KR20020095011A - 프롤린 축적 능력이 높아 환경 스트레스에 내성이 있는트랜스제닉 벼과 식물 및 그 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프롤린 축적 능력을 높이고, 이에 따라 내염성이 향상된 형질전환 벼과 식물을 얻기 위해서, 벼의 P5CS (델타1-피롤린-5-카르복실산 합성효소) 유전자 또는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자와, 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH (프롤린 탈수소효소) 유전자의 안티센스 (역방향 염기 서열) 유전자를 유전자 조작 기술을 이용하여 벼과 식물에 도입하는 것에 관한 것이다.

Description

프롤린 축적 능력이 높아 환경 스트레스에 내성이 있는 트랜스제닉 벼과 식물 및 그 제조 방법 {Transgenic Rice Plant and Its Family with Environmental Stress Resistant by Proline Accumulation of High Level and Its Production}

본 발명은 프롤린 축적 능력이 높아 내염성, 내건조성, 내냉성이 향상된 벼과 식물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

염생 식물 (halophytes)을 비롯한 몇개의 식물에 있어서, 식물이 고염 스트레스나 건조 스트레스를 받으면 세포질에 아미노산의 일종인 프롤린을 축적하는 것으로 알려져 있다. 이것은 축적된 프롤린이 식물 세포질의 삼투압 조절이나 스트레스에 의한 기능성 단백질의 변성 (degradation)을 억제하는데 도움이 되기 때문이라고 생각된다. 식물에 있어서의 프롤린은, Δ1-피롤린-5-카르복실산 합성효소 (P5CS)와 Δ1-피롤린-5-카르복실산 환원효소 (P5CR)의 2가지 효소에 의해서 글루탐산으로부터 합성된다. 한편, 프롤린은 프롤린 탈수소효소 (ProDH)와 Δ1-피롤린-5-카르복실산 탈수소효소 (P5CDH)의 2가지 효소에 의해서 글루탐산으로 분해된다.

상기한 식물이 고염 스트레스나 건조 스트레스 등의 수분 스트레스 (물을 흡수하기 어려운 상태)를 받으면, P5CS 유전자의 발현 수준이 상승하여 P5CS가 활성화된다. 그러나, P5CR 활성 및 그 유전자 발현은 낮은 수준으로 일정하다. 또한 대사계의 유전자 발현 및 효소 활성도 억제된 상태가 된다. 그런데 일단 수분 스트레스가 해제되면 이번에는 반대로 합성계의 유전자 발현과 효소 활성이 억제되어, ProDH 유전자의 발현이 급속하게 유도되고 효소활성도 높아져 세포질에 축적되어 있던 프롤린은 빠르게 글루탐산으로 대사된다.

이상으로부터 수분 스트레스시에 있어서의 프롤린 합성은 P5CS가 속도제한 요인 (rate-limiting)이 되고 있고, 또한 수분 스트레스 해제 후의 프롤린 대사에는 ProDH가 속도제한 요인이 된다고 생각된다 (Yoshiba et al., Plant Cell Physiol. 38: 1095-1102 (1997)).

지구 환경의 악화에 따라 건조 또는 반건조에 의한 염류 토양의 증가나 인구 증가에 의한 식품 부족이 미래에는 점점 심각해질 것으로 예상된다. 고염 스트레스, 건조 스트레스 및 저온 스트레스 (물을 흡수하기 어려운 상태) 내성 작물의 육종은 세계의 식품 문제를 해결하는 데에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 각 방면에서 연구가 진행되고 있고, 그 성과가 기대되고 있다.

본 발명의 목적은 식물의 프롤린 합성계 및 대사계의 속도제한 요인이 되는 효소인 Δ1-피롤린-5-카르복실산 합성효소 (P5CS)와 프롤린 탈수소효소 (ProDH)의 중요성에 주목하고, 유전자 재조합 기술에 의해 이들 효소의 유전자 발현을 제어하여 프롤린 축적 능력이 높고 이에 따라 내염성, 내건조성, 내냉성이 향상된 벼과 식물, 및 그 제조 방법을 제공하는 데에 있다.

도 1A 내지 도 1D는 프롤린 합성계 효소 P5CS 유전자와 프롤린 대사계 효소 ProDH 유전자 및 그 안티센스 유전자가 각각 혼입된 벼용 벡터를 나타낸 도면이다.

도 2는 도 1A 내지 도 1D에 나타낸 벡터를 유전자 조작에 의해 도입한, 스트레스를 주지 않을 때 벼에 축적된 프롤린의 양을 나타낸 도면이다.

도 3은 도 2에 나타낸 프롤린 관련 유전자가 혼입된 트랜스제닉 벼의 내염성을 나타낸 도면이다.

프롤린 합성계의 P5CS 유전자를 도입하여 과잉으로 발현시키거나 대사계의 ProDH 유전자의 안티센스 (역방향 염기 서열) 유전자를 도입하여 프롤린의 분해를 억제하거나, 또는 P5CS 유전자 및 ProDH 유전자의 안티센스 유전자 모두를 도입하여 프롤린의 분해를 억제하면서 프롤린 합성을 촉진시킴으로써 벼 및 벼과 식물의 세포에 프롤린을 고농도로 축적시킨다.

본 발명에서는 프롤린을 고농도로 축적시킴으로써 내염성, 내건조성 또는 내냉성을 갖는 벼 및 벼과 식물을 분자 수준에서 육종 (분자 육종; molecular breeding)할 수 있게 된다.

지금까지 벼 및 벼과 식물에 있어서 적합 용질 (osmoprotectant)로서의 프롤린 농도를, 합성 촉진 및 분해 억제함으로써 높이는 것이 가능하다는 보고는 알려져 있지 않다. 본 발명의 발명자들은 P5CS 유전자와 ProDH 유전자의 중요성에 주목하여, 종래 알려져 있지 않은 신규 기술 과제를 해결하기 위해서 유전자의 도입이 쉬운 벼 품종 (rice variety)의 선정, 캘러스 형성율 (callus formation rate)을 향상시키는 연구, 벼용 유전자 도입 벡터의 제작 연구 등 각 방면에서 연구하고, 신규 기술을 해명하여 본 발명을 완성시킴에 이르렀다.

본 발명에서는, 벼 또는 아라비돕시스 탈리아나 유래의 프롤린 합성 유전자, 프롤린 대사 유전자의 안티센스 유전자를 개별로 또는 조합하여 도입한 형질전환 벼과 식물 및 그 제조 방법이 제공된다.

본 발명의 벼과 식물에는 아미노산의 일종인 프롤린의 합성효소 단백질을 코딩하는 유전자 또는 프롤린 분해 효소의 안티센스 유전자 중 어느 하나, 또는 이들 쌍방의 유전자가 도입되어 있다. 이 구성에 의해 내염성, 내건조성 및 내냉성이 향상된 벼과 식물을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 벼과 식물로부터 수확된 성숙 종자, 특히 벼의 종자는 복수 세대에 걸쳐 높은 프롤린 축적 능력을 유지할 가능성을 갖는다는 점에 특징이 있다.

또한 본 발명은, 벼 및 벼과 식물을 대상으로 하며, 벼과 식물에 속하는 식물이면 특별히 제한은 없다. 벼과 식물에 속하는 식물의 예로서는 벼, 옥수수, 밀, 보리, 호밀, 잔디, 기장, 조 등이 있다. 본 발명은 특히 벼에 보다 적합하게 적용시킬 수 있다.

본 발명 실시예의 벼과 식물에서는, 벼 또는 아라비돕시스 탈리아나 유래의 프롤린 (적합 용질) 합성 유전자와 프롤린 대사 유전자의 안티센스 유전자 중 어느 하나, 또는 이들 쌍방의 유전자가 도입되어 형질전환이 이루어지고 있다.

본 발명 실시예의 벼과 식물에 도입되는 1 종류 유전자의 예로는, (1) 서열번호 1에 기재된 서열 (염기 서열 및 아미노산 서열)을 포함하는 벼의 P5CS (Δ1-피롤린-5-카르복실산 합성효소) 유전자, (2) 서열번호 2에 기재된 서열 (염기 서열 및 아미노산 서열)을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS (Δ1-피롤린-5-카르복실산 합성효소) 유전자, (3) 서열번호 3에 기재된 서열 (염기 서열 및 아미노산 서열)을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH (프롤린 탈수소효소) 유전자의 안티센스 (역방향 염기 서열) 유전자가 있다.

본 발명 실시예의 벼과 식물에 도입되는 2 종류 유전자의 예로는

(1) 서열번호 1에 기재된 서열을 포함하는 벼의 P5CS (Δ1-피롤린-5-카르복실산 합성효소) 유전자 또는 서열번호 2에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자와, 서열번호 3에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH (프롤린 탈수소효소)유전자의 안티센스 (역방향 염기 서열) 유전자와의 2개의 유전자, 및

(2) 서열번호 1에 기재된 서열을 포함하는 벼의 P5CS (Δ1-피롤린-5-카르복실산 합성효소) 유전자 또는 서열번호 2에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자와, 서열번호 3에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH (프롤린 탈수소효소) 유전자의 안티센스 (역방향 염기 서열) 유전자가 탠덤 (직렬)으로 연결되어 있는 2개의 유전자가 있다.

본 발명의 실시예에서 사용되는 벡터에는, 서열번호 1에 기재된 서열을 포함하는 벼의 P5CS (Δ1-피롤린-5-카르복실산 합성효소) 유전자, 서열번호 2에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자, 서열번호 3에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH (프롤린 탈수소효소) 유전자의 안티센스 (역방향 염기 서열) 유전자 중 어느 하나의 유전자가 혼입되어 있거나, 또는 벼 또는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자와 상기 안티센스 유전자가 탠덤으로 연결된 2개의 유전자가 혼입되어 있다.

본 발명 실시예의 벼과 식물은, 예를 들면 하기 방법 중 어느 하나에 의해 얻을 수 있다.

(1) 상기 벡터를 벼과 식물 유래의 캘러스 (callus)에 도입하고, 이 캘러스를 증식시킨 후에 캘러스로부터 식물체를 재분화시킨다.

(2) 상기 벡터를 벼과 식물 유래의 프로토플라스트 (protoplast)에 도입하고, 이 프로토프라스트를 증식시킨 콜로니로부터 식물체를 재분화시킨다.

(3) 상기 벡터를 유전자 조작에 의해 도입하여 얻어진 벼과 식물과 교잡시킨다.

본 발명 실시예의 벼과 식물의 제조 방법은, 예를 들면 하기 예를 들 수 있다.

(1) 상기 벡터를 벼과 식물 유래의 캘러스에 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용하여 도입하고 이 캘러스를 증식시킨 후에 캘러스로부터 식물체를 재분화시킨다.

(2) 상기한 벡터를 전기천공법 (electroporation)에 의해 벼과 식물 유래의 프로토플라스트에 도입하고, 이 프로토플라스트를 증식시킨 콜로니로부터 식물체를 재분화시킨다.

(3) 상기 벡터를 유전자 조작에 의해 도입하여 얻어진 벼과 식물과 교잡시킨다.

이러한 제조 방법은 프롤린의 축적 능력이 높아, 내염성, 내건조성, 내냉성이 향상된 벼과 식물을 제공한다.

또한, 본 발명 실시예의 벼과 식물로부터 수확된 성숙 종자, 특히 벼의 종자는 복수 세대에 걸쳐 높은 프롤린 축적 능력을 유지해 간다.

본 발명 실시예의 벼과 식물 및 그 제조 방법을 실현하는 예를, 벼를 대표적인 예로 들어 하기 순서에 따라 상세히 설명한다. 하기에 설명하는 순서는 벼 이외의 벼과 식물에도 각종 조건을 그대로 또는 변경하여 적용할 수 있다.

<유전자의 클로닝>

제일 먼저, 벼 묘목 (rice seedling)으로부터 mRNA를 추출하고 이 mRNA를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 플라스미드 또는 파지로 이루어진 벡터에 연결하고, 이를 숙주 미생물 (E. coli)에 도입하여 재조합 DNA를 제조하였다. 이 재조합 DNA가 도입된 형질전환체는, 아라비돕시스 탈리아나로부터의 P5CS 유전자를 프로브로 사용하는 플라크 혼성화 (plaque hybridization)에 의해 스크리닝하였다. 벼 및 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자의 서열은 이미 보고되어 있기 (Yoshiba et al., Plant J. (1995) 7:751-760, Igarashi et al., Plant Mol. Bio1. (1997)33:857-865) 때문에, 이를 바탕으로 적당한 프라이머를 설계하고 PCR에 의해 스크리닝하여 목적으로 하는 형질전환체를 선별하였다. 얻어진 형질전환체로부터 목적하는 플라스미드를 단리하고, 필요하면 적당한 제한 효소로 절단하여 클로닝을위한 플라스미드 벡터에 서브클로닝하였다. 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자도, 벼와 마찬가지 방법으로 클로닝할 수 있다. 다만, mRNA를 추출하는 샘플은 통상의 환경에서 육종한 것보다도, 고염 스트레스 (250 mM NaCl 용액 등에 침지함)나 건조 스트레스 처리를 실시한 것이 바람직하다. 이는 P5CS 유전자가 고염 스트레스나 건조 스트레스 등의 수분 스트레스에 반응하여 유도되기 때문이다 (Yoshiba et al, Plant J. (1995) 7:751-760, Igarashi et al, Plant Mol. Biol. (1997) 33:857-865, Yoshiba et al, Plant Cell Physiol. (1997) 38:1095-1102).

한편, 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH 유전자 (서열은 문헌 [Kiyosue et al, Plant Cell (1996) 8: 1323-1335]에 이미 보고됨)도 상술한 방법에 의해 클로닝할 수 있다. 단, mRNA를 추출하는 샘플은 건조 스트레스를 주고 (약 10 시간 처리) 난 후, 다시 물에 침지하여 물을 흡수시킨 것, 또는 프롤린 용액에 침지하여 프롤린을 흡수시킨 것 등을 사용하는 것이 바람직하다. 이는 ProDH 유전자가, 수분 스트레스를 받고 있는 동안은 그 발현이 억제되고, 고농도의 프롤린에 의해서 그 유전자 발현이 유도되기 때문이다 (Kiyosue et al, Plant Cell (1996) 8:1323-1335, Yoshiba et al, Plant Cell Physiol (l997) 38:1095-1102).

이상과 같은 샘플을 사용하면 벼나 아라비돕시스 탈리아나 뿐만 아니라 다른 벼과 식물로부터도 P5CS 유전자와 ProDH 유전자를 단리할 수 있다.

<유전자 도입 벡터의 제작>

클론닝된 각 P5CS 유전자 및 ProDH 유전자를 적당한 제한 효소로 잘라낸 후, 이를 도 1A 내지 도 1D에 나타낸 바와 같이 pBI 벡터를 변형시킨 벼용 벡터의 꽃양배추 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터 뒤에 연결하였다. 도 1A 내지 도 1D에 있어서, RB는 우측 경계 (right border), 35SPro는 꽃양배추 모자이크 바이러스의 프로모터, P5CS는 벼 또는 아라비돕시스 탈리아나의 프롤린 합성계 효소 유전자, ProDH는 아라비돕시스 탈리아나의 프롤린 대사계 효소 유전자, Noster는 노팔린 (nopaline) 합성효소 유전자의 터미네이터, HTP는 하이그로마이신 내성 유전자, LB는 좌측 경계 (left border)를 각각 나타내고 있다. 또한 화살표는 유전자의 센스 방향을 나타내고 있다.

도 1A 내지 도 1D에 있어서, 도 1A는, RB-35SPro-P5CS-Noster-35SPro-HTP-Noster-LB의 순으로 배열된 벡터 (작제물)를 제작한 예를 나타내는 도면이다. 도 1B는, 상기 A에 대하여, RB-35SPro-P5CS-Noster-35SPro-HTP-Noster-LB의 순으로 상기 A의 작제물과 동일하게 배열되지만 유전자 P5CS가 안티센스로 배열된 예를 나타내는 도면이다. 도 1C는, 상기 A의 작제물 유전자의 P5CS 대신에 유전자 ProDH를 안티센스로 배열하여 치환하고, RB-35SPro-ProDH(안티센스)-Noster-35SPro-HTP-Noster-LB의 순으로 배열된 벡터를 제작한 예를 나타내는 도면이다. 도 1D는 상기 A의 작제물에, 유전자 ProDH를 안티센스로 배열하고 상기 C에 나타낸 작제물을 탠덤으로 연결한 RB-35SPro-P5CS-Noster-35SPro-ProDH(안티센스)-Noster-35 SPro-HTP-Noster-LB의 순으로 배열된 벡터를 제작한 예를 나타내는 도면이다.

35S 프로모터는 강력하고, 항상 어떤 조직에서도 유전자 발현을 유도하는 프로모터로서 잘 알려져 있다. 또한, 유전자가 혼입되는 방향은 P5CS 유전자의 경우는 센스 방향으로, ProDH 유전자의 경우는 안티센스 방향으로 연결하였다.

그리고, 각 유전자가 연결된 벡터는 전기천공법에 의해 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA101 균주에 도입하였다. 각 작제물 (도 1A 내지 도 1D)이 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스는 박토 펩톤 (10 g/l), 박토 효모 추출물 (1O g/l), 염화나트륨 (5 g/l), 1M 염화마그네슘 (2 ㎖/l), 하이그로마이신 B (50 mg/l)를 포함하는 YEP 배지에 28 ℃에서 배양하여 증식시켰다. 유전자 도입은 각 작제물 (도 1A 내지 도 1D)이 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스를 벼의 캘러스 세포에 감염시킴으로써 행하였다. 작제물 D는 2개의 유전자 (P5CS 유전자와 ProDH 유전자)를 탠덤으로 연결하여 동시에 도입되도록 설계되어 있지만, 작제물 A와 C를 혼합하여 함께 감염시켜도 작제물 D와 마찬가지 효과를 얻을 수 있다.

또한, 각 작제물에는 HPT (하이그로마이신 내성) 유전자가 연결되어 있지만, 이것은 도입 유전자의 효과를 해석하는 기초 연구용으로서 형질전환된 세포 및 식물체를 효율적으로 선별하기 위한 것이므로 실제의 염에 손상된 경작지나 건조지 등에서 육종할 경우에는 혼입시킬 필요가 없다.

<유전자 도입용 벼 캘러스의 유도>

성숙한 벼 종자는, 왕겨를 박리한 후, 70％ 에틸 알코올로 10 분간, 3％ 차아염소산 나트륨으로 1 시간 살균하였다. 살균 후 종자를 멸균수로 3회 세정하고, 1 g/l의 카사미노산, 30 g/l의 수크로스, 2 mg/l의 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D), 2 g/l의 겔라이트 (Gelrite)를 포함한 pH 5.8의 N6 배지 (2N6 배지)에 넣어, 28 ℃의 암흑하에서 3 내지 5 주간 배양하였다.

<벼 캘러스로의 유전자 도입>

상기에서 유도한 벼 캘러스 중 크기가 1 내지 3 mm 직경의 것을 다시 2N6 배지에 넣어, 28 ℃의 암흑하에서 3 내지 4일 배양하였다. 이에 따라 캘러스 세포의 분열 활성을 높일 수 있었다. 유전자 도입은 배양된 캘러스와 YEP 배지에서 증식한 각 작제물이 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스 용액 (균의 농도를 OD 66O nm으로 측정하여 O.1이 되도록 희석한 것)을 혼합하여 감염시킴으로써 행하였다. 그 후, 캘러스를 25 ℃의 암흑하에서 3 일간 배양하였다. 배양 후, 캘러스를 1 mg/4 ㎖ 농도의 크라포란 수용액으로 캘러스 표면에 붙은 여분의 균을 수회 세정 살균하고, 멸균한 킴 타올 (kim towel) 등으로 닦아 낸 후, 250 mg/l의 크라포란 (cefotaxime), 10 mg/l의 하이그로마이신 B를 포함하는 2N6 배지 (1차 선별 배지)에 넣어, 28 ℃의 암흑하에서 1 주간 배양하였다.

<형질전환된 캘러스의 선별과 식물체의 재분화>

크라포란을 포함하는 배지에서 배양한 캘러스를, 하이그로마이신 B를 30 mg/l로 늘린 배지 (2차 선별 배지)에 넣어 28 ℃의 암흑하에서 3주간 배양하였다. 그 후, 캘러스를 수크로스 30 g/l, 소르비톨 30 g/l, 카사미노산 2 g/l, MES 완충액 11 g/l, 나프탈렌 아세트산 (NAA) 2 mg/l, 카이네틴 (kinetin) 1 mg/l, 크라포란 250 mg/l, 하이그로마이신 B 30 mg/l, 겔라이트 4 g/l를 포함하는 pH 5.8의 MS 배지 (재분화 유도 배지)에 옮겨, 28 ℃의 밝은 장소에서 3 주간 배양하였다. 유전자가 도입된 캘러스는 그린 스폿 (green spot)을 형성하였고, 거기에서 싹 (shoot)과 뿌리가 분화되었다. 식물 호르몬이 제거된, 수크로스 30 g/l, 크라포란 250 mg/l, 하이그로마이신 B 30 mg/l, 한천 8 g/l를 포함하는 pH 5.8의 MS 배지 (식물체 형성 배지)에 분화된 캘러스를 옮겨, 28 ℃의 밝은 곳에서 수주 동안 배양함으로써 식물체를 더욱 크게 육종하였다.

<형질전환 벼 식물체의 육종과 종자 형성>

재분화된 벼는, 샤알레 안에서 약 4 내지 5 cm 정도의 크기 (높이)가 되면 묘목 육종용 토양이 든 플랜터 (planter)에 옮겨, 조도가 약 2만 룩스 정도의 인공 기후 시스템 내에서 28 ℃의 온도 조건으로 제4 잎부터 제5 잎이 발육할 때까지 육종하였다. 그 후, 묘목을 더욱 적절하게 비료를 가한 흑토를 넣은 와그넬 포트 (pot)로 옮겨 온실 내에서 종자가 여물 때까지 육종하였다. 재분화된 당대의 식물체는 T0 세대이고 이 식물체로부터 취할 수 있는 종자를 T1 세대로 가정하고, T2 세대 내지 T3 세대까지 육종하였다. 실제 농지에서 육종할 경우에는 또한 세대를 중첩하여 여러가지 안전성 평가 시험을 행하여 안전성을 확인한 후, 시장에 낼 필요가 있다.

<형질전환 벼로부터의 프롤린 추출과 그 농도 측정>

프롤린은, T2 세대 또는 T3 세대의 형질전환 벼의 묘목 (제4 잎이 발육한 것)의 잎에서 추출하였다. 인공 기후 시스템 내에서 육종한 벼 묘목의 잎은 가위 등으로 약 200 mg 만큼 잘라 내고, 모르타르에서 액체 질소를 가하여 분말이 될 때까지 갈아서 깨뜨렸다. 분말이 된 샘플을, 순수한 물을 가하여 호모게나이저 등을 사용하여 추가로 마쇄하였다. 분쇄한 샘플을, 97 ℃에서 6 분간 가열한 후, 빙냉하여, 4 ℃에서 약 17,000×G로 10 분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 얻어진 상층액에 최종 농도가 5 ％가 되도록 트리클로로아세트산을 가하여 혼합하고,다시 4 ℃에서 약 17,000×G로 10 분간 원심분리하여 단백질을 침전시켰다. 적합 용질로서의 프롤린은 이 때의 상층액에 포함되어 있고, 농도는 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 측정하였다. 프롤린의 정성 정량은 각종 아미노산의 표준을 일정한 농도로 녹인 것을 미리 HPLC에서 측정해 두고, 그 보유 시간 (retention time)을 기준으로 환산하여 실제 트랜스제닉 벼의 잎에 포함된 프롤린의 양을 정량하였다.

도 2는 각종 유전자를 도입한 재조합 벼에 스트레스를 제공하지 않을 때의 프롤린 함량을 보이고 있다. 좌단의 흰색 표시 그래프는 프롤린 관련 유전자가 혼입되지 않은 대조군을, 우측 5개의 흑색 표시 그래프는 프롤린 관련 유전자가 혼입된 트랜스제닉 벼의 각 계통을 나타내고 있다. 프롤린의 양은 도입한 유전자의 종류에 따라 다르다는 것이 확인되었다.

좌측으로부터 2 열째의 벼의 P5CS 유전자 (OsP5CS)를 안티센스 방향으로 도입한 것 (도 1B)은 거의 프롤린을 축적하지 않는 것으로 관찰되었다. 좌측으로부터 3 열째의 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자 (AtP5CS)를 센스 방향으로 도입한 것 (도 1A)은 대조군에 비하여 프롤린의 축적량이 증가되어 있는 것으로 확인되었다. 마찬가지로 좌측으로부터 4 열째 및 5 열째의 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH 유전자 (AtProDH)를 안티센스 방향으로 도입한 것 (도 1C) 및 벼의 P5CS 유전자 (OsP5CS)를 센스 방향으로 도입한 것 (도 1A)은, 각각 대조군에 비하여 프롤린의 축적량이 증가하고 있는 것으로 확인되었다. 이들에 대하여, 우단에서 벼의 P5CS 유전자 (OsP5CS)를 센스 방향으로, 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH 유전자(AtProDH)를 안티센스 방향으로 도입한 것은 상기 1종류의 유전자를 도입한 것에 비하여 축적된 프롤린의 양이 상당히 높다는 (높은 것은 대조군에 비하여 100 배 이상) 것이 확인되었다. 그리고, 유전자를 센스 방향으로 도입한 것에서는, AtP5CS (좌측으로부터 3열째) 보다도 OsP5CS (좌측으로부터 5열째) 쪽이 프롤린 축적에 있어서 약간 효과가 있음이 확인되었다.

<내염성 시험과 트랜스제닉 벼의 내염성 향상>

도 3은, 도 2의 우측 4열에 나타낸 프롤린 축적이 인정된 트랜스제닉 벼를 여러 계통 사용하여, 250 mM의 농도 (해수 소금 농도의 약 절반)로 내염성 시험을 행한 결과를 나타낸다. 이 흰색 표시 그래프는 프롤린 관련 유전자가 혼입되지 않은 대조군을, 흑색 표시 그래프는 트랜스제닉 벼 샘플을 나타내고 있다. 내염성 시험은 공지된 생존률 (survival rate)을 지표로 한 시험 방법 (일본 특허 공개 평 09-266726호, 발명의 명칭: 식물의 내염성의 간이 평가 방법)에 준하여 행하였다. 프롤린 관련 유전자를 도입하지 않은 대조군은 소금 처리 3일로 모두 고사해 버리는데 비하여, 프롤린을 축적하는 트랜스제닉 벼는 3 일째에 95％로 5일 동안 처리하여도 65％라는 높은 생존률을 나타내는 것이 확인되었다. 이로부터 벼를 형질전환시킴으로써 프롤린 축적 능력을 높여 내염성을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 의해 제조된 벼과 작물은 안전성 평가 등 상세한 분석을 진행시켜 품종화하면, 장래 염류가 집적된 토양이나 사막화된 토양에서도 육종이 가능해지고 식품 생산의 향상을 기대할 수 있다. 또한, 개발도상국에 있어서의 인구 증가에도 대처할 수 있을 것으로 크게 기대할 수 있다.

본 발명에 의해서, 프롤린 축적 능력을 높인 트랜스제닉 벼과 식물의 제조가 가능해졌다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 벼과 식물은 프롤린 축적량이 높기 때문에 내염성을 향상시킬 수 있게 되었다.

Claims (15)

1. 서열번호 1에 기재된 서열을 포함하는 벼의 P5CS (Δ1-피롤린-5 -카르복실산 합성효소) 유전자가 도입된 것을 특징으로 하는 벼과 식물.
2. 서열번호 2에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)의 P5CS (Δ1-피롤린-5-카르복실산 합성효소) 유전자가 도입된 것을 특징으로 하는 벼과 식물.
3. 서열번호 3에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH (프롤린 탈수소효소) 유전자의 안티센스 (역방향 염기 서열) 유전자가 도입된 것을 특징으로 하는 벼과 식물.
4. 서열번호 1에 기재된 서열을 포함하는 벼의 P5CS 유전자 또는 서열번호 2에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자와, 서열번호 3에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH 유전자의 안티센스 유전자가 도입된 것을 특징으로 하는 벼과 식물.
5. 서열번호 1에 기재된 서열을 포함하는 벼의 P5CS 유전자 또는 서열번호 2에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자와, 서열번호 3에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH 유전자의 안티센스 유전자가 탠덤 (tandem)으로 연결되어 도입된 것을 특징으로 하는 벼과 식물.
6. 서열번호 1에 기재된 서열을 포함하는 벼의 P5CS 유전자, 서열번호 2에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자, 서열번호 3에 기재된 서열을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH 유전자의 안티센스 유전자 중 어느 하나가 도입되거나, 또는 상기 벼 또는 아라비돕시스 탈리아나의 P5CS 유전자와 상기 아라비돕시스 탈리아나의 ProDH 유전자의 안티센스 유전자가 탠덤으로 연결되어 도입된 것을 특징으로 하는 벡터.
7. 제6항에 기재된 벡터를 벼과 식물 유래의 캘러스 (callus)에 도입하고, 상기 캘러스를 증식시킨 후에, 상기 캘러스로부터 식물체를 재분화 (regeneration)시켜 얻어지는 것을 특징으로 하는 벼과 식물.
8. 제6항에 기재된 벡터를 벼과 식물 유래의 프로토플라스트 (protoplast)에 도입하고, 상기 프로토플라스트를 증식시킨 콜로니로부터 식물체를 재분화시켜 얻어지는 것을 특징으로 하는 벼과 식물.
9. 제6항에 기재된 벡터를 유전자 조작에 의해 도입하여 얻어진 벼과 식물의 교잡 (cross)에 의해서 얻어지며, 제6항에 기재된 벡터가 도입된 것을 특징으로 하는벼과 식물.
10. 제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 벼과 식물이 벼인 것을 특징으로 하는 벼과 식물.
11. 제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 벼과 식물로부터 수확된 것을 특징으로 하는 벼과 식물의 종자.
12. 제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 벼과 식물이 벼이고, 상기 벼로부터 수확된 것을 특징으로 하는 벼과 식물의 종자.
13. 제6항에 기재된 벡터를 벼과 식물 유래의 캘러스에 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)을 사용하여 도입하고, 상기 캘러스를 증식시킨 후에, 상기 캘러스로부터 식물체를 재분화시키는 것을 특징으로 하는 벼과 식물의 제조 방법.
14. 제6항에 기재된 벡터를 벼과 식물 유래의 프로토플라스트에 전기천공법 (electroporation)으로 도입하고, 상기 프로토플라스트를 증식시킨 콜로니로부터 식물체를 재분화시키는 것을 특징으로 하는 벼과 식물의 제조 방법.
15. 제6항에 기재의 벡터를 유전자 조작에 의해 도입하여 얻어진 벼과 식물과 교잡시킴으로써 제6항에 기재된 벡터가 도입된 것을 특징으로 하는 벼과 식물의 제조 방법.