아그로박테리움(Agrobacterium)을 사용한 벼의 형질전환을 실시할 수 있는 플라스미드벡터 pBIGRZ1에 삽입하였다. 도 7에서 나타낸 파지 DNA의 최초NotI 사이트에서 11.0kb에 있는NotI 사이트까지의 단편 11.0kbp를 잘라내어, pBIGRZ1의 NotI 사이트에 삽입하였다(도 8 참조). 도 8의 NPTII는 카나마이신 내성 유전자를, HPT는 하이그로마이신 내성 유전자를, GUS는 인트론 함유 β글루크로니다아제 유전자를, LacZ는 갈락토시다아제 유전자를, 35P는 35S 프로모터를, NP는 NOS 프로모터를, NT는 NOS 터미네이터를, MCS는 멀티클로닝사이트를, Riori는 Ri플라스미드 복제기점을 각각 나타내고 있다.

즉, 이 11.0kb에 대해서 염시서열의 결정을 실시하였다.

나중 벼의 형질전환에는 이 작성한 구성을 사용하였다.

(2) pBIGRZ1은 대장균(E. coliXL1-blue) 내에서 안정되게 유지된다. 이 구성을 가진 대장균을 배양하고, 여기에서 플라스미드를 플라스미드 조정기 PI-50α(쿠라보방적주식회사)에 의해 추출하였다.

(3) 도 7에 나타낸 단편에 대해서 11.0kb까지를, A∼D까지의 4개로 나누고, 이것들을 플라스미드벡터 pBluescript SK(-)의EcoRI사이트(B,C), 또는NotI,EcoRI사이트(A,D)에 도입하였다.

(4) A∼D의 각 단편에 대해서 플라스미드 위의 서열을 원래대로 한 프라이머(M13 포워드프라이머, M13 리바스프라이머)로 단편의 양끝에서 염기서열을 결정하였다. 염기서열의 결정에는 시마즈제작소사제 DNA시퀀서DSQ-2000L을 사용하였다.

(5) 각 단편에 대해서 염기서열이 결정된 부분에서 더 앞쪽을 읽기 위한 프라이머와 거기까지 읽은 서열을 역방향에서 확인하기 위한 프라이머를 작성하고, 차례로 염기서열을 결정하였다. 최종적으로는 모든 단편에 대해서, 5' 역방향에서와 3'방향으로부터의 양방향에 대해서 서열결정을 실시하였다. 각 단편의 염기서열으리 결정하는데 사용한 프라이머의 서열을 아래와 같이 나타낸다.

이들 프라이머는, DSQ-2000L에서의 사용을 위해서 5' 단말에 형광색소 (fluorescein isothiocyanate, FITC)로 라벨링하였다.

단편 A용 프라이머

명칭:서열 F-A1F: FITC-5' -gct act agt agt att cct ggt gta g

명칭:서열 F-A1R: FITC-5' -gga gta cta cta gac tac acc agg a

명칭:서열 F-A2F: FITC-5' -aca tgc gca tgc atg aat tgc cg

명칭:서열 F-A2R: FITC-5' -caa ttc atg cat gcg cat gtg cc

단편 B용 프라이머

명칭:서열 F-B1F: FITC-5' -ggt caa gta tgc agt atg ttg gaa c

명칭:서열 F-B1R: FITC-5' -gtt cca aca tac tgc ata ctt gac c

명칭:서열 F-B2F: FITC-5' -cta gaa gcc tat gga tgt ttc ttt tgg

명칭:서열 F-B2R: FITC-5' -cca aaa gaa aca tcc ata ggc ttc tag

명칭:서열 F-B3F: FITC-5' -agt tct tat caa ttt ccg aga tga c

명칭:서열 F-B3R: FITC-5' -ata gtc atc tcg gaa att gat aag a

명칭:서열 F-B4F: FITC-5' -agt ggt cac cat gcg gac caa cac c

명칭:서열 F-B4R: FITC-5'- ggt gtt ggt ccg cat ggt gac cac t

단편 C용프라이머

명칭:서열 F-C1F: FITC-5' -cac cgg cca gtt caa ctg cta cgc

명칭:서열 F-C1R: FITC-5' -gcg tag cag ttg aac tgg ccg gtg

명칭:서열 F-C2F: FITC-5' -ttt gga gga gat cca tga cga cat a

명칭:서열 F-C2R: FITC-5' -tat gtc gtc atg gat ctc ctc caa a

명칭:서열 F-C3F: FITC-5' -tct tct cat atg cta ctg tgg gga t

명칭:서열 F-C3R: FITC-5' -tga cat gca aca cag gga cat gag c

단편 D용 프라이머

명칭:서열 F-D1F: FITC-5' -cat gct gac gaa gag cga ggt cat a

명칭:서열 F-D1R: FITC-5' -ccc agg ata tga cct tag tgg ttg g

(6) 상기에서 완전하게 서열결정할 수 없었던 부분에 대하여 신규하게 나타내는 프라이머를 합성하고, 파킨엘마저팬사제 자동 DNA 시퀀서 ABI PRISMTM 310 제네틱 아날라이저를 사용하고, 완전하게 염기서열을 결정하였다.

단편 B용 프라이머

명칭:서열 B5F: 5' -gaa tgg caa act ggg tcc gca tta c

명칭:서열 B5R: 5' -gta atg cgg acc cag ttt gcc att c

명칭:서열 B6F: 5' -ctg gtt gtt gtg gcc tgg acg aaa c

명칭:서열 B6R: 5' -gtt tcg tcc agg cca caa caa cca g

명칭:서열 B7F: 5' -agc aca aac cct acc tat gtt agg c

명칭:서열 B7R: 5' -gcc taa cat agg tag ggt ttg tgc t

단편 C용 프라이머

명칭:서열 C4F: 5' -tgg aat ttc gcc cgg ggc aag gac

명칭:서열 C4R: 5' -ccc tgt gac aag tgc tct gct acg

명칭:서열 C5F: 5' -tct ggg atc tca gtg cat cca aca

명칭:서열 C5R: 5' -gaa gca tat atc agt caa aca taa cc

또한, 단편 A와 단편 B, 단편 B와 단편 C의 연결부분을 확정하기 위해서 이하의 프라이머를 작성하고, (1)에서 작성한 구성을 파킨엘마저팬사제 자동 DNA 시퀀서 ABI PRISMTM 310 제네틱 아날라이저를 사용하여, 염기서열을 결정하였다.

단편 A와 단편 B의 경계부분

명칭:서열 A-eF: 5' -cac atc ctt tgc ctt gct gaa tat gg

명칭:서열 B-tR: 5' -cag tag tac taa tta atc acc tta gta gc

단편 B와 단편 C의 경계부분

명칭:서열 B-eF: 5' -cac gat caa cca aag aat gtc ctc c

명칭:서열 C-tR: 5' -tac ttg tat atg cag ctc cag cac

(7) 결정한 10,966bp의 염기서열을 서열표의 서열번호1에 나타낸다. 또한, 전체 서열을 도 9(염기번호 없음)에 나타냈다. 수득된 염기서열에서, 이 10,866 bp 의 유전자는, 지금까지 수득되고 있었던naat-A와naat-B를 코딩하는 대맥게놈의 단편이라는 것을 알 수 있었다. 순서는naat-B, naat-A의 순이었다.

도 10에 cDNA와 비교하여 결정한naat-A와naat-B의 5' 상류, 엑손, 인트론, 3' 하류를 나타냈다. 도 10에서 대문자는 cDNA에 전사되어 있던 엑손부분을 나타내며, 소문자가 그것 이외의 부분을 나타내고 있다. 엑손부분의 염기번호는 각각 다음과 같이 된다.

naat-B 제 1 엑손 579-1299 (개시코돈 6518)

제 2 엑손 1483-1825

제 3 엑손 1922-2140

제 4 엑손 2244-2303

제 5 엑손 2761-2916

제 6 엑손 3263-3356

제 7 엑손 3735-4033 (종료코돈 3868)

naat-A 제 1 엑손 6457-6897 (개시코돈 6518)

제 2 엑손 7029-7371

제 3 엑손 7479-7697

제 4 엑손 7784-7843

제 5 엑손 8285-8440

제 6 엑손 8738-8831

제 7 엑손 9414-9732 (종료코돈 9547)

이 모식도를 도 11에 나타낸다. 엑손부분을 사선으로 칠한 부분으로 나타낸다. 양 유전자 모두 6개의 인트론, 7개의 엑손으로 구성되어 있다. 또한, 인트론의삽입위치는 각 유전자 모두 상동의 위치였다. cDNA의 어떤 위치에 어느정도 크기의 인트론이 삽입되어 있는지를 도 12에 나타냈다.

cDNA에서 예측되는naat-A및naat-B의 아미노서열을 도 13 및 도 14에 각각 나타냈다.

실시예 7 : 대맥의 게놈 naat 를 도입한 벼의 형질전환

상기한 실시예 6에서 수득된 대맥의 게놈naat를 도입한 벼의 형질전환법은 아래의 (1)∼(3)의 점을 제외하고는 35S의 형질전환 벼의 경우와 동일하게 형질전환을 실시하였다.

(1) 캘러스 유도를 28℃ 어두운 곳에서 실시하며, 캘러스유도배지를 N6무기염 N6비타민 0.3g/ℓ, 카사미노산 30g/ℓ, 수크로오스(sucrose) 2mg/ℓ, 2,4-D 2.8g/ℓ, 프롤린 4g/㎗, 겔라이트(gelrite)(pH 5.8)로 하였다.

(2) 아그로박테리움(Agrobacterium)에 의한 감염을 25℃에서 실시하며, 공존 배양배지를 N6무기염 N비타민 30g/ℓ, 수크로오스(sucrose) 10g/ℓ, 글루코오스 (glucose) 1g/ℓ, 카사노미산 2mg/ℓ, 2,4-D 20mg/ℓ, 아세토실리곤 (acetosyringone) 2g/ℓ, 겔라이트(gelrite)(pH 5.2)로 하고, 여지를 깔고 실시하였다.

(3) 선택은 처음 1주를 10mg/ℓ, 다음 1 주를 30㎍/ℓ, 마지막 2주를 50mg/ℓ의 하이그로마이신을 함유하는 선택배지를 사용하여, 어두운 곳 28℃에서 배양하였다.

선택배지로서, N6무기염 N6비타민 1g/ℓ, 카사노미산, 30g/ℓ수크로오스(sucrose), 2mg/ℓ2,4-D, 250mg/ℓ크라포란, 10-50mg/ℓ하이그로마이신 (hygromycin), 2g/ℓ 겔라이트(gelrite)(pH 5.8)를 사용하고,

재분화 배지로, MS무기염 MS비타민 30g/ℓ, 수크로오스(sucrose), 30g/ℓ소르비톨(sorbitol), 2g/ℓ카사노미산, 1.1g/ℓMES, 2mg/ℓNAA, 1mg/ℓ 키네틴(kinetin), 250mg/ℓ크라포란, 50mg/ℓ하이그로마이산(hygromycin), 4g/ℓ 겔라이트(gelrite)(pH 5.8)를 사용하여, 28℃에서 배양하였다.

실시예 8 : 게놈 naat 를 도입한 벼의 철 결핍내성의 검정

게놈naat를 도입한 벼의 철 결핍내성의 검정은 수득된 재생체(T1)중 39개체와 벡터만을 도입한 대조군 15개체를 이용하여 35S의 형질전환식물과 동일하게 검정을 실시하였다. 이식 후 5주째부터 1주 또는 2주 단위로 잎 길이를 측정하였다. 4 - 5주 단위로 토양사이즈를 늘린 포트로 2회 이동시켰다.

게놈naat로 형질전환된 벼는 알칼리 토양에 이식한 후 2주째까지 잎이 황화하고 4∼5주째에 새로운 잎이 진한 녹색이 되어 회복하기 시작하여, 갑자기 왕성한 생육을 보이도록 되어 있다. 이것에 대해서 벡터만을 넣은 대조군은 오랜동안 황화잎이 계속되고, 8주째 무렵부터 새로운 잎의 녹화가 시작되었다. 이것에 의해naat의 도입에 의해 벼에 철 결핍내성을 부여할 수 있다는 것을 알 수 있었다(도 15 및 도 16 참조).

도 15는 알칼리 토양에 이식한 후 10주째의 생육 상황을 촬영한 사진이다.

도 15의 대조군은 벡터만을 이식한 대조벼를 나타낸다. 우측의 벼는 게놈naat로 형질전환한 것이다.

알칼리 토양 이식 후의 잎 길이의 변화를 도 16에 나타낸다. 도 16의 그래프의 종축은 잎 길이(cm)이고, 종축은 알칼리 토양 이식 후의 일수(일)을 나타낸다. 도 16의 좌측은 게놈naat로 형질전환한 벼이고, 우측은 벡터만을 이식한 대조벼이다.

이것에 의해, 게놈naat의 도입에 의해 벼에 철 결핍내성을 부여할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

본 발명은 철 결핍내성을 가지는 벼과 식물을 제공하는 것으로, 철 결핍경지에서도 생육가능한 신규의 벼과 식물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은, 벼과 식물에, 뮤지네이산류 합성경로 중의 효소를 코딩하는 유전자를 도입하는 것에 의해, 철 흡수성이 개선된 벼과 식물을 얻을 수 있다는 신규 내용을 제공하는 것이다.

Claims

벼과 식물에 뮤지네이산류 합성경로 중의 효소를 코딩하는 유전자를 도입하여, 철 흡수성이 개선된 벼과 식물을 작출하는 방법.
제 1항에 있어서, 효소가 니코티아나민 아미노그룹전이효소(NAAT)이고, 그것을 코딩하는 유전자가naat인 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 프로모터(promoter)가 CaMV35S인 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 도입되는 유전자가 게놈 유전자인 방법.
제 4항에 있어서, 게놈이 대맥의 게놈naat인 방법.
제 5항에 있어서, 유전자의 염기서열이, 서열표의 서열번호 1로 나타나는 염기서열, 또는 엄격한 조건하에서 해당 염기서열에 혼성화할 수 있거나 니코티아나민 아미노그룹전이효소(NAAT) 활성을 가지는 단백질을 발현시켜 수득되는 염기서열, 또는 이것들에 상보적인 염기서열인 방법.
제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항의 방법에 따라 제조되어 얻는 철 결핍내성을 가지는 벼과 식물.
제 7항의 벼과 식물의 종자.
제 7항의 벼과 식물의 세포.
제 7항의 벼과 식물을 철 결핍경지에서 육성하는 방법.
제 10항의 방법에 의해 얻어진 벼과 식물의 작물.