FR2848571A1 - Cassette d'expression codant pour une hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et plantes contenant un tel gene tolerantes aux herbicides - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une nouvelle cassette d'expression comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD) et son utilisation pour l'obtention de plantes résistantes à certains herbicides.

Description

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Cassette d'expression codant pour une Hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase et plantes contenant un tel gène tolérantes aux herbicides.

La présente invention concerne une nouvelle cassette d'expression comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour une hydroxy-phényl pyruvate dioxygénase (HPPD) et son utilisation pour l'obtention de plantes résistantes à certains herbicides.

Les hydroxy-phényl pyruvate dioxygénases sont des enzymes qui catalysent la réaction de transformation du para-hydroxy-phényl-pyruvate (HPP) en homogentisate.

Cette réaction a lieu en présence de fer (Fe2+) en présence d'oxygène (Crouch N. P. & al., Tetrahedron, 53,20, 6993-7010, 1997).

On connaît par ailleurscertaines molécules inhibitrices de cette enzyme, qui viennent se fixer à l'enzyme pour inhiber la transformation de l'HPP en homogentisate. Certaines de ces molécules ont trouvé un emploi comme herbicides, dans la mesure où l'inhibition de la réaction dans les plantes conduit à un blanchiment des feuilles des plantes traitées, et à la mort des dites plantes (Pallett K. E. et al. 1997 Pestic. Sci. 50 83-84). De tels herbicides ayant pour cible l'HPPD décrits dans l'état de la technique sont notamment les isoxazoles (EP 418 175, EP 470 856, EP 487 352, EP 527 036, EP 560 482, EP 682 659, US 5 424 276) en particulier l'isoxaflutole (IFT), herbicide sélectif du maïs, les dicétonitriles (EP 496 630, EP 496 631), en particulier la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-CF3 phényl) propane-1,3-dione et la 2-cyano- 3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-2,3 Cl2 phényl) propane-1, 3-dione, les tricétones (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195), en particulier la sulcotrione ou la mésotrione, ou encore les pyrazolinates.

Pour rendre les plantes tolérantes aux herbicides, on dispose de trois stratégies principales, (1) la détoxification de l'herbicide par une enzyme venant transformer l'herbicide, ou son métabolite actif, en produits de dégradation non toxique, comme par exemple les enzymes de tolérance au bromoxynil ou au basta (EP 242 236, EP 337 899) ; (2) la mutation de l'enzyme cible en une enzyme fonctionnelle moins sensible à l'herbicide, ou son métabolite actif, comme par exemple les enzymes de tolérance au glyphosate (EP 293356, Padgette S. R. & al., J. Biol. Chem., 266,33, 1991, FR 2 736 926) ; ou (3) la surexpression de l'enzyme sensible, de manière à produire dans la plante des quantités suffisantes d'enzyme cible au regard des constantes cinétiques de

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cette enzyme vis à vis de l'herbicide de manière à avoir suffisamment d'enzyme fonctionnelle, malgré la présence de son inhibiteur.

C'est cette troisième stratégie qui a été décrite pour obtenir avec succès des plantes tolérantes aux inhibiteurs d'HPPD (WO 96/38567), étant entendu que pour la première fois une stratégie de simple surexpression de l'enzyme cible sensible (non mutée) était employée avec succès pour conférer aux plantes une tolérance à un niveau agronomique à un herbicide. Un niveau agronomique de tolérance aux inhibiteurs d'HPPD a également été obtenue avec des HPPD chimères (WO 99/24586), et même amélioré avec des HPPD mutées dans leur partie C-terminale (WO 99/24586).

Alors que les HPPD de plantes sont des enzymes à localisation cytoplasmique (Garcia, I., et al. 1997. Biochem. J. 325 : il a également été montré que la meilleure tolérance était obtenue lorsque l'HPPD exogène était accumulée dans les plastes, plus particulièrement les chloroplastes.

Différentes cassettes d'expression susceptible d'améliorer le niveau de tolérance des plantes transformées ont été décrites avec différents éléments de régulations, et notament des promoteurs dits lumière dépendants (WO 99/25842) ou pour les plantes monocotylédones avec une séquence de régulation promotrice comprenant la combinaison du promoteur H3C4 d'histone de maïs et du premier intron de l'actine de riz (WO 99/34005).

La présente invention concerne donc une nouvelle cassette d'expression comprenant dans le sens de la transcription liées de manière fonctionnelle une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans les cellules végétales ou les plantes, une séquence d'acide nucléique codant pour une HPPD et une séquence de régulation terminatrice, fonctionnelle dans les cellules végétales ou les plantes, caractériséee en ce que la séquence de régulation promotrice est une séquence d'acide nucléique choisie parmi les séquences de régulation promotrice du virus de plante CsVMV (Cassava Vein Mosaic Virus).

Selon un des aspect de la présente invention, la cassette d'expression comprend un activateur de transcription ("enhancer") ou un intron entre la séquence de régulation promotrice et la séquence codant pour une HPPD.

Des séquences de régulation promotrice de CsVMV sont décrites dans la demande de brevet WO 97/48819, en particulier la séquence de régulation promotrice comprenant l'une des séquences nucléotidiques représentées par l'une des SEQ ID NO

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1, 2,3, 4, 5, 6,7, 8,9, 10,11, 12,13, 14,15 ou 16 de la demande de brevet WO 97/48819, plus particulièrement la séquence d'acide nucléique représentée par la SEQ ID NO 3 de la demande de brevet WO 97/48819.

Selon un premier mode préférentiel de réalisation de l'invention, la séquence de régulation promotrice comprend dans le sens de la transcription les séquences d'acide nucléique X, Y et Z telles que définies respectivement par les SEQ ID 1, 2 et 3 de la présente demande de brevet.

De manière préférentielle, la séquence de régulation promotrice est représentée par la SEQ ID NO 4 de la présente demande de brevet.

Selon un deuxième mode préférentiel de réalisation de l'invention, la séquence de régulation promotrice comprend dans le sens de la transcription les séquences d'acides nucléique X, Y, Y et Z telles que définies précédemment. La séquence de régulation promotrice comprenant la duplication de la séquence d'acide nucléique Y sera appelée double CsVMV.

De manière préférentielle, la séquence d'acide nucléique du double CsVMV est représentée par la SEQ ID NO 5 de la présente demande de brevet.

Par HPPD, on entend selon l'invention toute enzyme HPPD native, mutée ou chimère, présentant l'activité HPPD. De nombreuses HPPD sont décrites dans la littérature, notamment les notamment les HPPD de bactéries comme Pseudomonas (Rüetschi & al., Eur. J. Biochem., 205,459-466, 1992, WO 96/38567), de plantes comme d'Arabidopsis (WO 96/38567, Genebank AF047834) ou de carotte (WO 96/38567, Genebank 87257), de Coccicoides (Genebank COITRP), ou de mammifères comme la souris ou le cochon.

Par HPPD mutée, on entend selon l'invention les HPPD mutées pour obtenir des propriétés de tolérance aux herbicides inhibiteurs d'HPPD améliorées par rapport à l'HPPD native correspondante. De manière avantageuse, l'HPPD mutée est une HPPD mutée dans sa partie C-terminale telle que décrite dans la demande de brevet WO 99/24585.

Par HPPD chimère, on entend une HPPD comprenant des éléments provenants de différentes HPPD, notamment les HPPD chimères décrites dans la demande de brevet WO 99/24586.

De manière avantageuse, l'HPPD est une HPPD de Pseudomonas fluorescens (WO 96/38567).

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De manière avantageuse, l'HPPD mutée comprend la mutation W336 telle que décrite dans la demande de brevet WO 99/24585.

Il est connu dans la littérature que l'ajout d'une séquence codante correspondant à un peptide supplémentaire en N-ou C-terminal de la protéine va permettre le transport de celle ci vers un autre compartiment cellulaire que le cytoplasme où l'ARNm est traduit. Ce peptide dit peptide signal ou peptide de transit selon les cas, selon sa séquence va permettre le routage vers cet autre compartiment qui peut être par exemple le plaste (membrane ou stroma), le lumen du thylakoide ou la membrane du thylakoide, vers le réticulum endoplasmique, vers la vacuole, la paroi, les mitochondries, sans que cela soit exhaustif
Le peptide de transit permet d'adresser l'HPPD chimère dans les plastes, plus particulièrement les chloroplastes, la protéine de fusion peptide de transit/HPPD étant clivée entre le peptide de transit et l'HPPD chimère au passage de la membrane des plastes. Le peptide de transit peut être simple, comme un peptide de transit d'EPSPS (décrit dans le brevet US 5,188,642) ou un peptide de transit de celui de la petite sousunité de ribulose-biscarboxylase/oxygénase (ssu RuBisCO) d'une plante, éventuellement comprenant quelques acides aminés de la partie N-terminale de la ssu RuBisCO mature (EP 189 707) ou encore un peptide de transit multiple comprenant un premier pepde de transit de plante fusionné à une partie de la séquence N-terminale d'une protéine mature à localisation plastidiale, fusionnée à un deuxième peptide de transit de plante tel que décrit dans le brevet EP 508 909, et plus particulièrement le peptide de transit optimisé comprenant un peptide de transit de la ssu RuBisCO de tournesol fusionné à 22 acides aminés de l'extrémité N-terminale de la ssu RuBisCO de maïs fusionnée au peptide de transit de la ssu RuBisCO de maïs tel que décrit avec sa séquence codante dans le brevet EP 508 909.

Par séquence protéique signal, on entend selon l'invention tout peptide signal ou de transit permettant l'adressage de l'HPPD dans les compartiments cellulaires autres que le cytoplasme ou les plastes (en particulier chloroplastes).

Le rôle de telles séquences protéiques sont notamment décrites dans le numéro 38de le revue Plant molecular Biology (1998) consacré en grande partie aux transports des protéines dans les différents compartiments de la cellule végétale (Sorting of proteins to vacuoles in plant cells pp 127-144 ; the nuclear pore complex pp145-162 ; protein translocation into and across the chloroplastic enveloppe membranes pp 91-

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207 ; multiple pathways for the targeting of thylakoid proteins in chloroplasts pp 209- 221 ; mitochondrial protein import in plants pp 311-338).

De manière avantageuse, la séquence protéique signal permet l'adressage de l'HPPD vers le compartiment vacuolaire (vacuole). De tels peptides sont largements décrits dans la littérature (Neuhaus J. M. and Rogers J. C Sorting of proteins to vacuoles in plant cells Plant molecular Biology 38 : 1998).

De préférence, le peptide vacuolaire est le peptide vacuolaire de la protéine décrite dans J.M. Ferullo et al (Plant Molecular Biology 33 : 1997), fusionné à la partie C-terminale de l'HPPD.

La présente invention concerne également les séquences capables de s'hybrider de manière sélective avec la séquence d'acide nucléique ci-dessus, les séquences homologues à la séquence ci-dessus, les fragments des dites séquences, et les séquences qui diffèrent des séquences ci-dessus mais qui du fait de la dégénérescence du code génétique, codent pour la même protéine de fusion.

Selon la présente invention, on entend par séquence d'acide nucléique une séquence nucléotidique ou polynucléotide, pouvant être de type ADN ou ARN, de préférence de type ADN, notamment double brin.

Par séquence capable de s'hybridiser de manière sélective , on entend selon l'invention les séquences qui s'hybrident avec les séquences ci-dessus à un niveau suppérieur au bruit de fond de manière significative. Le bruit de fond peut être lié à l'hybridation d'autres séquences d'ADN présentes, notamment d'autres ADNc présentes dans une banque d'ADNc. Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybridiser de manière sélective et les séquences définies par les identifiant de séquence (SEQ ID) ci-dessus selon l'invention est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Le niveau d'interaction peut être mesuré par exemple, par marquage de la sonde avec des éléments radioactifs, comme le 32P.

L'hybridation sélective est généralement obtenue en employant des conditions de milieu très sévères (par exemple NaCl 0,03 M et citrate de sodium 0,03 M à environ 50 C-60 C). L'hybridation peut bien entendu être effectuée selon les méthodes usuelles de l'état de la technique (notamment Sambrook & al., 1989, Molecular Cloning : A Labratory Manual).

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Par homologue , on entend selon l'invention un fragment d'acide nucléique présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la séquence nucléotidique codant pour la protéine de fusion selon l'invention. Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation, ou encore en choisissant les oligonucléotides synthétiques employés dans la préparation de ladite séquence par hybridation. Au regard des multiples combinaisons d'acides nucléiques pouvant conduire à l'expression d'un même acide aminé, les différences entre la séquence de référence selon l'invention et l'homologue correspondant peuvent être importantes. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport à la séquence de référence, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Ces modifications sont généralement et de préférence neutres, c'est à dire qu'elles n'affectent pas la séquence primaire de la protéine de fusion.

Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP ou BLAST (notamment Altschul & al., 1993, J.

Mol. Evol. 36 :290-300 ; Altschul & al., 1990, J. Mol. Biol. 215 :403-10).

Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre polypeptides ou protéines sont également connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple le package UWGCG et le programme BESTFITT pour calculer les homologies (Deverexu & al., 1984, Nucleic Acid Res. 12, 387-395).

Par fragments , on entend selon l'invention des fragments des séquences d'ADN selon l'invention, c'est à dire les séquences ci-dessus pour lesquelles des parties ont été délétées mais qui conservent la fonction des dites séquences.

L'invention a encore pour objet l'utilisation de la cassette d'expression selon l'invention dans un procédé pour la transformation des plantes, comme gène marqueur ou comme séquence codante permettant de conférer à la plante une tolérance aux herbicides inhibiteurs d'HPPD. Cette cassette d'expression peut bien entendu également être utilisée en association avec d'autre (s) marqueur (s) séquence (s) pour une ou plusieurs propriétés agronomiques.

Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.

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On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton, etc.

Selon l'invention, on peut également utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice selon l'invention, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"), comme par exemple l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (VMT) décrit dans la demande WO 87/07644, du virus etch du tabac (TEV) décrit par Carrington & Freed, ou du virus de la mosaïque du figwort (Figwort Mosaic Virus, US 5 994 521) ou encore des introns, en particulier des intron favorisant l'expression des gènes dans les plantes monocotylédones tels que l'intron 1 du gène de l'actine de riz tel que décrit dans la demande de brevet WO 99/34005, ou l'intron adhl de maïs
Comme séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, on peut utiliser toute séquence correspondante d'origine bactérienne, comme par exemple le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, d'origine virale, comme par exemple le terminateur du CaMV 35S, ou encore d'origine végétale, comme par exemple un terminateur d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633317.

La présente invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression pour la transformation d'un organisme hôte contenant au moins un gène chimère tel que défini ci-dessus. Ce vecteur comprend outre le gène chimère ci-dessus, au moins une origine de réplication. Ce vecteur peut être constitué par un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus, transformés par l'introduction du gène chimère selon l'invention. De tels vecteurs de transformation en fonction de l'organisme hôte à transformer sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. Pour la transformation des cellules végétales ou des plantes, il s'agira notamment d'un virus qui peut être employé pour la transformation des plantes développées et contenant en outre ses propres éléments de réplication et d'expression.

De manière préférentielle, le vecteur de transformation des cellules végétales ou des plantes selon l'invention est un plasmide.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le vecteur comprend outre le

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gène chimère selon l'invention, un autre gène chimère codant pour un autre gène d'intérêt. Il peut s'agir d'un gène codant pour un marqueur de sélection comme d'un gène conférant à la plante transformée de nouvelles propriétés agronomiques, ou d'un gène d'amélioration de la qualité agronomique de la plante transformée.

Marqueurs de Sélection
Parmi les gènes codant pour des marqueurs de sélection, on peut citer les gènes de résistance aux antibiotiques, les gènes de tolérance aux herbicides (bialaphos, glyphosate ou isoxazoles), des gènes codant pour des enzymes rapporteurs facilement identifiables comme l'enzyme GUS, des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet EP 242 236, EP 242 246, GB 2 197 653, WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 ou WO 97/04103.

Gènes d'intérêt
Parmi les gènes conférant de nouvelles propriétés agronomiques aux plantes transformées, on peut citer les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, ceux conférant une résistance à certains insectes, ceux conférant une tolérance à certaines maladies, etc. De tels gènes sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071 et WO 95/06128.

Tolérance herbicide
Parmiles gènes conférant une tolérance à certains herbicides, on peut citer le gène Bar conférant une tolérance au bialaphos, le gène codant pour une EPSPS appropriée conférant une résistance aux herbicides ayant l'EPSPS comme cible comme le glyphosate et ses sels (US 4,535,060, US 4,769,061, US 5,094,945, US 4,940,835, US 5,188,642, US 4,971,908, US 5,145,783, US 5,310,667, US 5,312,910, US 5,627,061, US 5,633,435, FR 2 736 926), le gène codant pour la glyphosate oxydoréductase (US 5,463,175).

Parmi les gènes codant pour une EPSPS appropriée conférant une résistance aux herbicides ayant l'EPSPS comme cible, on citera plus particulièrement le gène codant pour une EPSPS végétale, en particulier de maïs, présentant deux mutations 102 et 106, décrit dans la demande de brevet FR 2 736 926, dénommé ci-dessous EPSPS double mutant, ou encore le gène codant pour une EPSPS isolée d'Agrobacterium décrit par les SEQ ID 2 et ID 3 du brevet US 5,633,435, dénommé

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ci-dessous CP4.

Dans les cas des gènes codant pour EPSPS, et plus particulièrement pour les gènes ci-dessus, la séquence codant pour ces enzymes est avantageusement précédée par une séquence codant pour un peptide de transit, en particulier pour le peptide de transit tel que défini ci-dessus.

Résistance aux Insectes
Parmi les protéines d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux insectes, on citera plus particulièrement les protéines Bt largement décrites dans la littérature et bien connues de l'homme du métier. On citera aussi les protéines extraites de bactéries comme Photorabdus (WO 97/17432 & WO 98/08932).

Résistance aux Maladies
Parmi les protéines ou peptides d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux maladies on citera notamment les chitinases, les glucanases, l'oxalate oxydase, toutes ces protéines et leurs séquences codantes étant largement décrites dans la littérature. ou encore les peptides antibactériens et/ou antifongiques, en particulier les peptides de moins de 100 acides aminés riches en cystéines comme les thionines ou défensines de plantes, et plus particulièrement les peptides lytiques de toutes origines comprenant un ou plusieurs ponts disulfures entre les cystéines et des régions comprenant des acides aminés basiques, notamment les peptides lytiques suivants : l'androctonine (WO 97/30082 et WO 99/09189), la drosomicine (WO 99/02717) ou la thanatine (WO 99/24594).

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la protéine ou peptide d'intérêt est choisi parmi les peptides éliciteurs fongiques, en particulier les élicitines (Kamoun & al., 1993 ; Panabières & al., 1995).

Modification de la qualité
On peut également citer les gènes modifiant la constitution des plantes modifiées, en particulier la teneur et la qualité de certains acides gras essentiels (EP 666 918) ou encore la teneur et la qualité des protéines, en particuliers dans les feuilles et/ou les graines desdites plantes. On citera en particulier les gènes codant pour des protéines enrichies en acides aminés soufrés (Korit, A.A. & al., Eur. J. Biochem.

(1991) 195, 329-334 ; WO 98/20133 ;WO 97/41239 ; WO 95/31554 ; WO 94/20828 ; WO 92/14822). Ces protéines enrichies en acides aminés soufrés auront également pour fonction de piéger et stocker la cystéine et/ou la méthionine excédentaire,

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permettant d'éviter les problèmes éventuels de toxicité liés à une surproduction de ces acides aminés soufrés en les piégeant. On peut citer également des gènes codant pour des peptides riches en acides aminés soufrés et plus particulièrement en cystéines, les dits peptides ayant également une activité antibactérienne et/ou antifongique. On citera plus particulièrement les défensines de plantes, de même que les peptides lytiques de toute origine, et plus particulièrement les peptides lytiques suivants : l'androctonine, la drosomicine ou la thanatine.

L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des organismes hôtes, en particulier des cellules végétales par intégration d'au moins une séquence d'acide nucléique ou un gène chimère tels que définis ci-dessus, transformation qui peut être obtenue par tout moyen connu approprié, amplement décrit dans la littérature spécialisée et notamment les références citées dans la présente demande, plus particulièrement par le vecteur selon l'invention.

Une série de méthodes consiste à bombarder des cellules, des protoplastes ou des tissus a ec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. Une autre série de méthodes consiste à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens ou Ri d'Agrobacterium rhizogenes. D'autres méthodes peuvent être utilisées telles que la micro-injection ou l'électroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG. L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de l'organisme hôte, en particulier de la cellule végétale ou de la plante.

La présente invention a encore pour objet les cellules végétales ou les plantes transformées et contenant un gène chimère selon l'invention. De préférence, le gène chimère est intégré de manière stable dans le génome des cellules végétales ou des plantes.

Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, les cellules végétales ou les plantes comprennent outre le gène chimère selon l'invention, un autre gène chimère codant pour un autre gène d'intérêt tel que défini ci-dessus.

Les différents gènes chimères peuvent être intégrés dans le génome de l'organisme hôte par transformation au moyen d'un vecteur selon l'invention comprenant les différents gènes chimères tels que définis ci-dessus.

Les différents gènes chimères peuvent également être intégrés de manière stable dans le génome de l'organisme hôte par co-transformation au moyen de

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plusieurs vecteurs, chacun comprenant au moins un gène chimère devant être intégré dans le génome de l'organisme hôte.

La présente invention a encore pour objet les plantes transformées, dans le génome desquelles au moins un gène chimère selon l'invention est intégré de manière stable. Les plantes selon l'invention contiennent des cellules transformées telles que définies ci-dessus, en particulier les plantes régénérées à partir des cellules transformées ci-dessus. La régénération est obtenue par tout procédé approprié qui dépend de la nature de l'espèce, comme par exemple décrit dans les références cidessus. Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevet suivants : 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US
5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.

La présente invention concerne également les plantes transformées issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les graines de plantes transformées, lesdites plantes ou graines comprenant au moins un gène chimère selon l'invention.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les plantes transformées comprennent outre le gène chimère selon l'invention, un autre gène chimère codant pour un autre gène d'intérêt tel que défini ci-dessus.

Les différents gènes chimères dans les plantes transformées selon l'invention peuvent provenir soit de la même plante transformée parente, et dans ce cas la plante est issue d'un seul procédé de transformation/régénération avec les différents gènes chimères contenus dans un même vecteur ou par co-transformation au moyen de plusieurs vecteurs. Elle peut également être obtenue par le croisement de plantes parentes contenant chacune au moins un gène chimère, l'une des plantes parentes comprenant au moins un gène chimère selon l'invention.

Les plantes transformées pouvant être obtenues selon l'invention peuvent être du type monocotylédones telles que par exemple les céréales, la canne à sucre, le riz et

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le maïs ou dicotyledones comme par exemple le tabac, la soja, le colza, le coton, la betterave, le trèfle, etc.

L'invention a aussi pour objet un procédé de désherbage sélectif de plantes, notamment de cultures, à l'aide d'un inhibiteur de l'HPPD notamment un herbicide définit auparavant, caractérisé en ce qu'on applique cet herbicide sur des plantes transformées selon l'invention, tant en présemis, en prélevée qu'en postlevée de la culture.

La présente invention concerne également un procédé de contrôle des mauvaises herbes dans une surface d'un champ comprenant des graines ou des plantes transformées avec le gène chimère selon l'invention, lequel procédé consiste à appliquer dans la dite surface du champ une dose toxique pour les dites mauvaises herbes d'un herbicide inhibiteur d'HPPD, sans toutefois affecter de manière substantielle les graines ou plantes transformée avec le dit gène chimère selon l' invention.

La présente invention concerne également un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention avec un gène chimère selon l'invention lequel procédé consiste à smer les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface du dit champ une dose toxique pour les mauvaises herbes d'un herbicide ayant pour cible l'HPPD défini ci-dessus en cas de présence de mauvaises herbes, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.

Par sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées , on entend selon l'invention que les plantes comprenant la cassette d'expression selon l'invention, soumises à une application d'une dose d'herbicide toxique pour les mauvaises herbes, présentent une phytotoxicité légère ou nulle. Par dose toxique pour les mauvaises herbes, on entend selon l'invention une dose d'application de l'herbicide pour laquelle les mauvaises herbes sont tuées. Par phytotoxicité légère on etend selon l'invention un pourcentage de feuilles blanchies inférieur à 25%, préférentiellement inférieur à 10%, plus préférentiellement inférieur à 5%. Il est entendu également selon la présente invention que l'application de la même dose toxique sur une plante autrement comparable non transformée, c'est à dire ne

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comprenant pas la cassette d'expression selon l'invention, conduirait à observer sur ladite plante des symtomes de phytotoxicité suppérieurs à ceux observés pour la plante transformée comprenant la cassette d'expression selon l'invention.

Dans les deux procédés ci-dessus, l'application de l'herbicide ayant pour cible l'HPPD peut être faite selon l'invention, tant en présemis, en prélevée qu'en postlevée de la culture.

Par herbicide au sens de la présente invention on entend une matière active herbicide seule ou associée à un additif qui modifie son efficacité comme par exemple un agent augmentant l'activité (synergiste) ou limitant l'activité (en anglais safener).

Les herbicides inhibiteurs d'HPPD sont en particulier définis auparavant. Bien entendu, pour leur application pratique, les herbicides ci-dessus sont associée de manière en soi connue aux adjuvants de formulations utilisés habituellement en agrochimie.

Dans es trois procédés cités ci-dessus, les herbicides inhibiteurs d'HPPD sont choisis parmi les isoxazoles en particulier l'isoxaflutole, les dicétonitriles en particulier la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-CF3 phényl) propane-1,3-dione et la 2cyano-3-cyclopropyl-1-(2-SO2 CH3-4-2,3 Cl2 phényl) propane-1, 3-dione, les tricétones, en particulier la sulcotrione ou la mésotrione, ou les pyrazolinates.

Lorsque la plante transformée selon l'invention comprend un autre gène de tolérance à un autre herbicide (comme par exemple un gène codant pour une EPSPS mutée ou non conférant à la plante une tolérance au glyphosate), ou lorsque la plante transformée est naturellement insensible à un autre herbicides, le procédé selon l'invention peut comprendre l'application simultanée ou décalée dans le temps d'un inhibiteur d'HPPD en association avec ledit herbicide, par exemple le glyphosate.

L'invention a encore pour objet l'utilisation du gène chimère codant pour une protéine de fusion selon l'invention comme gène marqueur au cours du cycle "transformation-régénération" d'une espèce végétale et sélection sur l'herbicide cidessus.

Lorsque le gène chimère selon l'invention est combiné dans un même vecteur à un autre gène chimère codant pour une protéine d'intérêt conférant de nouvelles propriétés agronomiques autre qu'un gène de tolérance herbicide (résistance aux insectes, résistance aux maladies, modification de la qualité), l'application de l'herbicide inhibiteur d'HPPD sur les plantes transformées et leurs descendances,

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permet de sélectionner dans les champs les plantes issues d'un croisement entre une plante parente comprenant les deux gènes chimères et une plante non transformée qui auront conservé les gènes chimères.

Les différents aspects de l'invention seront mieux compris à l'aide des exemples expérimentaux ci-dessous.

Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans ces exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F. M. et al , publiés par Greene Publishing Associates et Wiley-Interscience (1989) ou dans Molecular cloning, T. Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambrook,1982.

Description des figures :
Figure 1 : extrait de la carte du plasmide pILTAB 357
Figure 2 : séquence du promoteur CsVMV (de Hind III à Xba I, 539 bp)
Figure 3: carte du plasmide pRD 254
Figure 4 : carte du plasmide pRD 257 Figure 5 : du plasmide pCH 10 Figure 6 : du plasmide pCH 27 Figure 7 : du plasmide pCH 27 PCR 1 Figure 8 : du plasmide pCH 27 pCR 2 Figure 9 : du plasmide pCH 45 Figure 10 : du plasmide pCH 13 D
Figure 11: carte du plasmide pCH 43 D Figure 12 : du plasmide pCH 55 D.

Figure 13 : de germination in vitro de descendants Tl de lignées de tabacs transformées avec pCH 43 K Figure 14 : de germination in vitro de descendants Tl de lignées de tabacs transformées avec pCH 55 K
Tous les plasmides décrits ci-dessous ont été mobilisés dans la souche E.coli DH5 alpha, à l'exception de pTVK 291 et ses dérivés qui sont mobilisés dans C2110.

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Example 1 : Clonage de la séquence du promoteur CsVMV dans le vecteur de clonage multiple pRD 254
Le plasmide pILTAB 357 fourni par le The Scripps Research Institute, La Jolla, USA (Figure 1), contient les éléments suivants dans un vecteur pBIN 19 (Clontech): promoteur CsVMV (séquence donnée Figure 2, SEQ ID NO 4) site de clonage multiple terminateur NOS
Trois régions ont été définies dans la séquence du promoteur CsVMV, dénommées CsVMV X, CsVMV Y, et CsVMV Z.

CsVMV X : de la position 9 à la position 227 (SEQ ID NO 1, longueur 218 bp)
CsVMV Y : de la position 228 à la position 395 (SEQ ID NO 2, longueur 167 bp)
CsVMV Z : de la position 396 à la position 522 (SEQ ID NO 3, longueur 126 bp)
Dans la séquence originale du promoteur CsVMV, les régions X et Y sont adjascentes, ainsi que les regions Y et Z.

Le vecteur de clonage pRD 254 correspond au vecteur commercial pBlueScripi II SK (-) (Clontech) mutagénisé pour remplacer le site unique Sca 1 contenu dans le gène ApR gène par un site Pvu II (Figure 3).

Les 532 bp contenues entre les sites Hind III et Xba 1 de pILTAB 357 a été cloné dans le vecteur de clonage pRD 254 pour obtenir le plasmide pRD 257 (Figure 4).

Example 2 : Insertion de la séquence du CsVMV dans une cassette d'expression OTP-HPPD pCH 10 est un plasmide de base pUC 19 qui contient une cassette d'expression OTP/HPPD. Cette cassette comprend les composants suivants: promoteur histone H3C4 de maïs premier intron du gène d'actine de riz peptide de transit optimisé (OTP)
HPPD
NOS.

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La SEQ ID NO 6 en annexe décrit la séquence de pCH 10 comprise entre les sites NcoI et Xbal.

Dans pCHlO, la région promoteur histone de maïs + intron d'actine de riz été excisée avec les enzymes de restriction Xholet Not I, pour être remplcée par la séquence du promoteur CsVMV contenue dans pRD 257 comme suit:
1. Ouverture de pRD 257 avec Not I, remplissage de l'extrémité Notl avec une polymérase de Klenow et excision du fragment de promoteur avec Xhol.

2. Purification du fragment de 560 bp -XhoI-NotI contenant la séquence du promoteur CsVMV.

3. Ouverture de pCH 10 avec Ncol, remplissage de l'extrémité NcoI avec une polymérase de Klenow et excision du fragment promoteur histone de maïs + intron d'actine de nzavec XhoI.

4. Purification de la molécule acceptrice 4591 bp-XhoI-NcoI(filled in).

5. Libation des deux fragments purifiés pour obtenir pCH 27 (Figure 6).

Example 3: Construction d'un promoteur chimère double-CsVMV
A partir de pCH 27, une version chimère du promteur CsVMV a été préparée qui contient une duplication de la region interne Y. A cette fin, deux séries (Setl et Set2 d'oligonucléotides ont été préparées, correspondant aux séquences suivantes:
Setl Universal M13 primer: GAGGAAACAG CTATGACCAT GATT (SEQ ID NO 7)
CsVMV63 : GGACTAGTGA CACGGAAAAA TATAAAAGG (SEQ ID NO 8)
Set 2
CsVMV222 : GGACTAGTGA AGACGTAAGC ACTGACG (SEQ ID NO 9)
CsVMV3' : AAGCCATGGG CCGCTTTAGA (SEQ ID NO 10)
Une réaction PCR a été conduite avec pCH 27 comme matrice et les oligonucleotides du setl comme amorces pour obtenir un produit PCR de 493-bp correspondant à la Figure 7 (PCR pCH27-1).

Une réaction PCR a été conduite avec pCH 27 comme matrice et les oligonucleotides du set2 comme amorces pour obtenir un produit PCR de 332-bp correspondant à la Figure 8 (PCR pCH27-2).

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Un plasmide comprenant la région CsVMV Y dupliquée a été obtenu comme suit
1. Restriction de PCR pCH27-1 avec Xhol et Spel
2. Restriction de pCR pCH 27-2 avec Spel et Ncol
3. Restriction de pCH 27 avec Xhol et Spel et purification du plasmide accepteur de 4591-bp
4. Ligation des 3 fragments pour generrer pCH 45 (Figure 9).

Example 4: Intégration de la cassette d'expression dans un vecteur-tDNA d'Agrobacterium pCH 13 D (Figure 10) est un plasmide navette construit dans le laboratoire pour être recombiné dans le plasmide superbinaire pTVK 291 (Jun et al., 1987). La recombinaison entre les sites COS uniques présents sur les deux plasmides conduit à une molécu@ circulaire unique correspondant à la fusion des deux plasmides.

Le fragment PvuII-PvuII de 2791 bp contenant la cassette CsVMV-OTPHPPD-NOS a été excisé de pCH 27 et cloné dans le site Pmel de pCH 13D pour donner pCH 13 D (Figure 11).

Le fragment Xbal-Pvull de 2821 bp contenant la cassette double CsVMV XYYZ-OTP-HPPD-NOS a été excisé de pCH 45et cloné entre les sites Avril and Pmel de pCH 13D pour donner pCH 55 D (Figure 12).

La recombinaison entre pCH 43 D (ou respectivement pCH 55 D) et le plasmide superbinaire pTVK 291 a été obtenue par croisement triparental avec DH5 alpha [pCH 43 D] (resp. DH5 alpha [pCH 55D]), C2110 [pTVK 291], et la souche helper JC 2073. Le plasmide résultant est dénommé pCH 43 K (resp. pCH 55 K). La souche obtenue, C2110 [pCH 43 K] (resp. C2110 [pCH 55K]) a été sélectionnée sur milieu LB contenant les 3 antibiotiques gentamycine, kanamycine et acide nalidixique.

L'acide nalidixique permet la sélection de C2110 contre DH5 alpha ou JC2073; puisque C2110 contient une résistance chromosomale à l'acide nalidixique qui ne peut être transférée aux autres souches durant le croisement. L'association de la gentamycine et de la kanamycine permet la sélection des bactéries contenant pCH 43 D (resp. pCH 55 D) et pTVK 291. De plus, pCH 43 D (resp. pCH 55 D) ne peut se répliquer dans C2110, à moins d'avoir été recombiné avec pTVK 291, puisque C2110

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contient l'origine de réplication RK2 supportée par pTVK 291, mais pas l'origine de réplication pBR 322 supportée par pCH 43 D (resp. pCH 55 D).

Le plasmide recombiné a ensuite été transféré dans la souche d'Agrobacterium LBA 4404 par un deuxième croisement triparental. La souche résultante LBA 4404 [pCH 43 K] (resp. LBA 4404 [pCH 55 K]) a été sélectionnée sur milieu AB (sélectif pour Agrobacterium) contenant de la kanamycine et de la gentamycine.

Example 5: Transformation de tabacs par Agrobacterium tumefaciens avec les cassettes d'expression
La transformation du tabac, Nicotiana tabacum var. Petit Havana par Agrobacterium a été effectuée selon les procédures standard d'infection et de régénération de disques foliaires et sélection par la kanamycine.

Dix lignées de tabac ont été obtenues avec LBA 4404 [pCH 43 K], et 13 lignées de tabac ont été obtenues avec LBA 4404 [pCH 55 K]. Les plantes régénérées onté été transférées en serre. Après floraison et autopolination, les graines Tl de chaque ligénc- onté été recueillies. Les lignées transformées avec LBA 4404 [pCH 43 K] ont été ensuite référencées 43. 1, 43.2, 43.3, 43. 4, 43. 5, 43. 6, 43. 7, 43. 8, 43. 9 et 43. 11. Les 'ignées transformées avec LBA 4404 [pCH 55 K] ont été ensuite référencées @5.1, 55. 2, 55. 6, 55. 8, 55. 11, 55. 12, 55. 13, 55. 14, 55. 15, 55. 16, 55. 17, 55.18 et 55.19.

Example 6:Test de germination in vitro
Dans ce test, des graines de Petit Havana sauvage ont été employées comme contrôle négatif. Comme contrôle positif, les graines de lignées transgéniques PBD6 T2 ont été employées comme référence. Cette lignée transgénique comprend une cassette d'expression codant pour une HPPD sous le contrôle d'un promoteur de la petite sous unité de la RuBisCO de tournesol (Heliantus annuus) Cette lignée référencée 7 1, décrite dans la demande de brevet WO 99/25842 a montré la meilleur tolérance à 1 IFT jamais décrite à notre connaissance dans le tabac. Des boîtes de petri carrées contenant 16 puits carrés de 30 mm de progondeur ont été remplies avec un milieu Murashige and Skoog autoclave (Difco) contenant 15 g/L de phyto Agar (Difco) ,10 g/L de sucrose, et soit 0 ou 8 ppm de DKN [lequel] (4 mL dans chaque puit). Les capsules de tabac contenant Tl ont été aspergées avec de l'éthanol à 70%

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puis ouvertes avec des instruments stériles pour obtenir des graines stériles. Pour chaque lignée et chaque concentration en DKN, 25 graines ont été placées à la surface d'un milieu solide pour germination dans une chambre de culture (24 C, 16h jour/ 8h nuit). Après une période de croissance de 10 jours, une note de 0 à 4 a été attribuée à chaque plantule ayant poussé avec 8 ppm de DKN, selon la grille de notation suivante: taille : - taille normale (comparée aux plantules non traitées de la même lignée): 2 points - taille naine (cotyledons non développés): 0 point - taille intermédiaire : 1 point
Symptomes de phytotoxicité: - aucuns : points - intermédiaire (quelques parties vertes): 1 point.

- compètement brulées ou blanchiées : point - pas de germination : non comptée - complètement blanche (plantes non transgéniques): non comptées
La somme des scores de toutes les plantules de la même lignée, exprimée en pourcentage Je la notation totale des lignées contrôles 7.1, sont reportées sur la Figure
13. Les numéros entre parenthèses indiquent le nombre de plantules notées pour une ligne donnée après élimination des plantes transgéniques ou des graines non germées.

Le test a été répété une fois par deux personnes différentes. Les notes observées avec les lignées transgéniques transformées avec LBA 4404 [pCH 55 K] sont donnés sur la Figure 14. L'absence de données correspond à des cellules contaminées. Dans ce test, les notes observées pour toutes les lignées testées ont été trouvées entre 2 et 9 fois plus grandes que celles de la ligéne contrôle.

Example 7 : Evaluationen serre en pré-émergence
Dans ce test, les même contrôles positifs et négatifs de l'exemple 6 ont été employés. Approximativement 100 graines Tl de chaque lignée ont été semées sur 3 plateaux (20 cm longueur x 15cm largeur x 5 cm profondeur) remplis de vermiculite préalablement imbibée avec une solution nutritive standard 20 :20:20 plateaux par lignée). Deux plateaux ont été aspergés avec une solution d' IFT à deux concentrations (0.1g/L et 0. 2 g/L respectivement). L'appareil pour asperger a été calibré pour délivrer

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une dose d'IFT correspondant à 50 g/ha pour le premier plateau et 100g/ha pour le second.Le troisièmme plateau est resté non traité (contrôle).

Durant les 3 premiers jours suivant le semis les plateaux ont été couverts avec une feuille de matière plastique transparente recouverte par une feuille de papier blanche de manière à réduire l'intensité lumineuse. Après le troisième jour, les plateaux ont été découverts et les plantules laissées croître pendant 7 jours supplémentaires avec arosage quotidien avec une solution nutritive. Pour chaque plateau, le niveau de phytotoxicité et le retard à la croissance par rapport au plateau non traité a été estimé et rapporté dans le Tableau ci-dessous. Les plantules Tl non transgéniques apparaissant complètement blanches sur les plateaux traités sont comptés pour déterminés le nombre de locus indépendants pour l'intégration des tDNA dans chaque lignée. Les résultats sont présentés sur les Tableaux 1 et 2 cidessous.

Tableau 1: Lignées transformées avec pCH 43 K

<tb>
<tb> Dose <SEP> IFT <SEP> 7.1 <SEP> 43. <SEP> 1 <SEP> 43.2 <SEP> 43.3 <SEP> 43.4 <SEP> 43.5 <SEP> 43.6 <SEP> 43.7 <SEP> 43.8 <SEP> 43.9 <SEP> 43.11
<tb> g/ha
<tb> Phytotoxicité <SEP> 50 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 100 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Retard <SEP> 50 <SEP> ++ <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> Croissance
<tb> 100 <SEP> +++ <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ++
<tb> Nb <SEP> de <SEP> Locus <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 2
<tb> 15
<tb>
Tableau 2 : transformées avec pCH 55 K

<tb>
<tb> Dose <SEP> IFT <SEP> 55.1 <SEP> 55.2 <SEP> 55.6 <SEP> 55.8 <SEP> 55.11 <SEP> 55.12 <SEP> 55.13 <SEP> 55.14 <SEP> 55.15 <SEP> 55.16 <SEP> 55.17 <SEP> 55.18 <SEP> 55.19
<tb> g/ha
<tb> Phytotoxicité <SEP> 50 <SEP> @ <SEP> - <SEP> + <SEP> ± <SEP> ± <SEP> - <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP>
<tb> 100 <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> ++ <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> ++
<tb> Retard <SEP> 50 <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++ <SEP> - <SEP> ++ <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> -
<tb> 100- <SEP> - <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> - <SEP> +++ <SEP> + <SEP> + <SEP> +Nb <SEP> de <SEP> locus <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb>
rhytotoxicite: -:nulle + : légère (5-25 % surface de feuilles blanchies) ++ : intermédiaire (25-50% surface de feuilles blanchies) +++: intense (>50% surface de feuilles blanchies)

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Retard de croissance (comparé aux contrôles non traités): -: nul + : léger (cotylédons complètement développés, première feuilles retardée) ++ : intermédiare (cotylédons développés, pas de première feuilles visibles) +++: intense (cotylédons non développés).

Exemple 8 : Insertion de la séquence du CsVMV dans une cassette d'expression ActinOS intron-OTP-HPPD pCH 10 (figure 5) est un plasmide de base pUC 19 qui contient une cassette d'expression OTP/HPPD. Cette cassette comprend les composants suivants: promoteur histone H3C4 de maïs (Mc Elroy et al., 1990, Plant Cell 2(2) : 163-171). premier intron du gène d'actine de riz (Mc Elroy et al., , MGG 231(1) : 150- 160). peptide de transit optimisé (OTP)
HPPD
NOS
La SEQ ID NO 6 décrit la séquence de pCH 10 comprise entre les sites Ncol et Xbal.

Dans pCHlO, la région promoteur histone de maïs a été excisé par les enzymes de restriction Xhol et SacII, pour être remplacé par laséquence du CsVMV contenue dans le pRD257. Le fragment du CsVMV a été obtenu par digestion de pRD257 par Xhol et SacII. La ligation de la molécule acceptrice 5107bp (XhoI-SacII) et de la séquence du CsVMV 566bp (XhoI-SacII) a donné pCH26 (figure 15) Exemple 9 : Intégration de la cassette d'expression dans un vecteur-tDNA d'Agrobacterium pCH 21 D (Figure 16) est un plasmide navette construit dans le laboratoire pour être recombiné dans le plasmide superbinaire pTVK 291 (Jun et al., 1987). La

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recombinaison entre les sites COS uniques présents sur les deux plasmides conduit à une molécule circulaire unique correspondant à la fusion des deux plasmides.

Le fragment PacI-PvuII de 3197bp contenant la cassette CsVMVintron actin-OTP-HPPD-Nos a été excisé de pCH26 et cloné dans les sites PacI-MscI de pCH21D pour donner pCH31D (Figure 17).

Le fragment PacI-PvuII de 2679bp contenant la cassette CsVMVOTP-HPPD-Nos a été excisé de pCH27 et cloné dans les sites PacI-MscI de pCH21D pour donner pCH32D (Figure 18).

La recombinaison entre pCH 31 D (ou respectivement pCH 32 D) et le plasmide superbinaire pTVK 291 a été obtenue par croisement triparental avec DH5 alpha [pCH 31 D] (resp. DH5 alpha [pCH 32 D]), C2110 [pTVK 291], et la souche helper JC 2073. Le plasmide résultant est dénommépCH 31 K (resp. pCH 32 K). La souche obtenue, C2110 [pCH 31 K] (resp. C2110 [pCH 32 K]) a étésélectionnéesur milieu LB contenant les 3 antibiotiques gentamycine, kanamycine et acide nalidixique. L'acide nalidixique permet la sélection de C2110 contre DH5 alpha ou JC2073 ; puisque C2110 contient une résistance chromosomale à l'acide nalidixique qui ne peut @tre transférée aux autres souches durant le croisement. L'association de la gentamycine et de la kanamycine permet la sélection des bactéries contenant pCH 31 D (resp. pCH 32 D) et pTVK 291. De plus, pCH 31 D (resp. pCH 32 D) ne peut se répliquer dans C2110, à moins d'avoir été recombiné avec pTVK 291, puisque C2110 contient l'origine de réplication RK2 supportée par pTVK 291, mais pas l'origine de réplication pBR 322 supportée par pCH 31 D (resp. pCH 32 D).

Le plasmide recombiné a ensuite ététransférédans la souche d'Agrobacterium LBA 4404 par un deuxième croisement triparental. La souche résultante LBA 4404 [pCH 31 K] (resp. LBA 4404 [pCH 32 K]) a étésélectionnéesur milieu AB (sélectif pour Agrobacterium) contenant de la kanamycine et de la gentamycine.

Le plasmide pCH 68 (figure 19) ayant servi de contrôle à été construit de manière similaire (non détaillée) en utilisant l'élément promoteur du gène actine-1 de riz (Mc Elroy et al., 1990) et l'intron de ce même gène (McElroy et al, 1991). puis intégré dans un vecteur t-DNA d'agrobactérium selon la méthode décrite dans cet exemple pourdonner la souche d'Agrobactérium LBA 4404 [pCH 68 k].

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Exemple 10 : transformation de maïs par Agrobacterium tumefaciens avec les cassettes d'expression.

La transformation du génotype de maïs A188 à étéeffectuée selon la méthode décrite par Ishida, Y. et al., Nature Biotechnology, 1996,14, 745-750. En résumé des embryons immature de maïs sont co-cultivés en présence des agrobacéries puis les cals obtenus sont sélectionnés en présence de phosphinotricine (5 mg/1).

L'enracinement des plantes est réaliséen tube sur milieu géloséen présence de DKN (100mg/1) et les plantes tolérantes sont acclimatées en serre puis fécondées avec du maïs A188 non transgénique afin de produire des graines.

Un échantillon de graines de la descendance obtenue est semé en serre (voirprotocole détaillédans l'exemple YY) et traité en pré-émergenceavec l'IFT à 200g/ha afin de ne sélectionner que lignées transformées ayant une tolérance minimale.

Les lignées C92A1, C99A1, L72A1, L74Q1, L78A2, L80A1, L80C3, L89B2, F85B3, L72H1, L74A4 ont ainsi été obtenues avec LBA4404 [pCH31 k].

Les lignées C111D3, C111H1, C112A1, C112A3, F100A2, F100D7, F102G3 ont été obtenues avec LBA4404 [pCH32 k].

Les lignées C62B2, F79-lAl, C60-lAl, L45B2, L54C1, C114B3M, C123B4M, C58C1F, C60-1B1M, L102F1M, L45B2M, L53A1M ont été obtenues avec LBA4404 [pCH68k].

Exemple 11 : de la tolérance du Maïs à l'IFTt appliqué en pré- emergence en serre Afin de mesurer la tolérance à l'IFT appliqué en pré-émergencedes lignées de maïs produites des semis en barquettes ont été réalisés. Des barquettes (15 x 20 x 5 cm) remplies de sable (granulométrie 3) ont été préparées et le sable à été mouillé par arrosage. 15 graines de chaque lignée ont étésemées à une profondeur de 0.5 cm dans chaque barquette. Après semis les barquettes ont été recouvertes d'une plaque de verre pour assurer un taux d'humidité propice à la lévée.

Le lendemain du semis une barquette de chaque lignée utilisée à été traitée à l'aide d'une tour de traitement calibrée afin de délivrer un volume correspondant à 500 1/ha

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sur chaque barquette. Les doses suivantes ont été pulvérisées :NT : eau pure, IFT 200 g/ha (soit 200g de matière active pour 500 litres), IFT 400 g/ha ; IFT 600 g/ha, IFT 800 g/ha.

Après traitement les barquettes sont à nouveau recouvertes d'une plaque de verre. La plaque de verre est retirée après trois jours afin de permettre le développement des plantules.

L'arrosage des plantules et réalisédans les plateaux contenants les barquettes tous les deux à trois jours en fonction des besoins des plantes. Une fois par semaine une solution nutritive complète (Fertigofol 313 # à 2.51/ha) est ajoutée à l'eau d'arrosage.

La mesure de la hauteur des plantes est effectuée 30 jours après le traitement au niveau du cornet.

La figure 20 montre les résultats obtenus. La réduction de taille est calculée pour chaque dose par rapport au contrôle non traité. La valeur représente pour chaque dose la moyenne des mesures effectuées sur les plantes des lignées utilisées pour chaque construction (respectivement pCH31D et pCH68), voir tableau 3. Les lignées utilisées soir, toutes hétérozygotes pour le gène HPPD introduit.

Des plantes de maïs A188 sauvages ont étéutilisées comme contrôle négatif. Dès la dose d'IFT 200g/ha toutes les plantes sauvages ont été détruites par le traitement herbicide.

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Tableau 3

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<tb> Plasmide <SEP> Promoteur <SEP> nbre <SEP> total <SEP> de <SEP> % <SEP> de <SEP> % <SEP> de <SEP> plantes <SEP> tolérantes <SEP> toute
<tb> Lignée <SEP> graines <SEP> semées <SEP> germination <SEP> doses <SEP> cumulées <SEP> sauf <SEP> non <SEP> trait
<tb> - <SEP> A188 <SEP> 75 <SEP> 100 <SEP> 0
<tb> pCH31D <SEP> CsVMV <SEP> C99A1 <SEP> 75 <SEP> 100 <SEP> 39
<tb> pCH31D <SEP> CsVMV <SEP> F85B3 <SEP> 75 <SEP> 100 <SEP> 27
<tb> pCH31D <SEP> CsVMV <SEP> L72H1 <SEP> 75 <SEP> 100 <SEP> 53
<tb> pCH3lD <SEP> CsVMV <SEP> L74A4 <SEP> 75 <SEP> 100 <SEP> 32
<tb> pCH31D <SEP> CsVMV <SEP> L78A2 <SEP> 75 <SEP> 100 <SEP> 41
<tb> pCH68 <SEP> R.Actm <SEP> C62B2 <SEP> 75 <SEP> 100 <SEP> 27
<tb> pCH68 <SEP> R.Actm <SEP> F79-1A1 <SEP> 75 <SEP> 100 <SEP> 37
<tb> pCH68 <SEP> R <SEP> Actm <SEP> L45B2 <SEP> 75 <SEP> 100 <SEP> 32
<tb> pCH68 <SEP> R. <SEP> Actin <SEP> L54C1 <SEP> 75 <SEP> 100 <SEP> 49
<tb>
Exemple 12 : en plein champ de lignées tolérantes à l'IFT.

Les lignées transformées soit avec pCH31D (lignées C92A1, C99A1, L72A1, L74Q1, L78A2, L80A1, L80C3, L89B2), soit avec pCH32D (lignées C111D3, C111H1, Cl12A1, C112A3, F100A2, F100D7, F102G3), soit avec pCH68 (lignées C114B3, C23B4, C58C1, C60-1B1, L102F1, L45B2, L53A1, L54C1) ont été testées en champ. Les graines ont été plantées à une profondeur de 2 cm sur deux rangées (2 m de long, 20 plantes par rangées).

L'irrigation des plantes a été effectuée par goutte à goutte au pied des plantes sans mouillage des parties foliaires.

Les plantes ont ététraitées en post-émergence au stade V3-V4 (3 à 4 feuilles) avec l'IFT à 250g/ha additionné d'un pour cent d'huile de colza . Les résultats ont été mesurés 14 jours après traitements.

La phytotoxicité à été évaluée en mesurant la surface folaire présentant des symptômes de blanchiement et/ou de nécroses. Les résultats sont présentés dans le tableau 4.

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Tableau 4 : Résultats du traitement à l'IFT en plein champ

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<tb> Plasmide <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> Moyenne <SEP> du <SEP> % <SEP> Déviation
<tb> lignées <SEP> testées <SEP> Plantes <SEP> de <SEP> Phytotoxicité <SEP> strandard.
<tb> pCH31D <SEP> 8 <SEP> 60 <SEP> 4,5 <SEP> 4,4
<tb> (CsVMV <SEP> +intron) <SEP>
<tb> pCH32D <SEP> (CsVMV) <SEP> 7 <SEP> 55 <SEP> 4,5 <SEP> 1,1
<tb> pCH68 <SEP> (RiceActin <SEP> + <SEP> 8 <SEP> 67 <SEP> 12 <SEP> 3,8
<tb> intron)
<tb>

Claims (30)

REVENDICATIONS

1. Cassette d'expression comprenant dans le sens de la transcription liées de manière fonctionnelle une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans les cellules végétales ou les plantes, une séquence d'acide nucléique codant pour une HPPD et une séquence de régulation terminatrice fonctionnelle dans les cellules végétales ou les plantes, caractériséee en ce que la séquence de régulation promotrice est une séquence d'acide nucléique choisie parmi les séquences de régulation promotrice du virus de plante CsVMV (Cassava Vein Mosaic Virus).

2. Cassette d'expression selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence de régulation promotrice comprend dans le sens de la transcription les séquences d'acide nucléique X, Y et Z telles que définies respectivement par les SEQ ID 1,2 et 3.

3. Cassette d'expression selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la séquence de régulation promotrice est représentée par la SEQ ID NO 4.

4. Cassette d'expression selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que la séquence de régulation promotrice comprend dans le sens de la transcription les séquences d'acides nucléique X, Y, Y et Z (double CsVMV).

5. Cassette d'expression selon la revendication 4, caractérisée en ce que la séquence de régulation promotrice du double CsVMV est représentée par la SEQ ID NO 5.

6. Cassette d'expression selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique codant pour une HPPD est une séquence codant pour une enzyme HPPD choisie parmi les HPPD natives, mutées ou chimères.

7. Cassette d'expression selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'HPPD est choisie parmi les HPPD de bactéries comme Pseudomonas, de plantes comme d'Arabidopsis ou de carotte, de Coccicoides ou de mammifères comme la souris ou le cochon.

8. Cassette d'expression selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'HPPD est une HPPD de Pseudomonasfluorescens.

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9. Cassette d'expression selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisée en ce que l'HPPD mutée est choisie parmi les HPPD mutées dans leur partie Cterminale.

10. Cassette d'expression selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'HPPD mutée comprend la mutation W336.

11. Cassette d'expression selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisée en ce que l'HPPD chimère est une HPPD comprenant des éléments provenants de différentes HPPD.

12. Cassette d'expression selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique codant pour une HPPD comprend une séquence codant pour un peptide signal ou peptide de transit.

13. Cassette d'expression selon la revendication 12, caractérisée en ce que le peptide de transit est un peptide de transit chloroplastique.

14. Cassette d'expression selon la revendication 13, caractérisée en ce que le peptide de transit est un peptide de transit optimisé.

15. Cassette d'expression selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce qu'elle comprend un activateur de transcription ("enhancer") ou un intron entre ia séquence de régulation promotrice et la séquence codant pour une HPPD.

16. Cassette d'expression selon la revendication 15, caractérisée en ce que l'activateur de transcription est choisi parmi les activateurs de transcription des virus de la mosaïque du tabac (VMT), etch du tabac (TEV), ou de la mosaique du figwort .

17. Cassette d'expression selon la revendication 15, caractérisée en ce que les introns sont choisis parmi l'intron 1 du gène de l'actine de riz ou l'intron adhl de maïs.

18. Cassette d'expression selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisée en ce que la séquence de régulation terminatrice est choisie par mi les séquences codant pour le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciens, le terminateur du CaMV 35S, ou le terminateur d'histone de plante.

19. Vecteur de clonage et/ou d'expression pour la transformation de cellules végétales ou de plantes, caracaractérisé en ce qu'il comprend au moins une cassette d'expression selon l'une des revendications 1 à 18.

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20. Cellules végétales caractérisées en ce qu'elles comprennent une cassette d'expression selon l'une des revendications 1 à 19.

21. Cellules végétales selon la revendication 20, caractérisée en ce que la cassette d'expression est intégré de manière stable dans son génome.

22. Plante, caractérisée en ce qu'elle comprend des cellules selon l'une des revendications 20 ou 21.

23. Plante transformée caractérisée en ce que une cassette d'expression selon l'une des revendications 1 à 19 est intégrée de manière stable dans son génome.

24. Plantes transformées selon l'une des revendications 22 ou 23, caractérisées en ce qu'elles sont choisies parmi les plantes monocotylédones telles que les céréales, la canne à sucre, le riz et le maïs ou les plantes dicotylédones comme le tabac, la soja, le colza, le coton, la betterave, le trèfle.

25. Graines de plantes transformées selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisées en ce qu'elles comprennent une cassette d'expression selon l'une des revendications 1 à 19.

26. Procédé de désherbage sélectif de plantes à l'aide d'un herbicide inhibiteur de l'HPPD, caractérisé en ce qu'on applique cet herbicide sur des plantes selon l'une des revendications 22 à 24.

27. Procédé de contrôle des mauvaises herbes dans une surface d'un champ comprenant des graines selon la revendication 25 ou des plantes selon l'une des revendications 23 à 24, caractérisé en ce qu'il consiste à appliquer dans la dite surface du champ une dose toxique pour les dites mauvaises herbes d'un herbicide inhibiteur d'HPPD, sans toutefois affecter de manière substantielle les graines ou plantes transformée avec le dit gène chimère selon l'invention.

28. Procédé de culture des plantes selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisé en ce qu'il consiste à semer les graines des dites plantes dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface du dit champ une dose toxique pour les mauvaises herbes d'un herbicide ayant pour cible l'HPPD en cas de présence de mauvaises herbes, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.

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29. Procédé selon l'une des revendications 26 à 28, caractérisé en ce que l'application de l'herbicide ayant pour cible l'HPPD est faite en présemis, en prélevée et/ou en postlevée de la culture.

30. Procédé selon l'une des revendications 26 à 29, caractérisé en ce que les herbicides inhibiteurs d'HPPD sont choisis parmi les isoxazoles en particulier l'isoxaflutole, les dicétonitriles en particulier la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3- 4-CF3 phényl) propane-l,3-dione et la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02 CH3-4-2,3 Cl2 phényl) propane- 1, 3-dione, les tricétones, en particulier la sulcotrione ou la mésotrione, ou les pyrazolinates.