KR100459054B1

KR100459054B1 - 프롤린 축적 능력이 높아 환경 스트레스에 내성이 있는트랜스제닉 벼과 식물 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR100459054B1
Application number: KR10-2001-0085746A
Authority: KR
Inventors: 요슈 요시바; 가즈꼬 시노자끼; 가즈오 시노자끼
Original assignee: 가부시키가이샤 히타치세이사쿠쇼; 리가가쿠 겐큐쇼; 독립행정법인농업· 생물계특정산업기술연구기구; 도꾸리쯔 교세 호징 곳사이 노우링 스이산교 겡뀨 센터
Priority date: 2001-06-08
Filing date: 2001-12-27
Publication date: 2004-12-03
Also published as: GB2376236B; JP2002369634A; US20030014774A1; GB2376236A; CA2365662A1; KR20020095011A; CN1390939A; GB0130946D0

Abstract

본 발명은 프롤린 축적 능력을 높이고, 이에 따라 내염성이 향상된 형질전환 벼과 식물을 얻기 위해서, 벼의 P5CS (델타1-피롤린-5-카르복실산 합성효소) 유전자 또는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자와, 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH (프롤린 탈수소효소) 유전자의 안티센스 (역방향 염기 서열) 유전자를 유전자 조작 기술을 이용하여 벼과 식물에 도입하는 것에 관한 것이다.

Description

프롤린 축적 능력이 높아 환경 스트레스에 내성이 있는 트랜스제닉 벼과 식물 및 그 제조 방법 {Transgenic Rice Plant and Its Family with Environmental Stress Resistant by Proline Accumulation of High Level and Its Production}

본 발명은 프롤린 축적 능력이 높아 내염성, 내건조성, 내냉성이 향상된 벼과 식물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

염생 식물 (halophytes)을 비롯한 몇개의 식물에 있어서, 식물이 고염 스트레스나 건조 스트레스를 받으면 세포질에 아미노산의 일종인 프롤린을 축적하는 것으로 알려져 있다. 이것은 축적된 프롤린이 식물 세포질의 삼투압 조절이나 스트레스에 의한 기능성 단백질의 변성 (degradation)을 억제하는데 도움이 되기 때문이라고 생각된다. 식물에 있어서의 프롤린은, Δ1-피롤린-5-카르복실산 합성효소 (P5CS)와 Δ1-피롤린-5-카르복실산 환원효소 (P5CR)의 2가지 효소에 의해서 글루탐산으로부터 합성된다. 한편, 프롤린은 프롤린 탈수소효소 (ProDH)와 Δ1-피롤린-5-카르복실산 탈수소효소 (P5CDH)의 2가지 효소에 의해서 글루탐산으로 분해된다.

상기한 식물이 고염 스트레스나 건조 스트레스 등의 수분 스트레스 (물을 흡수하기 어려운 상태)를 받으면, P5CS 유전자의 발현 수준이 상승하여 P5CS가 활성화된다. 그러나, P5CR 활성 및 그 유전자 발현은 낮은 수준으로 일정하다. 또한 대사계의 유전자 발현 및 효소 활성도 억제된 상태가 된다. 그런데 일단 수분 스트레스가 해제되면 이번에는 반대로 합성계의 유전자 발현과 효소 활성이 억제되어, ProDH 유전자의 발현이 급속하게 유도되고 효소활성도 높아져 세포질에 축적되어 있던 프롤린은 빠르게 글루탐산으로 대사된다.

이상으로부터 수분 스트레스시에 있어서의 프롤린 합성은 P5CS가 속도제한 요인 (rate-limiting)이 되고 있고, 또한 수분 스트레스 해제 후의 프롤린 대사에는 ProDH가 속도제한 요인이 된다고 생각된다 (Yoshiba et al., Plant Cell Physiol. 38: 1095-1102 (1997)).

지구 환경의 악화에 따라 건조 또는 반건조에 의한 염류 토양의 증가나 인구 증가에 의한 식품 부족이 미래에는 점점 심각해질 것으로 예상된다. 고염 스트레스, 건조 스트레스 및 저온 스트레스 (물을 흡수하기 어려운 상태) 내성 작물의 육종은 세계의 식품 문제를 해결하는 데에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 각 방면에서 연구가 진행되고 있고, 그 성과가 기대되고 있다.

본 발명의 목적은 식물의 프롤린 합성계 및 대사계의 속도제한 요인이 되는 효소인 Δ1-피롤린-5-카르복실산 합성효소 (P5CS)와 프롤린 탈수소효소 (ProDH)의 중요성에 주목하고, 유전자 재조합 기술에 의해 이들 효소의 유전자 발현을 제어하여 프롤린 축적 능력이 높고 이에 따라 내염성, 내건조성, 내냉성이 향상된 벼과 식물, 및 그 제조 방법을 제공하는 데에 있다.

도 1A 내지 도 1D는 프롤린 합성계 효소 P5CS 유전자와 프롤린 대사계 효소 ProDH 유전자 및 그 안티센스 유전자가 각각 혼입된 벼용 벡터를 나타낸 도면이다.

도 2는 도 1A 내지 도 1D에 나타낸 벡터를 유전자 조작에 의해 도입한, 스트레스를 주지 않을 때 벼에 축적된 프롤린의 양을 나타낸 도면이다.

도 3은 도 2에 나타낸 프롤린 관련 유전자가 혼입된 트랜스제닉 벼의 내염성을 나타낸 도면이다.

프롤린 합성계의 P5CS 유전자를 도입하여 과잉으로 발현시키거나 대사계의 ProDH 유전자의 안티센스 (역방향 염기 서열) 유전자를 도입하여 프롤린의 분해를 억제하거나, 또는 P5CS 유전자 및 ProDH 유전자의 안티센스 유전자 모두를 도입하여 프롤린의 분해를 억제하면서 프롤린 합성을 촉진시킴으로써 벼 및 벼과 식물의 세포에 프롤린을 고농도로 축적시킨다.

본 발명에서는 프롤린을 고농도로 축적시킴으로써 내염성, 내건조성 또는 내냉성을 갖는 벼 및 벼과 식물을 분자 수준에서 육종 (분자 육종; molecular breeding)할 수 있게 된다.

지금까지 벼 및 벼과 식물에 있어서 적합 용질 (osmoprotectant)로서의 프롤린 농도를, 합성 촉진 및 분해 억제함으로써 높이는 것이 가능하다는 보고는 알려져 있지 않다. 본 발명의 발명자들은 P5CS 유전자와 ProDH 유전자의 중요성에 주목하여, 종래 알려져 있지 않은 신규 기술 과제를 해결하기 위해서 유전자의 도입이 쉬운 벼 품종 (rice variety)의 선정, 캘러스 형성율 (callus formation rate)을 향상시키는 연구, 벼용 유전자 도입 벡터의 제작 연구 등 각 방면에서 연구하고, 신규 기술을 해명하여 본 발명을 완성시킴에 이르렀다.

본 발명에서는, 벼 또는 아라비돕시스 탈리아나 유래의 프롤린 합성 유전자, 프롤린 대사 유전자의 안티센스 유전자를 개별로 또는 조합하여 도입한 형질전환 벼과 식물 및 그 제조 방법이 제공된다.

본 발명의 벼과 식물에는 아미노산의 일종인 프롤린의 합성효소 단백질을 코딩하는 유전자 또는 프롤린 분해 효소의 안티센스 유전자 중 어느 하나, 또는 이들 쌍방의 유전자가 도입되어 있다. 이 구성에 의해 내염성, 내건조성 및 내냉성이 향상된 벼과 식물을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 벼과 식물로부터 수확된 성숙 종자, 특히 벼의 종자는 복수 세대에 걸쳐 높은 프롤린 축적 능력을 유지할 가능성을 갖는다는 점에 특징이 있다.

또한 본 발명은, 벼 및 벼과 식물을 대상으로 하며, 벼과 식물에 속하는 식물이면 특별히 제한은 없다. 벼과 식물에 속하는 식물의 예로서는 벼, 옥수수, 밀, 보리, 호밀, 잔디, 기장, 조 등이 있다. 본 발명은 특히 벼에 보다 적합하게 적용시킬 수 있다.

본 발명 실시예의 벼과 식물에서는, 벼 또는 아라비돕시스 탈리아나 유래의 프롤린 (적합 용질) 합성 유전자와 프롤린 대사 유전자의 안티센스 유전자 중 어느 하나, 또는 이들 쌍방의 유전자가 도입되어 형질전환이 이루어지고 있다.

본 발명 실시예의 벼과 식물에 도입되는 1 종류 유전자의 예로는, (1) 서열번호 1에 기재된 서열 (염기 서열 및 아미노산 서열)을 포함하는 벼의 P5CS (Δ1-피롤린-5-카르복실산 합성효소) 유전자, (2) 서열번호 2에 기재된 서열 (염기 서열 및 아미노산 서열)을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS (Δ1-피롤린-5-카르복실산 합성효소) 유전자, (3) 서열번호 3에 기재된 서열 (염기 서열 및 아미노산 서열)을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH (프롤린 탈수소효소) 유전자의 안티센스 (역방향 염기 서열) 유전자가 있다.

본 발명 실시예의 벼과 식물에 도입되는 2 종류 유전자의 예로는

(1) 서열번호 1에 기재된 서열을 포함하는 벼의 P5CS (Δ1-피롤린-5-카르복실산 합성효소) 유전자 또는 서열번호 2에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자와, 서열번호 3에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH (프롤린 탈수소효소)유전자의 안티센스 (역방향 염기 서열) 유전자와의 2개의 유전자, 및

(2) 서열번호 1에 기재된 서열을 포함하는 벼의 P5CS (Δ1-피롤린-5-카르복실산 합성효소) 유전자 또는 서열번호 2에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자와, 서열번호 3에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH (프롤린 탈수소효소) 유전자의 안티센스 (역방향 염기 서열) 유전자가 탠덤 (직렬)으로 연결되어 있는 2개의 유전자가 있다.

본 발명의 실시예에서 사용되는 벡터에는, 서열번호 1에 기재된 서열을 포함하는 벼의 P5CS (Δ1-피롤린-5-카르복실산 합성효소) 유전자, 서열번호 2에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자, 서열번호 3에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH (프롤린 탈수소효소) 유전자의 안티센스 (역방향 염기 서열) 유전자 중 어느 하나의 유전자가 혼입되어 있거나, 또는 벼 또는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자와 상기 안티센스 유전자가 탠덤으로 연결된 2개의 유전자가 혼입되어 있다.

본 발명 실시예의 벼과 식물은, 예를 들면 하기 방법 중 어느 하나에 의해 얻을 수 있다.

(1) 상기 벡터를 벼과 식물 유래의 캘러스 (callus)에 도입하고, 이 캘러스를 증식시킨 후에 캘러스로부터 식물체를 재분화시킨다.

(2) 상기 벡터를 벼과 식물 유래의 프로토플라스트 (protoplast)에 도입하고, 이 프로토프라스트를 증식시킨 콜로니로부터 식물체를 재분화시킨다.

(3) 상기 벡터를 유전자 조작에 의해 도입하여 얻어진 벼과 식물과 교잡시킨다.

본 발명 실시예의 벼과 식물의 제조 방법은, 예를 들면 하기 예를 들 수 있다.

(1) 상기 벡터를 벼과 식물 유래의 캘러스에 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용하여 도입하고 이 캘러스를 증식시킨 후에 캘러스로부터 식물체를 재분화시킨다.

(2) 상기한 벡터를 전기천공법 (electroporation)에 의해 벼과 식물 유래의 프로토플라스트에 도입하고, 이 프로토플라스트를 증식시킨 콜로니로부터 식물체를 재분화시킨다.

이러한 제조 방법은 프롤린의 축적 능력이 높아, 내염성, 내건조성, 내냉성이 향상된 벼과 식물을 제공한다.

또한, 본 발명 실시예의 벼과 식물로부터 수확된 성숙 종자, 특히 벼의 종자는 복수 세대에 걸쳐 높은 프롤린 축적 능력을 유지해 간다.

본 발명 실시예의 벼과 식물 및 그 제조 방법을 실현하는 예를, 벼를 대표적인 예로 들어 하기 순서에 따라 상세히 설명한다. 하기에 설명하는 순서는 벼 이외의 벼과 식물에도 각종 조건을 그대로 또는 변경하여 적용할 수 있다.

<유전자의 클로닝>

제일 먼저, 벼 묘목 (rice seedling)으로부터 mRNA를 추출하고 이 mRNA를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 플라스미드 또는 파지로 이루어진 벡터에 연결하고, 이를 숙주 미생물 (E. coli)에 도입하여 재조합 DNA를 제조하였다. 이 재조합 DNA가 도입된 형질전환체는, 아라비돕시스 탈리아나로부터의 P5CS 유전자를 프로브로 사용하는 플라크 혼성화 (plaque hybridization)에 의해 스크리닝하였다. 벼 및 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자의 서열은 이미 보고되어 있기 (Yoshiba et al., Plant J. (1995) 7:751-760, Igarashi et al., Plant Mol. Bio1. (1997)33:857-865) 때문에, 이를 바탕으로 적당한 프라이머를 설계하고 PCR에 의해 스크리닝하여 목적으로 하는 형질전환체를 선별하였다. 얻어진 형질전환체로부터 목적하는 플라스미드를 단리하고, 필요하면 적당한 제한 효소로 절단하여 클로닝을위한 플라스미드 벡터에 서브클로닝하였다. 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자도, 벼와 마찬가지 방법으로 클로닝할 수 있다. 다만, mRNA를 추출하는 샘플은 통상의 환경에서 육종한 것보다도, 고염 스트레스 (250 mM NaCl 용액 등에 침지함)나 건조 스트레스 처리를 실시한 것이 바람직하다. 이는 P5CS 유전자가 고염 스트레스나 건조 스트레스 등의 수분 스트레스에 반응하여 유도되기 때문이다 (Yoshiba et al, Plant J. (1995) 7:751-760, Igarashi et al, Plant Mol. Biol. (1997) 33:857-865, Yoshiba et al, Plant Cell Physiol. (1997) 38:1095-1102).

한편, 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH 유전자 (서열은 문헌 [Kiyosue et al, Plant Cell (1996) 8: 1323-1335]에 이미 보고됨)도 상술한 방법에 의해 클로닝할 수 있다. 단, mRNA를 추출하는 샘플은 건조 스트레스를 주고 (약 10 시간 처리) 난 후, 다시 물에 침지하여 물을 흡수시킨 것, 또는 프롤린 용액에 침지하여 프롤린을 흡수시킨 것 등을 사용하는 것이 바람직하다. 이는 ProDH 유전자가, 수분 스트레스를 받고 있는 동안은 그 발현이 억제되고, 고농도의 프롤린에 의해서 그 유전자 발현이 유도되기 때문이다 (Kiyosue et al, Plant Cell (1996) 8:1323-1335, Yoshiba et al, Plant Cell Physiol (l997) 38:1095-1102).

이상과 같은 샘플을 사용하면 벼나 아라비돕시스 탈리아나 뿐만 아니라 다른 벼과 식물로부터도 P5CS 유전자와 ProDH 유전자를 단리할 수 있다.

<유전자 도입 벡터의 제작>

클론닝된 각 P5CS 유전자 및 ProDH 유전자를 적당한 제한 효소로 잘라낸 후, 이를 도 1A 내지 도 1D에 나타낸 바와 같이 pBI 벡터를 변형시킨 벼용 벡터의 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터 뒤에 연결하였다. 도 1A 내지 도 1D에 있어서, RB는 우측 경계 (right border), 35SPro는 꽃양배추 모자이크 바이러스의 프로모터, P5CS는 벼 또는 아라비돕시스 탈리아나의 프롤린 합성계 효소 유전자, ProDH는 아라비돕시스 탈리아나의 프롤린 대사계 효소 유전자, Noster는 노팔린 (nopaline) 합성효소 유전자의 터미네이터, HTP는 하이그로마이신 내성 유전자, LB는 좌측 경계 (left border)를 각각 나타내고 있다. 또한 화살표는 유전자의 센스 방향을 나타내고 있다.

도 1A 내지 도 1D에 있어서, 도 1A는, RB-35SPro-P5CS-Noster-35SPro-HTP-Noster-LB의 순으로 배열된 벡터 (작제물)를 제작한 예를 나타내는 도면이다. 도 1B는, 상기 A에 대하여, RB-35SPro-P5CS-Noster-35SPro-HTP-Noster-LB의 순으로 상기 A의 작제물과 동일하게 배열되지만 유전자 P5CS가 안티센스로 배열된 예를 나타내는 도면이다. 도 1C는, 상기 A의 작제물 유전자의 P5CS 대신에 유전자 ProDH를 안티센스로 배열하여 치환하고, RB-35SPro-ProDH(안티센스)-Noster-35SPro-HTP-Noster-LB의 순으로 배열된 벡터를 제작한 예를 나타내는 도면이다. 도 1D는 상기 A의 작제물에, 유전자 ProDH를 안티센스로 배열하고 상기 C에 나타낸 작제물을 탠덤으로 연결한 RB-35SPro-P5CS-Noster-35SPro-ProDH(안티센스)-Noster-35 SPro-HTP-Noster-LB의 순으로 배열된 벡터를 제작한 예를 나타내는 도면이다.

35S 프로모터는 강력하고, 항상 어떤 조직에서도 유전자 발현을 유도하는 프로모터로서 잘 알려져 있다. 또한, 유전자가 혼입되는 방향은 P5CS 유전자의 경우는 센스 방향으로, ProDH 유전자의 경우는 안티센스 방향으로 연결하였다.

그리고, 각 유전자가 연결된 벡터는 전기천공법에 의해 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA101 균주에 도입하였다. 각 작제물 (도 1A 내지 도 1D)이 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스는 박토 펩톤 (10 g/l), 박토 효모 추출물 (1O g/l), 염화나트륨 (5 g/l), 1M 염화마그네슘 (2 ㎖/l), 하이그로마이신 B (50 mg/l)를 포함하는 YEP 배지에 28 ℃에서 배양하여 증식시켰다. 유전자 도입은 각 작제물 (도 1A 내지 도 1D)이 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스를 벼의 캘러스 세포에 감염시킴으로써 행하였다. 작제물 D는 2개의 유전자 (P5CS 유전자와 ProDH 유전자)를 탠덤으로 연결하여 동시에 도입되도록 설계되어 있지만, 작제물 A와 C를 혼합하여 함께 감염시켜도 작제물 D와 마찬가지 효과를 얻을 수 있다.

또한, 각 작제물에는 HPT (하이그로마이신 내성) 유전자가 연결되어 있지만, 이것은 도입 유전자의 효과를 해석하는 기초 연구용으로서 형질전환된 세포 및 식물체를 효율적으로 선별하기 위한 것이므로 실제의 염에 손상된 경작지나 건조지 등에서 육종할 경우에는 혼입시킬 필요가 없다.

<유전자 도입용 벼 캘러스의 유도>

성숙한 벼 종자는, 왕겨를 박리한 후, 70％ 에틸 알코올로 10 분간, 3％ 차아염소산 나트륨으로 1 시간 살균하였다. 살균 후 종자를 멸균수로 3회 세정하고, 1 g/l의 카사미노산, 30 g/l의 수크로스, 2 mg/l의 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D), 2 g/l의 겔라이트 (Gelrite)를 포함한 pH 5.8의 N6 배지 (2N6 배지)에 넣어, 28 ℃의 암흑하에서 3 내지 5 주간 배양하였다.

<벼 캘러스로의 유전자 도입>

상기에서 유도한 벼 캘러스 중 크기가 1 내지 3 mm 직경의 것을 다시 2N6 배지에 넣어, 28 ℃의 암흑하에서 3 내지 4일 배양하였다. 이에 따라 캘러스 세포의 분열 활성을 높일 수 있었다. 유전자 도입은 배양된 캘러스와 YEP 배지에서 증식한 각 작제물이 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스 용액 (균의 농도를 OD 66O nm으로 측정하여 O.1이 되도록 희석한 것)을 혼합하여 감염시킴으로써 행하였다. 그 후, 캘러스를 25 ℃의 암흑하에서 3 일간 배양하였다. 배양 후, 캘러스를 1 mg/4 ㎖ 농도의 크라포란 수용액으로 캘러스 표면에 붙은 여분의 균을 수회 세정 살균하고, 멸균한 킴 타올 (kim towel) 등으로 닦아 낸 후, 250 mg/l의 크라포란 (cefotaxime), 10 mg/l의 하이그로마이신 B를 포함하는 2N6 배지 (1차 선별 배지)에 넣어, 28 ℃의 암흑하에서 1 주간 배양하였다.

<형질전환된 캘러스의 선별과 식물체의 재분화>

크라포란을 포함하는 배지에서 배양한 캘러스를, 하이그로마이신 B를 30 mg/l로 늘린 배지 (2차 선별 배지)에 넣어 28 ℃의 암흑하에서 3주간 배양하였다. 그 후, 캘러스를 수크로스 30 g/l, 소르비톨 30 g/l, 카사미노산 2 g/l, MES 완충액 11 g/l, 나프탈렌 아세트산 (NAA) 2 mg/l, 카이네틴 (kinetin) 1 mg/l, 크라포란 250 mg/l, 하이그로마이신 B 30 mg/l, 겔라이트 4 g/l를 포함하는 pH 5.8의 MS 배지 (재분화 유도 배지)에 옮겨, 28 ℃의 밝은 장소에서 3 주간 배양하였다. 유전자가 도입된 캘러스는 그린 스폿 (green spot)을 형성하였고, 거기에서 싹 (shoot)과 뿌리가 분화되었다. 식물 호르몬이 제거된, 수크로스 30 g/l, 크라포란 250 mg/l, 하이그로마이신 B 30 mg/l, 한천 8 g/l를 포함하는 pH 5.8의 MS 배지 (식물체 형성 배지)에 분화된 캘러스를 옮겨, 28 ℃의 밝은 곳에서 수주 동안 배양함으로써 식물체를 더욱 크게 육종하였다.

<형질전환 벼 식물체의 육종과 종자 형성>

재분화된 벼는, 샤알레 안에서 약 4 내지 5 cm 정도의 크기 (높이)가 되면 묘목 육종용 토양이 든 플랜터 (planter)에 옮겨, 조도가 약 2만 룩스 정도의 인공 기후 시스템 내에서 28 ℃의 온도 조건으로 제4 잎부터 제5 잎이 발육할 때까지 육종하였다. 그 후, 묘목을 더욱 적절하게 비료를 가한 흑토를 넣은 와그넬 포트 (pot)로 옮겨 온실 내에서 종자가 여물 때까지 육종하였다. 재분화된 당대의 식물체는 T0 세대이고 이 식물체로부터 취할 수 있는 종자를 T1 세대로 가정하고, T2 세대 내지 T3 세대까지 육종하였다. 실제 농지에서 육종할 경우에는 또한 세대를 중첩하여 여러가지 안전성 평가 시험을 행하여 안전성을 확인한 후, 시장에 낼 필요가 있다.

<형질전환 벼로부터의 프롤린 추출과 그 농도 측정>

프롤린은, T2 세대 또는 T3 세대의 형질전환 벼의 묘목 (제4 잎이 발육한 것)의 잎에서 추출하였다. 인공 기후 시스템 내에서 육종한 벼 묘목의 잎은 가위 등으로 약 200 mg 만큼 잘라 내고, 모르타르에서 액체 질소를 가하여 분말이 될 때까지 갈아서 깨뜨렸다. 분말이 된 샘플을, 순수한 물을 가하여 호모게나이저 등을 사용하여 추가로 마쇄하였다. 분쇄한 샘플을, 97 ℃에서 6 분간 가열한 후, 빙냉하여, 4 ℃에서 약 17,000×G로 10 분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 얻어진 상층액에 최종 농도가 5 ％가 되도록 트리클로로아세트산을 가하여 혼합하고,다시 4 ℃에서 약 17,000×G로 10 분간 원심분리하여 단백질을 침전시켰다. 적합 용질로서의 프롤린은 이 때의 상층액에 포함되어 있고, 농도는 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 측정하였다. 프롤린의 정성 정량은 각종 아미노산의 표준을 일정한 농도로 녹인 것을 미리 HPLC에서 측정해 두고, 그 보유 시간 (retention time)을 기준으로 환산하여 실제 트랜스제닉 벼의 잎에 포함된 프롤린의 양을 정량하였다.

도 2는 각종 유전자를 도입한 재조합 벼에 스트레스를 제공하지 않을 때의 프롤린 함량을 보이고 있다. 좌단의 흰색 표시 그래프는 프롤린 관련 유전자가 혼입되지 않은 대조군을, 우측 5개의 흑색 표시 그래프는 프롤린 관련 유전자가 혼입된 트랜스제닉 벼의 각 계통을 나타내고 있다. 프롤린의 양은 도입한 유전자의 종류에 따라 다르다는 것이 확인되었다.

좌측으로부터 2 열째의 벼의 P5CS 유전자 (OsP5CS)를 안티센스 방향으로 도입한 것 (도 1B)은 거의 프롤린을 축적하지 않는 것으로 관찰되었다. 좌측으로부터 3 열째의 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자 (AtP5CS)를 센스 방향으로 도입한 것 (도 1A)은 대조군에 비하여 프롤린의 축적량이 증가되어 있는 것으로 확인되었다. 마찬가지로 좌측으로부터 4 열째 및 5 열째의 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH 유전자 (AtProDH)를 안티센스 방향으로 도입한 것 (도 1C) 및 벼의 P5CS 유전자 (OsP5CS)를 센스 방향으로 도입한 것 (도 1A)은, 각각 대조군에 비하여 프롤린의 축적량이 증가하고 있는 것으로 확인되었다. 이들에 대하여, 우단에서 벼의 P5CS 유전자 (OsP5CS)를 센스 방향으로, 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH 유전자(AtProDH)를 안티센스 방향으로 도입한 것은 상기 1종류의 유전자를 도입한 것에 비하여 축적된 프롤린의 양이 상당히 높다는 (높은 것은 대조군에 비하여 100 배 이상) 것이 확인되었다. 그리고, 유전자를 센스 방향으로 도입한 것에서는, AtP5CS (좌측으로부터 3열째) 보다도 OsP5CS (좌측으로부터 5열째) 쪽이 프롤린 축적에 있어서 약간 효과가 있음이 확인되었다.

<내염성 시험과 트랜스제닉 벼의 내염성 향상>

도 3은, 도 2의 우측 4열에 나타낸 프롤린 축적이 인정된 트랜스제닉 벼를 여러 계통 사용하여, 250 mM의 농도 (해수 소금 농도의 약 절반)로 내염성 시험을 행한 결과를 나타낸다. 이 흰색 표시 그래프는 프롤린 관련 유전자가 혼입되지 않은 대조군을, 흑색 표시 그래프는 트랜스제닉 벼 샘플을 나타내고 있다. 내염성 시험은 공지된 생존률 (survival rate)을 지표로 한 시험 방법 (일본 특허 공개 평 09-266726호, 발명의 명칭: 식물의 내염성의 간이 평가 방법)에 준하여 행하였다. 프롤린 관련 유전자를 도입하지 않은 대조군은 소금 처리 3일로 모두 고사해 버리는데 비하여, 프롤린을 축적하는 트랜스제닉 벼는 3 일째에 95％로 5일 동안 처리하여도 65％라는 높은 생존률을 나타내는 것이 확인되었다. 이로부터 벼를 형질전환시킴으로써 프롤린 축적 능력을 높여 내염성을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 의해 제조된 벼과 작물은 안전성 평가 등 상세한 분석을 진행시켜 품종화하면, 장래 염류가 집적된 토양이나 사막화된 토양에서도 육종이 가능해지고 식품 생산의 향상을 기대할 수 있다. 또한, 개발도상국에 있어서의 인구 증가에도 대처할 수 있을 것으로 크게 기대할 수 있다.

본 발명에 의해서, 프롤린 축적 능력을 높인 트랜스제닉 벼과 식물의 제조가 가능해졌다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 벼과 식물은 프롤린 축적량이 높기 때문에 내염성을 향상시킬 수 있게 되었다.

<110> Hitachi, LTD. RIKEN Japan International Research Center for Agricaltural Science Bio-oriented Technology Research Advancement Institute (BRAIN) <120> Transgenic rice plant and its family with environmental stress resistant by proline accumulation of high level and its production. <130> NT0549US <160> 3 <210> 1 <211> 2549 <212> DNA <213> Oryza sativa L. <220> <221> CDS <222> 99..2249 <300> <301> Yumiko Igarashi, Yoshu Yoshiba, Yukika Sanada, Kazuko Yamaguchi-Shinozaki, Keishiro Wada, Kazuo Shinozaki <302> Characterization of the gene for Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase and correlation between the expression of the gene and salt tolerance in Oryza sativa L. <303> Plant Molecular biology <304> 33 <306> 857-865 <307> 1996-12-03 <308> D49714 <309> 1995-03-16 <400> 1 gcggctgcgg cggcaaggcg gcgagacgtg ggagagggat ttacaggtag agggagaggg 60 tggaggagga gaggctgagg ctaggaagcg gtttcgcc atg gcg agc gtc gac ccg 116 Met Ala Ser Val Asp Pro 1 5 tcc cgg agc ttc gtg agg gac gtg aag cgc gtc atc atc aag gtg ggc 164 Ser Arg Ser Phe Val Arg Asp Val Lys Arg Val Ile Ile Lys Val Gly 10 15 20 act gca gtt gtc tcc aga caa gat gga aga ttg gct ttg ggc agg gtt 212 Thr Ala Val Val Ser Arg Gln Asp Gly Arg Leu Ala Leu Gly Arg Val 25 30 35 gga gct ctg tgc gag cag gtt aag gaa ctg aac tct tta gga tac gaa 260 Gly Ala Leu Cys Glu Gln Val Lys Glu Leu Asn Ser Leu Gly Tyr Glu 40 45 50 gtg att ttg gtc acc tca ggt gct gtt gga gtg ggg cga cag cga ctt 308 Val Ile Leu Val Thr Ser Gly Ala Val Gly Val Gly Arg Gln Arg Leu 55 60 65 70 agg tac cgg aag ctt gtc aat agc agc ttt gct gat ctg caa aag cca 356 Arg Tyr Arg Lys Leu Val Asn Ser Ser Phe Ala Asp Leu Gln Lys Pro 75 80 85 cag atg gag tta gat gga aag gct tgt gcc gct gtt ggt cag agt gga 404 Gln Met Glu Leu Asp Gly Lys Ala Cys Ala Ala Val Gly Gln Ser Gly 90 95 100 ctg atg gct ctt tac gat atg ttg ttt aac caa ctg gat gtc tcg tca 452 Leu Met Ala Leu Tyr Asp Met Leu Phe Asn Gln Leu Asp Val Ser Ser 105 110 115 tct caa ctt ctt gtc acc gac agt gat ttt gag aac cca aag ttc cgg 500 Ser Gln Leu Leu Val Thr Asp Ser Asp Phe Glu Asn Pro Lys Phe Arg 120 125 130 gag caa ctc act gaa act gtt gag tca tta tta gat ctt aaa gtt ata 548 Glu Gln Leu Thr Glu Thr Val Glu Ser Leu Leu Asp Leu Lys Val Ile 135 140 145 150 cca ata ttt aat gaa aat gat gcc atc agc act aga aag gct cca tat 596 Pro Ile Phe Asn Glu Asn Asp Ala Ile Ser Thr Arg Lys Ala Pro Tyr 155 160 165 gag gat tca tct ggt ata ttc tgg gat aat gac agt tta gca gga ctg 644 Glu Asp Ser Ser Gly Ile Phe Trp Asp Asn Asp Ser Leu Ala Gly Leu 170 175 180 ttg gca ctg gaa ctg aaa gct gat ctc ctt att ctg ctc agt gat gtg 692 Leu Ala Leu Glu Leu Lys Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu Ser Asp Val 185 190 195 gat ggg ttg tat agt ggt cca cca agt gaa cca tca tca aaa atc ata 740 Asp Gly Leu Tyr Ser Gly Pro Pro Ser Glu Pro Ser Ser Lys Ile Ile 200 205 210 cac act tat att aaa gaa aag cat cag caa gaa atc act ttt gga gac 788 His Thr Tyr Ile Lys Glu Lys His Gln Gln Glu Ile Thr Phe Gly Asp 215 220 225 230 aaa tct cgt gta ggt aga gga ggc atg aca gca aaa gtg aag gct gct 836 Lys Ser Arg Val Gly Arg Gly Gly Met Thr Ala Lys Val Lys Ala Ala 235 240 245 gtc ttg gct tca aat agc ggc aca cct gtg gtt att aca agt ggg ttt 884 Val Leu Ala Ser Asn Ser Gly Thr Pro Val Val Ile Thr Ser Gly Phe 250 255 260 gaa aat cgg agc att ctt aaa gtt ctt cat ggg gaa aaa att ggt act 932 Glu Asn Arg Ser Ile Leu Lys Val Leu His Gly Glu Lys Ile Gly Thr 265 270 275 ctc ttt cac aag aat gcg aat ttg tgg gaa tca tct aag gat gtt agt 980 Leu Phe His Lys Asn Ala Asn Leu Trp Glu Ser Ser Lys Asp Val Ser 280 285 290 act cgt gag atg gct gtt gcc gca aga gat tgt tca agg cat cta cag 1028 Thr Arg Glu Met Ala Val Ala Ala Arg Asp Cys Ser Arg His Leu Gln 295 300 305 310 aat ttg tca tca gag gaa cga aaa aag ata ttg cta gat gtt gca gat 1076 Asn Leu Ser Ser Glu Glu Arg Lys Lys Ile Leu Leu Asp Val Ala Asp 315 320 325 gct ttg gag gca aat gag gat tta ata agg tct gag aat gaa gct gat 1124 Ala Leu Glu Ala Asn Glu Asp Leu Ile Arg Ser Glu Asn Glu Ala Asp 330 335 340 gta gct gcg gcc caa gtt gct gga tat gag 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His Ala Arg 665 670 675 gga cca gtg ggt gtt gaa ggt ctc tta act aca cga tgg atc ttg cga 2180 Gly Pro Val Gly Val Glu Gly Leu Leu Thr Thr Arg Trp Ile Leu Arg 680 685 690 gga cgt ggg caa gtg gtg aat ggt gac aag gat gtc gtg tac acc cat 2228 Gly Arg Gly Gln Val Val Asn Gly Asp Lys Asp Val Val Tyr Thr His 695 700 705 710 aag agt ctt cct ttg caa tgaggtcaaa tgctcctttt agcctgttca 2276 Lys Ser Leu Pro Leu Gln 715 ggagtaggtg aatatccttt taagaatgga ttgactactt tattttgtca tcttgtacaa 2336 gcatcttatt gcggcattcc gatggattat tgattttggg ggttcccact ttcaaatgtg 2396 acaccaaaaa taaattcatc agttctgaga gcaagatttt ggaggttcag cttctccatg 2456 taataagtaa attcagttct gagaacttgt gtaccaacgc gctatgttgc ttgtaatgag 2516 cgatactaac atctgtgatt gcacatatac taa 2549 <210> 2 <211> 2571 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> 107...2260 <301> Yoshu Yoshiba, Tomohiro Kiyasue, Takeshi Katagiri, Hiroko Ueda, Tsuyoshi Mizoguchi, Kazuko Yamaguchi-Shinozaki, Keishiro Wada, Yoshinori Harada, Kazuo Shinozaki <302> 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ctt cgt tat cga caa tta gtc aat agc agc ttt gcg gat ctt 355 Gln Arg Leu Arg Tyr Arg Gln Leu Val Asn Ser Ser Phe Ala Asp Leu 70 75 80 cag aag cct cag act gaa ctt gat ggg aag gct tgt gct ggt gtt gga 403 Gln Lys Pro Gln Thr Glu Leu Asp Gly Lys Ala Cys Ala Gly Val Gly 85 90 95 caa agc agt ctt atg gct tac tat gag act atg ttt gac cag ctt gat 451 Gln Ser Ser Leu Met Ala Tyr Tyr Glu Thr Met Phe Asp Gln Leu Asp 100 105 110 115 gtg acg gca gct caa ctt ctg gtg aat gac agt agt ttt aga gac aag 499 Val Thr Ala Ala Gln Leu Leu Val Asn Asp Ser Ser Phe Arg Asp Lys 120 125 130 gat ttc agg aag caa ctt aat gaa act gtc aag tct atg ctt gat ttg 547 Asp Phe Arg Lys Gln Leu Asn Glu Thr Val Lys Ser Met Leu Asp Leu 135 140 145 agg gtt att cca att ttc aat gag aat gat gct att agc acc cga aga 595 Arg Val Ile Pro Ile Phe Asn Glu Asn Asp Ala Ile Ser Thr Arg Arg 150 155 160 gcc cca tat cag gat tct tct ggt att ttc tgg gat aac gat agc tta 643 Ala Pro Tyr Gln Asp Ser Ser Gly Ile Phe Trp Asp Asn Asp Ser Leu 165 170 175 gct gct cta ctg gcg ttg gaa ctg aaa gct gat ctt ctg att ctt ctg 691 Ala Ala Leu Leu Ala Leu Glu Leu Lys Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu 180 185 190 195 agc gat gtt gaa ggt ctt tac aca ggc cct cca agt gat cct aac tca 739 Ser Asp Val Glu Gly Leu Tyr Thr Gly Pro Pro Ser Asp Pro Asn Ser 200 205 210 aag ttg atc cac act ttt gtt aaa gaa aaa cat caa gat gag att aca 787 Lys Leu Ile His Thr Phe Val Lys Glu Lys His Gln Asp Glu Ile Thr 215 220 225 ttc ggc gac aaa tca aga tta ggg aga ggg ggt atg act gca aaa gtc 835 Phe Gly Asp Lys Ser Arg Leu Gly Arg Gly Gly Met Thr Ala Lys Val 230 235 240 aaa gct gca gtc aat gca gct tat gct ggg att cct gtc atc ata acc 883 Lys Ala Ala Val Asn Ala Ala Tyr Ala Gly Ile Pro Val Ile Ile Thr 245 250 255 agt ggg tat tca gct gag aac ata gat aaa gtc ctc aga gga cta cgt 931 Ser Gly Tyr Ser Ala Glu Asn Ile Asp Lys Val Leu Arg Gly Leu Arg 260 265 270 275 gtt gga acc ttg ttt cat caa gat gct cgt tta tgg gct ccg atc aca 979 Val Gly Thr Leu Phe His Gln Asp Ala Arg Leu Trp Ala Pro Ile Thr 280 285 290 gat tct aat gct cgt gac atg gca gtt gct gcg agg gaa agt tcc aga 1027 Asp Ser Asn Ala Arg Asp Met Ala Val Ala Ala Arg Glu Ser Ser Arg 295 300 305 aag ctt cag gcc tta tct tcg gaa gac agg aaa aaa att ctg ctt gat 1075 Lys Leu Gln Ala Leu Ser Ser Glu Asp Arg Lys Lys Ile Leu Leu Asp 310 315 320 att gcc gat gcc ctt gaa gca aat gtt act aca atc aaa gct gag aat 1123 Ile Ala Asp Ala Leu Glu Ala Asn Val Thr Thr Ile Lys Ala Glu Asn 325 330 335 gag tta gat gta gct tct gca caa gag gct ggg ttg gaa gag tca atg 1171 Glu Leu Asp Val Ala Ser Ala Gln Glu Ala Gly Leu Glu Glu Ser Met 340 345 350 355 gtg gct cgc tta gtt atg aca cct gga aag atc tcg agc ctt gca gct 1219 Val Ala Arg Leu Val Met Thr Pro Gly Lys Ile Ser Ser Leu Ala Ala 360 365 370 tca gtt cgt aag cta gct gat atg gaa gat cca atc ggc cgt gtt tta 1267 Ser Val Arg Lys Leu Ala Asp Met Glu Asp Pro Ile Gly Arg Val Leu 375 380 385 aag aaa aca gag gtg gca gat ggt ctt gtc tta gag aag acc tca tca 1315 Lys Lys Thr Glu Val Ala Asp Gly Leu Val Leu Glu Lys Thr Ser Ser 390 395 400 cca tta ggc gta ctt ctg att gtt ttt gaa tcc cga cct gat gca ctt 1363 Pro Leu Gly Val Leu Leu Ile Val Phe Glu Ser Arg Pro Asp Ala Leu 405 410 415 gta cag ata gct tca ctt gcc atc cgt agt gga aat ggt ctt ctg ctg 1411 Val Gln Ile Ala Ser Leu Ala Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Leu Leu 420 425 430 435 aag ggt gga aag gag gcc cgg cga tca aat gct atc tta cac aag gtg 1459 Lys Gly Gly Lys Glu Ala Arg Arg Ser Asn Ala Ile Leu His Lys Val 440 445 450 atc act gat gca att cca gag act gtt ggg ggt aaa ctc att gga ctt 1507 Ile Thr Asp Ala Ile Pro Glu Thr Val Gly Gly Lys Leu Ile Gly Leu 455 460 465 gtg act tca aga gaa gag att cct gat ttg ctt aag ctt gat gac gtt 1555 Val Thr Ser Arg Glu Glu Ile Pro Asp Leu Leu Lys Leu Asp Asp Val 470 475 480 atc gat ctt gtg atc cca aga gga agc aac aag ctt gtt act cag ata 1603 Ile Asp Leu Val Ile Pro Arg Gly Ser Asn Lys Leu Val Thr Gln Ile 485 490 495 aaa aat act aca aaa atc cct gtg cta ggt cat gct gat gga atc tgt 1651 Lys Asn Thr Thr Lys Ile Pro Val Leu Gly His Ala Asp Gly Ile Cys 500 505 510 515 cat gta tat gtc gac aag gct tgt gat acg gat atg gca aag cgc ata 1699 His Val Tyr Val Asp Lys Ala Cys Asp Thr Asp Met Ala Lys Arg Ile 520 525 530 gtt tct gat gca aag ttg gac tat cca gca gcc tgt aat gcg atg gaa 1747 Val Ser Asp Ala Lys Leu Asp Tyr Pro Ala Ala Cys Asn Ala Met Glu 535 540 545 acc ctt ctt gtg cat aag gat cta gag cag aat gct gtg ctt aat gag 1795 Thr Leu Leu Val His Lys Asp Leu Glu Gln Asn Ala Val Leu Asn Glu 550 555 560 ctt att ttt gct ctg cag agc aat gga gtc act ttg tat ggt gga cca 1843 Leu Ile Phe Ala Leu Gln Ser Asn Gly Val Thr Leu Tyr Gly Gly Pro 565 570 575 agg gca agt aag ata ctg aac ata cca gaa gca cgg tca ttc aac cat 1891 Arg Ala Ser Lys Ile Leu Asn Ile Pro Glu Ala Arg Ser Phe Asn His 580 585 590 595 gag tac tgt gcc aag gct tgc act gtt gaa gtt gta gaa gac gtt tat 1939 Glu Tyr Cys Ala Lys Ala Cys Thr Val Glu Val Val Glu Asp Val Tyr 600 605 610 ggt gct ata gat cac att cac cga cat ggg agt gca cac aca gac tgc 1987 Gly Ala Ile Asp His Ile His Arg His Gly Ser Ala His Thr Asp Cys 615 620 625 att gtg aca gag gat cac gaa gtt gca gag cta ttc ctt cgc caa gtg 2035 Ile Val Thr Glu Asp His Glu Val Ala Glu Leu Phe Leu Arg Gln Val 630 635 640 gat agc gct gct gtg ttc cac aac gcc agc aca aga ttc tca gat ggt 2083 Asp Ser Ala Ala Val Phe His Asn Ala Ser Thr Arg Phe Ser Asp Gly 645 650 655 ttc cga ttt gga ctt ggt gca gag gtg ggg gta agc acg ggc agg atc 2131 Phe Arg Phe Gly Leu Gly Ala Glu Val Gly Val Ser Thr Gly Arg Ile 660 665 670 675 cat gct cgt ggt cca gtc ggg gtc gaa gga tta ctt aca acg aga tgg 2179 His Ala Arg Gly Pro Val Gly Val Glu Gly Leu Leu Thr Thr Arg Trp 680 685 690 ata atg aga gga aaa gga caa gtt gtc gac gga gac aat gga att gtt 2227 Ile Met Arg Gly Lys Gly Gln Val Val Asp Gly Asp Asn Gly Ile Val 695 700 705 tac acc cat cag gac att ccc atc caa gct taaacaagac ttccgagtgt 2277 Tyr Thr His Gln Asp Ile Pro Ile Gln Ala 710 715 gtgtttgtgt atttggttga gacttgagga gagacacaga ggaggatggg cttttttgtt 2337 tcctctctgc ttagtactca tatcctatca ttattattat tactactact tattattgaa 2397 accctcgctt atgtagtggt tttgatttag ggttaggatt gcaccaaaaa taagatccac 2457 tttaccactt agtcttgctc ataagtacga tgaagaacat ttaattagct tctcttcttg 2517 tcattgtaag ctacctacac atttctgatc tttatcaaga tactactact tttc 2571 <210> 3 <211> 1833 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> 113...1612 <301> Tomohiro Kiyasue, Yoshu Yoshiba, Kazuko Yamaguchi-Shinozaki, Kazuo Shinozaki <302> an enzyme involved in proline metabolism, is upregulated by proline but downregulated by dehydration in Arabidopsis. <303> The Plant Cell <304> 8 <306> 1323-1335 <307> 1996-05-27 <308> D83025 <309> 1995-12-25 <400> 3 agcgtttaga aaaaaacagc gataaaaccg aaacatcaag caaacaaaaa aaaaagagaa 60 gagaaattat ttttttttgt tttcgttttc aaaaacaaaa tctttgaatt tt atg gca 118 Met Ala 1 acc cgt ctt ctc cga aca aac ttt atc cgg cga tct tac cgt tta ccc 166 Thr Arg Leu Leu Arg Thr Asn Phe Ile Arg Arg Ser Tyr Arg Leu Pro 5 10 15 gct ttt agc ccg gtg ggt cct ccc acc gtg act gct tcc acc gcc gtc 214 Ala Phe Ser Pro Val Gly Pro Pro Thr Val Thr Ala Ser Thr Ala Val 20 25 30 gtc ccg gag att ctc tcc ttt gga caa caa gca ccg gaa cca cct ctt 262 Val Pro Glu Ile Leu Ser Phe Gly Gln Gln Ala Pro Glu Pro Pro Leu 35 40 45 50 cac cac cca aaa ccc acc gag caa tct cac gat ggt ctc gat ctc tcc 310 His His Pro Lys Pro Thr Glu Gln Ser His Asp Gly Leu Asp Leu Ser 55 60 65 gat caa gcc cgt ctt ttc tcc tct atc cca acc tct gat ctc ctc cgt 358 Asp Gln Ala Arg Leu Phe Ser Ser Ile Pro Thr Ser Asp Leu Leu Arg 70 75 80 tcc acc gcc gtg ttg cat gcg gcg gcg ata ggt cct atg gtc gac cta 406 Ser Thr Ala Val Leu His Ala Ala Ala Ile Gly Pro Met Val Asp Leu 85 90 95 ggg acg tgg gtc atg agc tct aaa ctt atg gac gct tcg gtg acg cgt 454 Gly Thr Trp Val Met Ser Ser Lys Leu Met Asp Ala Ser Val Thr Arg 100 105 110 ggc atg gtt tta ggg ctt gtg aaa agt acg ttt tat gac cat ttt tgc 502 Gly Met Val Leu Gly Leu Val Lys Ser Thr Phe Tyr Asp His Phe Cys 115 120 125 130 gcc ggt gaa gat gcc gac gca gcc gct gag cgc gtg aga agc gtt tat 550 Ala Gly Glu Asp Ala Asp Ala Ala Ala Glu Arg Val Arg Ser Val Tyr 135 140 145 gaa gct act ggt ctt aaa ggg atg ctt gtc tat ggc gtc gaa cac gcc 598 Glu Ala Thr Gly Leu Lys Gly Met Leu Val Tyr Gly Val Glu His Ala 150 155 160 gat gac gct gta tct tgt gat gat aac atg caa caa ttc att cga acc 646 Asp Asp Ala Val Ser Cys Asp Asp Asn Met Gln Gln Phe Ile Arg Thr 165 170 175 att gaa gct gcc aaa tct tta cca aca tct cac ttt agc tca gtg gtt 694 Ile Glu Ala Ala Lys Ser Leu Pro Thr Ser His Phe Ser Ser Val Val 180 185 190 gtg aag ata act gcc att tgt cca att agt ctt ctg aaa cga gtg agc 742 Val Lys Ile Thr Ala Ile Cys Pro Ile Ser Leu Leu Lys Arg Val Ser 195 200 205 210 gat ctg ctg cgg tgg gaa tac aaa agt ccg aac ttc aaa ctc tca tgg 790 Asp Leu Leu Arg Trp Glu Tyr Lys Ser Pro Asn Phe Lys Leu Ser Trp 215 220 225 aag ctc aaa tcg ttt ccg gtt ttc tcc gaa tcg agt cct ctc tac cac 838 Lys Leu Lys Ser Phe Pro Val Phe Ser Glu Ser Ser Pro Leu Tyr His 230 235 240 aca aac tca gaa ccg gaa ccg tta acc gcg gaa gaa gaa agg gag ctc 886 Thr Asn Ser Glu Pro Glu Pro Leu Thr Ala Glu Glu Glu Arg Glu Leu 245 250 255 gaa gca gct cat gga agg att caa gaa atc tgt agg aaa tgc caa gag 934 Glu Ala Ala His Gly Arg Ile Gln Glu Ile Cys Arg Lys Cys Gln Glu 260 265 270 tcc aat gta cca ttg ttg att gat gcg gaa gac aca atc ctc caa ccc 982 Ser Asn Val Pro Leu Leu Ile Asp Ala Glu Asp Thr Ile Leu Gln Pro 275 280 285 290 gcg atc gat tac atg gct tat tca tcg gcg atc atg ttc aat gct gac 1030 Ala Ile Asp Tyr Met Ala Tyr Ser Ser Ala Ile Met Phe Asn Ala Asp 295 300 305 aaa gac cga cca atc gtt tac aac acg att cag gcg tac ttg aga gac 1078 Lys Asp Arg Pro Ile Val Tyr Asn Thr Ile Gln Ala Tyr Leu Arg Asp 310 315 320 gcc ggt gag aga ctg cat ttg gca gta caa aat gct gag aaa gag aat 1126 Ala Gly Glu Arg Leu His Leu Ala Val Gln Asn Ala Glu Lys Glu Asn 325 330 335 gtt cct atg ggg ttc aag ttg gtg aga ggg gct tac atg tct agc gaa 1174 Val Pro Met Gly Phe Lys Leu Val Arg Gly Ala Tyr Met Ser Ser Glu 340 345 350 cgt agc ttg gcg gat tcc ctg ggt tgc aag tcg cca gtc cac gac aca 1222 Arg Ser Leu Ala Asp Ser Leu Gly Cys Lys Ser Pro Val His Asp Thr 355 360 365 370 att cag gat act cac tct tgt tac aat gat tgt atg aca ttc ctg atg 1270 Ile Gln Asp Thr His Ser Cys Tyr Asn Asp Cys Met Thr Phe Leu Met 375 380 385 gag aaa gca tca aac ggt tct ggt ttc ggt gtc gtt ctc gca aca cat 1318 Glu Lys Ala Ser Asn Gly Ser Gly Phe Gly Val Val Leu Ala Thr His 390 395 400 aac gct gat tcg ggg aga ctt gcg tcg agg aaa gcg agt gac ctc ggg 1366 Asn Ala Asp Ser Gly Arg Leu Ala Ser Arg Lys Ala Ser Asp Leu Gly 405 410 415 atc gat aaa cag aac ggg aag ata gag ttt gca cag cta tat ggt atg 1414 Ile Asp Lys Gln Asn Gly Lys Ile Glu Phe Ala Gln Leu Tyr Gly Met 420 425 430 tca gat gca ttg tcc ttc ggg tta aag aga gca ggg ttc aat gtt agc 1462 Ser Asp Ala Leu Ser Phe Gly Leu Lys Arg Ala Gly Phe Asn Val Ser 435 440 445 450 aag tac atg ccg ttt gga ccc gtc gca acc gct ata ccg tat ctt ctc 1510 Lys Tyr Met Pro Phe Gly Pro Val Ala Thr Ala Ile Pro Tyr Leu Leu 455 460 465 cga cgc gct tat gag aac cgg gga atg atg gcc acc gga gct cat gac 1558 Arg Arg Ala Tyr Glu Asn Arg Gly Met Met Ala Thr Gly Ala His Asp 470 475 480 cgt caa ctc atg agg atg gaa ctt aag agg aga tta atc gcc ggg att 1606 Arg Gln Leu Met Arg Met Glu Leu Lys Arg Arg Leu Ile Ala Gly Ile 485 490 495 gcg taaagagaga gtatggagcc attaaatgaa attgggaaat gtagatgaat 1659 Ala aaatttcttc tatgtagttt aagaaattga aaacaaaaaa ttataatata agaaatggag 1719 taggtaagaa catttcctgt ggctaaatat ttttcatgag ggactatgtt tttactatca 1779 atatatcatt cacaaatgta tattcacctt atcaataaaa atgcttttta cttt 1833

Claims

서열번호 1에 기재된 서열을 포함하는 벼의 P5CS(Δ1-피롤린-5 -카르복실산 합성효소) 유전자가 도입된 것을 특징으로 하고, 상기 유전자가 도입된 벼과 식물 유래의 캘러스 또는 프로토플라스트를 증식시킨 콜로니의 재분화 방법에 의해 무성번식되는 형질전환된 벼과 식물.
서열번호 2에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 P5CS(Δ1-피롤린-5-카르복실산 합성효소) 유전자가 도입된 것을 특징으로 하고, 상기 유전자가 도입된 벼과 식물 유래의 캘러스 또는 프로토플라스트를 증식시킨 콜로니의 재분화 방법에 의해 무성번식되는 형질전환된 벼과 식물.
서열번호 3에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH(프롤린 탈수소효소) 유전자의 안티센스(역방향 염기 서열) 유전자가 도입된 것을 특징으로 하고, 상기 유전자가 도입된 벼과 식물 유래의 캘러스 또는 프로토플라스트를 증식시킨 콜로니의 재분화 방법에 의해 무성번식되는 형질전환된 벼과 식물.
서열번호 1에 기재된 서열을 포함하는 벼의 P5CS 유전자 또는 서열번호 2에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자와, 서열번호 3에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH 유전자의 안티센스 유전자가 도입된 것을 특징으로 하고, 상기 유전자가 도입된 벼과 식물 유래의 캘러스 또는 프로토플라스트를 증식시킨 콜로니의 재분화 방법에 의해 무성번식되는 형질전환된 벼과 식물.
서열번호 1에 기재된 서열을 포함하는 벼의 P5CS 유전자 또는 서열번호 2에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자와, 서열번호 3에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH 유전자의 안티센스 유전자가 탠덤(tandem)으로 연결되어 도입된 것을 특징으로 하고, 상기 유전자가 도입된 벼과 식물 유래의 캘러스 또는 프로토플라스트를 증식시킨 콜로니의 재분화 방법에 의해 무성번식되는 형질전환된 벼과 식물.
서열번호 1에 기재된 서열을 포함하는 벼의 P5CS 유전자, 서열번호 2에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자, 서열번호 3에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH 유전자의 안티센스 유전자 중 어느 하나가 도입되거나, 또는 상기 벼 또는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자와 상기 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH 유전자의 안티센스 유전자가 탠덤으로 연결되어 도입된 것을 특징으로 하는 벡터.
제6항에 기재된 벡터를 벼과 식물 유래의 캘러스(callus)에 도입하고, 상기 캘러스를 증식시킨 후에, 상기 캘러스로부터 식물체를 재분화(regeneration)시켜 얻어지는 것을 특징으로 하는 형질전환된 벼과 식물.
제6항에 기재된 벡터를 벼과 식물 유래의 프로토플라스트(protoplast)에 도입하고, 상기 프로토플라스트를 증식시킨 콜로니로부터 식물체를 재분화시켜 얻어지는 것을 특징으로 하는 형질전환된 벼과 식물.
삭제
제1항 내지 제5항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벼과 식물이 벼인 것을 특징으로 하는 형질전환된 벼과 식물.
제1항 내지 제5항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 기재된 벼과 식물로부터 수확된 것을 특징으로 하는 형질전환된 벼과 식물의 종자.
제1항 내지 제5항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 기재된 벼과 식물이 벼이고, 상기 벼로부터 수확된 것을 특징으로 하는 형질전환된 벼과 식물의 종자.
제6항에 기재된 벡터를 벼과 식물 유래의 캘러스에 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용하여 도입하고, 상기 캘러스를 증식시킨 후에, 상기 캘러스로부터 식물체를 재분화시키는 것을 특징으로 하는 형질전환된 벼과 식물의 제조 방법.
제6항에 기재된 벡터를 벼과 식물 유래의 프로토플라스트에 전기천공법(electroporation)으로 도입하고, 상기 프로토플라스트를 증식시킨 콜로니로부터 식물체를 재분화시키는 것을 특징으로 하는 형질전환된 벼과 식물의 제조 방법.
제6항에 기재된 벡터를 유전자 조작에 의해 도입하여 얻어진 벼과 식물과 교잡시킴으로써 제6항에 기재된 벡터가 도입된 것을 특징으로 하는 형질전환된 벼과 식물의 제조 방법.