JP7111798B2 - プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ変異体およびこれを用いる除草剤耐性付与および／または増進のための組成物および方法 - Google Patents

プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ変異体およびこれを用いる除草剤耐性付与および／または増進のための組成物および方法 Download PDF

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Description

原核生物に由来したプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ ｏｘｉｄａｓｅ）の変異体、およびこれを用いて植物および／または藻類（Ａｌｇａｅ）の除草剤に対する耐性を付与および／または増進させる技術が提供される。
ポルフィリン合成経路は植物の代謝過程で重要な葉緑素とヘム（Ｈｅｍｅ）を合成する過程であって、葉緑体で行われる。この経路で、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ ＩＸ ｏｘｉｄａｓｅ、以下、ＰＰＯ；ＥＣ：１．３．３．４）は、プロトポルフィリノーゲンＩＸ（Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ ＩＸ）からプロトポルフィリンＩＸ（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＩＸ）への酸化過程を触媒する。プロトポルフィリノーゲンＩＸがプロトポルフィリンＩＸに酸化された後、Ｍｇ－ｃｈｅｌａｔａｓｅによってマグネシウムと結合すれば葉緑素が合成され、Ｆｅ－ｃｈｅｌａｔａｓｅによって鉄と結合すればヘム（Ｈｅｍｅ）が合成される。
したがって、ＰＰＯの活性が阻害されれば葉緑素とヘムの合成が抑制され、基質であるプロトポルフィリノーゲンＩＸは正常なポルフィリン合成経路から離脱して葉緑体から細胞質に移動して急速にプロトポルフィリンＩＸに酸化され、光と酸素分子の存在下で活性の高い一重項酸素（ｓｉｎｇｌｅｔｏｘｙｇｅｎ、１Ｏ２）を発生させて植物の細胞膜を破壊することによって急速な植物細胞死滅を起こす。このような原理を用いて、ＰＰＯ活性を抑制する除草剤が開発され、現在まで化学構造によってピリミジンジオン系（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）、ジフェニルエーテル系（ｄｉｐｈｅｎｙｌ－ｅｔｈｅｒｓ）、フェニルピラゾール系（ｐｈｅｎｙｌｐｙｒａｚｏｌｅｓ）、フェニルフタルイミド系（Ｎ－ｐｈｅｎｙｌｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅｓ）、チアジアゾール系（ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅｓ）、オキサジアゾール系（ｏｘａｄｉａｚｏｌｅｓ）、トリアゾリノン系（ｔｒｉａｚｏｌｉｎｏｎｅｓ）、オキサゾリジンジオン系（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）およびその他の９個系統の除草剤が使用されている。
また、前記除草剤を使用しながらも栽培対象作物の生長には影響を与えないようにするためには、栽培対象作物に前記除草剤に対する耐性を付与する必要性が台頭してきた。
一方、藻類（Ａｌｇａｅ）は光合成生物であって、光エネルギーを多様な有用化合物を合成できるエネルギーに転換することができる。例えば、藻類は光合成によって炭素を固定させ、二酸化炭素を糖、デンプン、脂質、脂肪または他の生体分子に転換することによって、大気中の温室ガスを除去することができる。また、藻類の大規模培養を通じて産業的酵素、治療化合物および蛋白質、栄養物質、商業的物質、燃料物質のような多様な物質を生産することができる。
しかし、生物反応器（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）または公開されたまたは閉鎖された池で藻類を大規模に培養する場合、望まない競争生物、例えば望まない藻類、かび、ワムシ類（ｒｏｔｉｆｅｒ）または動物性プランクトンによって汚染が発生することがある。
したがって、所望の植物および／または藻類に除草剤耐性を付与した後、除草剤耐性のない競争生物の成長を阻害できる濃度で除草剤を処理して、所望の植物および／または藻類を大規模に収穫することができる技術が必要である。
米国特許出願登録公報ＵＳ６，３０８，４５８（２００１年１０月３０日） 米国特許出願登録公報ＵＳ６，８０８，９０４（２００４年１０月２６日） 米国特許出願登録公報ＵＳ７，５６３，９５０（２００９年７月２１日） 国際特許出願公開公報ＷＯ２０１１／０８５２２１（２０１１年７月１４日）
Ｌｉ Ｘ，Ｖｏｌｒａｔｈ ＳＬ．，Ｃｈｉｌｃｏｔｔ ＣＥ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＭＡ，Ｗａｒｄ ＥＲ，Ｌａｗ ＭＤ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ ｏｘｉｄａｓｅ ａｓ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ．Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １３３：７３６－７４７，２００３
本明細書で、原核生物からｈｅｍＹタイプのＰＰＯ遺伝子を分離してこの遺伝子およびそのアミノ酸変異体がプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）活性阻害除草剤に対して広範囲な除草剤耐性を示すのが立証され、これを植物および／または藻類（Ａｌｇａｅ）に発現させれば除草剤耐性を付与するか、および／または耐性を増進させることができるのが提案される。
一例は、配列番号１のポリペプチドとＰＰＯ活性阻害除草剤との相互作用に関与する配列番号１のアミノ酸（例えば、配列番号１のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸）からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して欠失または該当位置の元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド変異体を提供する。前記配列番号１のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸からなる群より選択された１種以上は、配列番号１のアミノ酸配列中のＳ６３、Ｐ９１、Ｒ９２、Ｆ１６９、Ｖ１７３、Ａ１７５、Ｅ２２８、Ｌ２２９、Ｐ３１６、Ｖ３１８、Ｆ３３７、Ｌ３４０、Ｇ３５１、Ｔ３５２、Ｉ３５３、およびＹ３７３からなる群より選択された１種以上であってもよい。
他の例は、配列番号３のポリペプチドとＰＰＯ活性阻害除草剤との相互作用に関与する配列番号３のアミノ酸（例えば、配列番号３のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸）からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して欠失または該当位置の元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド変異体を提供する。前記配列番号３のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸からなる群より選択された１種以上は、配列番号３のアミノ酸配列中のＮ６３、Ｓ６４、Ｓ６６、Ｐ６７、Ｐ９２、Ｒ９３、Ｆ１７０、Ｓ１７２、Ｇ１７３、Ｖ１７４、Ｙ１７５、Ａ１７６、Ｒ１９０、Ｅ２３０、Ｌ２３１、Ｐ３１８、Ｖ３２０、Ｆ３３９、Ｇ３４０、Ｎ３４１、Ｌ３４２、Ｌ３５２、Ｇ３５３、Ｔ３５４、Ｉ３５５、Ｙ３７５、Ｉ４２４、Ｖ４５８、およびＲ４６５からなる群より選択された１種以上であってもよい。
他の例は、配列番号５のポリペプチドとＰＰＯ活性阻害除草剤との相互作用に関与する配列番号５のアミノ酸（例えば、配列番号５のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸）からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して欠失または該当位置の元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド変異体を提供する。前記配列番号５のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸からなる群より選択された１種以上は、配列番号５のアミノ酸配列中のＰ８４、Ｒ８５、Ｆ１５６、Ｖ１６０、Ａ１６２、Ｑ１７９、Ｐ３０６、Ｖ３０８、Ｆ３２７、Ｌ３３０、Ｉ３４３、Ｎ３６２、およびＦ３６３からなる群より選択された１種以上であってもよい。
他の例は、配列番号１のポリペプチド、配列番号３のポリペプチド、配列番号５のポリペプチド、または前記ポリペプチド変異体を暗号化するポリヌクレオチドを提供する。
他の例は、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。
他の例は、前記組換えベクターを含む組換え細胞を提供する。
他の例は、配列番号１のポリペプチド、配列番号３のポリペプチド、配列番号５のポリペプチド、前記ポリペプチド変異体、前記ポリペプチドまたは変異体を暗号化するポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択された１種以上を含む、植物および／または藻類の除草剤に対する耐性付与および／または増進用組成物を提供する。
前記除草剤は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤であってもよい。
具体例として、前記除草剤は、ピリミジンジオン系（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）、ジフェニルエーテル系（ｄｉｐｈｅｎｙｌ－ｅｔｈｅｒｓ）、フェニルピラゾール系（ｐｈｅｎｙｌｐｙｒａｚｏｌｅｓ）、フェニルフタルイミド系（Ｎ－ｐｈｅｎｙｌｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅｓ）、フェニルエステル系（ｐｈｅｎｙｌｅｓｔｅｒｓ）、チアジアゾール系（ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅｓ）、オキサジアゾール系（ｏｘａｄｉａｚｏｌｅｓ）、トリアゾリノン系（ｔｒｉａｚｏｌｉｎｏｎｅｓ）、オキサゾリジンジオン系（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）およびその他の除草剤からなる群より選択される１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。
具体例として、前記除草剤は、ブタフェナシル（ｂｕｔａｆｅｎａｃｉｌ）、サフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）、ベンズフェンジゾン（ｂｅｎｚｆｅｎｄｉｚｏｎｅ）、チアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）、ホメサフェン（ｆｏｍｅｓａｆｅｎ）、オキシフルオルフェン（ｏｘｙｆｌｕｏｒｆｅｎ）、アクロニフェン（ａｃｌｏｎｉｆｅｎ）、アシフルオルフェン（ａｃｉｆｌｕｏｒｆｅｎ）、ビフェノックス（ｂｉｆｅｎｏｘ）、エトキシフェン（ｅｔｈｏｘｙｆｅｎ）、ラクトフェン（ｌａｃｔｏｆｅｎ）、クロメトキシフェン（ｃｈｌｏｍｅｔｈｏｘｙｆｅｎ）、クロルニトロフェン（ｃｈｌｏｒｎｉｔｒｏｆｅｎ）、フルオログリコフェン－エチル（ｆｌｕｏｒｏｇｌｙｃｏｆｅｎ－ｅｔｈｙｌ）、ハロサフェン（ｈａｌｏｓａｆｅｎ）、ピラフルフェン－エチル（ｐｙｒａｆｌｕｆｅｎ－ｅｔｈｙｌ）、フルアゾレート（ｆｌｕａｚｏｌａｔｅ）、フルミオキサジン（ｆｌｕｍｉｏｘａｚｉｎ）、シニドン－エチル（ｃｉｎｉｄｏｎ－ｅｔｈｙｌ）、フルミクロラック－ペンチル（ｆｌｕｍｉｃｌｏｒａｃ－ｐｅｎｔｙｌ）、フルチアセット（ｆｌｕｔｈｉａｃｅｔ）、チジアジミン（ｔｈｉｄｉａｚｉｍｉｎ）、オキサジアルギル（ｏｘａｄｉａｒｇｙｌ）、オキサジアゾン（ｏｘａｄｉａｚｏｎ）、カルフェントラゾン（ｃａｒｆｅｎｔｒａｚｏｎｅ）、スルフェントラゾン（ｓｕｌｆｅｎｔｒａｚｏｎｅ）、アザフェニジン（ａｚａｆｅｎｉｄｉｎ）、ペントキサゾン（ｐｅｎｔｏｘａｚｏｎｅ）、ピラクロニル（ｐｙｒａｃｌｏｎｉｌ）、フルフェンピル－エチル（ｆｌｕｆｅｎｐｙｒ－ｅｔｈｙｌ）、プロフルアゾル（ｐｒｏｆｌｕａｚｏｌ）、フェノピレート（ｐｈｅｎｏｐｙｌａｔｅ；２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ １－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、フェノピレートのカルバメート類似体（例えば、Ｏ－ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ－ａｎｄ ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｏｃａｒｂａｍａｔｅ ａｎａｌｏｇｅｓ（“Ｕｊｊａｎａ Ｂ．Ｎａｎｄｉｈａｌｌｉ，Ｍａｒｙ Ｖ．Ｄｕｋｅ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｏ．Ｄｕｋｅ，Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｏ－ｐｈｅｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ－ａｎｄ ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｏｃａｒｂａｍａｔｅ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，１９９２，４０（１０） １９９３－２０００”参照））、これらの農薬的に許容可能な塩、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。
上記植物は光合成を行う多細胞真核生物を意味するものであって、単子葉植物または双子葉植物であるか、草本植物または木本植物であってもよい。前記藻類（Ａｌｇａｅ）は光合成を行う単細胞生物を意味するものであって、原核（Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ）藻類または真核（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ）藻類であってもよい。
一例で、上記植物または藻類は、第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子をさらに含むように遺伝的に操作され、前記第２の除草剤に対するさらに広い範囲の除草剤耐性が付与されるかおよび／または増進されたものであってもよい。前記第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子をさらに含むように遺伝的に操作された植物または藻類は、前記除草剤に対する耐性付与および／または増進用組成物に第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子をさらに含ませたものを使用して製造されたものであってもよい。したがって、除草剤に対する耐性付与および／または増進用組成物は、第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子をさらに含むものであってもよい。
具体例として、前記第２の除草剤は、細胞分裂阻害性除草剤、光合成阻害性除草剤、アミノ酸合成阻害性除草剤、色素体阻害性除草剤および細胞膜阻害性除草剤を含むが、これに制限されるのではない。
具体例として、前記第２の除草剤は、グリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）、グルホシネート（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ）、ジカンバ（ｄｉｃａｍｂａ）、２，４－Ｄ（２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、イソキサフルトール（ｉｓｏｘａｆｌｕｔｏｌｅ）、ＡＬＳ（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）阻害性除草剤、第２光系（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ ＩＩ）阻害性除草剤、フェニルウレア（ｐｈｅｎｙｌｕｒｅａ）系除草剤、またはブロモキシニル（Ｂｒｏｍｏｘｙｎｉｌ）系除草剤またはこれらの組み合わせを例示することができるが、これに制限されるのではない。
具体例として、第２の除草剤耐性ポリペプチドは、グリホサート除草剤耐性ＥＰＳＰＳ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ５－ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＧＯＸ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ）、ＧＡＴ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）またはグリホサートデカルボキシラーゼ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）；グルホシネート除草剤耐性ＰＡＴ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）；ジカンバ除草剤耐性ＤＭＯ（ｄｉｃａｍｂａ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）；２，４－Ｄ除草剤耐性２，４－ＤモノオキシゲナーゼまたはＡＡＤ（ａｒｙｌｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）；ＡＬＳ阻害性スルホニルウレア（ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ）系除草剤耐性ＡＬＳ（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＡＨＡＳ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、またはＡｔｈａｈａｓｌ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ）；第２光系阻害性除草剤耐性光系ＩＩ（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ ＩＩ）蛋白質Ｄ１；フェニルウレア系除草剤耐性シトクロムＰ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０）；色素体阻害性除草剤耐性ＨＰＰＤ（ｈｙｄｏｒｘｙｌｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）；ブロモキシニル除草剤耐性ニトリラーゼ（ｎｉｔｒｉｌａｓｅ）；およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種以上を例示することができるが、これに制限されるのではない。
また、前記第２の除草剤耐性ポリペプチドを暗号化する遺伝子は、グリホサート除草剤耐性ｃｐ４ ｅｐｓｐｓ、ｍｅｐｓｐｓ、２ｍｅｐｓｐｓ、ｇｏｘｖ２４７、ｇａｔ４６０１またはｇａｔ４６２１遺伝子；グルホシネート除草剤耐性ｂａｒ、ｐａｔまたはｐａｔ（ＳＹＮ）遺伝子；ジカンバ除草剤耐性ｄｍｏ遺伝子；２，４－Ｄ除草剤耐性ＡＡＤ－１、ＡＡＤ－１２遺伝子；ＡＬＳ阻害性スルホニルウレア系除草剤耐性ＡＬＳ、ＧＭ－ＨＲＡ、Ｓ４－ＨＲＡ、ＺＭ－ＨＲＡ、Ｃｓｒ１、Ｃｓｒ１－１、Ｃｓｒ１－２、ＳｕｒＡまたはＳｕｒＢ；第２光系（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ ＩＩ）阻害性除草剤耐性ｐｓｂＡ遺伝子；フェニルウレア除草剤耐性ＣＹＰ７６Ｂ１遺伝子；イソキサフルトール除草剤耐性ＨＰＰＤＰＦ Ｗ３３６遺伝子およびブロモキシニル除草剤耐性ｂｘｎ遺伝子；およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種以上を例示することができるが、これに制限されるのではない。
他の例は、前記ポリヌクレオチドで形質転換された、除草剤に対する耐性が付与および／または増進された除草剤耐性植物および／または藻類の形質転換体、そのクローン、または子孫を提供する。
他の例は、前記ポリヌクレオチドを植物および／または藻類に形質転換する段階を含む、除草剤に対する耐性が付与および／または増進された植物または藻類を製造する方法を提供する。
他の例は、前記ポリヌクレオチドを植物および／または藻類に形質転換する段階を含む、植物および／または藻類の除草剤に対する耐性を付与および／または増進させる方法を提供する。
前記形質転換は、藻類、および／または植物の細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽、または全体（ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ）に対して行われることであってもよい。
前記形質転換体は、藻類、または植物の細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽、または全体（ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ）であってもよい。
他の例は、配列番号１のポリペプチド、配列番号３のポリペプチド、配列番号５のポリペプチド、または前記ポリペプチド変異体；これを暗号化するポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター；および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択された１種以上を含む群より選択される１種以上を含む植物を栽培地に提供する段階、および前記栽培地に（または上記植物に）プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する段階を含む、栽培地で雑草を防除する方法を提供する。
具体例として、前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する段階は、２種以上のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を順次にまたは同時に適用して行われることであってもよい。
他の例として、前記植物は、第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子をさらに含むように遺伝的に操作されたものであり、前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤および第２の除草剤の有効量を順次にまたは同時に適用するものであってもよい。
他の例は、前記ポリペプチド変異体、これを暗号化するポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞からなる群より選択された１種以上を含む群より選択される１種以上を含む藻類を培養培地に提供する段階、および前記培養培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する段階を含む、栽培地で望まない生物を除去する方法を提供する。
植物または藻類に除草剤に対する耐性を付与および／または増進する技術が提供される。
本明細書で、「植物または藻類の除草剤に対する耐性付与および／または増進」または「植物または藻類の除草剤に対する耐性増進」とは、除草剤に対する耐性がない植物または藻類に対して耐性を付与すること、または除草剤に対する耐性を有している植物または藻類に対してその耐性をより向上させること、またはこれらを両方とも包括する広範囲な意味として解釈される。
本明細書で、「配列からなる」または「配列を含む」というのは、記載された配列を含むか、前記配列を必須的に含む場合を全て意味するために使用され、記載された配列以外の配列を含むことを排除しようとする意図として解釈されない。
一例で、
配列番号１のポリペプチドとＰＰＯ活性阻害除草剤との相互作用に関与する配列番号１のアミノ酸（例えば、配列番号１のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸）からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して欠失または該当位置の元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド変異体；
配列番号３のポリペプチドとＰＰＯ活性阻害除草剤との相互作用に関与する配列番号３のアミノ酸（例えば、配列番号３のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸）からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して欠失または該当位置の元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド変異体；
配列番号５のポリペプチドとＰＰＯ活性阻害除草剤との相互作用に関与する配列番号５のアミノ酸（例えば、配列番号５のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸）からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して欠失または該当位置の元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド変異体；およびこれらの組み合わせ
からなる群より選択される１種以上のポリペプチド変異体が提供される。
他の例で、前記配列番号１、３、または５のポリペプチドまたは前記ポリペプチド変異体を暗号化するポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および前記組換えベクターを含む組換え細胞が提供される。前記ポリヌクレオチドは、各アミノ酸を暗号化するコドンのうちの形質導入される細胞に最適化された（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）コドンを含むように設計されたものであってもよい。前記最適化コドンは、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば容易に知ることができる（例えば、「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｃｏｄｏｎ－ｏｐｔ．ｈｔｍｌ」、「ｈｔｔｐ：／／ｓｇ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔ」など参照）。
他の例で、前記配列番号１、３、または５のポリペプチド、前記ポリペプチド変異体、これらを暗号化するポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、前記組換えベクターを含む組換え細胞、およびこれらの組み合わせからなる群より選択された１種以上を含む、植物および／または藻類の除草剤に対する耐性付与および／または増進用組成物が提供される。
他の例で、前記ポリヌクレオチドで形質転換された、除草剤に対する耐性を有する形質転換体が提供される。
他の例で、前記ポリヌクレオチドを藻類または植物の細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽、または植物全体に形質転換する段階を含む、除草剤に対する耐性を有する植物または藻類の製造方法が提供される。
他の例で、前記ポリヌクレオチドを藻類または植物の細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽、または植物全体に形質転換する段階を含む、植物または藻類の除草剤に対する耐性を付与および／または増進させる方法を提供する。
以下、本発明をより詳細に説明する。
本明細書で提供される配列番号１、３、または５のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその変異体は原核生物（例えば、藍色細菌）に由来するＰＰＯ蛋白質であって、ＰＰＯ阻害除草剤に対して耐性を有する除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質である。具体的に、オシラトリアニグロ－ビリディス（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｎｉｇｒｏ－ｖｉｒｉｄｉｓ）ＰＣＣ ７１１２に由来したＰＰＯ蛋白質が提供され、これをＣｙＰＰＯ２と命名し、そのアミノ酸配列を配列番号１と、これを暗号化する遺伝子の塩基配列を配列番号２と表す。また、リングビア属（Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．）ＰＣＣ ８１０６菌株に由来したＰＰＯが提供され、これをＣｙＰＰＯ４と命名し、そのアミノ酸配列を配列番号３と、これを暗号化する遺伝子の塩基配列を配列番号４と表す。また、ハロテース属（Ｈａｌｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．）ＰＣＣ ７４１８菌株に由来したＰＰＯが提供され、これをＣｙＰＰＯ８と命名し、そのアミノ酸配列を配列番号５と、これを暗号化する遺伝子の塩基配列を配列番号６と表す。本明細書で、前述のポリペプチドおよびポリペプチドの変異体は、それぞれＰＰＯ阻害除草剤に対して耐性を有する除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質または除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質変異体と表現することができる。また、本明細書に使用されたものとして、「除草剤耐性ＰＰＯまたはその変異体」は、前記除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質または除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質変異体、除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質暗号化遺伝子または除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質変異体暗号化遺伝子、またはこれら全てを意味するために使用することができる。
藍色細菌由来ＰＰＯ蛋白質はそれ自体で植物ＰＰＯより酵素活性に優れた特性を有し、ＰＰＯ活性阻害除草剤に対して耐性を付与することができるだけでなく、これらＰＰＯ蛋白質は固有の酵素活性を全体的に維持させる範囲内でアミノ酸変異を含むことによって野生型ＰＰＯ蛋白質より除草剤耐性を強化させることができる。このようなアミノ酸変異は、ＰＰＯ蛋白質と除草剤間相互作用部位のアミノ酸残基の中から選択された１種以上のアミノ酸の置換、欠失、付加および／または挿入を含むものであってもよい。
以下、前記ＰＰＯ蛋白質変異体をより具体的に説明する。
一例は、配列番号１のポリペプチド（ＣｙＰＰＯ２）とＰＰＯ活性阻害除草剤との相互作用に関与する配列番号１のアミノ酸（配列番号１のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸）からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して欠失または元のアミノ酸（即ち、野生型の該当位置のアミノ酸）とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むか前記アミノ酸配列からなるポリペプチド変異体を提供する。
前記配列番号１のポリペプチドの欠失または元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されるアミノ酸残基（例えば、配列番号１のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸からなる群より選択された１種以上）は、配列番号１のアミノ酸配列中のＳ６３（「６３番目位置のＳ（Ｓｅｒ）」を意味；以下のアミノ酸残基の表現はこれと同一な方式で解釈される）、Ｐ９１、Ｒ９２、Ｆ１６９、Ｖ１７３、Ａ１７５、Ｅ２２８、Ｌ２２９、Ｐ３１６、Ｖ３１８、Ｆ３３７、Ｌ３４０、Ｇ３５１、Ｔ３５２、Ｉ３５３、およびＹ３７３からなる群より選択された１種以上であってもよい。
一具体例で、前記ポリペプチドの変異体は、配列番号１のアミノ酸配列中のＳ６３、Ｐ９１、Ｒ９２、Ｆ１６９、Ｖ１７３、Ａ１７５、Ｅ２２８、Ｌ２２９、Ｐ３１６、Ｖ３１８、Ｆ３３７、Ｌ３４０、Ｇ３５１、Ｔ３５２、Ｉ３５３、およびＹ３７３からなる群より選択された１種以上が、それぞれ独立して、欠失またはＭ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｋ（Ｌｙｓ）などからなる群より選択され、野生型の該当位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換（例えば、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｆ（Ｐｈｅ）などからなる群より選択され、野生型の該当位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換）されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
例えば、前記ポリペプチドの変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｙ３７３Ｍ（「３７３番目位置のアミノ酸残基がＹ（Ｔｙｒ）からＭ（Ｍｅｔ）に置換されること」を意味する；以下のアミノ酸変異の表現はこれと同一な方式で解釈される）、Ｙ３７３Ｖ、Ｙ３７３Ｉ、Ｙ３７３Ｔ、Ｙ３７３Ｌ、Ｙ３７３Ｃ、Ｆ１６９Ａ、Ａ１７５Ｃ、Ａ１７５Ｌ、Ａ１７５Ｉ、Ｐ３１６Ａ、Ｐ３１６Ｌ、Ｖ３１８Ｍ、Ｖ３１８Ｔ、Ｖ３１８Ｌ、Ｇ３５１Ａ、Ｓ６３Ｔ、Ｐ９１Ｌ、Ｒ９２Ａ、Ｖ１７３Ｓ、Ｖ１７３Ｃ、Ｖ１７３Ｔ、Ｖ１７３Ｌ、Ｅ２２８Ａ、Ｌ２２９Ｆ、Ｆ３３７Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｌ３４０Ｉ、Ｌ３４０Ｖ、Ｔ３５２Ｖ、Ｉ３５３Ｔ、Ｉ３５３Ｌ、Ｉ３５３Ｖ、およびＩ３５３Ｃからなる群より選択された１種以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。例えば、前記ポリペプチドの変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｙ３７３Ｍ、Ｙ３７３Ｖ、Ｙ３７３Ｉ、Ｙ３７３Ｔ、Ｙ３７３Ｌ、Ｙ３７３Ｃ、Ｆ１６９Ａ、Ａ１７５Ｃ、Ａ１７５Ｌ、Ａ１７５Ｉ、Ｐ３１６Ａ、Ｐ３１６Ｌ、Ｖ３１８Ｍ、Ｖ３１８Ｔ、Ｖ３１８Ｌ、Ｇ３５１Ａ、Ｓ６３Ｔ、Ｐ９１Ｌ、Ｒ９２Ａ、Ｖ１７３Ｓ、Ｖ１７３Ｃ、Ｖ１７３Ｔ、Ｖ１７３Ｌ、Ｅ２２８Ａ、Ｌ２２９Ｆ、Ｆ３３７Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｌ３４０Ｉ、Ｌ３４０Ｖ、Ｔ３５２Ｖ、Ｉ３５３Ｔ、Ｉ３５３Ｌ、Ｉ３５３Ｖ、Ｉ３５３Ｃ、Ｓ６３Ｔ＋Ｙ３７３Ｍ（６３番目残基のＳからＴへの置換および３７３番目残基のＹからＭへの置換を全て含む；以下の２つ以上のアミノ酸変異の表現はこれと同一な方式で解釈される）、Ｒ９２Ａ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｖ１７３Ｓ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｖ１７３Ｓ＋Ｙ３７３Ｉ、Ｖ１７３Ｓ＋Ｙ３７３Ｌ、Ｖ１７３Ｓ＋Ｙ３７３Ｖ、Ｖ１７３Ｃ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｖ１７３Ｃ＋Ｙ３７３Ｉ、Ｖ１７３Ｔ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｖ１７３Ｔ＋Ｙ３７３Ｉ、Ｖ１７３Ｌ＋Ｙ３７３Ｍ、Ａ１７５Ｌ＋Ｙ３７３Ｍ、Ａ１７５Ｌ＋Ｙ３７３Ｉ、Ａ１７５Ｃ＋Ｙ３７３Ｍ、Ａ１７５Ｃ＋Ｙ３７３Ｉ、Ａ１７５Ｉ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｅ２２８Ａ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｌ２２９Ｆ＋Ｙ３７３Ｔ、Ｖ３１８Ｍ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｖ３１８Ｍ＋Ｙ３７３Ｉ、Ｖ３１８Ｍ＋Ｙ３７３Ｖ、Ｖ３１８Ｔ＋Ｙ３７３Ｉ、Ｌ３４０Ｉ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｌ３４０Ｉ＋Ｙ３７３Ｉ、Ｌ３４０Ｖ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｇ３５１Ａ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｉ３５３Ｔ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｉ３５３Ｔ＋Ｙ３７３Ｉ、Ｉ３５３Ｔ＋Ｙ３７３Ｌ、Ｉ３５３Ｌ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｉ３５３Ｖ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｉ３５３Ｃ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｓ６３Ｔ＋Ｖ１７３Ｓ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｓ３６Ｔ＋Ｖ１７３Ｓ＋Ｙ３７３Ｉ、Ｓ６３Ｔ＋Ｉ３５３Ｔ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｓ６３Ｔ＋Ｉ３５３Ｔ＋Ｙ３７３Ｉ、Ｖ１７３Ｓ＋Ｖ３１８Ｍ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｖ１７３Ｔ＋Ｌ３４０Ｉ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｖ１７３Ｓ＋Ａ１７５Ｃ＋Ｙ３７３Ｍ、Ａ１７５Ｃ＋Ｖ３１８Ｍ＋Ｙ３７３Ｍ、Ａ１７５Ｌ＋Ｖ３１８Ｍ＋Ｙ３７３Ｍ、Ａ１７５Ｃ＋Ｉ３５３Ｌ＋Ｙ３７３Ｍ、Ａ１７５Ｃ＋Ｉ３５３Ｖ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｐ３１６Ａ＋Ｖ３１８Ｌ、Ｐ３１６Ｌ＋Ｖ３１８Ｌ、Ｆ３３７Ｖ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｔ３５２Ｖ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｇ３５１Ａ＋Ｔ３５２Ｖ＋Ｙ３７３Ｍ、またはＰ９１Ｌ＋Ｙ３７３Ｍのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
他の例は、配列番号３のポリペプチド（ＣｙＰＰＯ４）とＰＰＯ活性阻害除草剤との相互作用に関与する配列番号３のアミノ酸（配列番号３のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸）からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して欠失または元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むか前記アミノ酸配列からなるポリペプチド変異体を提供する。
前記配列番号３のポリペプチドの欠失または元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されるアミノ酸残基（例えば、配列番号３のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸からなる群より選択された１種以上）は、配列番号３のアミノ酸配列中のＮ６３、Ｓ６４、Ｓ６６、Ｐ６７、Ｐ９２、Ｒ９３、Ｆ１７０、Ｓ１７２、Ｇ１７３、Ｖ１７４、Ｙ１７５、Ａ１７６、Ｒ１９０、Ｅ２３０、Ｌ２３１、Ｐ３１８、Ｖ３２０、Ｆ３３９、Ｇ３４０、Ｎ３４１、Ｌ３４２、Ｌ３５２、Ｇ３５３、Ｔ３５４、Ｉ３５５、Ｙ３７５、Ｉ４２４、Ｖ４５８、およびＲ４６５からなる群より選択された１種以上、例えば、Ａ１７６、Ｐ３１８、Ｖ３２０、およびＹ３７５からなる群より選択された１種以上であってもよい。
一具体例で、前記ポリペプチドの変異体は、配列番号３のアミノ酸配列中のＮ６３、Ｓ６４、Ｓ６６、Ｐ６７、Ｐ９２、Ｒ９３、Ｆ１７０、Ｓ１７２、Ｇ１７３、Ｖ１７４、Ｙ１７５、Ａ１７６、Ｒ１９０、Ｅ２３０、Ｌ２３１、Ｐ３１８、Ｖ３２０、Ｆ３３９、Ｇ３４０、Ｎ３４１、Ｌ３４２、Ｌ３５２、Ｇ３５３、Ｔ３５４、Ｉ３５５、Ｙ３７５、Ｉ４２４、Ｖ４５８、およびＲ４６５からなる群より選択された１種以上、例えばＡ１７６、Ｐ３１８、Ｖ３２０、およびＹ３７５からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して、欠失またはＭ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｋ（Ｌｙｓ）などからなる群より選択され、野生型の該当位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換（例えば、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）などからなる群より選択され、野生型の該当位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換）されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
例えば、前記ポリペプチドの変異体は、配列番号３のアミノ酸配列において、Ｙ３７５Ｍ、Ｙ３７５Ｖ、Ｙ３７５Ｉ、Ｙ３７５Ｔ、Ｙ３７５Ｃ、Ａ１７６Ｃ、Ａ１７６Ｌ、Ｐ３１８Ｌ、Ｖ３２０Ｌ、Ｖ３２０Ｍ、およびＰ３１８Ａからなる群より選択された１種以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。より具体的に、前記ポリペプチドの変異体は、配列番号３のアミノ酸配列においてＹ３７５Ｍ、Ｙ３７５Ｖ、Ｙ３７５Ｉ、Ｙ３７５Ｔ、Ｙ３７５Ｃ、Ａ１７６Ｃ、Ａ１７６Ｌ、Ｐ３１８Ｌ＋Ｖ３２０Ｌ、Ｖ３２０Ｍ、またはＰ３１８Ａ＋Ｖ３２０Ｌのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
他の例は、配列番号５のポリペプチド（ＣｙＰＰＯ８）とＰＰＯ活性阻害除草剤との相互作用に関与する配列番号５のアミノ酸（配列番号５のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸）からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して欠失または元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むか前記アミノ酸配列からなるポリペプチド変異体を提供する。
前記配列番号５のポリペプチドの欠失または元のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されるアミノ酸残基（例えば、配列番号５のポリペプチドのＰＰＯ活性阻害除草剤との結合部位に位置するアミノ酸からなる群より選択された１種以上）は、配列番号５のアミノ酸配列中のＰ８４、Ｒ８５、Ｆ１５６、Ｖ１６０、Ａ１６２、Ｑ１７９、Ｐ３０６、Ｖ３０８、Ｆ３２７、Ｌ３３０、Ｉ３４３、Ｎ３６２、およびＦ３６３からなる群より選択された１種以上であってもよい。
一具体例で、前記ポリペプチドの変異体は、配列番号５のアミノ酸配列中のＰ８４、Ｒ８５、Ｆ１５６、Ｖ１６０、Ａ１６２、Ｑ１７９、Ｐ３０６、Ｖ３０８、Ｆ３２７、Ｌ３３０、Ｉ３４３、Ｎ３６２、およびＦ３６３からなる群より選択された１種以上がそれぞれ独立して、欠失またはＭ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｋ（Ｌｙｓ）などからなる群より選択され、野生型の該当位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換（例えば、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｈ（Ｈｉｓ）Ｇ（Ｇｌｙ）などからなる群より選択され、野生型の該当位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換）されたアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
例えば、前記ポリペプチドの変異体は、配列番号５のアミノ酸配列において、Ｐ８４Ｌ、Ｒ８５Ａ、Ｒ８５Ｃ、Ｒ８５Ｈ、Ｒ８５Ｌ、Ｒ８５Ｔ、Ｒ８５Ｖ、Ｆ３６３Ｍ、Ｆ３６３Ｖ、Ｆ３６３Ｌ、Ｆ３６３Ｃ、Ｆ３６３Ｉ、Ｆ３６３Ｔ、Ａ１６２Ｃ、Ａ１６２Ｌ、Ｐ３０６Ｌ、Ｐ３０６Ａ、Ｖ３０８Ｌ、Ｖ３０８Ｍ、Ｎ３６２Ｓ、Ｖ１６０Ｓ、Ｖ１６０Ｃ、Ｉ３４３Ｖ、Ｉ３４３Ｔ、Ｆ１５６Ａ、Ｑ１７９Ｇ、Ｆ３２７Ｖ、およびＬ３３０Ｔからなる群より選択された１種以上のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。より具体的に、ポリペプチドの変異体は、配列番号５のアミノ酸配列においてＰ８４Ｌ、Ｒ８５Ａ、Ｒ８５Ｃ、Ｒ８５Ｈ、Ｒ８５Ｌ、Ｒ８５Ｔ、Ｒ８５Ｖ、Ｆ３６３Ｍ、Ｆ３６３Ｖ、Ｆ３６３Ｌ、Ｆ３６３Ｃ、Ｆ３６３Ｉ、Ｆ３６３Ｔ、Ａ１６２Ｃ、Ａ１６２Ｌ、Ｐ３０６Ｌ、Ｐ３０６Ａ、Ｖ３０８Ｌ、Ｖ３０８Ｍ、Ｎ３６２Ｓ、Ｖ１６０Ｓ、Ｖ１６０Ｃ、Ｉ３４３Ｖ、Ｉ３４３Ｔ、Ｆ１５６Ａ、Ｑ１７９Ｇ、Ｆ３２７Ｖ、Ｌ３３０Ｔ、Ｐ８４Ｌ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｒ８５Ａ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｒ８５Ａ＋Ｆ３６３Ｉ、Ｒ８５Ｃ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｒ８５Ｈ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｒ８５Ｌ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｒ８５Ｔ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｒ８５Ｖ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｒ８５Ａ＋Ａ１６２Ｌ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｒ８５Ａ＋Ａ１６２Ｌ＋Ｆ３６３Ｉ、Ｒ８５Ａ＋Ａ１６２Ｃ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｒ８５Ａ＋Ａ１６２Ｃ＋Ｆ３６３Ｉ、Ｒ８５Ａ＋Ｖ３０８Ｍ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｖ１６０Ｓ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｖ１６０Ｓ＋Ｆ３６３Ｉ、Ｖ１６０Ｓ＋Ｖ３０８Ｍ＋Ｆ３６３Ｉ、Ａ１６２Ｌ＋Ｆ３６３Ｍ、Ａ１６２Ｃ＋Ｆ３６３Ｍ、Ａ１６２Ｃ＋Ｆ３６３Ｉ、Ａ１６２Ｃ＋Ｆ３６３Ｌ、Ａ１６２Ｃ＋Ｖ３０８Ｍ＋Ｆ３６３Ｍ、Ａ１６２Ｃ＋Ｖ３０８Ｌ＋Ｆ３６３Ｍ、Ａ１６２Ｌ＋Ｑ１７９Ｇ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｐ３０６Ａ＋Ｖ３０８Ｌ、Ｐ３０６Ｌ＋Ｖ３０８Ｌ、Ｖ３０８Ｍ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｖ３０８Ｍ＋Ｆ３６３Ｉ、Ｉ３４３Ｔ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｉ３４３Ｖ＋Ｆ３６３Ｍ、またはＮ３６２Ｓ＋Ｆ３６３Ｍのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列またはこれと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
本明細書に記載された配列相同性（例えば、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド変異体は、配列相同性判断の基準となるアミノ酸配列を有するポリペプチド（例えば、前述のアミノ酸変異を有するＰＰＯ蛋白質）と同等程度の酵素活性、例えば、植物内（植物体内、植物細胞または細胞培養体内、植物組織内など）、藻類内、および／または試験管内で基準となるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の酵素活性を維持しながら除草剤抵抗性を付与する機能を保有するものであってもよく、前記配列相同性基材は、本明細書に記載された除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質変異体またはポリペプチド変異体が前記条件（酵素活性を維持しながら除草剤抵抗性を付与する機能を保有）を満足する範囲の全ての配列変異を含むことができるのを明確にするために使用される。
本明細書で使用されたアミノ酸の命名を以下に整理した：
Figure 0007111798000001
前記ポリペプチド変異体（除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質変異体）は、野生型ＰＰＯ蛋白質の酵素活性は維持しながら、野生型と比較して増進された除草剤耐性を示すものであってもよい。
また、前記除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質変異体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または前述のようなアミノ酸変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドと生物学的均等な活性を示す変異を追加的に含むことができる。例えば、前記追加的変異は、分子の活性を全体的に変更させないアミノ酸置換であってもよく、このようなアミノ酸置換は当該分野に公知されている。一例で、前記追加的置換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、またはＡｓｐ／Ｇｌｙ間の置換が挙げられるが、これに制限されるのではない。場合によって、前記除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質変異体は、一つ以上のアミノ酸がリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アシル化（ａｃｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）などからなる群より選択された１種以上に修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。また、前記除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質変異体は、アミノ酸変異および／または修飾によって蛋白質の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性が増加するか蛋白質活性が増加した蛋白質変異体を含むことができる。
用語「配列相同性」とは、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）または基準となるアミノ酸配列または塩基配列との類似の程度を示すためのものであって、除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質変異体のアミノ酸配列と６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上同一なアミノ酸残基を含みながら、前記除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質変異体と生物学的に均等な活性を保有すれば本発明の範囲に含まれ得る。このような蛋白質相同物は目的蛋白質と同一な活性部位を含むことができる。このような相同性の比較は、肉眼で、または購入が容易な比較プログラムを用いて行うことができる。オンライン分析プログラムは、２つ以上の配列間の相同性を百分率（％）に計算することができる。比較のための配列整列方法は当業界に知られた方法を用いることができ、例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、およびＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａなどを含む。
前記除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質またはこれらの変異体は、当分野に広く公知された方法で天然から抽出および精製して得ることができる。または、遺伝子組換え技術を用いた組換え蛋白質として得ることができる。遺伝子組換え技術を用いる場合、除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質またはこれらの変異体を暗号化する核酸を適切な発現ベクターに挿入し、ベクターを宿主細胞に形質転換して目的蛋白質が発現されるように宿主細胞を培養した後、宿主細胞から除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質またはこれらの変異体を回収する過程で得ることができる。蛋白質は選択された宿主細胞で発現させた後、分離および精製のために通常の生化学分離技術、例えば蛋白質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、超音波破砕、限外ろ過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和度クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどを用いることができ、純度の高い蛋白質を分離するためにこれらのうちの２種類以上を組み合わせて用いることができる。
前記除草剤耐性ＰＰＯ核酸分子（ＰＰＯ蛋白質またはこれらの変異体を暗号化するポリヌクレオチド）は、標準分子生物学技術、例えば化学的合成方法または組換え方法を用いて分離または製造するか、市販されるものを使用することができる。
具体的な実施例で、前記提供されたＰＰＯ蛋白質／核酸分子またはこれらの変異体はＰＰＯが欠乏した大腸菌ＢＴ３（ΔＰＰＯ）を用いた除草剤耐性検証システムを通じて、化学構造によって９個系統に属する代表的なＰＰＯ活性阻害除草剤に対して広範囲な除草剤耐性を示すということが検証され、トランジットペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＴＰ）を使用すれば植物の葉緑体で発現できるということが確認された。また、前記ＰＰＯ蛋白質／核酸分子は植物発現用ベクターによってシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｅｃｏｔｙｐｅ Ｃｏｌｕｍｂｉａ－０）のような双子葉植物または稲のような単子葉植物で発現が可能であり、このように形質転換された植物体にＰＰＯ活性阻害除草剤を処理しても植物が発芽および／または生長可能であることが確認された。同時に、後代遺伝性試験を通じて上記のような除草剤耐性形質が次世代に成功的に伝達されることが確認された。
したがって、本明細書で提供するＰＰＯ蛋白質またはこれらの変異体を植物または藻類に導入することによって植物または藻類の除草剤耐性を付与および／または増進させるのに使用できる。
一例は、
（１）配列番号１、配列番号３、配列番号５、またはこれらと９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）前述のポリペプチド変異体、
（３）前記ポリペプチド（１）またはポリペプチド変異体（２）を暗号化するポリヌクレオチド、
（４）前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および
（５）前記組換えベクターを含む組換え細胞
からなる群より選択された１種以上を含む、植物および／または藻類の除草剤に対する耐性付与および／または増進用組成物を提供する。本明細書で除草剤とは、植物または藻類を死滅させるか防除するか、または植物または藻類の生長を不利に調整する活性成分をいう。また、本願で除草剤耐性とは、正常または野生型植物または藻類を正常に死滅させるかその生長を正常に抑制させる除草剤を処理しても、正常または野生型の植物または藻類に比べて植物または藻類生長の阻害程度が弱化されるか除去され、植物または藻類の生長が持続的に行われることをいう。前記除草剤は、植物または藻類のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）を抑制する除草剤を含む。このようなＰＰＯ阻害除草剤は、化学構造によってピリミジンジオン系（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）、ジフェニルエーテル系（ｄｉｐｈｅｎｙｌ－ｅｔｈｅｒｓ）、フェニルピラゾール系（ｐｈｅｎｙｌｐｙｒａｚｏｌｅｓ）、フェニルフタルイミド系（Ｎ－ｐｈｅｎｙｌｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅｓ）、フェニルエステル系（ｐｈｅｎｙｌｅｓｔｅｒｓ）、チアジアゾール系（ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅｓ）、オキサジアゾール系（ｏｘａｄｉａｚｏｌｅｓ）、トリアゾリノン系（ｔｒｉａｚｏｌｉｎｏｎｅｓ）、オキサゾリジンジオン系（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ）およびその他の除草剤を例示することができる。
具体例として、ピリミジンジオン系除草剤は、ブタフェナシル（ｂｕｔａｆｅｎａｃｉｌ）、サフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）、ベンズフェンジゾン（ｂｅｎｚｆｅｎｄｉｚｏｎｅ）およびチアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）を含むが、これに制限されない。
ジフェニルエーテル系除草剤は、ホメサフェン（ｆｏｍｅｓａｆｅｎ）、オキシフルオルフェン（ｏｘｙｆｌｕｏｒｆｅｎ）、アクロニフェン（ａｃｌｏｎｉｆｅｎ）、アシフルオルフェン（ａｃｉｆｌｕｏｒｆｅｎ）、ビフェノックス（ｂｉｆｅｎｏｘ）、エトキシフェン（ｅｔｈｏｘｙｆｅｎ）、ラクトフェン（ｌａｃｔｏｆｅｎ）、クロメトキシフェン（ｃｈｌｏｍｅｔｈｏｘｙｆｅｎ）、クロルニトロフェン（ｃｈｌｏｒｎｉｔｒｏｆｅｎ）、フルオログリコフェン－エチル（ｆｌｕｏｒｏｇｌｙｃｏｆｅｎ－ｅｔｈｙｌ）およびハロサフェン（ｈａｌｏｓａｆｅｎ）を含むが、これに制限されない。
フェニルピラゾール系除草剤は、ピラフルフェン－エチル（ｐｙｒａｆｌｕｆｅｎ－ｅｔｈｙｌ）およびフルアゾレート（ｆｌｕａｚｏｌａｔｅ）を含むが、これに制限されない。
フェニルフタルイミド系除草剤は、フルミオキサジン（ｆｌｕｍｉｏｘａｚｉｎ）、シニドン－エチル（ｃｉｎｉｄｏｎ－ｅｔｈｙｌ）およびフルミクロラック－ペンチル（ｆｌｕｍｉｃｌｏｒａｃ－ｐｅｎｔｙｌ）を含むが、これに制限されない。
フェニルエステル系（ｐｈｅｎｙｌｅｓｔｅｒｓ）除草剤は、フェノピレート（ｐｈｅｎｏｐｙｌａｔｅ；２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ １－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）およびフェノピレートのカルバメート類似体（例えば、Ｏ－ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ－ ａｎｄ ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｏｃａｒｂａｍａｔｅ ａｎａｌｏｇｅｓ（“Ｕｊｊａｎａ Ｂ．Ｎａｎｄｉｈａｌｌｉ，Ｍａｒｙ Ｖ．Ｄｕｋｅ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｏ．Ｄｕｋｅ，Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｏ－ｐｈｅｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ－ ａｎｄ ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｏｃａｒｂａｍａｔｅ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，１９９２，４０（１０） １９９３－２０００”参照））などを含むが、これに制限されるのではない。一具体例で、前記フェノピレートのカルバメート類似体は、ピロリジン－１カルボン酸フェニルエステル（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ；ＣＡＳ Ｎｏ．５５３７９－７１－０）、１－ピロリジンカルボン酸、２－クロロフェニルエステル（１－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ、２－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ；ＣＡＳ Ｎｏ．１４３１２１－０６－６）、４－クロロフェニルピロリジン－１－カルボキシレート（４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ：ＣＡＳ Ｎｏ．１７５９－０２－０）、カルバミン酸、ジエチル－、２，４－ジクロロ－５－（２－プロピニルオキシ）フェニルエステル（ｃａｒｂａｍｉｃ ａｃｉｄ、ｄｉｅｔｈｙｌ－、２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏ－５－（２－ｐｒｏｐｙｎｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ（９ＣＩ）；ＣＡＳ Ｎｏ．１４３１２１－０７－７）、１－ピロリジンカルボン酸、２，４－ジクロロ－５－ヒドロフェニルエステル（１－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ、２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏ－５－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ；ＣＡＳ Ｎｏ．１４３１２１－０８－８）、２，４－ジクロロ－５－（メトキシカルボニル）フェニルピロリジン－１－カルボキシレート（２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏ－５－（ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ；ＣＡＳ Ｎｏ．１３３６３６－９４－９）、２，４－ジクロロ－５－［（プロパン－２－イルオキシ）カルボニル］フェニルピロリジン－１－カルボキシレート（２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏ－５－［（ｐｒｏｐａｎ－２－ｙｌｏｘｙ）ｃａｒｂｏｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ；ＣＡＳ Ｎｏ．１３３６３６－９６－１）、１－ピペリジンカルボン酸、２，４－ジクロロ－５－（２－プロピニルオキシ）フェニルエステル（１－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ、２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏ－５－（２－ｐｒｏｐｙｎｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ；ＣＡＳ Ｎｏ．８７３７４－７８－５）、２，４－ジクロロ－５－（プロプ－２－イン－１－イルオキシ）フェニルピロリジン－１－カルボキシレート（２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏ－５－（ｐｒｏｐ－２－ｙｎ－１－ｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ；ＣＡＳ Ｎｏ．８７３６５－６３－７）、２，４－ジクロロ－５－（プロプ－２－イン－１－イルオキシ）フェニル４，４－ジフルオロピペリジン－１－カルボキシレート（２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏ－５－（ｐｒｏｐ－２－ｙｎ－１－ｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ ４，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ；ＣＡＳ Ｎｏ．１３８９２６－２２－４）、１－ピロリジンカルボン酸、３，３－ジフルオロ－、２，４－ジクロロ－５－（２－プロピン－１－イルオキシ）フェニルエステル（１－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ、３，３－ｄｉｆｌｕｏｒｏ－、２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏ－５－（２－ｐｒｏｐｙｎ－１－ｙｌｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ；ＣＡＳ Ｎｏ．１４３１２１－１０－２），４－クロロ－２－フルオロ－５－［（プロパン－２－イルオキシ）カルボニル］フェニルピロリジン－１－カルボキシレート（４－ｃｈｌｏｒｏ－２－ｆｌｕｏｒｏ－５－［（ｐｒｏｐａｎ－２－ｙｌｏｘｙ）ｃａｒｂｏｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ；ＣＡＳ Ｎｏ．１３３６３６－９８－３）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
チアジアゾール系除草剤は、フルチアセット（ｆｌｕｔｈｉａｃｅｔ）およびチジアジミン（ｔｈｉｄｉａｚｉｍｉｎ）を含むが、これに制限されない。
オキサジアゾール系除草剤は、オキサジアルギル（ｏｘａｄｉａｒｇｙｌ）およびオキサジアゾン（ｏｘａｄｉａｚｏｎ）を含むが、これに制限されない。
トリアゾリノン系除草剤は、カルフェントラゾン（ｃａｒｆｅｎｔｒａｚｏｎｅ）、スルフェントラゾン（ｓｕｌｆｅｎｔｒａｚｏｎｅ）およびアザフェニジン（ａｚａｆｅｎｉｄｉｎ）を含むが、これに制限されない。
オキサゾリジンジオン系除草剤は、ペントキサゾン（ｐｅｎｔｏｘａｚｏｎｅ）を含むが、これに制限されない。
その他の除草剤は、ピラクロニル（ｐｙｒａｃｌｏｎｉｌ）、フルフェンピル－エチル（ｆｌｕｆｅｎｐｙｒ－ｅｔｈｙｌ）およびプロフルアゾル（ｐｒｏｆｌｕａｚｏｌ）を含むが、これに制限されない。
本願で提供する除草剤耐性ＰＰＯ遺伝子またはその変異体は当業界に公知された多様な方法によって植物体または藻類内に導入することができ、好ましくは植物または藻類形質転換用発現ベクターを用いることができる。
植物体形質転換の場合、ベクターに含まれるのに適したプロモーターとしては、植物体内遺伝子導入のために当業界で通常用いられるいずれのものも用いることができ、例えば、ＳＰ６プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＰＭプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）プロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、サトウキビバシリフォルムウイルスプロモーター、コメリナイエローモットルウイルスプロモーター、リブロース－１，５－ビス－ホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）の光誘導性プロモーター、稲サイトゾルトリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーター、シロイヌナズナのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）プロモーター、オクトピンシンターゼプロモーターおよびＢＣＢ（ｂｌｕｅ ｃｏｐｐｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）プロモーターなどからなる群より選択された１種以上を使用することができるが、これに制限されるのではない。
また、前記ベクターは、３’－末端のポリアデニル化を引き起こすポリＡシグナル配列を含むことができ、例えば、アグロバクテリウムツメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝子に由来したもの（ＮＯＳ ３’ｅｎｄ）、アグロバクテリウムツメファシエンスのオクトピンシンターゼ遺伝子に由来したターミネーター（ｏｃｔｏｐｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）、トマトまたはジャガイモのプロテアーゼインヒビターＩまたはＩＩ遺伝子の３’末端部分、ＣａＭＶ ３５Ｓターミネーター、稲α－アミラーゼＲＡｍｙ１ Ａターミネーターおよびファセオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎｅ）ターミネーターを含むことができるが、これに制限されるのではない。
また、藻類形質転換の場合、プロモーターとして葉緑体特異的プロモーター、核プロモーター、常時性プロモーターまたは誘導性プロモーターを使用することができる。本明細書で提供される除草剤耐性ＰＰＯ遺伝子またはその変異体は、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに作動的に連結され藻類の核中で機能を発揮するように設計できる。また、前記ベクターは、藻類形質転換に適した転写調節配列をさらに含むことができる。除草剤耐性を付与する組換え遺伝子は、宿主藻類で核のゲノムまたは葉緑体のゲノムに統合できるが、これに制限されるのではない。
また、前記ベクターは、除草剤耐性ＰＰＯ遺伝子またはその変異体を葉緑体に発現させるために、葉緑体へのターゲッティングに必要なトランジットペプチドをＰＰＯ遺伝子またはその変異体の５’－位置に連結させることができる。
また、前記ベクターは選択的に、リポーター分子として選択標識を暗号化する遺伝子を追加的に含むことができ、選択標識の例として抗生剤（例：ネオマイシン、カルベニシリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコールなど）または除草剤（グリホサート、グルホシネート、ホスフィノトリシンなど）耐性遺伝子などを含むことができるが、これに制限されるのではない。
また、植物発現用組換えベクターは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）バイナリーベクター、コインテグレーションベクター（ｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）またはＴ－ＤＮＡ部位を含まないが、植物で発現されるようにデザインされた一般ベクターが使用できる。この中、バイナリーベクターはＴｉ（ｔｕｍｏｒ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）プラスミドで移動に必要な部分であるＬＢ（ｌｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒ）とＲＢ（ｒｉｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒ）を有するプラスミドと、ターゲットヌクレオチドを移すのに必要な遺伝子を有するプラスミドを含むベクターを言い、その内部に植物体で発現させるためのプロモーター部位とポリアデニル化信号配列を含むベクターを使用することができる。
前記でバイナリーベクターまたはコインテグレーションベクターを使用する場合、植物体に前記組換えベクターを導入するための形質転換用菌株としてはアグロバクテリウムを使用することが好ましく（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、この時、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウムリゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を使用することができる。その他に、Ｔ－ＤＮＡ部位を含まないベクターを用いる場合には、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、粒子銃法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、ポリエチレングリコール沈殿法（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｐｔａｋｅ）などが組換えプラスミドを植物体に導入するのに用いられ得る。
前記のような方法で遺伝子が導入された形質転換植物は、当業界に公知された標準技術を使用してカルス誘導、発根および土壌純化のような過程を経て植物体に再分化させることができる。
本明細書で形質転換の対象になる植物は、成熟した植物体だけでなく成熟した植物に発育可能な植物細胞（懸濁培養細胞含み）、原形質体（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）、カルス（ｃａｌｌｕｓ）、胚軸（ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ）、種子（ｓｅｅｄ）、子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）、新芽（ｓｈｏｏｔ）などを全て含む意味として理解される。
また、本明細書の形質転換体の範疇には前記遺伝子が導入された形質転換体だけでなくそのクローンまたは子孫（Ｔ１世代、Ｔ２世代、Ｔ３世代、Ｔ４世代、Ｔ５世代、またはそれ以上）を含み、例えば、ＰＰＯ遺伝子またはその変異体が形質転換された植物の無性または有性子孫として除草剤耐性形質が遺伝した植物も本発明の形質転換植物の範疇に含まれる。また、本願の遺伝子が形質転換された植物の全ての交配および融合生成物と共に、初期形質転換された植物の特性を示す全ての突然変異体および変異体が本発明の範疇に含まれる。同時に、本発明の方法で予め形質転換させた形質転換された植物、またはこれらの子孫に起源し形質転換された細胞の少なくとも一部からなる種子、花、幹、果実、葉、根、塊茎、および／または塊根のような植物の一部も本発明の範疇に含まれる。
本発明が適用される植物は特に制限されず、単子葉または双子葉植物を全て含んでなる群より選択された１種以上であってもよい。また草本または木本植物であってもよい。前記単子葉植物は、オモダカ科（Ａｌｉｓｍａｔａｃｅａｅ）、トチカガミ科（Ｈｙｄｒｏｃｈａｒｉｔａｃｅａｅ）、シバナ科（Ｊｕｎｃａｇｉｎａｃｅａｅ）、ホロムイソウ科（Ｓｃｈｅｕｃｈｚｅｒｉａｃｅａｅ）、ヒルムシロ科（Ｐｏｔａｍｏｇｅｔｏｎａｃｅａｅ）、イバラモ科（Ｎａｊａｄａｃｅａｅ）、アマモ科（Ｚｏｓｔｅｒａｃｅａｅ）、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）、ハエモドルム科（Ｈａｅｍｏｄｏｒａｃｅａｅ）、リュウゼツラン科（Ａｇａｖａｃｅａｅ）、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）、ヤマノイモ科（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ）、ミズアオイ科（Ｐｏｎｔｅｄｅｒｉａｃｅａｅ）、アヤメ科（Ｉｒｉｄａｃｅａｅ）、ヒナノシャクジョウ科（Ｂｕｒｍａｎｎｉａｃｅａｅ）、イグサ科（Ｊｕｎｃａｃｅａｅ）、ツユクサ科（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｃｅａｅ）、ホシクサ科（Ｅｒｉｏｃａｕｌａｃｅａｅ）、イネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ、Ｐｏａｃｅａｅ）、サトイモ科（Ａｒａｃｅａｅ）、ウキクサ科（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）、ミクリ科（Ｓｐａｒｇａｎｉａｃｅａｅ）、ガマ科（Ｔｙｐｈａｃｅａｅ）、カヤツリグサ科（Ｃｙｐｅｒａｃｅａｅ）、バショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）、ショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ）、カンナ科（Ｃａｎｎａｃｅａｅ）、ラン科（Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ）の植物を含むことができるが、これに制限されるのではない。
前記双子葉植物は、イワウメ科（Ｄｉａｐｅｎｓｉａｃｅａｅ）、リョウブ科（Ｃｌｅｔｈｒａｃｅａｅ）、イチヤクソウ科（Ｐｙｒｏｌａｃｅａｅ）、ツツジ科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）、ヤブコウジ科（Ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｅ）、サクラソウ科（Ｐｒｉｍｕｌａｃｅａｅ）、イソマツ科（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｃｅａｅ）、カキノキ科（Ｅｂｅｎａｃｅａｅ）、エゴノキ科（Ｓｔｙｒａｃａｃｅａｅ）、ハイノキ科（Ｓｙｍｐｌｏｃａｃｅａｅ）、モクセイ科（Ｏｌｅａｃｅａｅ）、マチン科（Ｌｏｇａｎｉａｃｅａｅ）、リンドウ科（Ｇｅｎｔｉａｎａｃｅａｅ）、ミツガシワ科（Ｍｅｎｙａｎｔｈａｃｅａｅ）、キョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）、ガガイモ科（Ａｓｃｌｅｐｉａｄａｃｅａｅ）、アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）、ハナシノブ科（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｃｅａｅ）、ヒルガオ科（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌａｃｅａｅ）、ムラサキ科（Ｂｏｒａｇｉｎａｃｅａｅ）、クマツヅラ科（Ｖｅｒｂｅｎａｃｅａｅ）、シソ科（Ｌａｂｉａｔａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、ゴマノハグサ科（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ）、ノウゼンカズラ科（Ｂｉｇｎｏｎｉａｃｅａｅ）、キツネノマゴ科（Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ）、ゴマ科（Ｐｅｄａｌｉａｃｅａｅ）、ハマウツボ科（Ｏｒｏｂａｎｃｈａｃｅａｅ）、イワタバコ科（Ｇｅｓｎｅｒｉａｃｅａｅ）、タヌキモ科（Ｌｅｎｔｉｂｕｌａｒｉａｃｅａｅ）、ハエドクソウ科（Ｐｈｒｙｍａｃｅａｅ）、オオバコ科（Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｃｅａｅ）、スイカズラ科（Ｃａｐｒｉｆｏｌｉａｃｅａｅ）、レンプクソウ科（Ａｄｏｘａｃｅａｅ）、オミナエシ科（Ｖａｌｅｒｉａｎａｃｅａｅ）、マツムシソウ科（Ｄｉｐｓａｃａｃｅａｅ）、キキョウ科（Ｃａｍｐａｎｕｌａｃｅａｅ）、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、ヤマモモ科（Ｍｙｒｉｃａｃｅａｅ）、クルミ科（Ｊｕｇｌａｎｄａｃｅａｅ）、ヤナギ科（Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ）、カバノキ科（Ｂｅｔｕｌａｃｅａｅ）、ブナ科（Ｆａｇａｃｅａｅ）、ニレ科 （Ｕｌｍａｃｅａｅ）、クワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）、イラクサ科（Ｕｒｔｉｃａｃｅａｅ）、ビャクダン科（Ｓａｎｔａｌａｃｅａｅ）、ヤドリギ科（Ｌｏｒａｎｔｈａｃｅａｅ）、タデ科（Ｐｏｌｙｇｏｎａｃｅａｅ）、ヤマゴボウ科（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａｃｅａｅ）、オシロイバナ科（Ｎｙｃｔａｇｉｎａｃｅａｅ）、ザクロソウ科（Ａｉｚｏａｃｅａｅ）、スベリヒユ科（Ｐｏｒｔｕｌａｃａｃｅａｅ）、ナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、ヒユ科（Ａｍａｒａｎｔｈａｃｅａｅ）、サボテン科（Ｃａｃｔａｃｅａｅ）、モクレン科（Ｍａｇｎｏｌｉａｃｅａｅ）、シキミ科（Ｉｌｌｉｃｉａｃｅａｅ）、クスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）、カツラ科（Ｃｅｒｃｉｄｉｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、キンポウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）、メギ科（Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ）、アケビ科（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌａｃｅａｅ）、ツヅラフジ科（Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍａｃｅａｅ）、スイレン科（Ｎｙｍｐｈａｅａｃｅａｅ）、マツモ科（Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、ハゴロモモ科（Ｃａｂｏｍｂａｃｅａｅ）、ドクダミ科（Ｓａｕｒｕｒａｃｅａｅ）、コショウ科（Ｐｉｐｅｒａｃｅａｅ）、センリョウ科（Ｃｈｌｏｒａｎｔｈａｃｅａｅ）、ウマノスズクサ科（Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａｃｅａｅ）、マタタビ科（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）、オトギリソウ科（Ｇｕｔｔｉｆｅｒａｅ）、モウセンゴケ科（Ｄｒｏｓｅｒａｃｅａｅ）、ケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、フウチョウソウ科（Ｃａｐｐａｒｉｄａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、スズカケノキ科（Ｐｌａｔａｎａｃｅａｅ）、マンサク科（Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｃｅａｅ）、ベンケイソウ科（Ｃｒａｓｓｕｌａｃｅａｅ）、ユキノシタ科（Ｓａｘｉｆｒａｇａｃｅａｅ）、トチュウ科（Ｅｕｃｏｍｍｉａｃｅａｅ）、トベラ科（Ｐｉｔｔｏｓｐｏｒａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）、カタバミ科（Ｏｘａｌｉｄａｃｅａｅ）、フウロソウ科（Ｇｅｒａｎｉａｃｅａｅ）、ノウゼンハレン科（Ｔｒｏｐａｅｏｌａｃｅａｅ）、ハマビシ科（Ｚｙｇｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、アマ科（Ｌｉｎａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、アワゴケ科（Ｃａｌｌｉｔｒｉｃｈａｃｅａｅ）、ミカン科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）、ニガキ科（Ｓｉｍａｒｏｕｂａｃｅａｅ）、センダン科（Ｍｅｌｉａｃｅａｅ）、ヒメハギ科（Ｐｏｌｙｇａｌａｃｅａｅ）、ウルシ科（Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ）、カエデ科（Ａｃｅｒａｃｅａｅ）、ムクロジ科（Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ）、トチノキ科（Ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎａｃｅａｅ）、アワブキ科（Ｓａｂｉａｃｅａｅ）、ツリフネソウ科（Ｂａｌｓａｍｉｎａｃｅａｅ）、モチノキ科（Ａｑｕｉｆｏｌｉａｃｅａｅ）、ニシキギ科（Ｃｅｌａｓｔｒａｃｅａｅ）、ミツバウツギ科（Ｓｔａｐｈｙｌｅａｃｅａｅ）、ツゲ科（Ｂｕｘａｃｅａｅ）、ガンコウラン科（Ｅｍｐｅｔｒａｃｅａｅ）、クロウメモドキ科（Ｒｈａｍｎａｃｅａｅ）、ブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）、ホルトノキ科（Ｅｌａｅｏｃａｒｐａｃｅａｅ）、シナノキ科（Ｔｉｌｉａｃｅａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、アオギリ科（Ｓｔｅｒｃｕｌｉａｃｅａｅ）、ジンチョウゲ科（Ｔｈｙｍｅｌａｅａｃｅａｅ）、グミ科（Ｅｌａｅａｇｎａｃｅａｅ）、イイギリ科（Ｆｌａｃｏｕｒｔｉａｃｅａｅ）、スミレ科（Ｖｉｏｌａｃｅａｅ）、トケイソウ科（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａｃｅａｅ）、ギョリュウ科（Ｔａｍａｒｉｃａｃｅａｅ）、ミゾハコベ科（Ｅｌａｔｉｎａｃｅａｅ）、シュウカイドウ科（Ｂｅｇｏｎｉａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、ミソハギ科（Ｌｙｔｈｒａｃｅａｅ）、ザクロ科（Ｐｕｎｉｃａｃｅａｅ）、アカバナ科（Ｏｎａｇｒａｃｅａｅ）、アリノトウグサ科（Ｈａｌｏｒａｇａｃｅａｅ）、ウリノキ科（Ａｌａｎｇｉａｃｅａｅ）、ミズキ科（Ｃｏｒｎａｃｅａｅ）、ウコギ科（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）、セリ科（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ（Ａｐｉａｃｅａｅ））の植物を含むことができるが、これに限定されるのではない。
具体例として、上記植物は、稲、小麦、麦、トウモロコシ、大豆、ジャガイモ、小豆、燕麦およびキビを含む食糧作物類；ハクサイ、ダイコン、トウガラシ、イチゴ、トマト、スイカ、キュウリ、キャベツ、マクワウリ、カボチャ、ネギ、タマネギおよびニンジンを含む野菜作物類；朝鮮人参、タバコ、ワタ、馬草、牧草、ゴマ、サトウキビ、サトウダイコン、エゴマ、ピーナッツ、アブラナ、芝およびトウゴマを含む特用作物類；リンゴの木、ナシの木、ナツメの木、桃、キウイフルーツ、ブドウ、ミカン、柿、スモモ、アンズおよびバナナを含むやり果樹類；松、パームオイルおよびユーカリを含む木本類；バラ、グラジオラス、ガーベラ、カーネーション、菊、ユリおよびチューリップを含む花卉類；およびライグラス、レッドクローバー、オーチャードグラス、アルファルファ、トールフェスクおよびペレニアルライグラスを含む飼料作物類などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されない。具体例として、上記植物は、シロイヌナズナ、ジャガイモ、ナス、タバコ、トウガラシ、トマト、ゴボウ、シュンギク、チシャ、キキョウ、ホウレンソウ、フダンソウ、サツマイモ、セロリ、ニンジン、セリ、パセリ、ハクサイ、キャベツ、ダイコン、スイカ、マクワウリ、キュウリ、カボチャ、ユウガオ、イチゴ、大豆、緑豆、インゲンマメ、またはエンドウなどの双子葉植物；および稲、小麦、麦、トウモロコシ、キビなどの単子葉植物などからなる群より選択された１種以上が挙げられるが、これに制限されるのではない。
本発明が適用される藻類は特に制限されず、原核（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ）藻類または真核（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ）藻類であってもよい。例えば、藻類は、シアノバクテリア、緑藻類、紅藻類、褐藻類、大型藻類（ｍａｃｒｏａｌｇａｅ）または微細藻類（ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）であってもよい。
シアノバクテリア類としては、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃａｌｅｓ門（例、Ａｐｈａｎｏｃａｐｓａ、Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ、Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｏｎ、Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈｒｏｏｇｌｏｅｏｃｙｓｔｉｓ、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ、Ｃｙａｎｏｄｉｃｔｙｏｎ、Ｃｙａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ、Ｄａｃｔｙｌｏｃｏｃｃｏｐｓｉｓ、Ｇｌｏｅｏｃａｐｓａ、Ｇｌｏｅｏｔｈｅｃｅ、Ｈａｌｏｔｈｅｃｅ、Ｊｏｈａｎｎｅｓｂａｐｔｉｓｔｉａ、Ｍｅｒｉｓｍｏｐｅｄｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ、Ｒａｄｉｏｃｙｓｔｉｓ、Ｒｈａｂｄｏｄｅｒｍａ、Ｓｎｏｗｅｌｌａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｗｏｒｏｎｉｃｈｉｎｉａ）、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門、Ｎｏｓｔｏｃａｌｅｓ門（例、Ｍｉｃｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ、Ｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ、Ｒｉｖｕｌａｒｉａｃｅａｅ、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａｔａｃｅａｅ）、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ門（例、Ａｒｔｈｒｏｎｅｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ、Ｂｌｅｎｎｏｔｈｒｉｘ、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ、Ｇｅｉｔｌｅｒｉｎｅｍａ、Ｈａｌｏｍｉｃｒｏｎｅｍａ、Ｈａｌｏｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｈｙｄｒｏｃｏｌｅｕｍ、Ｊａａｇｉｎｅｍａ、Ｋａｔａｇｎｙｍｅｎｅ、Ｋｏｍｖｏｐｈｏｒｏｎ、Ｌｅｐｔｏｌｙｎｇｂｙａ、Ｌｉｍｎｏｔｈｒｉｘ、Ｌｙｎｇｂｙａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ、Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ、Ｐｓｅｕｄａｎａｂａｅｎａ、Ｐｓｅｕｄｏｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｔｈｒｉｘ、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ、Ｓｔａｒｒｉａ、Ｓｙｍｐｌｏｃａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ、Ｔｙｃｈｏｎｅｍａ）、Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａｌｅｓ門（例、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｉｄｉｏｐｓｉｓ、Ｄｅｒｍｏｃａｒｐａ、Ｄｅｒｍｏｃａｒｐｅｌｌａ、Ｍｙｘｏｓａｒｃｉｎａ、Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａ、Ｓｏｌｅｎｔｉａ、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ、Ｘｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒａｌｅｓ門、またはＳｔｉｇｏｎｅｍａｔａｌｅｓ門（例、Ｃａｐｓｏｓｉｒａ、Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅｏｐｓｉｓ、Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ、Ｈａｐａｌｏｓｉｐｈｏｎ、Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｏｐｓｉｓ、Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｕｓ、Ｎｏｓｔｏｃｈｏｐｓｉｓ、Ｓｔｉｇｏｎｅｍａ、Ｓｙｍｐｈｙｏｎｅｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｎｅｍｏｐｓｉｓ、Ｕｍｅｚａｋｉａ、Ｗｅｓｔｉｅｌｌｏｐｓｉｓ）などを例示することができる。
藻類の他の例として、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｖｏｌｖａｃａｌｅｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、またはＨｅｍａｔｏｃｏｃｃｍを例示することができる。
藻類の他の例として、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ ｈｙａｌｉｎｅ、Ａｍｐｈｏｒａ ｓｐｐ．、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｎａｖｉｃｕｌａ ｓａｐｒｏｐｈｉｌａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ ｃｏｍｍｕｎｉｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｏｂｌｉｑｕｕｓ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｕｅｃｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｏｃｕｌａｔａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓａｌｉｎａ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｄｅｔｉｃｕｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ ｐａｌｅａ、Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ ｃａｒｔｅｒａｅ、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｃｈｕｉｉ、Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐｐ．、Ａｐｈａｎｏｃａｐｓａ ｓｐｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ ｓｐｐ．などを例示することができる。しかし、前記の列挙した種類に制限されるのではなく、その他の多様な属および種に属する藻類が含まれ得る。
本明細書で提供される除草剤耐性ＰＰＯまたはその変異体が導入された植物または藻類は、２種以上のＰＰＯ阻害除草剤に対して耐性を示すことができる。
したがって、本明細書で提供される技術は、２種以上のＰＰＯ阻害除草剤を順次に、または同時に使用することによって雑草を防除するか望まない水生生物を除去することに使用することができる。
一例は、前述の除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質、その変異体、またはこれを暗号化する遺伝子を含む植物を栽培地に提供する段階、および前記栽培地に２種以上のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を順次にまたは同時に適用する段階を含む、栽培地で雑草を防除する方法を提供する。
他の例は、前述の除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質、その変異体、またはこれを暗号化する遺伝子を含む藻類を培養培地に提供する段階、および前記培養培地に２種以上のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を順次にまたは同時に適用する段階を含む、培養培地で望まない水生生物を除去する方法を提供する。
また、本明細書で提供する除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質、その変異体、またはその遺伝子は、第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子と組み合わせて使用することができる。
これにより、本明細書で提供する除草剤耐性ＰＰＯまたはその変異体が導入された植物または藻類は、作用機序が相異なる２種以上の除草剤に対して耐性を示すことができる。したがって、本発明は、作用機序がＰＰＯ阻害除草剤を含む相異なる２種以上の除草剤を順序に関係なく順次に、または同時に使用することによって雑草を防除するかおよび／または望まない水生生物を除去するのに使用することができる。以下、ＰＰＯ阻害除草剤と作用機序が異なる除草剤を「第２の除草剤」と称する。
一例は、前述の除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質、その変異体、またはこれを暗号化する遺伝子；および第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子を含む、植物または藻類の除草剤に対する耐性付与および／または増進用組成物を提供する。
他の例は、前述の除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質、その変異体、またはこれを暗号化する遺伝子；および第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子を含む、植物または藻類の除草剤に対する耐性を有する形質転換体、そのクローンまたは子孫を提供する。
他の例は、前述の除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質、その変異体、またはこれを暗号化する遺伝子；および第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子を藻類、または植物の細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽または植物体全体に形質転換する段階を含む、除草剤に対する耐性を有する植物または藻類を製造する方法を提供する。
他の例は、前述の除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質、その変異体、またはこれを暗号化する遺伝子；および第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子を含む植物を栽培地に提供する段階、および前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤および第２の除草剤の有効量を同時にまたは順序に関係なく順次に適用する段階を含む、栽培地で雑草を防除する方法を提供する。
他の例は、前述の除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質またはこれを暗号化する遺伝子；および第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子を含む藻類を培養培地に提供する段階、および前記培養培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤および第２の除草剤の有効量を同時にまたは順序に関係なく順次に適用する段階を含む、培養培地で望まない水生生物を除去する方法を提供する。
例えば、上記植物または藻類は第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子をさらに含み、前記第２の除草剤に対する耐性が付与および／または増進されたものであってもよい。
例えば、前記第２の除草剤は、細胞分裂阻害性除草剤、光合成阻害性除草剤、アミノ酸合成阻害性除草剤、色素体阻害性除草剤、細胞膜阻害性除草剤および／またはこれらの組み合わせを含むが、これに制限されるのではない。具体例として、前記第２の除草剤は、グリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）、グルホシネート（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ）、ジカンバ（ｄｉｃａｍｂａ）、２，４－Ｄ（２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ＡＬＳ（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）阻害性除草剤（例えば、イミダゾリジノン、スルホニルウレア、トリアゾルピリミジン、スルホンアニリド、ピリミジンチオベンゾエートなど）、第２光系（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ ＩＩ）阻害性除草剤、フェニルウレア（ｐｈｅｎｙｌｕｒｅａ）系除草剤、色素体阻害性除草剤、ブロモキシニル（ｂｒｏｍｏｘｙｎｉｌ）系除草剤および／またはこれらの組み合わせを例示することができるが、これに制限されるのではない。
例えば、第２の除草剤耐性ポリペプチドは、グリホサート除草剤耐性ＥＰＳＰＳ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ５－ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＧＯＸ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ）、ＧＡＴ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）またはグリホサートデカルボキシラーゼ（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）；グルホシネート除草剤耐性ＰＡＴ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）；ジカンバ除草剤耐性ＤＭＯ（ｄｉｃａｍｂａ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）；２，４－Ｄ除草剤耐性２，４－ＤモノオキシゲナーゼまたはＡＡＤ（ａｒｙｌｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）；ＡＬＳ阻害性スルホニルウレア（ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ）系除草剤耐性ＡＬＳ（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＡＨＡＳ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、またはＡｔｈａｈａｓｌ（ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ）；第２光系阻害性除草剤耐性光系ＩＩ（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ ＩＩ）蛋白質Ｄ１；フェニルウレア系除草剤耐性シトクロムＰ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０）；色素体阻害性除草剤耐性ＨＰＰＤ（ｈｙｄｏｒｘｙｌｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）；ブロモキシニル除草剤耐性ニトリラーゼ（ｎｉｔｒｉｌａｓｅ）；およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種以上を例示することができるが、これに制限されるのではない。
また、前記第２の除草剤耐性ポリペプチドを暗号化する遺伝子は、グリホサート除草剤耐性ｃｐ４ ｅｐｓｐｓ、ｅｐｓｐｓ（ＡＧ）、ｍｅｐｓｐｓ、２ｍｅｐｓｐｓ、ｇｏｘｖ２４７、ｇａｔ４６０１またはｇａｔ４６２１遺伝子；グルホシネート除草剤耐性ｂａｒ、ｐａｔまたはｐａｔ（ＳＹＮ）遺伝子；ジカンバ除草剤耐性ｄｍｏ遺伝子；２，４－Ｄ除草剤耐性ＡＡＤ－１、ＡＡＤ－１２遺伝子；ＡＬＳ阻害性スルホニルウレア系除草剤耐性ＡＬＳ、ＧＭ－ＨＲＡ、Ｓ４－ＨＲＡ、ＺＭ－ＨＲＡ、Ｃｓｒ１、Ｃｓｒ１－１、Ｃｓｒ１－２、ＳｕｒＡまたはＳｕｒＢ；第２光系（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ ＩＩ）阻害性除草剤耐性ｐｓｂＡ遺伝子；フェニルウレア除草剤耐性ＣＹＰ７６Ｂ１遺伝子；イソキサフルトール除草剤耐性ＨＰＰＤＰＦ Ｗ３３６遺伝子；ブロモキシニル除草剤耐性ｂｘｎ遺伝子；およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１種以上を例示することができるが、これに制限されるのではない。
本発明で提供する除草剤耐性ＰＰＯ蛋白質の変異体またはこれを暗号化する遺伝子を植物または藻類に適用することによってより優れた除草剤耐性形質を付与および／または増進させ、除草剤を用いた選別的防除を通じて経済的に雑草を防除するか望まない水生生物を除去することができる。
ＰＰＯが欠乏したＢＴ３大腸菌（ＢＴ３（ΔＰＰＯ））にｐＡＣＢＢベクター（Ｖと示す）、シロイヌナズナＰＰＯ１遺伝子（ＷＴと示す）、ＣｙＰＰＯ２野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）遺伝子（Ｃｙ２と示す）、ＣｙＰＰＯ４野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）遺伝子（Ｃｙ４と示す）、またはＣｙＰＰＯ８野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）遺伝子（Ｃｙ８と示す）を形質転換させた後、チアフェナシル（Ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）を０μＭ（ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび４００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ｐＥＴ２９ｂベクターの開裂地図である。 ｐＡＣＢＢ－ｅＧＦＰベクターの開裂地図である。 ｐＥＴ３０３－ＣＴ－Ｈｉｓベクターの開裂地図である。 ＰＰＯが欠乏したＢＴ３大腸菌（ＢＴ３（ΔＰＰＯ））にＣｙＰＰＯ２野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）遺伝子（Ｃｙ２ ＷＴと示す）または多様なＣｙＰＰＯ２変異遺伝子を形質転換させた後、チアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ２ ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ２変異遺伝子を形質転換させた後、サフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ２ ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ２変異遺伝子を形質転換させた後、フルミオキサジン（ｆｌｕｍｉｏｘａｚｉｎ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ２ ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ２変異遺伝子を形質転換させた後、ホメサフェン（ｆｏｍｅｓａｆｅｎ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ２ ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ２変異遺伝子を形質転換させた後、アシフルオルフェン（ａｃｉｆｌｕｏｒｆｅｎ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ２ ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ２変異遺伝子を形質転換させた後、ピラクロニル（ｐｙｒａｃｌｏｎｉｌ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ２ ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ２変異遺伝子を形質転換させた後、スルフェントラゾン（ｓｕｌｆｅｎｔｒａｚｏｎｅ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ２ ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ２変異遺伝子を形質転換させた後、ペントキサゾン（ｐｅｎｔｏｘａｚｏｎｅ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ２ ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ２変異遺伝子を形質転換させた後、ピラフルフェン－エチル（ｐｙｒａｆｌｕｆｅｎ－ｅｔｈｙｌ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙＰＰＯ４野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）遺伝子（Ｃｙ４ ＷＴと示す）または多様なＣｙＰＰＯ４変異遺伝子を形質転換させた後、チアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ４ ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ４変異遺伝子を形質転換させた後、サフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）を０μＭ、５μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ４ ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ４変異遺伝子を形質転換させた後、フルミオキサジン（ｆｌｕｍｉｏｘａｚｉｎ）を０μＭ、５μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙＰＰＯ８野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）遺伝子（Ｃｙ８ ＷＴと示す）または多様なＣｙＰＰＯ８変異遺伝子を形質転換させた後、チアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭおよび４００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真であって、上段はｐＥＴ３０３－ＣＴ－Ｈｉｓベクターを使用して得られた結果であり、下段はｐＡＣＢＢベクターを使用して得られた結果である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ８ ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ８変異遺伝子を形質転換させた後、サフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ８ ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ８変異遺伝子を形質転換させた後、ホメサフェン（ｆｏｍｅｓａｆｅｎ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ８ ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ８変異遺伝子を形質転換させた後、アシフルオルフェン（ａｃｉｆｌｕｏｒｆｅｎ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ８ ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ８変異遺伝子を形質転換させた後、フルミオキサジン（ｆｌｕｍｉｏｘａｚｉｎ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ８ ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ８変異遺伝子を形質転換させた後、スルフェントラゾン（ｓｕｌｆｅｎｔｒａｚｏｎｅ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ８ ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ８変異遺伝子を形質転換させた後、ペントキサゾン（ｐｅｎｔｏｘａｚｏｎｅ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ８ ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ８変異遺伝子を形質転換させた後、ピラフルフェン－エチル（ｐｙｒａｆｌｕｆｅｎ－ｅｔｈｙｌ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＢＴ３（ΔＰＰＯ）にＣｙ８ ＷＴまたは多様なＣｙＰＰＯ８変異遺伝子を形質転換させた後、ピラクロニル（ｐｙｒａｃｌｏｎｉｌ）を０μＭ、５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの濃度で処理した場合の細胞生長程度を示す写真である。 ＭＢＰ（ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）とＰＰＯ蛋白質が融合された融合蛋白質製造のための組換えベクターを模式的に示す図である。 ｐＭＡＬ－ｃ２Ｘベクターの開裂地図である。 ＣｙＰＰＯ２野生型蛋白質およびＣｙＰＰＯ２－Ｙ３７３Ｍ変異蛋白質を分離精製するために行ったＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果である。 ＣｙＰＰＯ４野生型蛋白質およびＣｙＰＰＯ４－Ｙ３７５Ｍ変異蛋白質を分離精製するために行ったＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果である。 ＣｙＰＰＯ８野生型蛋白質およびＣｙＰＰＯ８－Ｆ３６３Ｍ変異蛋白質を分離精製するために行ったＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果である。 ＣｙＰＰＯ遺伝子の植物形質転換のためのバイナリーベクターの構造を例示的に示す模式図である。 ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４またはＣｙＰＰＯ８の変異遺伝子が導入された形質転換シロイヌナズナ（Ｔ２）種子の除草剤耐性を確認するために、多様な濃度のチアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）を含む培地で種子発芽させた場合の発芽程度を示す写真である。 ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４、またはＣｙＰＰＯ８の変異遺伝子が導入された形質転換シロイヌナズナ（Ｔ２）でのＣｙＰＰＯ変異蛋白質の発現程度を示すウエスタンブロット結果である。 ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ変異体およびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ変異体を暗号化する遺伝子が導入された形質転換シロイヌナズナ（Ｔ３）に５μＭ濃度のチアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）をスプレー処理した後７日目に観察した結果を示す写真である。 ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ変異体、ＣｙＰＰＯ４ Ｙ３７５Ｍ変異体、およびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ変異体を暗号化する遺伝子が導入された形質転換シロイヌナズナ（Ｔ３）に５μＭ濃度のサフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）をスプレー処理した後７日目に観察した結果を示す写真である。 ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ変異体、ＣｙＰＰＯ４ Ｙ３７５Ｍ変異体、およびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ変異体を暗号化する遺伝子が導入された形質転換シロイヌナズナ（Ｔ３）に５μＭ濃度のホメサフェン（ｆｏｍｅｓａｆｅｎ）をスプレー処理した後７日目に観察した結果を示す写真である。 ＣｙＰＰＯ２のＹ３７３Ｉ、Ｙ３７３Ｌ、Ｙ３７３Ｖ、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７３Ｍ、Ｖ３１８Ｍ＋Ｙ３７３Ｉ、Ｖ１７３Ｓ＋Ａ１７５Ｃ＋Ｙ３７３Ｍ、およびＡ１７５Ｃ＋Ｖ３１８Ｍ＋Ｙ３７３Ｍ変異遺伝子がそれぞれ導入された形質転換シロイヌナズナ（Ｔ３またはＴ２）に２５μＭまたは５μＭ濃度のチアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）、または７５μＭ濃度のサフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）をスプレー処理した後７日目に観察した結果を示す写真である。 ＣｙＰＰＯ８のＦ３６３Ｖ、Ｆ３６３Ｌ、Ａ１６２Ｌ、およびＡ１６２Ｃ＋Ｖ３０８Ｍ＋Ｆ３６３Ｍ変異遺伝子がそれぞれ導入された形質転換シロイヌナズナ（Ｔ３またはＴ２）に２５μＭまたは１０μＭ濃度のチアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）または１００μＭ濃度のサフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）をスプレー処理した後７日目に観察した結果を示す写真である。 ｐＣＡＭＢＩＡ３３０１ベクターの開裂地図である。 野生型ドンジン稲（Ｄｏｎｇｊｉｎ－ｎｏｎ ＧＭ）とドンジン稲をＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ変異遺伝子で形質転換させた形質転換体（ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ）とＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ変異遺伝子で形質転換させた形質転換体（ＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ）のＴ０世代にＰＰＯ阻害除草剤撒布後７日目の様子を示す写真であって、Ａはチアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）を８５３ｇ ａｉ／ｈａ処理後の様子であり、Ｂはサフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）２，０８７ｇ ａｉ／ｈａ処理後の様子である。 ドンジン稲のＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ Ｔ２形質転換体ライン３番およびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ Ｔ２形質転換体ライン３番のＰＰＯ阻害除草剤撒布後７日目の様子を示す写真であって、Ａはチアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）４２０ｇ ａｉ／ｈａ処理後の様子であり、Ｂはサフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）８４０ｇ ａｉ／ｈａ処理後の様子である（１：若葉（ｙｏｕｎｇ ｌｅａｆ）→４：古葉（ｏｌｄ ｌｅａｆ））。 ドンジン稲のＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ形質転換体の葉でのＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ変異蛋白質の発現の有無を観察したウエスタンブロット結果である。 ドンジン稲のＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換体の葉でのＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ変異蛋白質の発現の有無を確認したウエスタンブロット結果である。 ドンジン稲のＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換体で変異遺伝子の存否を確認したサザンブロッティング（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）結果である。 ＣｙＰＰＯ２のＹ３７３ＩおよびＣｙＰＰＯ８のＦ３６３Ｖ変異遺伝子がそれぞれ挿入されたシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ３）の多様な除草剤に対する抵抗性水準を示す写真である。 ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３ＩおよびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｖ変異遺伝子がそれぞれ挿入されたシロイヌナズナ形質転換体のＴ４世代の除草剤抵抗性を示す写真である。 ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３ＩおよびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｖ変異遺伝子がそれぞれ挿入されたシロイヌナズナ形質転換体のＴ５世代の除草剤抵抗性を示す写真である。 シロイヌナズナのＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｉ挿入形質転換体およびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｖ挿入形質転換体のＴ４世代でのＰＰＯ蛋白質発現を示すウエスタンブロット結果である。 シロイヌナズナのＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｉ挿入形質転換体およびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｖ挿入形質転換体のＴ５世代のＰＰＯ蛋白質発現を示すウエスタンブロット結果である。 大豆形質転換用ベクターの構造を例示的に示す構造図である。 大豆のＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ形質転換体およびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換体で挿入遺伝子の存否を確認したサザンブロッティング（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）結果である。 大豆（クァンアン豆（Ｋｗａｎｇａｎ ｓｏｙｂｅａｎ））のＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ挿入形質転換体およびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ挿入形質転換体のＴ２世代の除草剤抵抗性を示す写真である。 大豆のＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ形質転換体およびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換体の葉でＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ蛋白質およびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ蛋白質の発現の有無を確認したウエスタンブロット結果である。 アブラナ（ヨンサン（Ｙｏｕｎｇｓａｎ））のＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ挿入形質転換体チアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）処理前後の成長の様子を示す写真である。 アブラナのＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ挿入形質転換体のサフルフェナシル（ｓａｆｌｕｆｅｎａｃｉｌ）処理前後の成長の様子を示す写真である。 アブラナのＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換体の葉でのＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ蛋白質の発現の有無を確認したウエスタンブロット結果（上段）およびクマシブルー染色結果（下段）を示す。
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明が下記の実施例によって限定されるのではない。
実施例１．原核生物からＰＰＯ遺伝子の分離
オシラトリアニグロ－ビリディス（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｎｉｇｒｏ－ｖｉｒｉｄｉｓ）ＰＣＣ７１１２、リングビア属（Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．）ＰＣＣ８１０６、ハロテース属（Ｈａｌｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．）ＰＣＣ７４１８菌株の分譲をパスツール研究所（フランス）から受け、各菌株からＰＰＯ遺伝子を分離した。ＢＴ３ Ｅ．ｃｏｌｉでより効率的な除草剤抵抗性スクリーニングのために各ＰＰＯ遺伝子をコドン最適化（ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）して合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。表１のプライマーを使用してＰＣＲを通じてＰＰＯ遺伝子を増幅させた。
ＰＣＲ反応液は、鋳型（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）（各遺伝子の合成ＤＮＡ）１μｌ（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）、１０Ｘバッファー（１０Ｘ ｂｕｆｆｅｒ）５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ）（各１０ｍＭ）１μｌ、フォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）（表１参照；１０μＭ）１μｌ、リバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（表１参照；１０μＭ）１μｌ、ＤＤＷ４０μｌ、およびＰｆｕ－Ｘ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、２．５ｕｎｉｔ／μｌ）１μｌを含む反応液５０μｌから構成し、９４℃で４分間反応した後、２５サイクル（９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、および７２℃で１．５分）繰り返し、７２℃で５分および４℃で５分反応して増幅した。
オシラトリアニグロ－ビリディスＰＣＣ７１１２から分離したＰＰＯをＣｙＰＰＯ２と命名し、リングビア属ＰＣＣ８１０６菌株から分離したＰＰＯをＣｙＰＰＯ４と命名し、ハロテース属ＰＣＣ７４１８から分離したＰＰＯをＣｙＰＰＯ８と命名した。
また、ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４、およびＣｙＰＰＯ８それぞれの塩基配列およびこれによって暗号化されるアミノ酸配列を確認して配列番号１～６に示した。
Figure 0007111798000002
前記準備されたＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４、およびＣｙＰＰＯ８の除草剤耐性をＰＰＯ遺伝子が欠乏した大腸菌を用いて試験した。
前記ＰＰＯ遺伝子をＰＰＯが欠乏したＢＴ３大腸菌（ＢＴ３（ΔＰＰＯ））に形質転換した後、ＰＰＯ阻害除草剤を処理した環境で培養して、形質転換大腸菌の生長阻害の有無を確認した。ＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株は北海道大学（Ｈｏｋｋａｉｄｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、日本）から提供を受け、ヘムＧ（ｈｅｍＧ）タイプＰＰＯが欠如した大腸菌であり、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ）に対して耐性を有する菌株である（“Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｕａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｓｐｉｎａｃｈ ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ ｏｘｉｄａｓｅ ＩＩ ｔｏ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ ｂｙ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｗｏ ｉｎ－ｆｒａｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎｓ、ＪＢＣ ２００１ ２７６（２３）：２０４７４－２０４８１；Ｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ Ｏｘｉｄａｓｅ ｉｎ Ｓｐｉｎａｃｈ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００ Ｓｅｐ；１２４（１）：５９－７０”参照）。
具体的な試験過程は、以下の通りである：
前記準備されたＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４、およびＣｙＰＰＯ８遺伝子をｐＡＣＢＢベクター（Ｐｌａｓｍｉｄ＃３２５５１；Ａｄｄｇｅｎｅ；図３参照）にクローニングした。このクローニングしたプラスミドをそれぞれＢＴ３コンピテントセル（ＢＴ３ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）１００μｌに入れて熱衝撃方法で形質転換した。各変異遺伝子種類別にクロラムフェニコール（Ｄｕｃｈｅｆａ）が含まれているＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）寒天培地で培養した。
各遺伝子で形質転換された大腸菌の種培養のために、各単一コロニー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙ）をクロラムフェニコールを含む３ｍｌのＬＢブロス（ＬＢ ｂｒｏｔｈ）で１２時間以上培養（２２０ｒｐｍ、３７℃）した後、５０～１００μｌを新たな３ｍｌのＬＢブロス（ＬＢ ｂｒｏｔｈ）に継代して、吸光度（ＯＤ６００）が０．５～１になるまで培養し、吸光度（ＯＤ６００）を０．５に合わせるためにＬＢブロス（ＬＢ ｂｒｏｔｈ）で希釈した。この稀釈液をＬＢブロス（ＬＢ ｂｒｏｔｈ）で１０倍ずつ５回希釈した。その次に、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールとチアフェナシル（ｔｉａｆｅｎａｃｉｌ）が濃度別に（０～４００μＭ）混合されたＬＢ寒天培地（ペトリ皿）に前記で準備した形質転換大腸菌培養稀釈液を１０μｌずつ落とした。ＬＢ寒天培地を３７℃、光条件で培養し、１６～２０時間後に生長阻害程度を確認した。
比較のために、ｐＡＣＢＢベクター（Ｐｌａｓｍｉｄ ＃３２５５１；Ａｄｄｇｅｎｅ；図３参照）で形質転換されたＢＴ３大腸菌形質転換体（Ｖ；ＰＰＯ欠乏大腸菌；ｐＡＣＢＢベクターがＢＴ３（ΔＰＰＯ）菌株に導入されたもの）および前記原核細胞由来のＰＰＯ遺伝子の代わりにシロイヌナズナ由来の野生型ＰＰＯ遺伝子（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ＡｔＰＰＯ１）（配列番号８）が導入されたＢＴ３大腸菌形質転換体（ＷＴ）を使用して同一な試験を行った。
前記得られた結果を図１に示した。図１に示されているように、前記原核細胞由来のＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４、およびＣｙＰＰＯ８遺伝子は何れも試験した全ての除草剤濃度でシロイヌナズナ由来の野生型ＰＰＯ遺伝子が導入された大腸菌と比較して優れた除草剤耐性を示すのを確認することができる。このような結果に基づいて、シロイヌナズナ由来の野生型ＰＰＯ遺伝子より優れた除草剤耐性が立証されたＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４、およびＣｙＰＰＯ８を下記の実施例３での大腸菌を用いた除草剤耐性試験の比較群として使用して、より厳しい基準で除草剤耐性を立証した。
実施例２．ＰＰＯ－除草剤複合体構造分析を通じた除草剤と相互作用するＰＰＯのアミノ酸情報獲得
ＰＰＯ蛋白質と除草剤の結合構造情報の確認のために、ＰＰＯ蛋白質の代表例としてＣｙＰＰＯ２を、ＰＰＯ阻害除草剤の代表例としてチアフェナシルを使用して試験した。水溶性ＣｙＰＰＯ２蛋白質の純粋分離精製および結晶化を行った後、放射光加速器を用いてＣｙＰＰＯ２のＸ線回折データを確保し、分子水準の３次元構造を糾明してＣｙＰＰＯ２－チアフェナシル複合体の構造を分析した。これによって除草剤耐性を付与するＰＰＯ蛋白質内アミノ酸変異位置に関する情報を収集した。
水溶性状態のＣｙＰＰＯ２蛋白質を獲得するために、ＣｙＰＰＯ２のアミノ酸（配列番号１）でチラコイド膜結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）ドメインに位置する疎水性アミノ酸残基７個を親水性残基で置換した。前記アミノ酸残基が置換されたＣｙＰＰＯ２の変異蛋白質を暗号化する遺伝子をｐＥＴ２９ｂベクター（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｕｍｂｅｒ：６９８７２－３；ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；図２参照）にクローニングし、大腸菌システムを使用してＣｙＰＰＯ２蛋白質を発現させた。発現されたＣｙＰＰＯ２蛋白質をニッケル親和クロマトグラフィーを通じて純粋分離し、精製されたＣｙＰＰＯ２蛋白質を結晶化した後、３ｍＭチアフェナシルをソーキング（ｓｏａｋｉｎｇ）してチアフェナシルと結合したＣｙＰＰＯ２の結晶を獲得した。その後、放射光加速器を用いて２．８Å解像度のＣｙＰＰＯ２－チアフェナシル複合体結晶のＸ線回折データを収集して３次元構造を糾明し、これを分析してＣｙＰＰＯ２蛋白質内チアフェナシルの結合位置を確認した。ＣｙＰＰＯ２とチアフェナシル複合体構造分析の結果、ＣｙＰＰＯ２蛋白質（配列番号１）のＳ６３、Ｐ９１、Ｒ９２、Ｆ１６９、Ｖ１７３、Ａ１７５、Ｅ２２８、Ｌ２２９、Ｐ３１６、Ｖ３１８、Ｆ３３７、Ｌ３４０、Ｇ３５１、Ｔ３５２、Ｉ３５３およびＹ３７３位置のアミノ酸がチアフェナシルと相互作用しているのを確認した。
このようにＣｙＰＰＯ２－チアフェナシル複合体構造から導出された結合アミノ酸情報を用いて、ＣｙＰＰＯ２（配列番号１）と、ＣｙＰＰＯ４およびＣｙＰＰＯ８それぞれのアミノ酸間の配列ホモロジー（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）分析（ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｐ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ）を通じてＣｙＰＰＯ４（配列番号３）とＣｙＰＰＯ８（配列番号５）蛋白質でチアフェナシルと相互作用するアミノ酸残基を導出した。
その結果、ＣｙＰＰＯ４蛋白質（配列番号３）のＮ６３、Ｓ６４、Ｓ６６、Ｐ６７、Ｐ９２、Ｒ９３、Ｆ１７０、Ｓ１７２、Ｇ１７３、Ｖ１７４、Ｙ１７５、Ａ１７６、Ｒ１９０、Ｅ２３０、Ｌ２３１、Ｐ３１８、Ｖ３２０、Ｆ３３９、Ｇ３４０、Ｎ３４１、Ｌ３４２、Ｌ３５２、Ｇ３５３、Ｔ３５４、Ｉ３５５、Ｙ３７５、Ｉ４２４、Ｖ４５８、およびＲ４６５位置のアミノ酸がチアフェナシルと相互作用すると判断した。また、ＣｙＰＰＯ８蛋白質（配列番号５）のＰ８４、Ｒ８５、Ｆ１５６、Ｖ１６０、Ａ１６２、Ｑ１７９、Ｐ３０６、Ｖ３０８、Ｆ３２７、Ｌ３３０、Ｉ３４３、Ｎ３６２、およびＦ３６３位置のアミノ酸がチアフェナシルと相互作用すると判断した。
実施例３．ＰＰＯ変異体のＰＰＯ阻害除草剤耐性検証（大腸菌で試験）
ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４およびＣｙＰＰＯ８のＰＰＯ阻害除草剤耐性を高めるためにそれぞれＰＰＯアミノ酸配列中の前記実施例２で得られた除草剤と相互作用する位置のアミノ酸に変異を誘発した。このような変異が誘発されたＰＰＯ遺伝子を設計してＰＰＯが欠乏したＢＴ３大腸菌（ＢＴ３（ΔＰＰＯ））に形質転換した後、ＰＰＯ阻害除草剤を処理した環境で培養して、形質転換大腸菌の生長阻害の有無を確認した。対照群として各変異遺伝子の野生型を用いた。
具体的な試験過程は以下の通りである：
実施例１で合成増幅してｐＡＣＢＢベクター（Ｐｌａｓｍｉｄ ＃３２５５１；Ａｄｄｇｅｎｅ；図３参照）にそれぞれクローニングしたＣｙＰＰＯ２およびＣｙＰＰＯ４、ｐＡＣＢＢベクターまたはｐＥＴ３０３－ＣＴ－Ｈｉｓベクター（ＶＴ０１６３；Ｎｏｖａｇｅｎ；図４参照）にクローニングしたＣｙＰＰＯ８を鋳型（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）にして、下記表２～４のプライマーを使用してＰＣＲを通じて変異遺伝子を製作した。
ＰＣＲ反応液は、鋳型（Ｔｅｍｐａｔｅ）１μｌ、１０Ｘバッファー（１０Ｘ ｂｕｆｆｅｒ）５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ）（各１０ｍＭ）１μｌ、フォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）１０μＭ）１μｌ、リバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（１０μＭ）１μｌ、ＤＤＷ４０μｌ、およびＰｆｕ－Ｘ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、２．５ｕｎｉｔ／μｌ）１μｌを含む反応液５０μｌから構成し、９４℃で４分間反応させた後、１７～２５サイクル（９４℃で３０秒、５６～６５℃で３０秒および７２℃で３分）繰り返し、７２℃で５分反応して増幅した。各ＰＣＲ溶液５μｌにＤｐｎＩ０．５μｌ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を処理して３７℃で３０分反応させ、この溶液をそれぞれＤＨ５αコンピテントセル（ＤＨ５ ａｌｐｈａ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μｌに入れて熱衝撃方法で形質転換した。各変異遺伝子種類別にクロラムフェニコールまたはアンピシリンが含まれているＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）寒天培地で培養した。遺伝子の変異はプラスミドＤＮＡシーケンシングで確認し、各プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）はＢＴ３に形質転換した。
Figure 0007111798000003
Figure 0007111798000004

Figure 0007111798000005
Figure 0007111798000006
Figure 0007111798000007
Figure 0007111798000008

Figure 0007111798000009
各遺伝子で形質転換された大腸菌の種培養のために、各単一コロニー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙ）をクロラムフェニコールまたはアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢブロス（ＬＢ ｂｒｏｔｈ）で１２時間以上培養した後、５０～１００μｌを新たな３ｍｌのＬＢブロス（ＬＢ ｂｒｏｔｈ）に継代して、吸光度（ＯＤ６００）が０．５～１になるまで培養し、吸光度（ＯＤ６００）を０．５に合わせるためにＬＢブロス（ＬＢ ｂｒｏｔｈ）で希釈した。この稀釈液をＬＢブロス（ＬＢ ｂｒｏｔｈ）で１０倍ずつ５回希釈した。その次に、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールまたは１００μｇ／ｍｌアンピシリンと多様な除草剤（下記表５参照）が濃度別（０～４００μＭ）に混合されたＬＢ寒天培地（ペトリ皿）に前記で準備した形質転換大腸菌培養稀釈液を１０μｌずつ落とした。ＬＢ寒天培地を３７℃、光条件で培養し、培養１６～２０時間後に生長阻害程度を確認した。
試験に使用された除草剤を下記の表５に整理した：
Figure 0007111798000010
前記得られた結果を表６～表８および図５～図２５に示した。
Figure 0007111798000011
Figure 0007111798000012
Figure 0007111798000013
上記表６～表８は各ＰＰＯ蛋白質の除草剤の耐性評価結果を等級化して示したものであって、ＰＰＯ蛋白質の野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）の耐性を０（「－」で表示）にして耐性程度によって最大「＋＋＋＋＋」まで等級を定めて表わしたものである。
図５～２５はＰＰＯ遺伝子（野生型および変異型）が形質導入された大腸菌の培養結果を示す写真であって、上端に記載された濃度は除草剤処理濃度であり、各濃度別６個のカラムは大腸菌培養液を１０倍ずつ希釈した結果を示すものであって、最も左側のカラムがＯＤ６００＝０．５の大腸菌培養液の実験結果であり、右側に行くほど１０倍ずつ希釈された培養液の実験結果である。
表６および図５～図１３に示されているように、多様な除草剤処理時、ＣｙＰＰＯ２野生型遺伝子が挿入された形質転換大腸菌（以下、「Ｃｙ２ ＷＴ」で表示；対照群）は除草剤処理濃度が低濃度である場合にも生長阻害が観察される反面、変異遺伝子がそれぞれ挿入された形質転換大腸菌は除草剤処理濃度が高濃度である場合にも対照群に比べて優れた生長を示すことが観察された。例えば、ピリミジンジオン（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ）系除草剤チアフェナシル処理時、Ｃｙ２ ＷＴは除草剤処理濃度２５μＭから急激な生長阻害が観察され、これ以上の濃度で形質転換体の生長が観察されない反面、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７３Ｉ、Ｙ３７３Ｌ、Ｙ３７３Ｍ、Ｙ３７３Ｔ、Ｙ３７３Ｖ、Ａ１７５Ｃ、Ａ１７５Ｌ、Ｖ３１８Ｍ、Ｇ３５１Ａ＋Ｙ３７３Ｍ、Ｐ３１６Ａ＋Ｖ３１８Ｌ、Ｐ３１６Ｌ＋Ｖ３１８Ｌ、Ｙ３７３Ｍ＋Ｆ３３７Ｖ、Ｙ３７３Ｍ＋Ｔ３５２Ｖ、Ｙ３７３Ｍ＋Ｇ３５１Ａ＋Ｔ３５２Ｖ、およびＹ３７３Ｍ＋Ｐ９１Ｌの変異遺伝子がそれぞれ挿入された形質転換大腸菌は試験最大濃度の２００μＭでも生長が観察された（図５）。また、ピリミジンジオン系除草剤サフルフェナシル処理時、Ｃｙ２ ＷＴは除草剤処理濃度１００μＭ以上で生長阻害が観察される反面、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７３Ｉ、Ｙ３７３Ｌ、Ｙ３７３Ｍ、Ｙ３７３Ｔ、Ｙ３７３Ｖ、Ａ１７５Ｃ、Ａ１７５Ｌ、Ｖ３１８Ｍ、およびＧ３５１Ａ＋Ｙ３７３Ｍの変異遺伝子がそれぞれ挿入された形質転換大腸菌は試験最大濃度の２００μＭでも除草剤が含まれていない培地（除草剤処理濃度０の培地；以下、「対照培地」）と同等な水準の生長が観察された（図６）。また、フェニルフタルイミド（Ｎ－ｐｈｅｎｙｌｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅｓ）系除草剤フルミオキサジン処理時、Ｃｙ２ ＷＴは除草剤処理濃度２５μＭから生長阻害が開始されこれ以上の濃度で形質転換大腸菌の生長がほとんど観察されない反面、Ｙ３７３Ｃ、Ｙ３７３Ｉ、Ｙ３７３Ｌ、Ｙ３７３Ｍ、Ｙ３７３Ｔ、Ｙ３７３Ｖ、Ａ１７５Ｃ、Ａ１７５Ｌ、Ｖ３１８Ｍ、およびＧ３５１Ａ＋Ｙ３７３Ｍの変異遺伝子がそれぞれ挿入された形質転換大腸菌は試験最大濃度の２００μＭでも生長阻害が観察されなかった（図７）。
表７および図１４～図１６に示されているように、多様な除草剤処理時、ＣｙＰＰＯ４野生型遺伝子が挿入された形質転換大腸菌（以下、「Ｃｙ４ ＷＴ」と表示；対照群）は除草剤処理濃度が低濃度である場合にも生長阻害が観察される反面、変異遺伝子がそれぞれ挿入された形質転換大腸菌は除草剤処理濃度が高濃度である場合にも対照群に比べて優れた生長を示すことが観察された。例えば、ピリミジンジオン系除草剤チアフェナシル処理時、Ｃｙ４ ＷＴは除草剤処理濃度１００μＭから生長阻害が観察される反面、Ａ１７６Ｌ、Ａ１７６Ｃ、Ｐ３１８Ｌ＋Ｖ３２０Ｌ、Ｐ３１８Ａ＋Ｖ３２０Ｌ、Ｖ３２０Ｍ、Ｙ３７５Ｉ、Ｙ３７５Ｔ、Ｙ３７５Ｖ、Ｙ３７５Ｍ、およびＹ３７５Ｃの変異遺伝子がそれぞれ挿入された形質転換大腸菌は試験最大濃度の２００μＭでも対照培地と同等な水準の生長が観察された（図１４）。また、ピリミジンジオン系除草剤サフルフェナシル処理時、Ｃｙ４ ＷＴは除草剤処理濃度１００μＭから生長阻害が観察される反面、Ｙ３７５Ｃ、Ｙ３７５Ｉ、Ｙ３７５Ｍ、Ｙ３７５Ｔ、Ｙ３７３Ｖ、Ａ１７６Ｃ、Ａ１７６Ｌ、Ｐ３１８Ｌ＋Ｖ３２０Ｌ、Ｐ３１８Ａ＋Ｖ３２０Ｌ、およびＶ３２０Ｍの変異遺伝子がそれぞれ挿入された形質転換大腸菌は試験最大濃度の２００μＭでも対照培地と同等な水準の生長が観察された（図１５）。また、フェニルフタルイミド（Ｎ－ｐｈｅｎｙｌｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅｓ）系除草剤フルミオキサジン処理時、Ｃｙ４ ＷＴは２００μＭで生長阻害が観察されるが、Ｙ３７５Ｉ、Ｙ３７５Ｍ、Ｙ３７５Ｔ、Ｙ３７３Ｖ、Ａ１７６Ｃ、Ａ１７６Ｌの変異遺伝子が挿入された形質転換大腸菌は試験最大濃度の２００μＭでも除草剤が含まれていない対照培地と同一な生長が観察された（図１６）。
表８および図１７～図２５に示されているように、多様な除草剤処理時、ＣｙＰＰＯ８野生型遺伝子が挿入された形質転換大腸菌（以下、「Ｃｙ８ ＷＴ」と表示；対照群）は除草剤処理濃度が低濃度である場合にも生長阻害が観察される反面、変異遺伝子がそれぞれ挿入された形質転換大腸菌は除草剤処理濃度が高濃度である場合にも対照群に比べて優れた生長を示すことが観察された。具体的に、ピリミジンジオン系除草剤（チアフェナシル、サフルフェナシル）処理時、Ｃｙ８ ＷＴは除草剤処理濃度５μＭから生長が観察されない反面、Ｆ３６３Ｃ、Ｆ３６３Ｌ、Ｆ３６３Ｍ、Ｆ３６３Ｖ、Ａ１６２Ｌ、Ｖ３０８Ｍ、Ｐ３０６Ａ＋Ｖ３０８Ｌ、Ｐ３０６Ｌ＋Ｖ３０８Ｌ、Ｆ３６３Ｍ＋Ｐ８４Ｌ、およびＦ３６３Ｍ＋Ｎ３６２Ｓの変異遺伝子がそれぞれ挿入された形質転換大腸菌は除草剤処理濃度最小２５μＭ以上でも生長が観察された（図１７および図１８）。また、ジフェニルエーテル（ｄｉｐｈｅｎｙｌ－ｅｔｈｅｒ）系除草剤ホメサフェン処理時、Ｃｙ８ ＷＴは除草剤処理濃度２５μＭから形質転換大腸菌の生長が観察されない反面、Ｆ３６３Ｃ、Ｆ３６３Ｌ、Ｆ３６３Ｍ、Ａ１６２Ｌ、Ｖ３０８Ｍ、Ｐ３０６Ａ＋Ｖ３０８Ｌ、およびＰ３０６Ｌ＋Ｖ３０８Ｌの変異遺伝子がそれぞれ挿入された形質転換大腸菌は除草剤処理濃度最小２５μＭ以上でも生長が観察された（図１９）。また、ジフェニルエーテル系除草剤アシフルオルフェン処理時、Ｃｙ８ ＷＴは除草剤処理濃度５０μＭから形質転換大腸菌の生長が観察されない反面、Ｆ３６３Ｃ、Ｆ３６３Ｌ、Ｆ３６３Ｍ、Ｆ３６３Ｖ、Ａ１６２Ｃ、Ａ１６２Ｌ、Ｖ３０８Ｍ、Ｐ３０６Ａ＋Ｖ３０８Ｌ、およびＰ３０６Ｌ＋Ｖ３０８Ｌの変異遺伝子がそれぞれ挿入された形質転換大腸菌は除草剤処理濃度最小５０μＭ以上でも生長が観察された（図２０）。また、フェニルフタルイミド（Ｎ－ｐｈｅｎｙｌｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅｓ）系除草剤フルミオキサジン処理時、Ｃｙ８ ＷＴは除草剤処理濃度５μＭから生長が観察されない反面、Ｆ３６３Ｃ、Ｆ３６３Ｌ、Ｆ３６３Ｍ、Ｆ３６３Ｖ、Ａ１６２Ｌ、およびＶ３０８Ｍの変異遺伝子がそれぞれ挿入された形質転換大腸菌は除草剤処理濃度２５μＭ以上でも生長が観察された（図２１）。また、トリアゾリノン系除草剤スルフェントラゾン処理時、Ｃｙ８ ＷＴは除草剤処理濃度２５μＭまでのみ生長が観察される反面、Ｆ３６３Ｃ、Ｆ３６３Ｌ、Ｆ３６３Ｍ、Ｆ３６３Ｖ、Ａ１６２Ｃ、Ａ１６２Ｌ、Ｖ３０８Ｍ、Ｐ３０６Ａ＋Ｖ３０８Ｌ、およびＰ３０６Ｌ＋Ｖ３０８Ｌの変異遺伝子がそれぞれ挿入された形質転換大腸菌は除草剤処理濃度５０μＭ以上でも生長が観察された（図２２）。また、ペントキサゾン（ｐｅｎｔｏｘａｚｏｎｅ）またはピラフルフェン－エチル（ｐｙｒａｆｌｕｆｅｎ－ｅｔｈｙｌ）処理時、Ｃｙ８ ＷＴは除草剤処理濃度５μＭ以上で生長が観察されない反面、Ｆ３６３Ｃ、Ｆ３６３Ｌ、Ｆ３６３Ｍ、Ｆ３６３Ｖ、Ａ１６２Ｃ、Ａ１６２Ｌ、Ｖ３０８Ｍ、Ｐ３０６Ａ＋Ｖ３０８Ｌ、およびＰ３０６Ｌ＋Ｖ３０８Ｌの変異遺伝子がそれぞれ挿入された形質転換大腸菌は最大処理濃度である２００μＭでも生長が観察された（図２３および図２４）。また、ピラクロニル（ｐｙｒａｃｌｏｎｉｌ）処理時、Ｃｙ８ ＷＴは除草剤処理濃度２５μＭ以上で生長が観察されない反面、Ｆ３６３Ｃ、Ｆ３６３Ｌ、Ｆ３６３Ｍ、Ｆ３６３Ｖ、Ａ１６２Ｃ、Ａ１６２Ｌ、Ｖ３０８Ｍ、Ｐ３０６Ａ＋Ｖ３０８Ｌ、Ｐ３０６Ｌ＋Ｖ３０８Ｌがそれぞれ挿入された形質転換大腸菌は最大処理濃度である２００μＭでも生長が観察された（図２５）。
実施例４：ＰＰＯ野生型および変異体の酵素活性および除草剤別ＩＣ５０値測定
除草剤耐性を増加させるためにＰＰＯ蛋白質の特定位置のアミノ酸を変異させた変異体の酵素活性を調査しＰＰＯ活性阻害除草剤による阻害試験（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を行った。ＰＰＯ蛋白質は水溶性が低いが、ＭＢＰ（ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と共に融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＢＰ－ＰＰＯ）で発現させる場合、安定的に水溶性蛋白質が発現されることを確認し、下記の野生型および変異型蛋白質をＭＢＰとの融合蛋白質形態に発現させて本試験に使用した（図２６参照）。
ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰ０４、およびＣｙＰＰＯ８の野生型遺伝子および変異型遺伝子（実施例１および実施例２参照）を発現させるために、前記遺伝子をそれぞれｐＭＡＬ－ｃ２Ｘベクター（図２７参照）に挿入した後、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ）にクローニングした。
前記得られた形質転換大腸菌を以下の条件で培養してＰＰＯ遺伝子を発現させた：
誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）：ＯＤ６００＝０．２、最終濃度０．３ｍＭ ＩＰＴＧ添加；
発現温度：２３℃、２００ｒｐｍの振盪培養；
発現時間：１６ｈｒｓ；
培養規模：２００ｍｌ／１，０００ｍｌフラスコ（ｆｌａｓｋ）。
前記培養された形質転換大腸菌に対して以下の過程で細胞破砕および蛋白質抽出を行った：
抽出バッファー：カラムバッファー（Ｃｏｌｕｍｎ ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ）５ｍｌ ｂｕｆｆｅｒ／ｇ ｃｅｌｌ；
超音波処理（Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）：ＳＯＮＩＣＳ＆ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ社 ＶＣＸ１３０（１３０ｗａｔｔｓ）；
１５ ｓｅｃ ＯＮ、１０ ｓｅｃ ＯＦＦ ｆｏｒ ５ ｍｉｎ ｏｎ ｉｃｅ；
４℃および２０分条件下で遠心分離（２０，０００ｘｇ）；および
前記遠心分離で得られた上澄み液をカラムバッファー（ｃｏｌｕｍｎ ｂｕｆｆｅｒ）を使用して１：６比率で希釈した。
前記得られた蛋白質抽出物に対して以下の過程を４℃低温室で行ってＰＰＯ蛋白質の精製を行った。１．５×１５ｃｍカラム（ｃｏｌｕｍｎ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｅｃｏｎｏ Ｃｏｌｕｍｎｓ １．５×１０ｃｍ、ｇｌａｓｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｌｕｍｎ、ｍａｘ．ｖｏｌ）にアミロースレジン（ａｍｙｌｏｓｅ ｒｅｓｉｎ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を注いでカラムをパッキング（ｐａｃｋｉｎｇ）し、前記得られた蛋白質抽出物をカラムに０．２ｍｌ／ｍｉｎの速度でローディングした。前記カラムをカラム体積基準に３体積倍のカラムバッファー（ｃｏｌｕｍｎ ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）後、洗浄液内の蛋白質量を確認してそれ以上蛋白質が検出されなければ洗浄を終了した。前記カラム体積基準に約２体積倍の２０ｍＭマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）を含むカラムバッファー（ｃｏｌｕｍｎ ｂｕｆｆｅｒ）でＭＢＰ－ＰＰＯ蛋白質を溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）（１．５ｍｌのＥ－ｔｕｂｅに各フラクション（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を分取）しながら各溶出液（ｅｌｕｅｎｔ）の蛋白質濃度を確認した。それ以上蛋白質が検出されなければ溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）を終了させた。各フラクション（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を１０μｌの量で取って蛋白質定量後、蛋白質が検出されたフラクション（ｆｒａｃｔｉｏｎ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、純度が高いフラクション（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を取って酵素活性分析試験に使用した。
ＰＰＯ蛋白質変異体（例えば、ＣｙＰＰＯ２－Ｙ３７３Ｍ、ＣｙＰＰＯ４－Ｙ３７５Ｍ、ＣｙＰＰＯ８－Ｆ３６３Ｍ）の蛋白質発現および精製を前記のように行い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を通じて純度の高いフラクション（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を取って以下の酵素活性分析試験に使用した。
前記得られたＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を図２８～図３０に示した。図２８は、ＣｙＰＰＯ２野生型蛋白質および変異型蛋白質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示すものである。図２８に示された結果を参照して、ＣｙＰＰＯ２野生型蛋白質はｅｌｕｔｉｏｎ７（ｌａｎｅ２）、ＣｙＰＰＯ２－Ｙ３７３Ｍはｅｌｕｔｉｏｎ５（ｌａｎｅ７）を取って酵素活性分析に使用した。図２９は、ＣｙＰＰＯ４野生型蛋白質および変異型蛋白質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示すものである。図２９に示された結果を参照して、ＣｙＰＰＯ４野生型蛋白質はｅｌｕｔｉｏｎ３（ｌａｎｅ２）、ＣｙＰＰＯ４－Ｙ３７５Ｍはｅｌｕｔｉｏｎ３（ｌａｎｅ６）を取って酵素活性分析に使用した。
図３０は、ＣｙＰＰＯ８野生型蛋白質および変異型蛋白質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示すものである。図３０に示された結果を参照して、ＣｙＰＰＯ８野生型蛋白質はｅｌｕｔｉｏｎ９（ｌａｎｅ３）、ＣｙＰＰＯ８－Ｆ３６３Ｍはｅｌｕｔｉｏｎ４（ｌａｎｅ６）を取って酵素活性分析に使用した。
前記精製されたＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４およびＣｙＰＰＯ８の野生型蛋白質および変異型蛋白質の酵素活性を下記の過程で測定した。
まず、ＰＰＯ蛋白質の基質であるプロトポルフィリノーゲンＩＸ（Ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ ＩＸ）を合成した。この過程は窒素気体がストリーミング（ｓｔｒｅａｍｉｎｇ）される空間で行われた。プロトポルフィリンＩＸ（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＩＸ）６ｍｇを２０％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ２０ｍｌに溶解させ、暗条件（ｄａｒｋ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）で３０分間攪拌した。前記得られたプロトポルフィリンＩＸ溶液を１５ｍｌのスクリューチューブ（ｓｃｒｅｗ ｔｕｂｅ）に８００μｌの量で入れ、５分間窒素気体をフラッシング（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）した。ここにアマルガムナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｍａｌｇａｍ）１ｇを入れ、２分間激しく振盪（ｖｉｇｏｒｏｕｓ ｓｈａｋｉｎｇ）した。チューブの中の水素気体を排出するために蓋を開けておいた。その後、蓋を閉じて３分間インキュベーションした後、シリンジ（Ｓｙｒｉｎｇｅ）とセルロースメンブレンフィルター（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ）を用いてプロトポルフィリノーゲンＩＸ溶液をろ過（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）した。前記得られたプロトポルフィリノーゲンＩＸ溶液６００μｌに２Ｍ ＭＯＰＳ［３－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ］を約３００μｌの量で添加してｐＨを８．０に調節した。ＰＰＯ蛋白質の酵素活性を測定するために次の組成で反応混合物（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ）を準備した（１０ｍｌ基準：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）；５０ｍＭ ＮａＣｌ；０．０４％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０；４０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ（０．０７２ｇ）；５ ｕｎｉｔｓ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ（１６．６ｍｇ）；および１０ ｕｎｉｔｓ ｃａｔａｌａｓｅ（１μｌ））。
前記反応混合物（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ）１８０μｌを９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅｓ）に入れ、先に精製されたＰＰＯ蛋白質（前記ＭＢＰ－融合タンパク質を精製した産物）２０μｌを添加し、約５０μｌのミネラルオイル（ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）で表面をカバーした。基質であるプロトポルフィリノーゲンＩＸ溶液を最終濃度５０μＭになるように添加して室温で３０分間反応させた。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｈｉｄｅｘ社ｓｅｎｓｅ）を用いてプロトポルフィリンＩＸ（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ＩＸ）の蛍光を測定した（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：４０５ｎｍ；ｅｍｉｓｓｉｏｎ：６３３ｎｍ）。ＰＰＯ酵素活性値を計算するために、前記プロトポルフィリノーゲンＩＸ溶液が入っているチューブを空気中に開放して溶液を１２時間以上酸化させた。ここに２．７Ｎ ＨＣｌを添加して４０８ｎｍでの吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）を測定した。標準（Ｓｔａｎｄａｒｄ）プロトポルフィリンＩＸを用いて標準曲線（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ）を作成し、これを用いてプロトポルフィリノーゲンＩＸの濃度を検定（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）してＰＰＯ活性を測定した。
前記得られたＰＰＯ野生型および変異体の酵素活性を下記の表１０および１１に示した。
一方、ＣｙＰＰＯ２とＣｙＰＰＯ８の酵素活性能力を評価するために各酵素のミカエリス－メンテン定数（Ｋｍ）および最大反応速度（Ｖｍａｘ、Ｔｈｅ ｍａｘｉｍａｌ ｖｅｌｏｃｉｔｙ）値を求めた。初期反応速度は基質濃度を異にして濃度によって反応速度が比例する区間を選定し、常温で２０分間経時変化（ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ）として酵素反応産物であるプロトポルフィリンＩＸの生成量を測定した。ＫｍおよびＶｍａｘ値はミカエリス－メンテン式によって酵素反応速度（ｅｎｚｙｍｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）分析プログラムで計算し、対照群としてシロイヌナズナＰＰＯを使用した。前記得られた結果を表９に示した：
Figure 0007111798000014
前記結果から、ＣｙＰＰＯ２とＣｙＰＰＯ８のＫｍ値はシロイヌナズナＰＰＯより低いため酵素と基質の親和力がさらに良く、Ｖｍａｘ値は約二倍以上高いのを確認することができた。結論的に、ＣｙＰＰＯ２とＣｙＰＰＯ８のＰＰＯ蛋白質が植物由来のシロイヌナズナＰＰＯよりＰＰＯ酵素としての能力がさらに優れるのを示す。
また、各ＰＰＯ野生型および変異体のＰＰＯ酵素活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）を各除草剤別に測定した。この時、各除草剤の最終濃度は下記のとおりであった：
－チアフェナシル、サフルフェナシル、ホメサフェン、ブタフェナシル、フルミオキサジン、およびスルフェントラゾン各除草剤の最終濃度：０、１０、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００ｎＭ
ＩＣ５０値は、前記酵素活性測定過程に除草剤を前記濃度で添加してＰＰＯ酵素活性を除草剤添加前の５０％に阻害する除草剤の濃度として求めた。
このように得られた除草剤別ＩＣ５０を下記の表１０および表１１に示した。
Figure 0007111798000015
Figure 0007111798000016

Figure 0007111798000017

Figure 0007111798000018
Figure 0007111798000019
上記表１０および表１１から確認されるように、ＣｙＰＰＯ蛋白質変異体の場合、野生型と比較して各除草剤のＩＣ５０値が顕著に上昇するのを確認することができる。このような結果は、ＰＰＯ蛋白質が特定位置のアミノ酸変異によって除草剤に対する耐性が増加するのを立証するものである。本試験結果でＣｙＰＰＯ蛋白質変異体が大体的に野生型に比べて減少した酵素活性を有することが確認されたが、これはＰＰＯ酵素が存在する植物の葉緑体環境と実験条件が同一でないためＣｙＰＰＯ蛋白質間酵素活性の差が大きかったが、実際植物に形質転換されて葉緑体に正常に発現されれば酵素活性減少が大きくないことと予想される。
実施例５．ＣｙＰＰＯ変異体を用いたシロイヌナズナ形質転換体製作およびＰＰＯ阻害除草剤耐性試験
５－１．シロイヌナズナ形質転換ベクター製作およびシロイヌナズナ形質転換体製作
シロイヌナズナ形質転換は選抜マーカであるｂａｒ遺伝子（グルホシネート耐性遺伝子）のＯＲＦとそれぞれのＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４、またはＣｙＰＰＯ８のアミノ酸変異遺伝子のＯＲＦを有するバイナリーベクター（ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ）を製作して行った。ＰＰＯ阻害除草剤と作用機序が異なる除草剤を交差使用する場合、その効果を確認するためにｂａｒ遺伝子を使用し、前記遺伝子は後代遺伝が安定的に行われているかどうかを検証することにも使用した。ｂａｒ遺伝子の発現のためにＮＯＳプロモーターと転写終結のためのＥ９ターミネーターを使用した。
ＣｙＰＰＯ２変異体、ＣｙＰＰＯ４変異体、およびＣｙＰＰＯ８変異体それぞれを植物体で発現させるためにＣａＭＶ３５ＳプロモーターとＮＯＳターミネーターを使用した。また、葉緑体への蛋白質の移動と発現を誘導するためにＡｔＰＰＯ１遺伝子（配列番号８）の輪送ペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＴＰ）をＸｂａＩ、ＸｈｏＩ制限酵素を用いて挿入遺伝子の５’前に挿入した。また、発現された蛋白質の確認のためにヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＨＡ）タグをＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ制限酵素を用いて３’末端部位に挿入した。ベクター内挿入された輪送ペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）部位を配列番号１０と、挿入されたＨＡタグ配列を配列番号１１と示した。ＣｙＰＰＯ２変異体、ＣｙＰＰＯ４変異体、およびＣｙＰＰＯ８変異体の暗号化遺伝子はそれぞれ輪送ペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）とＨＡタグの間にＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ制限酵素を用いて挿入した。ＨＡタグの後にＮＯＳターミネーター（ＮＯＳ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）が挿入されてＰＰＯ遺伝子の転写終結を誘導した。本実施例に用いた植物形質転換バイナリーベクターの構造模式図を図３１に例示的に示した。
前記で製作したそれぞれのベクターをアグロバクテリウムＧＶ３１０１コンピテントセル（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＶ３１０１ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）に凍結および融解（ｆｒｅｅｚｅ ａｎｄ ｔｈａｗ）方法で形質転換させた。アグロバクテリウムＧＶ３１０１コンピテントセル（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＶ３１０１ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）を製造するために、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１菌株を５ｍｌのＬＢ培地（ＬＢ ｍｅｄｉａ）に３０℃および２００ｒｐｍ条件で１２時間培養した。この培養液を２００ｍｌのＬＢ培地（ＬＢ ｍｅｄｉａ）に注いだ後、３０℃および２００ｒｐｍ条件で３～４時間培養し、３０００ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離した。滅菌蒸留水でペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を洗浄した後、２０ｍｌのＬＢ培地（ＬＢ ｍｅｄｉａ）で再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）した。２００μｌずつ等分（ａｌｉｑｕｏｔ）して液体窒素に瞬間凍結（ｓｎａｐ ｆｒｅｅｚｉｎｇ）した後、超低温冷凍庫に保管した。
それぞれの形質転換アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を抗生剤培地（スペクチノマイシン（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）を含むＬＢ寒天（ＬＢ ａｇａｒ））で培養および選抜した。前記選別されたコロニーをＬＢブロス（ＬＢ ｂｒｏｔｈ）で液体培養した。この培養液からアグロバクテリウムセル（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｅｌｌ）を収穫（ｈａｒｖｅｓｔ）した後、５％（ｗ／ｖ）スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、０．０５％（ｖ／ｖ）シルウェット（Ｓｉｌｗｅｔ）Ｌ－７７溶液（Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｃｏｍｐａｎｙ）に吸光度（ＯＤ６００）０．８の濃度で懸濁した。フロラルディップ（Ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐｐｉｎｇ）方法でＣｏｌ－０生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）シロイヌナズナ野生型に形質転換して１～２ヵ月後に種子（Ｔ１）を収穫した。
ベクター製作時に挿入されたｂａｒ遺伝子を用いて形質転換個体を選抜した。前記得られたＴ１種子を２５μＭグルホシネートが添加された１／２ＭＳ培地（２．２５ｇ／Ｌ ＭＳ塩（ＭＳ ｓａｌｔ）、１０ｇ／Ｌスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、７ｇ／Ｌ寒天（ａｇａｒ））に播種し、播種７日後に生存した個体を選抜して土に移植し成長させてＴ１植物体を収得した。
移植したＴ１植物体のＰＰＯ阻害除草剤耐性を判断するために、４週育てた後、抽苔前にチアフェナシルを処理した。１００ｍｌのチアフェナシル溶液（１μＭチアフェナシル＋０．０５％シルウェット（Ｓｉｌｗｅｔ）Ｌ－７７）を４０×６０ｃｍ（０．２４ｍ２）の面積に噴射して満遍なく処理した。野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ－０ ｅｃｏｔｙｐｅ；Ｃｏｌｕｍｂｉａ－０生態型）の場合、前記と同一な濃度および量でチアフェナシルを処理する場合に死滅した。前記のようなチアフェナシル処理後７日経過後、各形質転換体のＰＰＯ阻害除草剤耐性の有無を判別した。
耐性を示して生残る植物体は持続的に育てて種子を収穫し（Ｔ２種子）、前記Ｔ２種子を２５μＭグルホシネートを添加した１／２ＭＳ培地（２．２５ｇ／Ｌ ＭＳ塩（ＭＳ ｓａｌｔ）、１０ｇ／Ｌスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、７ｇ／Ｌ寒天（Ａｇａｒ））に播種して一週間育てた後、土に移植して植物体を収得した。
下記の実施例で陰性対照群として使用されたシロイヌナズナ由来の野生型ＰＰＯ（野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）ＡｔＰＰＯ１）はＰＰＯ阻害除草剤感受性があり、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＸ０８４７３２に配列情報が登録されている（遺伝子の塩基配列を配列番号８、アミノ酸配列を配列番号７に示す）。陽性対照群として前記野生型ＡｔＰＰＯ１のアミノ酸配列でＹ４２６Ｍ（４２６番目アミノ酸であるチロシンがメチオニンで置換）およびＳ３０５Ｌ（３０５番目アミノ酸であるセリンがロイシンで置換）のアミノ酸置換が発生した変異（Ｍｕｔａｎｔ）ＡｔＰＰＯ１（ＡｔＰＰＯ１ ＳＬＹＭ）を使用した（アミノ酸配列を配列番号９に示す）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ ｏｘｉｄａｓｅ ａｓ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ．Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ．２００３ １３３：７３６－７４７）。
前記シロイヌナズナ形質転換体の製作に使用されたＣｙＰＰＯ変異体を下記の表１２に整理した：
Figure 0007111798000020
５－２．種子発芽
前記製作されたＣｙＰＰＯ２のＹ３７３Ｍ変異体、ＣｙＰＰＯ４のＹ３７５Ｍ変異体、またはＣｙＰＰＯ８のＦ３６３Ｍの変異体が挿入された形質転換体（それぞれＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ形質転換体、ＣｙＰＰＯ４ Ｙ３７５Ｍ形質転換体、およびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換体）の中の１μＭチアフェナシルのスプレー処理下でも生存した個体のＴ２世代種子を用いてチアフェナシル耐性を確認した。このために、７０ｎＭチアフェナシルが含まれている１／２ＭＳ培地に前記得られたＴ２シロイヌナズナ種子を播種した。５０ｎＭチアフェナシルが含まれている１／２ＭＳ培地で野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ－０；Ｃｏｌｕｍｂｉａ－０生態型）は発芽障害が観察され遅く発芽する特性を示したが、７０ｎＭ含まれている１／２ＭＳ培地でＣｏｌ－０は正常発芽せずに死滅した。したがって、７０ｎＭで生存すればチアフェナシルに対する耐性を有するものと判断することができる。同時にグルホシネート（ＰＰＴ）が添加された培地でシロイヌナズナ種子を播種してグルホシネート耐性を確認した。
前記得られた結果を図３２に示した。図３２に示したように、ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ形質転換体のＴ２世代ラインの中の３２番、３４番と３８番ライン、ＣｙＰＰＯ４ Ｙ３７５Ｍ形質転換体のＴ２世代ラインの中の１４番と３１番ライン、そしてＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換体のＴ２世代ラインの中の２２番、５１番および５２番が１μＭチアフェナシルが含まれている１／２ＭＳ培地でも発芽することを確認した。特にＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍの３２番ライン形質転換体は５μＭチアフェナシル含有１／２ＭＳ培地で発芽した。また、陰性対照群として使用された野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ－０）種子は７０ｎＭチアフェナシルが含まれている１／２ＭＳ培地で発芽せず、陽性対照群として使用された変異（Ｍｕｔａｎｔ）ＡｔＰＰＯ１（ＡｔＰＰＯ１ ＳＬＹＭ）形質転換体は１μＭチアフェナシルが含まれている１／２ＭＳ培地でも発芽するのを確認することができる。
５－３．Ｔ ２ 世代種子で耐性形質分離比の確認
形質転換シロイヌナズナが世代を進展しながら挿入した遺伝子の分離比を確認し同時に除草剤耐性形質を評価した。Ｔ２種子を対象にしてｂａｒ遺伝子挿入によるＰＰＴ系除草剤耐性個体と感受性個体の分離比（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）をライン別に判断した。耐性対感受性個体の比が約３：１を示せば、メンデルの法則によってトランス遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）がシロイヌナズナに単一コピー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐｙ）で挿入されて分離および発現されたと判断した。
前記得られた結果を表１３～表１５に示した。
Figure 0007111798000021
Figure 0007111798000022
Figure 0007111798000023
表１３のように、ＣｙＰＰＯ２変異遺伝子挿入形質転換体の下記ラインはトランス遺伝子が単一コピーで挿入されたと判断した：
Ｙ３７３Ｍ変異体の３２番、３４番、３８番、３９番ライン、Ｙ３７３Ｖ変異体の３４番ライン、Ｙ３７３Ｉ変異体の２３番、３４番ライン、Ｙ３７３Ｌ変異体の２３番、４３番ライン、Ｙ３７３Ｃ変異体の４０番ライン、Ｖ３１８Ｍ＋Ｙ３７３Ｉ変異体の１番、３番ライン、Ｖ１７３Ｓ＋Ａ１７５Ｃ＋Ｙ３７３Ｍ変異体の３番、４番、７２番、８４番、５１番ライン、およびＡ１７５Ｃ＋Ｖ３１８Ｍ＋Ｙ３７３Ｍ変異体の４番、８番ライン。
表１４のように、ＣｙＰＰＯ４変異遺伝子挿入形質転換体の下記ラインはトランス遺伝子が単一コピーで挿入されたと判断した：
Ｙ３７５Ｍ変異体の１４番、３１番ライン。
表１５のように、ＣｙＰＰＯ８変異遺伝子挿入形質転換体の下記ラインはトランス遺伝子が単一コピーで挿入されたと判断した：
Ｆ３６３Ｍ変異体の２２番、５１番、５２番ライン、Ｆ３６３Ｖ変異体の１番、１８番ライン、Ｆ３６３Ｌ変異体の１番、３３番ライン、Ａ１６２Ｌ変異体の１番、５番ライン、およびＡ１６２Ｃ＋Ｖ３０８Ｍ＋Ｆ３６３Ｍ変異体の４６番、４８番ライン。
５－４．修飾（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＣｙＰＰＯ２，４、８遺伝子導入シロイヌナズナ（Ｔ ２ ）対象ＣｙＰＰＯ蛋白質発現調査
導入したＣｙＰＰＯ２のＹ３７３Ｍ、ＣｙＰＰＯ４のＹ３７５ＭおよびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ遺伝子がシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ２）で発現されるか判断して、世代進展時に挿入遺伝子の発現が維持されるかを確認した。形質転換体のＴ２世代ライン別にシロイヌナズナ形質転換体葉約１００ｍｇを液体窒素と共に摩砕した後、蛋白質抽出バッファー（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１ｍＭ ＤＴＴ）を添加して蛋白質を抽出した。抽出した蛋白質を用いてウェスタンブロットを行った。シロイヌナズナ形質転換ベクターに含まれているＨＡタグを用いてＰＰＯ蛋白質量を検出しようとした。その後、電気泳動してＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に転移した後、抗－ＨＡ抗体（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ）と抗－ａｃｔｉｎ抗体（ｌｏａｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ、実験蛋白質量比較；Ａｂｃａｍ）を用いてウェスタンブロットを行った。
前記得られた結果を図３３に示した。図３３に示したように、ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ形質転換体とＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換体は類似なＰＰＯ変異体発現を示し、ＣｙＰＰＯ４ Ｙ３７５Ｍ変異体はＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ変異体とＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ変異体に比べてＰＰＯ変異体の発現水準が低かった。
前記形質転換体ラインを一世代さらに進展させて形質転換体Ｔ３世代ライン別に除草剤を処理した（実施例５－５参照）。これは、発現された導入遺伝子が世代を進展しながら維持され除草剤耐性を付与することを示す。
５－５．形質転換シロイヌナズナの除草剤耐性検証
ＣｙＰＰＯ２、ＣｙＰＰＯ４およびＣｙＰＰＯ８のアミノ酸変異体暗号化遺伝子の植物内除草剤耐性形質とその水準を判断するためにそれぞれの遺伝子が形質転換されたシロイヌナズナのＴ２世代またはＴ３世代植物体に対して除草剤耐性をテストした。下記の全ての除草剤処理試験は抽苔直前（移植約４週経過後）に行った。各除草剤を含む溶液１００ｍｌを４０×６０ｃｍ（０．２４ｍ２）面積に満遍なく処理した。
ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ変異体、ＣｙＰＰＯ４ Ｙ３７５Ｍ変異体、およびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ変異体のＴ３世代にチアフェナシル、サフルフェナシルおよびホメサフェンをそれぞれ処理した。チアフェナシル、サフルフェナシルおよびホメサフェン各５μＭをそれぞれスプレーした。
スプレー後７日目観察結果を図３４（チアフェナシル処理結果）、図３５（サフルフェナシル処理結果）および図３６（ホメサフェン処理結果）に示した。図３４～図３６に示されているように、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）Ｃｏｌ－０植物体は全て死滅し、陽性対照群であるＡｔＰＰＯ１ ＭＴ（変異（Ｍｕｔａｎｔ）ＡｔＰＰＯ１；「ＡｔＰＰＯ１ ＳＬＹＭ」で表示）と実験群であるＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ形質転換体の３８番、３９番および３４番ライン、ＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換体の２２番、５１番および５２番ラインはチアフェナシル５μＭ、サフルフェナシル５μＭおよびホメサフェン５μＭで全て持続生長を示した。ＣｙＰＰＯ４ Ｙ３７５Ｍ形質転換体の１４番ラインはサフルフェナシル５μＭおよびホメサフェン５μＭで比較的に持続生長を示した。
ＣｙＰＰＯ２のＹ３７３Ｃ、Ｙ３７３Ｉ、Ｙ３７３Ｌ、Ｙ３７３ＭおよびＹ３７３Ｖ変異遺伝子がそれぞれ挿入された形質転換植物体のＴ３世代にチアフェナシル２５μＭまたはサフルフェナシル７５μＭをスプレーした。また、ＣｙＰＰＯ８のＦ３６０Ｌ、Ｆ３６０ＶおよびＡ１６２Ｌ変異遺伝子がそれぞれ挿入された形質転換植物体のＴ３世代、約４週育ったシロイヌナズナにチアフェナシル２５μＭまたはサフルフェナシル１００μＭをスプレーした。
ＣｙＰＰＯ２のＶ３１８Ｍ＋Ｙ３７３Ｉ、Ｖ１７３Ｓ＋Ａ１７５Ｃ＋Ｙ３７３ＭおよびＡ１７５Ｃ＋Ｖ３１８Ｍ＋Ｙ３７３Ｍ変異遺伝子が挿入されたそれぞれの形質転換植物体のＴ２世代にチアフェナシル５μＭをスプレーした。また、ＣｙＰＰＯ８のＡ１６２Ｃ＋Ｖ３０８Ｍ＋Ｆ３６３Ｍ変異遺伝子が挿入された形質転換植物体のＴ２世代にチアフェナシル１０μＭをスプレーした。
スプレー後７日目観察結果を表１６（薬害水準（Ｉｎｊｕｒｙ ｉｎｄｅｘ））および図３７（ＣｙＰＰＯ２変異体；Ｔ３世代（上段、下段）／Ｔ２世代（中間））と図３８（ＣｙＰＰＯ８変異体；Ｔ３世代（上段、中間）／Ｔ２世代（下段））に示した。
Figure 0007111798000024
上記表１６の薬害水準（Ｉｎｊｕｒｙ ｉｎｄｅｘ）は下記の表１７の基準で評価した（本明細書に提供された薬害水準（Ｉｎｊｕｒｙ ｉｎｄｅｘ）に同一に適用される）：
Figure 0007111798000025
表１６および図３７に示されているように、ＣｙＰＰＯ２の変異がそれぞれ導入された形質転換シロイヌナズナは何れもチアフェナシル５μＭだけでなく２５μＭでも持続生長し、サフルフェナシル７５μＭでも持続生長した。
表１６および図３８に示されているように、ＣｙＰＰＯ８の変異がそれぞれ導入された形質転換シロイヌナズナはチアフェナシル１０μＭだけでなく２５μＭで持続生長し、サフルフェナシル１００μＭでも持続生長した。
また、チアフェナシルまたはサフルフェナシル以外の除草剤（フルミオキサジン、スルフェントラゾン）各５０μＭでＣｙＰＰＯ２のＹ３７３ＩおよびＣｙＰＰＯ８のＦ３６３Ｖ変異遺伝子がそれぞれ挿入されたシロイヌナズナ形質転換体（Ｔ３）の抵抗性水準を確認した。ＡｔＰＰＯ１のＳＬ＋ＹＭはシロイヌナズナＰＰＯ１のＳ３０５Ｌ＋Ｙ４２６Ｍ変異体を意味するものであって、本試験で抵抗性対照群（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使用した。チアフェナシル、サフルフェナシル、フルミオキサジン、スルフェントラゾンをそれぞれ５０μＭずつ処理し、７日後、薬害水準（ｉｎｊｕｒｙ ｉｎｄｅｘ）評価した。前記得られた結果を図４５および表１８に示した。参考として、チアフェナシルの分子量（ＭＷ）は５１１．８７、サフルフェナシルの分子量は５００．８５、フルミオキサジンの分子量は３５４．３４、スルフェントラゾンの分子量は３８７．１８である。各除草剤５０μＭ濃度を４０×６０ｃｍ面積（０．２４ｍ２）に１００ｍｌずつ均等に撒布した。換算した処理薬量はチアフェナシルは１０６．７ｇ ａｉ／ｈａ、サフルフェナシルは１０４．４ｇ ａｉ／ｈａ、フルミオキサジンは７３．８ｇ ａｉ／ｈａ、スルフェントラゾンは８０．７ｇ ａｉ／ｈａに該当する。
Figure 0007111798000026
図４５および表１８に示されているように、除草剤抵抗性として知られたシロイヌナズナＰＰＯ１の変異体（ＡｔＰＰＯ１ ＳＬＹＭ）と比較して変異遺伝子形質転換体の抵抗性が類似しているかさらに優れていた。
チアフェナシルのシロイヌナズナ死滅濃度が約０．８μＭであることを考慮する時、ＰＰＯ変異遺伝子が導入された形質転換シロイヌナズナが０．８μＭ以上の高濃度で持続的な生長を示したことから、この遺伝子が実際作物に導入されて優れた除草剤耐性を示すことが予想される。また、チアフェナシル以外の除草剤の場合にも、ＰＰＯ変異遺伝子が導入された形質転換シロイヌナズナがシロイヌナズナ死滅濃度より顕著に高い濃度で持続的な生長を示すことが確認された。
５－６．挿入遺伝子の後代安定性確認
本試験は、シロイヌナズナ内挿入した遺伝子が世代を進展しても安定的に遺伝して発現されるか確認するためのものである。
ＣｙＰＰＯ２のＹ３７３Ｉ変異遺伝子とＣｙＰＰＯ８のＦ３６３Ｖ変異遺伝子がそれぞれ挿入された形質転換シロイヌナズナをＴ４、またはＴ５世代に展開させた。ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｉ形質転換体のＴ３ライン２３－２、２３－７、３４－２とＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｖ挿入形質転換体のＴ３ライン１－７、１８－１、１８－７を展開させた。各ラインのＴ３世代からＴ５世代まで除草剤抵抗性が維持され、これは世代を経る間に導入遺伝子が安定的に伝達されることを意味する。
具体的に、約４週育った抽苔前シロイヌナズナ（Ｔ４ラインおよびＴ５ライン）を対象にして１００ｍｌのチアフェナシル１５μＭまたはサフルフェナシル１５０μＭを４０×６０ｃｍ（０．２４ｍ２）の面積に処理した。除草剤処理後７日目に除草剤薬害程度を評価した。前記得られた結果を図４６（Ｔ４ライン）および図４７（Ｔ５ライン）に示した。
また、遺伝子発現を確認するために、形質転換体の世代別、ライン別に蛋白質を抽出した。芽生え（Ｓｅｅｄｌｉｎｇ）状態の植物体地上部を液体窒素を用いて摩砕した後、蛋白質抽出バッファー（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．５、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ－１００、１ｍＭ ＤＴＴ）を添加して総タンパク（ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）を抽出してウエスタンブロットを行った。シロイヌナズナ形質転換ベクターに含まれているＨＡタグを用いて挿入したＰＰＯ蛋白質発現を検出した。抽出した蛋白質を電気泳動してＰＶＤＦ膜（ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に転移した後、抗－ＨＡ抗体（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ）を用いてウエスタンブロットを行った。前記得られた結果を図４８（Ｔ４ライン）および図４９（Ｔ５ライン）に示した。
図４６～図４９に示されているように、Ｔ４およびＴ５世代まで除草剤抵抗性およびＰＰＯ蛋白質発現が維持されることを確認した。具体的に、チアフェナシル１５μＭまたはサフルフェナシル１５０μＭ処理時、陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）として用いたＣｏｌ－０（野生型シロイヌナズナ）の場合、完全死滅する反面、Ｔ４およびＴ５世代形質転換体は薬害水準（ｉｎｊｕｒｙ ｉｎｄｅｘ）０水準に抵抗性を維持しているのを確認することができる。参考として、Ｔ３世代でチアフェナシル２５μＭまたはサフルフェナシル７５μＭ処理時、薬害水準（ｉｎｊｕｒｙ ｉｎｄｅｘ）０～１水準であった。前記結果から、世代を進展しても挿入遺伝子の蛋白質発現を通じた除草剤抵抗性が維持されるのを確認することができる。
実施例６．ＣｙＰＰＯ変異体を用いた稲形質転換体製作およびＰＰＯ阻害除草剤耐性試験
６－１．稲形質転換ベクター製作および稲形質転換体製作
稲形質転換のための植物発現ベクターはｂａｒ遺伝子（グルホシネート耐性遺伝子）のＯＲＦとそれぞれのＣｙＰＰＯ２またはＣｙＰＰＯ８のアミノ酸変異遺伝子のＯＲＦを有するバイナリーベクター（ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ）を製作して使用した。各遺伝子の発現のためにｐＣＡＭＢＩＡ３３０１ベクター（図３９参照）を用いた。ｂａｒ遺伝子の発現のためにＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターと転写終結のために３５Ｓターミネーターを用いた。
ＣｙＰＰＯ２またはＣｙＰＰＯ８の変異遺伝子それぞれを植物体で発現させるためにトウモロコシのユビキチンプロモーターとＮＯＳターミネーターを使用した。また、葉緑体への蛋白質の移動と発現を誘導するためにＣｙＰＰＯ２またはＣｙＰＰＯ８の変異遺伝子と共にＡｔＰＰＯ１遺伝子の輪送ペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＴＰ）を挿入した。
前記で製作したそれぞれのベクターをアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４コンピテントセル（Ｔａｋａｒａ）に電気衝撃方法で導入して形質転換した。
前記製造された形質転換アグロバクテリウムをドンジン稲に感染させて形質転換稲を製作した。ドンジン稲の種子の皮を除去した後に消毒してＮ６Ｄ培地で３２℃、５日間暗培養した後、形質転換アグロバクテリウム溶液に稲種子を混合して２Ｎ６－ＡＳ１００培地に置床した。これを２８℃で１日間暗培養し、２３．５℃で４日間暗培養した。Ｎ６Ｄ ｃｆ５００ ｐｐｔ４培地１リットル（Ｌｉｔｅｒ）にホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎ、Ｄｕｃｈｅｆａ）１ｍｌを添加した培地で２８℃、１０日間光培養して感染した種子から形質転換カルス（ｃａｌｌｕｓ）を選抜した。選抜されたカルス（ｃａｌｌｕｓ）はＲＥＩＩＩ ｃｆ５００ ｐｐｔ４培地１リットル（Ｌｉｔｅｒ）にホスフィノトリシン１ｍｌを添加した培地に移して植物体を誘導して純化過程を経た後、土壌に移して生長させた。
前記使用された培地組成を下記の表１９に整理した：
Figure 0007111798000027
６－２．形質転換稲対象ＰＰＯ阻害除草剤耐性検証
ＣｙＰＰＯ２とＣｙＰＰＯ８の変異遺伝子形質転換植物の除草剤耐性とその水準を単子葉作物内で判断するためにそれぞれの遺伝子が形質転換されたドンジン稲のＴ０世代植物体に対して除草剤耐性をテストした。
ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ形質転換体とＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換体のＴ０世代、約５週育った稲の分けつを取って別途の植物体にした後、チアフェナシルとサフルフェナシルをそれぞれ処理した。チアフェナシル、サフルフェナシルの処理面積は４０×６０ｃｍであり、チアフェナシルは２００μＭ、サフルフェナシルは５００μＭ（３３％アセトン（ａｃｅｔｏｎｅ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶媒）濃度２００ｍｌを使用し、これを換算すればチアフェナシルの処理量は８５３ｇ ａｉ／ｈａ、サフルフェナシルの処理量は２，０８７ｇ ａｉ／ｈａになる。参考として、チアフェナシルの雑草防除のための推奨処理薬量は約１５０ｇ ａｉ／ｈａであり、サフルフェナシルの雑草防除のための推奨処理最大薬量は１４５ｇ ａｉ／ｈａ未満である。前記除草剤は全てスプレー方式で処理した。
ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ形質転換体とＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換体Ｔ０世代で世代を進展しＴ２植物体を播種した。播種後４７日目に処理面積４０×６０ｃｍにそれぞれチアフェナシル２００μＭ、サフルフェナシル４００μＭ濃度１００ｍｌをスプレーした。これを換算すれば、チアフェナシル処理量は４２０ｇ ａｉ／ｈａ、サフルフェナシル処理量は８４０ｇ ａｉ／ｈａである。スプレー後７日目の観察結果を図４０（ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ Ｔ０形質転換体１、３番ラインおよびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ Ｔ０形質転換体２、３番ラインのチアフェナシルおよびサフルフェナシル処理結果）、図４１（ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ Ｔ２形質転換体３番ラインおよびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ Ｔ２形質転換体３番ラインのチアフェナシルおよびサフルフェナシル処理結果）にそれぞれ示した。図４０で、「ｎｏｎ－ＧＭ」は形質転換されていない野生型ドンジン稲であって、陰性対照群として使用された。
図４０、および図４１に示されているように、陰性対照群である野生型ドンジン稲ではチアフェナシルおよびサフルフェナシル処理によって深刻な薬害が発生した。反面、ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ形質転換体（「ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ」と表示）のＴ０世代の２つのライン（１番および３番）とそのＴ２子世代（３－１）を観察した結果、チアフェナシル４２０ｇ ａｉ／ｈａまたは８５３ｇ ａｉ／ｈａとサフルフェナシル８４０ｇ ａｉ／ｈａまたは２，０８７ｇ ａｉ／ｈａの処理群の全てで薬害が観察されないか、野生型ドンジン稲と比較して微弱な薬害が観察された。ＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換体（「ＣｙＰＰＯ８＿Ｆ３６３Ｍ」で表示）の２つのライン（２番および３番）とそのＴ２子世代（３－１）を観察した結果、チアフェナシル４２０ｇ ａｉ／ｈａまたは８５３ｇ ａｉ／ｈａまたはサフルフェナシル８４０ｇ ａｉ／ｈａまたは２，０８７ｇ ａｉ／ｈａを処理した時、全ての処理群に薬害が観察されなかった。
全てのＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍの形質転換体およびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍの形質転換体稲がチアフェナシルとサフルフェナシルの各雑草推奨防除量以上濃度処理で耐性があった。そして世代を進展しても耐性が維持されるのを示し、挿入された遺伝子が世代を経ても安定的に遺伝して発現されることが分かる。
６－３．形質転換稲蛋白質発現検証および方法
ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ形質転換体およびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換体で変異蛋白質（ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３ＭまたはＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ）が発現されるか確認するために各形質転換体ライン別に葉から蛋白質を抽出してウェスタンブロットを行った。
このために、各形質転換体の葉組織に抽出バッファー（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＮＰ－４０）５ｍｌ ｂｕｆｆｅｒ／ｇ ｃｅｌｌ、サンプルバッファー（ｂｅｔａ－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ ２μｌ／１０ｍｌ、ＤＴＴ １ｍＭ、ＭＧ１３２、ＮａＦ）、およびプロテアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（Ｘｐｅｒｔ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＧｅｎＤｅｐｏｔ）を添加し、１００℃で５分間沸かした後、４℃で５分間遠心分離（２０，０００ｘｇ）した。上澄み液２０μｌをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングした後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルからＰＶＤＦ膜に蛋白質を転移した。各蛋白質に特異な抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）で標識させた（ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ形質転換体はＣｙＰＰＯ２特異抗体（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換体はＣｙＰＰＯ８抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いる；Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を１：１，０００比率で添加して反応させた。ＥＣＬ発色試薬とルミノグラフ（Ｌｕｍｉｎｏｇｒａｐｈ）を用いて蛋白質発現を確認した。
前記得られたイメージを図４２（ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ発現）および図４３（ＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ）に示した。図４２および図４３に示したように、チアフェナシルとサフルフェナシルに対して耐性であったＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ形質転換体の１番、３番ライン、ＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換体の２番、３番ラインで全て導入遺伝子蛋白質が検出された。
６－４．形質転換稲の挿入遺伝子コピー数（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ）分析
ＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換体で変異遺伝子の存否を確認するために各形質転換体ライン別に葉からＤＮＡを抽出してサザンブロッティング（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行った。
ＣＴＡＢ Ｂｕｆｆｅｒ方法を用いてゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を抽出した。具体的に、液体窒素で凍らせた状態で乳棒と乳鉢を用いて前記形質転換稲の葉組織を微細に擦った後、５ｍｌ／ｇ ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％（ｖ／ｖ）ｂｅｔａ－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）を入れてボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）した。６０℃で１時間以上加熱した後、クロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）：イソアミルアルコール（ｉｓｏａｍｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）（２４：１）を１ｖｏｌｕｍｅ添加しインバーティング（ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ）して混合した。７０００ｘｇおよび４℃条件で１０分間遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）した後、上澄み液を新しいチューブに移して２．５ｖｏｌｕｍｅエタノールを混合した。５０００ｘｇおよび４℃条件で５分間遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）した後、上澄み液を捨て、ペレットをＴＥバッファー（ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ）（ＬＰＳＳ）で溶かした。２０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を添加した後、３７℃で３０分間培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。１ｖｏｌｕｍｅのフェノール：クロロホルム（１：１）を入れて混合した後、１００００ｘｇおよび４℃条件で１０分間遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）し、上澄み液を新しいチューブに移した後、１ｖｏｌｕｍｅのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を入れて混合した。１００００ｘｇおよび４℃条件で１０分間遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）し、上澄み液を新しいチューブに移した後、０．１ｖｏｌ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）、２ｖｏｌｕｍｅエタノールを添加して混合した。５０００ｘｇおよび４℃条件で５分間遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）し、得られたペレットを７０％エタノールで洗浄した。空気乾燥（Ａｉｒ ｄｒｙ）した後、適正量のＴＥバッファー（ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ）でゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を溶かした。
前記抽出されたＤＮＡ１０～４０μｇをＥｃｏＲＩ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を用いて１２時間以上消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）した。
その後、下記の条件でアガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）０．８％（ｗ／ｖ）電気泳動（５０Ｖ）後、ゲル処理（ｇｅｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を行った：
１）脱プリン反応（ｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎ）：０．２５Ｎ ＨＣｌ、１５分間振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）
２）変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）：０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、３０分間振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）
３）中和（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）：０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１．５Ｍ ＮａＣｌ、２０分間振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）
その後、キャピラリートランスファー（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）方法を用いてゲル内のＤＮＡ片をニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移した後、ＵＶ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ（ＵＶＣ－５０８；ＵＬＴＲＡ ＬＵＭ Ｉｎｃ．）を用いて架橋結合（ｃｒｏｓｓ ｌｉｎｋｉｎｇ）を行った。
下記の方法で混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った：
前記ニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）をＤＩＧ Ｅａｓｙハイブリダイゼーション溶液（ＤＩＧ Ｅａｓｙｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｒｏｃｈｅ）で４２℃で３時間培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。その後、新たなＤＩＧ Ｅａｓｙハイブリダイゼーション溶液で交替した後、プローブ（ｐｒｏｂｅ）をいれて、４２℃で１２時間以上反応させた。
前記プローブ（ｐｒｏｂｅ）（ＤＩＧラベリングされたＣｙＰＰＯ８－Ｍプローブ）は下記の条件でＰＣＲを行って製作した：
材料
鋳型（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）（ＣｙＰＰＯ８ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ） ０．５μｌ
１０Ｘバッファー ３μｌ
ＤＩＧ－ｄＮＴＰ ２μｌ
フォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）（１０μＭ） ３μｌ
リバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（１０μＭ） ３μｌ
ＤＤＷ １８μｌ
ｅ－ｔａｑポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ社） ０．５μｌ
総３０μｌ
Figure 0007111798000028
プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ ｐｒｏｂｅ：ＧＣＧＴＴＡＡＣＧＧＧＴＧＣＡＴＴＡＧＧＣ（配列番号１５８）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ ｐｒｏｂｅ：ＴＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧＴＴＧＡＡＣＴＣＣ（配列番号１５９）
前記得られたＰＣＲ産物（ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ）をアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）に電気泳動後、プローブバンド（ｐｒｏｂｅ ｂａｎｄ）をゲル抽出（ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）して使用した。
前記反応した膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に対してｌｏｗ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ｗａｓｈｉｎｇ（２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）とｈｉｇｈ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ｗａｓｈｉｎｇ（０．５Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を行った。下記の条件でＤＩＧ検出（ＤＩＧ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を行ってバンドを確認した：
１）前記膜をブロッキングバッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、Ｒｏｃｈｅ）に入れて３０分間振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）
２）ＤＩＧ抗体（ａｎｔｉ－ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ＡＰ Ｆａｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、Ｒｏｃｈｅ）を入れて３０分間振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）
３）洗浄バッファー（Ｒｏｃｈｅ）で１５分間振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）
４）検出バッファー（Ｒｏｃｈｅ）を入れて３分間振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）
５）ＣＤＰ－Ｓｔａｒ、ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）を膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に塗布した後、Ｘ線フィルム（ｘ－ｒａｙ ｆｉｌｍ）でバンド（ｂａｎｄ）を現像。
前記得られた結果を図４４に示した。ＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍの３番ラインで一つのバンドが確認され、これはＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ遺伝子が単一コピー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐｙ）で挿入されたことを意味する。
実施例７．ＣｙＰＰＯ変異体を用いた大豆形質転換体製作およびＰＰＯ阻害除草剤耐性試験
７－１．大豆形質転換体製作
ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３ＭおよびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ遺伝子を大豆植物体にそれぞれ発現させてチアフェナシル抵抗性を付与するための形質転換用ベクターを製作した。
シロイヌナズナ形質転換時に用いたベクター（図３１参照）を鋳型（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）にしてシロイヌナズナＰＰＯ１遺伝子の輪送ペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）が結合されたＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３ＭおよびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ遺伝子をそれぞれＰＣＲで分離した。
ＰＣＲ反応液は鋳型（シロイヌナズナ形質転換時に用いたベクター）１μｌ（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）、１０Ｘバッファー（１０Ｘ ｂｕｆｆｅｒ）５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ）（各１０ｍＭ）１μｌ、ＴＯＰＯ－ｃＴＰ＿Ｆプライマー（１０μＭ）１μｌ、ＴＯＰＯ－ＣｙＰＰＯ２＿ＲまたはＴＯＰＯ－ＣｙＰＰＯ８＿Ｒプライマー（１０μＭ）１μｌ、ＤＤＷ４０μｌ、およびＰｆｕ－Ｘ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、２．５ｕｎｉｔ／μｌ）１μｌを含む反応液５０μｌから構成し、９４℃で４分間反応した後、２５サイクル（９４℃で３０秒、５６℃で３０秒および７２℃で１．５分）繰り返し、７２℃で５分反応して増幅した。
この時に使用されたプライマーを下表２１に整理した：
Figure 0007111798000029
ｐＥＮＴＲ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＥＮＴＲ－ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に各増幅した産物（ｐｒｏｄｕｃｔ）をクローニングし（図５０参照）、ＤＨ５αコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。
このように製作されたエントリーベクター（Ｅｎｔｒｙ ｖｅｃｔｏｒ）を用いて植物形質転換用ベクターであるｐＢ２ＧＷ７．０バイナリーベクター（ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ）にクローニングした。前記クローニングは、ＧａｔｅｗａｙＬＲクロナーゼＩＩ酵素ミックス（Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ＩＩ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットを用いて行った。ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３ＭまたはＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ遺伝子が挿入されたｐＥＮＴＲ／Ｄ－ＴＯＰＯベクターとｐＢ２ＧＷ７．０プラスミド、ＴＥバッファー、およびＬＲクロナーゼＩＩ酵素ミックス（ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ＩＩ ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ）を混合した後、２５℃で１時間反応させた。前記得られた反応物にプロテイナーゼＫ溶液（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した後、３７℃で１０分間反応させＤＨ５αコンピテントセルに形質転換した。
前記のように製作した各ベクターを用いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＨＡ１０５（Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｌｐｅｒ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｐｌａｎｔｓ（ＥＨＡ１０５）．Ｔｒａｎｓ Ｒｅｓ．１９９３ ２：２０８－２１８）をｅｌｅｃｔｒｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ方法を用いて大豆形質転換体を製作した。
前記大豆形質転換体製作はクァンアン豆を用いて行った。滅菌した３次水に浸漬しておいた種子の両子葉の間に外科用メス（Ｓｃａｐｅｌ）を入れて下胚軸まで垂直に切断して種皮を除去した。胚軸を子葉の下部約１ｃｍになる所で切断した後、胚軸（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｘｉｓ）がついている一方を外科用メス（＃１１ブレード（ｂｌａｄｅ））で７、８回程度切り付けた。大略５０個程度の切片体を形質転換されたアグロバクテリウムツメファシエンスＥＨＡ１０５と混合後、超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を２０秒間行った後、３０分間接種させた。それぞれの切片体を滅菌したろ過紙の上に置いて水気を除去した後、固体ＣＣＭ（共培養培地（Ｃｏ－ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）；０．３２ｇ／Ｌガムボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５、４．２６ｇ／Ｌ ＭＥＳ、３０ｇ／Ｌスクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、０．７％寒天（Ａｇａｒ））にもろ過紙を一枚敷いて１０個体を載せておいた。この時、切片体の向軸（ａｄａｘｉａｌ）部分が下へ向かうように置いた。マイクロポアサージカルテープ（Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｔａｐｅ）で封じた後、２５℃および１８時間光周期条件で５日間共培養した。
５日間共培養した後に、除菌のために液体１／２ＳＩＭ培地（シュート誘導培地（ｓｈｏｏｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）；Ｂ５塩（ｓａｌｔ）３．２ｇ／Ｌ、ＢＡ １．６７ｍｇ／Ｌ、ＭＥＳ ３ｍＭ、寒天（ａｇａｒ）０．８％（ｗ／ｖ）、スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）３％（ｗ／ｖ）、セフォタキシム（ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ）２５０ｍｇ／Ｌ、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）５０ｍｇ／Ｌ、チカルシリン（ｔｉｃａｒｃｉｌｌｉｎ）１００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）に１０分間洗浄した。それぞれの切片体をろ過紙の上に置いて水気を除去した後、選抜抗生剤がないＳＩＭに一プレート（ｐｌａｔｅ）当り６個体ずつ胚軸部分が培地に固着され再分化される部分が３０度程度の角度で上へ向かうように置床した。それぞれのプレートをマイクロポアサージカルテープ（Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｔａｐｅ）で封じた後、２５℃および１８時間光周期条件で培養した。
２週後、新芽が出た切片体を選抜抗生剤ＰＰＴ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）１０ｍｇ／Ｌが入っているＳＩＭ－１（ＳＩＭにＤＬ－ホスフィノトリシン（ＤＬ－ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）１０ｍｇ／Ｌ添加、ｐＨ５．６）に置床し、この時、新芽を除いた残りの部分は切り捨て、向軸（ａｄａｘｉａｌ）部分が下へ向かうように置床した。
２週後、褐変した新芽／新芽パッド（ｐａｄ）は外科用メス（＃１５ブレード（ｂｌａｄｅ））で削って選抜抗生剤ＰＰＴ５ｍｇ／Ｌが入っているＳＥＭ（ｓｈｏｏｔ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ、新芽伸張培地；ＭＳ塩（ＭＳ ｓａｌｔ）４．４ｇ／Ｌ、ＭＥＳ ３ｍＭ、ＧＡ３ ０．５ｍｇ／Ｌ、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）５０ｍｇ／Ｌ、ピログルタミン酸（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）１００ｍｇ／Ｌ、ＩＡＡ ０．１ｍｇ／Ｌ、ゼアチン（ｚｅａｔｉｎ）１ｍｇ／Ｌ、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）３％（ｗ／ｖ）、寒天（ａｇａｒ）０．８％（ｗ／ｖ）、セフォタキシム（ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ）２５０ｍｇ／Ｌ、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）５０ｍｇ／Ｌ、チカルシリン（ｔｉｃａｒｃｉｌｌｉｎ）１００ｍｇ／Ｌ、ＤＬ－ホスフィノトリシン（ＤＬ－ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）５ｍｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）に置床した。２週ごとに新たなＳＥＭに移しながら、新芽の褐変部位は外科用メス（＃１５ブレード（ｂｌａｄｅ））の上面で打って除去し、新芽パッドは少しずつ継続して削って培地がよく吸収されるようにした。
ＳＥＭで選抜を経て伸張した新芽が４ｃｍ以上である時、外科用メス（＃１１ブレード（ｂｌａｄｅ））で切断してＲＩＭ（ｒｏｏｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ、根誘導培地；ＭＳ塩（ＭＳ ｓａｌｔ）４．４ｇ／Ｌ、ＭＥＳ ３ｍＭ、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）３％、寒天（ａｇａｒ）０．８％、セフォタキシム（ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ）５０ｍｇ／Ｌ、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）５０ｍｇ／Ｌ、チカルシリン（ｔｉｃａｒｃｉｌｌｉｎ）５０ｍｇ／Ｌ、アスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）２５ｍｇ／Ｌ、ピログルタミン酸（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）２５ｍｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）に移した。この時、分離した伸張した新芽の下部分を１ｍｇ／ｍＬ濃度のＩＢＡ（Ｉｎｄｏｌｅ－３－ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）に３分間浸漬した後に取り出してＲＩＭが入っているテストチューブに入れた。
根が十分に育つようになると、３次蒸留水で培地を洗浄し、床土（バイオプラグ２号、ファームハンノン（ｆａｒｍｈａｎｎｏｎｇ））とバーミキュライトを２：１（ｖ／ｖ）で混合して入れた小さいポット（６ｃｍ×６ｃｍ×５．６ｃｍ）に植えた。１０日程度経過後、葉の表面に１００ｍｇ／ＬのＤＬ－ホスフィノトリシン（ＤＬ－ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）でリーフペインティング（ｌｅａｆ ｐａｉｎｔｉｎｇ）した。１０日後、植物体にｂａｓｔａ（ＢＡＹＥＲ、５３ｍｇ／Ｌ）処理を行って抵抗性個体を選抜した。
７－２．形質転換大豆内挿入遺伝子数確認
ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ変異遺伝子挿入形質転換大豆Ｔ０植物体（１２、１４、１６、２４、２５、２７、２８、３４、４１番ライン）およびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ変異遺伝子挿入形質転換大豆Ｔ１植物体（３、５、７、９、１１、１４、１７、３６、４４番ライン）に対して挿入遺伝子数を確認するために、各植物体の葉２５０ｍｇから実施例６－４を参考にしてＣＴＡＢ方法でゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を抽出した。
前記抽出されたＤＮＡ１０～４０μｇに対してＥｃｏＲＩ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を用いて１２時間以上消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を行い、実施例６－４の方法でサザンブロッティング（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行った。
混成化のためのＤＮＡプローブ（ＤＮＡ ｐｒｏｂｅ）はシロイヌナズナ形質転換時に用いたベクターを鋳型（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）にしてｂａｒ遺伝子の一部配列にジゴキシゲニン（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）が標識（ｌａｂｅｌｉｎｇ）されるようにＰＣＲして製作した。ＰＣＲ反応液は鋳型（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）（シロイヌナズナ形質転換時に用いたベクター）０．５μｌ（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）、１０Ｘバッファー（１０Ｘ ｂｕｆｆｅｒ）５μｌ、ＤＩＧ－ｄＮＴＰ混合物（ＤＩＧ－ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ）（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ各０．５ｍＭ、ｄＴＴＰ ０．３２ｍＭ、ＤＩＧ－１１－ｄＵＴＰ ０．１８ｍＭ）１０μｌ、フォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）（１００μＭ）０．５μｌ、リバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）（１００μＭ）０．５μｌ、ＤＤＷ ３３μｌ、およびｅ－ｔａｑ（Ｓｏｌｇｅｎｔ、２．５ｕｎｉｔ／μｌ）０．５μｌを含む反応液５０μｌで構成し、９４℃で４分間反応した後、３５サイクル（ｃｙｃｌｅｓ）（９４℃で３０秒、５６℃で３０秒および７２℃で３０秒）繰り返し、７２℃で５分反応して増幅した。
ｂａｒ ｐｒｏｂｅ ｐｒｉｍｅｒ
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ｂａｒ ｐｒｏｂｅ ５’－ＴＴＣ ＣＧＴ ＡＣＣ ＧＡＧ ＣＣＧ ＣＡＧ ＧＡ－３’（配列番号１６３）
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ｂａｒ ｐｒｏｂｅ ５’－ＣＧＴ ＴＧＧ ＧＣＡ ＧＣＣ ＣＧＡ ＴＧＡ ＣＡ－３’（配列番号１６４）
比較のために、陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）として形質転換していないクァンアン豆のゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）（ＷＴ）を用いた。
前記得られた結果を図５１に示した。図５１でフィルム上に示されるバンドの数が挿入された遺伝子の数を意味する。形質転換していないクァンアン豆（ＷＴ）の場合、バンドが確認されず、一つの外来遺伝子がクァンアン豆のゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）に挿入された形質転換体はＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ形質転換大豆の１４、２５、３４、４１番ラインとＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換大豆の３、５、７、１１、１４、１７番ラインであるのを確認することができる。
以下、前記確認された単一コピー（ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐｙ）挿入形質転換体ラインを用いて除草剤抵抗性評価および植物体内挿入遺伝子の蛋白質発現確認を行った。
７－３．形質転換大豆対象除草剤抵抗性検証
ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３ＭとＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍがそれぞれ導入された形質転換大豆の除草剤耐性水準を判断するために、各遺伝子が形質転換されたクァンアン豆Ｔ２世代に除草剤を処理した。
大豆植物体（Ｖ２～３ Ｓｔａｇｅ）に２０μＭチアフェナシルまたは１５０μＭ、３００μＭサフルフェナシルをそれぞれスプレー処理した。４０×６０ｃｍ面積に前記の濃度で除草剤が含まれている溶液１００ｍｌを満遍なくスプレーして５日後も植物体の状態を評価した。前記使用された除草剤の濃度を量に換算すれば、チアフェナシル４２ｇ ａｉ／ｈａ、サフルフェナシル３１５ｇ ａｉ／ｈａ、６３０ｇ ａｉ／ｈａである。
形質転換されていないクァンアン豆（クァンアン豆と表示）を陰性対照群にして、形質転換体の除草剤処理後変化と比較した。
前記得られた結果を図５２に示した。図５２に示されているように、形質転換されていないクァンアン豆は各除草剤によって損傷レベル（ｉｎｊｕｒｙ ｌｅｖｅｌ）９程度で死滅した反面、ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３ＭまたはＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換大豆Ｔ２世代個体の場合には、チアフェナシル２０μＭを処理した時の損傷レベル（ｉｎｊｕｒｙ ｌｅｖｅｌ）は１～３程度であり、ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍにサフルフェナシル１５０μＭを処理した時の損傷レベル（ｉｎｊｕｒｙ ｌｅｖｅｌ）は０、ＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍにサフルフェナシル３００μＭを処理した時の損傷レベル（ｉｎｊｕｒｙ ｌｅｖｅｌ）は１であった。前記損傷レベル（ｉｎｊｕｒｙ ｌｅｖｅｌ）は下記の基準で判断した：
Figure 0007111798000030
上記結果は、野生型クァンアン豆は各除草剤によって死滅した反面、形質転換体はチアフェナシルには弱い薬害を示し、サフルフェナシルにはほとんど薬害を示さないのが分かる。参考として、ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３ＭのチアフェナシルＩＣ５０は２５０ｎＭ、サフルフェナシルＩＣ５０は５，０００ｎＭであり、ＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３ＭのチアフェナシルＩＣ５０は１８３ｎＭ、サフルフェナシルＩＣ５０は５，０００ｎＭである（表１０～１１）。
７－４．形質転換大豆の蛋白質発現検証
大豆のＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ形質転換体およびＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換体で挿入されたそれぞれの外来遺伝子が正常に発現されて蛋白質を生産するか確認した。この確認結果は挿入した遺伝子の蛋白質発現によって形質転換体の除草剤抵抗性が付与されるのを立証することができる。
蛋白質発現を確認するために、各形質転換体（Ｔ１）から蛋白質を抽出してウェスタンブロット分析を実施した。各形質転換体の葉一部を液体窒素と共に摩砕した後、蛋白質抽出バッファー（０．８％ＳＤＳ、４％グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、２％β－メルカプトエタノール（ｂｅｔａ－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、０．０００８％ブロモフェノールブルー（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）、０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．４）を添加して総タンパク（ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）を抽出した。
抽出した蛋白質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離した後、ＰＶＤＦ膜（ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に転移（ｔｒａｓｆｅｒ）した。蛋白質が転移された膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）を各挿入蛋白質に特異的な抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）で標識させた（ＣｙＰＰＯ２ Ｙ３７３Ｍ形質転換体はＣｙＰＰＯ２特異抗体（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ形質転換体はＣｙＰＰＯ８抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いる；Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）。
前記得られたウェスタンブロット結果を図５３に示した。図５３に示されているように、各形質転換体ラインの個別個体を各挿入遺伝子発現蛋白質の特異的な抗体を用いて検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）した結果、全ての個体で挿入遺伝子による蛋白質が発現されたのを確認することができる。このような結果は形質転換体内で挿入した遺伝子が正常に発現されるため除草剤抵抗性特性が示されるのを提案する。
実施例８．ＣｙＰＰＯ変異体を用いたアブラナ形質転換体製作およびＰＰＯ阻害除草剤耐性試験
８－１．アブラナ形質転換体製作
実施例５－１で製作したＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ遺伝子が挿入されたベクター（図３１参照）を用いてアブラナ形質転換体製作に用いた。アブラナ種子を７０％（ｖ／ｖ）エタノールに４分間浸漬した後、１．３％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム溶液を入れて３０分間消毒した。滅菌水で５回洗浄した後、滅菌されたろ過紙の上で水分を除去し、滅菌された種子はＭＳＯ培地（ＭＳ粉末（ｐｏｗｄｅｒ）４．４３ｇ／Ｌ、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）３０ｇ／Ｌ、フィタゲル（ｐｈｙｔａｇｅｌ）３ｇ／Ｌ、ｐＨ５．８）に置床した後、２５℃が維持される培養室で１６時間明培養（２５，０００Ｌｕｘ）条件で５日間培養した。
ＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ遺伝子が挿入されたベクターにアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＶ３１０１を形質転換させた後、スペクチノマイシン（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）（１００ｍｇ／Ｌ）とリファンピシン（ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）（５０ｍｇ／Ｌ）が添加されたＬＢ培地に接種し、２８℃が維持される振盪培養機で最小１６時間以上培養した。アブラナの柔植物体組織とアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を３日間（暗条件、２５＄＄＄１℃）共培養した後、選抜培地（４．４３ｇ／Ｌ ＭＳ粉末（ＭＳ ｐｏｗｄｅｒ）、２０ｇ／Ｌスクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、０．２ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、８μＭ ＴＤＺ、０．０１ｍｇ／Ｌ ＧＡ３、５０μＭ チオ硫酸銀（ｓｉｌｖｅｒ ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ）、１０ｍｇ／Ｌ ＰＰＴ、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、４ｇ／Ｌフィタゲル（ｐｈｙｔａｇｅｌ）、ｐＨ５．８）に移して２５＄＄＄１℃環境の培養室で１６時間明培養条件下で培養した。
接種した植物体は２週間隔で継代培養を行い、カルスを経て再分化された幹は根誘起培地（ＭＳ塩（ＭＳ ｓａｌｔ）４．４３ｇ／Ｌ、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）３０ｇ／Ｌ、フィタゲル（ｐｈｙｔａｇｅｌ）３ｇ／Ｌ、活性炭（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｈａｒｃｏａｌ）３ｇ／Ｌ、ｐＨ５．８）に移して根を誘起した。
根が生成された小植物体をジフィーポットに移して植物体を生長させた後、葉を切断して形質転換体の有無を確認した。
８－２．形質転換アブラナ対象除草剤抵抗性検証
アブラナ形質転換体（Ｔ１）およびヨンサンアブラナ（野生型アブラナ、対照群）種子を５０％（ｗ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウムで３０分間消毒後、滅菌水で５回洗浄した後、選抜培地（１／２ＭＳ、チアフェナシル５０ｎＭ、ｐＨ５．８）に播種し、野生型アブラナは１／２ＭＳ培地に播種した。７日後生存した個体を植木鉢に移植して植物培養室（２５＄＄＄１℃、１６ｈ ｌｉｇｈｔ／８ｈ ｄａｒｋ）で培養した。移植３５日後、１０μＭチアフェナシルおよび１０μＭサフルフェナシルをそれぞれ植木鉢が置かれたトレイ（４０×６０ｃｍ、０．２４ｃｍ２）当り１００ｍＬ（０．０５％ シルウェット（Ｓｉｌｗｅｔ）Ｌ－７７）ずつスプレー処理した。
前記除草剤処理前と処理７日後の結果を図５４（チアフェナシル処理結果）および図５５（サフルフェナシル処理結果）に示した。図５４および図５５で、野生型ヨンサンアブラナは「ヨンサン」と表示した。
また、除草剤処理７日後、薬害程度を薬害水準（Ｉｎｊｕｒｙ Ｉｎｄｅｘ）０－５（薬害ない－死滅；表１７参照）で評価して下記の表２３に示した：
Figure 0007111798000031
表１９に、ヨンサン（野生型アブラナ、対照群）は除草剤処理時４水準で死滅に近い薬害を示す反面、形質転換アブラナはライン別に程度の差はあるが、全体的に抵抗性を示すことが確認された。具体的に、ＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ－２ラインは１０μＭチアフェナシルに対する薬害水準が１－２程度と確認された（図５４）。また、１０μＭサフルフェナシルに対して、ＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ－２ラインは薬害がなかった（図５５）。
８－３．形質転換アブラナの蛋白質発現検証
ＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ変異遺伝子形質転換アブラナ内で挿入遺伝子の発現を確認して遺伝子の発現と除草剤抵抗性発現の間の関係を確認した。
形質転換アブラナの２番ラインで除草剤抵抗性を確認した５個体（２－１、２－２、２－６、２－９、２－１０）を選定してウェスタンブロットを行った。
各植物体の葉約２００ｍｇを液体窒素と乳棒を用いて摩砕した後、０．８ｍＬのフェノール（Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ、ｐＨ８．０）と０．８ｍＬ ｄｅｎｓｅ ＳＤＳ ｂｕｆｆｅｒ（３０％（ｗ／ｖ）スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ８．０、５％（ｖ／ｖ）β―メルカプトエタノール（ｂｅｔａ－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ））を入れ、３０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）して混合し、１０，０００ｘｇで３分間遠心分離した。上澄み液を新しいチューブに移し、移した試料の５倍量のメタノール（４℃、０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）含む）を入れてよく混合した後、－２０℃で３０分間放置した。１０，０００ｘｇで５分間遠心分離して蛋白質を沈殿させ、１ｍＬメタノール（４℃、０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）含む）で二回、８０％アセトン（４℃）で二回洗浄した後、乾燥させた。前記得られた乾燥された蛋白質は、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳバッファー（ＳＤＳ ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ６．８、１ｍＭ ＤＴＴ）で溶解させた。
形質転換ベクターは、ＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ蛋白質の後にｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＨＡ）が付着されて発現されるように構成されているので（実施例５－１参照）、ＣｙＰＰＯ８ Ｆ３６３Ｍ蛋白質を確認するために、前記得られた蛋白質をＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に転移した後、ＨＡ抗体（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ）を用いてウエスタンブロットを行った。
前記得られた蛋白質に対するウエスタンブロット結果を図５６の上段に示した。図５６の上段に示されているように、ＣｙＰＰＯ８蛋白質はヨンサン（野生型アブラナ、対照群）を除いた全ての個体で発現されることが確認された。このような結果は、挿入遺伝子の蛋白質発現によって除草剤抵抗性が誘導されるのを示すものであると言える。
追加的に、前記ウエスタンブロット分析に用いたＰＶＤＦ膜（ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ）をクマシブルーで染色した結果を図５６の下段に示した。図５６の下段に示されているように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに使用した各試料の蛋白質量にほとんど差がないのを確認することができる。

Claims (33)

  1. （１）配列番号５のアミノ酸配列中のＦ３６３Ｍ、Ｆ３６３Ｖ、Ｆ３６３Ｌ、Ｆ３６３Ｃ、Ｆ３６３Ｉ又はＦ３６３Ｔ；
    あるいは
    （２）（ｉ）配列番号５のアミノ酸配列中のＦ３６３Ｍ、Ｆ３６３Ｖ、Ｆ３６３Ｌ、Ｆ３６３Ｃ、Ｆ３６３Ｉ又はＦ３６３Ｔと
    （ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列中の
    Ｐ８４Ｌ、Ｒ８５Ａ、Ｒ８５Ｃ、Ｒ８５Ｈ、Ｒ８５Ｌ、Ｒ８５Ｔ又はＲ８５Ｖ、
    Ａ１６２Ｃ又はＡ１６２Ｌ、
    Ｐ３０６Ｌ又はＰ３０６Ａ、
    Ｖ３０８Ｌ又はＶ３０８Ｍ、
    Ｎ３６２Ｓ、
    Ｖ１６０Ｓ又はＶ１６０Ｃ、
    Ｉ３４３Ｖ又はＩ３４３Ｔ、
    Ｆ１５６Ａ、
    Ｑ１７９Ｇ、
    Ｆ３２７Ｖ、及び
    Ｌ３３０Ｔ
    からなる群から選択されるすくなくとも１つとの
    組み合わせ
    のアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  2. 配列番号５のアミノ酸配列において、
    Ｆ３６３Ｍ、Ｆ３６３Ｖ、Ｆ３６３Ｌ、Ｆ３６３Ｃ、Ｆ３６３Ｉ、Ｆ３６３Ｔ、Ｐ８４Ｌ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｒ８５Ａ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｒ８５Ａ＋Ｆ３６３Ｉ、Ｒ８５Ｃ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｒ８５Ｈ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｒ８５Ｌ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｒ８５Ｔ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｒ８５Ｖ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｒ８５Ａ＋Ａ１６２Ｌ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｒ８５Ａ＋Ａ１６２Ｌ＋Ｆ３６３Ｉ、Ｒ８５Ａ＋Ａ１６２Ｃ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｒ８５Ａ＋Ａ１６２Ｃ＋Ｆ３６３Ｉ、Ｒ８５Ａ＋Ｖ３０８Ｍ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｖ１６０Ｓ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｖ１６０Ｓ＋Ｆ３６３Ｉ、Ｖ１６０Ｓ＋Ｖ３０８Ｍ＋Ｆ３６３Ｉ、Ａ１６２Ｌ＋Ｆ３６３Ｍ、Ａ１６２Ｃ＋Ｆ３６３Ｍ、Ａ１６２Ｃ＋Ｆ３６３Ｉ、Ａ１６２Ｃ＋Ｆ３６３Ｌ、Ａ１６２Ｃ＋Ｖ３０８Ｍ＋Ｆ３６３Ｍ、Ａ１６２Ｃ＋Ｖ３０８Ｌ＋Ｆ３６３Ｍ、Ａ１６２Ｌ＋Ｑ１７９Ｇ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｐ３０６Ａ＋Ｖ３０８Ｌ、Ｖ３０８Ｍ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｖ３０８Ｍ＋Ｆ３６３Ｉ、Ｉ３４３Ｔ＋Ｆ３６３Ｍ、Ｉ３４３Ｖ＋Ｆ３６３Ｍ、又はＮ３６２Ｓ＋Ｆ３６３Ｍのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 配列番号５のアミノ酸配列において、
    （１）Ｆ３６３がＭ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）又はＬ（Ｌｅｕ）で置換されているか；
    （２）Ｆ３６３がＭ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）又はＬ（Ｌｅｕ）で置換されており、かつ以下から選択されるすくなくとも１つの置換がさらに導入されている：
    Ｒ８５がＡ（Ａｌａ）で置換されている、
    Ｖ１６０がＳ（Ｓｅｒ）又はＣ（Ｃｙｓ）で置換されている、
    Ａ１６２がＬ（Ｌｅｕ）又はＣ（Ｃｙｓ）で置換されている、及び
    Ｖ３０８がＭ（Ｍｅｔ）で置換されている；
    請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 請求項１～３のうちのいずれか一項のポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド。
  5. 請求項４のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
  6. 請求項５の組換えベクターを含む形質転換細胞。
  7. 請求項１～３のうちのいずれか一項のポリペプチド；前記ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター；および前記組換えベクターを含む形質転換細胞からなる群より選択された１種以上を含む、植物または藻類の除草剤に対する耐性付与または増進用組成物。
  8. 前記除草剤は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤である、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記除草剤は、ピリミジンジオン系、ジフェニルエーテル系、フェニルピラゾール系、Ｎ－フェニルフタルイミド系、フェニルエステル系、チアジアゾール系、オキサジアゾール系、トリアゾリノン系、オキサゾリジンジオン系、ピラクロニル、フルフェンピル－エチルおよびプロフルアゾルからなる群より選択される１種以上である、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記除草剤は、ブタフェナシル、サフルフェナシル、ベンズフェンジゾン、チアフェナシル、ホメサフェン、オキシフルオルフェン、アクロニフェン、アシフルオルフェン、ビフェノックス、エトキシフェン、ラクトフェン、クロメトキシフェン、クロルニトロフェン、フルオログリコフェン－エチル、ハロサフェン、ピラフルフェン－エチル、フルアゾレート、フルミオキサジン、シニドン－エチル、フルミクロラック－ペンチル、フルチアセット、チジアジミン、オキサジアルギル、オキサジアゾン、カルフェントラゾン、スルフェントラゾン、アザフェニジン、ペントキサゾン、ピラクロニル、フルフェンピル－エチル、プロフルアゾル、フェノピレート、フェノピレートのカルバメート類似体、およびこれらの農薬的に許容可能な塩からなる群より選択される１種以上である、請求項９に記載の組成物。
  11. 上記植物または藻類は、第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子をさらに含み、前記第２の除草剤に対する耐性が付与または増進されたものである、請求項７に記載の組成物。
  12. 前記第２の除草剤は、グリホサート、グルホシネート、ジカンバ、２，４－Ｄ（２，４－ジクロロフェノキシ酢酸）、イソキサフルトール、ＡＬＳ（アセト乳酸シンターゼ）阻害性除草剤、光化学系ＩＩ阻害性除草剤、フェニルウレア系除草剤、ブロモキシニル系除草剤およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるものである、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記第２の除草剤耐性ポリペプチドは、
    グリホサート除草剤耐性ＥＰＳＰＳ（グリホサート耐性５－ピルビンシキミ酸－３－シンターゼ）、ＧＯＸ（グリホサートオキシダーゼ）、ＧＡＴ（グリホサート－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ）またはグリホサートデカルボキシラーゼ；
    グルホシネート除草剤耐性ＰＡＴ（ホスフィノリシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ）；
    ジカンバ除草剤耐性ＤＭＯ（ジカンバモノオキシゲナーゼ）；
    ２，４－Ｄ（２，４－ジクロロフェノキシ酢酸）除草剤耐性２，４－ＤモノオキシゲナーゼまたはＡＡＤ（アリルオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ）；
    ＡＬＳ（アセト乳酸シンターゼ）阻害性スルホニルウレア系除草剤耐性ＡＨＡＳ（アセトヒドロキシ酸シンターゼ）、ＡＨＡＳ（アセト乳酸シンターゼ）またはａｔａｈａｓｌ（アセトヒドロキシ酸シンターゼ大型サブユニット）；
    光化学系ＩＩ阻害性除草剤耐性光化学系ＩＩタンパク質Ｄ１；
    フェニルウレア除草剤耐性シトクロムＰ４５０；
    色素体阻害性除草剤耐性ＨＰＰＤ（ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ）；
    ブロモキシニル除草剤耐性ニトリラーゼ；および
    これらの組み合わせからなる群より選択される１種以上である、請求項１１に記載の組成物。
  14. 前記第２の除草剤耐性ポリペプチドを暗号化する遺伝子は、
    グリホサート除草剤耐性ｃｐ４ ｅｐｓｐｓ、ｍｅｐｓｐｓ、２ｍｅｐｓｐｓ、ｇｏｘｖ２４７、ｇａｔ４６０１またはｇａｔ４６２１遺伝子；
    グルホシネート除草剤耐性ＢＡＲまたはＰＡＴ遺伝子；
    ジカンバ除草剤耐性ｄｍｏ遺伝子；
    ２，４－Ｄ（２，４－ジクロロフェノキシ酢酸）除草剤耐性ＡＡＤ－１またはＡＡＤ－１２遺伝子；
    イソキサフルトール除草剤耐性ＨＰＰＤＰＦ Ｗ３３６遺伝子；
    スルホニルウレア除草剤耐性ＡＬＳ、Ｃｓｒ１、Ｃｓｒ１－１、Ｃｓｒ１－２、ＧＭ－ＨＲＡ、Ｓ４－ＨＲＡ、Ｚｍ－ＨＲＡ、ＳｕｒＡまたはＳｕｒＢ遺伝子；
    光化学系ＩＩ阻害性除草剤耐性ｐｓｂＡ遺伝子；
    フェニルウレア除草剤耐性ＣＹＰ７６Ｂ１遺伝子；
    ブロモキシニル除草剤耐性ｂｘｎ遺伝子；および
    これらの組み合わせからなる群より選択される１種以上である、請求項１１に記載の組成物。
  15. 請求項１～３のうちのいずれか一項のポリペプチドまたはこれを暗号化するポリヌクレオチドを含む、除草剤に対する耐性を有する植物または藻類の形質転換体、そのクローンまたは子孫。
  16. 前記形質転換体は、植物細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽または植物体全体である、請求項１５に記載の形質転換体、そのクローンまたは子孫。
  17. 請求項１～３のうちのいずれか一項のポリペプチドまたはこれを暗号化するポリヌクレオチドを藻類、または植物の細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽または植物体全体に形質転換する段階を含む、除草剤に対する耐性を有する植物または藻類の製造方法。
  18. 請求項１～３のうちのいずれか一項のポリペプチドまたはこれを暗号化するポリヌクレオチドを藻類、または植物細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽または植物体全体に形質転換する段階を含む、植物または藻類の除草剤に対する耐性を付与または増進させる方法。
  19. 請求項１～３のうちのいずれか一項のポリペプチドまたはこれを暗号化するポリヌクレオチドを含む植物を栽培地に提供する段階、そして
    前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する段階を含む、
    栽培地で雑草を防除する方法。
  20. 前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する段階は、２種以上のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を順次にまたは同時に適用することによりなされる、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記植物は、第２の除草剤耐性ポリペプチドまたはこれを暗号化する遺伝子をさらに含むものであり、そして
    前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する段階は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤および第２の除草剤の有効量を順次にまたは同時に適用することによりなされる、請求項１９に記載の方法。
  22. 請求項１～３のうちのいずれか一項のポリペプチドまたはこれを暗号化するポリヌクレオチドを含む藻類を培養培地に提供する段階、および
    前記培養培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する段階を含む、培養培地で望まない水生生物を除去する方法。
  23. 配列番号５に記載された野生型プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ＰＰＯ）ポリペプチドより除草剤耐性の増進したポリペプチド変異体の製造方法であって、
    １）配列番号５のアミノ酸配列中のＰ８４、Ｒ８５、Ｆ１５６、Ｖ１６０、Ａ１６２、Ｑ１７９、Ｐ３０６、Ｖ３０８、Ｆ３２７、Ｌ３３０、Ｉ３４３、Ｎ３６２、およびＦ３６３からなる群より選択されたすくなくとも１種以上の部位を、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ａ（Ａｌａ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、およびＫ（Ｌｙｓ）からなる群より選択され、野生型の該当位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換し、ポリペプチド変異体を製造する工程；及び
    ２）前記ポリペプチド変異体と前記野生型ＰＰＯポリペプチドの除草剤耐性を比較する工程；
    を含む製造方法。
  24. 前記ポリペプチド変異体は、
    配列番号５のアミノ酸配列において、Ｐ８４Ｌ、Ｒ８５Ａ、Ｒ８５Ｃ、Ｒ８５Ｈ、Ｒ８５Ｌ、Ｒ８５Ｔ、Ｒ８５Ｖ、Ｆ３６３Ｍ、Ｆ３６３Ｖ、Ｆ３６３Ｌ、Ｆ３６３Ｃ、Ｆ３６３Ｉ、Ｆ３６３Ｔ、Ａ１６２Ｃ、Ａ１６２Ｌ、Ｐ３０６Ｌ、Ｐ３０６Ａ、Ｖ３０８Ｌ、Ｖ３０８Ｍ、Ｎ３６２Ｓ、Ｖ１６０Ｓ、Ｖ１６０Ｃ、Ｉ３４３Ｖ、Ｉ３４３Ｔ、Ｆ１５６Ａ、Ｑ１７９Ｇ、Ｆ３２７Ｖ、およびＬ３３０Ｔからなる群より選択された１種以上のアミノ酸置換を含む、請求項２３に記載の製造方法。
  25. 請求項２３または２４に記載の製造方法で製造されたポリペプチド変異体を暗号化するポリヌクレオチドを含む組換えベクターで細胞を形質転換する工程を含む、形質転換細胞の製造方法。
  26. 請求項２３または２４に記載の製造方法で製造されたポリペプチド変異体、これを暗号化するポリヌクレオチド、あるいはそのポリヌクレオチドを含む組換えベクターで、藻類、または植物の細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽または植物体全体を形質転換する工程を含む、形質転換植物又は形質転換藻類の製造方法。
  27. 前記除草剤は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤である、請求項２３または２４に記載の製造方法。
  28. 前記除草剤は、ピリミジンジオン系、ジフェニルエーテル系、フェニルピラゾール系、Ｎ－フェニルフタルイミド系、フェニルエステル系、チアジアゾール系、オキサジアゾール系、トリアゾリノン系、オキサゾリジンジオン系、ピラクロニル、フルフェンピル－エチルおよびプロフルアゾルからなる群より選択される１種以上である、請求項２７に記載の製造方法。
  29. 前記除草剤は、ブタフェナシル、サフルフェナシル、ベンズフェンジゾン、チアフェナシル、ホメサフェン、オキシフルオルフェン、アクロニフェン、アシフルオルフェン、ビフェノックス、エトキシフェン、ラクトフェン、クロメトキシフェン、クロルニトロフェン、フルオログリコフェン－エチル、ハロサフェン、ピラフルフェン－エチル、フルアゾレート、フルミオキサジン、シニドン－エチル、フルミクロラック－ペンチル、フルチアセット、チジアジミン、オキサジアルギル、オキサジアゾン、カルフェントラゾン、スルフェントラゾン、アザフェニジン、ペントキサゾン、ピラクロニル、フルフェンピル－エチル、プロフルアゾル、フェノピレート、フェノピレートのカルバメート類似体、およびこれらの農薬的に許容可能な塩からなる群より選択される１種以上である、請求項２７に記載の製造方法。
  30. 前記形質転換植物は、植物細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽または植物体全体である、請求項２６に記載の製造方法。
  31. 請求項２３または２４に記載の製造方法で製造されたポリペプチド変異体またはこれを暗号化するポリヌクレオチドを藻類、または植物細胞、原形質体、カルス、胚軸、種子、子葉、新芽または植物体全体に形質転換する段階を含む、植物または藻類の除草剤に対する耐性を付与または増進させる方法。
  32. 請求項２６に記載の製造方法で製造された形質転換植物を栽培地に提供する段階、および
    前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する段階を含む、
    栽培地で雑草を防除する方法。
  33. 前記栽培地にプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を適用する段階は、２種以上のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを抑制する除草剤の有効量を順次にまたは同時に適用することである、請求項３２に記載の方法。
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