CN104955947A

CN104955947A - 用于增加植物中胁迫耐受性和生物量的方法和工具

Info

Publication number: CN104955947A
Application number: CN201480006617.2A
Authority: CN
Inventors: A·阿姆特曼; M·汉娜; V·格瑟勒; M·洛佩兹-维娜扎; G·佩雷拉; C·维尔杜因
Original assignee: University of Glasgow; Bayer CropScience LP
Current assignee: University of Glasgow; Bayer CropScience LP
Priority date: 2013-01-29
Filing date: 2014-01-27
Publication date: 2015-09-30
Also published as: EP2951298A1; WO2014118123A1; US20180037903A1; US20150376637A1; BR112015017830A2; CA2899274A1; AU2014211570A1

Abstract

本发明提供用于产生具有增加的胁迫耐受性和产量的植物的方法，以及根据这些方法使用的嵌合基因和包含这类嵌合基因的植物。

Description

用于增加植物中胁迫耐受性和生物量的方法和工具

发明领域

本发明一般地涉及植物分子生物学领域并且涉及一种用于改善植物对胁迫条件的耐受性的方法。更具体地，本发明涉及一种用于增加胁迫耐受性和生长的方法和用于降低ABA敏感性的方法，所述方法包括增加植物中组蛋白脱乙酰酶复合体1(HDC1)蛋白的表达和/或活性。本发明还涉及具有增加的HDC1表达和/或活性的植物，所述植物相对于相应的野生型植物具有增加的胁迫耐受性、生物量、产量和降低的ABA敏感性，等等。本发明也提供编码这类HDC1蛋白的嵌合基因、核酸和多肽。

背景

种群生长和气候变化产生威胁到在世界多个地区造成缺水和食物短缺(Lobell等人,2011,Science 333,616-620)。迫切需要增加食物作物的产量、水利用效率和胁迫耐受性(Foresight,2011,Final Project Report:Futures.Government Office for Science,伦敦)。详细认识支持植物对环境胁迫作出应答的分子实体是作物改良计划的必需前提。经过上个二十年，植物科学家已经鉴定出调节植物对环境胁迫作出应答的复杂信号传导网络的许多小片(Cramer等人,2011,BMC Plant Biol.11)。‘胁迫’激素脱落酸(ABA)指导着在干旱、盐度或冰冻胁迫期间和种子成熟和休眠期间保护植物的无数生理应答和代谢应答(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki,2006,AnnualReview of Plant Biology 57,781-803；Urano等人,2009,Plant J.57,1065-1078；Kim等人,2010,引自Annual Review of Plant Biology,第61卷(Palo Alto:ANNUAL REVIEWS),第561-591页；Yang等人,2010,MolPlant 3,469-490)。例如，ABA诱导气孔关闭以使蒸腾水损耗最小化并启动防止干燥、解冻和渗透冲击期间细胞损伤的蛋白质和代谢物的产生。ABA和其他激素如乙烯(ET)、赤霉素(GA)、细胞分裂素(CK)和茉莉酸(JA)之间的交互作用将生理应答和代谢应答与植物生长及发育整合(Chinnusamy等人,2004,Journal of Experimental Botany 55,225-236；Achard等人,2006,Science 311,91-94；Daszkowska-Golec,2011,Omics 15,763-774；Wilkinson等人,2012,Journal of Experimental Botany 63,3499-3509)。植物中激素性信号传导的复杂性是一项进化成功，但是它经常限制作物产量，因为它使得植物在主要由农民控制的环境中不必要地“小心”。因此，生长停滞和衰老，由植物诱导作为胁迫阶段期间保护储备水和养分储备的先发制人措施，可能导致产量损失(Skirycz和Inze,2010,Curr Opin Biotech 21,197-203)。现在存在令人信服的证据：在缺水情况下生长减少不是气孔关闭的必然结果，而是植物通过生长与碳信号传导解偶联实现的主动应答(Muller等人,2011,Journal of Experimental Botany 62,1715-1729)。这意味在减少水输入情况下维持生物量产生在生物学上并非不可能，并且可以通过调节植物的天然激素应答来实现。最近对水胁迫下引起衰老的CK例举了这种方法的有效性。如果这种应答因CK-生物合成酶过表达而被抑制，则水限制条件下的产量增加(Peleg等人,2011,Plant Biotechnol J 9,747-758)。类似地，降低ABA敏感性并因此抑制生长，或ABA诱导的保护性措施与生长抑制解偶联可能是有前景的生物技术方案以获得更多的“每滴水作物(crop perdrop)”。

已经鉴定到ABA信号传导网络的许多组分，包括充当正向或负向调节物的转录因子、蛋白激酶/磷酸酶、E3连接酶和小RNA(Hirayama和Shinozaki,2007,Trends in Plant Sci.12,343-351；Sunkar等人,2007,Trends in Plant Sci.12,301-309；Cutler等人,2010,引自Annual Review ofPlant Biology,第61卷(Palo Alto:ANNUAL REVIEWS),第651-679页；Yang等人,2010,上文)。在更高控制级别，染色质重塑已经作为转录性ABA应答的重要因素出现(Chinnusamy等人,2008,J Integr Plant Biol 50,1187-1195)。例如，已经报道核小体装配蛋白和SWI/SNF染色质重塑复合体的亚基改变ABA敏感性(Saez等人,2008,Plant Cell 20,2972-2988；Liu等人,2009,Mol Plant 2,688-699)。组蛋白脱乙酰化(HD)已经作为环境胁迫期间的重要调节过程出现(Kim等人,2012,Plant Cell Physiol 53:797-800)。组蛋白脱乙酰酶(HDAC)从组蛋白3和4的赖氨酸残基移除活性乙酰化标记，这转而通过与基因特异性阻遏蛋白相互作用和通过总体染色质压缩导致基因转录的阻遏(Kurdistani和Grunstein,2003,Nat Rev Mol Cell Bio 4,276-284)。在植物中，HDAC属于三个不同结构类别；与酵母和动物中Rpd3/HDAC-1型酶相似的I型HDAC、与其他真核生物中类似酶同源的Sirtuin和一种植物特异性蛋白质类别HD-tuins(Pandey等人,2002,NucleicAcids Res 30:5036-5055；Hollender和Liu,2008,J Integr Plant Biol 50,875-885)。拟南芥(A.thaliana)基因组含有约20个编码HDAC的基因，其中仅少量已经进行功能表征。据报道HD-tuin HD2C过量表达克服萌发拟南芥种子的ABA诱导型生长停滞(Sridha和Wu,2006,Plant J.46,124-133)。相反，hd2c敲除突变体的幼苗是对ABA过度敏感，对于HDA6(一种Rpd3/HD1-型HDAC)的敲低株系的幼苗也是如此(axe1-5，CS2483)(Sridha和Wu,2006,上文；Luo等人,2012,Journal ofExperimental Botany 63,3297-3306；Chen等人,2010,Exp Bot 61:3345-3353)。进一步显示HD2C与HDA6相互作用并且axe1-5与hd2c杂交进一步增加幼苗的ABA敏感性(Luo等人,2012,上文)。通过以下研究结果进一步增强ABA敏感性、组蛋白(脱)乙酰化和转录性调节之间的联系：在HD2C和HDA6敲低/敲除株系中H3/H4赖氨酸残基的乙酰化增加和许多基因表达受到调节(To等人,2011,PLoS Genet.7；Luo等人,2012,上文)。然而，并非全部HDAC均在ABA-信号传导中发挥作用。例如，拟南芥HDA19的功能与防御激素茉莉酸更密切相关。拟南芥中敲除HDA19造成植物对真菌性病原体芸苔生链格孢(Alternaria brassicola)的抗性下降。过量表达HDA19具有相反效果(抗性增加)，但是还导致发育表型(异常子叶、更窄、分支莲座叶、开花延迟、长角果短小；Zhou等人,2005,Plant cell17:1196-1204)。类似地，稻中HDAC1-3的诱导性过量表达造成发育异常连同生长增强(Jang等人,2003,Plant J 33:531-541)。

在酵母和动物中，组蛋白Rpd3/HD1-型组蛋白脱乙酰酶与基因特异性转录阻遏物(例如Ume6)、辅阻遏物(Sin3)、Sin3相关肽(例如SAP18)、组蛋白结合蛋白(例如Ume1，RbAp46/48、TBL1)以及功能未表征的蛋白质(例如Rxt1-3)一起发挥作用(Carrozza等人,2005,Bba-Gene Struct Expr 1731,77-87；Chen等人2012,Curr Biol 22:56-63；Roguev和Krogan,2007,Nat.Struct.Mol.Biol.14,358-359；Yang和Seto,2008,Nat Rev Mol Cell Bio 9,206-218)。已经描述几个类型的复合体，各自含有不同的蛋白质组。例如，酵母装配出一个大Sin3复合体和一个小Sin3复合体(酿酒酵母(S.cerevisiae)中的Rpd3L/S、粟酒裂殖酵母(S.pombe)中的I/II(Roguev和Krogan,2007,上文)，而哺乳动物和昆虫装配出至少三种不同的复合体(Mi-2/NuRD、CoREST和N-CoR/SMRT(Yang和Seto,2008,上文)。最近的实验已经显示复合体中催化性组蛋白脱乙酰酶的蛋白质环境对HD抑制剂的特异性关键(Bantscheff等人,2011,Nature Biotech 29:255-256)。因此体内调节HDAC可能类似地依赖于复杂背景。已经表征与动物或酵母HDAC复合体成员Sin3、SAP18、和Rb46/48同源物FVE具有同源性的一些拟南芥蛋白并发现它们与Rpd3/HD1-型组蛋白脱乙酰酶HDA6或HDA19相互作用(Song等人,2005,Plant Cell 17,2384-2396；Song和Galbraith,2006,Plant Mol.Biol.60,241-257)。拟南芥中这些基因的敲除/敲低造成与敲低HDA6相似的表型，例如ABA超敏感性和开花延迟(Song等人,2005,上文；Song和Galbraith,2006,上文)。相反，敲除哺乳动物TBL1(HOS15)的拟南芥同源物不改变ABA-敏感性，但是造成幼苗对冷超敏感(Zhu等人2008,Proc.Natl.Acad.Aci.USA 105,4945-4950)。这些研究结果显示，在植物中HDAC还在多蛋白复合体中发挥作用，但是这些研究结果还显示不能单从序列同源性预测修饰推定性复合体成员的生理学下游应答。显然，许多其他HD复合体蛋白仍待发现及功能表征。难以按计算机方式装配推定性植物HD复合体，因为大多数酵母/动物HD复合体蛋白质在拟南芥基因组中没有同源物或具有多个同源物，总计超过100个拟南芥基因与酵母或动物中的HDAC复合体成员具有显著相似性。鉴于HDAC在发育和胁迫应答中的重要性，以下假设是合理的：HDAC复合体的特定组成和功能取决于组织、发育阶段和环境。WO 04/022735公开了作为组蛋白脱乙酰酶发挥作用的蛋白质OsНDAC1、OsНDAC2和OsНDAC3、编码所述蛋白质的基因和一种通过在植物中表达所述基因而产生具有高生长率的植物的方法。Jang等人(2003，上文)公开了，稻中HDAC1-3的组成型过量表达产生不能增殖的愈伤组织，诱导性过量表达还造成除生长增强外的发育异常。

WO 04/035798公开一种用于改变植物特征的方法并且描述了鉴定到在过量表达E2Fa/DPa的转基因植物中上调或下调的基因以及这类序列改变植物特征的用途。

通过公开可以用来调节植物胁迫应答、ABA敏感性、生长和开花的新的HDAC-相互作用蛋白，本发明提供超越现有技术的贡献。

发明简述

在第一实施方案中，本发明提供一种方法，其用于增加植物、植物部分、植物器官或植物细胞对胁迫条件、优选轻度或中度胁迫条件的耐受性；或用于降低植物、植物部分、植物器官或植物细胞的ABA敏感性；和/或用于增加植物、植物器官或植物部分的生物量和/或产量和/或生长速率；和/或用于加速植物开花时间，所述方法包括步骤

a.在所述植物、植物部分、植物器官或植物细胞中增加蛋白质的表达和/或活性，所述蛋白质具有含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的蛋白质的活性。

所述增加具有含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的蛋白质的活性的蛋白质的表达和/或活性可以包括在所述植物细胞、植物部分、植物器官或植物中表达包含以下有效相连的元件的嵌合基因：

a.植物可表达启动子

b.核酸，当转录时，所述核酸导致具有由SEQ.ID.NO.6编码的蛋白质的活性的蛋白质的活性和/或表达增加

c.任选的，在植物中有功能的参与转录终止和多聚腺苷酸化的3’末端区。

在该方法的又一个实施方案中，核酸编码具有含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的蛋白质的活性的蛋白质，或核酸包含编码蛋白质的核酸序列，所述蛋白质与SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40或SEQ ID NO.41具有至少70％序列同一性，或核酸包含与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37或SEQ ID NO.39具有至少70％序列同一性的核酸序列。

启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。

在甚至又一个实施方案中，植物选自小麦、油菜(oilseed rape)、莴苣、烟草、棉花、玉米、稻、蔬菜植物、胡萝卜、黄瓜、韭葱(leek)、豌豆、瓜(melon)、马铃薯、番茄、高粱、黑麦、燕麦、甘蔗、花生、亚麻、菜豆、糖萝卜(sugar beet)、大豆、向日葵和观赏植物。

胁迫条件可以选自干旱胁迫、盐胁迫、低养分水平、高光胁迫和氧化胁迫。

本发明另外提供一种用于增强严重胁迫条件下植物、植物部分、植物器官或植物细胞存活、或用于增强严重胁迫后植物、植物部分、植物器官或植物细胞恢复或用于延迟植物开花时间的方法，所述方法包括步骤：

a.在所述植物、植物部分、植物器官或植物细胞中减少蛋白质的表达和/或活性，所述蛋白质具有由SEQ ID NO.6编码的蛋白质的活性。

减少表达和/或活性可以包括在所述植物细胞、植物部分、植物器官或植物中表达包含以下有效相连的元件的嵌合基因：

a.植物可表达启动子

b.核酸，当转录时，所述核酸导致具有由SEQ.ID.NO.6编码的蛋白质的活性的蛋白质的活性和/或表达减少

在又一个实施方案中，核酸可以在转录时产生HDC1抑制性RNA分子。

优选地，启动子是诱导型启动子。

本发明也提供如上文所述的嵌合基因。

还提供植物、植物部分、植物器官、植物细胞或种子，它们已经根据本发明被修饰，从而当与对照植物比较时，具有增加或减少的蛋白质表达和/或活性，所述蛋白质具有含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的蛋白质的活性，例如包含本发明嵌合基因的植物、植物部分、植物器官、植物细胞或种子。

本发明的植物、植物部分、植物器官、植物细胞或种子可以是油菜(oilseed rape)、莴苣、烟草、棉花、玉米、稻、小麦、蔬菜植物、胡萝卜、黄瓜、韭葱(leek)、豌豆、瓜(melon)、马铃薯、番茄、高粱、黑麦、燕麦、甘蔗、花生、亚麻、菜豆、糖萝卜(sugar beet)、大豆、向日葵或观赏植物。

还提供是一种用于减少胁迫条件如轻度或中度胁迫条件下植物产量损失的方法，所述方法包括在所述植物中增加蛋白质的表达和/或活性，所述蛋白质具有含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的蛋白质的活性，所述方法例如通过在所述植物中表达如上文所述的嵌合基因以增加具有由SEQ.ID.NO.6编码的蛋白质的活性的蛋白质的活性和/或表达(即，嵌合基因包含与植物可表达启动子和任选地植物功能性3’末端区有效连接的核酸，其中转录时，所述核酸导致具有由SEQ.ID.NO.6编码的蛋白质的活性的蛋白质的活性和/或表达增加)。

还提供一种用于产生具有对胁迫条件如轻度或中度胁迫条件的耐受性增加的植物、具有ABA敏感性降低的植物、或具有生物量或产量或生长速率增加的植物，或具有开花时间更早的植物，所述方法包括步骤：

a.向植物的细胞引入如上文所述的嵌合基因用于增加具有由SEQ.ID NO.6编码的蛋白质的活性的蛋白质的活性和/或表达，以产生转基因细胞；和

b.从表达所述嵌合基因的所述转基因植物细胞产生植物、植物部分、植物器官。

本发明也提供一种用于调节细胞中组蛋白乙酰化的方法，包括步骤：调节所述细胞中具有由SEQ.ID.NO.6编码的蛋白质的活性的蛋白质的表达和/或活性，其中增加所述蛋白质的表达和/或活性抑制组蛋白乙酰化并且减少所述蛋白质的表达和/或活性增强组蛋白乙酰化。

进一步提供如上文所述的嵌合基因的用途，用于增加具有由SEQ.ID.NO.6编码的蛋白质的活性的蛋白质的活性和/或表达，以增加植物、植物部分、植物器官或植物细胞对(轻度或中度)胁迫条件的耐受性；或以降低植物、植物部分、植物器官或植物细胞的ABA敏感性；或以增加植物、植物器官或植物部分的生物量或产量或生长速率；或以加速植物开花时间。根据权利要求14或15所述的植物的用途，以产生包含根据权利要求13所述的嵌合基因的种子。

本发明也提供植物的用途，所述植物已经被修饰，从而具有增加的蛋白质表达和/或活性，所述蛋白质具有含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的蛋白质的活性，所述植物例如包含如上文所述的用于增加具有由SEQ.ID.NO.6编码的蛋白质的活性的蛋白质的活性和/或表达的嵌合基因的植物，所述用途用于产生对(轻度或中度的)胁迫条件具有增加的耐受性、或具有降低的ABA敏感性、或具有增加的生物量或产量或生长速率、或具有加速的开花时间的植物群体。

在另一个实施方案中，本发明提供一种蛋白质，所述蛋白质具有含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的蛋白质的活性。该蛋白质可以与SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40或SEQID NO.41具有至少70％序列同一性。

还提供编码以上蛋白质(即具有含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的蛋白质的活性的蛋白质)的核酸。该核酸可以与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37或SEQ ID NO.39具有至少70％序列同一性。

图例

图1：HDC1蛋白已经从祖先Rxt3蛋白扩展。(A)基于补充文件1中提供的预测氨基酸序列比对，酵母、藻类、原生动物、藓类和高等植物中HDC1/Rxt3基因的预测蛋白质序列的聚簇系统树。(B)高等植物HDC1蛋白的保守部分和新部分的示意图。对于蛋白质的Rxt3部分，插入拟南芥(At)序列与来自二穗短柄草(Brachypodium distachyon)(Bd)HDC1和酵母(Sc)Rxt3的序列相对于拟南芥(At)的比对。用方框标出保守的蛋白质结构域家族标签‘组蛋白脱乙酰化Rxt3’(PF08642)。

图2：HDC1是一种遍在核蛋白。HDC1的组织表达模式和亚细胞定位。GUS染色显示拟南芥种子(A)，幼苗(B)和成熟植物(C)的根和枝条、莲座叶(D)和花芽(E)中的HDC1启动子活性。花药或柱头内部见不到染色(F，箭头)。GFP-HDC1在瞬时表达的烟草(N.tabacum)的表皮叶细胞(G)中和在稳定表达的拟南芥植物的根细胞(H，J)中的核定位。核仁内部见不到GFP信号(J，箭头)。J中的比例尺是50μm。

图3：HDC1连同HDA6和HDA19在瞬时表达的烟草表皮细胞的核内部的共定位。在瞬时表达GFP-HDC1和RFP-HDA6或RFP-HDA19后烟草(本生烟草(N.benthamiana))表皮叶细胞中细胞核的高放大率图像。每列含有从左至右以下图像：亮视野、GFP荧光、RFP荧光、GFP/RFP重叠、定量比较GFP和RFP信号，连同行扫描(重叠图像中的箭头)。HDC1在整个细胞核(A、D)、在明显核斑(B-E)或在核仁(C、F)中与HDA6(A-C)和HDA19(D-F)共定位。比例尺是10μm。

图4：HDC1在比率BiFC测定法中与组蛋白脱乙酰酶HDA6和HDA19相互作用。(A)构建用于比率BiFC测定法的‘二合一’载体，其含有与HDC1、HDA6、HDA19和SIN3融合的YFP N端半侧和C端半侧(nYFP、cYFP)以及全长RFP。(B)在瞬时表达nYFP-HDC1连同cYFP-HDA6、cYFP-HDA19或cYFP-SIN3(阴性对照)后烟草叶细胞细胞核中YFP(上行)和RFP(中间行)的信号。nYFP-SIN3还与cYFP-HDA19(阳性对照)一起表达。末行显示亮视野图像。比例尺是10μm。(C)各个细胞核中的YFP/RFP信号比(均值±SE，来自3个独立转化植物的n≥20个细胞)。星号表示就针对HDC1-SIN3获得的信号比而言显著差异(p<0.001)。

图5：HDC1与植物中的组蛋白脱乙酰酶相互作用并促进H3K9/14脱乙酰化。(A)在体外用重组GST-HDA6(第二泳道)和GST-HDA19(第三泳道)下拉后重组HDC1-His的抗His Western印迹。第一泳道含有阳性对照(重组HDC1-His)，最后泳道含有阴性对照(单用GST下拉)。(B)用重组GST-HDA6(第二泳道)或GST-HDA19(第三泳道)从拟南芥野生型(WT，左)或HDC1敲除植物(hdc1-1，右)的细胞核富集的蛋白质样品下拉后天然HDC1的抗HDC1Western印迹。在来自野生型(输入)的未处理蛋白质样品中和在用GST-HDA6/19下拉，但未用单一GST下拉后的野生型样品中的HDC1。HDC1不存在于来自敲除植物的蛋白质样品(输入或下拉)。下面的小图显示用抗GST再探测的膜，证实存在诱饵。(C)与野生型(左印迹)比较，采用抗H3K9K14ac的Western印迹显示来自拟南芥hdc1-1植物的蛋白质提取物中乙酰化H3K49K14的量增加。在互补后(在hdc1-1中表达HDC1，HDC1c)，H3K49K14ac恢复至野生型水平(右印迹)。总H3(上样对照)用抗(α)-H3检测。用Image J对条带定量后，确定野生型系、hdc1-1系和HDC1c系中的H3K49K14Ac/H3信号比。柱是来自至少三次Western印迹的均值±SE。星号表示相对于WT和HDC1c为显著差异(p<0.05)。

图6：验证hdc1-1敲除系和HDC1过量表达系。A：T-DNA和引物对在拟南芥hdc1-1敲除株系(GABI-Kat054G03)基因组DNA中的位置。数字表示用于基因分型的引物对的位置。B：如使用A中所示引物对，通过半定量RT-PCR所测定的野生型和hdc1-1中的HDC1mRNA。使用微管蛋白9(Tub9)作为上样对照。C：采用抗HDC1的Western印迹在拟南芥野生型中检出HDC1，在hdc1-1中未检出。显示在烟草中瞬时表达更大的HDC1-GFP融合蛋白的检测用于比较。通过Ponceau染色检测Rubisco(上样对照)。D：在35-S启动子或泛素-10启动子控制下过量表达HDC1的两个株系中的HDC1mRNA水平(相对Tub9)。

图7：Salk150126和Sail1263E05不是hdc1敲除体。A：T-DNA和引物对在Salk_150126系和Sail_1263_E05系基因组DNA中的位置。B：使用A中所示的引物对时拟南芥野生型、Salk_150126和Sail_1263_E05中的HDC1mRNA水平。RpII是RNA聚合酶II(上样对照)。星号表示相对于野生型是显著差异(p<0.05)。C：拟南芥野生型(黑色)、Salk_150126(灰色条纹)和Sail_1263_E05(浅灰色条纹)在含有不同浓度ABA的琼脂上的萌发率。柱是至少3块平板的均值+/-SE，所述平板各自含有至少50粒种子。注意株系均未显示ABA超敏感。

图8：针对盐、甘露醇、ABA和PAC的HDC1脱敏的幼苗。拟南芥野生型(黑色)，hdc1-1敲除系(白色)和HDC1过量表达(OX)系(灰色)在含有不同浓度盐(NaCl，A)、甘露醇(B)、ABA(C)或GA生物合成抑制剂多效唑(PAC，D)的琼脂上的萌发率。萌发率％反映已经在播种后第6日发育子叶的幼苗的数量，针对播种的种子总数归一化。柱是至少3块平板的均值+/-SE，所述平板各自含有50粒种子。星号表示相对于野生型是显著差异(p<0.05)。图9中显示幼苗的照片。

图9：A：在播种后第6日幼拟南芥幼苗的外观。使野生型(上方第三块平板)种子、hdc1-1(中央)种子和OX(下部)种子浸渗并允许在添加或不添加(对照)0.3的半强度Murashige Skoog培养基上萌发。在同一天拍照，同时对萌发率评分。注意在无ABA情况下，对于全部株系，幼苗的数量和大小相似。B：在萌发后2-6日(DAG)，野生型(WT，黑色)、hdc1-1敲除(KO，白色)和HDC1过量表达(OX，灰色)幼苗中胚胎发生相关基因ABI3、FUS3和LEC1的转录物水平。柱代表4次技术性qPCR重复的均值，mRNA从50株幼苗汇总。星号表示相对于野生型是显著差异(p<0.05)。

图10：HDA6过量表达不影响萌发或生长。A：浸渗的拟南芥野生型(黑色)种子、35S::HDC1(浅灰色)种子和35S::HDA6(深灰色)种子的萌发率。萌发率％反映已经在第6日发育子叶的幼苗的数量，针对涂布出的种子总数归一化。柱是3块平板的均值+/-SE，所述平板各自含有50粒种子。星号表示相对于野生型是显著差异(p<0.05)。B：HDA6在野生型和35S::HDA6系中的转录物水平。C：枝条重量(5周龄植物的FW：鲜重，DW：干重)。柱是8株植物的均值。

图11：ABA-低敏感性需要组蛋白脱乙酰化。在含有或不含0.3μM或3μM组蛋白脱乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(TSA)的含有渐增浓度ABA的琼脂上拟南芥野生型(B)植物和HDC1过量表达植物(B，C)的萌发率。其他细节如图8所示。

图12：HDC1的敲除在不改变间隔期情况下延迟开花。(A)在土壤上长日照条件下生长的拟南芥野生型植物(黑色)、hdc1-1敲除植物(白色)和HDC1OX植物(灰色)的间隔期。柱是3株植物的均值±SE。(B)抽苔时的植物年龄。柱是10-15株植物的均值±SE。(C)抽苔时的叶数。柱是10-15株植物的均值±SE。(D)在第28日的FLC转录物水平。柱是3株植物的均值±SE。星号表示相对于野生型有差异，p<0.05。

图13：HDC1促进植物营养生长。(A)拟南芥野生型植物(黑色)，hdc1-1敲除植物(白色)和HDC1OX植物(深灰色)的枝条及根鲜重(FW)。植物在短日照条件下水培。柱显示6株植物平均FW±SE。星号表示相对于野生型有差异，p<0.05。为了测定干重(DW)，将第35日收获的6株植物的组织汇集并干燥。合计重量除以植物株数。在右边照片里显示第35日的植物外观。(B)hdc1-1敲除植物和两个独立互补作用系(hdc1-1背景下的35S::基因组HDC1)的枝条重量。柱是5株植物的均值±SE，分别与相同托盘中培育的hdc1-1植物比较。照片显示典型植物外观(第24日，长日照条件)。采用HDC1-抗体(αHDC1)的叶蛋白提取物的Western印迹反映HDC1蛋白在植物中的量。Ponceau染色的Rubisco提供上样对照。

图14：HDC1提高幼小植株中膨大莲座叶的叶表面。在土壤上长日照条件下生长的2周龄拟南芥野生型植物(黑色)、hdc1-1植物(白色)和HDC1-OX植物(灰色)的叶表面积。全部植物均具有相同叶数(参见图7A)。按出现顺序摘除叶并用Image J分析。柱是3株植物的均值±SE。星号表示相对于野生型是显著差异(p<0.05)。

图15：HDA6敲低在不延迟叶发育的情况下影响植物生长。A：4周龄拟南芥野生型植物(Col-DR5，黑色)和hda6-敲低植物(axe1-5，白色点状)的鲜重和干重。B：野生型和axe1-5突变体的叶数。柱是5株植物的均值±SE。

图16：HDC1敲除/过量表达使得对盐应答的基因失调。盐应答性基因在拟南芥野生型(WT；黑色)、hdc1-1敲除系(KO；白色)和HDC1过量表达系(OX；灰色)中的转录物水平。植物在短日照条件下培育4周并接受(+)或不接受(2)在水培中150mM NaCl持续24小时。mRNA从三个独立处理的植物批次汇集，每批次5株植物。每个重复处理导致ABA显著增加(参见图17)。转录物水平对微管蛋白9(TUB9)的转录物水平归一化。柱是四次技术性qPCR重复的均值+SE。星号表示相对于野生型是显著差异(P<0.05)。RAB18，应答于ABA18。

图17：HDC1对盐处理后的ABA含量产生微弱影响。A：野生型(WT，黑色)、hdc1-1敲除(KO，白色)和HDC1过量表达(OX，灰色)的枝条ABA含量。植物在短日照条件下培育4周并接受(+)或不接受(-)在水培中150mM NaCl持续24小时。显示来自三个独立处理的植物批次的绝对结果。B：与野生型相比，hdc1-1植物和HDC1-过量表达植物中ABA含量的相对变化。ABA含量对相同批次中盐处理的野生型植物的ABA含量归一化。

图18：HDC1决定ABA1、DR4、PYL4和RD29B的H3K9/K14乙酰化状态。如通过ChIP-qPCR所测定，拟南芥野生型植物(WT，黑色)，hdc1-1敲除植物(KO，白色)和HDC1过量表达植物(OX，灰色)植物中与ABA1、DR4、PYL4和RD29B的乙酰化H3K9/K14相关的DNA的相对量。叶组织从3个独立批次中培育的4周龄植物汇集，每批次12株植物。提取染色质并用抗H3K9K14Ac免疫沉淀。qPCR-扩增的ChIP-DNA对肌动蛋白2和对输入DNA(免疫沉淀法之前的染色质)归一化。柱是4个技术性qPCR重复的均值±SE。星号表示相对于野生型是显著差异(p<0.05)。

图19：HDC1在良好加水条件和在水限制条件增加植物生长。(A)拟南芥野生型植物(黑色)、hdc1-1敲除植物(白色)和HDC1OX植物(灰色)的莲座直径和枝条重量(鲜重；FW，干重：DW)。植物在土壤上在短日照条件下培育。水限制方案在于从第14日减少水供应量以实现对照条件的约50％连续相对土壤含水量直至实验在第40日结束。柱是至少24株植物的均值±SE。星号表示相对于野生型有差异，p<0.05。(B)在含80mM NaCl的养分溶液中生长的水培植物的根和枝条重量。实验开始时的植物年龄是29日(短日照条件)。第一时点是在施加盐后6小时。图8中显示无盐情况下平行培育的对照植物。柱是每个株系6株植物的平均鲜重(FW)±SE。星号表示相对于野生型有差异，p<0.05。为确定干重(DW)，汇集6株植物的组织。照片显示在80mM NaCl中6日后每个株系的植物。

图20：HDC1在对照条件和干旱条件下增加生物量。在干旱下以及在对照条件下表现更好的小麦野生型(“对照”)和3种事件(事件1，事件2和事件3)的每株植物和每种处理的鲜重。(统计显著性：*＝p<0.1，**＝p<0.05)。

图21：HDC1增加穗数。小麦野生型(“对照”)和对照条件下表现更好的2种事件(事件4和事件5)的每株植物穗数。(统计显著性：*＝p<0.1)。

图22：HDC1在对照条件下增加产量。小麦野生型(“对照”)和对照条件下表现更好的2个事件(事件4和事件5)的每株植物以种子数计的产量。(统计显著性：**＝p<0.05)。

图23：HDC1在对照条件下增加产量。小麦野生型(“对照”)和对照条件下表现更好的2个事件(事件4和事件5)的每株植物以克计的产量。

图24：HDC1在转化的小麦植物中具有mRNA表达。事件#1和事件#2清晰显示mRNA表达。H代表纯合分离子，A代表野生型分离子。

图25：HDC1在转化的小麦植物中具有mRNA表达。事件#4和事件#4清晰显示mRNA表达。H代表纯合分离子，A代表野生型分离子。

详细描述

本发明基于鉴定到一种调节植物ABA敏感性、生长和开花的新HDAC相互作用蛋白，该蛋白质称作组蛋白脱乙酰酶复合体1(HDC1)。HDC1是来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的在其他植物物种(包括重要作物)中以单拷贝数或低拷贝数保守的单拷贝基因。它与酵母基因Rxt3(LRpd3复合体的经证实但尚未功能表征的成员)具有部分同源性(Carrozza等人,2005,Bba-Gene Struct Expr 1731,77-87；Chen等人,2012,Curr Biol 22,56-63)。然而，不能从现有知识推断HDC1的功能。迄今RXT3-型和HDC1-型基因均尚未进行功能表征，并且它们均不含有任何已知的功能基序。另外，植物基因明显长于祖先RXT3基因并且可能已经获得新功能。发明人已经显示HDC1在全部二倍体组织中遍在表达并定位至细胞核，在那里它与组蛋白脱乙酰酶HDA6和HDA19相互作用。发现HDC1促进组蛋白脱乙酰化，因为对于组蛋白3中赖氨酸残基的脱乙酰化而言似乎需要它。HDC1过量表达产生三个基本表型：(i)幼苗中萌发后生长和成熟植物中胁迫诱导ABA合成的ABA不敏感性，(ii)再良好加水和在水限制土壤中增强的营养生长(生物量生产)，和(iii)加速开花，尽管在hdc1敲除突变体中相反地影响这些特征。还可能在小麦植物中观察到产量增加。这表明表型是的确由HDC1引起，因而将HDC1鉴定为植物生长、开花和非生物胁迫应答的关键决定因素。

根据组蛋白脱乙酰化作用的阻抑功能，发现几种已知的胁迫应答基因的转录物水平在hdc1-1敲除植物中增加和/或在HDC1-OX植物中降低。因此认为HDC1促进的组蛋白脱乙酰化增加胁迫时为了基因去阻抑所要求的刺激物(例如ABA)和激活物(例如转录因子)的量，因而降低其胁迫敏感性。HDC1的缺少降低去阻抑所需要的刺激物的量，但在刺激和激活物不存在(即在对照条件中)时不足以激活转录。在胁迫阻遏型基因情况下，HDC1降低给定量组成型激活物的效率，因而降低转录物水平。

因此在不意图限制本发明的情况下，认为HDC1通过作为通用支架蛋白发挥作用调节ABA-敏感性、生长和开花，其中所述支架蛋白通过稳定酶与底物或与其他调节蛋白的相互作用增强表观组蛋白脱乙酰酶活性。另外，与稻中过量表达HDA19同源物(这增加生长，还产生一系列发育异常)相反(Zhou等人,2005，上文)相反，在过量表达HDC1的植物中没有出现这类异常。Hdc1敲除也没有重复出现在hda6/19双突变体中观察到的异常发育表型(Tian和Chen,2001,Proc.Natl.Acad.Aci.USA 98,200-205；Tanaka等人,2008,Plant Physiol.146,149-161)。因此，通过如本文所述调节HDC1表达水平对组蛋白脱乙酰酶活性的间接操纵提供了在无发育副作用情况下有效控制植物生长和胁迫敏感性的手段。

因此在第一实施方案中，本发明提供一种方法，其用于增加植物、植物部分、植物器官或植物细胞对胁迫条件、优选地轻度或中度胁迫条件的耐受性；或用于降低植物、植物部分、植物器官或植物细胞的ABA敏感性；或用于增加植物、植物器官或植物部分的生物量或产量或生长速率；或用于加速植物开花时间；所述方法包括步骤：在所述植物、植物部分、植物器官或植物细胞中增加HDC1(即，具有由SEQ.ID.NO.6编码的蛋白质的活性的蛋白质)的功能性表达(即表达和/或活性)。

如本文所用，“具有含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的蛋白质的活性的蛋白质”指任何有功能的HDC1蛋白。这些例如包括如SEQ ID NO.6、SEQID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.41所代表的植物HDC1蛋白。这还包括其功能性变体，例如与上文引用的编码有功能HDC1蛋白的任何氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的蛋白质。另一个例子是基于SEQ ID NO.:42的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

HDC1蛋白是普遍表达的约900个氨基酸的核蛋白，其C端半侧与绿藻、原生动物和真菌中的Rxt3-型蛋白(参见图1)如294个氨基酸的酵母蛋白Rxt3(SEQ ID NO 4)共有序列同一性。还已经显示HDC1是组蛋白脱乙酰化必需的并且与多种组蛋白脱乙酰酶(HDAC)相互作用。在不意图使本发明限于特定作用模式的情况下，据信HDC1作为一种相对非特异性结构性组分发挥作用以增强组蛋白脱乙酰化复合体的稳定性，因而增加组蛋白脱乙酰化和下游基因阻遏的效率。HDC1不是基本HDAC活性必需的，因为敲除体有活力的，但是认为它调控(titrate)HDAC的效率。另外，作为HDAC活性的增强剂，HDC1依赖于HDAC的催化功能，但是降低涉及HDAC功能的过程对组蛋白脱乙酰酶抑制剂化合物(例如TSA)和对激素如ABA的敏感性。

可以通过修饰编码这种HDC1蛋白的一种或多种内源基因或通过引入转录或表达时导致HDC1蛋白表达和/或活性增加的转基因，实现增加HDC1蛋白的表达和/或活性。

因此，可以通过提供含有表达时导致蛋白质活性和/或表达增加的嵌合基因的植物或植物细胞，实现增加HDC1蛋白的活性和或表达以产生具有增加的对胁迫条件的耐受性的植物或植物细胞或具有产量/生物量/生长增加的植物或开花时间更早的植物，例如使用如上文所述的方案。

除非另外指明，否则下文对本文所公开的嵌合基因描述的实施方案也适用于本文所公开的其他方面的各个实施方案。

在另一个实施方案中，本发明提供一种用于增加植物、植物部分、植物器官或植物细胞的胁迫耐受性；或用于增加植物、植物器官或植物部分的生物量或产量或生长；或用于加速植物开花时间的方法，所述方法包括步骤在所述植物、植物部分、植物器官或植物细胞中表达包含以下有效相连的元件的嵌合基因：

i.植物可表达启动子；

ii.核酸，当转录时，所述核酸导致具有由SEQ.ID.NO.6编码的蛋白质的活性的蛋白质的活性和/或表达增加；和

iii.在植物中有功能的参与转录终止和多聚腺苷酸化的3’末端区。

在一个实施方案中，当转录时导致具有由SEQ.ID.NO.6编码的蛋白质的活性的蛋白质的活性和/或表达增加的核酸可以编码靶向植物中存在的内源性HDC1基因的启动子(例如，如SEQ ID NO.1代表的启动子)的激活转录因子，从而内源性HDC1基因的表达增加。这类转录因子可以例如通过非特异性转录增强子连接至序列特异性DNA结合蛋白来设计。设计具有特殊所需位点特异性的转录因子的这类技术例如在Bogdanova和Voytas(2011,Science 333,第1843-1846页)及其中参考文献中描述。

在其他实施方案中，核酸可以本身编码HDC1蛋白，因而增加细胞中有功能的HDC1蛋白的量，所述蛋白如包含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的蛋白质或其功能性变体，例如与上文引用的任何氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或至少99％序列同一性的蛋白质。

在一个具体实施方案中，该核酸编码HDC1蛋白并且包含SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.39的核苷酸序列或其变体，例如与上文引用的任何核苷酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或至少99％序列同一性并编码有功能的HDC1蛋白的核苷酸序列。

两个相关核苷酸序列或氨基酸序列的“序列同一性”(表述为百分数)指两条经最优比对的序列中具有相同残基的位置的数量(x 100)除以比较的位置的数量。空位(即，比对中一个残基存在于一个序列中但不存在于另一个序列中的位置)视为具有不相同残基的位置。根据欧洲分子生物学开放软件包(The European Molecular Biology Open Software Suite)(EMBOSS,Rice等人,2000,Trends in Genetics 16(6):276-277；例如参见http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)中的Needleman和Wunsch总体比对算法(Needleman和Wunsch,1970,J Mol Biol 48(3):443-53)，使用默认设置(空位开放罚分＝10(用于核苷酸)/10(用于蛋白质)和空位延伸罚分＝0.5用于核苷酸)/0.5(用于蛋白质))，通过在整个长度范围内比对两个序列，找到这两个序列的“最优比对”。对于核苷酸，所用的默认计分矩阵是EDNAFULL，并且对于蛋白质，默认计分矩阵是EBLOSUM 62。

基于可获得的序列，技术人员可以分离编码HDC1的基因，而非编码具有上文提到的氨基酸序列的基因或具有上文提到的编码序列的基因。可以通过在严格条件下使用鉴定的核苷酸序列作为探针杂交，鉴定并分离同源核苷酸序列。

可以例如通过以下方式提供“高严格性条件”：在65℃于含有6x SSC(20x SSC含有3.0M NaCl，0.3M Na-柠檬酸盐，pH 7.0)、5x Denhardt(100x Denhardt含有2％Ficoll、2％聚乙烯吡咯烷酮、2％牛血清白蛋白)、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)和作为非特异性竞争物的20μg/ml变性载体DNA(单链鱼精DNA，平均长度为120-3000个核苷酸)的水溶液中杂交。在杂交后，可以在几个步骤中进行高严格性洗涤，在杂交温度于0.2-0.1×SSC，0.1％SDS中进行最终洗涤(约30分钟)。

“中等严格性条件”指与上述溶液中杂交等同但是在约60-62℃的条件。中等严格性洗涤可以在杂交温度于1x SSC，0.1％SDS中进行。

“低严格性”指与上述溶液中杂交等同并在约50-52℃的条件。低严格性洗涤可以在杂交温度于2x SSC，0.1％SDS中进行。还参见Sambrook等人(1989)和Sambrook和Russell(2001)。

也可以使用对编码HDC1的基因特异的寡核苷酸作为引物，如但不限于包含来自已知核苷酸序列或其互补序列的约20个至约50个连续核苷酸或由其组成的寡核苷酸，通过DNA扩增获得编码HDC1的其他序列。

如本文所用，嵌合基因指由有效连接以促使基因表达的异源元件组成的基因，因而这种组合通常在自然界中不存在。因此，术语“异源”指来自不同来源的两个或更多个核酸序列或蛋白质序列之间的关系。例如，如果这种组合正常情况下不存在于自然界中，则启动子相对于有效连接的核酸序列(如编码序列)是异源。此外，特定序列可以”相对于插入该序列的细胞或生物是“异源”的(即不天然存在于这种特定细胞或生物中)。

表述“有效连接”意指所述嵌合基因元件彼此以如此方式连接，从而它们的功能得到协调并允许编码序列的表达，即它们是功能性连接的。例如，当启动子能够确保另一个核苷酸序列转录和最终表达时，则它与所述另一个核苷酸序列功能性连接。如果编码两种蛋白质的核苷酸序列，例如编码转运肽的核酸序列和编码具有HDC1活性的蛋白质的核酸序列以如此方式连接，从而可以形成第一和第二蛋白或多肽的融合蛋白的话，则它们是彼此功能连接或有效连接。

当某基因(例如本发明的嵌合基因)导致表达产物形成时，称该基因表达。表达产物指因转录和任选地翻译编码这类产物的核酸、DNA或RNA而产生的中间产物或终产物，例如本文所述的第二核酸。在转录过程期间，处于调节区、尤其启动子的控制下的DNA序列转录成RNA分子。当RNA分子能够翻译成肽或蛋白质时，这种RNA分子本身可以形成表达产物或是中间产物。当RNA分子作为基因表达的终产物例如能够与另一种核酸或蛋白质相互作用时，称该基因编码该RNA分子作为表达产物。RNA表达产物的例子包括抑制性RNA，例如有义RNA(共抑制作用)、反义RNA、核酶、miRNA或siRNA、mRNA、rRNA和tRNA。当基因表达的终产物是蛋白质或肽时，称该基因编码蛋白质作为表达产物。

如技术人员将充分知晓，各种启动子可以用来促进转录本发明的核酸，即转录时导致HDC1蛋白质活性和/或表达增加的核酸。这类种启动子例如包括组成型启动子、诱导型启动子(例如胁迫诱导型启动子、干旱诱导型启动子、激素诱导型启动子、化学的诱导型启动子等)、组织特异性启动子、发育调节型启动子等。

因此，植物可表达启动子可以是组成型启动子，即能够在大多数细胞类型(以空间-时间非依赖性方式)指导高水平表达的启动子。植物可表达组成型启动子的例子包括细菌源启动子，如来自农杆菌的章鱼碱合酶(OCS)启动子和胭脂碱合酶(NOS)启动子，还包括病毒源启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录物(Hapster等人,1988,Mol.Gen.Genet.212:182-190)或19S RNA基因(Odell等人,1985,Nature.6；313(6005):810-2；美国专利号5,352,605；WO 84/02913；Benfey等人,1989,EMBO J.8:2195-2202)的启动子、增强型2x35S启动子(Kay等人,1987,Science236:1299–1302；Datla等人(1993),Plant Sci 94:139–149)、木薯脉花叶病毒启动子(CsVMV；WO 97/48819、US 7,053,205)、2x CsVMV(WO2004/053135)、圆环病毒(AU 689311)启动子、甘蔗杆状DNA病毒(ScBV)启动子(Samac等人,2004,Transgenic Res.13(4):349-61)、玄参花叶病毒(FMV)启动子(Sanger等人,1990,Plant Mol Biol.14(3):433-43)、地三叶病毒启动子第4号或第7号(WO 96/06932)和如US 5,164,316、US 5,196,525、US 5,322,938、US 5,359,142和US 5,424,200中所述的增强型35S启动子。在植物源启动子当中，将提到以下启动子：来自玉米和向日葵的植物核酮糖-二羧化酶/加氧酶(Rubisco)小亚基启动子(US 4,962,028；WO 99/25842)、拟南芥组蛋白H4基因启动子(Chabouté等人,1987)、玉米、稻和甘蔗的泛素启动子(Holtorf等人,1995,Plant Mol.Biol.29:637-649、US 5,510,474)、稻肌动蛋白1启动子(Act-1，US 5,641,876)、如EP 0507698A1中所述的组蛋白启动子、玉米醇脱氢酶1启动子(Adh-1)(来自http://www.patentlens.net/daisy/promoters/242.html))。来自菊属(Chrysanthemum)的小亚基启动子如果与使用相应终止子组合，则也可以使用(Outchkourov等人,Planta,216:1003–1012,2003)。

应答于环境信号、激素信号、化学信号、发育信号并以组织活性方式调节基因表达的多种植物基因启动子可以用于在植物中表达序列。启动子的选择主要基于目的表型并且由这类因素如组织(例如，种子、果实、根、花粉、脉管组织、花、心皮等)、可诱导性(例如，应答于创伤、热、冷、干旱、光、病原体等)、时序、发育阶段等决定。

可以用来实施本发明的额外启动子是应答于胁迫而激发表达的那些，如应答于干旱、低温、盐胁迫或暴露于ABA而激活的RD29启动子(Yamaguchi-Shinozaki等人,2004,Plant Cell,第6卷,251-264；WO12/101118)，还有应答于热(例如，参见Ainley等人(1993)Plant Mol.Biol.22:13-23)、光(例如，豌豆rbcS-3A启动子，Kuhlemeier等人(1989)Plant Cell 1:471-478；和玉米rbcS启动子，Schaffher和Sheen(1991)PlantCell 3:997-1012)；创伤(例如，wunl，Siebertz等人(1989)Plant Cell 1:961-968)；病原体(如Buchel等人(1999)Plant Mol.Biol.40:387-396中所述的PR-I启动子和Manners等人(1998)Plant Mol.Biol.38:1071-1080中描述的PDF 1.2启动子)和化学物如茉莉酸甲酯或水杨酸(例如，参见Gatz(1997)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48:89-108)而诱导的启动子。此外，可以通过使用多种启动子如在衰老(例如，参见Gan和Amasino((1995)Science 270:1986-1988)或晚期种子发育(例如，参见Odell等人,(1994)Plant Physiol.106:447-458)时发挥作用的那些启动子控制表达时序。

也可以利用盐诱导型启动子如稻地方品种Pokkali(PKN)盐诱导型NHX1启动子(Jahan等人,,6^th International Rice Genetics symposium,2009，海报摘要第4-37页)、盐芥(Thellungiella halophila)液泡H+-焦磷酸酶(TsVP1)的盐诱导型启动子(Sun等人,,BMC Plant Biology 2010,10:90)、编码磷脂过氧化氢同工型gpx1的甜橙(Citrus sinensis)基因的盐诱导型启动子(Avsian-Kretchmer等人,Plant Physiology 2004年7月第135卷,第1685-1696页)。

在可选实施方案中，使用组织特异性和/或发育阶段特异性启动子，例如，仅可以在该组织内部在某发育阶段时间框架内促进转录的启动子。参见，例如，Blazquez(1998)Plant Cell 10:791-800，其表征了拟南芥LEAFY基因启动子。还参见Cardon(1997)Plant J 12:367-77，其描述了识别拟南芥花分生组织身份基因API启动子区内保守序列基序的转录因子SPL3；和Mandel(1995)Plant Molecular Biology,第29卷,第995-1004页，其描述分生组织启动子eIF4。可以使用在特定组织整个生活周期有活性的组织特异性启动子。在一个方面，本发明的核酸与主要仅在棉纤维细胞中有活性的启动子有效连接；在一个方面，本发明的核酸与主要在棉纤维细胞伸长阶段期间有活性的启动子有效连接，例如，如Rinehart(1996)上文描述。这些核酸可以与棉纤维细胞(Ibid)中偏好表达的Fbl2A基因启动子有效连接。还参见，John(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5769-5773；John等人,美国专利号5,608,148和5,602,321，其描述棉纤维特异性启动子和用于构建转基因棉花植物的方法。根特异性启动子也可以用来表达本发明的核酸。根特异性启动子的例子包括来自醇脱氢酶基因的启动子(DeLisle(1990)Int.Rev.Cytol.123:39-60)和多种启动子如美国专利号5,618,988、5,837,848和5,905,186中公开的那些。可以用来表达本发明核酸的其他启动子例如包括胚珠特异性、胚特异性、胚乳特异性、珠被特异性、种皮特异性启动子或其一些组合；叶特异性启动子(参见，例如，Busk(1997)PlantJ.11：12851295，其描述玉米中的叶特异性启动子)；来自发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的ORF13启动子(其在根中显示出高活性，参见，例如，Hansen(1997)上文)；玉米花粉特异性启动子(参见，例如，Guerrero(1990)Mol.Gen.Genet.224:161168)；可以使用在果实成熟、叶衰老和脱落期间有活性的番茄启动子、防卫细胞偏好性启动子，例如PCT/EP 12/065608中所述和更低程度上花的防卫细胞偏好性启动子(参见，例如，Blume(1997)Plant J.12:731746)；来自马铃薯SK2基因的雌蕊特异性启动子(参见，例如，Ficker(1997)Plant Mol.Biol.35:425431)；在转基因苜蓿营养性和花枝顶端的表皮组织中有活性的豌豆Blec4基因，这使得该基因成为一种将外来基因表达靶向正在活跃生长的枝条或纤维的表皮层的有用工具；胚珠特异性BELl基因(参见，例如，Reiser(1995)Cell83:735-742,GenBank No.U39944)；和/或，在Klee的美国专利号5,589,583中的启动子，所述文献描述了植物启动子区能够在分生组织和/或快速分裂的细胞中赋予高水平转录。可以根据本发明使用的其他组织特异性启动子包括种子特异性启动子(如美国专利号5,773,697中描述的油菜籽蛋白、菜豆蛋白或DC3启动子)、在果实成熟期间有活性的果实特异性启动子(如dru1启动子(美国专利号5,783,393))，或2Al1启动子(例如，参见美国专利号4,943,674)和番茄多聚半乳糖醛酸酶启动子(例如，参见Bird等人,(1988)Plant Mol.Biol.11:651-662)、花特异性启动子(例如，参见Kaiser等人,(1995)Plant Mol.Biol.28:231-243)、花粉活性启动子，如PTA29、PTA26和PTAl3(例如，参见美国专利号5,792,929)和如例如Baerson等人,(1994Plant Mol.Biol.26:1947-1959)中所述、在维管组织(例如，参见Ringli和Keller(1998)Plant Mol.Biol.37：977-988)、心皮(例如，参见OhI等人,(1990)Plant Cell 2:)、花粉和胚珠(例如，参见Baerson等人,(1993)Plant Mol.Biol.22：255-267)中有活性的启动子。在可选实施方案中，暴露于植物激素如植物生长素时可诱导的植物启动子用来表达用于实施本发明的核酸。例如，本发明可以使用大豆(Glycine max L.)中的植物生长素应答元件El启动子片段(AuxREs)(Liu(1997)Plant Physiol.115:397-407)；植物生长素应答性拟南芥GST6启动子(还应答于水杨酸和过氧化氢)(Chen(1996)Plant J.10:955-966)；来自烟草的植物生长素诱导型parC启动子(Sakai(1996)37：906-913)；植物生物素应答元件(Streit(1997)Mol.Plant MicrobeInteract.10:933-937)；和应答于胁迫激素脱落酸(ABA)的启动子(Sheen(1996)Science 274:1900-1902)。可以使用的其他激素诱导型启动子包括植物生长素诱导型启动子(如在van der Kop等人,(1999)Plant Mol.Biol.39:979-990或Baumann等人,(1999)Plant Cell 11:323-334中描述的那种)、细胞分裂素诱导型启动子(例如，参见Guevara-Garcia(1998)Plant Mol.Biol.38:743-753)、应答于赤霉素的启动子(例如，参见Shi等人,(1998)Plant Mol.Biol.38:1053-1060，Willmott等人,(1998)Plant Molec.Biol.38:817-825)等。

在可选实施方案中，用来实施本发明的核酸也可以与暴露于可以向植物施加的化学剂如除草剂或抗生素时可诱导的植物启动子有效连接。例如，可以使用被苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉米In2-2启动子(De Veylder(1997)Plant Cell Physiol.38:568-577)；施加不同的除草剂安全剂诱导不同的基因表达模式，包括在根、排水器和枝条顶端分生组织中表达。编码序列可以处在例如四环素诱导型启动子(例如，如采用含有燕麦(Avena sativaL.)(燕麦)精氨酸脱羧酶基因的转基因烟草植物时所述那样(Masgrau(1997)Plant J.11:465-473))或水杨酸应答元件(Stange(1997)Plant J.11:1315-1324)控制下。使用化学(例如激素或杀虫剂)诱导型启动子，即，应答于可以向田间转基因植物施加的化学品的启动子，本发明多肽的表达可以在植物特定发育阶段处被诱导。也可以利用雌激素诱导型表达系(如美国专利6,784,340和Zuo等人(2000,Plant J.24:265-273)中所述)驱动用来实施本发明的核酸表达。

在可选实施方案中，可以使用其宿主范围限于靶植物物种如玉米、稻、大麦、小麦、马铃薯或其他作物的在作物任何发育阶段可诱导的启动子。

在可选实施方案中，组织特异性植物启动子可以驱动有效连接的序列在除靶组织之外的组织中表达。在可选实施方案中，使用偏好在靶组织或细胞类型中驱动表达但也可以在其他组织中引起一些表达的组织特异性启动子。

在可选实施方案中，可以利用例如

http://arabidopsis.med.ohio-state.edu/AtcisDB/bindingsites.html.中描述的启动子元件，它们组合时应当产生有功能的启动子。

根据本发明，也可以利用与启动子组合的位于启动子和编码序列之间的其他调节序列，如转录激活蛋白(“增强子”)，例如在申请WO 87/07644中描述的烟草花叶病毒(TMV)的翻译激活蛋白或例如Carrington和Freed1990,J.Virol.64:1590-1597描述的烟草蚀纹病毒(TEV)的翻译激活蛋白。

增强HDC1表达和/或活性的其他调节序列也可以位于嵌合基因中。这类调节序列的一个例子是内含子。内含子是存在于前mRNA中但在通过精确剪接机制切除之后不存在于成熟RNA中的间插序列。天然内含子增强基因表达的能力，称作内含子介导增强(IME)的过程，已经在各种生物包括哺乳动物、昆虫、线虫和植物中已知(WO 07/098042，第11-12页)。通常将IME描述为通过稳定转录物导致基因表达增加的转录后机制。内含子需要在启动子和编码序列之间以正常方向安置。然而，也已经描述一些内含子影响翻译、充当启动子或充当位置和方向非依赖性转录增强子发挥功能(Chaubet-Gigot等人,2001,Plant Mol Biol.45(1):17-30,第27-28页)。

含有这类内含子的基因的例子包括来自稻肌动蛋白1基因(参见US5641876)、稻肌动蛋白2基因、玉米蔗糖合酶基因(Clancy和Hannah,2002,Plant Physiol.130(2):918-29)、玉米醇脱氢酶-1(Adh-1)和Bronze-1基因(Callis等人,1987Genes Dev.1(10):1183-200；Mascarenhas等人,1990,Plant Mol Biol.15(6):913-20)、玉米热休克蛋白70基因(参见US 5593874)、玉米Shrunken基因、马铃薯(Solanum tuberosum)光敏1基因和矮牵牛(Petunia hybrida)热休克蛋白70基因(参见US5659122)、来自苜蓿的替代组蛋白H3基因(Keleman等人,2002Transgenic Res.11(1):69-72)和拟南芥替代组蛋白H3(组蛋白H3.3样)基因(Chaubet-Gigot等人,2001,Plant MolBiol.45(1):17-30)的5’内含子。

其他适合的调节序列包括5'UTR。如本文所用，5'UTR，也称作前导序列，是信使RNA(mRNA)的一个特定区域，其位于转录起始位点和编码区的起始密码子之间。它参与mRNA稳定性和翻译效率。例如，35S转录起始位点下游的碧冬茄叶绿素a/b结合蛋白基因的5'非翻译前导序列可以用来增进报道基因表达的稳态水平(Harpster等人,1988,Mol Gen Genet.212(1):182-90)。WO 95/006742描述了来自编码热休克蛋白的基因的5'非翻译前导序列序列增加转基因表达的用途。

嵌合基因还可以包含在植物细胞中有效3’末端区，即转录终止或多聚腺苷酸化序列。作为转录终止或多聚腺苷酸化序列，可以利用细菌来源的任何相应序列，如例如根癌农杆菌nos终止子；病毒来源的任何相应序列，如例如CaMV 35S终止子，或植物来源的任何相应序列，如例如在公布的专利申请EP 0,633,317A1中所述的组蛋白终止子。多聚腺苷酸化区可以源自天然基因、来自多种其他植物基因或来自T-DNA。待添加的3'末端序列可以源自例如胭脂碱合酶基因或章鱼碱合酶基因或备选地来自另一种植物基因或较少优选地来自任何其他真核基因。

可以应用的其他增加表达的措施是优化在靶生物中用于表达的编码区，这可以包括改造密码子选择、CG含量和清除不想要的核苷酸序列(例如成熟前多聚腺苷酸化信号、隐蔽型内含子剪接位点、ATTTA五聚物，CCAAT框序列、因形成RNA二级结构影响前mRNA剪接的序列如长CG片段或AT片段)。

还可以进一步修饰嵌合基因的编码序列，以增加蛋白质稳定性、防止蛋白质降解、提高编码的HDC1蛋白的蛋白质活性，例如通过引入或删除参与翻译后修饰的位点，如SUMO化(sumoylation)、遍在蛋白化、磷酸化等。

如SEQ ID NO.6所代表的HDC1序列含有数量相对高的预测的SUMO化位点，显示SUMO化在维持HDC1蛋白水平/活性中发挥重要作用。与随机选择长度相似的蛋白质时7–14％相比，涉及约20％的赖氨酸。该概率评分极高(例如对于K273、K426、K192是94％)并且位点在其他植物物种的HDC1序列，如上文描述的HDC1序列中充分保守。SUMO化作为抵抗HDC1蛋白降解的保护性机制得到以下研究结果支持：敲除SUMO E3连接酶SIZ1造成ABA-超敏感性并且因此拟表型hdc1敲除植物(Miura等人,(2009)PNAS 13,5418-5423)。Miura等人发现敲除将SUMO1蛋白与SUMO化靶蛋白连接的SUMO1ER连接酶(SIZ1)造成ABA-敏感性。这表明HDC1功能(不论因内源基因表达，还是因引入的转基因产生)可以通过过量表达SUMO E3连接酶进一步增强。

为了进一步增加HDC1功能性表达，可以如此修饰编码HDC1蛋白的嵌合基因的核酸，从而编码的HDC1蛋白更密切地与HDAC蛋白相互作用，例如通过优化HDAC结合位点或引入更多HDAC结合位点。

在又一个实施方案中，增加HDC1(即具有由SEQ.ID.NO.6编码的蛋白质的活性的蛋白质)功能性表达(即表达和/或活性)，可以通过修饰编码HDC1蛋白的内源基因实现。这可以通过例如T-DNA活化标签法、诱变(例如EMS诱变)或通过定向基因组工程化技术进行。例如使用这类技术，可以如此修饰内源启动子，从而它驱动更高水平的表达，或可以将内源启动子替换为更强的启动子，或可以将提高mRNA稳定性、翻译效率、蛋白质活性和/或稳定性的突变引入编码区，类似于用于增强引入的嵌合基因表达的上述方法。

T-DNA活化标签法(Memelink,2003,Methods Mol Biol.236:345)是一种通过随机插入携带T-DNA的启动子元件或增强子元件激活内源基因的方法，所述元件可以引起侧翼植物基因的转录激活。该方法可以由使用专用T-DNA构建体产生许多转化的植物或植物细胞，随后选择所需表型组成。

定向基因组工程化涉及向基因组中产生预期和定向的修饰。这类预期修饰可以是在特定基因组位置插入，缺失特定内源序列，和替换内源序列。定向基因组工程化可以基于同源重组。增加HDC1内源基因功能性表达的定向基因组工程化可以由在HDC1编码序列前方插入比内源启动子更强的启动子或插入增加启动子活性的增强子组成。这类技术也可以适用于例如插入增加RNA稳定性或增强编码的mRNA翻译的元件，或修饰编码序列以增强翻译、蛋白质稳定性和活性，这类似于用于增强引入的嵌合基因表达的上述方法。

如本文所用，“诱变”，指其中植物细胞接受一项技术处理的过程，所述技术在细胞的DNA中诱导突变，如接触于诱变剂，如化学物质(如甲磺酸乙酯(EMS)、乙基亚硝基脲(ENU)等)或电离辐射(中子(如在的快中子诱变中等)、α射线、伽玛射线(如钴60源供应)、X射线、UV辐射等)或定向诱变方法，例如借助寡核苷酸(例如技术)。根据需要，这些方法也可以用于修饰编码HDC1的内源性基因。

可以根据本领域已知的各种方法如(定量)RT-PCR、Northern印迹、微阵列分析、Western印迹法、ELISA等，测量蛋白质的转录物(例如mRNA)表达。

如本文所用，增加的表达，指表达水平增加至少2％、或至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少30％、或至少40％、或至少50％或甚至更多。所述增加是相对于对照植物中表达的增加。

如本文所用，胁迫条件，例如指因以下情况引起的胁迫：施加化学化合物(例如，除草剂、杀真菌剂、杀虫剂、植物生长调节剂、佐剂、肥料)、暴露于非生物胁迫(例如，干旱、水涝、淹没、强光条件、高UV辐射、过氧化氢水平升高、极端(高或低)温度、臭氧和其他大气污染物、土壤盐度或重金属、低氧、缺氧、渗透胁迫、氧化胁迫、低养分水平如氮或磷等)或生物性胁迫(例如，病原体或害虫感染，包括被真菌、病毒、细菌、昆虫、线虫、支原体和支原体样生物等感染)。胁迫也可以由激素如ABA或影响激素活性的化合物引起。

干旱、盐度、极端温度、高光胁迫和氧化胁迫已知是相互联系的，并且可以通过相似的机制引起生长损害及细胞损害。Rabbani等人(PlantPhysiol(2003)133:1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间极高程度的“交互作用”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。氧化胁迫，其经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫，可以造成功能蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长停滞。

应用本发明的教导，与对照植物相比，无论植物处于非胁迫条件下或无论植物暴露于各种轻度或中度胁迫条件，均出现产量和/或生长速率的增加。植物一般通过生长得更慢而应答暴露于胁迫。在严重胁迫或长期胁迫的情况下，植物甚至可能完全停止生长。另一方面，中度胁迫的条件在本文中定义为植物所暴露的任何胁迫，其不导致植物完全停止生长，但同时不能恢复生长。与非胁迫条件下的对照植物相比时，中度胁迫在本发明的意义下导致受胁迫植物的生长降低为小于40％、35％或30％、优选地小于25％、20％或15％、更优选地小于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的进步，栽培的作物植物中并不经常遭遇严重胁迫。因此，由中度胁迫引起的受损生长往往对农业而言是不受欢迎的特征。中度胁迫是植物在标准农业条件下所暴露的生物胁迫和/或非生物(环境)胁迫。例如，认为如以下实施例中所述的胁迫构成中等或中度胁迫条件。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。

相对于本发明，可以通过降低植物的ABA敏感性，如根据本发明增加HDC1蛋白的活性和/或表达情况下那样，代偿中度胁迫对植物的影响。同样地，严重胁迫不能通过降低ABA敏感性代偿，并且在这种情况下可以优选减少本发明HDC1蛋白的活性和或表达，如下文将进一步描述。

如本文所用的“对照植物”通常是相同物种的植物，所述植物具有HDC1的野生型水平。如本文所用，“HDC1的野生型水平”指植物中HDC1蛋白如同它在自然界中最常见存在的一般水平。因此尚未向所述对照植物提供表达时增加HDC1表达和/或活性的核酸分子，也没有向它提供表达时减少HDC1表达和/或活性的核酸分子。

本领域可获得多种方法以测量植物、植物部分、植物细胞或种子对各种胁迫的耐受性，其中某些方法在以下实施例中描述。增加的胁迫耐受性通常将从植物的总体外观表现并且可以例如通过生物量产生增加、不利条件下继续营养生长或较高种子产量来测量。胁迫耐受性植物具有更宽生长谱，即与对照植物相比，它们能够在不损失产量情况下承受更宽范围的气候性变化和其他非生物变化。在生物化学上，胁迫耐受性可以表现为与胁迫条件下的对照植物相比，胁迫耐受性植物的NAD+-NADH/ATP含量更高和产生更少活性氧。胁迫耐受性也可以表现为与相同条件下的对照植物比较，胁迫耐受性植物在胁迫条件下的叶绿素含量更高、萌发率更高、光合作用更高和叶绿素荧光更低。

显然，也不要求在不利条件下连续培育植物以便胁迫耐受性变得显而易见。通常，甚至在生长期间仅遭遇相对短时间的不利条件时，根据本发明产生的植物或植物细胞和对照植物或植物细胞之间的胁迫耐受性差异将变得明显。

如本文所用，产量或生物量指种子数量/重量、果实数/重量、鲜重、干重、叶数/叶面积、植物高度、分支、圆蒴数/大小、纤维长度、种子含油量、种子蛋白质含量、种子含糖量。如本文所用，增加的生长速率指生长或向构成前述植物器官的一种或多种这些细胞或组织的分配增加的阶段。

生物量或产量或生长的增加可以至少2％、或至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少30％、或至少40％、或至少50％的增加。所述增加是相对于对照植物生物量或产量或生长的增加。

脱落酸(ABA)是一种在许多植物发育过程(包括种子休眠)中发挥作用的植物激素。另外，ABA在植物中介导对水胁迫、高盐胁迫、冷胁迫(Mansfield 1987,第411–430页引自：P.J.Davies(编辑).Plant hormonesand their role in plant growth and development.Martinus NijhoffPublishers,Dordrecht；Yamaguchi-Shinozaki 1993,Plant Physiol.101,1119-1120；Yamaguchi-Shinozaki 1994,Plant Cell 6,251-264)和植物病原体(Seo和Koshiba,2002,Trends Plant Sci.7,41–48))反应时的胁迫应答。ABA是部分借助叶绿体和其他质体中甲羟戊酸途径产生的倍半萜样(15-碳)。它部分地在叶绿体中合成并且因此，生物合成主要出现在叶中。ABA的产生因胁迫如失水和冰冻温度而增加。认为生物合成间接地通过产生类胡萝卜素发生。已知与脱落酸相关的生理应答包含刺激气孔关闭、抑制幼苗或枝条生长、诱导种子中贮藏蛋白合成和抑制赤霉素对刺激性α-淀粉酶从头合成的影响。基础ABA水平可以在植物间明显不同。例如在非胁迫的拟南芥叶中，ABA基础浓度是2ng/g至3ng/g鲜重(Lopez-Carbonell和Jàuregui，2005)。在水胁迫条件下，ABA浓度达到10ng/g至21ng/g鲜重。

ABA敏感性可以例如如下文所述测量。ABA敏感性也可以通过测量气孔孔径(Zhang等人,2009,EurAsia J BioSci 3,10-16)，测量离子电流(Armstrong等人,1995,PNAS 92:9520-4；Marten等人,Plant Physiol.第143卷,28037)或借助微阵列、RNA测序、RT-PCR或RNA凝胶印迹测量ABA-依赖性基因表达(Hoth等人,2002,Journal of Cell Science 115,4891-4900)进行测量。

ABA敏感性的下降可以是至少2％、或至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少30％、或至少40％、或至少50％的下降。所述下降是相对于对照植物的ABA敏感性而言下降。

因此，与对照植物相比，尤其在不利条件如限水条件下，根据本发明产生的具有增加的HDC1表达和/或活性的植物可以具有至少一个以下表型，所述表型包括但不限于：与正常生长条件下或不利条件如水限制条件下的未修饰植物相比，总体植物产量增加、根质量增加、根长度增加、叶尺寸增加、穗尺寸增加、种子尺寸增加、胚乳尺寸增加、直立性(standability)改善、胚胎和胚乳的相对大小改变(导致种子中蛋白质、油和/或淀粉的相对水平改变)、叶发育改变、叶数改变、叶表面改变、维管系统改变、节间改变、叶衰老改变、不存在雄穗、不存在携带有功能花粉的雄穗或植物尺寸增加。

在某些实施方案中，本发明提供用于增强严重胁迫条件下植物、植物部分、植物器官或植物细胞存活的方法、用于增强严重胁迫后植物、植物部分、植物器官或植物细胞恢复的方法，或用于延迟植物开花时间的方法，所述方法包括步骤：减少在植物、植物部分、植物器官或植物细胞中具有由SEQ.ID.NO.6编码的蛋白质的活性的蛋白质(HDC1蛋白)的功能性表达(表达和/或活性)。

已经显示在一段严重干旱胁迫时间(9日)后，与野生型植物相比时，ABA-超敏感性植物显示改善的恢复(Tran等人,2004,Plant Cell 16,2481-2498，所述文献通过引用方式并入本文)。由于现在已经显示HDC1下调(例如敲除)增加ABA敏感性，所以认为严重胁迫下通过增加ABA敏感性下调HDC1可以提高植物存活/恢复。优选地，HDC1下调是可诱导的，因为认为具有组成型低水平HDC1和同时具有ABA超敏感性的植物在对照条件下具有生长损失。

降低或消除植物或植物细胞中HDC1的活性可以例如通过向植物或植物细胞中引入可以抑制HDC1多肽表达或功能的核酸、通过阻止HDC1信使RNA转录或翻译来直接实现，或通过编码抑制编码HDC1多肽的HDC1基因转录或翻译的多肽来间接实现。将这类核酸称作编码HDC1抑制性RNA分子。用于抑制或消除植物中基因表达的方法是本领域熟知的，并且可以在本发明中使用任一种这样的方法抑制HDC1多肽的表达。在其他实施方案中，将编码抑制HDC1多肽活性的多肽的核酸引入植物或植物细胞中。许多方法可以用来降低或消除HDC1多肽的活性。

根据本发明，如果转录物或蛋白质水平统计地低于尚未修饰以抑制HDC1表达的植物中该HDC1的转录物水平或蛋白质水平，则抑制HDC1的表达。在本发明的具体实施方案中，HCD1的转录物或蛋白质水平可以小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、或小于5％的在不是突变体或尚未修饰以抑制该HDC1表达的植物中相同HDC1的mRNA水平或蛋白质水平。

在本发明的一些实施方案中，向植物或植物细胞中引入诱导表达时抑制植物或植物细胞中HDC1表达的核酸。下文给出抑制HDC1多肽表达的核酸的例子。

在本发明的一些实施方案中，可以通过有义抑制作用或共抑制作用抑制HDC1多肽表达。为了共抑制，将嵌合基因或表达盒设计成表达与编码HDC1多肽的信使RNA的全部或部分在“有义方向”对应的RNA分子。用于共抑制的核酸可以对应于编码HDC1多肽的序列的全部或部分、HDC1多肽转录物的5'和/或3'非翻译区的全部或部分或编码HDC1多肽的转录物的编码序列和非翻译区二者的全部或部分。用于共抑制或其他基因沉默方法的核酸可以与靶序列共有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、85％、80％或更小的序列同一性。当核酸(例如，SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37或SEQ ID NO.39)的部分用来破坏靶基因的表达时，通常，可以使用至少15、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900或1000个或更多个连续核苷酸的序列。在核酸包含HDC1多肽的全部或部分编码区的一些实施方案中，嵌合基因设计成消除多核苷酸的起始密码子，从而将不翻译蛋白质产物。随后可以筛选用共抑制嵌合基因转化的多个植物株系以鉴定显示所需(诱导型)HDC1多肽表达抑制的那些株系。

在本发明的一些实施方案中，可以通过反义抑制作用获得抑制HDC1多肽表达。为了反义抑制，嵌合基因或表达盒设计成表达与编码HDC1多肽的信使RNA的全部或部分互补的RNA分子。反义RNA分子的过量表达可以导致天然基因的表达减少。用于反义抑制的多核苷酸可以对应于编码HDC1多肽的序列的互补序列的全部或部分、HDC1转录物的5'和/或3'非翻译区的互补序列的全部或部分或编码HDC1多肽的转录物的编码序列和非翻译区二者的互补序列的全部或部分。此外，反义核酸可以完全互补于(即100％与靶序列的互补序列相同)或部分互补于(即小于100％，包括但不限于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、85％、80％与靶序列的互补序列相同，在一些实施方案中，所述靶序列是SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQID NO.37或SEQ ID NO.39)靶序列。另外，反义核苷酸的部分可以用来破坏靶基因的表达。通常，可以使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、400、450、500、550个或更多个核苷酸的序列。随后可以筛选用反义嵌合基因转化的多个植物株系以鉴定显示所需(诱导型)HDC1多肽表达抑制的那些株系。使用反义抑制作用抑制植物中内源基因表达的方法例如在US 5759829中描述，所述文献通过引用的方式并入本文。

在本发明的一些实施方案中，可以通过双链RNA(dsRNA)干扰作用抑制HDC1多肽表达。为了dsRNA干扰，在相同细胞中表达有义RNA分子(如上文对共抑制作用描述的那种)和完全或部分互补于有义RNA分子的反义RNA分子，导致抑制相应内源信使RNA的表达。可以通过设计同时包含有义序列和反义序列的嵌合基因，实现有义分子和反义分子的表达。可选地，分立的嵌合基因可以用于有义序列和反义序列。随后可以筛选用一种或多种dsRNA干扰嵌合基因转化的多个植物株系以鉴定显示所需(诱导型)HDC1多肽表达抑制的植物株系。使用dsRNA干扰作用抑制内源植物基因表达的方法在WO 9949029、WO 9953050、WO 9961631和WO0049035中描述，所述文献的每一篇通过引用的方式并入本文。

在本发明的一些实施方案中，可以通过发夹RNA(hpRNA)干扰作用或含有内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰作用抑制HDC1多肽表达。这些方法在抑制内源基因表达方面高度有效。参见，Waterhouse和Helliwell,(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38及其中引用的参考文献。对于hpRNA干扰，将嵌合基因设计成表达这样的RNA分子，所述RNA分子与自身杂交以形成包含单链环区和碱基配对茎的发夹结构。碱基配对茎区包含与编码待抑制其表达的基因的内源信使RNA的全部或部分相对应的有义序列和与有义序列完全或部分互补的反义序列。反义序列可以位于有义序列“上游”(即反义序列可以比有义序列更靠近驱动发夹RNA表达的启动子)。碱基配对茎区可以对应于控制待抑制基因的表达的启动子序列的一部分。设计成表达具有发夹结构的RNA分子的核酸包含第一核苷酸序列和作为第一核苷酸序列的互补序列的第二核苷酸序列，并且其中第二核苷酸序列相对于第一核苷酸序列处于逆转取向。因此，分子的碱基配对茎区通常决定RNA干扰的特异性。有义序列和反义序列通常具有相似的长度，但是可以长度不同。因此，这些序列可以是具有至少10、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、50、70、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、500、600、700、800、900个核苷酸长度或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10kb长度的部分或片段。嵌合基因环区域可以在长度上变动。因此，环区域可以具有至少10、20、30、40、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900个核苷酸长度或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10kb的长度。hpRNA分子在抑制表达内源基因时高度有效，并且它们诱导的RNA干扰由植物后续世代遗传。参见，例如，Waterhouse和Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38。针对hpRNA构建体体内沉默基因表达的效率的瞬时测定法已经由Panstruga等人,(2003)Mol.Biol.Rep.30:135-140描述，所述文献通过引用方式并入本文。对于ihpRNA，干扰分子具有与hpRNA相同的总体结构，但是RNA分子额外地在发夹的环中包含在表达ihpRNA的细胞内能够受到剪接的内含子。内含子的使用使得剪接后发夹RNA分子中环的尺寸最小化，并且这增加干扰效率。参见，例如，Smith等人(2000)Nature407:319-320。实际上，Smith等人利用ihpRNA介导的干扰作用显示100％抑制内源基因表达。在一些实施方案中，内含子是ADHl内含子1。利用ihpRNA干扰作用抑制内源植物基因表达的方法例如在Smith等人,(2000)Nature 407:319-320；Waterhouse和Helliwell,(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38；Helliwell和Waterhouse,(2003)Methods 30:289-295和US2003180945中描述，所述文献的每一篇通过引用的方式并入本文。

也可以如此设计用于hpRNA干扰的嵌合基因，从而有义序列和反义序列并不对应于内源RNA。在这个实施方案中，有义序列和反义序列侧接环序列，所述环序列包含与靶基因的内源信使RNA全部或部分相对应的核苷酸序列。因此，正是环区域决定RNA干扰的特异性。参见例如通过引用方式并入本文的WO0200904。

扩增子嵌合基因包含来自植物病毒的序列，所述序列含有靶基因的全部或部分，但是通常不含有天然病毒的全部基因。在嵌合基因的转录产物中存在的病毒序列允许转录产物指引其自身复制。由扩增子产生的转录物可以相对于靶序列是有义或反义的(即，HDC1多肽的信使RNA)。利用扩增子抑制内源植物基因表达的方法例如在US 6635805中描述，所述文献通过引用的方式并入本文。

在一些实施方案中，本发明嵌合基因表达的核酸是催化性RNA或具有对HDC1多肽的信使RNA特异的核酶活性。因此，多核苷酸造成内源信使RNA降解，导致HDC1多肽的表达减少。这种方法例如在通过引用方式并入本文的US 4987071中描述。

在本发明的一些实施方案中，可以通过表达编码微RNA(miRNA)的核酸进行RNA干扰，获得对HDC1多肽表达的抑制。miRNA是由约22个核糖核苷酸组成的调节物质。miRNA在抑制内源基因表达方面高度有效。参见，例如Javier等人,(2003)Nature 425:257-263，所述文献通过引用方式并入本文。对于miRNA干扰，将嵌合基因设计成表达基于内源前miRNA基因建模的RNA分子，其中将内源miRNA和miRNA*序列替代为靶向HDC1mRNA的序列。miRNA基因编码形成发夹结构的RNA，所述发夹结构含有18-22个核苷酸，例如与另一个内源基因(靶序列)互补的21核苷酸序列。为了抑制HDC1，18-22个核苷酸序列选自靶转录物序列并且含有有义方向(miRNA*序列)的所述靶序列的18-22核苷酸和与有义序列互补并与靶mRNA(miRNA序列)互补的相应反义序列。不要求miRNA和其靶之间的完美互补性，而是允许一些错配。还允许miRNA序列和miRNA*序列之间高至4个错配。miRNA分子在抑制表达内源基因方面高度有效，并且它们诱导的RNA干扰由植物后续世代遗传。

在一个实施方案中，核酸编码与编码HDC1多肽的基因结合的锌指蛋白，导致基因的表达减少。在具体的实施方案中，锌指蛋白与HDC1基因的调节区结合。在其他实施方案中，锌指蛋白与编码HDC1多肽的信使RNA结合并阻止其翻译。选择由锌指蛋白靶向的位点的方法已经例如在US 6453242中描述，并且使用锌指蛋白抑制植物中基因表达的方法例如在US 2003/0037355中描述，所述文献的每一篇通过引用的方式并入本文。

在另一个实施方案中，核酸编码与编码HDC1多肽的基因结合的TALE蛋白，导致基因的表达减少。在具体的实施方案中，TALE蛋白与HDC1基因的调节区结合。在其他实施方案中，TALE蛋白与编码HDC1多肽的信使RNA结合并阻止其翻译。选择由TALE蛋白靶向的位点的方法已经例如在Moscou MJ,Bogdanove AJ(2009)(A simple cipher governsDNA recognition by TAL effectors.Science 326:1501)和Morbitzer R,Romer P,Boch J,Lahaye T(2010)(Regulation of selected genome lociusing de novo-engineered transcription activator-like effector(TALE)-typetranscription factors.Proc Natl Acad Sci USA 107:21617–21622)中描述。

在一些实施方案中，可以将多肽或编码多肽的核酸引入植物，其中编码的多肽能够抑制HDC1多肽的功能性表达或活性。

在一个实施方案中，能够抑制HDC1多肽的功能性表达或活性的蛋白质或多肽例如包括编码抗体(或纳米体等)的核酸，所述抗体与HDC1多肽结合并降低其活性。在另一个实施方案中，抗体的结合导致细胞质量控制机制对抗体-HDC1复合物的周转增加。本领域熟知在植物细胞中表达抗体和在植物细胞中通过表达抗体及其与蛋白质的结合抑制分子途径。参见，例如，Conrad和Sonnewald,(2003)Nature Biotech.21:35-36,所述文献通过引用方式并入本文。

在另一个实施方案中，能够抑制HDC1多肽的功能性表达或活性的蛋白质也可以是显性负性HDC1蛋白或蛋白片段。显性负性HDC1蛋白可能例如是其中已经修饰例如移除HDAC结合位点，因而抑制HDAC功能的HDC1蛋白。

在一个备选实施方案中，植物或植物细胞可以与通过触发靶蛋白(干扰肽)聚集而干扰HDC1功能的分子接触，如WO 2007/071789和WO2008/148751中所描述。

在甚至又一个实施方案中，植物或植物细胞可以与对HDC1特异的所谓α体接触，所述α体是可以拮抗蛋白功能的非天然蛋白质分子，如WO2009/030780、WO 2010/066740和WO 2012/092970中所描述。

由于非胁迫或轻度或中度胁迫条件下HDC1功能降低通常是不利的，应当理解在上述方法中，减少HDC1表达和/或活性优选地是在需要减少HDC1表达和/或功能的条件如严重胁迫条件下可诱导或可由所述条件诱导的。如本领域技术人员将轻易地理解，植物或植物细胞中表达的上述核酸的诱导型表达与诱导型启动子有效关联，所述诱导型表达导致抑制植物或植物细胞中HDC1表达和/或活性。上文详述一系列诱导型启动子。

在可选实施方案中，可以在需要的时刻使用含抑制性核酸如RNA或DNA分子的喷雾剂(全身性应用)诱导HDC1下调，所述抑制性核酸在靶向内源性HDC1的RNA介导的基因沉默中发挥作用(类似于上述分子)，例如WO 2011/112570中所描述(所述文献通过引用方式并入本文)。

在其他实施方案中，本发明提供包含核酸的嵌合基因，其中所述核酸在转录时导致增加或减少的HDC1活性和/或表达，如上文详述。在本发明中还包括嵌合基因或包含嵌合基因的载体。

用来实施本发明的核酸和嵌合基因可以通过任何手段引入植物细胞中来表达。例如，可以将核酸或表达构建体引入所需植物宿主的基因组，或该核酸或嵌合基因可以是附加体。也可以向所需植物的基因组如此引入，从而宿主的HDC1蛋白产生受内源转录或翻译的控制元件调节或受异源启动子例如本发明的启动子调节。

与本申请相关的“引入”涉及通过人工手段将遗传信息安置在植物细胞或植物中，如转化。这可以通过本领域已知的向植物细胞，组织，原生质体或完整植株引入RNA或DNA的任何方法实现。除如上文所述的人工引入之外，“引入”还包括如下文进一步定义的渐渗基因。

转化意指将核苷酸序列以引起该序列稳定表达或瞬时表达的方式引入植物。单子叶植物细胞和双子叶植物细胞的转化和再生现在是常规技术，并且最适宜转化技术的选择将由实施者决定。方法的选择将随待转化植物的类型变动；本领域技术人员将认识到针对给定植物类型的特定方法的适宜性。合适的方法可以包括，但不是限于植物原生质体电穿孔法；脂质体介导的转化法；聚乙二醇(PEG)介导转化法；使用病毒转化；微量注射植物细胞；微粒轰击植物细胞；真空渗入法；和农杆菌介导转化法。

在可选实施方案中，本发明使用根癌农杆菌介导的转化法。还可以使用能够向植物细胞中转移核酸分子的其他细菌，如根瘤菌目(Rhizobiales)、例如根瘤菌科(Rhizobiaceae)(例如根瘤菌属物种(Rhizobium spp.)、中华根瘤菌属物种(Sinorhizobium spp.)、农杆菌属物种(Agrobacterium spp))；叶杆菌科(Phyllobacteriaceae)(例如中慢生根瘤菌属物种(Mesorhizobium)、叶杆菌属物种(Phyllobacterium spp))；Brucellaceae(Brucellaceae)(例如苍白杆菌属物种(Ochrobactrum spp))；慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)(例如慢生根瘤菌属物种(Bradyrhizobium spp.))和黄色杆菌科(Xanthobacteraceae)(例如固氮根瘤菌属物种(Azorhizobium spp.))、农杆菌属物种、根瘤菌属物种、中华根瘤菌属物种(Sinorhizobium spp.)、中慢生根瘤菌属物种(Mesorhizobium spp.)、叶杆菌属物种、苍白杆菌属物种和慢生根瘤菌属物种的某些土壤细菌，其例子包括苍白杆菌属物种、根瘤菌属物种、百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)。根瘤菌的例子包括豌豆根瘤菌车轴草生物型(R.leguminosarum bv,trifolii)、豌豆根瘤菌菜豆生物型(R.leguminosarum bv.phaseoli)和豌豆根瘤菌豌豆生物型(Rhizobium leguminosarum,bv.viciae)(美国专利7,888,552)。可以用来实施本发明的能够转化植物细胞并诱导外来DNA并入植物基因组的其他细菌是固氮菌属(Azobacter)(需氧)、新月藻属(Clostridium)(严格厌氧)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(任选地需氧)和红螺菌属(Rhodospirillum)(厌氧，光合活性)细菌。还发现Ti质粒的转移对几种根瘤菌科成员如车轴草根瘤菌(Rhizobium trifolii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)和紫金牛叶杆菌(Phyllobacteriummyrsinacearum)上赋予肿瘤诱导能力，同时确实可以修饰根瘤菌属物种NGR234、苜蓿中华根瘤菌和百脉根中慢生根瘤菌以介导基因转移到众多各异植物(Broothaerts等人,2005,Nature,433:629-633)。

在可选实施方案中，产生转基因植物或种子包括将用来实施本发明的序列和在一个方面(任选地)标记基因并入靶表达构建体(例如，质粒)，连同启动子序列和终止子序列定位。这可以涉及通过合适的方法，将修饰的基因转移至植物中。例如，可以使用多种技术如电穿孔法和微量注射植物细胞原生质体，将构建体直接引入植物细胞的基因组DNA，或可以使用弹射法如DNA粒子轰击法，将构建体向植物组织直接引入。例如，参见，例如，Christou(1997)Plant Mol.Biol.35:197-203；Pawlowski(1996)Mol.Biotechnol.6:17-30；Klein(1987)Nature 327:70-73；Takumi(1997)GenesGenet.Syst.72:63-69，其讨论利用粒子轰击法将转基因引入小麦中；和Adam(1997)上文，利用粒子轰击法将YAC引入植物细胞中。例如，上文的Rinehart(1997)使用粒子轰击法产生转基因棉花植物。美国专利号5,015,580描述了将粒子加速的装置；和市售的BioRad(生物射弹法)PDS-2000粒子加速仪；还参见，John，美国专利号5,608,148；和Ellis，美国专利号5,681,730，其描述粒子介导的裸子植物转化。

在可选实施方案中，可以将原生质体固定并用核酸例如表达构建体注射。尽管对于谷类植物而言不易从原生质体再生出植物，但是使用来自原生质体衍生的愈伤组织的体细胞胚发生，可能在豆科植物中再生出植物。可以使用基因枪技术，以裸DNA转化有组织的组织，所述基因枪技术中将DNA涂覆在钨微微粒上，所述钨微粒射向1/100大小的细胞，携带DNA深入细胞和细胞器。随后诱导转化的组织再生，通常借助体细胞胚发生。这项技术已经在几个谷类物种(包括玉米和稻)中取得成功。

在可选实施方案中，第三步骤可以涉及选择和再生能够将并入的靶基因传输到下一个世代的完整植株。这类再生技术依赖于在组织培养生长培养基中操作某些植物激素，一般依赖于已经与所需核苷酸序列一起引入的杀生物剂标记和/或除草剂标记。在Evans等人,Protoplasts Isolation andCulture,Handbook of Plant Cell Culture,第124-176页；MacMillilanPublishing Company,New York,1983；和Binding,Regeneration of Plants,Plant Protoplasts,第21-73页,CRC Press,Boca Raton,1985中描述了从培养的原生质体再生植物。也可以从植物愈伤组织、外植体、器官或其部分获得再生。这类再生技术总体上在Klee(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38:467-486中描述。为了从转基因组织(如不成熟胚)获得完整植株，它们可以在受控环境条件下在一系列含有养分和激素的培养基中培育，一个称作组织培养的过程。一旦完整植株生成并产生种子，则开始评价后代。

根椐病毒基因组的性质，病毒转化(转导)法也可以用于基因的瞬时或稳定表达。将所需的遗传物质包装成适合的植物病毒并且允许修饰的病毒感染植物。感染植物的子代不含病毒并且也不含插入的基因。用于病毒转化的合适方法例如在WO 90/12107、WO 03/052108或WO 2005/098004中描述或进一步详述。

在可选实施方案中，在嵌合基因稳定并入转基因植物后，可以通过有性杂交或渐渗将它引入其他植物中。根据待杂交的物种，可以使用众多标准育种技术的任一项技术。由于本发明核酸的转基因表达导致表型改变，所以包含本发明重组核酸的植物可以与第二植物有性杂交以获得终产物。因此，本发明的种子可以来自本发明的两个转基因植物之间的杂交或本发明植物和另一个植物之间的杂交。当两种亲本植物均表达多肽例如本发明的HDC1基因时，可以增强所需效果(例如，表达本发明的多肽以产其中开花行为改变的植物)。所需效果可以通过标准繁殖手段传递给其他的植物世代。

通过用克隆的序列转化修饰植物特征的成功例子起到说明本技术领域现有知识的作用并且例如包括：美国专利号5,571,706；5,677,175；5,510,471；5,750,386；5,597,945；5,589,615；5,750,871；5,268,526；5,780,708；5,538,880；5,773,269；5,736,369和5,619,042。

在可选实施方案中，在转化之后，使用并入转化载体的显性选择标记，选择植物。这种标记可以对转化的植物赋予抗生素抗性或除草剂抗性，并且可以通过使植物暴露于适宜浓度的抗生素或除草剂，完成转化体的选择。

在可选实施方案中，在选择转化的植物并培育至成熟后，鉴定显示已修饰性状的那些植物。修饰的性状可以是上文描述的那些性状的任何。在可选实施方案中，为了证实修饰的性状归因于转基因多肽或核酸的表达水平或活性变化，可以通过使用Northern印迹、RT-PCR或微阵列分析mRNA表达或使用免疫印迹或Western印迹法或凝胶迁移测定法分析蛋白质表达来确定。

基因“渐渗”意指通过天然手段，即通过将包含本文所述的嵌合基因的植物与不包含所述嵌合基因的植物杂交，将基因整合于植物基因组内。可以选择包含嵌合基因的后代。

用来实施本发明的核酸和多肽可以在任何植物细胞、器官、种子或组织中表达或插入其中，所述植物细胞、器官、种子或组织包括分化的和未分化的组织或植物，包括但不限于根、茎、枝条、子叶、上胚轴、下胚轴、叶、花粉、种子、肿瘤组织和多种形式的培养细胞如单细胞，原生质体，胚胎和愈伤组织。植物组织可以处于植物中或处于器官、组织或细胞培养物中。

本发明还提供这样的植物、植物细胞、器官、种子或组织，它们已经如此修饰，从而与对照植物相比时，具有增加的具有含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的蛋白质的活性的蛋白质的表达和/或活性。这些例如包括转基因植物、植物细胞、器官、种子或组织，它们包含并表达用来实施本发明的核酸，从而导致增加的HDC1多肽表达和/或活性；例如，本发明提供在(轻度或中度的)胁迫条件如限水条件下显示生长改善的植物，例如，转基因植物、植物细胞、器官、种子或组织；因此，本发明提供耐受胁迫的并且尤其干旱耐受的植物、植物细胞、器官、种子或组织(例如，作物)。本发明也提供在对照条件下显示生长改善的植物，例如，转基因植物、植物细胞、器官、种子或组织；因此，本发明提供生物量和/或产量和/或生长速率增加的植物、植物细胞、器官、种子或组织(例如，作物)。本发明还提供在水限制条件下显示生长改善的植物，例如，转基因植物、植物细胞、器官、种子或组织；因此，本发明提供干旱耐受的植物、植物细胞、器官、种子或组织(例如，作物)。本发明提供显示开花时间加速的植物，例如，转基因植物、植物细胞、器官、种子或组织；因此，本发明提供开花时间加速的植物、植物细胞、器官、种子或组织(例如，作物)。

在一个备选实施方案中，本发明还提供这样的植物、植物细胞、器官、种子或组织，它们已经如此修饰，从而与对照植物相比时，具有减少的具有含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的蛋白质的活性的蛋白质的表达和/或活性。这些例如包括转基因植物、植物细胞、器官、种子或组织，它们包含并表达用来实施本发明的核酸，从而导致减少的HDC1多肽表达和/或活性，例如，本发明提供在严重胁迫条件下显示存活增强，在严重胁迫条件后恢复增强的植物，例如，转基因植物、植物细胞、器官、种子或组织。还提供显示开花时间延迟的植物，例如，转基因植物。优选地，具有含SEQID NO.6的氨基酸序列的蛋白质的活性的蛋白质表达和/或活性减少是可诱导的。

包含用来实践本发明的核酸的本发明植物、植物部分、植物器官和植物细胞(例如，转染、感染或转化的细胞)可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。包含本发明核酸的单子叶植物的例子，例如，作为本发明的单子叶转基因植物，是草类如草甸草(meadow grass)(早熟禾(bluegrass)、早熟禾属(Poa))、饲用草如羊茅属、黑麦草属、温带草如剪股草属(Agrostis)，和谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱和玉蜀黍(玉米)。包含本发明核酸的双子叶植物的例子，例如，作为本发明的双子叶转基因植物是棉花、烟草、豆科植物，如羽扇豆、马铃薯、糖萝卜(sugarbeet)、豌豆、豆和大豆和十字花植物(十字花科)，如花椰菜、油菜(rape seed)和密切相关的模式生物拟南芥。因此，包含本发明核酸的植物或植物细胞，包括本发明的转基因植物及种子，包含广泛类型的植物，包括但不限于，来自以下属的物种：腰果属(Anacardium)、落花生属(Arachis)、天门冬属(Asparagus)、颠茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)、芸苔属(Brassica)、柑橘属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、红蓝花属(Carthamus)、可可属(Cocos)、咖啡属(Cojfea)、香瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、胡萝卜属(Daucus)、油棕属(Elaeis)、草莓属(Fragaria)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、萱草属(Heterocallis)、大麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoscyamus)、莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、羽扇豆属(Lupinus)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、Majorana、苜蓿属(Medicago)、烟草属(Nicotiana)、Olea、稻属(Oryza)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pannisetum)、鳄梨属(Persea)、菜豆属(Phaseolus)、黄连木属(Pistachia)、豌豆属(Pisum)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、萝卜属(Raphanus)、蓖麻属(Ricinus)、黑麦属(Secale)，千里光属(Senecio)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solarium)、高粱属(Sorghum)、Theobromus、葫芦巴属(Trigonella)、小麦属(Triticum)、野豌豆属(Vicia)、葡萄属(Vitis)、豇豆属(Vigna)和玉蜀黍属(Zea)。

本发明另外提供本发明植物细胞的植物产生的繁殖材料。产生繁殖材料涉及本领域已知的产生其他植物、植物部分或种子任何手段并且尤其包括营养性繁殖方法(例如空中压条法或地面压条法、分株、(芽)嫁接、微繁殖，匍匐茎或纤匐枝、贮藏器官如鳞茎、球茎、块茎和根状茎、striking或插条、twinscaling)、有性繁殖(与另一株植物杂交)和无性繁殖(例如无融合生殖、体细胞杂交)。

在具体的实施方案中，本文所述的植物细胞是非增殖性植物细胞或不能再生成植物的植物细胞或不能通过光合作用从无机物如水、二氧化碳和无机盐合成碳水化合物和蛋白质维持其生命的植物细胞。

本发明的转基因植物还可以包含为表达或改变多肽活性(例如，通过改变多肽的磷酸化状态以使它维持活化状态)必需的装置，其中所述多肽由内源基因编码，所述内源基因例如编码本发明有功能的HDC1蛋白的基因。可以通过如本申请中其他地方所描述的多种充分建立的技术，产生并入本发明核酸和/或表达本发明多肽的转基因植物(或植物细胞、或植物外植体、或植物组织)。

如本文所用，核酸或多核苷酸可以是单链或双链DNA或RNA。核酸可以化学地合成或通过体内或甚至体外生物表达产生。核酸可以使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规DNA/RNA合成仪化学地合成。RNA合成试剂的供应商是Proligo(汉堡,德国)、Dharmacon Research(Lafayette,CO,USA)、Pierce Chemical(Perbio Science分部,Rockford,IL,USA)、Glen Research(Sterling,VA,USA)、ChemGenes(Ashland,MA,USA)和Cruachem(Glasgow,UK)。与本公开的嵌合基因相关，DNA包括cDNA和基因组DNA。

如本文所用的术语“蛋白质”或“多肽”描述了一组由多于30个氨基酸组成的分子，而术语“肽”描述由高达30个氨基酸组成的分子。蛋白质和肽还可以形成二聚体，三聚体和高级低聚体，即由不止一个(多)肽分子组成。形成这类二聚体、三聚体等的蛋白质或肽分子可以是相同或不相同的。相应的更高阶结构物因此称作同型二聚体或异二聚体、同型三聚体或异三聚体等。术语“蛋白质”和“肽”也指天然修饰的蛋白质或肽，其中例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化等实现所述修饰。这类修饰是本领域熟知的。

如本文所用，“包含”应解释为是指存在如所提到的特征、整数、步骤或组分，但是不排除存在或附加一种或多种特征、整数、步骤或组分或它们的群组。因此，例如，包含核苷酸序列或氨基酸序列的核酸或蛋白质可以包含比实际所引述更多的核苷酸或氨基酸，即，嵌入更大的核酸或蛋白质中。包含以结构方式或功能方式定义的核酸的嵌合基因可以包含额外的DNA区域等。

除非在实施例中另外指出，否则全部重组DNA技术按照Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,NY和Ausubel等人(1994)Current Protocols inMolecular Biology,Current Protocols,USA的第1和2卷中所述的标准方案实施。在BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell ScientificPublications,UK联合出版的Plant Molecular Biology Labfax(1993)(R.D.D.Croy)中描述了用于植物分子操作的标准材料和方法。用于标准分子生物学技术的其他参考文献包括Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,NY；Brown(1998)Molecular Biology LabFax第I卷和第II卷,第2版,Academic Press(UK)。用于聚合酶链式反应的标准材料和方法可以在Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press中并在McPherson等人(2000)PCR-Basics:From Background to Bench,第1版,德国Springer Verlag中找到。

通过引用的方式完整并入本文中提及或援引的全部专利、专利申请和出版物或公开披露(包括互联网上的出版物)。

在376千字节(大小如Microsoft中所测量)、含有41个序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:55并且名为“BCS13-2001_ST25”的文件中所含的序列表在此通过电子提交方式提交并且通过引用的方式并入本文。

本发明将参考本文所述的实施例进一步描述；然而，应当理解本发明不限于这类实施例。

序列表

SEQ ID NO.1：拟南芥HDC1基因的启动子区

SEQ ID NO.2：过量表达载体pMDC32 35S HDC

SEQ ID NO.3：过量表达载体pUB-DEST Ubi10 HDC1

SEQ ID NO.4：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Rxt3aa的氨基酸序列

SEQ ID NO.5：来自拟南芥的HDC1的核苷酸序列

SEQ ID NO.6：来自拟南芥的HDC1的氨基酸序列

SEQ ID NO.7：来自Arabidopsis lyrata的HDC1的核苷酸序列

SEQ ID NO.8：来自Arabidopsis lyrata的HDC1的氨基酸序列

SEQ ID NO.9：来自毛果杨(Populus trichocarpa)的HDC1的核苷酸序列

SEQ ID NO.10：来自毛果杨的HDC1的氨基酸序列

SEQ ID NO.11：来自蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的HDC1的核苷酸序列

SEQ ID NO.12：来自蒺藜苜蓿的HDC1的氨基酸序列

SEQ ID NO.13：来自葡萄(Vitis vinifera)的HDC1的核苷酸序列

SEQ ID NO.14：来自葡萄的HDC1的氨基酸序列

SEQ ID NO.15：来自蓖麻(Ricinus communis)的HDC1的核苷酸序列

SEQ ID NO.16：来自蓖麻的HDC1的氨基酸序列

SEQ ID NO.17：来自稻(Oryza sativa)的HDC1的核苷酸序列

SEQ ID NO.18：来自稻的HDC1的氨基酸序列

SEQ ID NO.19：来自稻(Oryza sativa)的HDC1的核苷酸序列

SEQ ID NO.20：来自稻的HDC1的氨基酸序列

SEQ ID NO.21：来自二穗短柄草的HDC1的核苷酸序列

SEQ ID NO.22：来自二穗短柄草的HDC1的氨基酸序列

SEQ ID NO.23：来自二色蜀黍(Sorghum bicolor)的HDC1的核苷酸序列

SEQ ID NO.24：来自二色蜀黍的HDC1的氨基酸序列

SEQ ID NO.25：来自二色蜀黍(Sorghum bicolor)的HDC1的核苷酸序列

SEQ ID NO.26：来自二色蜀黍的HDC1的氨基酸序列

SEQ ID NO.27：来自玉蜀黍(Zea mays)的HDC1的核苷酸序列

SEQ ID NO.28：来自玉蜀黍的HDC1的氨基酸序列

SEQ ID NO.29：来自大豆(Glycine max)的HDC1的核苷酸序列

SEQ ID NO.30：来自大豆的HDC1的氨基酸序列

SEQ ID NO.31：来自大豆(Glycine max)的HDC1的核苷酸序列

SEQ ID NO.32：来自大豆的HDC1的氨基酸序列

SEQ ID NO.33：来自大豆(Glycine max)的HDC1的核苷酸序列

SEQ ID NO.34：来自大豆的HDC1的氨基酸序列

SEQ ID NO.35：来自大豆(Glycine max)的HDC1的核苷酸序列

SEQ ID NO.36：来自大豆的HDC1的氨基酸序列

SEQ ID NO.37：来自普通小麦(Triticum aestivum)的HDC1的核苷酸序列

SEQ ID NO.38：来自普通小麦的HDC1的氨基酸序列

SEQ ID NO.39：来自番茄(Solanum lycopersicum)的HDC1的核苷酸序列

SEQ ID NO.40：来自番茄的HDC1的氨基酸序列

SEQ ID NO.41：来自稻的HDC1的氨基酸序列

SEQ ID NO.42：hdc1-1侧翼序列正向引物(基因分型)

SEQ ID NO.43：hdc1-1侧翼序列反向引物(基因分型)

SEQ ID NO.44：hdc1-1左边界正向引物(基因分型)

SEQ ID NO.45：hdc1-1左边界反向引物(基因分型)

SEQ ID NO.46：HDC1对1正向引物(RT-PCR/qPCR)

SEQ ID NO.47：HDC1对1反向引物(RT-PCR/qPCR)

SEQ ID NO.48：HDC1对2正向引物(RT-PCR/qPCR)

SEQ ID NO.49：HDC1对2反向引物(RT-PCR/qPCR)

SEQ ID NO.50：HDC1对3正向引物(RT-PCR/qPCR)

SEQ ID NO.51：HDC1对3反向引物(RT-PCR/qPCR)

SEQ ID NO.52：HDC1对4正向引物(RT-PCR/qPCR)

SEQ ID NO.53：HDC1对4反向引物(RT-PCR/qPCR)

SEQ ID NO.54：密码子优化用于小麦中过量表达的拟南芥HDC1的核苷酸序列

SEQ ID NO.55：过量表达载体pTVE704

实施例

实施例1：实验方法

植物材料

在我们的实验室中，HDC1的全部转基因系均在拟南芥Col-0背景下产生。稳定的纯合敲除株系hdc1-1从GABI-Kat系054G03的后代获得。从hdc1-1植物的后代鉴定稳定纯合互补系，所述hdc1-1植物用包含天然启动子的基因组HDC1转化(参见克隆方法)。稳定的纯合HDC1-过量表达系从野生型Col-0植物的后代生成，所述野生型Col-0植物用35-S启动子或泛素-10启动子控制下的HDC1转化(参见克隆方法)。35S::HDA6的种子(Gu等人,PLoS Genet.7)和axe1-5的种子(Probst等人,2004,Plant Cell16,1021-1034)由Yuehui He和Ortrun Mittelsten Scheid友好提供。

生长条件和处理

全部实验均在受控生长室中在20-22℃温度和光强度120-150μmolPAR实施。植物在长日照(16小时光照)或在短日照(10小时光照)培育，如文本和图注中所示。将拟南芥野生型和转基因系的种子消毒，分层并在土壤上或在琼脂平板上萌发。琼脂平板含有半强度Murashige&Skoog(MS)培养基连同1％蔗糖和0.8％琼脂，pH 5.7。对于萌发测定法，将培养基以图中给出的浓度补充NaCl、ABA(目录号A1049，SIGMA)、PAC(Fluka目录号46046)或TSA(SIGMA；目录号T8852)。在播种后第6日通过计数发育成绿色子叶的幼苗，对萌发率评分。采用成年植物的实验在土壤上或在水培培养中实施。对于后者，使得种子在琼脂平板上萌发并将2-3周龄幼苗置于黑色1升塑料容器的穿孔盖。生长培养基为最小足够营养培养基(minimal sufficient nutrient medium)(Kellermeier等人,2013,PLoS Genet.7))。对于盐处理，将NaCl粉末直接拌入生长容器以获得所需浓度(如图中所述)。搅拌对照培养基但不添加NaCl。对于受控干旱实验，根据随机化设计在土壤上盆钵中培育植物。使用先前报道的方法(Granier等人,NewPhytologist 169:623-635；Skirycz等人,2011,Nat.Biotech.29:212-214)，利用受控浇水引起中度水胁迫。植物在充分浇水的土壤中生长14日后，减少浇水，从而受胁迫植物的相对土壤含水量维持在正常浇水方案的50％。对照植物正常浇水。

克隆方法

使用含有attB1和attB2位点或attB3和attB4作为5’修饰的引物，通过PCR扩增产生含有全长HDC1、HDA6、HDA19和AtSIN3的具有或没有终止密码子的进入克隆。使用BP克隆酶II，根据制造商的说明书，将凝胶纯化的PCR产物引入pDONR207/221(Life Technologies)并使用LR-克隆酶II(Life Technologies)，通过重组转移至目的载体。反应产物用来转化Top10细菌细胞。分离抗生素标记抗性菌落和通过限制性消化物分析和测序进行验证。这项研究中产生并使用以下质粒：pB7RWG2中的35S::HDA6/HDA19-RFP、pMDC163中的HDC1(646bp上游)启动子、pMDC123中的HDC1gDNA(包含646bp上游序列)、pMDC032中的2X35S::HDC1(Curtis和Grossniklaus,2003,Plant Physiol.133:462-9)、pUB-Dest中的Ubi10::HDC1、pH7WGF2中的35S::GFP-HDC1(Karimi等人,2002,Trends Plant Sci 7:193-195)、pUBN-GFPDest中的Ubi10::GFP-HDC1(Grefen等人,2010,Plant J 64:355-365)、pBiFCt-2in1-NN中的35S::nYFP-HDC1/cYFP-HDA6/HDA19/SIN3、pBiFCt-2in1-NN中的35S::nYFP-SIN3/cYFP-HDA19(Grefen和Blatt,2012,Biotechniques 53:311–314)。

抗体

使用匹配HDC1序列中氨基酸341-356的合成肽，在兔中产生HDC1抗体(Agrisera)并亲和纯化。将额外半胱氨酸添加至N末端以改善结合能力。H3K9/K14Ac和H3抗体购自Diagenode(pAb-005-044)和Abcam(ab1791)。His标签抗体获自NEB(#2366)。

植物转化

通过热休克法将质粒插入根癌农杆菌菌株GV3101pMP90(Koncz和Schell,1986,Mol.Gen.Genet.204:383–396)。通过花浸染法进行农杆菌介导的拟南芥转化(Clough和Bent,1998,Plant J.16,735-743)。纯合T2子代用于萌发试验。通过叶浸润法实现农杆菌介导的烟草(N.tabacum)和本生烟草瞬时转化(Geelen等人,2002,Plant Cell 14:387–406)。对于比率计BiFC测定法和共定位研究，将每个构建体随编码用于基因沉默的阻抑蛋白的番茄丛矮病毒(tomato blushy stunt virus)p19蛋白基因一起共表达(Voinnet等人,2003,Plant Journal 33,949-956)。

聚合酶链反应

根据(Edwards等人,1991,Nucleic Acids Research 19,1349-1349)提取总基因组DNA。全部PCR反应均用0.4单位Taq聚合酶(Promega目录号M8301)进行。使用热酚法提取总RNA(Schmitt等人,1990,Nucleic AcidsResearch 18,3091-3092)。遵循制造商的方法，用Quantitect逆转录试剂盒(Qiagen)获得cDNA。在MX3000序列检测系统(Agilent)上用Brilliant IIIUltra快速SYBR QPCRMaster Mix n(Agilent)进行定量PCR。引物序列在序列表中作为SEQ IDs 43-53提供。

ChIP

遵循公开的方案(Gendrel等人.,2002,Science 297,1871-1873；Saleh等人,2008,Plant Cell 20,568-579)，实施染色质提取和免疫沉淀(ChIP)。简言之，将组织样品在真空下在1％(w/v)甲醛中温育15分钟。通过添加125mM甘氨酸终止交联，并将组织润洗、蘸干和冷冻。遵循制造商的说明书，将稀释的染色质提取物与针对H3K9/K14Ac(Diagenode pAb-005-044)的抗体温育。将免疫沉淀的染色质-DNA(IP-DNA)或输入染色质-DNA反向交联，并且通过蛋白酶K处理移除残余的蛋白质。通过酚/氯仿提取和乙醇沉淀回收DNA。随后将DNA重悬和通过MinEluteReaction Cleanup试剂盒(QIAGEN)纯化。在进入ChIP-qPCR之前，遵循制造商的操作方案，使用GenomePlex Complete Whole Genome Amplification(WGA2，Sigma-Aldrich)扩增DNA样品。

蛋白质提取和Western印迹

根据公开的方案(Gendrel等人,2002,上文)

制备核-富集的蛋白质提取物。将染色质用0.4M H₂SO₄提取2次并将蛋白质用20％三氯乙酸沉淀。全部缓冲液均补充有100mMPMSF和蛋白酶抑制剂(Complete Mini,Roche UK)。将样品煮沸并上样到SDS-PAGE凝胶上。在转移到PVDF膜(IPVH00010，Millipore)后，实施Ponceau S染色(P3504，Sigma-Aldrich)。将HDC1抗体按1:4000稀释度温育过夜。将辣根过氧化物酶缀合的兔第二抗体(Roche)与该膜温育至少1小时。使用ECL+系统(RPN2132，Amersham)，检测蛋白质。

产生加标签的重组蛋白和GST下拉测定法

在大肠杆菌BL21细胞中表达加GST标签或His标签的蛋白质。用1mM IPTG诱导之后，将细胞收获在裂解缓冲液中并超声处理。使用Ni-NTA(Sigma)和谷胱甘肽-Sepharose树脂(GE Healthcare)，根据制造商的说明书，亲和纯化可溶解HDC1-His、GST-HDA6和GST-HDA19蛋白。对于下拉测定法，将加GST标签的蛋白质与谷胱甘肽-Sepharose树脂结合并施加至微量柱。将重组HDC1-His或核富集的植物裂解物(Gendrel等人,2002,上文)与Tris-NaCl缓冲液中的1X蛋白质抑制剂(Complete Mini,11836153001,Roche,UK)合并。样品在冰上温育过夜。在几次洗涤后，在1X Laemmli缓冲液中洗脱拉下的蛋白质。

GUS测定法

在含有0.1M NaPO₄、10mM EDTA、0.1％Triton、1mM K₃Fe(CN)₆和2mM X-GLUC的溶液中浸润来自表达HDC1启动子::GUS的独立原代转化体的植物组织。将样品在37℃温育过夜，随后每两个小时在65℃进行70％乙醇洗涤以除去多余的蓝色着染。在立体显微镜上拍照照片。

共聚焦显微术

浸润后两日，使用CLSM-510-META-UV共聚焦显微镜(Zeiss，Jena)，评估烟草表皮细胞中的荧光。对于单一蛋白定位，在488nm用来自Argon激光器的光激发GFP荧光并在通过具有505nm长通滤光片的NFT545二色镜后采集GFP荧光。对于共定位实验，用505-530带通滤片采集GFP荧光。在543nm用来自Helium Neon激光器的光激发RFP荧光并在通过NFT545二色镜和560-615nm带通滤片后采集RFP荧光。在514nm用来自Argon激光器的光激发YFP荧光并在520-550nm之间使用λ模式采集YFP荧光。使用Zeiss LSM510AIM软件(3.2版)评估共定位平面和行扫描。

脱落酸(ABA)的测定

使用1200系列HPLC(Agilent Technologies，3.5μm，2.1x 150mmEclipse Plus C18C18柱)和6410B增强灵敏度三级四极质谱仪(AgilentTechnologies)，通过在Exeter Mass Spectrometry Facility(Exeter，UK)的LC-MS定量来自干燥叶样品的甲醇提取物中的ABA(Page等人,2012)。包含[²H₆](+)-顺,反-脱落酸，(Chemlm Ltd，捷克共和国)作为标准物。

基因登录号

ABA1(ABA缺陷1)：AT5G67030；ABA3(ABA缺陷3)：AT1G16540；ABI3(ABA不敏感3)：AT3G24650；AFP3(ABI FIVE结合蛋白)3：AT3G29575；DR4(干旱阻遏4)：AT1G73330；FLC(开花基因座C)：AT5G10140；FUS3(FUSCA3)：AT3G26790；HDC1(组蛋白脱乙酰化复合体1)：AT5G08450；HDA6(组蛋白脱乙酰酶6)：AT5G63110；HDA19(组蛋白脱乙酰酶19)：AT4G38130；LEC1(叶状子叶1)：AT1G21970；PYL4(PYR1样4)：AT2G38310；RAB18(应答于ABA18)：AT5G66400；RD29A(应答于干燥29)：AAT1G16540；RD29B(应答于干燥29B)：AT5G52300；SIN3(SIN3样3)：AT1G24190。

实施例2：HDC1是一种非冗余、普遍存在的核蛋白。

HDC1(At5g08450)是拟南芥中的单拷贝基因。预测的多个剪接变体仅在上游UTR中不同。独特HDC1同源物还存在于目前可获得其基因组信息的全部其他植物物种中，包括重要作物如玉米和稻(图1A)。预测的植物HDC1蛋白的长约900个氨基酸的序列在C端半侧含有与Rxt3蛋白高度相似的长约300个氨基酸的序列，所述Rxt3蛋白在低等真核生物中普遍存在，但是尚未功能表征(图1C中的比对)。特别高的序列相似性出现在标记为‘组蛋白脱乙酰化Rxt3’的PFAM特征标识(PF08642)中(图1C中的框)。该术语来源于生物化学证据：酵母Rxt3与LRpd3复合体共洗脱(Carrozza等人,2005,Cell 123,581-592)，但是该区域与组蛋白脱乙酰酶的催化结构域没有同源性。基于序列相似性，没有明显的功能可以归属该HDC1序列的这种部分或任何其他部分。可变性更高的延长的HDC1N端部分在非植物基因组中没有对应物。从Rxt3至HDC1的序列延长出现在藻类和高等植物之间，藓类植物显示居间长度(参见图1C中的序列比对结果)。

植物内部普遍存在的表达支持HDC1保守性非冗余功能的观念。在HDC1启动子控制下表达β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的稳定拟南芥系的组织化学分析在全部营养组织(包括种子、根、子叶、莲座叶和花芽)中揭示HDC1启动子活性(图2，A-E)。但是，在花药和柱头内部检测不到GUS(图2，F)，这表明HDC1在繁殖期间沉默。这符合繁殖期间染色质状态的总体再设定(Paszkowski和Grossniklaus,2011,Current Opinion in Plant Biology14,195-203)。

对瞬时表达型烟草植物中和稳定转基因拟南芥植物中绿色荧光蛋白(GFP)-HDC1融合蛋白的显微镜分析显示HDC1在细胞核中排他性存在(图2，G，H)，但是不存在于核仁中(图2，J)。

实施例3：HDC1与HDA6和HDA19物理相互作用并促进组蛋白脱乙酰化

为了研究HDC1是否为植物中HDAC蛋白质复合体的成员，我们检验HDC1与已知的拟南芥HDAC的共定位和直接相互作用。全长GFP-HDC1与红色荧光蛋白(RFP)-HDA6或RFP-HDA19在烟草表皮细胞中的共表达显示HDC1与HDA6和HDA19在细胞核内部的不同位置紧密共定位(图3)。通过双分子荧光互补(BiFC)研究直接相互作用。为避免错误解释背景荧光，我们使用新的比率计BiFC测定法(Grefen和Blatt,2012,上文)，其中从单个载体表达分别与HDC1和HDA6/19融合的黄色荧光蛋白(YFP)N端半侧和C端半侧和全长RFP(图4A)。在产生RFP的细胞中，记录到HDA6和HDA19的强YFC信号，表明BiFC成功并因此表明HDC1与两种HDAC相互作用。当HDA19与Sin3样蛋白3(SNL3，AtSin3)共表达时，BiFC也成功，其中先前在酵母双杂交测定法中显示所述Sin3样蛋白3与HDA19相互作用(Song等人,2005,上文)。相反，未记录到HDC1和AtSin3的YFP信号，这表明HDC1并不与全部HDAC复合体蛋白相互作用。获得的YFP信号对来自相同细胞的RFP信号归一化(图4B)，这提供了HDC1在异源系统中与两种脱乙酰酶强烈和特异性相互作用的统计显著性定量证据(图4C)。

使用加GST标签和加His标签的重组蛋白的体外下拉实验进一步证实HDC1与HDA6和HDA19物理相互作用的能力(图5A)。使用GST-HDA6作为诱饵，在从成熟拟南芥植物叶获得的富集细胞核的蛋白质样品中拉下HDC1(图5B)。[注意，这里未见到在体外拉下的样品中见到的一个三重HDC1条带，显示在异源系统中而非植物中的稳定翻译后修饰作用]。当使用GST-HDA19作为诱饵时，拉下明显更少的HDC1。在仅采用GST的下拉测定法中没有回收到HDC1。用来自T-DNA插入敲除株系hdc1-1的蛋白质提取物进行相同测定法时，未检出HDC1(关于突变体描述，见下文)。

为了检验HDC1是否影响植物中的组蛋白脱乙酰化活性，我们用商业抗体探测来自野生型和突变系的叶蛋白提取物，所述商业抗体识别组蛋白3(HDA6的优势靶)中乙酰化赖氨酸9和14(抗-H3K9K14ac)(To等人,2011,上文)。如图5C中所示，hdc1-1敲除植物比野生型植物产生显著更高的H3K9K14ac:H3信号，显示比脱乙酰化形式更高水平的H3乙酰化形式。HDC1基因组序列在其自身启动子下在hdc1-1背景中的表达(HDC1c)逆转这种表型；互补系中的H3K9K14ac:H3类似于野生型(图5C)。我们得出结论：HDC1与组蛋白脱乙酰酶相互作用并且是植物中组蛋白脱乙酰酶活性必需的。

实施例4：用于功能表征HDC1的突变系

为了研究HDC1的生理功能，我们从目前可获得的拟南芥系产生T-DNA在HDC1编码序列或UTR中插入的几个纯合系(SALK043645、SALK150126C、SAIL1263E05和GABI-Kat054G03，均在Col-0背景中)。这些突变系中仅一个突变系，即来自GABI-Kat054G03的其中TDNA在第一内含子内插入的hdc1-1，在转录物水平和蛋白质水平经证明是HDC1真实敲除体(图6A-C)。其他T-DNA插入系中的HDC1转录物水平类似于野生型或甚至更高(图7A、B)。在hdc1-1植物中检测到某种不完整的mRNA，但是未检出HDC1蛋白(全长或部分)(补充图S2C)。通过将基因组HDC1在hdc1-1背景在其自身启动子(646bp上游序列)下表达，获得HDC1c互补系。在Col-0背景中使用35-S启动子或泛素-10启动子，我们还产生了稳定的纯合HDC1-过量表达系(分别是HDC1-OX1和HDC1-OX2)。两个株系均产生比Col-0野生型高大约30倍的HDC1mRNA水平(图6D)。

实施例5：HDC1决定萌发期间ABA敏感性的设定点

先前hda6和hda19突变系在萌发期间对ABA超敏感(Chen等人,2010,上文；Chen和Wu,2010,Plant Signal Behav.5,1318–1320)。如果正在萌发的种子遭遇环境中的低水势，它们出现生长和发育停滞(Finkelstein等人,2008,In Annual Review of Plant Biology(Palo Alto:Annual Reviews),第387-415页)。吸涨后反应由ABA介导并且可以通过外在施加ABA进行模拟。赤霉素(GA)在这个反应中拮抗ABA，并且因此如果施加GA-生物合成抑制剂多效唑(PAC)，则也出现幼苗生长停滞(Daszkowska-Golec,2011,上文)。为了检验HDC1在这个过程中的功能，使拟南芥野生型、hdc1-1和HDC1-OX系的种子吸涨以打破休眠，并随后铺展在含有不同浓度NaCl、甘露醇、ABA或PAC的琼脂平板上。将累积性萌发率(涵盖幼苗发育的全部吸涨后阶段)评定为在6日后已经形成子叶的幼苗的数量。在对照条件中，全部株系类似地良好萌发(接近于100％)并且萌发的幼苗在大小和形状方面相似(图8、图9)。全部株系显示萌发率随NaCl、甘露醇、ABA或PAC浓度渐增而下降，然而，与野生型相比，hdc1-1显著地更敏感，而OX系对处理明显地较不敏感。两个OX系中均观察到过低敏感性，与启动子或插入位点无关。根据这些株系中HDC1mRNA的中度增加，衍生自SALK 150126C、SAIL 1263E05的纯合系在萌发期间显示相似或略微低的ABA-敏感性(图7C)。我们得出结论：HDC1的表达水平定量地决定正在萌发的种子中ABA敏感性的设定点。

HDC1过量表达对ABA-依赖性萌发具有脱敏作用的事实令人感兴趣，因为迄今尚未报道HDA6过量表达的生理表型。我们因此在先前产生用于生物化学研究的HDA6过量表达系的幼苗中评定ABA敏感性(Gu等人,2011,上文)。35S::HDA6幼苗显示与野生型植物相似的ABA敏感性，并且它们比HDC1-OX幼苗对ABA明显更敏感，尽管转录物水平的增长相似(图10A、B)。

为了检验种子萌发的ABA依赖性和HDC1对这个过程的影响是否需要组蛋白脱乙酰化，我们将正在萌发的种子用组蛋白脱乙酰酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)处理。不同于之前测试的更高TSA浓度(Tanaka等人,2008,Plant Physiol.146:149-161)，我们实验中所用的低微摩尔浓度TSA在不存在ABA的情况下对种子萌发没有影响(图11)。然而，TSA以剂量依赖性方式增加野生型植物的ABA-敏感性，0.3μM在0.2μM ABA时产生明显影响，并且3μM TSA在0.4μM ABA时产生明显影响。另外，添加TSA增加了HDC1-过量表达系的ABA-敏感性。因此，正在萌发的种子的ABA灵敏度和幼苗因HDC1-过量表达而对ABA脱敏化取决于组蛋白脱乙酰酶的催化活性。

实施例6：HDC1不影响营养性发育但是开花需要的

已经报道HDAC突变体的几种发育表型。例如，hda6/hda19双突变体在成熟叶上显示胚性结构并且在萌发后不阻抑胚特异性转录因子如LEC1、FUS3和ABI3(Tanaka等人,2008,上文)。相反，hdc1-1植物的叶正常并且LEC1和FUS3在已经萌发2日后被有效阻遏(DAG，图9)。ABI3转录物在2DAG仍存在，与野生型植物相比，hdc1-1植物表达更高的水平和HDC1-OX植物表达更低的水平，但是截至第六日在全部株系中均减少到非常低的水平。我们得出结论：在对照条件下幼苗成功进展到营养生长阶段不需要HDC1。

在营养生长期间，叶发育在hdc1-1植物中和HDC1-OX植物中正常。全部株系中，新叶均以相似速率出现(图12A)。在长日照条件下培育时，野生型和HDC1-OX植物在4周内开始抽苔，hdc1-1植物继续产生莲座叶并且大约2周后以明显更高的莲座叶数(图12C)开花(图12B)。与野生型和HDC1-OX植物中的低水平相比，开花表型以第28日hdc1-1敲除植物中开花抑制物FLC的高转录物水平反映(图12D)。可以得出结论：HDC1不影响营养性发育，但是过渡到繁殖期需要它。

实施例7：HDC1促进植物生长

尽管营养性发育正常，但HDC1突变体显示一种清晰的生长表型(图13)。在萌发后2周内叶膨大的差异变得明显(图14)。在较老植物中记录各株系之间枝条重和根重的显著差异，尤其当营养生长阶段因使用短日照条件延长时(图13)。在叶数相似情况下，4周龄HDC1-OX植物产生比野生型植物多20％的鲜重，并且hdc1-1植物产生比野生型植物少10％的鲜重，并且这种差异在5周后增长至50％(左右)(图13A)。全部株系均具有相似的相对含水量92±1％，并且因此鲜重差异主要由干物质的差异引起。两种HDC1-过量表达系均显示增强的生长，OX2(Ubi10)总是略大于OX1(35S)植物。在hdc1-1::HDC1互补系中进一步证实HDC1表达水平和生长之间的正相关。植物尺寸和重量反映各株系中的HDC1蛋白水平(图13B)。迄今尚未报道拟南芥组蛋白脱乙酰酶突变体的生长表型。我们因此在我们的生长条件下重新评估hda6敲低(axe1-5)植物的生长。实际上，axe1-5植物产生比相应野生型植物(Col-0DR5)更少的鲜重和干重，尽管叶数略微更高(图15)。相反，HDA6-过量表达植物具有与野生型植物相似的重量(图10)并且因此没有模拟HDC1-过量表达系的表型。

实施例8：HDC1改变盐胁迫调节型基因的转录物水平和乙酰化状态

为了检验HDC1在转录性调节中的功能，我们用150mM NaCl处理4周龄水培野生型植物和突变植物24小时，并且测定几种已知的盐胁迫应答性基因的转录物水平，这些基因包括ABA-生物合成基因ABA1和ABA3、转录因子Rd29A/B、脱水蛋白Rab18和ABI5结合蛋白AFP3(Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，2006,上文)。我们发现在盐处理后，各株系之间的转录物水平显示一致的概况，hdc1-1中的水平高于野生型植物和/或HDC1-OX植物中的水平低于野生型植物(图16)。在对照条件下，这些基因的转录物水平在全部株系中相似地低，例外是ABA1转录物，它在hdc1-1中增加。枝条ABA水平证实在全部株系中，ABA生物合成均由盐有效诱导，但是达到的水平在hdc1-1/OX系中略微更高/更低(图17)。

在全部株系中，ABA-受体PYL4和‘干旱阻遏的’基因DR4均被盐胁迫有效阻遏，但是在对照条件下，记录到hdc1-1/HDC-OX植物中更高/更低的转录物水平。

为了评估是不是或哪种观察到的转录性变化是组蛋白乙酰化状态改变的直接结果，我们对涵盖上述基因的起始密码子的区域进行抗-H3K9K14ac ChIP-qPCR。对于ABA1、RD29B、PYL4和DR4，我们从HDC1-OX植物回收到比野生型植物更少的ChIP-DNA并且从ChIP-DNAhdc1-1植物回收到比野生型植物更多的ChIP-DNA(图18)。相反，没有发现ABA3的变化，表明这个基因的转录性变化是通过ABA正反馈控制的结果(Barrero等人,2006,Plant Cell Env.29:2000-2008)。其他基因的乙酰化状态仍待检验。这些结果确定ABA1、RD29B、PYL4和DR4为HDC1促进的组蛋白脱乙酰化的直接靶，并且它们为突变体中这些基因的转录性应答的改变提供机理性解释。

实施例9:HDC1过量表达的生长增强效应在水胁迫下维持

HDC1-OX系中生长增强与胁迫诱导型基因较低表达的组合令我们对这些可能产生相反效果的特征对水胁迫或盐胁迫下植物性能的净影响感到好奇。我们因此将HDC1突变系和野生型植物接受在短日照条件下受控的水限制方案处理，所述方案在第14日启动并且在实验剩余时间造成对照条件约50％的持续相对土壤含水量(图19A)。各株系之间生长的差异明显表现为在第14日和第28日记录的较年轻植物的更大莲座直径(HDC1-OX)和更小莲座直径(hd1-1)。在较老植物中，莲座直径差异更小，原因在于外侧叶最大地延长，但在第40日(在开花之前)收获植物时，发现总枝条鲜重和总干重显著差异。在充分浇水条件下，枝条鲜重在HDC1-OX植物中比野生型植物高约20％，并且在hdc1-1植物中比野生型植物低约40％。有限的水供应减慢全部株系的生长(在第28日减慢约30％并且在第40日减慢约80％)，然而HDC1-OX植物仍然比野生型植物产生显著地更多(约20％)的生物量，并且hdc1-1敲除植物仍然显著地小于野生型植物(虽然鲜重的差异收窄到约10％，图19A)。

在第二实验中，水培的植物接受中度盐胁迫(80mM NaCl，图19B)处理6日。这种胁迫不产生严重的缺绿或脱水，但是它降低枝条含水量(在6日后从92±1％至86±1％)并且在全部株系中减慢生长(对照植物的比较数据在图13中)。在盐胁迫下，HDC1-OX持续产生比野生型显著更多的根与枝条生物量，并且hdc1-1植物保持更小。因此，HDC1-OX植物中盐诱导型基因的较低应答性似乎没有在中度盐胁迫下展示出生长劣势。

实施例10：小麦中的HDC1过量表达：材料和方法

克隆方法

将拟南芥HDC1基因的2757bp编码序列(SEQ ID NO.:5)针对小麦密码子选择而优化(产生SEQ ID NO:54的核苷酸序列)。在ATG处产生BsaI位点并且在终止密码子之后产生MluI位点。将凝胶纯化的含有优化hdc1基因的BsaI-MluI片段连接在NcoI-MluI消化的载体pTCD145中玉米遍在蛋白-1启动子PubiZm和nos终止子之间，所述载体额外地含有P35S:bar选择标记盒。连接反应产物用来转化MC1061细菌细胞。分离抗生素标记抗性菌落和通过限制性消化物分析和测序对其进行验证。

用于产生小麦转基因(SEQ ID NO.55)的植物转化载体pTVE704含有两个表达盒。选择标记盒具有驱动Bar基因的35S启动子并且hdc1盒具有驱动密码子优化的拟南芥HDC1编码序列的玉米遍在蛋白-1启动子。pTVE704载体主链来自pGSC1700(Cornelissen和Vandewiele,1989:Nuclear transcriptional activity of the tobacco plastid psbA promoter.Nucleic Acids Research,17,19-25)。

植物转化

将质粒通过热休克法插入根癌农杆菌菌株AGL1(Lazo等人,1991)。使用Rothamsted方法的改良，进行农杆菌介导的普通小麦不成熟胚转化(Wu等人,2003:Factors influencing successful Agrobacterium-mediated genetic transformation of wheat.Plant Cell Reports,21,659-668)。使用含有PPT的培养基选择植物，并将再生的小植物转移至温室以获得多个事件。通过Sourthern印迹分析证实单拷贝事件。

实施例11：小麦中HDC1过量表达对生物量的影响

植物材料和生长条件

为了评价含有HDC1基因的小麦(普通小麦)在干旱条件和对照条件下的反应，使用品种Fielder的几种独立事件，其中使用含有与作为可选择标志物的bar基因组合的单拷贝HDC1基因的根癌农杆菌转化所述事件。

在拉链封袋中播种每个事件的120粒种子和野生型品种Fielder的30粒种子并且将它们置于4℃的冰箱和12小时光照方案中。在8日后，将种子播种在9cm方形盆钵中并置于生长箱中，采用16小时光照方案(大约250par)，昼间温度20-22℃和夜间温度14-16℃。

植物材料的选择

在1-2叶期，将每个事件的植物采样用于bar和taqman的cRT-PCR，以检验HDC1基因的存在/不存在。对于每个事件，选择纯合植物用于实验。

处理

将全部植物均相同地用正常浇水处理直至播种后19日，此时进行两种处理。正常浇水(“对照”)维持最佳的浇水，而限制的浇水方案带来干旱胁迫(“干旱”)。在实验伊始测量所用土壤的土壤水容量(SWC)和土壤持水能力(SRC)。这些数据用来确定每种处理的盆钵目标重量。将正常浇水的盆钵保持在50％SRC，将限制的浇水方案中所用的盆钵保持在40％SRC。全部盆钵每日称重并且如果需要，添加水直至达到目标重量。植物按随机区组设计排序，每个纯合事件5次重复并以野生型品种Fielder作为对照。

采样测定鲜重

在处理14日后，播种后33日，收获全部植物以测定鲜重。

数据分析

全部数据均使用Excel记录。使用统计编程语言R分析数据。为了确定纯合基因型和野生型对照之间的效应，使用双因素ANOVA。

结果

在野生型对照或不成对植物中未检测到HDC1的表达，而在事件#1和事件#2中检测到HDC1的强烈过量表达(图24)。在事件#3中未测定表达，因为发现T-DNA的左边界不完整。在生物量实验中，3个独立事件(#1、2和3)在干旱下以及在对照条件下表现得更好(图20)。对于这些事件而言，与野生型对照相比，在干旱条件下生物量(鲜重)存在10-20％增长。这些事件显示与野生型对照相比，对照条件下生物量(鲜重)增加9-19％。

实施例12：小麦中HDC1过量表达对产量的影响

植物材料和生长条件

为了评价含有HDC1基因的小麦(普通小麦)在对照条件下的反应，使用品种Fielder的几种独立事件，其中使用含有与作为可选择标志物的bar基因组合的单拷贝HDC1基因的根癌农杆菌转化所述事件。利用PCR分析左边界/右边界，证实构建体的完整性，从实验排除全部边界不完整的事件。

在链封袋中播种每个事件的50粒种子和野生型品种Fielder的30粒种子并且将它们置于4℃的冰箱和12小时光照方案中。在8日后，将种子播种在9cm方形盆钵中并置于温室隔间中，采用16小时光照方案(大约250par)，昼间温度20-22℃和夜间温度14-16℃。在选择后，将植物移栽于17cm盆钵中并用滴灌浇水。培育植物直至完全成熟。

植物材料的选择

在1-2叶期，将植物采样用于bar和taqman的cRT-PCR，以检验HDC1基因的存在/不存在。每个株系中，选择3株纯合植物在正常浇水条件(“对照”)下培育。

产量性状观察结果

在种子产生期间分析以下性状：

分蘖数和穗数

每株植物的种子数

每株植物以克计的产量

数据分析

全部数据均使用Excel记录。使用统计编程语言R分析数据。为了确定纯合基因型和野生型之间的效应，使用双因素ANOVA。

结果

在野生型对照或不成对植物中未检测到HDC1的表达，而在事件#4和事件#5中检测到HDC1的强烈过量表达(图25)。与野生型对照相比，两个所研究的事件显示穗数增加14％(事件5)和35％(事件4)(图21)。这些事件显示与野生型对照相比，产量(克)增加14％(事件5)和23％(事件4)(图23)，和与野生型对照相比，产量(种子数)增加33％(事件5)和37％(事件4)(图22)。

实施例13：作物植物中的HDC1过量表达

根据本领域已知的标准方法，将HDC1过量表达构建体转化到除小麦之外的作物植物中，并且通过RT-PCR、Northern印迹或Western印迹法证实过量表达。在如上文所述的各种胁迫条件(例如水限制条件、盐胁迫、渗透胁迫)下培育或非胁迫条件下培育的过量表达HDC1的植物的(营养组织和种子)生物量与相同条件下培育的野生型植物比较。与野生型相比，在胁迫下和在非胁迫条件下均观察到HDC1-过量表达植物中生物量增加。

过量表达HDC1的以上植物的种子经受ABA、渗透胁迫和/或组蛋白脱乙酰酶抑制剂处理，并且与如上文所述的对照植物的种子比较萌发。与野生型种子相比，以上处理对过量表达HDC1的种子的萌发抑制较少。

另外，将过量表达HDC1的作物植物的开花时间、种子产量和植物高度与野生型植物比较。与野生型植物相比，过量表达的植物显示比野生型植物更早的开花时间、增加的种子产量和增加的植物高度。

Claims

1.方法，其用于增加植物、植物部分、植物器官或植物细胞对胁迫条件耐受性；或用于降低植物、植物部分、植物器官或植物细胞的ABA敏感性；或用于增加植物、植物器官或植物部分的生物量或产量或生长速率；或用于加速植物开花时间；所述方法包括步骤

a在所述植物、植物部分、植物器官或植物细胞中增加蛋白质的表达和/或活性，所述蛋白质具有含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的蛋白质的活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述胁迫条件是中度胁迫条件。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述增加具有含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的蛋白质的活性的蛋白质的表达和/或活性包括在所述植物细胞、植物部分、植物器官或植物中表达包含以下有效相连的元件的嵌合基因：

i.植物可表达启动子

ii.核酸，当转录时，所述核酸导致具有由SEQ.ID.NO.6编码的蛋白质的活性的蛋白质的活性和/或表达增加

iii.任选的，在植物中有功能的参与转录终止和多聚腺苷酸化的3’末端区。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述核酸编码具有含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的蛋白质的活性的蛋白质。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述核酸包含核酸序列，所述核酸序列编码与SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQID NO.38、SEQ ID NO.40或SEQ ID NO.41具有至少70％序列同一性的蛋白质，或所述核酸序列与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37或SEQ ID NO.39具有至少70％序列同一性。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述植物选自小麦、油菜、莴苣、烟草、棉花、玉米、稻、蔬菜植物、胡萝卜、黄瓜、韭葱、豌豆、瓜、马铃薯、番茄、高粱、黑麦、燕麦、甘蔗、花生、亚麻、菜豆、糖萝卜(sugar beet)、大豆、向日葵、观赏植物。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述胁迫条件选自干旱胁迫、盐胁迫、低养分水平、强光胁迫和氧化胁迫。

9.方法，其用于增强严重胁迫条件下植物、植物部分、植物器官或植物细胞存活、或用于增强严重胁迫后植物、植物部分、植物器官或植物细胞恢复或用于延迟植物开花时间，所述方法包括步骤：

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述减少表达和/或活性包括在所述植物细胞、植物部分、植物器官或植物中表达包含以下有效相连的元件的嵌合基因：

i.植物可表达启动子

ii.核酸，当转录时，所述核酸导致具有由SEQ.ID.NO.6编码的蛋白质的活性的蛋白质的活性和/或表达减少

11.根据权利要求10所述的方法，其中转录时，所述核酸产生HDC1抑制性RNA分子。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述启动子是诱导型启动子。

13.嵌合基因，如根据权利要求3-6或10-12任一项中所述。

14.植物、植物部分、植物器官、植物细胞或种子，其包含根据权利要求13所述的嵌合基因。

15.根据权利要求14所述的植物、植物部分、植物器官、植物细胞或种子，所述植物是油菜、莴苣、烟草、棉花、玉米、稻、小麦、蔬菜植物、胡萝卜、黄瓜、韭葱(leek)、豌豆、瓜、马铃薯、番茄、高粱、黑麦、燕麦、甘蔗、花生、亚麻、菜豆、糖萝卜、大豆、向日葵、观赏植物。

16.用于减少胁迫条件下植物产量损失的方法，包括表达在所述植物中表达根据权利要求3-6任一项中所述的嵌合基因。

17.方法，其用于产生具有增加的对胁迫条件的耐受性的植物、具有降低的ABA敏感性的植物、或具有增加的生物量或产量或生长速率的植物，或具有更早的开花时间的植物，所述方法包括步骤：

a.向植物的细胞引入根据权利要求3-6中任一项所述的嵌合基因以产生转基因细胞；并且

18.一种用于调节细胞中组蛋白乙酰化的方法，包括步骤调节所述细胞中具有由SEQ.ID.NO.6编码的蛋白质的活性的蛋白质的表达和/或活性，其中增加所述蛋白质的表达和/或活性抑制组蛋白乙酰化并且减少所述蛋白质的表达和/或活性增强组蛋白乙酰化。

19.根据权利要求3-6任一项中所述的嵌合基因的用途，用于增加植物、植物部分、植物器官或植物细胞对胁迫条件的耐受性；或用于降低植物、植物部分、植物器官或植物细胞的ABA敏感性；或用于增加植物、植物器官或植物部分的生物量或产量或生长速率；或用于加速植物开花时间。

20.根据权利要求14或15所述的植物的用途，以产生包含根据权利要求13所述的嵌合基因的种子。

21.根据权利要求14或15所述的植物的用途，所述植物包含根据权利要求3-6任一项中所述的嵌合基因，用于产生对胁迫条件、优选中度胁迫条件具有增加的耐受性的、或具有降低的ABA敏感性的、或具有增加的生物量或产量或生长速率的、或具有加速的开花时间的植物群体。

22.蛋白质，其具有含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的蛋白质的活性。

23.根据权利要求22所述的蛋白质，其与SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQID NO.26、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.40或SEQ ID NO.41具有至少70％序列同一性。

24.核酸，其编码根据权利要求22或23所述的蛋白质。

25.根据权利要求24所述的核酸，其与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.39具有至少70％序列同一性。