JP2002369634A - プロリン蓄積能力の高いイネ科植物およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 プロリン蓄積能力を高め、これにより耐塩性
レベルの向上した形質転換イネ科植物を得る。 【解決手段】 イネのＰ５ＣＳ（デルタ¹−ピロリンー
５−カルボン酸合成酵素）遺伝子またはシロイヌナズナ
のＰ５ＣＳ遺伝子とシロイヌナズナのＰｒｏＤＨ（プロ
リン脱水素酵素）遺伝子のアンチセンス（逆向きな塩基
配列を持つ）遺伝子とを遺伝子操作技術を利用してイネ
科植物に導入する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、プロリン蓄積能力
が高く、耐塩性・耐乾燥性・耐冷性が向上したイネ科植
物、及びその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】塩生植物を含む幾つかの植物において、
植物が高塩ストレスや乾燥ストレスを受けると細胞内に
アミノ酸の１つであるプロリンを蓄積することがで知ら
れている。これは、蓄積したプロリンが植物細胞内の浸
透圧調節やストレスによる機能タンパク質の変性を抑え
るのに役立っていると考えられている。植物におけるプ
ロリンは、Δ¹−ピロリンー５−カルボン酸合成酵素
（Ｐ５ＣＳ）とΔ¹−ピロリンー５−カルボン酸還元酵
素（Ｐ５ＣＲ）の２つの酵素によってグルタミン酸から
合成される。一方、プロリンはプロリン脱水素酵素（Ｐ
ｒｏＤＨ）とΔ¹−ピロリンー５−カルボン酸脱水素酵
素（Ｐ５ＣＤＨ）の２つの酵素によってグルタミン酸へ
と分解される。

【０００３】上記の植物では、高塩ストレスや乾燥スト
レスなどの水ストレス（水を吸収しにくい状態）を受け
るとＰ５ＣＳ遺伝子の発現レベルが上昇し、Ｐ５ＣＳが
活性化するが、Ｐ５ＣＲ活性およびその遺伝子発現は、
一定で低いレベルにある。また、代謝系の遺伝子発現お
よび酵素活性も抑制された状態になる。ところが、一旦
水ストレスが解除されると、今度は逆に合成系の遺伝子
発現と酵素活性が抑制され、ＰｒｏＤＨ遺伝子の発現が
急速に誘導され、酵素活性も高まり、細胞内に蓄積され
ていたプロリンは速やかにグルタミン酸へと代謝され
る。

【０００４】以上のことから、水ストレス時におけるプ
ロリン合成はＰ５ＣＳが律速となっており、また水スト
レス解除後のプロリン代謝にはＰｒｏＤＨが律速となっ
ていると考えられる（YoshibaらPlant Cell Physiol. 3
8:1095-1102(1997)）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】地球環境の悪化に伴っ
て乾燥、半乾燥による塩類土壌の増加や人口増加による
食料不足が今後益々深刻化することが予想される。高塩
ストレス、乾燥ストレス及び低温ストレス（水を吸収し
にくい状態）耐性作物の育種は、世界の食料問題を解決
する上で重要な役割を果たすものとして、各方面から研
究が進められ、その成果が期待されている。

【０００６】本発明の目的は、植物のプロリン合成系及
び代謝系の律速酵素であるΔ¹−ピロリンー５−カルボ
ン酸合成酵素（Ｐ５ＣＳ）とプロリン脱水素酵素（Ｐｒ
ｏＤＨ）の重要性に注目し、遺伝子組換え技術によりこ
れら酵素遺伝子の発現制御を行い、プロリン蓄積能力が
高く、これにより耐塩性・耐乾燥性・耐冷性が向上した
イネ科植物、及びその製造方法を提供するところにあ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】プロリン合成系のＰ５Ｃ
Ｓ遺伝子を導入して過剰に発現させたり、代謝系のＰｒ
ｏＤＨ遺伝子のアンチセンス（逆向きの塩基配列を持
つ）遺伝子を導入してプロリンの分解を抑制したり、Ｐ
５ＣＳ遺伝子及びＰｒｏＤＨ遺伝子のアンチセンス遺伝
子の両方を導入して、プロリンの分解を抑制しながらプ
ロリン合成を促進させることにより、イネ及びイネ科植
物の細胞にプロリンを高濃度蓄積させる。

【０００８】本発明では、プロリンを高濃度蓄積させる
ことにより、耐塩性、耐乾燥性あるいは耐冷性を持つイ
ネ及びイネ科植物を分子レベルで育種（分子育種）する
ことが可能となる。

【０００９】これまで、イネ及びイネ科植物において適
合溶質としてのプロリン濃度を、合成促進及び分解抑制
することにより、高めることを可能とした報告は知られ
ていない。本発明の発明者らは、Ｐ５ＣＳ遺伝子とＰｒ
ｏＤＨ遺伝子の重要性に注目し、従来知られていない新
規な技術課題を解決するために、遺伝子の導入が行いや
すいイネ品種の選定、カルス形成律を向上させる研究、
イネ用遺伝子導入ベクターの構築の研究など各方面から
研究を行い、新規な技術解明を行い本発明を完成させる
に至った。

【００１０】本発明では、イネ又はシロイヌナズナ由来
のプロリン合成遺伝子、プロリン代謝遺伝子のアンチセ
ンス遺伝子を個別にあるいは組み合わせて導入して形質
転換されたイネ科植物、及びその製造方法が提供され
る。

【００１１】本発明のイネ科植物にはアミノ酸の１つで
あるプロリンの合成酵素タンパク質をコードする遺伝
子、プロリン分解酵素のアンチセンス遺伝子の何れか、
あるいは、これら双方の遺伝子が導入されている。この
構成により、耐塩性、耐乾燥性及び耐冷性が向上したイ
ネ科植物が実現できる。更に、本発明のイネ科植物から
収穫された完熟種子、特にイネの種子は、複数世代にわ
たって高いプロリン蓄積能力を維持していく可能性を有
する点に特徴がある。

【００１２】また本発明は、イネ及びイネ科植物を対象
とし、イネ科植物に属する植物であれば特に制限はな
い。イネ科植物に属する植物の例としては、イネ、トウ
モロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、シバ、アワ、
ヒエ等がある。本発明は、特に、イネに、より好適に適
用できる。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明の実施例のイネ科植物で
は、イネ又はシロイヌナズナ由来のプロリン（適合溶
質）合成遺伝子とプロリン代謝遺伝子のアンチセンス遺
伝子の何れか、あるいは、これら双方の遺伝子が導入さ
れて形質転換がなされている。

【００１４】本発明の実施例のイネ科植物に導入される
１種類の遺伝子の例としては、（１）列番号１に記載の
配列（塩基配列及びアミノ酸配列）を含むイネのＰ５Ｃ
Ｓ（Δ¹−ピロリンー５−カルボン酸合成酵素）遺伝
子、（２）配列番号２に記載の配列（塩基配列及びアミ
ノ酸配列）を含むシロイヌナズナのＰ５ＣＳ（Δ¹−ピ
ロリンー５−カルボン酸合成酵素）遺伝子、（３）配列
番号３に記載の配列（塩基配列及びアミノ酸配列）を含
むシロイヌナズナのＰｒｏＤＨ（プロリン脱水素酵素）
遺伝子のアンチセンス（逆向きの塩基配列を持つ）遺伝
子、がある。

【００１５】本発明の実施例のイネ科植物に導入される
２種類の遺伝子の例としては、（１）配列番号１に記載
の配列を含むイネのＰ５ＣＳ（Δ¹−ピロリンー５−カ
ルボン酸合成酵素）遺伝子又は配列番号２に記載の配列
を含むシロイヌナズナのＰ５ＣＳ遺伝子と、配列番号３
に記載の配列を含むシロイヌナズナのＰｒｏＤＨ（プロ
リン脱水素酵素）遺伝子のアンチセンス（逆向きの塩基
配列を持つ）遺伝子との２つの遺伝子、（２）配列番号
１に記載の配列を含むイネのＰ５ＣＳ（Δ¹−ピロリン
ー５−カルボン酸合成酵素）遺伝子又は配列番号２に記
載の配列を含むシロイヌナズナのＰ５ＣＳ遺伝子と、配
列番号３に記載の配列を含むシロイヌナズナのＰｒｏＤ
Ｈ（プロリン脱水素酵素）遺伝子のアンチセンス（逆向
きの塩基配列を持つ）遺伝子とがタンデム（直列）に連
結されている２つの遺伝子、がある。

【００１６】本発明の実施例で使用されるベクターに
は、配列番号１に記載の配列を含むイネのＰ５ＣＳ（Δ
¹−ピロリンー５−カルボン酸合成酵素）遺伝子、配列
番号２に記載の配列を含むシロイヌナズナのＰ５ＣＳ遺
伝子、配列番号３に記載の配列を含むシロイヌナズナの
ＰｒｏＤＨ（プロリン脱水素酵素）遺伝子のアンチセン
ス（逆向きの塩基配列を持つ）遺伝子の何れか１つの遺
伝子が取り込まれているか、あるいは、イネ又はシロイ
ヌナズナのＰ５ＣＳ遺伝子と上記のアンチセンス遺伝子
とがタンデムに連結されて２つの遺伝子が取り込まれて
いる。

【００１７】本発明の実施例のイネ科植物は、例えば、
次の何れかにより得ることができる。（１）上記のベク
ターをイネ科植物由来のカルスに導入し、このカルスを
増殖させた後にカルスから植物体を再分化させる。 （２）上記のベクターをイネ科植物由来のプロトプラス
トに導入し、このプロトプラストを増殖させたコロニー
から植物体を再分化させる。 （３）上記のベクターを遺伝子操作により導入して得ら
れたイネ科植物と交雑を行う。

【００１８】本発明の実施例のイネ科植物の製造方法と
して、例えば次の例をあげることができる。 （１）上記のベクターをイネ科植物由来のカルスにアグ
ロバクテリウムを用いて導入し、このカルスを増殖させ
た後にカルスから植物体を再分化させる。 （２）上記のベクターを電気パルスの印加によりイネ科
植物由来のプロトプラストに導入し、このプロトプラス
トを増殖させたコロニーから植物体を再分化させる。 （３）上記のベクターを遺伝子操作により導入して得ら
れたイネ科植物と交雑を行う。

【００１９】これらの製造方法では、プロリンの蓄積能
力が高くしかも耐塩性・耐乾燥性・耐冷性レベルが向上
したイネ科植物の製造方法が提供される。

【００２０】また、本発明の実施例のイネ科植物から収
穫された完熟した種子、特にイネの種子は、複数世代に
わたって高いプロリン蓄積能力を維持していく。

【００２１】本発明の実施例のイネ科植物及びその製造
方法を実現する例を、イネを代表的な例にとり、以下、
手順に従って詳細に説明する。以下に説明する手順はイ
ネ以外のイネ科植物にも、各種条件をそのまま又は変更
して適用されることは言うまでもない。

【００２２】（遺伝子のクローニング）最初に、イネ幼
苗からｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡを用いてｃＤＮ
Ａを合成する。このｃＤＮＡをプラスミドまたはファー
ジからなるベクターと連結して宿主微生物に導入し組換
え体ＤＮＡを調整する。この組換え体ＤＮＡが導入され
た形質転換微生物は、シロイヌナズナからのＰ５ＣＳ遺
伝子をプローブに用いるプラークハイブリダイゼーショ
ン法によりスクリーニングする。イネ及びシロイヌナズ
ナのＰ５ＣＳ遺伝子の配列は既に報告されている（Yosh
ibaら Plant J. (1995)7:751-760、Igarashiら Plant Mo
l. Biol. (1997) 33:857-865）ので、これをもとに適当
なプライマーを設計しＰＣＲによってスクリーニング
し、目的とする形質転換体を選び出す。得られた形質転
換体から目的とするプラスミドを単離し、必要があれば
適当な制限酵素で切断しプラスミドベクターにサブクロ
ーニングしてクローン化する。シロイヌナズナのＰ５Ｃ
Ｓ遺伝子も、イネと同様な方法にてクローン化すること
ができる。ただし、ｍＲＮＡを抽出するサンプルは、通
常の環境で育成したものよりも、高塩ストレス（２５０
ｍＭ ＮａＣｌ溶液などに漬ける）や乾燥ストレス処理
を施したものの方が好ましい。これは、Ｐ５ＣＳ遺伝子
が、高塩ストレスや乾燥ストレスといった水ストレスに
応答して誘導されるからである（Yoshibaら Plant J.
(1995)7:751-760、Igarashiら Plant Mol. Biol. (1997)
33:857-865、Yoshibaら Plant Cell Physiol. (1997) 3
8:1095-1102）。

【００２３】一方、シロイヌナズナのＰｒｏＤＨ遺伝子
（配列はKiyosueら Plant Cell (1996) 8:1323-1335に
既に報告済み）も上述した方法によりクローン化するこ
とができる。ただし、ｍＲＮＡを抽出するサンプルは、
乾燥ストレスを与えた（約１０時間処理）後、再び水に
漬け吸水させたものあるいはプロリン溶液に漬けてプロ
リンを吸収させたものなどを用いるとよい。これはＰｒ
ｏＤＨ遺伝子が、水ストレスを受けている間は、その発
現が抑制されていること、また高濃度のプロリンによっ
てその遺伝子発現が誘導されるからである（Kiyosueら
Plant Cell (1996) 8:1323-1335、Yoshibaら Plant Cell
Physiol. (1997) 38:1095-1102）。

【００２４】以上のようなサンプルを用いればイネやシ
ロイヌナズナばかりではなく他のイネ科植物からもＰ５
ＣＳ遺伝子とＰｒｏＤＨ遺伝子の単離が可能である。

【００２５】（遺伝子導入ベクターの構築）クローン化
した各Ｐ５ＣＳ遺伝子およびＰｒｏＤＨ遺伝子は、適当
な制限酵素でプラスミドから切り出し、図１に示すよう
に、ｐＢＩベクターを改変したイネ用ベクターのカリフ
ラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターの後に連
結する。図１において、ＲＢはライトボーダー、３５Ｓ
Ｐｒｏはカリフラワーモザイクウイルスのプロモータ
ー、Ｐ５ＣＳはイネまたはシロイヌナズナのプロリン合
成系酵素遺伝子、ＰｒｏＤＨはシロイヌナズナのプロイ
ン代謝系酵素遺伝子、Ｎｏｓｔｅｒはノパリン合成酵素
遺伝子のターミネーター、ＨＴＰはハイグロマイシン耐
性遺伝子、ＬＢはレフトボーダーを、それぞれ表してい
る。また、矢印は遺伝子のセンスの方向を示している。

【００２６】図１において、Ａは、ＲＢ−３５ＳＰｒｏ
−Ｐ５ＣＳ−Ｎｏｓｔｅｒ−３５ＳＰｒｏ−ＨＴＰ−Ｎ
ｏｓｔｅｒ−ＬＢの順に配列したベクター（コンストラ
クト）を構築した例を示す図である。Ｂは、上記Ａに対
して、ＲＢ−３５ＳＰｒｏ−Ｐ５ＣＳ−Ｎｏｓｔｅｒ−
３５ＳＰｒｏ−ＨＴＰ−Ｎｏｓｔｅｒ−ＬＢの順に上記
Ａのコンストラクトと同じように配列されるが、遺伝子
Ｐ５ＣＳがアンチセンスに配列された例を示す図であ
る。Ｃは、上記Ａのコンストラクトの遺伝子Ｐ５ＣＳに
代えて、遺伝子ＰｒｏＤＨをアンチセンスに配列して置
換し、ＲＢ−３５ＳＰｒｏ−ＰｒｏＤＨ（アンチセン
ス）−Ｎｏｓｔｅｒ−３５ＳＰｒｏ−ＨＴＰ−Ｎｏｓｔ
ｅｒ−ＬＢの順に配列したベクターを構築した例を示す
図である。Ｄは、上記Ａのコンストラクトに、さらに、
遺伝子ＰｒｏＤＨをアンチセンスに配列し、上記Ｃに示
すコンストラクトをタンデムに連結した、ＲＢ−３５Ｓ
Ｐｒｏ−Ｐ５ＣＳ−Ｎｏｓｔｅｒ−３５ＳＰｒｏ−Ｐｒ
ｏＤＨ（アンチセンス）−Ｎｏｓｔｅｒ−３５ＳＰｒｏ
−ＨＴＰ−Ｎｏｓｔｅｒ−ＬＢの順に配列したベクター
を構築した例を示す図である。

【００２７】３５Ｓプロモーターは強力で恒常的にどの
組織でも遺伝子発現を誘導するプロモーターとしてよく
知られている。また、遺伝子を組み込む方向はＰ５ＣＳ
遺伝子の場合はセンス方向に、ＰｒｏＤＨ遺伝子の場合
はアンチセンス方向に連結する。

【００２８】そして各遺伝子を連結したベクターはエレ
クトロポレーションによりアグロバクテリウムＥＨＡ１
０１菌に導入する。各コンストラクト（図1に示すＡ〜
Ｄ）が導入されたアグロバクテリウムはBacto Pepton
(１０ｇ／ｌ)、Bacto Yeast Extract (１０ｇ／ｌ)、塩
化ナトリウム（５ｇ／ｌ）、１Ｍ塩化マグネシウム（２
ｍｌ／ｌ）、ハイグロマイシンＢ（５０ｍｇ／ｌ）を含
むＹＥＰ培地により２８℃で培養し増殖させる。遺伝子
導入は各コンストラクト（図１に示すＡ〜Ｄ）を導入し
たアグロバクテリウムをイネのカルス細胞に感染させる
ことにより行う。コンストラクトＤは、２つの遺伝子
（Ｐ５ＣＳ遺伝子とＰｒｏＤＨ遺伝子）をタンデムに連
結して同時に導入するように設計されているが、コンス
トラクトＡとＣを混ぜて共感染させてもコンストラクト
Ｄと同様な効果が得られる。

【００２９】なお、各コンストラクトにはＨＰＴ（ハイ
グロマイシン耐性）遺伝子が連結されているが、これは
導入遺伝子の効果を解析する基礎研究用として形質転換
された細胞及び植物体を効率よく選抜するためのもの
で、実際の塩害地や乾燥地などで栽培する場合には組み
込んでおく必要はない。

【００３０】（遺伝子導入用イネカルスの誘導）完熟し
たイネ種子は、籾殻を剥離した後、７０％エチルアルコ
ールで１０分間、３％次亜塩素酸ナトリウムで１時間殺
菌する。殺菌後、種子は滅菌水で３回洗浄し１ｇ／ｌの
casamino酸、３０ｇ／ｌのショ糖、２ｍｇ／ｌの２，４
−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、２ｇ／ｌの
ジェランガムを含んだｐＨ５．８のＮ６培地（２Ｎ６培
地）に置床し、２８℃、暗黒下で３〜５週間培養する。

【００３１】（イネカルスへの遺伝子導入）上記で誘導
したイネカルスは、大きさが１〜３ｍｍ径のものを再び
２Ｎ６培地に置床し、２８℃、暗黒下で３〜４日培養す
る。これにより、カルス細胞の分裂活性を高めることが
できる。遺伝子導入はこの培養したカルスとＹＥＰ培地
で増殖した各コンストラクトを導入したアグロバクテリ
ウム液（菌の濃度をＯＤ６６０ｎｍで測定して０．１に
なるように希釈したもの）とを混ぜ合わせ感染させるこ
とで行う。その後カルスは２５℃、暗黒下で３日間培養
する。培養後、カルスは１ｍｇ／４ｍｌ濃度のクラフォ
ラン水溶液でカルス表面に付いた余分な菌を数回洗浄殺
菌し、滅菌したキムタオルなどで拭き取った後、２５０
ｍｇ／ｌのクラフォラン、１０ｍｇ／ｌのハイグロマイ
シンＢを含む２Ｎ６培地（一次選抜培地）に置床し、２
８℃、暗黒下で１週間培養する。

【００３２】（形質転換カルスの選抜と植物体の再分
化）クラフォランを含む培地で培養したカルスは、ハイ
グロマイシンＢを３０ｍｇ／ｌに増やした培地（二次選
抜培地）に置床し、２８℃、暗黒下で３週間培養する。
その後、カルスはショ糖３０ｇ／ｌ、ソルビトール３０
ｇ／ｌ、ｃａｓａｍｉｎｏ酸２ｇ／ｌ、ＭＥＳ緩衝剤１
１ｇ／ｌ、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）２ｍｇ／ｌ、カイ
ネチン１ｍｇ／ｌ、クラフォラン２５０ｍｇ／ｌ、ハイ
グロマイシンＢ３０ｍｇ／ｌ、ジェランガム４ｇ／ｌを
含むｐＨ５．８のＭＳ培地（再分化誘導培地）に移し、
２８℃、明所で３週間培養する。遺伝子の導入されたカ
ルスは、グリーンスポットを形成し、そこから芽と根が
分化してくる。分化したカルスは、更に植物ホルモンを
抜いた、ショ糖３０ｇ／ｌ、クラフォラン２５０ｍｇ／
ｌ、ハイグロマイシンＢ３０ｍｇ／ｌ、寒天８ｇ／ｌを
含むｐＨ５．８のＭＳ培地（植物体形成培地）に移し、
２８℃、明所で数週間培養することで、植物体をさらに
大きく育成する。

【００３３】（形質転換イネ植物体の育成と種子形成）
再分化したイネは、シャーレ内で約４〜５ｃｍ位の大き
さ（草丈）になったら育苗用土壌の入ったプランターに
移し代え、照度が約２万ルクス位の人工気象機内で２８
℃の温度条件で第４葉から５葉が展開するまで育成す
る。その後、幼苗は更に適度に肥料を加えた黒土を入れ
たワグネルポットに移し温室内で種子が稔るまで成育さ
せる。再分化した当代の植物体はＴ₀世代であり、この
植物体から取れる種子をＴ₁世代とするとＴ₂世代〜Ｔ₃
世代まで育成させる。実際の農地で栽培する場合には、
更に世代を重ね種々の安全性評価試験を行ない、安全性
を確認した後、市場に出す必要がある。

【００３４】（形質転換イネからのプロリン抽出とその
濃度測定）プロリンは、Ｔ₂世代あるいはＴ₃世代の形質
転換イネの幼苗（第４葉が展開したもの）の葉から抽出
する。人工気象機内で育成したイネ幼苗の葉はハサミな
どで約２００ｍｇ分切り取り、乳鉢で液体窒素を加えパ
ウダー状になるまで磨りつぶす。パウダー状になったサ
ンプルは、純水を加えホモジナイザーなどを用いてさら
に磨砕する。粉砕したサンプルは、９７℃で６分間加熱
した後、氷冷し、４℃で約１７，０００×Ｇ、１０分間
遠心して上清を分離する。得られた上清は、最終濃度が
５％になるようにトリクロロ酢酸を加え混ぜ合わせ、再
び４℃で約１７，０００×Ｇ、１０分間遠心してタンパ
ク質を沈殿させる。適合溶質としてのプロリンは、この
時の上清に含まれており、濃度は液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）を用いて測定する。プロリンの定性定量
は各種アミノ酸の標品を一定の濃度に溶かしたものをあ
らかじめＨＰＬＣで測定しておき、そのリテンションタ
イムをもとに換算することで実際の遺伝子組換えイネの
葉に含まれるプロリン量を定量する。

【００３５】図２は、各種遺伝子を導入した組換えイネ
のストレスを与えていない時のプロリン含量を示してい
る。左端の白抜きのグラフは、プロリン関連遺伝子を組
み込んでいない対照を、右側５つの黒塗りで示したグラ
フはプロリン関連遺伝子を組み込んだ遺伝子組換えイネ
の各系統をそれぞれ示している。プロリン量は導入した
遺伝子の種類により異なることが認められる。

【００３６】左から２列目のイネのＰ５ＣＳ遺伝子（Ｏ
ｓＰ５ＣＳ）をアンチセンスに導入した（図1に示す
Ｂ）ものは、ほとんど蓄積しないことがわかる。左から
３列目のシロイヌナズナのＰ５ＣＳ遺伝子（ＡｔＰ５Ｃ
Ｓ）をセンスに導入した（図1に示すＡ）ものは、対照
に対してプロリンの蓄積量が増加していることが認めら
れる。同様に、左から４列目および５列目のシロイヌナ
ズナのＰｒｏＤＨ遺伝子（ＡｔＰｒｏＤＨ）をアンチセ
ンスに導入した（図1に示すＣ）ものおよびイネのＰ５
ＣＳ遺伝子（ＯｓＰ５ＣＳ）をセンスに導入した（図1
に示すＡ）ものは、それぞれ、対照に対してプロリンの
蓄積量が増加していることが認められる。これらに対し
て、右端のイネのＰ５ＣＳ遺伝子（ＯｓＰ５ＣＳ）をセ
ンスに、シロイヌナズナのＰｒｏＤＨ遺伝子（ＡｔＰｒ
ｏＤＨ）をアンチセンスに導入したものは、上記の１種
類の遺伝子を導入したものに比べて、蓄積するプロリン
量がかなり高い（高いもので対照に対して１００倍以
上）ことが認められる。そして遺伝子をセンスに導入し
たものではＡｔＰ５ＣＳ（左から３列目）よりもＯｓＰ
５ＣＳ（左から５列目）の方がプロリン蓄積にはやや効
果のあることが認められる。

【００３７】（耐塩性試験と遺伝子組換えイネの耐塩性
の向上）図３は、図２の右側４列に示すプロリン蓄積が
認められた遺伝子組換えイネを数系統用いて、２５０ｍ
Ｍの濃度（海水の塩濃度の約半分）で耐塩性試験を行っ
た結果を示している。白抜きのグラフは、プロリン関連
遺伝子を組み込んでいない対照を、黒塗りで示したグラ
フが遺伝子組換えイネを表している。耐塩性試験は、公
知の生存率を指標にした試験方法（特開平０９−２６６
７２６号、発明の名称：植物の耐塩性の簡易評価方法）
に準じておこなった。プロリン関連の遺伝子を導入して
いない対照は塩処理３日ですべて枯死してしまうのに対
して、プロリンを蓄積する組換えイネは３日目で９５
％、５日処理しても６５％と高い生存率を示すことが認
められる。このことから、イネを遺伝子組換えによりプ
ロリン蓄積能力を高めることで耐塩性を向上させること
ができる。

【００３８】従って、本発明により作成されたイネ科作
物は、更に安全性評価など詳細な解析を進め品種化すれ
ば、将来、塩類の集積した土壌や砂漠化した土壌におい
て栽培が可能となり食料生産を向上させることが期待で
きる。また、発展途上国における人口増加にも対処でき
ることが大いに期待できる。

【００３９】

【発明の効果】本発明によって、プロリン蓄積能力を高
めた遺伝子組換えイネ科植物を作成することが可能にな
った。また、本方法により作成したイネ科植物はプロリ
ン蓄積量が高まったことにより、耐塩性レベルを向上さ
せることが可能となった。 [配列表] <110> Hitachi, LTD. RIKEN Japan International Research Center for Agricaltural Science Bio-oriented Technology Research Advancement Institute (BRAIN) <120> Transgenic rice plant and its family with environmental stress res istant by proline accumulation of high level and its production. <130> NT01P0353 <160> 3 <210> 1 <211> 2549 <212> DNA <213> Oryza sativa L. <220> <221> CDS <222> 99..2249 <300> <301> Yumiko Igarashi, Yoshu Yoshiba, Yukika Sanada, Kazuko Yamaguchi-Sh inozaki, Keishiro Wada, Kazuo Shinozaki <302> Characterization of the gene for Δ¹-pyrroline-5-carboxylate synth etase and correlation between the expression of the gene and salt tolera nce in Oryza sativa L. <303> Plant Molecular biology <304> 33 <306> 857-865 <307> 1996-12-03 <308> D49714 <309> 1995-03-16 <400> 1 gcggctgcgg cggcaaggcg gcgagacgtg ggagagggat ttacaggtag agggagaggg 60 tggaggagga gaggctgagg ctaggaagcg gtttcgcc atg gcg agc gtc gac ccg 116 Met Ala Ser Val Asp Pro 1 5 tcc cgg agc ttc gtg agg gac gtg aag cgc gtc atc atc aag gtg ggc 164 Ser Arg Ser Phe Val Arg Asp Val Lys Arg Val Ile Ile Lys Val Gly 10 15 20 act gca gtt gtc tcc aga caa gat gga aga ttg gct ttg ggc agg gtt 212 Thr Ala Val Val Ser Arg Gln Asp Gly Arg Leu Ala Leu Gly Arg Val 25 30 35 gga gct ctg tgc gag cag gtt aag gaa ctg aac tct tta gga tac gaa 260 Gly Ala Leu Cys Glu Gln Val Lys Glu Leu Asn Ser Leu Gly Tyr Glu 40 45 50 gtg att ttg gtc acc tca ggt gct gtt gga gtg ggg cga cag cga ctt 308 Val Ile Leu Val Thr Ser Gly Ala Val Gly Val Gly Arg Gln Arg Leu 55 60 65 70 agg tac cgg aag ctt gtc aat agc agc ttt gct gat ctg caa aag cca 356 Arg Tyr Arg Lys Leu Val Asn Ser Ser Phe Ala Asp Leu Gln Lys Pro 75 80 85 cag atg gag tta gat gga aag gct tgt gcc gct gtt ggt cag agt gga 404 Gln Met Glu Leu Asp Gly Lys Ala Cys Ala Ala Val Gly Gln Ser Gly 90 95 100 ctg atg gct ctt tac gat atg ttg ttt aac caa ctg gat gtc tcg tca 452 Leu Met Ala Leu Tyr Asp Met Leu Phe Asn Gln Leu Asp Val Ser Ser 105 110 115 tct caa ctt ctt gtc acc gac agt gat ttt gag aac cca aag ttc cgg 500 Ser Gln Leu Leu Val Thr Asp Ser Asp Phe Glu Asn Pro Lys Phe Arg 120 125 130 gag caa ctc act gaa act gtt gag tca tta tta gat ctt aaa gtt ata 548 Glu Gln Leu Thr Glu Thr Val Glu Ser Leu Leu Asp Leu Lys Val Ile 135 140 145 150 cca ata ttt aat gaa aat gat gcc atc agc act aga aag gct cca tat 596 Pro Ile Phe Asn Glu Asn Asp Ala Ile Ser Thr Arg Lys Ala Pro Tyr 155 160 165 gag gat tca tct ggt ata ttc tgg gat aat gac agt tta gca gga ctg 644 Glu Asp Ser Ser Gly Ile Phe Trp Asp Asn Asp Ser Leu Ala Gly Leu 170 175 180 ttg gca ctg gaa ctg aaa gct gat ctc ctt att ctg ctc agt gat gtg 692 Leu Ala Leu Glu Leu Lys Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu Ser Asp Val 185 190 195 gat ggg ttg tat agt ggt cca cca agt gaa cca tca tca aaa atc ata 740 Asp Gly Leu Tyr Ser Gly Pro Pro Ser Glu Pro Ser Ser Lys Ile Ile 200 205 210 cac act tat att aaa gaa aag cat cag caa gaa atc act ttt gga gac 788 His Thr Tyr Ile Lys Glu Lys His Gln Gln Glu Ile Thr Phe Gly Asp 215 220 225 230 aaa tct cgt gta ggt aga gga ggc atg aca gca aaa gtg aag gct gct 836 Lys Ser Arg Val Gly Arg Gly Gly Met Thr Ala Lys Val Lys Ala Ala 235 240 245 gtc ttg gct tca aat agc ggc aca cct gtg gtt att aca agt ggg ttt 884 Val Leu Ala Ser Asn Ser Gly Thr Pro Val Val Ile Thr Ser Gly Phe 250 255 260 gaa aat cgg agc att ctt aaa gtt ctt cat ggg gaa aaa att ggt act 932 Glu Asn Arg Ser Ile Leu Lys Val Leu His Gly Glu Lys Ile Gly Thr 265 270 275 ctc ttt cac aag aat gcg aat ttg tgg gaa tca tct aag gat gtt agt 980 Leu Phe His Lys Asn Ala Asn Leu Trp Glu Ser Ser Lys Asp Val Ser 280 285 290 act cgt gag atg gct gtt gcc gca aga gat tgt tca agg cat cta cag 1028 Thr Arg Glu Met Ala Val Ala Ala Arg Asp Cys Ser Arg His Leu Gln 295 300 305 310 aat ttg tca tca gag gaa cga aaa aag ata ttg cta gat gtt gca gat 1076 Asn Leu Ser Ser Glu Glu Arg Lys Lys Ile Leu Leu Asp Val Ala Asp 315 320 325 gct ttg gag gca aat gag gat tta ata agg tct gag aat gaa gct gat 1124 Ala Leu Glu Ala Asn Glu Asp Leu Ile Arg Ser Glu Asn Glu Ala Asp 330 335 340 gta gct gcg gcc caa gtt gct gga tat gag aag cct ttg gtt gct aga 1172 Val Ala Ala Ala Gln Val Ala Gly Tyr Glu Lys Pro Leu Val Ala Arg 345 350 355 ttg act ata aaa cca gga aag ata gca agc ctt gca aaa tct att cgt 1220 Leu Thr Ile Lys Pro Gly Lys Ile Ala Ser Leu Ala Lys Ser Ile Arg 360 365 370 acc ctt gca aat atg gaa gac cct ata aac cag ata ctt aaa aag aca 1268 Thr Leu Ala Asn Met Glu Asp Pro Ile Asn Gln Ile Leu Lys Lys Thr 375 380 385 390 gag gtt gct gat gat tta gtt ctt gag aaa aca tct tgc cca tta ggt 1316 Glu Val Ala Asp Asp Leu Val Leu Glu Lys Thr Ser Cys Pro Leu Gly 395 400 405 gtt ctc tta att gtt ttt gag tcc cga cct gat gcc ttg gtt cag att 1364 Val Leu Leu Ile Val Phe Glu Ser Arg Pro Asp Ala Leu Val Gln Ile 410 415 420 gca tct ttg gca att cga agt ggt aat ggt ctt ctc cta aaa ggt gga 1412 Ala Ser Leu Ala Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Leu Leu Lys Gly Gly 425 430 435 aaa gaa gct atc aga tca aac acg ata ttg cat aag gtt ata act gat 1460 Lys Glu Ala Ile Arg Ser Asn Thr Ile Leu His Lys Val Ile Thr Asp 440 445 450 gct att cct cgt aat gtt ggt gaa aaa ctt att ggc ctt gtt aca act 1508 Ala Ile Pro Arg Asn Val Gly Glu Lys Leu Ile Gly Leu Val Thr Thr 455 460 465 470 aga gat gag atc gca gat ttg cta aag ctt gat gat gtc att gat ctt 1556 Arg Asp Glu Ile Ala Asp Leu Leu Lys Leu Asp Asp Val Ile Asp Leu 475 480 485 gtc act cca aga gga agt aat aag ctt gtc tct caa atc aag gcg tca 1604 Val Thr Pro Arg Gly Ser Asn Lys Leu Val Ser Gln Ile Lys Ala Ser 490 495 500 act aag att cct gtt ctt ggg cat gct gat ggt ata tgc cac gta tat 1652 Thr Lys Ile Pro Val Leu Gly His Ala Asp Gly Ile Cys His Val Tyr 505 510 515 att gac aaa tca gct gac atg gat atg gca aaa ctt att gta atg gat 1700 Ile Asp Lys Ser Ala Asp Met Asp Met Ala Lys Leu Ile Val Met Asp 520 525 530 gca aaa act gat tac cca gca gcc tgc aat gca atg gag acc tta cta 1748 Ala Lys Thr Asp Tyr Pro Ala Ala Cys Asn Ala Met Glu Thr Leu Leu 535 540 545 550 gtt cat aag gat ctt atg aag agt cca ggc ctt gac gac ata tta gta 1796 Val His Lys Asp Leu Met Lys Ser Pro Gly Leu Asp Asp Ile Leu Val 555 560 565 gca cta aaa aca gaa gga gtt aat att tat ggt gga cct att gcg cac 1844 Ala Leu Lys Thr Glu Gly Val Asn Ile Tyr Gly Gly Pro Ile Ala His 570 575 580 aaa gct ctg gga ttt cca aaa gct gtt tca ttt cat cat gag tat agt 1892 Lys Ala Leu Gly Phe Pro Lys Ala Val Ser Phe His His Glu Tyr Ser 585 590 595 tct atg gcc tgc act gtt gag ttt gtt gat gat gtt caa tca gca att 1940 Ser Met Ala Cys Thr Val Glu Phe Val Asp Asp Val Gln Ser Ala Ile 600 605 610 gac cat att cat cgt tat gga agt gct cat aca gat tgt atc gtc act 1988 Asp His Ile His Arg Tyr Gly Ser Ala His Thr Asp Cys Ile Val Thr 615 620 625 630 aca gat gat aag gta gca gag act ttt cta cgc aga gtt gat agt gct 2036 Thr Asp Asp Lys Val Ala Glu Thr Phe Leu Arg Arg Val Asp Ser Ala 635 640 645 gct gta ttt cat aat gca agt acg aga ttc tct gat ggg gct cgt ttt 2084 Ala Val Phe His Asn Ala Ser Thr Arg Phe Ser Asp Gly Ala Arg Phe 650 655 660 gga ttg ggt gct gag gtt ggc ata agc aca ggg cgt atc cat gcc cgt 2132 Gly Leu Gly Ala Glu Val Gly Ile Ser Thr Gly Arg Ile His Ala Arg 665 670 675 gga cca gtg ggt gtt gaa ggt ctc tta act aca cga tgg atc ttg cga 2180 Gly Pro Val Gly Val Glu Gly Leu Leu Thr Thr Arg Trp Ile Leu Arg 680 685 690 gga cgt ggg caa gtg gtg aat ggt gac aag gat gtc gtg tac acc cat 2228 Gly Arg Gly Gln Val Val Asn Gly Asp Lys Asp Val Val Tyr Thr His 695 700 705 710 aag agt ctt cct ttg caa tga ggtcaaatgc tccttttagc ctgttcagga 2279 Lys Ser Leu Pro Leu Gln 715 gtaggtgaat atccttttaa gaatggattg actactttat tttgtcatct tgtacaagca 2339 tcttattgcg gcattccgat ggattattga ttttgggggt tcccactttc aaatgtgaca 2399 ccaaaaataa attcatcagt tctgagagca agattttgga ggttcagctt ctccatgtaa 2459 taagtaaatt cagttctgag aacttgtgta ccaacgcgct atgttgcttg taatgagcga 2519 tactaacatc tgtgattgca catatactaa 2549 <210> 2 <211> 2571 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> 107...2260 <301> Yoshu Yoshiba, Tomohiro Kiyasue, Takeshi Katagiri, Hiroko Ueda, Ts uyoshi Mizoguchi, Kazuko Yamaguchi-Shinozaki, Keishiro Wada, Yoshinori H arada, Kazuo Shinozaki <302> Correlation between the induction of a gene for Δ¹-pyrroline-5-ca rboxylate synthetase and the accumulation of proline in Arabidopsis thal iana under osmotic stress. <303> The Plant Journal <304> 7 <305> 5 <306> 751-760 <307> 1995-01-20 <308> D32138 <309> 1994-07-12 <400> 2 ctgatattta ttttcttacc ttaaatacga cggtgcttca ctgagtccga ctcagttaac 60 tcgttcctct ctctgtgtgt ggttttggta gacgacgacg acgata atg gag gag 115 Met Glu Glu 1 cta gat cgt tca cgt gct ttt gcc aga gac gtc aaa cgt atc gtc gtt 163 Leu Asp Arg Ser Arg Ala Phe Ala Arg Asp Val Lys Arg Ile Val Val 5 10 15 aag gtt ggg aca gca gtt gtt act gga aaa ggt gga aga ttg gct ctt 211 Lys Val Gly Thr Ala Val Val Thr Gly Lys Gly Gly Arg Leu Ala Leu 20 25 30 35 ggt cgt tta gga gca ctg tgt gaa cag ctt gcg gaa tta aac tcg gat 259 Gly Arg Leu Gly Ala Leu Cys Glu Gln Leu Ala Glu Leu Asn Ser Asp 40 45 50 gga ttt gag gtg ata ttg gtg tca tct ggt gcg gtt ggt ctt ggc agg 307 Gly Phe Glu Val Ile Leu Val Ser Ser Gly Ala Val Gly Leu Gly Arg 55 60 65 caa agg ctt cgt tat cga caa tta gtc aat agc agc ttt gcg gat ctt 355 Gln Arg Leu Arg Tyr Arg Gln Leu Val Asn Ser Ser Phe Ala Asp Leu 70 75 80 cag aag cct cag act gaa ctt gat ggg aag gct tgt gct ggt gtt gga 403 Gln Lys Pro Gln Thr Glu Leu Asp Gly Lys Ala Cys Ala Gly Val Gly 85 90 95 caa agc agt ctt atg gct tac tat gag act atg ttt gac cag ctt gat 451 Gln Ser Ser Leu Met Ala Tyr Tyr Glu Thr Met Phe Asp Gln Leu Asp 100 105 110 115 gtg acg gca gct caa ctt ctg gtg aat gac agt agt ttt aga gac aag 499 Val Thr Ala Ala Gln Leu Leu Val Asn Asp Ser Ser Phe Arg Asp Lys 120 125 130 gat ttc agg aag caa ctt aat gaa act gtc aag tct atg ctt gat ttg 547 Asp Phe Arg Lys Gln Leu Asn Glu Thr Val Lys Ser Met Leu Asp Leu 135 140 145 agg gtt att cca att ttc aat gag aat gat gct att agc acc cga aga 595 Arg Val Ile Pro Ile Phe Asn Glu Asn Asp Ala Ile Ser Thr Arg Arg 150 155 160 gcc cca tat cag gat tct tct ggt att ttc tgg gat aac gat agc tta 643 Ala Pro Tyr Gln Asp Ser Ser Gly Ile Phe Trp Asp Asn Asp Ser Leu 165 170 175 gct gct cta ctg gcg ttg gaa ctg aaa gct gat ctt ctg att ctt ctg 691 Ala Ala Leu Leu Ala Leu Glu Leu Lys Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu 180 185 190 195 agc gat gtt gaa ggt ctt tac aca ggc cct cca agt gat cct aac tca 739 Ser Asp Val Glu Gly Leu Tyr Thr Gly Pro Pro Ser Asp Pro Asn Ser 200 205 210 aag ttg atc cac act ttt gtt aaa gaa aaa cat caa gat gag att aca 787 Lys Leu Ile His Thr Phe Val Lys Glu Lys His Gln Asp Glu Ile Thr 215 220 225 ttc ggc gac aaa tca aga tta ggg aga ggg ggt atg act gca aaa gtc 835 Phe Gly Asp Lys Ser Arg Leu Gly Arg Gly Gly Met Thr Ala Lys Val 230 235 240 aaa gct gca gtc aat gca gct tat gct ggg att cct gtc atc ata acc 883 Lys Ala Ala Val Asn Ala Ala Tyr Ala Gly Ile Pro Val Ile Ile Thr 245 250 255 agt ggg tat tca gct gag aac ata gat aaa gtc ctc aga gga cta cgt 931 Ser Gly Tyr Ser Ala Glu Asn Ile Asp Lys Val Leu Arg Gly Leu Arg 260 265 270 275 gtt gga acc ttg ttt cat caa gat gct cgt tta tgg gct ccg atc aca 979 Val Gly Thr Leu Phe His Gln Asp Ala Arg Leu Trp Ala Pro Ile Thr 280 285 290 gat tct aat gct cgt gac atg gca gtt gct gcg agg gaa agt tcc aga 1027 Asp Ser Asn Ala Arg Asp Met Ala Val Ala Ala Arg Glu Ser Ser Arg 295 300 305 aag ctt cag gcc tta tct tcg gaa gac agg aaa aaa att ctg ctt gat 1075 Lys Leu Gln Ala Leu Ser Ser Glu Asp Arg Lys Lys Ile Leu Leu Asp 310 315 320 att gcc gat gcc ctt gaa gca aat gtt act aca atc aaa gct gag aat 1123 Ile Ala Asp Ala Leu Glu Ala Asn Val Thr Thr Ile Lys Ala Glu Asn 325 330 335 gag tta gat gta gct tct gca caa gag gct ggg ttg gaa gag tca atg 1171 Glu Leu Asp Val Ala Ser Ala Gln Glu Ala Gly Leu Glu Glu Ser Met 340 345 350 355 gtg gct cgc tta gtt atg aca cct gga aag atc tcg agc ctt gca gct 1219 Val Ala Arg Leu Val Met Thr Pro Gly Lys Ile Ser Ser Leu Ala Ala 360 365 370 tca gtt cgt aag cta gct gat atg gaa gat cca atc ggc cgt gtt tta 1267 Ser Val Arg Lys Leu Ala Asp Met Glu Asp Pro Ile Gly Arg Val Leu 375 380 385 aag aaa aca gag gtg gca gat ggt ctt gtc tta gag aag acc tca tca 1315 Lys Lys Thr Glu Val Ala Asp Gly Leu Val Leu Glu Lys Thr Ser Ser 390 395 400 cca tta ggc gta ctt ctg att gtt ttt gaa tcc cga cct gat gca ctt 1363 Pro Leu Gly Val Leu Leu Ile Val Phe Glu Ser Arg Pro Asp Ala Leu 405 410 415 gta cag ata gct tca ctt gcc atc cgt agt gga aat ggt ctt ctg ctg 1411 Val Gln Ile Ala Ser Leu Ala Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Leu Leu 420 425 430 435 aag ggt gga aag gag gcc cgg cga tca aat gct atc tta cac aag gtg 1459 Lys Gly Gly Lys Glu Ala Arg Arg Ser Asn Ala Ile Leu His Lys Val 440 445 450 atc act gat gca att cca gag act gtt ggg ggt aaa ctc att gga ctt 1507 Ile Thr Asp Ala Ile Pro Glu Thr Val Gly Gly Lys Leu Ile Gly Leu 455 460 465 gtg act tca aga gaa gag att cct gat ttg ctt aag ctt gat gac gtt 1555 Val Thr Ser Arg Glu Glu Ile Pro Asp Leu Leu Lys Leu Asp Asp Val 470 475 480 atc gat ctt gtg atc cca aga gga agc aac aag ctt gtt act cag ata 1603 Ile Asp Leu Val Ile Pro Arg Gly Ser Asn Lys Leu Val Thr Gln Ile 485 490 495 aaa aat act aca aaa atc cct gtg cta ggt cat gct gat gga atc tgt 1651 Lys Asn Thr Thr Lys Ile Pro Val Leu Gly His Ala Asp Gly Ile Cys 500 505 510 515 cat gta tat gtc gac aag gct tgt gat acg gat atg gca aag cgc ata 1699 His Val Tyr Val Asp Lys Ala Cys Asp Thr Asp Met Ala Lys Arg Ile 520 525 530 gtt tct gat gca aag ttg gac tat cca gca gcc tgt aat gcg atg gaa 1747 Val Ser Asp Ala Lys Leu Asp Tyr Pro Ala Ala Cys Asn Ala Met Glu 535 540 545 acc ctt ctt gtg cat aag gat cta gag cag aat gct gtg ctt aat gag 1795 Thr Leu Leu Val His Lys Asp Leu Glu Gln Asn Ala Val Leu Asn Glu 550 555 560 ctt att ttt gct ctg cag agc aat gga gtc act ttg tat ggt gga cca 1843 Leu Ile Phe Ala Leu Gln Ser Asn Gly Val Thr Leu Tyr Gly Gly Pro 565 570 575 agg gca agt aag ata ctg aac ata cca gaa gca cgg tca ttc aac cat 1891 Arg Ala Ser Lys Ile Leu Asn Ile Pro Glu Ala Arg Ser Phe Asn His 580 585 590 595 gag tac tgt gcc aag gct tgc act gtt gaa gtt gta gaa gac gtt tat 1939 Glu Tyr Cys Ala Lys Ala Cys Thr Val Glu Val Val Glu Asp Val Tyr 600 605 610 ggt gct ata gat cac att cac cga cat ggg agt gca cac aca gac tgc 1987 Gly Ala Ile Asp His Ile His Arg His Gly Ser Ala His Thr Asp Cys 615 620 625 att gtg aca gag gat cac gaa gtt gca gag cta ttc ctt cgc caa gtg 2035 Ile Val Thr Glu Asp His Glu Val Ala Glu Leu Phe Leu Arg Gln Val 630 635 640 gat agc gct gct gtg ttc cac aac gcc agc aca aga ttc tca gat ggt 2083 Asp Ser Ala Ala Val Phe His Asn Ala Ser Thr Arg Phe Ser Asp Gly 645 650 655 ttc cga ttt gga ctt ggt gca gag gtg ggg gta agc acg ggc agg atc 2131 Phe Arg Phe Gly Leu Gly Ala Glu Val Gly Val Ser Thr Gly Arg Ile 660 665 670 675 cat gct cgt ggt cca gtc ggg gtc gaa gga tta ctt aca acg aga tgg 2179 His Ala Arg Gly Pro Val Gly Val Glu Gly Leu Leu Thr Thr Arg Trp 680 685 690 ata atg aga gga aaa gga caa gtt gtc gac gga gac aat gga att gtt 2227 Ile Met Arg Gly Lys Gly Gln Val Val Asp Gly Asp Asn Gly Ile Val 695 700 705 tac acc cat cag gac att ccc atc caa gct taaacaagac ttccgagtgt 2277 Tyr Thr His Gln Asp Ile Pro Ile Gln Ala 710 715 gtgtttgtgt atttggttga gacttgagga gagacacaga ggaggatggg cttttttgtt 2337 tcctctctgc ttagtactca tatcctatca ttattattat tactactact tattattgaa 2397 accctcgctt atgtagtggt tttgatttag ggttaggatt gcaccaaaaa taagatccac 2457 tttaccactt agtcttgctc ataagtacga tgaagaacat ttaattagct tctcttcttg 2517 tcattgtaag ctacctacac atttctgatc tttatcaaga tactactact tttc 2571 <210> 3 <211> 1833 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> 113...1612 <301> Tomohiro Kiyasue, Yoshu Yoshiba, Kazuko Yamaguchi-Shinozaki, Kazuo Shinozaki <302>Title : A nuclear gene encoding mitochondrial prolne dehydrogenase, an enzyme involved in proline metabolism, is upregulated by proline but downregulated by dehydration in Arabidopsis. <303> The Plant Cell <304> 8 <306> 1323-1335 <307> 1996-05-27 <308> D83025 <309> 1995-12-25 <400> 3 agcgtttaga aaaaaacagc gataaaaccg aaacatcaag caaacaaaaa aaaaagagaa 60 gagaaattat ttttttttgt tttcgttttc aaaaacaaaa tctttgaatt tt atg gca 118 Met Ala 1 acc cgt ctt ctc cga aca aac ttt atc cgg cga tct tac cgt tta ccc 166 Thr Arg Leu Leu Arg Thr Asn Phe Ile Arg Arg Ser Tyr Arg Leu Pro 5 10 15 gct ttt agc ccg gtg ggt cct ccc acc gtg act gct tcc acc gcc gtc 214 Ala Phe Ser Pro Val Gly Pro Pro Thr Val Thr Ala Ser Thr Ala Val 20 25 30 gtc ccg gag att ctc tcc ttt gga caa caa gca ccg gaa cca cct ctt 262 Val Pro Glu Ile Leu Ser Phe Gly Gln Gln Ala Pro Glu Pro Pro Leu 35 40 45 50 cac cac cca aaa ccc acc gag caa tct cac gat ggt ctc gat ctc tcc 310 His His Pro Lys Pro Thr Glu Gln Ser His Asp Gly Leu Asp Leu Ser 55 60 65 gat caa gcc cgt ctt ttc tcc tct atc cca acc tct gat ctc ctc cgt 358 Asp Gln Ala Arg Leu Phe Ser Ser Ile Pro Thr Ser Asp Leu Leu Arg 70 75 80 tcc acc gcc gtg ttg cat gcg gcg gcg ata ggt cct atg gtc gac cta 406 Ser Thr Ala Val Leu His Ala Ala Ala Ile Gly Pro Met Val Asp Leu 85 90 95 ggg acg tgg gtc atg agc tct aaa ctt atg gac gct tcg gtg acg cgt 454 Gly Thr Trp Val Met Ser Ser Lys Leu Met Asp Ala Ser Val Thr Arg 100 105 110 ggc atg gtt tta ggg ctt gtg aaa agt acg ttt tat gac cat ttt tgc 502 Gly Met Val Leu Gly Leu Val Lys Ser Thr Phe Tyr Asp His Phe Cys 115 120 125 130 gcc ggt gaa gat gcc gac gca gcc gct gag cgc gtg aga agc gtt tat 550 Ala Gly Glu Asp Ala Asp Ala Ala Ala Glu Arg Val Arg Ser Val Tyr 135 140 145 gaa gct act ggt ctt aaa ggg atg ctt gtc tat ggc gtc gaa cac gcc 598 Glu Ala Thr Gly Leu Lys Gly Met Leu Val Tyr Gly Val Glu His Ala 150 155 160 gat gac gct gta tct tgt gat gat aac atg caa caa ttc att cga acc 646 Asp Asp Ala Val Ser Cys Asp Asp Asn Met Gln Gln Phe Ile Arg Thr 165 170 175 att gaa gct gcc aaa tct tta cca aca tct cac ttt agc tca gtg gtt 694 Ile Glu Ala Ala Lys Ser Leu Pro Thr Ser His Phe Ser Ser Val Val 180 185 190 gtg aag ata act gcc att tgt cca att agt ctt ctg aaa cga gtg agc 742 Val Lys Ile Thr Ala Ile Cys Pro Ile Ser Leu Leu Lys Arg Val Ser 195 200 205 210 gat ctg ctg cgg tgg gaa tac aaa agt ccg aac ttc aaa ctc tca tgg 790 Asp Leu Leu Arg Trp Glu Tyr Lys Ser Pro Asn Phe Lys Leu Ser Trp 215 220 225 aag ctc aaa tcg ttt ccg gtt ttc tcc gaa tcg agt cct ctc tac cac 838 Lys Leu Lys Ser Phe Pro Val Phe Ser Glu Ser Ser Pro Leu Tyr His 230 235 240 aca aac tca gaa ccg gaa ccg tta acc gcg gaa gaa gaa agg gag ctc 886 Thr Asn Ser Glu Pro Glu Pro Leu Thr Ala Glu Glu Glu Arg Glu Leu 245 250 255 gaa gca gct cat gga agg att caa gaa atc tgt agg aaa tgc caa gag 934 Glu Ala Ala His Gly Arg Ile Gln Glu Ile Cys Arg Lys Cys Gln Glu 260 265 270 tcc aat gta cca ttg ttg att gat gcg gaa gac aca atc ctc caa ccc 982 Ser Asn Val Pro Leu Leu Ile Asp Ala Glu Asp Thr Ile Leu Gln Pro 275 280 285 290 gcg atc gat tac atg gct tat tca tcg gcg atc atg ttc aat gct gac 1030 Ala Ile Asp Tyr Met Ala Tyr Ser Ser Ala Ile Met Phe Asn Ala Asp 295 300 305 aaa gac cga cca atc gtt tac aac acg att cag gcg tac ttg aga gac 1078 Lys Asp Arg Pro Ile Val Tyr Asn Thr Ile Gln Ala Tyr Leu Arg Asp 310 315 320 gcc ggt gag aga ctg cat ttg gca gta caa aat gct gag aaa gag aat 1126 Ala Gly Glu Arg Leu His Leu Ala Val Gln Asn Ala Glu Lys Glu Asn 325 330 335 gtt cct atg ggg ttc aag ttg gtg aga ggg gct tac atg tct agc gaa 1174 Val Pro Met Gly Phe Lys Leu Val Arg Gly Ala Tyr Met Ser Ser Glu 340 345 350 cgt agc ttg gcg gat tcc ctg ggt tgc aag tcg cca gtc cac gac aca 1222 Arg Ser Leu Ala Asp Ser Leu Gly Cys Lys Ser Pro Val His Asp Thr 355 360 365 370 att cag gat act cac tct tgt tac aat gat tgt atg aca ttc ctg atg 1270 Ile Gln Asp Thr His Ser Cys Tyr Asn Asp Cys Met Thr Phe Leu Met 375 380 385 gag aaa gca tca aac ggt tct ggt ttc ggt gtc gtt ctc gca aca cat 1318 Glu Lys Ala Ser Asn Gly Ser Gly Phe Gly Val Val Leu Ala Thr His 390 395 400 aac gct gat tcg ggg aga ctt gcg tcg agg aaa gcg agt gac ctc ggg 1366 Asn Ala Asp Ser Gly Arg Leu Ala Ser Arg Lys Ala Ser Asp Leu Gly 405 410 415 atc gat aaa cag aac ggg aag ata gag ttt gca cag cta tat ggt atg 1414 Ile Asp Lys Gln Asn Gly Lys Ile Glu Phe Ala Gln Leu Tyr Gly Met 420 425 430 tca gat gca ttg tcc ttc ggg tta aag aga gca ggg ttc aat gtt agc 1462 Ser Asp Ala Leu Ser Phe Gly Leu Lys Arg Ala Gly Phe Asn Val Ser 435 440 445 450 aag tac atg ccg ttt gga ccc gtc gca acc gct ata ccg tat ctt ctc 1510 Lys Tyr Met Pro Phe Gly Pro Val Ala Thr Ala Ile Pro Tyr Leu Leu 455 460 465 cga cgc gct tat gag aac cgg gga atg atg gcc acc gga gct cat gac 1558 Arg Arg Ala Tyr Glu Asn Arg Gly Met Met Ala Thr Gly Ala His Asp 470 475 480 cgt caa ctc atg agg atg gaa ctt aag agg aga tta atc gcc ggg att 1606 Arg Gln Leu Met Arg Met Glu Leu Lys Arg Arg Leu Ile Ala Gly Ile 485 490 495 gcg taaagagaga gtatggagcc attaaatgaa attgggaaat gtagatgaat 1659 Ala aaatttcttc tatgtagttt aagaaattga aaacaaaaaa ttataatata agaaatggag 1719 taggtaagaa catttcctgt ggctaaatat ttttcatgag ggactatgtt tttactatca 1779 atatatcatt cacaaatgta tattcacctt atcaataaaa atgcttttta cttt 1833

【図面の簡単な説明】

【図１】プロリン合成系酵素Ｐ５ＣＳ遺伝子とプロリン
代謝系酵素ＰｒｏＤＨ遺伝子およびそのアンチセンス遺
伝子を組み込んだイネ用ベクターを示す図。

【図２】図１で示したベクターを遺伝子操作により導入
したイネのストレスを与えていない時のプロリン蓄積量
を示す図。

【図３】図２で示したプロリン関連遺伝子を組み込んだ
遺伝子組換えイネの耐塩性を示した図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 000006792 理化学研究所 埼玉県和光市広沢２番１号 (72)発明者 吉羽 洋周 東京都国分寺市東恋ケ窪一丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内 (72)発明者 篠崎 和子 茨城県つくば市大わし１−１ 独立行政法 人国際農林水産業研究センター内 (72)発明者 篠崎 一雄 埼玉県和光市広沢二番一号 理化学研究所 内 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA17 CA19 CB02 CD06 CD09 CD13 CD17 4B024 AA08 BA08 CA04 CA12 DA01 DA05 FA02 GA11 GA17

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１に記載の配列を含むイネのＰ５
   ＣＳ（Δ¹−ピロリンー５−カルボン酸合成酵素）遺伝
   子が導入されたことを特徴とするイネ科植物。
2. 【請求項２】配列番号２に記載の配列を含むシロイヌナ
   ズナのＰ５ＣＳ（Δ¹−ピロリンー５−カルボン酸合成
   酵素）遺伝子が導入されたことを特徴とするイネ科植
   物。
3. 【請求項３】配列番号３に記載の配列を含むシロイヌナ
   ズナのＰｒｏＤＨ（プロリン脱水素酵素）遺伝子のアン
   チセンス（逆向きな塩基配列を持つ）遺伝子が導入され
   たことを特徴とするイネ科植物。
4. 【請求項４】配列番号１に記載の配列を含むイネのＰ５
   ＣＳ遺伝子または配列番号２に記載の配列を含むシロイ
   ヌナズナのＰ５ＣＳ遺伝子と配列番号３に記載の配列を
   含むシロイヌナズナのＰｒｏＤＨ遺伝子のアンチセンス
   遺伝子とが導入されたことを特徴とするイネ科植物。
5. 【請求項５】配列番号１に記載の配列を含むイネのＰ５
   ＣＳ遺伝子または配列番号２に記載の配列を含むシロイ
   ヌナズナのＰ５ＣＳ遺伝子と配列番号３に記載の配列を
   含むシロイヌナズナのＰｒｏＤＨ遺伝子のアンチセンス
   遺伝子とがタンデムに連結されて導入されたことを特徴
   とするイネ科植物。
6. 【請求項６】配列番号１に記載の配列を含むイネのＰ５
   ＣＳ遺伝子、配列番号２に記載の配列を含むシロイヌナ
   ズナのＰ５ＣＳ遺伝子、配列番号３に記載の配列を含む
   シロイヌナズナのＰｒｏＤＨ遺伝子のアンチセンス遺伝
   子の何れか、あるいは、前記イネ又はシロイヌナズナの
   Ｐ５ＣＳ遺伝子と前記シロイヌナズナのＰｒｏＤＨ遺伝
   子のアンチセンス遺伝子とがタンデムに連結されて取り
   込まれていることを特徴とするベクター。
7. 【請求項７】請求項６に記載のベクターをイネ科植物由
   来のカルスに導入し、前記カルスを増殖させた後に、前
   記カルスから植物体を再分化させて得られることを特徴
   とするイネ科植物。
8. 【請求項８】請求項６に記載のベクターをイネ科植物由
   来のプロトプラストに導入し、前記プロトプラストを増
   殖させたコロニーから植物体を再分化させて得られたこ
   とを特徴とするイネ科植物。
9. 【請求項９】請求項６に記載のベクターを遺伝子操作に
   より導入して得られたイネ科植物の交雑によって得ら
   れ、請求項６に記載のベクターが導入されたことを特徴
   とするイネ科植物。
10. 【請求項１０】請求項１から請求項９の何れかに記載の
    イネ科植物がイネであることを特徴とするイネ科植物。
11. 【請求項１１】請求項１から請求項９の何れかに記載の
    イネ科植物から収穫されたことを特徴とするイネ科植物
    の種子。
12. 【請求項１２】請求項１から請求項９の何れかに記載の
    イネ科植物がイネであり、前記イネから収穫されたこと
    を特徴とするイネ科植物の種子。
13. 【請求項１３】請求項６に記載のベクターをイネ科植物
    由来のカルスにアグロバクテリウムを用いて導入し、前
    期カルスを増殖させた後に、前記カルスから植物体を再
    分化させることを特徴とするイネ科植物の製造方法。
14. 【請求項１４】請求項６に記載のベクターをイネ科植物
    由来のプロトプラストに電気パルスの印加により導入
    し、前記プロトプラストを増殖させたコロニーから植物
    体を再分化させることを特徴とするイネ科植物の製造方
    法。
15. 【請求項１５】請求項６に記載のベクターを遺伝子操作
    により導入して得られたイネ科植物と交雑を行い、請求
    項６に記載のベクターが導入されたことを特徴とするイ
    ネ科植物の製造方法。