KR102011925B1 - 프로토포르피리노겐 옥시다아제 변이체 및 이를 이용하는 제초제 내성 부여 및/또는 증진을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

원핵생물에서 유래한 프로토포르피리노겐 옥시다아제(Protoporphyrinogen oxidase)의 아미노산 변이체를 이용하여 식물 및/또는 조류(Algae)의 제초제에 대한 보다 강화된 내성을 부여하거나 및/또는 내성을 보다 증진시키는 기술이 제공된다.

Description

프로토포르피리노겐 옥시다아제 변이체 및 이를 이용하는 제초제 내성 부여 및/또는 증진을 위한 조성물 및 방법{Protoporphyrinogen Oxidase Variants and Methods and Compositions for Conferring and/or Enhancing Herbicide Tolerance Using the Same}

원핵생물에서 유래한 프로토포르피리노겐 옥시다아제 (Protoporphyrinogen oxidase)의 변이체, 및 이를 이용하여 식물 및/또는 조류(Algae)의 제초제에 대한 내성을 부여 및/또는 증진시키는 기술이 제공된다.

포르피린 합성 경로는 식물의 대사 과정에서 중요한 엽록소와 헴 (Heme)을 합성하는 과정으로 엽록체에서 이루어진다. 이 경로에서, 프로토포르피리노겐 옥시다아제 (Protoporphyrinogen IX oxidase, 이하 PPO; EC:1.3.3.4)는 프로토포르피리노겐 IX (Protoporphyrinogen IX)로부터 프로토포르피린 IX (protoporphyrin IX)로의 산화과정을 촉매한다. 프로토포르피리노겐 IX이 프로토포르피린 IX로 산화된 후 Mg-chelatase에 의해 마그네슘과 결합하면 엽록소가 합성 되고, Fe-chelatase에 의해 철과 결합하면 헴 (Heme)이 합성된다.

따라서, PPO의 활성이 저해되면 엽록소와 헴의 합성이 억제되고, 기질인 프로토포르피리노겐 IX은 정상적인 포르피린 합성 경로에서 이탈하여 엽록체에서 세포질로 이동하여 빠르게 프로토포르피린 IX으로 산화되고, 광과 산소 분자의 존재 하에서 활성이 높은 단일항산소 (singlet oxygen, ¹O₂)를 발생시켜 식물의 세포막을 파괴함으로써 급속한 식물 세포 사멸을 일으킨다. 이러한 원리를 이용하여, PPO 활성을 억제하는 제초제가 개발되었으며, 현재까지 화학 구조에 따라 피리미딘디온계 (pyrimidinediones), 디페닐에테르계 (diphenyl-ethers), 페닐피라졸계 (phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계 (N-phenylphthalimides), 티아디아졸계 (thiadiazoles), 옥사디아졸계 (oxadiazoles), 트리아졸리논계 (triazolinones), 옥사졸리딘디온계 (oxazolidinediones) 및 기타의 9개 계통의 제초제가 사용되고 있다.

또한, 상기 제초제들을 사용하면서도 재배 대상 작물의 생장에는 영향을 미치지 않게 하기 위해서는 재배 대상 작물에 상기 제초제들에 대한 내성을 부여할 필요성이 대두되어 왔다.

한편, 조류 (Algae)는 광합성 생물로서, 빛에너지를 다양한 유용 화합물을 합성할 수 있는 에너지로 전환할 수 있다. 예를 들어, 조류는 광합성에 의하여 탄소를 고정시키며, 이산화탄소를 당, 전분, 지질, 지방 또는 다른 생체분자들로 전환함으로써, 대기 중의 온실가스를 제거할 수 있다. 또한, 조류의 대규모 배양을 통하여 산업적 효소, 치료 화합물 및 단백질, 영양 물질, 상업적 물질, 연료 물질과 같은 다양한 물질들을 생산할 수 있다.

그러나, 생물반응기 (bioreactor) 또는 공개된 또는 폐쇄된 연못에서 조류를 대규모로 배양하는 경우, 원하지 않는 경쟁 생물들, 예를 들어 원치 않는 조류, 곰팡이, 윤충류 (rotifer) 또는 동물성 플라크톤들에 의하여 오염이 발생할 수 있다.

따라서, 원하는 식물 및/또는 조류에 제초제 내성을 부여한 후, 제초제 내성이 없는 경쟁 생물들의 성장을 저해할 수 있는 농도로 제초제를 처리하여, 원하는 식물 및/또는 조류를 대규모로 수확할 수 있는 기술이 필요하다.

미국특허출원 등록공보 US 6,308,458 (2001.10.30) 미국특허출원 등록공보 US 6,808,904 (2004.10.26) 미국특허출원 등록공보 US 7,563,950 (2009.07.21) 국제특허출원 공개공보 WO2011/085221 (2011.07.14)

Li X, Volrath SL., Chilcott CE, Johnson MA, Ward ER, Law MD, Development of protoporphyrinogen oxidase as an efficient selection marker for agrobacterium tumefaciens- mediated transformation of maize. Plant physiology 133:736-747, 2003

본 명세서에서, 원핵생물로부터 hemY 타입의 PPO 유전자를 분리하여 이 유전자 및 이의 아미노산 변이체가 프로토포르피리노겐 옥시다아제 (PPO) 활성 저해 제초제들에 대하여 광범위한 제초제 내성을 나타냄이 입증되어, 이를 식물 및/또는 조류 (Algae)에 발현시키면 제초제 내성을 부여하거나 및/또는 내성을 증진시킬 수 있음이 제안된다.

일 예는 서열번호 1의 폴리펩타이드와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 1의 아미노산들 (예컨대, 서열번호 1의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 해당 위치의 원래 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다. 상기 서열번호 1의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 S63, P91, R92, F169, V173, A175, E228, L229, P316, V318, F337, L340, G351, T352, I353, 및 Y373으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

다른 예는 서열번호 3의 폴리펩타이드와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 3의 아미노산들 (예컨대, 서열번호 3의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 해당 위치의 원래 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다. 상기 서열번호 3의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상은 서열번호 3의 아미노산 서열 중 N63, S64, S66, P67, P92, R93, F170, S172, G173, V174, Y175, A176, R190, E230, L231, P318, V320, F339, G340, N341, L342, L352, G353, T354, I355, Y375, I424, V458, 및 R465로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

다른 예는 서열번호 5의 폴리펩타이드와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 5의 아미노산들 (예컨대, 서열번호 5의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 해당 위치의 원래 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다. 상기 서열번호 5의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상은 서열번호 5의 아미노산 서열 중 P84, R85, F156, V160, A162, Q179, P306, V308, F327, L330, I343, N362, 및 F363으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

다른 예는 서열번호 1의 폴리펩타이드, 서열번호 3의 폴리펩타이드, 서열번호 5의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.

다른 예는 서열번호 1의 폴리펩타이드, 서열번호 3의 폴리펩타이드, 서열번호 5의 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드 변이체, 상기 폴리펩타이드 또는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.

상기 제초제는 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제일 수 있다.

구체 예로, 상기 제초제는 피리미딘디온계 (pyrimidinediones), 디페닐에테르계 (diphenyl-ethers), 페닐피라졸계 (phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계 (N-phenylphthalimides), 페닐에스테르계 (phenylesters), 티아디아졸계 (thiadiazoles), 옥사디아졸계 (oxadiazoles), 트리아졸리논계 (triazolinones), 옥사졸리딘디온계 (oxazolidinediones) 및 기타 제초제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체 예로, 상기 제초제는 부타페나실 (butafenacil), 사플루페나실 (saflufenacil), 벤즈펜디존 (benzfendizone), 티아페나실 (tiafenacil), 포메사펜 (fomesafen), 옥시플루오르펜 (oxyfluorfen), 아클로니펜 (aclonifen), 아시플루오르펜 (acifluorfen), 비페녹스 (bifenox), 에톡시펜 (ethoxyfen), 락토펜 (lactofen), 클로메톡시펜 (chlomethoxyfen), 클로인트로펜 (chlorintrofen), 플루오로글리코펜-에틸 (fluoroglycofen-ethyl), 할로사펜 (halosafen), 피라플루펜-에틸 (pyraflufen-ethyl), 플루아졸레이트 (fluazolate), 플루미옥사진 (flumioxazin), 시니돈-에틸 (cinidon-ethyl), 플루미클로락-펜틸 (flumiclorac-pentyl), 플루티아셋 (fluthiacet), 티디아지민 (thidiazimin), 옥사디아길 (oxadiargyl), 옥사디아존 (oxadiazon), 카펜트라존 (carfentrazone), 설펜트라존 (sulfentrazone), 아자페니딘 (azafenidin), 펜톡사존 (pentoxazone), 피라클로닐 (pyraclonil), 플루펜피르-에틸 (flufenpyr-ethyl), 프로플루아졸 (profluazol), 페노필레이트 (phenopylate; 2,4-dichlorophenyl 1-pyrrolidinecarboxylate), 페노필레이트의 카바메이트 유사체 (예컨대, O-phenylpyrrolidino- and piperidinocarbamate analoges ("Ujjana B. Nandihalli, Mary V. Duke, Stephen O. Duke, Relationships between molecular properties and biological activities of O-phenyl pyrrolidino- and piperidinocarbamate herbicides., J. Agric. Food Chem., 1992, 40(10) 1993-2000" 참조)), 이들의 농약적으로 허용가능한 염들, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 식물은 광합성을 하는 다세포 진핵 생물을 의미하는 것으로, 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이거나, 초본 식물 또는 목본 식물일 수 있다. 상기 조류 (Algae)는 광합성을 하는 단세포 생물을 의미하는 것으로, 원핵 (Prokaryotic) 조류 또는 진핵 (Eukaryotic) 조류일 수 있다.

일 예에서, 상기 식물 또는 조류는 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하도록 유전적으로 조작되며 상기 제2의 제초제에 대한 더 넓은 범위의 제초제 내성이 부여되거나 및/또는 증진된 것일 수 있다. 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하도록 유전적으로 조작된 식물 또는 조류는 상기한 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물에 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함시킨 것을 사용하여 제조된 것일 수 있다. 따라서, 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물은 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하는 것일 수 있다.

구체 예로, 상기 제2의 제초제는 세포분열 저해성 제초제, 광합성 저해성 제초제, 아미노산 합성 저해성 제초제, 색소체 저해성 제초제 및 세포막 저해성 제초제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체 예로, 상기 제2의 제초제는 글리포세이트 (glyphosate), 글루포시네이트 (glufosinate), 디캄바 (dicamba), 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 이속사플루톨 (isoxaflutole), ALS (acetolactate synthase) 저해성 제초제, 제2광계 (photosystem II) 저해성 제초제, 페닐우레아 (phenylurea)계 제초제 또는 브로목시닐 (Bromoxynil)계 제초제 또는 이들의 조합을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체 예로, 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드는 글리포세이트 제초제 내성 EPSPS (glyphosate resistant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase), GOX (glyphosate oxidase), GAT (glyphosate-N-acetyltransferase) 또는 글리포세이트 디카복실레이즈 (glyphosate decarboxylase); 글루포시네이트 제초제 내성 PAT (phosphinothricin-N-acetyltransferase); 디캄바 제초제 내성 DMO (dicamba monooxygenase); 2,4-D 제초제 내성 2,4-D 모노옥시게나아제 또는 AAD (aryloxyalkanoate dioxygenase); ALS 저해성 설포닐우레아 (sulfonylurea)계 제초제 내성 ALS (acetolactate synthase), AHAS (acetohydroxyacid synthase), 또는 Athahasl (acetohydroxyacid synthase large subunit); 제2광계 저해성 제초제 내성 광계 II (photosystem II) 단백질 D1; 페닐우레아계 제초제 내성 시토크롬 P450 (cytochrome P450); 색소체 저해성 제초제 내성 HPPD (hydorxylphenylpyruvate dioxygenase); 브로목시닐 제초제 내성 니트릴레이즈 (nitrilase); 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 글리포세이트 제초제 내성 cp4 epsps, mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 또는 gat4621 유전자; 글루포시네이트 제초제 내성 bar, pat 또는 pat (SYN) 유전자; 디캄바 제초제 내성 dmo 유전자; 2,4-D 제초제 내성 AAD-1, AAD-12 유전자; ALS 저해성 설포닐우레아계 제초제 내성 ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM-HRA, Csr1, Csr1-1, Csr1-2, SurA 또는 SurB; 제2광계 (photosystem II) 저해성 제초제 내성 psbA 유전자; 페닐우레아 제초제 내성 CYP76B1 유전자; 이속사플루톨 제초제 내성 HPPDPF W336 유전자 및 브로목시닐 제초제 내성 bxn 유전자; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된, 제초제에 대한 내성이 부여 및/또는 증진된 제초제 내성 식물 및/또는 조류의 형질전환체, 이의 클론, 또는 자손을 제공한다.

다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 식물 및/또는 조류에 형질전환하는 단계를 포함하는, 제초제에 대한 내성이 부여 및/또는 증진된 식물 또는 조류를 제조하는 방법을 제공한다.

다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드 식물 및/또는 조류에 형질전환하는 단계를 포함하는, 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성을 부여 및/또는 증진시키는 방법을 제공한다.

상기 형질 전환은 조류, 및/또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초, 또는 전체 (whole body)에 대하여 수행되는 것일 수 있다.

상기 형질전환체는 조류, 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초, 또는 전체 (whole body)일 수 있다.

다른 예는, 서열번호 1의 폴리펩타이드, 서열번호 3의 폴리펩타이드, 서열번호 5의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드 변이체; 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및 상기 재배지에 (또는 상기 식물에) 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.

구체 예로, 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계는, 2종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하여 수행되는 것일 수 있다.

다른 예로, 상기 식물은 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하도록 유전적으로 조작된 것이고, 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 것일 수 있다.

다른 예는, 상기 폴리펩타이드 변이체, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및 상기 배양 배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 원하지 않는 생물들을 제거하는 방법을 제공한다.

식물 또는 조류에 제초제에 대한 내성을 부여 및/또는 증진하는 기술이 제공된다.

본 명세서에서, '식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진' 또는 '식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성 증진' 이란 제초제에 내성이 없는 식물 또는 조류에 대하여 내성을 부여하는 것, 또는 제초제에 내성을 지닌 식물 또는 조류에 대하여 그 내성을 보다 향상시키는 것, 또는 이 모두를 포괄하는 광범위한 의미로 해석된다.

본 명세서에서, '서열로 이루어진' 또는 '서열을 포함하는' 이라 함은 기재된 서열을 포함하거나, 상기 서열을 필수적으로 포함하는 경우를 모두 의미하기 위하여 사용되며, 기재된 서열 이외의 서열을 포함하는 것을 배제하고자 하는 의도로 해석되지 않는다.

일 예에서,

서열번호 1의 폴리펩타이드와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 1의 아미노산들 (예컨대, 서열번호 1의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체;

서열번호 3의 폴리펩타이드와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 3의 아미노산들 (예컨대, 서열번호 3의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체;

서열번호 5의 폴리펩타이드와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 5의 아미노산들 (예컨대, 서열번호 5의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체; 및 이들의 조합

으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 폴리펩타이드 변이체가 제공된다.

다른 예에서, 상기 서열번호 1, 3, 또는 5의 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 각 아미노산을 암호화하는 코돈들 중에서 형질도입 될 세포에 최적화된 (optimized) 코돈을 포함하도록 설계된 것일 수 있다. 상기 최적화 코돈은 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 알 수 있다 (예컨대, "http://www.genscript.com/codon-opt.html", "http://sg.idtdna.com/CodonOpt" 등 참조).

다른 예에서, 상기 서열번호 1, 3, 또는 5의 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드 변이체, 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물이 제공된다.

다른 예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된, 제초제에 대한 내성을 가진 형질전환체가 제공된다.

다른 예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 조류 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초, 또는 식물전체에 형질전환하는 단계를 포함하는, 제초제에 대한 내성을 가지는 식물 또는 조류의 제조 방법이 제공된다.

다른 예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 조류 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물 전체에 형질전환하는 단계를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성을 부여 및/또는 증진시키는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 명세서에서 제공되는 서열번호 1, 3, 또는 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 이의 변이체는 원핵생물 (예컨대, 남세균)로부터 유래하는 PPO 단백질로서, PPO 저해 제초제에 대하여 내성을 갖는 제초제 내성 PPO 단백질이다. 구체적으로, 오실라토리아 니그로-비리디스 (Oscillatoria nigro - viridis) PCC 7112 에서 유래한 PPO 단백질이 제공되며, 이를 CyPPO2로 명명하고, 이의 아미노산 서열을 서열번호 1로, 이를 암호화하는 유전자의 염기서열을 서열번호 2로 나타낸다. 또한, 링비아 속 (Lyngbya sp.) PCC 8106 균주에서 유래한 PPO가 제공되며, 이를 CyPPO4로 명명하고, 이의 아미노산 서열을 서열번호 3으로, 이를 암호화하는 유전자의 염기서열을 서열번호 4로 나타낸다. 또한, 할로테세 속 (Halothece sp.) PCC 7418 균주에서 유래한 PPO이 제공되며, 이를 CyPPO8로 명명하고, 이의 아미노산 서열을 서열번호 5로, 이를 암호화하는 유전자의 염기서열을 서열번호 6으로 나타낸다. 본 명세서에서, 앞서 설명한 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드의 변이체는 각각 PPO 저해 제초제에 대하여 내성을 갖는 제초제 내성 PPO 단백질 또는 제초제 내성 PPO 단백질 변이체로도 표현될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 바로서, "제초제 내성 PPO 또는 이의 변이체"는 상기한 제초제 내성 PPO 단백질 또는 제초제 내성 PPO 단백질 변이체, 제초제 내성 PPO 단백질 암호화 유전자 또는 제초제 내성 PPO 단백질 변이체 암호화 유전자, 또는 이들 모두를 의미하기 위하여 사용될 수 있다.

남세균 유래 PPO 단백질은 그 자체로 식물 PPO 보다 효소 활성이 우수한 특성을 가지며 PPO 활성 저해 제초제에 대하여 내성을 부여할 수 있을 뿐 아니라, 이들 PPO 단백질은 고유의 효소 활성을 전체적으로 유지시키는 범위 내에서 아미노산 변이를 포함함으로써 야생형 PPO 단백질보다 제초제 내성을 강화시킬 수 있다. 이러한 아미노산 변이는 PPO 단백질과 제초제 간 상호작용 부위의 아미노산 잔기 중에서 선택된 1종 이상의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 포함하는 것일 수 있다.

상기 PPO 단백질 변이체를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

일 예는 서열번호 1의 폴리펩타이드(CyPPO2)와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 1의 아미노산들 (서열번호 1의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 원래의 아미노산 (즉, 야생형의 해당 위치의 아미노산)과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다.

상기 서열번호 1의 폴리펩타이드의 결실 또는 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 아미노산 잔기 (예컨대, 서열번호 1의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상)는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 S63 ("63번째 위치의 S(Ser)"을 의미; 이하의 아미노산 잔기의 표현은 이와 동일한 방식으로 해석됨), P91, R92, F169, V173, A175, E228, L229, P316, V318, F337, L340, G351, T352, I353, 및 Y373으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 S63, P91, R92, F169, V173, A175, E228, L229, P316, V318, F337, L340, G351, T352, I353, 및 Y373으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이, 각각 독립적으로, 결실 또는 M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), F(Phe), P(Pro), W(Trp), N(Asn), Q(Gln), G(Gly), Y(Tyr), D(Asp), E(Glu), R(Arg), H(His), K(Lys) 등으로 이루어진 군에서 선택되고 야생형의 해당 위치의 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환 (예컨대, M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), F(Phe) 등으로 이루어진 군에서 선택되고 야생형의 해당 위치의 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환)된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

예컨대, 상기 폴리펩타이드의 변이체는, 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서, Y373M ("373번째 위치의 아미노산 잔기가 Y(Tyr)에서 M(Met)으로 치환됨"을 의미함; 이하의 아미노산 변이의 표현은 이와 동일한 방식으로 해석됨), Y373V, Y373I, Y373T, Y373L, Y373C, F169A, A175C, A175L, A175I, P316A, P316L, V318M, V318T, V318L, G351A, S63T, P91L, R92A, V173S, V173C, V173T, V173L, E228A, L229F, F337V, L340T, L340I, L340V, T352V, I353T, I353L, I353V, 및 I353C로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 폴리펩타이드의 변이체는, 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서, Y373M, Y373V, Y373I, Y373T, Y373L, Y373C, F169A, A175C, A175L, A175I, P316A, P316L, V318M, V318T, V318L, G351A, S63T, P91L, R92A, V173S, V173C, V173T, V173L, E228A, L229F, F337V, L340T, L340I, L340V, T352V, I353T, I353L, I353V, I353C, S63T+Y373M (63번째 잔기의 S에서 T로의 치환 및 373번째 잔기의 Y에서 M으로의 치환을 모두 포함; 이하의 2가지 이상의 아미노산 변이의 표현은 이와 동일한 방식으로 해석됨), R92A+Y373M, V173S+Y373M, V173S+Y373I, V173S+Y373L, V173S+Y373V, V173C+Y373M, V173C+Y373I, V173T+Y373M, V173T+Y373I, V173L+Y373M, A175L+Y373M, A175L+Y373I, A175C+Y373M, A175C+Y373I, A175I+Y373M, E228A+Y373M, L229F+Y373T, V318M+Y373M, V318M+Y373I, V318M+Y373V, V318T+Y373I, L340I+Y373M, L340I+Y373I, L340V+Y373M, G351A+Y373M, I353T+Y373M, I353T+Y373I, I353T+Y373L, I353L+Y373M, I353V+Y373M, I353C+Y373M, S63T+V173S+Y373M, S36T+V173S+Y373I, S63T+I353T+Y373M, S63T+I353T+Y373I, V173S+V318M+Y373M, V173T+L340I+Y373M, V173S+A175C+Y373M, A175C+V318M+Y373M, A175L+V318M+Y373M, A175C+I353L+Y373M, A175C+I353V+Y373M, P316A+V318L, P316L+V318L, F337V+Y373M, T352V+Y373M, G351A+T352V+Y373M, 또는 P91L+Y373M의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

다른 예는 서열번호 3의 폴리펩타이드 (CyPPO4)와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 3의 아미노산들 (서열번호 3의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다.

상기 서열번호 3의 폴리펩타이드의 결실 또는 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 아미노산 잔기 (예컨대, 서열번호 3의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상)은 서열번호 3의 아미노산 서열 중 N63, S64, S66, P67, P92, R93, F170, S172, G173, V174, Y175, A176, R190, E230, L231, P318, V320, F339, G340, N341, L342, L352, G353, T354, I355, Y375, I424, V458, 및 R465로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 예컨대, A176, P318, V320, 및 Y375로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열 중 N63, S64, S66, P67, P92, R93, F170, S172, G173, V174, Y175, A176, R190, E230, L231, P318, V320, F339, G340, N341, L342, L352, G353, T354, I355, Y375, I424, V458, 및 R465로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 예컨대 A176, P318, V320, 및 Y375로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로, 결실 또는 M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), F(Phe), P(Pro), W(Trp), N(Asn), Q(Gln), G(Gly), Y(Tyr), D(Asp), E(Glu), R(Arg), H(His), K(Lys) 등으로 이루어진 군에서 선택되고 야생형의 해당 위치의 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환 (예컨대, M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala)등으로 이루어진 군에서 선택되고 야생형의 해당 위치의 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환)된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

예컨대, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열에 있어서 Y375M, Y375V, Y375I, Y375T, Y375C, A176C, A176L, P318L, V320L, V320M, 및 P318A로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열에 있어서 Y375M, Y375V, Y375I, Y375T, Y375C, A176C, A176L, P318L+V320L, V320M, 또는 P318A+V320L의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

다른 예는 서열번호 5의 폴리펩타이드 (CyPPO8)와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 5의 아미노산들 (서열번호 5의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다.

상기 서열번호 5의 폴리펩타이드의 결실 또는 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 아미노산 잔기 (예컨대, 서열번호 5의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상)은 서열번호 5의 아미노산 서열 중 P84, R85, F156, V160, A162, Q179, P306, V308, F327, L330, I343, N362, 및 F363으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 5의 아미노산 서열 중 P84, R85, F156, V160, A162, Q179, P306, V308, F327, L330, I343, N362, 및 F363으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로, 결실 또는 M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), F(Phe), P(Pro), W(Trp), N(Asn), Q(Gln), G(Gly), Y(Tyr), D(Asp), E(Glu), R(Arg), H(His), K(Lys) 등으로 이루어진 군에서 선택되고 야생형의 해당 위치의 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환 (예컨대, M (Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), H(His), G(Gly) 등으로 이루어진 군에서 선택되고 야생형의 해당 위치의 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환)된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

예컨대, 상기 폴리펩타이드의 변이체는, 서열번호 5의 아미노산 서열에 있어서, P84L, R85A, R85C, R85H, R85L, R85T, R85V, F363M, F363V, F363L, F363C, F363I, F363T, A162C, A162L, P306L, P306A, V308L, V308M, N362S, V160S, V160C, I343V, I343T, F156A, Q179G, F327V, 및 L330T로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 5의 아미노산 서열에 있어서 P84L, R85A, R85C, R85H, R85L, R85T, R85V, F363M, F363V, F363L, F363C, F363I, F363T, A162C, A162L, P306L, P306A, V308L, V308M, N362S, V160S, V160C, I343V, I343T, F156A, Q179G, F327V, L330T, P84L+F363M, R85A+F363M, R85A+F363I, R85C+F363M, R85H+F363M, R85L+F363M, R85T+F363M, R85V+F363M, R85A+A162L+F363M, R85A+A162L+F363I, R85A+A162C+F363M, R85A+A162C+F363I, R85A+V308M+F363M, V160S+F363M, V160S+F363I, V160S+V308M+F363I, A162L+F363M, A162C+F363M, A162C+F363I, A162C+F363L, A162C+V308M+F363M, A162C+V308L+F363M, A162L+Q179G+F363M, P306A+V308L, P306L+V308L, V308M+F363M, V308M+F363I, I343T+F363M, I343V+F363M, 또는 N362S+F363M의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에 기재된 서열 상동성 (예컨대, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 변이체는 서열 상동성 판단의 기준이 되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (예컨대, 앞서 설명한 아미노산 변이를 갖는 PPO 단백질)와 동등 정도의 효소 활성, 예컨대, 식물 내 (식물체 내, 식물 세포 또는 세포 배양체 내, 식물 조직 내 등), 조류 내, 및/또는 시험관내에서 기준이 되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 대하여 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 효소 활성을 유지하면서 제초제 저항성을 부여하는 기능을 보유하는 것일 수 있으며, 상기 서열 상동성 기재는 본 명세서에 기재된 제초제 내성 PPO 단백질 변이체 또는 폴리펩타이드 변이체가 상기 조건(효소 활성을 유지하면서 제초제 저항성을 부여하는 기능을 보유)을 만족하는 범위의 모든 서열 변이를 포함할 수 있음을 명확하게 하기 위하여 사용된다.

본 명세서에서 사용된 아미노산의 명명을 아래에 정리하였다:

상기 폴리펩타이드 변이체 (제초제 내성 PPO 단백질 변이체)는 야생형 PPO 단백질의 효소 활성은 유지하면서, 야생형과 비교하여 증진된 제초제 내성을 나타내는 것일 수 있다.

또한, 상기 제초제 내성 PPO 단백질 변이체는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 앞서 설명한 바와 같은 아미노산 변이를 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드와 생물학적 균등한 활성을 나타내는 변이를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 추가적 변이는 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 치환일 수 있고, 이러한 아미노산 치환은 당해 분야에 공지되어 있다. 일 예에서, 상기 추가적 치환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 또는 Asp/Gly 간의 치환을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 경우에 따라서, 상기 제초제 내성 PPO 단백질 변이체는 하나 이상의 아미노산이 인산화(phosphorylation), 황화 (sulfation), 아실화 (acylation), 당화 (glycosylation), 메틸화 (methylation), 파네실화 (farnesylation) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 수식 (modification) 될 수도 있다. 또한, 상기 제초제 내성 PPO 단백질 변이체는 아미노산 변이 및/또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질 변이체를 포함할 수 있다.

용어 "서열 상동성"이란 야생형 (wild type) 또는 기준이 되는 아미노산 서열 또는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 제초제 내성 PPO 단백질 변이체의 아미노산 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 잔기를 포함하면서, 상기 제초제 내성 PPO 단백질 변이체와 생물학적으로 균등한 활성을 보유한다면 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 이러한 단백질 상동물은 목적 단백질과 동일한 활성 부위를 포함할 수 있다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 온라인 분석 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다. 비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어, GAP, BESTFIT, BLAST, 및 Clustal Omega 등을 포함한다.

상기 제초제 내성 PPO 단백질 또는 이들의 변이체는 당 분야에 널리 공지된 방법으로 천연에서 추출 및 정제하여 얻을 수 있다. 또는, 유전자 재조합 기술을 이용한 재조합 단백질로 수득할 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, 제초제 내성 PPO 단백질 또는 이들의 변이체를 암호화하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 목적 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 제초제 내성 PPO 단백질 또는 이들의 변이체를 회수하는 과정으로 수득할 수 있다. 단백질은 선택된 숙주 세포에서 발현시킨 후, 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리 (염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피 (겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들 중 2가지 이상을 조합하여 이용할 수 있다.

상기 제초제 내성 PPO 핵산 분자 (PPO 단백질 또는 이들의 변이체를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드)는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.

구체적인 실시예에서, 상기 제공된 PPO 단백질/핵산 분자 또는 이들의 변이체들은 PPO가 결핍된 대장균 BT3 (ΔPPO)를 이용한 제초제 내성 검증 시스템을 통하여, 화학 구조에 따라 9개 계통에 속하는 대표적인 PPO 활성 저해 제초제들에 대하여 광범위한 제초제 내성을 나타낸다는 것이 검증되었으며, 트랜지트 펩타이드 (transit peptide, TP)를 사용하면 식물의 엽록체에서 발현될 수 있다는 것이 확인되었다. 또한, 상기 PPO 단백질/핵산 분자는 식물 발현용 벡터에 의하여 애기장대 (Arabidopsis thaliana ecotype Columbia-0)와 같은 쌍자엽 식물 또는 벼와 같은 단자엽 식물에서 발현이 가능하며, 이와 같이 형질전환된 식물체에 PPO 활성 저해 제초제를 처리하더라도 식물이 발아 및/또는 생장 가능한 것이 확인되었다. 아울러, 후대 유전성 시험을 통하여 위와 같은 제초제 내성 형질이 다음 세대로 성공적으로 전달되는 것이 확인되었다.

따라서, 본 명세서에서 제공하는 PPO 단백질 또는 이들의 변이체들을 식물 또는 조류에 도입함으로써 식물 또는 조류의 제초제 내성을 부여 및/또는 증진시키는 데 사용될 수 있다.

일 예는

(1) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 이들과 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드,

(2) 앞서 설명한 폴리펩타이드 변이체,

(3) 상기 폴리펩타이드 (1) 또는 폴리펩타이드 변이체 (2)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,

(4) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및

(5) 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포

로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다. 본 명세서에서 제초제란, 식물 또는 조류를 사멸시키거나 방제하거나, 또는 식물 또는 조류의 생장을 불리하게 조정하는 활성 성분을 말한다. 또한, 본원에서 제초제 내성이란, 정상 또는 야생형 식물 또는 조류를 정상적으로 사멸시키거나 그의 생장을 정상적으로 억제시키는 제초제를 처리하더라도, 정상 또는 야생형의 식물 또는 조류에 비하여 식물 또는 조류 생장의 저해 정도가 약화되거나 제거되어, 식물 또는 조류의 생장이 지속적으로 이루어지는 것을 말한다. 상기 제초제는 식물 또는 조류의 프로토포르피리노겐 옥시다아제 (PPO) 를 억제하는 제초제를 포함한다. 이러한 PPO 저해 제초제는 화학 구조에 따라 피리미딘디온계 (pyrimidinediones), 디페닐에테르계 (diphenyl-ethers), 페닐피라졸계 (phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계 (N-phenylphthalimides), 페닐에스테르계 (phenylesters), 티아디아졸계 (thiadiazoles), 옥사디아졸계 (oxadiazoles), 트리아졸리논계 (triazolinones), 옥사졸리딘디온계 (oxazolidinediones) 및 기타의 제초제를 예시할 수 있다.

구체예로, 피리미딘디온계 제초제는 부타페나실 (butafenacil), 사플루페나실 (saflufenacil), 벤즈펜디존 (benzfendizone) 및 티아페나실 (tiafenacil)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

디페닐에테르계 제초제는 포메사펜 (fomesafen), 옥시플루오르펜 (oxyfluorfen), 아클로니펜 (aclonifen), 아시플루오르펜 (acifluorfen), 비페녹스 (bifenox), 에톡시펜 (ethoxyfen), 락토펜 (lactofen), 클로메톡시펜 (chlomethoxyfen), 클로인트로펜 (chlorintrofen), 플루오로글리코펜-에틸 (fluoroglycofen-ethyl) 및 할로사펜 (halosafen) 을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

페닐피라졸계 제초제는 피라플루펜-에틸 (pyraflufen-ethyl) 및 플루아졸레이트 (fluazolate)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

페닐프탈이미드계 제초제는 플루미옥사진 (flumioxazin), 시니돈-에틸 (cinidon-ethyl) 및 플루미클로락-펜틸 (flumiclorac-pentyl)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

페닐에스테르계 (phenylesters) 제초제는 페노필레이트 (phenopylate; 2,4-dichlorophenyl 1-pyrrolidinecarboxylate) 및 페노필레이트의 카바메이트 유사체 (예컨대, O-phenylpyrrolidino- and piperidinocarbamate analoges ("Ujjana B. Nandihalli, Mary V. Duke, Stephen O. Duke, Relationships between molecular properties and biological activities of O-phenyl pyrrolidino- and piperidinocarbamate herbicides., J. Agric. Food Chem., 1992, 40(10) 1993-2000" 참조)) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 페노필레이트의 카바메이트 유사체는 피롤리딘-1카르복실산 페닐 에스테르 (pyrrolidine-1-carboxylic acid phenyl ester; CAS No. 55379-71-0), 1-피롤리딘카르복실산, 2-클로로페닐 에스테르 (1-pyrrolidinecarboxylicacid, 2-chlorophenyl ester; CAS No. 143121-06-6), 4-클로로페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (4-chlorophenyl pyrrolidine-1-carboxylate: CAS No. 1759-02-0), 카르밤산, 디에틸-, 2,4-디클로로-5-(2-프로피닐옥시)페닐 에스테르 (carbamic acid, diethyl-, 2,4-dichloro-5-(2-propynyloxy)phenyl ester (9CI); CAS No. 143121-07-7), 1-피롤리딘카르복시산, 2,4-디클로로-5-하이드로페닐 에스테르 (1-pyrrolidinecarboxylicacid, 2,4-dichloro-5-hydroxyphenyl ester; CAS No. 143121-08-8), 2,4-디클로로-5-(메톡시카르보닐)페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (2,4-dichloro-5-(methoxycarbonyl)phenyl pyrrolidine-1-carboxylate; CAS No. 133636-94-9), 2,4-디클로로-5-[(프로판-2-일옥시)카르보닐]페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (2,4-dichloro-5-[(propan-2-yloxy)carbonyl]phenyl pyrrolidine-1-carboxylate; CAS No. 133636-96-1), 1-피페리딘카르복실산, 2,4-디클로로-5-(2-프로피닐옥시)페닐 에스테르 (1-piperidinecarboxylic acid, 2,4-dichloro-5-(2-propynyloxy)phenyl ester; CAS No. 87374-78-5), 2,4-디클로로-5-(프로프-2-인-1-일옥시)페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (2,4-dichloro-5-(prop-2-yn-1-yloxy)phenyl pyrrolidine-1-carboxylate; CAS No. 87365-63-7), 2,4-디클로로-5-(프로프-2-인-1-일옥시)페닐 4,4-디플루오로피페리딘-1-카르복실레이트 (2,4-dichloro-5-(prop-2-yn-1-yloxy)phenyl 4,4-difluoropiperidine-1-carboxylate; CAS No. 138926-22-4), 1-피롤리딘카르복실산, 3,3-디클루오로-, 2,4-디클로로-5-(2-프로핀-1-일옥시)페닐 에스테르 (1-pyrrolidinecarboxylicacid, 3,3-difluoro-, 2,4-dichloro-5-(2-propyn-1-yloxy)phenyl ester; CAS No. 143121-10-2), 4-클로로-2-플루오로-5-[(프로판-2-일옥시)카르보닐]페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (4-chloro-2-fluoro-5-[(propan-2-yloxy)carbonyl]phenyl pyrrolidine-1-carboxylate; CAS No. 133636-98-3) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

티아디아졸계 제초제는 플루티아셋 (fluthiacet) 및 티디아지민(thidiazimin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

옥사디아졸계 제초제는 옥사디아길 (oxadiargyl) 및 옥사디아존 (oxadiazon)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

트리아졸리논계 제초제는 카펜트라존 (carfentrazone), 설펜트라존 (sulfentrazone) 및 아자페니딘 (azafenidin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

옥사졸리딘디온계 제초제는 펜톡사존 (pentoxazone)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

기타의 제초제는 피라클로닐 (pyraclonil), 플루펜피르-에틸 (flufenpyr-ethyl) 및 프로플루아졸 (profluazol)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 제공하는 제초제 내성 PPO 유전자 또는 이의 변이체는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의하여 식물체 또는 조류 내에 도입될 수 있으며, 바람직하게는 식물 또는 조류 형질전환용 발현벡터가 이용될 수 있다.

식물체 형질전환의 경우, 벡터에 포함되는 적합한 프로모터로는, 식물체 내 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유니트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제(TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터, 옥토파인 신타아제 프로모터 및 BCB (blue copper binding protein) 프로모터 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 벡터는 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (NOS 3' end), 아그로박테리움 투메파시엔스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 터미네이터 (octopine synthase terminator), 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터, 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터 및 파세올린 (phaseoline) 터미네이터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 조류 형질전환의 경우, 프로모터로서 엽록체 특이적 프로모터, 핵 프로모터, 항시성 프로모터 또는 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 제초제 내성 PPO 유전자 또는 이의 변이체는 5'UTR 또는 3'UTR 에 작동적으로 연결되어 조류의 핵 안에서 기능을 발휘하도록 설계될 수 있다. 또한, 상기 벡터는 조류 형질전환에 적합한 전사 조절 서열을 더욱 포함할 수 있다. 제초제 내성을 부여하는 재조합 유전자는 숙주 조류에서 핵의 게놈 또는 엽록체의 게놈에 통합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 벡터는 제초제 내성 PPO 유전자 또는 이의 변이체를 엽록체에 발현시키기 위하여, 엽록체로의 타겟팅에 필요한 트랜지트 펩타이드를 PPO 유전자 또는 이의 변이체의 5'-위치에 연결시킬 수 있다.

또한, 상기 벡터는 선택적으로, 리포터 분자로서 선택 표지를 암호화하는 유전자를 추가적으로 포함할 수 있으며, 선택 표지의 예로서 항생제(예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신, 블레오마이신, 앰피실린, 클로람페니콜 등) 또는 제초제 (글리포세이트, 글루포시네이트, 포스피노트리신 등) 내성 유전자 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 식물 발현용 재조합 벡터는 아그로박테리움 (Agrobacterium) 바이너리 벡터, 코인테그레이션 벡터 (cointegration vector) 또는 T-DNA 부위를 포함하지는 않지만 식물에서 발현될 수 있도록 디자인된 일반 벡터가 사용될 수 있다. 이 중, 바이너리 벡터는 Ti (tumor inducible) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB (left border)와 RB (right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 포함하는 벡터를 말하며, 그 내부에 식물체에서 발현시키기 위한 프로모터 부위와 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 벡터를 사용할 수 있다.

상기에서 바이너리 벡터 또는 코인테그레이션 벡터를 사용하는 경우, 식물체에 상기 재조합 벡터를 도입하기 위한 형질전환용 균주로는 아그로박테리움을 사용하는 것이 바람직하며 (Agrobacterium - mediated transformation), 이때 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스 (Agrobacterium rhizogenes)를 사용할 수 있다. 그 밖에 T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는, 전기천공법 (electroporation), 입자 총법 (particle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법 (polyethylene glycol-mediated uptake) 등이 재조합 플라스미드를 식물체로 도입하는데 이용될 수 있다.

상기와 같은 방법으로 유전자가 도입된 형질전환 식물들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 캘러스 유도, 발근 및 토양 순화와 같은 과정을 거쳐 식물체로 재분화시킬 수 있다.

본 명세서에서 형질전환의 대상이 되는 식물은, 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물세포 (현탁배양 세포 포함), 원형질체 (protoplast), 캘러스 (callus), 배축 (hypocotyl), 종자 (seed), 자엽 (cotyledon), 신초 (shoot) 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

또한, 본 명세서의 형질전환체의 범주에는 상기 유전자가 도입된 형질전환체 뿐만 아니라 이의 클론 또는 자손(T₁ 세대, T₂ 세대, T₃ 세대, T₄ 세대, T₅ 세대, 또는 그 이상)을 포함하며, 예를 들어, PPO 유전자 또는 이의 변이체가 형질전환된 식물의 무성 또는 유성 자손으로서 제초제 내성 형질이 유전된 식물들도 본 발명의 형질전환 식물의 범주에 포함된다. 또한, 본원의 유전자가 형질전환된 식물의 모든 교배 및 융합 생성물과 함께, 초기 형질전환된 식물의 특성을 나타내는 모든 돌연변이체 및 변이체가 본 발명의 범주에 포함된다. 아울러, 본 발명의 방법으로 미리 형질전환시킨 형질전환된 식물, 또는 이들의 자손으로부터 기원하며 형질전환된 세포의 적어도 일부로 이루어진 종자, 꽃, 줄기, 과실, 잎, 뿌리, 괴경, 및/또는 괴근과 같은 식물의 일부도 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명이 적용될 수 있는 식물은 특별히 제한되지 않으며, 단자엽 또는 쌍자엽 식물을 모두 포함하여 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 또한 초본 또는 목본 식물일 수 있다. 상기 단자엽 식물은 택사과 (Alismataceae), 자라풀과 (Hydrocharitaceae), 지채과 (Juncaginaceae), 장지채과 (Scheuchzeriaceae), 가래과 (Potamogetonaceae), 나자스말과 (Najadaceae), 거머리말과 (Zosteraceae), 백합과 (Liliaceae), 지모과 (Haemodoraceae), 용설란과 (Agavaceae), 수선화과 (Amaryllidaceae), 마과 (Dioscoreaceae), 물옥잠과 (Pontederiaceae), 붓꽃과 (Iridaceae), 버먼초과 (Burmanniaceae), 골풀과 (Juncaceae), 닭의장풀과 (Commelinaceae), 곡정초과 (Eriocaulaceae), 화본과 (벼과, Gramineae, Poaceae), 천남성과 (Araceae), 개구리밥과 (Lemnaceae), 흑삼릉과 (Sparganiaceae), 부들과 (Typhaceae), 사초과 (방동사니과, Cyperaceae), 파초과 (Musaceae), 생강과 (Zingiberaceae), 홍초과 (Cannaceae), 난초과 (Orchidaceae)의 식물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 쌍자엽 식물은 암매과 (돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과 (Clethraceae), 노루발과 (Pyrolaceae), 진달래과 (Ericaceae), 자금우과 (Myrsinaceae), 앵초과 (Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과 (Ebenaceae), 때죽나무과 (Styracaceae), 노린재나무과 (Symplocaceae), 회목과 (Symplocaceae), 물푸레나무과 (목서과, Oleaceae), 마전과 (Loganiaceae), 용담과 (Gentianaceae), 조름나물과 (Menyanthaceae), 협죽도과 (마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과 (Asclepiadaceae), 꼭두서니과 (Rubiaceae), 꽃고비과 (Polemoniaceae), 메꽃과 (Convolvulaceae), 지치과 (Boraginaceae), 마편초과 (Verbenaceae), 꿀풀과 (Labiatae), 가지과 (Solanaceae), 현삼과 (Scrophulariaceae), 능소화과 (Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과 (Acanthaceae), 참깨과 (Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과 (Gesneriaceae), 통발과 (Lentibulariaceae), 파리풀과 (Phrymaceae), 질경이과 (Plantaginaceae), 인동과 (Caprifoliaceae), 연복초과 (Adoxaceae), 마타리과 (Valerianaceae), 산토끼꽃과 (Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과 (Compositae), 소귀나무과 (Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과 (Salicaceae), 자작나무과 (Betulaceae), 너도 밤나무과 (참나무과, Fagaceae), 느릅나무과 (Ulmaceae), 뽕나무과 (Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과 (Santalaceae), 겨우살이과 (Loranthaceae), 마디풀과 (여뀌과, Polygonaceae), 자리공과 (상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과 (Nyctaginaceae), 석류풀과 (Aizoaceae), 쇠비름과 (Portulacaceae), 석죽과 (Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과 (Amaranthaceae), 선인장과 (Cactaceae), 목련과 (Magnoliaceae), 붓순나무과 (Illiciaceae), 녹나무과 (Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과 (Ranunculaceae), 매자나무과 (Berberidaceae), 으름덩굴과 (Lardizabalaceae), 새모래덩굴과 (방기과, Menispermaceae), 수련과 (Nymphaeaceae), 붕어마름과 (Ceratophyllaceae), 어항마름과 (Cabombaceae), 삼백초과 (Saururaceae), 후추과 (Piperaceae), 홀아비꽃대과 (Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과 (Aristolochiaceae), 다래나무과 (Actinidiaceae), 차나무과 (동백나무과, Theaceae), 물레나물과 (Guttiferae), 끈끈이주걱과 (Droseraceae), 양귀비과 (Papaveraceae), 풍접초과 (Capparidaceae), 십자화과 (겨자과, Cruciferae), 플라타너스과 (버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과 (금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과 (돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과 (Saxifragaceae), 두충과 (Eucommiaceae), 돈나무과 (Pittosporaceae), 장미과 (Rosaceae), 콩과 (Leguminosae), 괭이밥과 (Oxalidaceae), 쥐손이풀과 (Geraniaceae), 한련과 (Tropaeolaceae), 남가새과 (Zygophyllaceae), 아마과 (Linaceae), 대극과 (Euphorbiaceae), 별이끼과 (Callitrichaceae), 운향과 (Rutaceae), 소태나무과 (Simaroubaceae), 멀구슬나무과 (Meliaceae), 원지과 (Polygalaceae), 옻나무과 (Anacardiaceae), 단풍나무과 (단풍과, Aceraceae), 무환자나무과 (Sapindaceae), 칠엽수과 (Hippocastanaceae), 나도 밤나무과 (Sabiaceae), 봉선화과 (물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과 (Aquifoliaceae), 노박덩굴과 (화살나무과, Celastraceae), 고추나무과 (Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과 (Empetraceae), 갈매나무과 (Rhamnaceae), 포도과 (Vitaceae), 담팔수과 (Elaeocarpaceae), 피나무과 (Tiliaceae), 아욱과 (Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과 (서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과 (Flacourtiaceae), 제비꽃과 (Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과 (Tamaricaceae), 물별과 (Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과 (Cucurbitaceae), 부처꽃과 (배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과 (Punicaceae), 바늘꽃과 (Onagraceae), 개미탑과 (Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과 (산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과 (오갈피나무과, Araliaceae), 산형과 (미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))의 식물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

구체예로, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 마초, 목초, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 잔디 및 피마자를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 소나무, 팜오일 및 유칼립투스를 포함하는 목본류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체 예로, 상기 식물은 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물; 및 벼, 밀, 보리, 옥수수, 수수 등의 단자엽 식물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명이 적용될 수 있는 조류는 특별히 제한되지 않으며, 원핵 (prokaryotic) 조류 또는 진핵 (eukaryotic) 조류일 수 있다. 예를 들어, 조류는 시아노박테리아, 녹조류, 홍조류, 갈조류, 대형조류 (macroalgae) 또는 미세조류 (microalgae)일 수 있다.

시아노박테리아류로는, Chroococcales 문 (예, Aphanocapsa, Aphanothece, Chamaesiphon, Chondrocystis, Chroococcus, Chroogloeocystis, Crocosphaera, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanodictyon, Cyanosarcina, Cyanothece, Dactylococcopsis, Gloeocapsa, Gloeothece, Halothece, Johannesbaptistia, Merismopedia, Microcystis, Radiocystis, Rhabdoderma, Snowella, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Woronichinia), Gloeobacteria 문, Nostocales 문 (예, Microchaetaceae, Nostocaceae, Rivulariaceae, Scytonemataceae), Oscillatoriales 문 (예, Arthronema, Arthrospira, Blennothrix, Crinalium, Geitlerinema, Halomicronema, Halospirulina, Hydrocoleum, Jaaginema, Katagnymene, Komvophoron, Leptolyngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microcoleus,Oscillatoria, Phormidium, Planktothricoides, Planktothrix, Plectonema, Pseudanabaena, Pseudophormidium, Schizothrix, Spirulina, Starria, Symploca, Trichodesmium, Tychonema), Pleurocapsales 문 (예, Chroococcidiopsis, Dermocarpa, Dermocarpella, Myxosarcina, Pleurocapsa, Solentia, Stanieria, Xenococcus), Prochlorales 문, 또는 Stigonematales 문 (예, Capsosira, Chlorogloeopsis, Fischerella, Hapalosiphon, Mastigocladopsis, Mastigocladus, Nostochopsis, Stigonema, Symphyonema, Symphonemopsis, Umezakia, Westiellopsis) 등을 예시할 수 있다.

조류의 다른 예로, Chlorophyta, Chlamydomonas, Volvacales, Dunaliella, Scenedesmus, Chlorella, 또는 Hematococcm 를 예시할 수 있다.

조류의 다른 예로, Phaeodactylum tricornutum, Amphiprora hyaline, Amphora spp., Chaetoceros muelleri, Navicula saprophila, Nitzschia communis, Scenedesmus dimorphus, Scenedesmus obliquus, Tetraselmis suecica, Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella vulgaris, Haematococcus pluvialis, Neochloris oleoabundans, Synechococcus elongatus, Botryococcus braunii, Gloeobacter violaceus, Synechocystis, Thermosynechococcus elongatus, Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis salina, Nannochloropsis gaditana, Isochrysis galbana, Botryococcus sudeticus, Euglena gracilis, Neochloris oleoabundans, Nitzschia palea, Pleurochrysis carterae, Tetraselmis chuii, Pavlova spp., Aphanocapsa spp., Synechosystis spp., Nannochloris spp. 등을 예시할 수 있다. 그러나, 상기 열거한 종류들에 제한되는 것은 아니며, 그 외 다양한 속 및 종에 속하는 조류들이 포함될 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 제초제 내성 PPO 또는 이의 변이체가 도입된 식물 또는 조류는 2 종 이상의 PPO 저해 제초제에 대하여 내성을 나타낼 수 있다.

따라서, 본 명세서에서 제공되는 기술은 2 종 이상의 PPO 저해 제초제를 순차적으로, 또는 동시에 사용함으로써 잡초를 방제하거나 원하지 않는 수생 생물을 제거하는 데 사용될 수 있다.

일 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및 상기 재배지에 2종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.

다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및 상기 배양 배지에 2종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 단계를 포함하는, 배양 배지에서 원하지 않는 수생 생물들을 제거하는 방법을 제공한다.

또한, 본 명세서에서 제공하는 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이의 유전자는, 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자와 조합하여 사용될 수 있다.

이에 따라, 본 명세서에서 제공하는 제초제 내성 PPO 또는 이의 변이체가 도입된 식물 또는 조류는 작용기전이 상이한 2 종 이상의 제초제에 대하여 내성을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명은 작용기전이 PPO 저해 제초제를 포함한 상이한 2 종 이상의 제초제를 순서에 상관없이 순차적으로, 또는 동시에 사용함으로써 잡초를 방제하거나 및/또는 원치 않는 수생 생물을 제거하는 데 사용될 수 있다. 이하, PPO 저해 제초제와 작용기전이 상이한 제초제를 "제2의 제초제"라고 지칭한다.

일 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성을 가지는 형질전환체, 이의 클론 또는 자손을 제공한다.

다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 조류, 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물체 전체에 형질전환하는 단계를 포함하는, 제초제에 대한 내성을 가지는 식물 또는 조류를 제조하는 방법을 제공한다.

다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 동시에 또는 순서에 상관없이 순차적으로 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.

다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및 상기 배양 배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 동시에 또는 순서에 상관없이 순차적으로 적용하는 단계를 포함하는, 배양 배지에서 원하지 않는 수생 생물을 제거하는 방법을 제공한다.

예컨대, 상기 식물 또는 조류는 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하며 상기 제2의 제초제에 대한 내성이 부여 및/또는 증진된 것일 수 있다.

예컨대, 상기 제2의 제초제는 세포분열 저해성 제초제, 광합성 저해성 제초제, 아미노산합성 저해성 제초제, 색소체 저해성 제초제, 세포막 저해성 제초제 및/또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체 예로, 상기 제2의 제초제는 글리포세이트 (glyphosate), 글루포시네이트 (glufosinate), 디캄바 (dicamba), 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), ALS (acetolactate synthase) 저해성 제초제 (예를 들어, 이미다졸리디논, 설포닐우레아, 트리아졸피리미딘, 설포아닐라이드, 피리미딘 티오벤조에이트 등), 제2광계 (photosystem II) 저해성 제초제, 페닐우레아 (phenylurea)계 제초제, 색소체 저해성 제초제, 브로목시닐 (bromoxynil)계 제초제 및/또는 이들의 조합을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

에컨대, 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드는 글리포세이트 제초제 내성 EPSPS (glyphosate resistant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase), GOX (glyphosate oxidase), GAT (glyphosate-N-acetyltransferase) 또는 글리포세이트 디카복실레이즈 (glyphosate decarboxylase); 글루포시네이트 제초제 내성 PAT (phosphinothricin-N-acetyltransferase); 디캄바 제초제 내성 DMO (dicamba monooxygenase); 2,4-D 제초제 내성 2,4-D 모노옥시게나아제 또는 AAD (aryloxyalkanoate dioxygenase); ALS 저해성 설포닐우레아 (sulfonylurea)계 제초제 내성 ALS (acetolactate synthase), AHAS (acetohydroxyacid synthase), 또는 Athahasl (acetohydroxyacid synthase large subunit); 제2광계 저해성 제초제 내성 광계 II (photosystem II) 단백질 D1; 페닐우레아계 제초제 내성 시토크롬 P450 (cytochrome P450); 색소체 저해성 제초제 내성 HPPD (hydorxylphenylpyruvate dioxygenase); 브로목시닐 제초제 내성 니트릴레이즈 (nitrilase); 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 글리포세이트 제초제 내성 cp4 epsps, epsps (AG), mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 또는 gat4621 유전자; 글루포시네이트 제초제 내성 bar, pat 또는 pat (SYN) 유전자; 디캄바 제초제 내성 dmo 유전자; 2,4-D 제초제 내성 AAD-1, AAD-12 유전자; ALS 저해성 설포닐우레아계 제초제 내성 ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM-HRA, Csr1, Csr1-1, Csr1-2, SurA 또는 SurB; 제2광계 (photosystem II) 저해성 제초제 내성 psbA 유전자; 페닐우레아 제초제 내성 CYP76B1 유전자; 이속사플루톨 제초제 내성 HPPDPF W336 유전자; 브로목시닐 제초제 내성 bxn 유전자; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 제공하는 제초제 내성 PPO 단백질의 변이체 또는 이를 암호화하는 유전자를 식물 또는 조류에 적용함으로써 보다 우수한 제초제 내성 형질을 부여 및/또는 증진시키고, 제초제를 이용한 선별적 방제를 통해 경제적으로 잡초를 방제하거나 원하지 않는 수생 생물을 제거할 수 있다.

도 1은 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (BT3(ΔPPO))에 pACBB 벡터 (V로 나타냄), 애기장대 PPO1 유전자 (WT로 나타냄), CyPPO2 wild type 유전자 Cy2로 나타냄), CyPPO4 wild type 유전자 (Cy4로 나타냄), 또는 CyPPO8 wild type 유전자 (Cy8로 나타냄)를 형질전환시킨 후, Tiafenacil을 0 μM (micromole), 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 400 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 2는 pET29b 벡터의 개열지도이다.
도 3은 pACBB-eGFP 벡터의 개열지도이다.
도 4는 pET303-CT-His벡터의 개열지도이다.
도 5는 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (BT3(ΔPPO))에 CyPPO2 wild type 유전자 (Cy2 WT로 나타냄) 또는 다양한 CyPPO2 변이 유전자를 형질전환시킨 후, tiafenacil을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 6은 BT3(ΔPPO)에 Cy2 WT 또는 다양한 CyPPO2 변이 유전자를 형질전환시킨 후, saflufenacil을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 7은 BT3(ΔPPO)에 Cy2 WT 또는 다양한 CyPPO2 변이 유전자를 형질전환시킨 후, flumioxazin을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 8은 BT3(ΔPPO)에 Cy2 WT 또는 다양한 CyPPO2 변이 유전자를 형질전환시킨 후, fomesafen을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 9는 BT3(ΔPPO)에 Cy2 WT 또는 다양한 CyPPO2 변이 유전자를 형질전환시킨 후, acifluorfen을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 10은 BT3(ΔPPO)에 Cy2 WT 또는 다양한 CyPPO2 변이 유전자를 형질전환시킨 후, pyraclonil을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 11은 BT3(ΔPPO)에 Cy2 WT 또는 다양한 CyPPO2 변이 유전자를 형질전환시킨 후, sulfentrazone을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 12는 BT3(ΔPPO)에 Cy2 WT 또는 다양한 CyPPO2 변이 유전자를 형질전환시킨 후, pentoxazone을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 13은 BT3(ΔPPO)에 Cy2 WT 또는 다양한 CyPPO2 변이 유전자를 형질전환시킨 후, pyraflufen-ethyl을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 14는 BT3(ΔPPO)에 CyPPO4 wild type 유전자 (Cy4 WT로 나타냄) 또는 다양한 CyPPO4 변이 유전자를 형질전환시킨 후, tiafenacil을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 15는 BT3(ΔPPO)에 Cy4 WT 또는 다양한 CyPPO4 변이 유전자를 형질전환시킨 후, saflufenacil을 0 μM, 5 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 16은 BT3(ΔPPO)에 Cy4 WT 또는 다양한 CyPPO4 변이 유전자를 형질전환시킨 후, flumioxazin을 0 μM, 5 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 17은 BT3(ΔPPO)에 CyPPO8 wild type 유전자 (Cy8 WT로 나타냄) 또는 다양한 CyPPO8 변이 유전자를 형질전환시킨 후, tiafenacil을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM 및 400 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진으로, 상단은 pET303-CT-His벡터를 사용하여 얻어진 결과이고, 하단은 pACBB 벡터를 사용하여 얻어진 결과이다.
도 18은 BT3(ΔPPO)에 Cy8 WT 또는 다양한 CyPPO8 변이 유전자를 형질전환시킨 후, saflufenacil을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 19는 BT3(ΔPPO)에 Cy8 WT 또는 다양한 CyPPO8 변이 유전자를 형질전환시킨 후, fomesafen을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 20은 BT3(ΔPPO)에 Cy8 WT 또는 다양한 CyPPO8 변이 유전자를 형질전환시킨 후, acifluorfen을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 21은 BT3(ΔPPO)에 Cy8 WT 또는 다양한 CyPPO8 변이 유전자를 형질전환시킨 후, flumioxazin을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 22는 BT3(ΔPPO)에 Cy8 WT 또는 다양한 CyPPO8 변이 유전자를 형질전환시킨 후, sulfentrazone을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 23은 BT3(ΔPPO)에 Cy8 WT 또는 다양한 CyPPO8 변이 유전자를 형질전환시킨 후, pentoxazone을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 24는 BT3(ΔPPO)에 Cy8 WT 또는 다양한 CyPPO8 변이 유전자를 형질전환시킨 후, pyraflufen-ethyl을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 25는 BT3(ΔPPO)에 Cy8 WT 또는 다양한 CyPPO8 변이 유전자를 형질전환시킨 후, pyraclonil을 0 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 농도로 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 26은 MBP (maltose binding protein)과 PPO 단백질이 융합된 융합 단백질 제조를 위한 재조합 벡터를 모식적으로 보여주는 그림이다.
도 27은 pMAL-c2X 벡터의 개열지도이다.
도 28은 CyPPO2 야생형 단백질 및 CyPPO2-Y373M 변이 단백질을 분리 정제하기 위하여 수행한 SDS-PAGE 결과이다.
도 29는 CyPPO4 야생형 단백질 및 CyPPO4-Y375M 변이 단백질을 분리 정제하기 위하여 수행한 SDS-PAGE 결과이다.
도 30은 CyPPO8 야생형 단백질 및 CyPPO8-F363M 변이 단백질을 분리 정제하기 위하여 수행한 SDS-PAGE 결과이다.
도 31은 CyPPO 유전자의 식물 형질전환을 위한 바이너리 벡터의 구조를 예시적으로 보여주는 모식도이다.
도 32는 CyPPO2, CyPPO4 또는 CyPPO8의 변이 유전자가 도입된 형질전환 애기장대 (T₂) 종자의 제초제 내성을 확인하기 위하여, 다양한 농도의 Tiafenacil을 포함하는 배지에서 종자 발아시킨 경우의 발아 정도를 보여주는 사진이다.
도 33은 CyPPO2, CyPPO4, 또는 CyPPO8의 변이 유전자가 도입된 형질전환 애기장대 (T₂)에서의 CyPPO 변이 단백질의 발현 정도를 보여주는 웨스턴블랏 결과이다.
도 34는 CyPPO2 Y373M 변이체 및 CyPPO8 F363M 변이체를 암호화하는 유전자가 도입된 형질전환 애기장대 (T₃)에 5 μM 농도의 tiafenacil을 스프레이 처리한 후 7일차에 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 35는 CyPPO2 Y373M 변이체, CyPPO4 Y375M 변이체, 및 CyPPO8 F363M 변이체를 암호화하는 유전자가 도입된 형질전환 애기장대 (T₃)에 5 μM 농도의 saflufenacil을 스프레이 처리한 후 7일차에 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 36은 CyPPO2 Y373M 변이체, CyPPO4 Y375M 변이체, 및 CyPPO8 F363M 변이체를 암호화하는 유전자가 도입된 형질전환 애기장대 (T₃)에 5 μM 농도의 fomesafen을 스프레이 처리한 후 7일차에 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 37은 CyPPO2의 Y373I, Y373L, Y373V, Y373C, Y373M, V318M+Y373I, V173S+A175C+Y373M, 및 A175C+V318M+Y373M 변이 유전자가 각각 도입된 형질전환 애기장대 (T₃ 또는 T₂)에 25 μM 또는 5 μM 농도의 tiafenacil, 또는 75 μM 농도의 saflufenacil을 스프레이 처리한 후 7일차에 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 38은 CyPPO8의 F363V, F363L, A162L, 및 A162C+V308M+F363M 변이 유전자가 각각 도입된 형질전환 애기장대 (T₃ 또는 T₂)에 25 μM 또는 10 μM 농도의 tiafenacil 또는 100 μM 농도의 saflufenacil을 스프레이 처리한 후 7일차에 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 39는 pCAMBIA3301 벡터의 개열지도이다.
도 40은 야생형 동진벼 (Dongjin-non GM)와 동진벼를 CyPPO2 Y373M 변이 유전자로 형질전환시킨 형질전환체 (CyPPO2 Y373M)와 CyPPO8 F363M 변이 유전자로 형질전환시킨 형질전환체 (CyPPO8 F363M)의 T₀ 세대에 PPO 저해 제초제 살포 후 7일차 모습을 보여주는 사진으로 A는 tiafenacil을 853 g ai/ha 처리 후의 모습이고, B는 saflufenacil 2,087 g ai/ha 처리 후의 모습이다.
도 41은 동진벼의 CyPPO2 Y373M T₂ 형질전환체 라인 3번 및 CyPPO8 F363M T₂ 형질전환체 라인 3번의 PPO 저해 제초제 살포 후 7일차 모습을 보여주는 사진으로, A는 tiafenacil 420 g ai/ha 처리 후의 모습이고, B는 saflufenacil 840 g ai/ha 처리 후의 모습이다 (1: young leaf → 4: old leaf).
도 42는 동진벼의 CyPPO2 Y373M 형질전환체의 잎에서의 CyPPO2 Y373M 변이 단백질의 발현 여부를 관찰한 웨스턴블랏 결과이다.
도 43은 동진벼의 CyPPO8 F363M 형질전환체의 잎에서의 CyPPO8 F363M 변이 단백질의 발현 여부를 확인한 웨스턴블랏 결과이다.
도 44는 동진벼의 CyPPO8 F363M 형질전환체에서 변이 유전자 존재 여부를 확인한 southern blotting 결과이다.
도 45는 CyPPO2의 Y373I 및 CyPPO8의 F363V 변이 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체 (T₃)의 다양한 제초제에 대한 저항성 수준을 보여주는 사진이다.
도 46은 CyPPO2 Y373I 및 CyPPO8 F363V 변이 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체의 T₄ 세대의 제초제 저항성을 보여주는 사진이다.
도 47은 CyPPO2 Y373I 및 CyPPO8 F363V 변이 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체의 T₅ 세대의 제초제 저항성을 보여주는 사진이다.
도 48은 애기장대의 CyPPO2 Y373I 삽입 형질전환체 및 CyPPO8 F363V 삽입 형질전환체의 T₄ 세대에서의 PPO 단백질 발현을 보여주는 웨스턴블랏 결과이다.
도 49는 애기장대의 CyPPO2 Y373I 삽입 형질전환체 및 CyPPO8 F363V 삽입 형질전환체의 T₅ 세대의 PPO 단백질 발현을 보여주는 웨스턴블랏 결과이다.
도 50은 콩 형질전환용 벡터의 구조를 예시적으로 보여주는 구조도이다.
도 51은 콩의 CyPPO2 Y373M 형질전환체 및 CyPPO8 F363M 형질전환체에서 삽입 유전자 존재 여부를 확인한 southern blotting 결과이다.
도 52는 콩(Kwangan soybean)의 CyPPO2 Y373M 삽입 형질전환체 및 CyPPO8 F363M 삽입 형질전환체의 T₂ 세대의 제초제 저항성을 보여주는 사진이다.
도 53은 콩의 CyPPO2 Y373M 형질전환체 및 CyPPO8 F363M 형질전환체의 잎에서 CyPPO2 Y373M 단백질 및 CyPPO8 F363M 단백질의 발현 여부를 확인한 웨스턴블랏 결과이다.
도 54는 유채(Youngsan)의 CyPPO8 F363M 삽입 형질전환체 tiafenacil 처리 전 후의 성장 모습을 보여주는 사진이다.
도 55는 유채의 CyPPO8 F363M 삽입 형질전환체의 saflufenacil 처리 전 후의 성장 모습을 보여주는 사진이다.
도 56은 유채의 CyPPO8 F363M 형질전환체의 잎에서의 CyPPO8 F363M 단백질의 발현 여부를 확인한 웨스턴블랏 결과 (상단) 및 쿠마시 블루 염색 결과 (하단)을 보여준다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 원핵생물로부터 PPO 유전자의 분리

오실라토리아 니그로-비리디스 (Oscillatoria nigro - viridis) PCC 7112, 링비아 속 (Lyngbya sp .) PCC 8106, 할로테세 속 (Halothece sp .) PCC 7418 균주를 파스퇴르 연구소 (프랑스)에서 분양받았으며, 각 균주에서 PPO 유전자를 분리하였다. BT3 E. coli 에서 보다 효율적인 제초제 저항성 스크리닝을 위해 각 PPO 유전자를 코돈 최적화 (codon optimization)하여 합성하였다 (GenScript). 표 1의 프라이머를 사용하여 PCR 을 통해 PPO 유전자를 증폭시켰다.

PCR 반응액은 Template (각 유전자의 합성 DNA) 1 ㎕ (microliter), 10X buffer 5 ㎕, dNTP mixture (각 10 mM) 1 ㎕, forward primer (표 1 참조; 10 μM) 1 ㎕, reverse primer (표 1 참조; 10 μM) 1 ㎕, DDW 40 ㎕, 및 Pfu-X (Solgent, 2.5 unit/㎕) 1 ㎕을 포함하는 반응액 50 ㎕ 으로 구성하였고, 94 ℃에서 4분간 반응한 후, 25 cycles (94 ℃ 에서 30초, 56 ℃ 에서 30초 및 72 ℃ 에서 1.5분) 반복하고, 72 ℃ 에서 5분 및 4 ℃ 에서 5분 반응하여 증폭하였다.

오실라토리아 니그로-비리디스 PCC 7112 에서 분리한 PPO를 CyPPO2 로 명명하고, 링비아 속 PCC 8106 균주에서 분리한 PPO를 CyPPO4 로 명명하고, 할로테세 속 PCC 7418 에서 분리한 PPO를 CyPPO8 로 명명하였다.

또한, CyPPO2, CyPPO4, 및 CyPPO8 각각의 염기서열 및 이에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 확인하여 서열번호 1 내지 6에 나타내었다.

균주	프라이머	서열	서열번호
Oscillatoria nigro-viridis PCC 7112	CyPPO2_F CyPPO2_R	CCCCGGATCCATGGAACTTCTTGATACTCT CCCCCTCGAGGATTGACC TGGTATCACTCT	12 13
Lyngbya sp. PCC 8106	CyPPO4_F CyPPO4_R	CCCCGGATCCATGACCCATGTTTTGGATTC CCCCCTCGAGCTGTCCTAAAAATGATAAAATCTCG	14 15
Halothece sp. PCC 7418	CyPPO8_F CyPPO8_R	CCCCGGATCCATGATAGATACTCTTATAGTGGG CCCCCTCGAGTCCTAAGTAATCTAAAACTG	16 17

상기 준비된 CyPPO2, CyPPO4, 및 CyPPO8의 제초제 내성을 PPO 유전자가 결핍된 대장균을 이용하여 시험하였다.

상기 PPO 유전자를 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (BT3(ΔPPO))에 형질전환한 후, PPO 저해 제초제를 처리한 환경에서 배양하여, 형질전환 대장균의 생장 저해 여부를 확인하였다. BT3(ΔPPO) 균주는 Hokkaido University (일본)에서 제공받았으며, hemG type PPO가 결여된 대장균이며 카나마이신 (kanamycine)에 내성을 가지는 균주이다 ("Watanabe et al., Dual targeting of spinach protoporphyrinogen oxidase II to mitochondria and chloroplasts by alternative use of two in-frame inhibition codons, JBC 2001 276(23):20474-20481; Che et al., Molecular Characterization and Subcellular Localization of Protoporphyrinogen Oxidase in Spinach Chloroplasts, Plant Physiol.　2000 Sep;124(1):59-70" 참조).

구체적인 시험 과정은 다음과 같다:

상기 준비된 CyPPO2, CyPPO4, 및 CyPPO8 유전자를 pACBB 벡터 (Plasmid #32551; Addgene; 도 3참조)에 클로닝하였다. 이 클로닝한 플라스미드를 각각 BT3 competent cell 100 ㎕에 넣어 열충격 방법으로 형질전환하였다. 각 변이 유전자 종류별로 클로람페니콜 (Duchefa)이 포함된 LB (Luria-Bertani) agar 배지에서 배양하였다.

각 유전자로 형질전환된 대장균의 종배양을 위해, 각 단일 콜로니 (single colony)를 클로람페니콜을 포함한 3 ml LB broth에서 12시간 이상 배양 (220 rpm, 37 ℃)한 후, 50 내지 100 ㎕를 새로운 3 ml LB broth에 계대하여, 흡광도 (OD₆₀₀)가 0.5 내지 1 이 될 때까지 배양하고, 흡광도 (OD₆₀₀)를 0.5에 맞추기 위해 LB broth로 희석하였다. 이 희석액을 LB broth 로 10배씩 5번 희석하였다. 다음으로, 34 ㎍/ml의 클로람페니콜과 tiafenacil이 농도별로 (0~400 μM) 혼합된 LB Agar 배지 (패트리디쉬)에 위에서 준비한 형질전환 대장균 배양 희석액을 10 ㎕씩 떨어뜨렸다. LB Agar 배지를 37 ℃, 광조건에서 배양하였고, 16 내지 20시간 후 생장 저해 정도를 확인하였다.

비교를 위하여, pACBB 벡터 (Plasmid #32551; Addgene; 도 3참조)로 형질전환된 BT3 대장균 형질전환체 (V; PPO 결핍 대장균; pACBB 벡터가 BT3(ΔPPO) 균주에 도입된 것) 및 상기 원핵세포 유래의 PPO 유전자 대신 애기장대 유래의 야생형 PPO 유전자 (Wild type AtPPO1) (서열번호 8)가 도입된 BT3 대장균 형질전환체 (WT)을 사용하여 동일한 시험을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 상기 원핵세포 유래의 CyPPO2, CyPPO4, 및 CyPPO8 유전자 모두 시험된 모든 제초제 농도에서 애기장대 유래의 야생형 PPO 유전자가 도입된 대장균과 비교하여 우수한 제초제 내성을 나타냄을 확인할 수 있다. 이러한 결과에 기초하여, 애기장대 유래의 야생형 PPO 유전자보다 우수한 제초제 내성이 입증된 CyPPO2, CyPPO4, 및 CyPPO8을 하기의 실시예 3에서의 대장균을 이용한 제초제 내성 시험의 비교군으로 사용하여 보다 엄격한 기준으로 제초제 내성을 입증하였다.

실시예 2. PPO -제초제 복합체 구조 분석을 통한 제초제와 상호작용하는 PPO의 아미노산 정보 획득

PPO 단백질과 제초제의 결합 구조 정보 확인을 위하여, PPO 단백질의 대표 예로서 CyPPO2를, PPO 저해 제초제의 대표 예로서 tiafenacil을 사용하여 시험하였다. 수용성 CyPPO2 단백질의 순수 분리 정제 및 결정화를 수행한 후, 방사광가속기를 이용하여 CyPPO2의 X-ray 회절데이터를 확보하고, 분자수준의 삼차원 구조를 규명하여 CyPPO2-tiafenacil 복합체의 구조를 분석하였다. 이를 통해 제초제 내성을 부여하는 PPO 단백질 내 아미노산 변이 위치에 대한 정보를 수집하였다.

수용성 상태의 CyPPO2단백질을 획득하기 위해서 CyPPO2 의 아미노산 (서열번호 1)에서 틸라코이드 막 binding 도메인에 위치하는 소수성 아미노산 잔기 7개를 친수성 잔기들로 치환하였다. 상기 아미노산 잔기가 치환된 CyPPO2의 변이 단백질을 암호화하는 유전자를 pET29b vector (Catalog Number: 69872-3; EMD Biosciences; 도 2 참조)에 클로닝하고, 대장균 시스템을 사용하여 CyPPO2 단백질을 발현시켰다. 발현된 CyPPO2 단백질을 니켈 친화 크로마토그래피를 통해 순수 분리하였고, 정제된 CyPPO2단백질을 결정화 후3 mM tiafenacil을 soaking 하여 tiafenacil과 결합한 CyPPO2의 결정을 획득하였다. 이후 방사광 가속기를 이용하여 2.8Å 해상도의 CyPPO2-tiafenacil 복합체 결정의 X-ray 회절 데이터를 수집하고 삼차원 구조를 규명하였으며, 이를 분석하여 CyPPO2단백질 내 tiafenacil의 결합 위치를 확인하였다. CyPPO2 과 tiafenacil 복합체 구조 분석결과, CyPPO2 단백질 (서열번호 1)의 S63, P91, R92, F169, V173, A175, E228, L229, P316, V318, F337, L340, G351, T352, I353 및Y373 위치의 아미노산이 tiafenacil과 상호작용하고 있음을 확인하였다.

이와 같이 CyPPO2-tiafenacil 복합체 구조로부터 도출된 결합 아미노산 정보를 이용하여, CyPPO2 (서열번호 1)와, CyPPO4 및 CyPPO8 각각의 아미노산 간의 서열 homology 분석 (NCBI BLAST, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)을 통해 CyPPO4 (서열번호 3)와 CyPPO8 (서열번호 5) 단백질에서 tiafenacil과 상호작용하는 아미노산 잔기들을 도출하였다.

그 결과, CyPPO4 단백질 (서열번호 3)의 N63, S64, S66, P67, P92, R93, F170, S172, G173, V174, Y175, A176, R190, E230, L231, P318, V320, F339, G340, N341, L342, L352, G353, T354, I355, Y375, I424, V458, 및 R465 위치의 아미노산이 tiafenacil과 상호작용하는 것으로 판단하였다. 또한, CyPPO8 단백질 (서열번호 5)의 P84, R85, F156, V160, A162, Q179, P306, V308, F327, L330, I343, N362, 및 F363 위치의 아미노산이 tiafenacil과 상호작용하는 것으로 판단하였다.

실시예 3. PPO 변이체의 PPO 저해 제초제 내성 검증 (대장균에서 시험)

CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8의 PPO 저해 제초제 내성을 높이기 위하여 각각 PPO 아미노산 서열 중 상기 실시예 2에서 얻어진 제초제와 상호작용하는 위치의 아미노산에 변이를 유발하였다. 이와 같은 변이가 유발된 PPO 유전자를 설계하여 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (BT3(ΔPPO))에 형질전환한 후, PPO 저해 제초제를 처리한 환경에서 배양하여, 형질전환 대장균의 생장 저해 여부를 확인하였다. 대조군으로 각 변이 유전자의 야생형을 이용하였다.

구체적인 시험 과정은 다음과 같다:

실시예 1에서 합성 증폭하여 pACBB 벡터 (Plasmid #32551; Addgene; 도 3참조)에 각각 클로닝한 CyPPO2 및 CyPPO4, pACBB 벡터 또는 pET303-CT-His벡터 (VT0163; Novagen; 도 4 참조)에 클로닝한 CyPPO8를 template로, 아래 표2 내지 4의 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 변이 유전자를 제작하였다.

PCR 반응액은 Tempate 1 ㎕, 10X buffer 5 ㎕, dNTP mixture (각 10 mM) 1 ㎕, forward primer (10 μM) 1 ㎕, reverse primer (10 μM) 1 ㎕, DDW 40 ㎕, 및 Pfu-X (Solgent, 2.5 unit/㎕) 1 ㎕을 포함하는 반응액 50 ㎕으로 구성하고, 94 ℃에서 4분간 반응시킨 후, 17~25 cycles (94 ℃ 에서 30초, 56~65 ℃ 에서 30초 및 72 ℃에서 3분) 반복하고, 72 ℃에서 5분 반응하여 증폭하였다. 각 PCR 용액 5 ㎕에 DpnI 0.5 ㎕ (New England Biolabs)를 처리하여 37 ℃에서 30분 반응시키고, 이 용액을 각각 DH5 alpha competent cell (Invitrogen) 100 ㎕에 넣어 열충격 방법으로 형질전환하였다. 각 변이 유전자 종류별로 클로람페니콜 또는 앰피실린이 포함된 LB (Luria-Bertani) agar 배지에서 배양하였다. 유전자의 변이는 plasmid DNA 시퀀싱으로 확인하였고, 각 plasmid는 BT3 에 형질전환하였다.

CyPPO2 변이용 프라이머

No.	CyPPO2 변이	Primer (Forward:상단; Reverse: 하단) (5'->3')
1	Y373M	GACCTCTATGATTGGTGGAGCTACTGATAG (서열번호 18)
		ACCAATCATAGAGGTCAATGTTTGCCATCC (서열번호 19)
2	Y373V	GACCTCTGTGATTGGTGGAGCTACTGATAG (서열번호 20)
		ACCAATCACAGAGGTCAATGTTTGCCATCC (서열번호 21)
3	Y373I	GACCTCTATCATTGGTGGAGCTACTGATAG (서열번호 22)
		ACCAATGATAGAGGTCAATGTTTGCCATCC (서열번호 23)
4	Y373T	GACCTCTACAATTGGTGGAGCTACTGATAG (서열번호 24)
		ACCAATTGTAGAGGTCAATGTTTGCCATCC (서열번호 25)
5	Y373L	GACCTCTTTGATTGGTGGAGCTACTGATAG (서열번호26)
		ACCAATCAAAGAGGTCAATGTTTGCCATCC (서열번호 27)
6	Y373C	GACCTCTTGTATTGGTGGAGCTACTGATAG (서열번호 28)
		ACCAATACAAGAGGTCAATGTTTGCCATCC (서열번호 29)
7	A175C	GGTGTGTACTGTGGAGATCCTCAACAGCTC (서열번호 30)
		AGGATCTCCACAGTACACACCAGAAACAAA (서열번호 31)
8	A175L	GGTGTGTACTTGGGAGATCCTCAACAGCTC (서열번호 32)
		AGGATCTCCCAAGTACACACCAGAAACAAA (서열번호 33)
9	V318M	TATCCAACAATGGCTTCAGTTGTGTTGGCA (서열번호 34)
		AACTGAAGCCATTGTTGGATAAGTGAATGC (서열번호 35)
10	G351A	CGCTGTCTCGCTACGATTTGGACATCGAGT (서열번호 36)
		CCAAATCGTAGCGAGACAGCGAATTCCCTG (서열번호 37)
11	S63T	GCCCGAACACTTTTTCGCCGACGCCGGAATTG (서열번호 38)
		GGCGAAAAAGTGTTCGGGCCCTCCTCCCAG (서열번호 39)
12	R92A	CAAATTGCCTGCTTTTGTGTATTGGGAAAATAAG (서열번호 40)
		ATACACAAAAGCAGGCAATTTGCGATCGGC (서열번호 41)
13	V173S	GTTTCTGGGAGTTATGCCGGCGATCCGCAAC (서열번호 42)
		CCGGCATAACTCCCAGAAACAAAAGGTTCC (서열번호 43)
14	V173C	GTTTCTGGGTGTTATGCCGGCGATCCGCAAC (서열번호 44)
		CCGGCATAACACCCAGAAACAAAAGGTTCCAC (서열번호 45)
15	V173T	GTTTCTGGGACTTATGCCGGCGATCCGCAAC (서열번호 46)
		CCGGCATAAGTCCCAGAAACAAAAGGTTCCAC (서열번호 47)
16	L229F	ACTAAGCCGGGGGAGTTCGGTTCGTTCAAGCAG (서열번호 48)
		CTGCTTGAACGAACCGAACTCCCCCGGCTTAGT (서열번호 49)
17	L340I	TTTTGGAAATATAATTCCGAGGGGGCAGGG (서열번호 50)
		CTCGGAATTATATTTCCAAAACCCACTAATTTAC (서열번호 51)
18	I353T	TCGGGACGACTTGGACATCGAGTTTATTTCC (서열번호 52)
		GATGTCCAAGTCGTCCCGAGACAGCGAATTC (서열번호 53)
19	I353L	CTCGGGACGCTTTGGACATCGAGTTTATTT (서열번호 54)
		ATGTCCAAAGCGTCCCGAGACAGCGAATTC (서열번호 55)
20	I353V	ACTAAGCCGGGGGAGTTCGGTTCGTTCAAGCAG (서열번호 56)
		CTGCTTGAACGAACCGAACTCCCCCGGCTTAGT (서열번호 57)
21	I353C	TCGGGACG TGT TGGACATCGAGTTTATTTCC (서열번호 58)
		GATGTCCA ACA CGTCCCGAGACAGCGAATTC (서열번호 59)
22	V318T	TCCTACGACTGCCTCCGTTGTCTTAGCA (서열번호 60)
		AACGGAGGCAGTCGTAGGATAAGTAAAAGC (서열번호 61)
23	E228A	AAAACTAAGCCGGGGGCGTTGGGTTCGTTCAAG (서열번호 62)
		CTTGAACGAACCCAACGCCCCCGGCTTAGTTTT (서열번호 63)
24	P91L	AAACTTCTTAGATTCGTGTATTGGGAAAAC (서열번호 64)
		ACGAATCTAAGAAGTTTTCTATCTGCGAAT (서열번호 65)
25	P316A+V318L	GCTTTTACTTATGCTACGCTTGCCTCCGTT (서열번호 66)
		GACAACGGAGGCAAGCGTAGCATAAGTAAA (서열번호 67)
26	P316L+V318L	GCTTTTACTTATCTTACGCTTGCCTCCGTT (서열번호 68)
		GACAACGGAGGCAAGCGTAAGATAAGTAAA (서열번호 69)
27	F337V	TTAGTGGGTGTTGGAAATTTAATTCCGAGGGG (서열번호 70)
		TAAATTTCCAACACCCACTAATTTACCCTTGAC (서열번호 71)
28	T352V	TGTCTCGGGGTGATTTGGACATCGAGTTTATTT (서열번호 72)
		GTCCAAATCACCCCGAGACAGCGAATTCCCTG (서열번호 73)
29	V173L	GTTTCTGGGCTTTATGCCGGCGATCCGCAAC (서열번호 74)
		CGGCATAAAGCCCAGAAACAAAAGGTTCCAC (서열번호 75)
30	A175I	GTTTCTGGGGTTTATATTGGCGATCCGCAA (서열번호 76)
		TTGTTGCGGATCGCCAATATAAACCCCAGA (서열번호 77)
31	L340V	TTTTGGAAATGTTATTCCAAGAGGTCAAGGAATC (서열번호 78)
		CTTGGAATAACATTTCCAAAACCCACGAGTTT (서열번호 79)
32	L340T	TTTTGGAAATACTATTCCAAGAGGTCAAGG (서열번호 80)
		CTTGGAATAGTATTTCCAAAACCCACGAGTTTTC (서열번호 81)
33	F169A	CCAGAAACAGCAGGTTCCACCAACCGCTGCATC (서열번호 82)
		GTGGAACCTGCTGTTTCTGGGGTTTATGCCG (서열번호 83)

CyPPO4 변이용 primer

No.	CyPPO4 변이	Primer (Forward:상단; Reverse: 하단) (5' ->3')
1	Y375M	CTTACATCTATGATTGGTGGAGCTACCGAT (서열번호 84)
		CCACCAATCATAGATGTAAGAACCTGCCAT (서열번호 85)
2	Y375V	CTTACATCTGTTATTGGTGGAGCTACCGAT (서열번호 86)
		CCACCAATAACAGATGTAAGAACCTGCCAT (서열번호 87)
3	Y375I	CTTACATCTATCATTGGTGGAGCTACCGAT (서열번호 88)
		CCACCAATGATAGATGTAAGAACCTGCCAT (서열번호 89)
4	Y375T	CTTACATCTACCATTGGTGGAGCTACCGAT (서열번호 90)
		CCACCAATGGTAGATGTAAGAACCTGCCAT (서열번호 91)
5	Y375C	CTTACATCTTGTATTGGTGGAGCTACCGAT (서열번호 92)
		CCACCAATACAAGATGTAAGAACCTGCCAT (서열번호 93)
6	A176C	GGTGTGTATTGTGGAGATCCACAACAGCTT (서열번호 94)
		TGGATCTCCACAATACACACCAGAAACAAA (서열번호 95)
7	A176L	GGTGTGTATTTGGGAGATCCACAACAGCTT (서열번호 96)
		TGGATCTCCCAAATACACACCAGAAACAAA (서열번호 97)
8	P318L+V320L	ATTCCTTATTTGCCATTGGCTTGTGTTGTGCTC (서열번호 98)
		AACACAAGCCAATGGCAAATAAGGAATTTCTGTA (서열번호 99)
9	V320M	TATCCTCCAATGGCTTGTGTTGTGCTCGCA (서열번호 100)
		AACACAAGCCATTGGAGGATAAGGAATTTC (서열번호 101)
10	P318A+V320L	ATTCCTTATGCTCCATTGGCTTGTGTTGTGCTC (서열번호 102)
		AACACAAGCCAATGGAGCATAAGGAATTTCTGTA (서열번호 103)

CyPPO8 변이용 primer

No.	CyPPO8 변이	Primer (Forward:상단; Reverse: 하단)
1	F363M	TTGACAAATATGATTGGTGGAGCTACCGAT (서열번호 104)
		CACCAATCATATTTGTCAAAAGGTGCCATC (서열번호 105)
2	F363V	CTT TTG ACA AAT GTT ATT GGT GGA GCT ACC (서열번호 106)
		AGC TCC ACC AAT AAC ATT TGT CAA AAG GTG (서열번호 107)
3	F363L	CTT TTG ACA AAT CTT ATT GGT GGA GCT ACC (서열번호 108)
		AGC TCC ACC AAT AAG ATT TGT CAA AAG GTG (서열번호 109)
4	F363C	CTT TTG ACA AAT TGT ATT GGT GGA GCT ACC (서열번호 110)
		AGC TCC ACC AAT ACA ATT TGT CAA AAG GTG (서열번호 111)
5	A162C	TCTGGTGTGTAT TGT GGAGATGTTGATCAA (서열번호 112)
		ATCAACATCTCC ACA ATACACACCAGAAAC (서열번호 113)
6	A162L	TCTGGTGTGTAT CTT GGAGATGTTGATCAA (서열번호 114)
		ATCAACATCTCC AAG ATACACACCAGAAAC (서열번호 115)
7	P306L+V308L	ATCTCATAT CTT CCA CTT GCTTGCGTTGTG (서열번호 116)
		AACGCAAGC AAG TGG AAG ATATGAGATTTC (서열번호 117)
8	V308M	TCATATCCTCCA ATG GCTTGCGTTGTGCTC (서열번호 118)
		CACAACGCAAGC CAT TGGAGGATATGAGAT (서열번호 119)
9	P306A+V308L	ATTTCCTATGCCCCCCTAGCTTGTGTGGTCTTAGCC (서열번호 120)
		CACACAAGCTAGGGGGGCATAGGAAATTTCGTTTAAGG (서열번호 121)
10	V160S	GTGTCTGGGTCTTATGCAGGGGATGTGGATC (서열번호 122)
		CCTGCATAAGACCCAGACACAAACGGACTCAC (서열번호 123)
11	I343T	TTGGTACAACTTGGAGTTCAACACTCTTTCC (서열번호 124)
		GAACTCCAAGTTGTACCAAGAGTGCGGATTC (서열번호 125)
12	F363I	CTT TTG ACA AAT ATT ATT GGT GGA GCT ACC (서열번호 126)
		AGC TCC ACC AAT AAT ATT TGT CAA AAG GTG (서열번호 127)
13	F363T	CTT TTG ACA AAT ACT ATT GGT GGA GCT ACC (서열번호 128)
		AGC TCC ACC AAT AGT ATT TGT CAA AAG GTG (서열번호 129)
14	R85A	GGACTTCCCGCTTATGTTTATTGGGAGGGG (서열번호 130)
		CAATAAACATAAGCGGGAAGTCCGCGATCAGC (서열번호 131)
15	I343V	CTTGGTACAGTTTGGAGTTCAACACTCTTTC (서열번호 132)
		AACTCCAAACTGTACCAAGAGTGCGGATTC (서열번호 133)
16	P84L	AGGTTTACTTAGGTATGTTTACTGGGAGGG (서열번호 134)
		CATACCTAAGTAAACCTCTATCTGCAAAGA (서열번호 135)
17	R85C	GACTTCCCTGTTATGTTTATTGGGAGGGGAAAC (서열번호 136)
		TAAACATAACAGGGAAGTCCGCGATCAGCAAAG (서열번호 137)
18	R85H	ACTTCCCCATTATGTTTATTGGGAGGGGAAAC (서열번호 138)
		CAATAAACATAATGGGGAAGTCCGCGATCAGC (서열번호 139)
19	R85L	ACTTCCCCTTTATGTTTATTGGGAGGGGAAAC (서열번호 140)
		CAATAAACATAAAGGGGAAGTCCGCGATCAGC (서열번호 141)
20	R85T	GACTTCCCACTTATGTTTATTGGGAGGGGAAAC (서열번호 142)
		ATAAACATAAGTGGGAAGTCCGCGATCAGCAAAG (서열번호 143)
21	R85V	GACTTCCCGTTTATGTTTATTGGGAGGGGAAAC (서열번호 144)
		ATAAACATAAACGGGAAGTCCGCGATCAGCAAAG (서열번호 145)
22	F156A	GTGAGTCCGGCTGTGTCTGGGGTTTATGCA (서열번호 146)
		CCCAGACACAGCCGGACTCACTAACCGTTG (서열번호 147)
23	V160C	CCGTTTGTGTCTGGGTGCTATGCAGGGGATGTG (서열번호 148)
		CACATCCCCTGCATAGCACCCAGACACAAACGG (서열번호 149)
24	Q179G	TCCGCCAGTCCGGTAACTCGTCCAAATGCAG (서열번호 150)
		CGAGTTACCGGACTGGCGGATGTGGGCGGTG (서열번호 151)
25	F327V	GTTTTCCCCTCAAAGGAGTGGGTAATCTTAACCCTC (서열번호 152)
		GAGGGTTAAGATTACCCACTCCTTTGAGGGGAAAAC (서열번호 153)
26	L330T	TTTGGTAATACTAACCCTCGCAGTCAAGGA (서열번호 154)
		GCGAGGGTTAGTATTACCAAATCCTTTGAG (서열번호 155)
27	F363M+N362S	CTTTTGACATCAATGATTGGTGGAGCTACC (서열번호 156)
		CCAATCATTGATGTCAAAAGGTGCCATCCT (서열번호 157)

각 유전자로 형질전환된 대장균의 종배양을 위해, 각 단일 콜로니 (single colony)를 클로람페니콜 또는 앰피실린을 포함한 3 ml LB broth에서 12시간 이상 배양한 후, 50 내지 100 ㎕를 새로운 3 ml LB broth에 계대하여, 흡광도 (OD₆₀₀)가 0.5 내지 1 이 될 때까지 배양하고, 흡광도 (OD₆₀₀)를 0.5에 맞추기 위해 LB broth로 희석하였다. 이 희석액을 LB broth 로 10배씩 5번 희석하였다. 다음으로, 34 ㎍/ml 클로람페니콜 또는 100 ㎍/ml 앰피실린과 다양한 제초제 (하기 표 5 참조)가 농도별 (0~400 μM)로 혼합된 LB Agar 배지 (패트리디쉬)에 위에서 준비한 형질전환 대장균 배양 희석액을 10 ㎕씩 떨어뜨렸다. LB Agar 배지를 37 ℃, 광 조건에서 배양하였고, 배양 16 내지 20시간 후 생장 저해 정도를 확인하였다.

시험에 사용된 제초제를 아래의 표 5에 정리하였다:

Family	제초제
Pyrimidinedione계 제초제	Tiafenacil
	Saflufenacil
Diphenyl ether계 제초제	Fomesafen
	Acifluorfen
N-phenylphthalimides계 제초제	Flumioxazin
Triazolinones계 제초제	Sulfentrazone
Oxazolidinediones계 제초제	Pentoxazone
Phenylpyrazoles계 제초제	Pyraflufen-ethyl
기타	Pyraclonil

상기 얻어진 결과를 표 6 내지 표 8 및 도 5 내지 도 25에 나타내었다.

CyPPO2 변이에 따른 제초제 내성

CyPPO2	Tiafenacil	Saflufenacil	Flumioxazin
CyPPO2 (wild type)	-	-	-
Y373M+G351A	+++++	+++++	+++++
Y373C	++++	+++++	+++++
Y373I	++++	+++++	+++++
Y373L	++++	+++++	+++++
Y373M	++++	+++++	+++++
Y373T	++++	+++++	+++++
Y373V	+++	+++++	+++++
A175C	+++	++++	+++++
A175L	++	+++++	++++
V318M	++	++++	+++++
P316A+V318L	+	NT	NT
P316L+V318L	+	NT	NT
F337V+Y373M	++	NT	NT
T352V+Y373M	++++	NT	NT
G351A+T352V+Y373M	+++	NT	NT
P91L+Y373M	++	NT	NT

(NT: Not Tested)

CyPPO4 변이에 따른 제초제 내성

CyPPO4	Tiafenacil	Saflufenacil	Flumioxazin
CyPPO4	-	-	-
Y375M	+++++	+++++	+++++
Y375V	+++++	+++++	+++++
Y375I	+++++	+++++	+++++
Y375T	+++++	+++	+++++
Y375C	+++++	+++	NT
A176C	+++++	+++++	+++++
A176L	+++++	++++	+++++
P318L+V320L	+++++	++++	NT
V320M	+++++	++++	NT
P318A+V320L	+++++	++++	NT

(NT: Not Tested)

CyPPO8 변이에 따른 제초제 내성

CyPPO8	Tiafenacil	Saflufenacil	Fomesafen	Acifluorfen	Flumioxazin	Sulfentrazone	Pentoxazone	Pyraflufen-ethyl	Pyraclonil
CyPPO8	-	-	-	-	-	-	-	-	-
F363C	++++	++++	++++	+++++	+++	++++	+++++	+++++	+++++
F363L	+++	+++	+	+++	++	++	+++++	++++	++++
F363M	+++	+++	+	+++	++	++	+++++	++++	++++
F363V	+++	+++	-	++	+++	++	+++++	++++	+++++
A162L	++	++	+++	++++	++++	++++	++++	++++	+++
V308M	++	++	+++	+++++	+++	++++	++++	++++	++++
P306A+V308L	+	+	+	++++	NT	++	+++	+++	+
P306L+V308L	+	+	++	+++++	NT	++++	+++	++++	+
A162C	NT	NT	NT	++	NT	+	+++	++++	+
P84L+F363M	+++	NT	NT	NT	NT	NT	NT	NT	NT
N362S+F363M	+++	NT	NT	NT	NT	NT	NT	NT	NT

(NT: Not Tested)

상기 표 6 내지 표 8은 각 PPO 단백질의 제초제의 내성 평가 결과를 등급화하여 나타낸 것으로, PPO 단백질의 wild type의 내성을 0 ('-'로 표시)으로 하여 내성 정도에 따라서 최대 '+++++'까지 등급을 정하여 표시한 것이다.

도 5 내지 25은 PPO 유전자 (야생형 및 변이형)가 형질도입된 대장균의 배양 결과를 보여주는 사진으로, 상단에 기재된 농도는 제초제 처리 농도이며, 각 농도별 6개의 컬럼은 대장균 배양액을 10배씩 희석한 결과를 나타낸 것으로, 가장 왼쪽 컬럼이 OD₆₀₀=0.5인 대장균 배양액의 실험 결과이고, 오른쪽으로 갈수록 10배씩 희석된 배양액의 실험 결과이다.

표 6 및 도 5 내지 도 13에 나타난 바와 같이, 다양한 제초제 처리시, CyPPO2 야생형 유전자가 삽입된 형질전환 대장균 (이하 'Cy2 WT'로 표시; 대조군)은 제초제 처리 농도가 저농도인 경우에도 생장저해가 관찰되는 반면, 변이 유전자가 각각 삽입된 형질전환 대장균은 제초제 처리 농도가 고농도인 경우에도 대조군 대비 우수한 생장을 보이는 것이 관찰되었다. 예컨대, pyrimidinedione계 제초제 tiafenacil 처리시, Cy2 WT는 제초제 처리 농도 25 μM 부터 급격한 생장저해가 관찰되고 이 이상의 농도에서 형질전환체의 생장이 관찰되지 않는 반면, Y373C, Y373I, Y373L, Y373M, Y373T, Y373V, A175C, A175L, V318M, G351A+Y373M, P316A+V318L, P316L+V318L, Y373M+F337V, Y373M+T352V, Y373M+G351A+T352V, 및 Y373M+P91L 의 변이 유전자가 각각 삽입된 형질전환 대장균은 시험 최대 농도인 200 μM에서도 생장이 관찰되었다 (도 5). 또한, pyrimidinedione계 제초제 saflufenacil 처리시, Cy2 WT는 제초제 처리 농도 100 μM 이상에서 생장저해가 관찰되는 반면, Y373C, Y373I, Y373L, Y373M, Y373T, Y373V, A175C, A175L, V318M, 및 G351A+Y373M 의 변이 유전자가 각각 삽입된 형질전환 대장균은 시험 최대 농도인 200 μM에서도 제초제가 포함되지 않은 배지 (제초제 처리 농도 0인 배지; 이하 '대조 배지')에서와 동등한 수준의 생장이 관찰되었다 (도 6). 또한, N-phenylphthalimides계 제초제 flumioxazin 처리시, Cy2 WT는 제초제 처리 농도 25 μM부터 생장저해가 시작되어 이 이상의 농도에서 거의 형질전환 대장균의 생장이 관찰되지 않는 반면, Y373C, Y373I, Y373L, Y373M, Y373T, Y373V, A175C, A175L, V318M, 및 G351A+Y373M 의 변이 유전자가 각각 삽입된 형질전환 대장균은 시험 최대 농도인 200 μM에서도 생장저해가 관찰되지 않았다 (도 7).

표 7 및 도 14 내지 도 16에 나타난 바와 같이, 다양한 제초제 처리시, CyPPO4 야생형 유전자가 삽입된 형질전환 대장균 (이하 'Cy4 WT'로 표시; 대조군)은 제초제 처리 농도가 저농도인 경우에도 생장저해가 관찰되는 반면, 변이 유전자가 각각 삽입된 형질전환 대장균은 제초제 처리 농도가 고농도인 경우에도 대조군 대비 우수한 생장을 보이는 것이 관찰되었다. 예컨대, pyrimidinedione계 제초제 tiafenacil 처리시, Cy4 WT은 제초제 처리 농도 100 μM부터 생장이 저해가 관찰되는 반면, A176L, A176C, P318L+V320L, P318A+V320L, V320M, Y375I, Y375T, Y375V, Y375M, 및 Y375C의 변이 유전자가 각각 삽입된 형질전환 대장균은 시험 최대 농도인 200 μM에서도 대조 배지에서와 동등한 수준의 생장이 관찰되었다 (도 14). 또한, pyrimidinedione계 제초제 saflufenacil처리시, Cy4 WT 는 제초제 처리 농도 100 μM에서부터 생장저해가 관찰되는 반면, Y375C, Y375I, Y375M, Y375T, Y373V, A176C, A176L, P318L+V320L, P318A+V320L, 및 V320M의 변이 유전자가 각각 삽입된 형질전환 대장균은 시험 최대 농도인 200 μM에서도 대조 배지에서와 동등한 수준의 생장이 관찰되었다 (도 15). 또한, N-phenylphthalimides계 제초제 flumioxazin에서 Cy4 WT 는 200 μM에서 생장저해가 관찰되나 Y375I, Y375M, Y375T, Y373V, A176C, A176L의 변이 유전자가 삽입된 형질전환 대장균은 시험 최대 농도인 200 μM에서도 제초제가 포함되지 않은 대조 배지에서와 동일한 생장이 관찰되었다 (도 16).

표 8 및 도 17 내지 도 25에 나타난 바와 같이, 다양한 제초제 처리시, CyPPO8 야생형 유전자가 삽입된 형질전환 대장균(이하 ' Cy8 WT '로 표시; 대조군)은 제초제 처리 농도가 저농도인 경우에도 생장저해가 관찰되는 반면, 변이 유전자가 각각 삽입된 형질전환 대장균은 제초제 처리 농도가 고농도인 경우에도 대조군 대비 우수한 생장을 보이는 것이 관찰되었다. 구체적으로, pyrimidinedione계 제초제 (tiafenacil, saflufenacil) 처리시, Cy8 WT 은 제초제 처리 농도 5 μM에서부터 생장이 관찰되지 않는 반면, F363C, F363L, F363M, F363V, A162L, V308M, P306A+V308L, P306L+V308L, F363M+P84L, 및 F363M+N362S의 변이 유전자가 각각 삽입된 형질전환 대장균은 제초제 처리 농도 최소 25 μM이상에서도 생장이 관찰되었다 (도 17 및 도 18). 또한, diphenyl-ether계 제초제 fomesafen 처리시, Cy8 WT 는 제초제 처리 농도 25 μM에서부터 형질전환 대장균의 생장이 관찰되지 않는 반면, F363C, F363L, F363M, A162L, V308M, P306A+V308L, 및 P306L+V308L의 변이 유전자가 각각 삽입된 형질전환 대장균은 제초제 처리 농도 최소 25 μM이상에서도 생장이 관찰되었다 (도 19). 또한, diphenyl-ether계 제초제 acifluorfen 처리시, Cy8 WT 는 제초제 처리 농도 50 μM에서부터 형질전환 대장균의 생장이 관찰되지 않는 반면, F363C, F363L, F363M, F363V, A162C, A162L, V308M, P306A+V308L, 및 P306L+V308L의 변이 유전자가 각각 삽입된 형질전환 대장균은 제초제 처리 농도 최소 50 μM 이상에서도 생장이 관찰되었다 (도 20). 또한, N-phenylphthalimides계 제초제 flumioxazin처리시, Cy8 WT 는 제초제 처리 농도 5 μM에서부터 생장이 관찰되지 않는 반면, F363C, F363L, F363M, F363V, A162L, 및 V308M의 변이 유전자가 각각 삽입된 형질전환 대장균은 제초제 처리 농도 25 μM 이상에서도 생장이 관찰되었다 (도 21). 또한, triazolinones계 제초제 sulfentrazone 처리시, Cy8 WT 는 제초제 처리 농도 25 μM까지만 생장이 관찰되는 반면, F363C, F363L, F363M, F363V, A162C, A162L, V308M, P306A+V308L, 및 P306L+V308L의 변이 유전자가 각각 삽입된 형질전환 대장균은 제초제 처리 농도 50 μM 이상에서도 생장이 관찰되었다 (도 22). 또한, pentoxazone 또는 pyraflufen-ethyl 처리시, Cy8 WT 는 제초제 처리 농도 5 μM 이상에서 생장이 관찰되지 않는 반면, F363C, F363L, F363M, F363V, A162C, A162L, V308M, P306A+V308L, 및 P306L+V308L의 변이 유전자가 각각 삽입된 형질전환 대장균은 최대 처리 농도인 200 μM에서도 생장이 관찰되었다 (도 23 및 도 24). 또한, pyraclonil 처리시, Cy8 WT 는 제초제 처리 농도 25 μM 이상에서 생장이 관찰되지 않는 반면, F363C, F363L, F363M, F363V, A162C, A162L, V308M, P306A+V308L, P306L+V308L가 각각 삽입된 형질전환 대장균은 최대 처리 농도인 200 μM에서도 생장이 관찰되었다 (도 25).

실시예 4: PPO 야생형 및 변이체의 효소 활성 및 제초제별 IC50값 측정

제초제 내성을 증가시키기 위해 PPO 단백질의 특정 위치의 아미노산을 변이시킨 변이체의 효소 활성을 조사하고 PPO활성 저해 제초제에 의한 inhibition assay를 수행하였다. PPO 단백질은 수용성이 낮지만, MBP (maltose binding protein)와 함께 fusion protein (MBP-PPO)으로 발현시킬 경우 안정적으로 수용성 단백질이 발현되는 것을 확인하여, 하기의 야생형 및 변이형 단백질을 MBP와의 융합 단백질 형태로 발현시켜서 본 시험에 사용하였다 (도 26 참조).

CyPPO2, CyPP04, 및 CyPPO8의 야생형 유전자 및 변이형 유전자 (실시예 1 및 실시예 2 참조)를 발현시키기 위하여, 상기 유전자를 각각 pMAL-c2X 벡터 (도 27 참조)에 삽입한 후, BL21 (DE3) 대장균 (CodonPlus)에 클로닝하였다.

상기 얻어진 형질전환 대장균을 다음의 조건으로 배양하여 PPO 유전자를 발현시켰다:

Induction: OD₆₀₀=0.2, 최종농도 0.3 mM IPTG 첨가;

발현온도: 23 ℃, 200 rpm의 진탕 배양;

발현시간: 16hrs;

배양규모: 200 ml/1,000 ml flask.

상기 배양된 형질전환 대장균에 대하여 다음의 과정으로 세포 파쇄 및 단백질 추출을 수행하였다:

추출 버퍼: Column buffer (50 mM Tris-Cl, pH8.0, 200 mM NaCl) 5 ml buffer/g cell;

Sonication: SONICS&MATERIALS社 VCX130 (130 watts);

15 sec ON, 10 sec OFF for 5 min on ice;

4 ℃ 및 20분 조건 하에서 원심분리 (20,000 x g); 및

상기 원심분리로 얻어진 상층액을 column buffer를 사용하여 1:6 비율로 로 희석하였다.

상기 얻어진 단백질 추출물에 대하여 다음의 과정을 4 ℃ 저온실에서 수행하여 PPO 단백질의 정제를 수행하였다. 1.5x15 cm column (Bio-Rad Econo Columns 1.5 x 10 cm, glass chromatography column, max. vol)에 amylose resin (New England Biolabs)을 부어 컬럼을 packing하고, 상기 얻어진 단백질 추출물을 컬럼에 0.2 ml/min의 속도로 로딩하였다. 상기 컬럼을 컬럼 부피 기준으로 3부피배의 column buffer로 washing 후 washing액 내의 단백질 양을 확인하여 더 이상 단백질이 검출되지 않으면 washing을 종료하였다. 상기 컬럼 부피 기준으로 약 2부피배의 20 mM maltose 를 포함하는 column buffer로 MBP-PPO 단백질을 elution (1.5 ml E-tube에 각 fraction을 분취)하면서 각 eluent의 단백질 농도를 확인하였다. 더 이상 단백질이 검출되지 않으면 elution을 종료시켰다. 각 fraction을 10 ㎕의 양으로 취하여 단백질 정량 후 단백질이 검출된 fraction을 SDS-PAGE로 분석하고, 순도가 높은 fraction을 취하여 효소 활성 분석 시험에 사용하였다.

PPO 단백질 변이체 (예컨대, CyPPO2-Y373M, CyPPO4-Y375M, CyPPO8-F363M)의 단백질 발현 및 정제를 상기와 같이 수행하였으며, SDS-PAGE 분석을 통해 순도가 높은 fraction을 취하여 아래의 효소활성 분석 시험에 사용하였다.

상기 얻어진 SDS-PAGE 결과를 도 28 내지 도 30에 나타내었다. 도 28은 CyPPO2 야생형 단백질 및 변이형 단백질의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 것이다. 도 28에 나타난 결과를 참조하여, CyPPO2 야생형 단백질은 elution 7 (lane 2), CyPPO2-Y373M은 elution 5 (lane 7)을 취하여 효소 활성 분석에 사용하였다. 도 29는 CyPPO4 야생형 단백질 및 변이형 단백질의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 것이다. 도 29에 나타난 결과를 참조하여, CyPPO4 야생형 단백질은 elution 3 (lane 2), CyPPO4-Y375M은 elution 3 (lane 6)을 취하여 효소 활성 분석에 사용하였다.

도 30은 CyPPO8 야생형 단백질 및 변이형 단백질의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 것이다. 도 30에 나타난 결과를 참조하여, CyPPO8 야생형 단백질은 elution 9 (lane 3), CyPPO8-F363M은 elution 4 (lane 6)을 취하여 효소 활성 분석에 사용하였다.

상기 정제된 CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8의 야생형 단백질 및 변이형 단백질의 효소 활성을 아래의 과정으로 측정하였다.

우선, PPO 단백질의 기질인 프로토포르피리노겐 IX (Protoporphyrinogen IX)를 합성하였다. 이 과정은 질소기체가 streaming 되는 공간에서 수행되었다. 프로토포르피린 IX (protoporphyrin IX) 6 mg을 20% (v/v) EtOH 20 ml에 용해시키고, dark condition에서 30분간 교반하였다. 상기 얻어진 프로토포르피린 IX 용액을 15 ml screw tube에 800 ㎕의 양으로 넣고 5분간 질소 기체를 flushing하였다. 여기에 아말감나트륨 (sodium amalgam) 1g을 넣고 2분간 vigorous shaking하였다. Tube 안의 수소 기체를 배출하기 위해 뚜껑을 열어두었다. 그 후, 뚜껑을 닫고 3분간 인큐베이션한 후, Syringe와 cellulose membrane filter를 이용해 프로토포르피리노겐 IX 용액을 filtering하였다. 상기 얻어진 프로토포르피리노겐 IX 용액 600 ㎕에 2M MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]를 약 300 ㎕의 양으로 첨가하여 pH를 8.0으로 조절하였다. PPO 단백질의 효소 활성을 측정하기 위하여 다음의 조성으로 Reaction mixture를 준비하였다 (10 ml 기준: 50 mM Tris-Cl (pH 8.0); 50 mM NaCl; 0.04% (v/v) Tween 20; 40 mM glucose (0.072g); 5 units glucose oxidase (16.6 mg); 및 10 units catalase (1 ㎕)).

상기 Reaction mixture 180 ㎕를 96 well plates에 넣고 앞서 정제된 PPO 단백질 (상기 MBP-fusion 단백질을 정제한 산물) 20 ㎕를 첨가하였으며, 약 50 ㎕의 mineral oil로 표면을 커버하였다. 기질인 프로토포르피리노겐 IX 용액을 최종농도 50 μM이 되도록 첨가하고 실온에서 30분간 반응시켰다. Microplate reader (Hidex社 sense)를 이용하여 프로토포르피린 IX (protoporphyrin IX)의 형광을 측정하였다 (excitation: 405 nm; emission: 633 nm). PPO 효소 활성값을 계산하기 위해, 상기 프로토포르피리노겐 IX 용액이 들어있는 튜브를 공기중에 개방하여 용액을 12 시간 이상 산화시켰다. 여기에 2.7 N HCl를 첨가하고 408nm에서의 흡광도 (absorbance)를 측정하였다. Standard 프로토포르피린 IX을 이용해 standard curve를 작성하고 이를 이용해 프로토포르피리노겐 IX의 농도를 calibration하여 PPO 활성을 측정하였다.

상기 얻어진 PPO 야생형 및 변이체의 효소 활성을 아래의 표 10 및 11에 나타내었다.

한편, CyPPO2와 CyPPO8의 효소활성능력을 평가하기 위해 각 효소의 미카엘리스-멘텐 상수 (Km) 및 최대반응속도 (Vmax, The maximal velocity) 값을 구하였다. 초기반응속도는 기질 농도를 달리하여 농도에 따라 반응속도가 비례하는 구간을 선정하였으며, 상온에서 20분간 time course로 효소 반응 산물인 프로토포르피린 IX의 생성량을 측정하였다. Km 및 Vmax값은 미카엘리스-멘텐식에 의해 enzyme kinetics 분석프로그램으로 계산하였으며, 대조군으로 애기장대 PPO를 사용하였다. 상기 얻어진 결과를 표 9에 나타내었다:

	CyPPO2	CyPPO8	AtPPO1
Km (μM)	9.1 ± 0.5	7.7 ± 0.2	9.6 ± 1.8
Vmax (μM mg protein-1 min-1)	285 mg p	305 mg p	135 g pr

상기 결과로부터 CyPPO2와 CyPPO8의 Km값은 애기장대 PPO보다 낮아 효소와 기질의 친화력이 더 좋고, Vmax 값은 약 두 배 이상 높은 것을 확인 할 수 있었다. 결론적으로 CyPPO2와 CyPPO8의 PPO 단백질이 식물 유래의 애기장대 PPO 보다 PPO 효소로써의 능력이 더 뛰어남을 보여준다.

또한, 각 PPO 야생형 및 변이체의 PPO 효소 활성을 50% 저해하는 농도 (IC₅₀)를 각 제초제별로 측정하였다. 이 때, 각 제초제의 최종 농도는 아래와 같이 하였다:

- Tiafenacil, saflufenacil, fomesafen, butafenacil, flumioxazin, 및 sulfentrazone 각 제초제의 최종농도: 0, 10, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000 nM

IC₅₀값은 상기한 효소 활성 측정 과정에 제초제를 상기 농도로 첨가하여 PPO 효소 활성을 제초제 첨가 전의 50%로 저해하는 제초제의 농도로 구하였다.

이와 같이 얻어진 제초제 별 IC₅₀을 아래의 표 10 및 표 11에 나타내었다.

CyPPO2	Mutation site	Activity (%)	IC50(nM)
No.			Tiafenacil	Saflufenacil	Fomesafen	Butafenacil	Flumioxazin	Sulfentrazone
0	WT	100	25	50	182	13	122	NT
1	Y373M	90	250	5,000	395	63	136	NT
2	Y373I	75	639	5,000	70	1516	464	NT
3	Y373L	44	300	NT	NT	NT	NT	NT
4	Y373V	35	525	NT	NT	NT	NT	NT
5	Y373C	39	225	NT	NT	NT	NT	NT
6	Y373T	10	2500	NT	NT	NT	NT	NT
7	A175L	41	230	NT	NT	NT	NT	NT
8	S63T+Y373M	90	246	NT	NT	NT	NT	NT
9	R92A+Y373M	50	219	NT	NT	NT	310	NT
10	V173S+Y373M	80	430	NT	NT	NT	NT	NT
11	V173S+Y373I	25	610	NT	NT	NT	NT	NT
12	V173S+Y373L	40	530	NT	NT	NT	NT	NT
13	V173S+Y373V	10	1,000	NT	NT	NT	NT	NT
14	V173C+Y373M	53	680	NT	NT	NT	NT	NT
15	V173C+Y373I	28	915	NT	NT	NT	NT	NT
16	V173T+Y373M	15	543	NT	NT	NT	NT	NT
17	V173T+Y373I	25	1,500	NT	NT	NT	NT	NT
18	V173L+Y373M	83	290	NT	NT	NT	NT	NT
19	A175L+Y373M	62	4,500	5,000	1,720	4,000	5,000	5,000
20	A175L+Y373I	15	2,000	5,000	NT	NT	NT	NT
21	A175C+Y373M	83	3,700	5,000	770	2,500	372	5,000
22	A175C+Y373I	31	2,000	NT	NT	NT	NT	NT
23	A175I+Y373M	52	2,500	NT	NT	NT	NT	NT
24	E228A+Y373M	85	214	NT	NT	NT	NT	NT
25	L229F+Y373T	10	1,800	NT	NT	NT	NT	NT
26	V318M+Y373M	73	456	5,000	523	708	210	3776
27	V318M+Y373I	50	2,765	5,000	145	1,232	1,021	5,000
28	V318M+Y373V	42	2,140	5,000	NT	NT	NT	NT
29	V318T+Y373I	25	1,500	NT	NT	NT	NT	NT
30	L340I+Y373M	80	259	NT	NT	NT	NT	NT
31	L340I+Y373I	85	584	NT	NT	NT	NT	NT
32	L340V+Y373M	80	257	NT	NT	NT	NT	NT
33	G351A+Y373M	23	706	5,000	300	36	NT	NT
34	I353T+Y373M	32	1,152	NT	NT	NT	NT	NT
35	I353T+Y373I	20	1,300	NT	NT	NT	NT	NT
36	I353T+Y373L	10	3,000	NT	NT	NT	NT	NT
37	I353L+Y373M	80	271	NT	NT	NT	NT	NT
38	I353V+Y373M	63	445	NT	NT	NT	NT	NT
39	I353C+Y373M	12	550	NT	NT	NT	NT	NT
40	S63T+V173S+Y373M	60	430	NT	NT	NT	NT	NT
41	S63T+V173S+Y373I	60	427	NT	NT	NT	NT	NT
42	S63T+I353T+Y373M	15	278	NT	NT	NT	NT	NT
43	S63T+I353T+Y373I	5	1200	NT	NT	NT	NT	NT
44	V173S+V318M+Y373M	5	3,000	NT	NT	NT	NT	NT
45	V173T+L340I+Y373M	50	518	NT	NT	NT	NT	NT
46	V173S +A175C +Y373M	38	5,000	5,000	758	2,591	5,000	5,000
47	A175C+V318M+Y373M	47	3,793	5,000	2,033	1,475	419	5,000
48	A175L+V318M+Y373M	40	3,100	NT	NT	NT	NT	NT
49	A175C+I353L+Y373M	5	1,900	NT	NT	NT	NT	NT
50	A175C+I353V+Y373M	69	2,310	NT	NT	NT	NT	NT
51	R92A	66	125	NT	NT	NT	NT	NT
52	F169A	72	57	NT	NT	NT	NT	NT
53	V173C	68	79	NT	NT	NT	NT	NT
54	A175C	86	100	NT	NT	NT	NT	NT
55	A175L	68	325	NT	NT	NT	NT	NT
56	V318M	76	140	NT	NT	NT	NT	NT
57	F337V	20	148	NT	NT	NT	NT	NT
58	L340T	18	56	NT	NT	NT	NT	NT
59	I353T	40	162	NT	NT	NT	NT	NT
CyPPO4
	WT	100	22	33	28	10	NT	NT
1	Y375M	95	124	5,000	133	39	NT	NT

(NT: not tested)

CyPPO8	Mutation site	Activity (%)	IC50(nM)
No.			Tiafenacil	Saflufenacil	Fomesafen	Butafenacil	Flumioxazin	Sulfentrazone
	WT	100	4	11	13	2.8	NT	NT
1	F363M	100	183	5,000	163	30	266	NT
2	F363C	17	36	500	38	53	NT	NT
3	F363V	15	2,000	5,000	1,500	250	2,500	NT
4	F363L	54	322	NT	NT	NT	NT	NT
5	F363I	62	698	5,000	133	NT	1,100	NT
6	F363T	5	3,000	5,000	1,500	NT	2,500	NT
7	R85A + F363M	62	700	NT	NT	NT	NT	NT
8	R85A + F363I	40	2,350	NT	NT	NT	NT	NT
9	A162L + F363M	17	5,000	NT	NT	NT	5,000	NT
10	A162C + F363M	87	2,500	5,000	NT	NT	1,166	NT
11	V160S + F363M	58	500	NT	NT	NT	NT	NT
12	V160S + F363I	26	2,280	NT	NT	NT	NT	NT
13	V308M + F363M	81	1,017	5,000	NT	NT	210	NT
14	V308M + F363I	29	1,810	NT	NT	NT	NT	NT
15	I343T + F363M	10	2,100	NT	NT	NT	NT	NT
16	I343V + F363M	44	288	NT	NT	NT	NT	NT
17	R85A + V308M + F363M	39	2,347	5,000	NT	NT	NT	NT
18	V160S + V308M + F363I	5	4,000	NT	NT	NT	NT	NT
19	A162C + F363I	29	2,450	NT	NT	NT	NT	NT
20	A162C + F363L	6	5,000	NT	NT	NT	NT	NT
21	R85A + A162L + F363M	11	5,000	NT	NT	NT	NT	NT
22	R85A + A162L + F363I	15	1,061	NT	NT	NT	NT	NT
23	R85A + A162C + F363M	19	5,000	5,000	5,000	4,310	2,700	5,000
24	R85A + A162C + F363I	16	5,000	NT	NT	NT	NT	NT
25	A162C + V308M + F363M	45	3,580	5,000	420	2500	697	5,000
26	A162C + V308L + F363M	53	2,041	NT	NT	NT	NT	NT
27	R85C + F363M	28	2,500	NT	NT	NT	NT	NT
28	R85H + F363M	30	622	NT	NT	NT	NT	NT
29	R85L + F363M	19	892	NT	NT	NT	NT	NT
30	R85T + F363M	24	1,356	NT	NT	NT	NT	NT
31	R85V + F363M	18	875	NT	NT	NT	NT	NT
32	A162L + Q179G + F363M	39	5,000	5,000	630	4,000	5,000	5,000
33	R85A	98	80	NT	NT	NT	NT	NT
34	F156A	85	28	NT	NT	NT	NT	NT
35	V160C	80	44	NT	NT	NT	NT	NT
36	A162C	76	75	NT	NT	NT	NT	NT
37	A162L	82	219	NT	NT	NT	NT	NT
38	V308M	93	76	NT	NT	NT	NT	NT
39	F327V	22	81	NT	NT	NT	NT	NT
40	L330T	27	69	NT	NT	NT	NT	NT
41	I343T	18	365	NT	NT	NT	NT	NT

(NT: not tested)

상기 표 10 및 표 11에서 확인되는 바와 같이, CyPPO 단백질 변이체의 경우 야생형과 비교하여 각 제초제의 IC₅₀값이 현저하게 상승하는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 PPO 단백질이 특정 위치의 아미노산 변이에 의하여 제초제에 대한 내성이 증가됨을 입증하는 것이다. 본 시험 결과에서 CyPPO 단백질 변이체가 대체적으로 야생형에 비하여 감소된 효소활성을 갖는 것으로 나타났지만, 이는 PPO 효소가 존재하는 식물의 엽록체 환경과 실험 조건이 동일하지 않아 CyPPO 단백질간 효소 활성의 차이가 크게 나는 것으로, 실제 식물에 형질전환 되어 엽록체에 정상적으로 발현되면 효소 활성 감소가 크지 않을 것으로 예상된다.

실시예 5. CyPPO 변이체를 이용한 애기장대 형질전환체 제작 및 PPO 저해 제초제 내성 시험

5-1. 애기장대 형질전환 벡터 제작 및 애기장대 형질전환체 제작

애기장대 형질전환은 선발 마커인 bar 유전자 (glufosinate 내성 유전자)의 ORF와 각각의 CyPPO2, CyPPO4, 또는 CyPPO8의 아미노산 변이 유전자의 ORF를 가진 이원벡터 (binary vector)를 제작하여 수행하였다. PPO 저해 제초제와 작용 기전이 다른 제초제를 교차 사용하는 경우 그 효과를 확인하기 위하여 bar 유전자를 사용하였으며, 상기 유전자는 후대 유전이 안정적으로 진행되고 있는지 여부를 검증하는데에도 사용하였다. bar 유전자의 발현을 위하여 NOS 프로모터와 전사 종결을 위한 E9 터미네이터를 사용하였다.

CyPPO2 변이체, CyPPO4 변이체, 및 CyPPO8 변이체 각각을 식물체에서 발현시키기 위하여 CaMV35S 프로모터와 NOS 터미네이터를 사용하였다. 또한, 엽록체로 단백질의 이동과 발현을 유도하기 위해 AtPPO1 유전자 (서열번호 8)의 transit peptide (TP)를 XbaI, XhoI 제한효소를 이용하여 삽입 유전자의 5' 앞에 삽입하였다. 또한, 발현된 단백질의 확인을 위해 헤마글루티닌 (hemaglutinin, HA) tag을 BamHI, SacI 제한효소를 이용하여 3' 말단 부위에 삽입하였다. 벡터 내 삽입된 transit peptide 부위를 서열번호 10으로, 삽입된 HA tag 서열을 서열번호 11로 나타내었다. CyPPO2 변이체, CyPPO4 변이체, 및 CyPPO8 변이체의 암호화 유전자는 각각 transit peptide와 HA tag 사이에 XhoI, BamHI 제한효소를 이용하여 삽입하였다. HA tag 뒤에 NOS terminator 가 삽입되어 PPO 유전자의 전사 종결을 유도하였다. 본 실시예에 사용한 식물 형질전환 이원벡터의 구조 모식도를 도 31에 예시적으로 나타내었다.

상기에서 제작한 각각의 벡터를 Agrobacterium GV3101 competent cell에 freeze and thaw 방법으로 형질전환시켰다. Agrobacterium GV3101 competent cell 을 제조하기 위하여, 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) GV3101 균주를 5 ml LB media 에 30 ℃ 및 200 rpm 조건에서 12시간 배양하였다. 이 배양액을 200 ml LB media 에 부은 뒤, 30 ℃ 및 200 rpm 조건에서 3~4시간 배양하고, 3000 xg, 4 에서 20분간 원심분리하였다. 멸균 증류수로 pellet을 씻어 준 뒤 20 ml LB media 로 재현탁 (resuspension)하였다. 200 ㎕씩 aliquot 하여 액체 질소에 snap freezing 한 뒤, 초저온 냉동고에 보관하였다.

각각의 형질전환 Agrobacterium을 항생제 배지 (spectinomycin을 포함한 LB agar)에서 배양 및 선발하였다. 상기 선별된 콜로니를 LB broth에서 액체 배양하였다. 이 배양액으로부터 Agrobacterium cell을 harvest 한 후, 5% (w/v) sucrose, 0.05% (v/v) Silwet L-77 용액 (Momentive performance materials company)에 흡광도 (OD₆₀₀) 0.8의 농도로 현탁하였다. Floral dipping 방법으로 Col-0 ecotype 애기장대 wild type에 형질전환하여 1~2달 후 종자 (T₁)를 수확하였다.

벡터 제작 시 삽입된 bar 유전자를 이용하여 형질전환 개체를 선발하였다. 상기 얻어진 T₁ 종자를 25 μM glufosinate가 첨가된 1/2 MS 배지 (2.25 g/L MS salt, 10 g/L sucrose, 7 g/L agar)에 파종하고, 파종 7일 후 생존한 개체를 선발하여 흙으로 이식하고 성장시켜 T₁ 식물체를 수득하였다.

이식한 T₁ 식물체들의 PPO 저해 제초제 내성을 판단하기 위해 4주 키운 후 추대 전 tiafenacil을 처리하였다. 100 ml의 tiafenacil 용액 (1 μM tiafenacil + 0.05% Silwet L-77)을 40 x 60 cm (0.24 m²)의 면적에 분사하여 골고루 처리하였다. 야생형 애기장대 (Col-0 ecotype; Columbia-0 생태형)의 경우 상기와 동일한 농도 및 양으로 tiafenacil을 처리하는 경우 사멸하였다. 상기와 같은 tiafenacil 처리 후 7일 경과 후 각 형질전환체들의 PPO 저해 제초제 내성 여부를 판별하였다.

내성을 나타내어 살아남는 식물체는 지속적으로 키워 종자를 수확하였고 (T₂ 종자), 상기 T₂ 종자를 25 μM glufosinate를 첨가한 1/2 MS 배지 (2.25 g/L MS salt, 10 g/L sucrose, 7 g/L Agar)에 파종하여 일주일간 키운 뒤 흙으로 이식하여 식물체를 수득하였다.

하기 실시예에서 음성 대조군으로 사용된 애기장대 유래의 야생형 PPO (Wild type AtPPO1)는 PPO 저해 제초제 감수성이 있으며 GenBank accession no. AX084732에 서열정보가 등록되어있다 (유전자의 염기서열을 서열번호 8, 아미노산 서열을 서열번호 7에 나타냄). 양성 대조군으로 상기 Wild type AtPPO1 의 아미노산 서열에서 Y426M (426번째 아미노산인 타이로신이 메티오닌으로 치환) 및 S305L (305번째 아미노산인 세린이 류신으로 치환)의 아미노산 치환이 발생한 Mutant AtPPO1 (AtPPO1 SLYM)를 사용하였다 (아미노산 서열을 서열번호 9에 나타냄) (Li et al. Development of protoporphyrinogen oxidase as an efficient selection marker for agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maize. Plant physiol. 2003 133:736-747).

상기 애기장대 형질전환체의 제작에 사용된 CyPPO 변이체를 다음의 표 12에 정리하였다:

CyPPO2 변이	Line No.	CyPPO4 변이	Line No.	CyPPO8 변이	Line No.
Y373M	32	Y375M	14	F363M	22
	34		31		51
	38				52
	39			F363V	1
	40				18
Y373V	34			F363L	1
Y373I	23				33
	34			A162L	1
Y373L	23				5
	43			A162C+V308M+F363M	46
Y373C	40				48
V318M+Y373I	1
	3
V173S+A175C+Y373M	3
	4
	51
	72
	84
A175C+V318M+Y373M	4
	8

5-2. 종자 발아

상기 제작된 CyPPO2의 Y373M 변이체, CyPPO4의 Y375M 변이체, 또는 CyPPO8의 F363M의 변이체가 삽입된 형질전환체 (각각 CyPPO2 Y373M 형질전환체, CyPPO4 Y375M 형질전환체, 및 CyPPO8 F363M 형질전환체) 중 1 μM tiafenacil 의 스프레이 처리 하에도 생존한 개체의 T₂ 세대 종자를 이용하여 tiafenacil 내성을 확인하였다. 이를 위하여, 70 nM tiafenacil이 함유된 1/2 MS 배지에 상기 얻어진 T₂ 애기장대 종자를 파종하였다. 50 nM tiafenacil 이 함유된 1/2 MS 배지에서 야생형 애기장대 (Col-0; Columbia-0 생태형)는 발아 장애가 관찰되고 느리게 발아하는 특성을 보였으나, 70 nM 함유된 1/2 MS 배지에서 Col-0는 정상 발아하지 못하고 사멸하였다. 따라서, 70 nM 에서 생존한다면 tiafenacil 에 대한 내성을 갖는 것으로 판단할 수 있다. 동시에 glufosinate (PPT)가 첨가된 배지에서 애기장대 종자를 파종하여 glufosinate 내성을 확인하였다.

상기 얻어진 결과를 도 32에 나타내었다. 도 32에 나타낸 바와 같이, CyPPO2 Y373M 형질전환체의 T₂ 세대 라인 중 32번, 34번과 38번 라인, CyPPO4 Y375M 형질전환체의 T₂ 세대 라인 중 14번과 31번 라인, 그리고 CyPPO8 F363M 형질전환체의 T₂ 세대 라인 중 22번, 51번 및 52번이 1 μM tiafenacil이 함유된 1/2 MS 배지에서도 발아하는 것을 확인하였다. 특히 CyPPO2 Y373M의 32번 라인 형질전환체는 5 μM tiafenacil 함유 1/2 MS 배지에서 발아하였다. 또한, 음성 대조군으로 사용된 야생형 애기장대 (Col-0) 종자는 70 nM tiafenacil이 함유된 1/2 MS 배지에서 발아하지 않았으며, 양성 대조군으로 사용된 Mutant AtPPO1 (AtPPO1 SLYM) 형질전환체는 1 μM tiafenacil이 함유된 1/2 MS 배지에서도 발아하는 것을 확인할 수 있다.

5-3. T ₂ 세대 종자에서 내성 형질 분리비의 확인

형질전환 애기장대가 세대를 진전하면서 삽입한 유전자의 분리비를 확인하고 동시에 제초제 내성 형질을 평가하였다. T₂ 종자를 대상으로 bar 유전자 삽입에 따른 PPT계 제초제 내성 개체와 감수성 개체의 분리비 (segregation ratio)를 라인 별로 판단하였다. 내성 대 감수성 개체의 비가 약 3:1을 보이면, 멘델의 법칙에 따라 트랜스유전자 (transgene)가 애기장대에 단일 카피 (single copy)로 삽입되어 분리 및 발현된 것으로 판단하였다.

상기 얻어진 결과를 표 13 내지 표 15에 나타내었다.

CyPPO2 형질전환체(T2)
변이	Line No.	Segregation ratio
Y373M	32	2.53:1
	34	3.21:1
	38	3.18:1
	39	3.17:1
Y373V	34	3.13:1
Y373I	23	2.70:1
	34	3.55:1
Y373L	5	2.7:1
	23	2.96:1
	43	3.3:1
Y373C	40	3.32:1
V318M+Y373I	1	2.95:1
	3	2.95:1
V173S+A175C+Y373M	3	3.27:1
	4	2.5:1
	72	3.08:1
	84	2.95:1
	51	3.32:1
A175C+V318M+Y373M	4	2.8:1
	8	2.57:1

CyPPO4 형질전환체(T2)
변이	Line No.	Segregation ratio
Y375M	14	2.53:1
	31	3:1

CyPPO8 형질전환체(T2)
변이	Line No.	Segregation ratio
F363M	22	3.08:1
	51	3.54:1
	52	3.04:1
F363V	1	2.52:1
	18	2.57:1
F363L	1	2.54:1
	33	2.77:1
A162L	1	2.5:1
	5	3.5:1
A162C + V308M + F363M	46	2.6:1
	48	2.59:1

표 13 과 같이, CyPPO2 변이 유전자 삽입 형질전환체의 아래 라인들은 트랜스유전자가 단일카피로 삽입된 것으로 판단하였다:

Y373M 변이체의 32번, 34번, 38번, 39번 라인, Y373V 변이체의 34번 라인, Y373I 변이체의 23번, 34번 라인, Y373L 변이체의 23번, 43번 라인, Y373C 변이체의 40번 라인, V318M+Y373I 변이체의 1번, 3번 라인, V173S+A175C+Y373M 변이체의 3번, 4번, 72번, 84번, 51번 라인, 및 A175C+V318M+Y373M 변이체의 4번, 8번 라인.

표 14 와 같이, CyPPO4 변이 유전자 삽입 형질전환체의 아래 라인들은 트랜스유전자가 단일카피로 삽입된 것으로 판단하였다:

Y375M 변이체의 14번, 31번 라인.

표 15 와 같이, CyPPO8 변이 유전자 삽입 형질전환체의 아래 라인들은 트랜스유전자가 단일카피로 삽입된 것으로 판단하였다:

F363M 변이체의 22번, 51번, 52번 라인, F363V 변이체의 1번, 18번 라인, F363L 변이체의 1번, 33번 라인, A162L 변이체의 1번, 5번 라인, 및 A162C+V308M+F363M 변이체의 46번, 48번 라인.

5-4. Modified CyPPO2 , 4, 8 유전자 도입 애기장대(T ₂ ) 대상 CyPPO 단백질 발현 조사

도입한 CyPPO2의 Y373M, CyPPO4의 Y375M 및 CyPPO8 F363M 유전자가 애기장대 형질전환체 (T₂)에서 발현되는지 판단하여 세대 진전 시 삽입 유전자의 발현이 유지되는지를 확인하였다. 형질전환체의 T₂ 세대 라인 별로 애기장대 형질전환체 잎 약 100 mg을 액체질소와 함께 마쇄한 후 단백질 추출버퍼 (0.05 M Tris-Cl pH7.5, 0.1 M NaCl, 0.01 M EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM DTT)를 첨가하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 애기장대 형질전환 벡터에 포함된 HA tag을 이용하여 PPO 단백질 양을 검출하고자 하였다. 이 후 전기영동하여 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane에 전이한 뒤 항-HA 항체 (Santa cruz)와 항-actin 항체 (loading control, 실험 단백질 양 비교; Abcam)를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 33에 나타내었다. 도 33에 나타낸 바와 같이, CyPPO2 Y373M 형질전환체와 CyPPO8 F363M 형질전환체는 유사한 PPO 변이체 발현을 보였으며, CyPPO4 Y375M 변이체는 CyPPO2 Y373M 변이체와 CyPPO8 F363M 변이체에 비해 PPO 변이체의 발현 수준이 낮았다.

상기 형질전환체 라인들을 한 세대 더 진전시켜 형질전환체 T₃ 세대 라인 별로 제초제를 처리하였다 (실시예 5-5 참조). 이는 발현된 도입 유전자들이 세대를 진전하면서 유지되고 제초제 내성을 부여함을 나타낸다.

5-5. 형질전환 애기장대의 제초제 내성 검증

CyPPO2, CyPPO4 및 CyPPO8의 아미노산 변이체 암호화 유전자의 식물 내 제초제 내성 형질과 그 수준을 판단하고자 각각의 유전자가 형질전환된 애기장대의 T₂ 세대 또는 T₃ 세대 식물체에 대하여 제초제 내성을 테스트하였다. 하기의 모든 제초제 처리 시험은 추대 직전 (이식 약 4주 경과 후)에 수행하였다. 각 제초제를 포함한 용액 100 ml을 40 x 60 cm (0.24 m²) 면적에 골고루 처리하였다.

CyPPO2 Y373M 변이체, CyPPO4 Y375M 변이체, 및 CyPPO8 F363M 변이체의 T₃ 세대에 tiafenacil, saflufenacil 및 fomesafen을 각각 처리하였다. Tiafenacil, saflufenacil 및 fomesafen 각 5 μM 을 각각 스프레이하였다.

스프레이 뒤 7일차 관찰 결과를 도 34 (tiafenacil 처리 결과), 도 35 (saflufenacil 처리 결과) 및 도 36 (fomesafen 처리 결과)에 나타내었다. 도 34 내지 도 36에 나타난 바와 같이, wild type Col-0 식물체는 모두 사멸하였고, 양성 대조군인 AtPPO1 MT (Mutant AtPPO1; "AtPPO1 SLYM"로 표시)와 실험군인 CyPPO2 Y373M 형질전환체의 38번, 39번 및 34번 라인, CyPPO8 F363M 형질전환체의 22번, 51번 및 52번 라인은 tiafenacil 5 μM, saflufenacil 5 μM 및 fomesafen 5 μM에서 모두 지속 생장을 나타냈다. CyPPO4 Y375M 형질전환체의 14번 라인은 saflufenacil 5 μM 및 fomesafen 5 μM에서 비교적 지속 생장을 나타냈다.

CyPPO2의 Y373C, Y373I, Y373L, Y373M 및 Y373V 변이 유전자가 각각 삽입된 형질전환 식물체의 T₃ 세대에 tiafenacil 25 μM 또는 saflufenacil 75 μM을 스프레이 하였다. 또한, CyPPO8의 F360L, F360V 및 A162L 변이 유전자가 각각 삽입된 형질전환 식물체의 T₃ 세대, 약 4주 자란 애기장대에 tiafenacil 25 μM 또는 saflufenacil 100 μM을 스프레이 하였다.

CyPPO2의 V318M+Y373I, V173S+A175C+Y373M 및 A175C+V318M+Y373M 변이 유전자가 삽입된 각각의 형질전환 식물체의 T₂ 세대에 tiafenacil 5 μM을 스프레이 하였다. 또한, CyPPO8의 A162C+V308M+F363M 변이 유전자가 삽입된 형질전환 식물체의 T₂ 세대에 tiafenacil 10 μM을 스프레이 하였다.

스프레이 뒤 7일차 관찰 결과를 표 16 (Injury index) 및 도 37 (CyPPO2 변이체; T₃ 세대(상단, 하단)/T₂ 세대(중간))과 도 38 (CyPPO8 변이체; T₃ 세대(상단, 중간)/T₂ 세대(하단))에 나타내었다.

Injury index

	Line No.	Tiafenacil	Saflufenacil
	농도	5 μM	5 μM
Col-0(Wild type)		5	5
CyPPO2		5	NT
CyPPO2 변이체(T3)		25 μM	75 μM
Y373M	40-4	2.5	NT
Y373C	40-3	2	1.5
Y373I	23-2	0	1
	34-2	0	0.75
Y373L	23-9	1.5	1.6
	43-1	1.5	3
Y373V	34-10	2	2
CyPPO2 변이체(T2)		5 μM	75 μM
V318M+Y373I	1	0	NT
	3	0	NT
V173S+A175C+Y373M	3	1.5	NT
	4	2	NT
	51	2	NT
	72	2	NT
	84	3	NT
A175C+V318M+Y373M	4	0	NT
	8	3	NT
CyPPO8		5	5
CyPPO8 변이체(T3)		5 μM	75 μM
F363M	22	0	NT
	51	0	NT
	52	0	NT
		25 μM	100 μM
F363L	33-7	1.5	2.5
	1-3	2.5	1.5
F363V	1-7	0.5	0
	18-1	0.5	0
A162L	1-6	3.4	4
	5-4	3.4	3.8
	5-7	3.9	3.8
CyPPO8 변이체(T2)		10 μM	100 μM
A162C + V308M + F363M	46	1	NT
	48	1	NT
CyPPO4 변이체		5 μM	5 μM
Y375M	14	4	2

NT: Not tested

상기 표 16의 Injury index는 다음의 표 17의 기준으로 평가하였다 (본 명세서에 제공된 Injury index에 동일하게 적용됨):

Injury index	증상
0	약해가 없음
1	잎 끝이 마른 상태
2	식물체의 20% 이상 30% 미만이 누렇게 마름
2.5	식물체의 30% 이상 50% 미만이 누렇게 마름
3	식물체의 50% 이상 70% 미만이 누렇게 마름
4	식물체의 70% 이상이 누렇게 마름
5	식물 전체가 말라서 죽음

표 16 및 도 37에 나타난 바와 같이, CyPPO2의 변이가 각각 도입된 형질전환 애기장대 모두 tiafenacil 5 μM 뿐 아니라 25 μM에서도 지속생장하였으며, saflufenacil 75 μM 에서도 지속생장하였다.

표 16 및 도 38에 나타난 바와 같이, CyPPO8의 변이가 각각 도입된 형질전환 애기장대는 tiafenacil 10 μM 뿐 아니라 25 μM에서 지속생장하였으며, saflufenacil 100 μM에서도 지속생장하였다.

또한 tiafenacil 또는 saflufenacil 외 제초제 (flumioxazin, sulfentrazone) 각 50 μM에서 CyPPO2의 Y373I 및 CyPPO8의 F363V 변이 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체 (T₃)의 저항성 수준을 확인하였다. AtPPO1의 SL+YM은 애기장대 PPO1의 S305L+Y426M 변이체를 의미하는 것으로, 본 시험에서 저항성 대조군 (Positive control)로 사용하였다. Tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, sulfentrazone을 각각 50 μM씩 처리하였으며, 7일 후 injury index 평가하였다. 상기 얻어진 결과를 도 45 및 표 18에 나타내었다. 참고로 tiafenacil의 분자량 (MW)은 511.87, saflufenacil 의 분자량은 500.85, flumioxazin 의 분자량 354.34, sulfentrazone 의 분자량은 387.18 이다. 각 제초제 50 μM 농도를 40 x 60 cm 면적 (0.24 m²) 에 100 ml씩 골고루 살포하였다. 환산한 처리 약량은 tiafenacil 은 106. 7 g ai/ha, saflufenacil 은 104.4 g ai/ha, flumioxazin 73.8 g ai/ha, sulfentrazone 은 80.7 g ai/ha 에 해당된다.

Injury Index

	AtPPO1 SLYM	CyPPO8 F363V	CyPPO2 Y373I
Tiafenacil	4	2	2
Saflufenacil	0-1	0-1	0-1
Flumioxazin	4-5	2	3
Sulfentrazone	0-1	0-1	0-1

도 45 및 표 18에 나타난 바와 같이, 제초제 저항성으로 알려진 애기장대 PPO1의 변이체 (AtPPO1 SLYM)과 비교하여 변이 유전자 형질전환체들의 저항성이 유사하거나 더 우수하였다.

Tiafenacil의 애기장대 사멸 농도가 약 0.8 μM인 것을 고려할 때, PPO 변이 유전자가 도입된 형질전환 애기장대가 0.8 μM 이상의 높은 농도에서 지속적인 생장을 나타낸 것을 통해, 이 유전자들이 실제 작물에 도입되어 우수한 제초제 내성을 나타낼 것임이 예상된다. 또한, tiafenacil 이외의 제초제의 경우에도, PPO 변이 유전자가 도입된 형질전환 애기장대가 애기장대 사멸 농도보다 현저히 높은 농도에서 지속적인 생장을 나타냄이 확인되었다.

5-6. 삽입 유전자의 후대 안정성 확인

본 시험은 애기장대 내 삽입한 유전자가 세대를 진전해도 안정적으로 유전되고 발현되는지 확인하기 위한 것이다.

CyPPO2의 Y373I 변이 유전자와 CyPPO8의 F363V 변이 유전자가 각각 삽입된 형질전환 애기장대를 T₄, 또는 T₅ 세대로 전개시켰다. CyPPO2 Y373I 형질전환체의 T₃ 라인 23-2, 23-7, 34-2과 CyPPO8 F363V 삽입 형질전환체의 T₃ 라인 1-7, 18-1, 18-7을 전개시켰다. 각 라인의 T₃ 세대에서부터 T₅ 세대까지 제초제 저항성이 유지되었으며, 이는 세대를 거치는 동안 도입 유전자가 안정적으로 전달됨을 의미한다.

구체적으로, 약 4주 자란 추대 전 애기장대 (T₄ 라인 및 T₅ 라인)를 대상으로 100 ml의 tiafenacil 15 μM 또는 saflufenacil 150 μM을 40 x 60 cm (0.24 m²)의 면적에 처리하였다. 제초제 처리 후 7일차에 제초제 약해 정도를 평가하였다. 상기 얻어진 결과를 도 46 (T₄ 라인) 및 도 47 (T₅ 라인)에 나타내었다.

또한, 유전자 발현을 확인하기 위하여, 형질전환체의 세대별, 라인별로 단백질을 추출하였다. Seedling 상태의 식물체 지상부를 액체질소를 이용하여 마쇄한 후 단백질 추출버퍼 (0.05 M Tris-Cl pH7.5, 0.1 M NaCl, 0.01 M EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM DTT)를 첨가하여 total protein을 추출하여 웨스턴블랏을 수행하였다. 애기장대 형질전환 벡터에 포함된 HA tag를 이용하여 삽입한 PPO 단백질 발현을 검출하였다. 추출한 단백질을 전기영동하여 PVDF membrane으로 전이한 후 항-HA 항체 (Santa cruz)를 이용하여 웨스턴블랏을 수행하였다. 상기 얻어진 결과를 도 48 (T₄ 라인) 및 도 49 (T₅ 라인)에 나타내었다.

도 46 내지 도 49에 나타난 바와 같이, T₄ 및 T₅ 세대까지 제초제 저항성 및 PPO 단백질 발현이 유지됨을 확인하였다. 구체적으로, tiafenacil 15 μM 또는 saflufenacil 150 μM 처리 시 negative control로 이용한 Col-0 (야생형 애기장대)의 경우 완전 사멸하는 반면, T₄ 및 T₅ 세대 형질전환체는 injury index 0 수준으로 저항성을 유지하고 있음 확인할 수 있다. 참고로, T₃ 세대에서 tiafenacil 25 μM 또는 saflufenacil 75 μM 처리 시 injury index 0~1 수준이었다. 상기 결과로부터, 세대를 진전하여도 삽입 유전자의 단백질 발현을 통한 제초제 저항성이 유지됨을 확인할 수 있다.

실시예 6. CyPPO 변이체를 이용한 벼 형질전환체 제작 및 PPO 저해 제초제 내성 시험

6-1. 벼 형질전환 벡터 제작 및 벼 형질전환체 제작

벼 형질전환을 위한 식물발현 벡터는 bar 유전자 (glufosinate 내성 유전자)의 ORF와 각각의 CyPPO2 또는 CyPPO8의 아미노산 변이 유전자의 ORF를 가진 이원벡터 (binary vector)를 제작하여 사용하였다. 각 유전자의 발현을 위해 pCAMBIA3301 벡터 (도 39 참조)를 이용하였다. bar 유전자의 발현을 위해 CaMV 35S 프로모터와 전사 종결을 위해 35S 터미네이터를 이용하였다.

CyPPO2 또는 CyPPO8의 변이 유전자 각각을 식물체에서 발현시키기 위하여 옥수수의 유비퀴틴 프로모터와 NOS 터미네이터를 사용하였다. 또한, 엽록체로 단백질의 이동과 발현을 유도하기 위해 CyPPO2 또는 CyPPO8의 변이 유전자와 함께 AtPPO1 유전자의 transit peptide (TP)를 삽입하였다.

상기에서 제작한 각각의 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) LBA4404 competent cell (Takara)에 전기충격 방법으로 도입하여 형질전환하였다.

상기 제조된 형질전환 Agrobacterium을 동진벼에 감염시켜 형질전환 벼를 제작하였다. 동진벼의 종자 껍질을 제거한 뒤 소독하고 N6D 배지에서 32 , 5일간 암배양한 후, 형질전환 Agrobacterium 용액에 벼 종자를 섞어 2N6-AS100 배지에 치상하였다. 이를 28 에서 1일간 암배양하고 23.5 에서 4일간 암배양하였다. N6D cf500 ppt4 배지 1 Liter에 phosphinotricin (Duchefa) 1 ml를 첨가한 배지에서에서 28, 10 일간 광배양하여 감염된 종자에서 형질전환 callus를 선발하였다. 선발된 callus는 REIII cf500 ppt4 배지 1 Liter에 phosphinotricin 1 ml를 첨가한 배지로 옮겨 식물체를 유도하여 순화 과정을 거친 후 토양으로 옮겨 생장시켰다.

상기 사용된 배지 조성을 아래의 표 19에 정리하였다:

배지명	성분	사용량
N6D	N6 powder	4 g
	Sucrose	30 g
	L-proline	2.878 g
	Casamino acid	0.3 g
	Myo-inositol	0.1 g
	2,4-Dichlorophenoxy (dissolve in ethanol)	2 mg
	Phytagel	4 g
	Distilled Water up to	1L (pH 5.8)
2N6-AS100	N6 powder	4 g
	Sucrose	30 g
	D-Glucose (Monohydrate)	10 g
	Casamino acid	0.3 g
	2,4-Dichlorophenoxy (dissolve in ethanol)	2 mg
	Phytagel	4 g
	Acetosyringone (20 mg/ml, dissolve in DMSO)	1 ml
	Distilled Water up to	1L (pH 5.2)
N6D cf500 ppt4	N6 powder	4 g
	Sucrose	30 g
	L-proline	2.878 g
	Casamino acid	0.3 g
	Myo-Inositol	0.1 g
	2,4-Dichlorophenoxy (2 mg/㎖ in ethanol)	1㎖
	Phytagel	4 g
	Cefotaxime sodium	500 mg
	Distilled Water up to	1L (pH 5.8)
REⅢ cf500 ppt4	MS vitamin powder	4.41 g
	Sucrose	30 g
	Sorbitol	30 g
	Casamino acid	2 g
	NAA (1 mg/㎖)	20㎕
	Kinetine	2 mg
	Myo-inositol	0.1 g
	Phytagel	4 g
	Cefotaxime sodium	500 mg
	Distilled Water up to	1L (pH 5.8)

6-2. 형질전환 벼 대상 PPO 저해 제초제 내성 검증

CyPPO2와 CyPPO8의 변이 유전자 형질전환 식물의 제초제 내성과 그 수준을 단자엽 작물 내에서 판단하고자 각각의 유전자가 형질전환된 동진벼의 T₀ 세대 식물체에 대하여 제초제 내성을 테스트하였다.

CyPPO2 Y373M 형질전환체와 CyPPO8 F363M 형질전환체의 T₀ 세대, 약 5주 자란 벼의 분얼을 취하여 별도의 식물체로 만든 후 tiafenacil과 saflufenacil을 각각 처리하였다. tiafenacil, saflufenacil 의 처리면적은 40 X 60 cm이고, tiafenacil은 200 μM, saflufenacil은 500 μM(33% acetone, 0.1% Tween20 용매) 농도 200 ml 을 사용하였으며, 이를 환산하면 tiafenacil의 처리량은 853 g ai/ha, saflufenacil의 처리량은 2,087 g ai/ha가 된다. 참고로 tiafenacil의 잡초방제를 위한 권장 처리 약량은 약 150 g ai/ha이고, saflufenacil의 잡초방제를 위한 권장 처리 최대 약량은 145 g ai/ha미만이다. 상기 제초제는 모두 스프레이 방식으로 처리하였다.

CyPPO2 Y373M 형질전환체와 CyPPO8 F363M 형질전환체 T₀ 세대에서 세대를 진전하였고 T₂ 식물체를 파종하였다. 파종 후 47일차에 처리면적 40 X 60 cm에 각각 tiafenacil 200 μM, saflufenacil 400 μM 농도 100 ml 을 스프레이하였다. 이를 환산하면 tiafenacil 처리량은 420 g ai/ha, saflufenacil 처리량은 840 g ai/ha 이다. 스프레이 뒤 7일차 관찰 결과를 도 40 (CyPPO2 Y373M T₀ 형질전환체 1, 3번 라인 및 CyPPO8 F363M T₀ 형질전환체 2, 3번 라인의 tiafenacil 및 saflufenacil 처리 결과), 도 41 (CyPPO2 Y373M T₂ 형질전환체 3번 라인 및 CyPPO8 F363M T₂ 형질전환체 3번 라인의 tiafenacil 및 saflufenacil 처리 결과)에 각각 나타내었다. 도 40 에서 "non-GM"은 형질전환되지 않은 야생형 동진벼로서 음성 대조군으로 사용되었다.

도 40, 및 도 41에 나타난 바와 같이, 음성대조군인 야생형 동진벼에서는 tiafenacil 및 saflufenacil 처리에 의하여 심각한 약해가 발생하였다. 반면, CyPPO2 Y373M 형질전환체 ("CyPPO2 Y373M"으로 표시)의 T₀ 세대 2개 라인 (1번 및 3번)과 이의 T₂ 자식세대 (3-1)를 관찰한 결과 tiafenacil 420 g ai/ha 또는 853g ai/ha와 saflufenacil 840 g ai/ha 또는 2,087 g ai/ha의 처리군 모두에서 약해가 관찰되지 않거나 야생형 동진벼와 비교하여 미약한 약해가 관찰되었다. CyPPO8 F363M 형질전환체 ("CyPPO8_F363M"으로 표시)의 2개 라인 (2번 및 3번)과 이의 T₂ 자식세대 (3-1)를 관찰한 결과, tiafenacil 420 g ai/ha 또는 853 g ai/ha 또는 saflufenacil 840 g ai/ha 또는 2,087 g ai/ha을 처리했을 때 모든 처리구에 약해가 관찰되지 않았다.

모든 CyPPO2 Y373M의 형질전환체 및 CyPPO8 F363M의 형질전환체 벼가 tiafenacil과 saflufenacil 의 각 잡초 권장 방제량 이상 농도 처리에서 내성이 있었다. 그리고 세대를 진전해도 내성이 유지됨을 보여 삽입된 유전자가 세대를 지나도 안정적으로 유전되어 발현되는 것을 알 수 있다.

6-3. 형질전환 벼 단백질 발현 검증 및 방법

CyPPO2 Y373M 형질전환체 및 CyPPO8 F363M 형질전환체에서 변이 단백질 (CyPPO2 Y373M 또는 CyPPO8 F363M)이 발현되는지 확인하기 위해서 각 형질전환체 라인별로 잎에서 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.

이를 위하여, 각 형질전환체의 잎 조직에 추출 버퍼 (Extraction buffer; 50 mM Tris-Cl, pH7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% NP-40) 5 ml buffer/g cell, 샘플 버퍼 (beta-mercaptoethanol 2 ㎕/10 ml, DTT 1 mM, MG132, NaF), 및 Protease inhibitor (Xpert Protease Inhibitor Cocktail Solution, GenDepot)를 첨가하고, 100 ℃에서 5분간 끓인 후, 4 ℃에서 5분간 원심분리 (20,000 xg)하였다. 상층액 20 ㎕를 SDS-PAGE gel에 로딩한 후, SDS-PAGE gel에서 PVDF 멤브레인으로 단백질을 transfer하였다. 각 단백질에 특이적인 antibody로 표지시켜 주었다 (CyPPO2 Y373M 형질전환체는 CyPPO2 Specific antibody, CyPPO8 F363M 형질전환체는 CyPPO8 antibody를 이용함; Genscript) 를 1:1,000 비율로 첨가하여 반응시켰다. ECL 발색시약과 Luminograph를 이용하여 단백질 발현을 확인하였다.

상기 얻어진 이미지를 도 42 (CyPPO2 Y373M 발현) 및 도 43 (CyPPO8 F363M)에 나타내었다. 도 42 및 도 43에 나타낸 바와 같이, tiafenacil과 saflufenacil에 내성이었던 CyPPO2 Y373M 형질전환체의 1번, 3번 라인, CyPPO8 F363M 형질전환체의 2번, 3번 라인에서 모두 도입 유전자 단백질이 검출되었다.

6-4. 형질전환 벼의 삽입 유전자 copy number 분석

CyPPO8 F363M 형질전환체에서 변이 유전자 존재 여부를 확인하기 위해서 각 형질전환체 라인별로 잎에서 DNA를 추출하여 southern blotting을 수행하였다.

CTAB Buffer 방법을 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 구체적으로, 액체질소로 얼려진 상태에서 막자와 막자사발을 이용하여 상기 형질전환 벼의 잎 조직을 미세하게 갈아준 뒤, 5 ml/g tissue DNA isolation buffer (2% (w/v) CTAB, 1.5 M NaCl, 25 mM EDTA, 0.2% (v/v) beta-Mercaptoethanol, 100 mM Tris-Cl (pH 8.0))를 넣고 vortexing하였다. 60 에서 1시간 이상 가열한 뒤, chloroform:isoamyl alcohol (24:1) 을 1 volume 첨가하고 inverting 하여 섞어주었다. 7000 xg 및 4 조건에서 10분간 centrifuge 한 뒤, 상층액을 새 튜브로 옮기고 2.5 volume 에탄올을 섞어주었다. 5000 xg 및 4 ℃ 조건에서 5분간 centrifuge 한 뒤, 상층액을 버리고 pellet 을 TE buffer (LPSS)로 녹여주었다. 20 ㎍/ml RNase A (Bioneer)를 첨가한 뒤 37 ℃에서 30분간 incubation 하였다. 1 volume 의 phenol:chloroform(1:1) 를 넣고 섞어준 뒤, 10000 xg 및 4 ℃ 조건에서 10분간 centrifuge 하고, 상층액을 새 튜브에 옮긴 뒤 1 volume chloroform:isoamyl alcohol(24:1) 을 넣고 섞어주었다. 10000 xg 및 4 ℃ 조건에서 10분간 centrifuge 하고 상층액을 새 튜브로 옮긴 뒤, 0.1 vol NaOAc(pH 5.2), 2 volume 에탄올을 첨가하고 섞어주었다. 5000 xg 및 4 ℃ 조건에서 5분간 centrifuge 하고 수득한 pellet을 70% 에탄올로 washing 하였다. Air dry 한 뒤 적정량의 TE buffer 로 genomic DNA 를 녹였다.

상기 추출된 DNA 10~40 ㎍을 EcoRI (Enzynomics)를 이용하여 12시간 이상 digestion 하였다.

그 후, 다음의 조건으로 Agarose gel 0.8% (w/v) 전기영동 (50 V) 후, gel treatment를 수행하였다:

1)depurination: 0.25 N HCl, 15분 shaking

2)denaturation: 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl, 30분 shaking

3)neutralization: 0.5 M Tris-Cl (pH 7.5), 1.5 M NaCl, 20분 shaking

그 후, capillary transfer 방법을 이용하여 gel 내 DNA 조각을 nitrocellulose membrane (GE Healthcare)에 옮긴 후, UV crosslinker (UVC-508; ULTRA LUM Inc.)를 이용하여 cross linking 수행하였다.

다음의 방법으로 혼성화 (hybridization)를 수행하였다: 상기 nitrocellulose membrane을 DIG Easyhybridization solution (Roche)에서 42 ℃에서 3시간 동안 incubation하였다. 그 후, 새로운 DIG Easyhybridization solution으로 교체한 후 probe를 넣어주고, 42 ℃에서 12시간 이상 반응시켰다.

상기 probe (DIG labelling 된 CyPPO8-M probe)는 다음의 조건으로 PCR을 수행하여 제작하였다:

재료

Template (CyPPO8 plasmid DNA) 0.5 ㎕

10X buffer 3 ㎕

DIG-dNTP 2 ㎕

forward primer (10 μM) 3 ㎕

reverse primer (10 μM) 3 ㎕

DDW 18 ㎕

e-taq polymerase (Solgent 社) 0.5 ㎕

총 30 ㎕

프라이머

Forward primer for CyPPO8 F363M probe: GCGTTAACGGGTGCATTAGGC (서열번호 158)

Reverse primer CyPPO8 F363M probe: TGGAAAGAGTGTTGAACTCC (서열번호 159)

상기 얻어진 PCR product 를 agarose gel에 전기영동 후 probe band 를 gel extraction 하여 사용하였다.

상기 반응된 membrane에 대하여 low stringency washing (2X SSC, 0.1% SDS)과 high stringency washing (0.5X SSC, 0.1% SDS)을 수행하였다. 다음의 조건으로 DIG detection을 수행하여 밴드를 확인하였다:

1) 상기 Membrane을 blocking buffer (Roche)에 넣고 30분간 shaking

2) DIG antibody (anti-digoxigenin-AP Fab fragments, Roche)를 넣고 30분간 shaking

3) washing buffer (Roche)에서 15분간 shaking

4) detection buffer (Roche)를 넣고 3분간 shaking

5) CDP-Star, ready-to-use (Roche)를 membrane에 도포한 후 x-ray film에서 band를 현상.

상기 얻어진 결과를 도 44에 나타내었다. CyPPO8 F363M 3번 라인에서 하나의 밴드가 확인되었고, 이는 CyPPO8 F363M 유전자가 단일 카피(single copy)로 삽입되었음을 의미한다.

실시예 7. CyPPO 변이체를 이용한 콩 형질전환체 제작 및 PPO 저해 제초제 내성 시험

7-1. 콩 형질전환체 제작

CyPPO2 Y373M 및 CyPPO8 F363M 유전자를 콩 식물체에 각각 발현시켜 tiafenacil 저항성을 부여하기 위한 형질전환용 벡터를 제작하였다.

애기장대 형질전환시 이용한 벡터 (도 31 참조)를 template로 하여 애기장대 PPO1 유전자의 transit peptide가 결합된 CyPPO2 Y373M 및 CyPPO8 F363M 유전자를 각각 PCR로 분리하였다.

PCR 반응액은 template (애기장대 형질전환시 이용한 벡터) 1 ㎕ (microliter), 10X buffer 5 ㎕, dNTP mixture (각 10 mM) 1 ㎕, TOPO-cTP_F primer (10 μM) 1 ㎕, TOPO-CyPPO2_R 또는 TOPO-CyPPO8_R primer (10 μM) 1 ㎕, DDW 40 ㎕, 및 Pfu-X (Solgent, 2.5 unit/㎕) 1 ㎕을 포함하는 반응액 50 ㎕ 으로 구성하였고, 94 ℃에서 4분간 반응한 후, 25 cycles (94 ℃ 에서 30초, 56 ℃ 에서 30초 및 72 ℃ 에서 1.5분) 반복하고, 72 ℃ 에서 5분 반응하여 증폭하였다.

이 때 사용된 프라이머를 아래 표 21에 정리하였다:

프라이머	서열
TOPO-cTP_F	CAC CAT GGA GTT ATC TCT TC (서열번호 160)
TOPO-CyPPO2_R	TCA GAT CGA TCG AGT ATC TG (서열번호 161)
TOPO-CyPPO8_R	TTA ACC CAA ATA ATC TAA CA (서열번호 162)

pENTR Directional TOPO cloning kits (Invitrogen)를 이용하여 pENTR-TOPO 벡터 (Invitrogen)에 각 증폭한 product를 클로닝하고 (도 50 참조), DH5 alpha competent cell (Invitrogen)에 형질전환하였다.

이와 같이 제작된 Entry vector를 이용하여 식물형질전환용 벡터인 pB2GW7.0 binary vector 에 클로닝하였다. 상기 클로닝은 Gateway LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen) 키트를 이용하여 수행하였다. CyPPO2 Y373M 또는 CyPPO8 F363M 유전자가 삽입된 pENTR/D-TOPO vector와 pB2GW7.0 plasmid, TE buffer, 및 LR Clonase II enzyme mix를 섞어준 뒤, 25 ℃에서 1시간동안 반응시켰다. 상기 얻어진 반응물에 Proteinase K solution (Invitrogen)을 첨가한 뒤 37 ℃에서 10분간 반응시키고 DH5 alpha competent cell 에 형질전환 하였다.

상기와 같이 제작한 각 벡터를 이용하여 Agrobacterium EHA105 (Hood et al., New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants (EHA105). Trans Res. 1993 2:208-218)를 electro-transformation 방법을 이용하여 콩 형질전환체를 제작하였다.

상기 콩 형질전환체 제작은 광안콩을 이용하여 수행하였다. 멸균한 3차수에 침지해 놓은 종자의 양 떡잎 사이로 외과용 메스 (Scapel)를 넣어 하배축까지 수직으로 자르고 종피를 제거하였다. 배축을 떡잎 밑 약 1 ㎝되는 곳에서 자른 후 embryonic axis가 붙어있는 한 쪽을 외과용 메스 (＃11 blade)로 7, 8회 정도 상처를 내었다. 대략 50개 정도의 절편체를 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105 와 혼합 후, 초음파 처리 (sonication)를 20초 간 한 뒤, 30분 동안 접종시켰다. 각각의 절편체를 멸균한 여과지 위에 놓고 물기를 제거한 뒤, 고체 CCM (Co-cultivation medium; 0.32 g/L Gamborg B5, 4.26 g/L MES, 30 g/L Sucrose, 0.7% Agar)에도 여과지를 한 장 깔고 10개체를 올려두었다. 이때 절편체의 향축 (adaxial) 부분이 아래로 향하도록 두었다. Micropore surgical tape 으로 봉한 뒤 25 ℃ 및 18시간 광주기 조건에서 5일 동안 공배양 하였다.

5일간 공배양을 한 후에, 제균을 위해서 액체 1/2 SIM 배지 (shoot induction medium; B5 salt 3.2 g/L, BA 1.67 ㎎/L, MES 3 mM, agar 0.8% (w/v), Sucrose 3% (w/v), cefotaxime 250 ㎎/L, vancomycin 50 ㎎/L, ticarcillin 100 ㎎/L, pH 5.6)에 10분 동안 세척하였다. 각각의 절편체를 여과지 위에 놓고 물기를 제거한 뒤 선발항생제가 없는 SIM에 한 플레이트 (plate)당 6개체씩 배축 부분이 배지에 고착되고 재분화 될 부분이 30도 정도의 각도로 위로 향하도록 치상하였다. 각각의 플레이트를 micropore surgical tape로 봉한 뒤 25 ℃ 및 18시간 광주기 조건에서 배양하였다.

2주 후 신초가 나온 절편체를 선발항생제 PPT (phosphinothricin) 10 ㎎ /L가 들어있는 SIM-1 (SIM에 DL-phosphinothricin 10 ㎎/L 첨가, pH 5.6)에 치상하였는데, 이 때 신초를 제외한 나머지 부분은 잘라버리고 향축 (adaxial) 부분이 밑으로 향하도록 치상하였다.

2주 후 갈변한 신초/신초 pad는 외과용 메스 (＃15 blade)로 깎아 선발항생제 PPT 5 ㎎ /L가 들어있는 SEM (shoot elongation medium, 신초 신장 배지; MS salt 4.4 g/L, MES 3 mM, GA3 0.5 ㎎/L, asparagine 50 ㎎/L, pyroglutamic acid 100 ㎎/L, IAA 0.1 ㎎/L, zeatin 1 ㎎/L, sucrose 3% (w/v), agar 0.8% (w/v), cefotaxime 250 ㎎/L, vancomycin 50 ㎎/L, ticarcillin 100 ㎎/L, DL-phosphinothricin 5 ㎎/L, pH 5.6)에 치상하였다. 2주마다 새로운 SEM으로 옮겨주면서 신초의 갈변부위는 외과용 메스 (＃15 blade) 윗면으로 쳐서 제거하고 신초 pad는 조금씩 계속 깎아내어 배지가 잘 흡수되도록 하였다.

SEM에서 선발을 거치면서 신장된 신초가 4 cm 이상 일 때, 외과용 메스 (#11 blade)로 잘라 RIM (root induction medium, 뿌리 유도 배지; MS salt 4.4 g/L, MES 3 mM, sucrose 3%, agar 0.8%, cefotaxime 50 ㎎/L, vancomycin 50 ㎎/L, ticarcillin 50 ㎎/L, asparagine 25 ㎎/L, pyroglutamic acid 25 ㎎/L, pH 5.6)으로 옮겼다. 이 때 분리해낸 신장된 신초의 밑 부분을 1 ㎎/mL 농도의 IBA (Indole-3-butyric acid)에 3분 동안 담가두었다가 꺼내어 RIM이 들어있는 테스트 튜브에 넣었다.

뿌리가 충분히 자라게 되면 3차 증류수로 배지를 씻어내고 상토 (바이오 프러그 2호, 팜한농)와 버미큘라이트를 2:1 (v/v)로 섞어 넣은 작은 포트 (6 ㎝ x 6 ㎝ x 5.6 ㎝) 에 심었다. 10일 정도 경과 후 잎 표면에 100 ㎎/L DL-phosphinothricin로 leaf painting 하였다. 10 일 후, 식물체에 basta (BAYER, 53 ㎎/L) 처리를 하여 저항성 개체를 선발하였다.

7-2. 형질전환 콩 내 삽입 유전자 수 확인

CyPPO2 Y373M 변이 유전자 삽입 형질전환 콩 T₀ 식물체 (12, 14, 16, 24, 25, 27, 28, 34, 41번 라인) 및 CyPPO8 F363M 변이 유전자 삽입 형질전환 콩 T₁ 식물체 (3, 5, 7, 9, 11, 14, 17, 36, 44번 라인)에 대하여 삽입 유전자 수를 확인하기 위하여, 각 식물체의 잎 250 mg 에서 실시예 6-4를 참고하여 CTAB 방법으로 genomic DNA를 추출하였다.

상기 추출된 DNA 10~40 ㎍에 대하여 EcoRI (Enzynomics)를 이용하여 12시간 이상 digestion 을 수행하고 실시예 6-4의 방법으로 southern blotting을 수행하였다.

혼성화를 위한 DNA probe는 애기장대 형질전환시 사용한 벡터를 template로 하여 bar 유전자의 일부 서열에 Digoxigenin이 labeling 되도록 PCR 하여 제작하였다. PCR 반응액은 template (애기장대 형질전환시 이용한 벡터) 0.5 ㎕ (microliter), 10X buffer 5 ㎕, DIG-dNTP mixture (dATP, dCTP, dGTP 각 0.5 mM, dTTP 0.32 mM, DIG-11-dUTP 0.18 mM) 10 ㎕, Forward primer (100 μM) 0.5 ㎕, Reverse primer (100 μM) 0.5 ㎕, DDW 33 ㎕, 및 e-taq (Solgent, 2.5 unit/㎕) 0.5 ㎕을 포함하는 반응액 50 ㎕ 으로 구성하였고, 94 ℃ 에서 4분간 반응한 후, 35 cycles (94 ℃에서 30초, 56 ℃에서 30초 및 72 ℃에서 30초) 반복하고, 72 ℃에서 5분 반응하여 증폭하였다.

bar probe primer

Forward primer for bar probe 5'- TTC CGT ACC GAG CCG CAG GA -3' (서열번호 163)

Reverse primer for bar probe 5 '- CGT TGG GCA GCC CGA TGA CA -3' (서열번호 164)

비교를 위하여, negative control로 형질전환하지 않은 광안콩의 genomic DNA(WT)를 이용하였다.

상기 얻어진 결과를 도 51에 나타내었다. 도 51에서 필름상에 나타나는 밴드의 수가 삽입된 유전자의 수를 의미한다. 형질전환하지 않은 광안콩 (WT)의 경우 밴드가 확인되지 않았으며, 하나의 외래 유전자가 광안콩의 genome에 삽입된 형질전환체는 CyPPO2 Y373M 형질전환 콩의 14, 25, 34, 41번 라인과 CyPPO8 F363M 형질전환 콩의 3, 5, 7, 11, 14, 17번 라인임을 확인할 수 있다.

이하, 상기 확인된 single copy 삽입 형질전환체 라인을 이용하여 제초제 저항성 평가 및 식물체 내 삽입 유전자의 단백질 발현 확인을 수행하였다.

7-3. 형질전환 콩 대상 제초제 저항성 검증

CyPPO2 Y373M과 CyPPO8 F363M가 각각 도입된 형질전환 콩의 제초제 내성 수준을 판단하고자 각 유전자가 형질전환된 광안콩 T₂ 세대에 제초제를 처리하였다

콩 식물체 (V2~3 Stage)에 20 μM tiafenacil 또는 150 μM, 300 μM saflufenacil 을 각각 스프레이 처리하였다. 40 X 60 cm 면적에 상기의 농도로 제초제가 포함된 용액 100 ml을 골고루 스프레이하여 5일 후 식물체의 상태를 평가하였다. 상기 사용된 제초제 농도를 양으로 환산하면 tiafenacil 42 g ai/ha, saflufenacil 315 g ai/ha, 630 g ai/ha이다.

형질전환되지 않은 광안콩 (광안콩으로 표시함)을 음성 대조군으로 하여, 형질전환체의 제초제 처리 후 변화와 비교하였다.

상기 얻어진 결과를 도 52에 나타내었다. 도 52에 나타난 바와 같이, 형질전환되지 않은 광안콩은 각 제초제에 의해 injury level 9 정도로 사멸한 반면, CyPPO2 Y373M 또는 CyPPO8 F363M 형질전환 콩 T₂ 세대 개체의 경우에는, tiafenacil 20 μM을 처리했을 때 injury level은 1~3 정도이며, CyPPO2 Y373M에 saflufenacil 150 μM을 처리했을 때 injury level은 0, CyPPO8 F363M에 saflufenacil 300 μM을 처리했을 때 injury level은 1 이었다. 상기 injury level은 다음의 기준으로 판단하였다:

상기 결과는 야생형 광안콩은 각 제초제에 의해 사멸한 반면, 형질전환체는 tiafenacil에는 약한 약해를 보이고, saflufenacil에는 거의 약해를 보이지 않음을 알 수 있다. 참고로, CyPPO2 Y373M 의 tiafenacil IC₅₀ 은 250nM, saflufenacil IC₅₀ 은 5,000nM 이고 CyPPO8 F363M 의 tiafenacil IC₅₀ 은 183nM, saflufenacil IC₅₀ 은 5,000nM 이다 (표10~11)

7-4. 형질전환 콩의 단백질 발현 검증

콩의 CyPPO2 Y373M 형질전환체 및 CyPPO8 F363M 형질전환체에서 삽입된 각각의 외래 유전자가 정상적으로 발현되어 단백질을 생산하는지 확인하였다. 이 확인 결과는 삽입한 유전자의 단백질 발현으로 인해 형질전환체의 제초제 저항성이 부여됨을 입증할 수 있다.

단백질 발현을 확인하기 위하여, 각 형질전환체 (T₁)에서 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. 각 형질전환체의 잎 일부를 액체질소와 함께 마쇄한 후 단백질 추출버퍼 (0.8% SDS, 4% glycerol, 2% beta-mercaptoethanol, 0.0008% bromophenol blue, 0.125 M Tris-Cl, pH 7.4)를 첨가하여 total protein을 추출하였다.

추출한 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 후 PVDF membrane으로 trasfer하였다. 단백질이 trasfer 된 membrane을 각 삽입 단백질에 특이적인 antibody로 표지시켜 주었다 (CyPPO2 Y373M 형질전환체는 CyPPO2 Specific antibody, CyPPO8 F363M 형질전환체는 CyPPO8 antibody를 이용함; Genscript).

상기 얻어진 웨스턴 블랏 결과를 도 53에 나타내었다. 도 53에 나타난 바와 같이, 각 형질전환체 라인의 개별 개체를 각 삽입 유전자 발현 단백질의 특이적인 antibody를 이용하여 detection 한 결과, 모든 개체에서 삽입 유전자로 인한 단백질이 발현되었음을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 형질전환체 내에서 삽입한 유전자가 정상적으로 발현되기 때문에 제초제 저항성 특성이 나타남을 제안한다.

실시예 8. CyPPO 변이체를 이용한 유채 형질전환체 제작 및 PPO 저해 제초제 내성 시험

8-1. 유채 형질전환체 제작

실시예 5-1에서 제작한 CyPPO8 F363M 유전자가 삽입된 벡터 (도 31 참조)를 이용하여 유채 형질전환체 제작에 이용하였다. 유채 종자를 70% (v/v) 에탄올에 4분간 침지한 후, 1.3% (v/v) 차아염소산 나트륨 용액을 넣고 30분간 소독하였다. 멸균수로 5회 세척한 다음, 멸균된 여과지 위에서 수분을 제거하고 멸균된 종자는 MSO 배지 (MS powder 4.43 g/L, sucrose 30 g/L, phytagel 3 g/L, pH 5.8)에 치상한 후 25±1 ℃가 유지되는 배양실에서 16시간 명배양 (25,000 Lux) 조건에서 5일간 배양하였다.

CyPPO8 F363M 유전자가 삽입된 벡터로 Agrobacterium GV3101 를 형질전환시킨 후, spectinomycin (100 mg/L)과 rifampicin (50 mg/L)이 첨가된 LB배지에 접종하여 28 ℃가 유지되는 진탕 배양기에서 최소 16시간 이상 배양하였다. 유채의 유식물체 조직과 Agrobacterium을 3일간 (암조건, 25±1 ℃) 공동배양한 후, 선발배지 (4.43 g/L MS powder, 20 g/L sucrose, 0.2 mg/L NAA, 8 μM TDZ, 0.01 mg/L GA3, 50 μM silver thiosulfate, 10 mg/L PPT, 500 mg/L carbenicillin, 4 g/L phytagel, pH 5.8)로 옮겨서 25±1 ℃ 환경의 배양실에서 16시간 명배양 조건 하에서 배양하였다.

접종한 식물체는 2주 간격으로 계대배양을 하고 캘러스를 거쳐 재분화된 줄기는 뿌리유기배지 (MS salt 4.43 g/L, sucrose 30 g/L, phytagel 3 g/L, activated charcoal 3 g/L, pH 5.8)로 옮겨 뿌리를 유기하였다.

뿌리가 생성된 소식물체를 지피포트에 옮겨 식물체를 생장시킨 후 잎을 절단하여 형질전환체 여부를 확인하였다.

8-2. 형질전환 유채 대상 제초제 저항성 검증

유채 형질전환체 (T₁) 및 영산 유채 (야생형 유채, 대조군) 종자를 50% (w/v) 차아염소산 나트륨으로 30분간 소독 후, 멸균수로 5회 세척한 다음, 선발배지 (1/2MS, tiafenacil 50 nM, pH 5.8)에 파종하고, 야생형 유채는 1/2MS 배지에 파종하였다. 7일 후 생존한 개체를 화분에 이식하여 식물배양실 (25±1 ℃, 16 h light/8 h dark)에서 배양하였다. 이식 35일 후, 10 μM tiafenacil 및 10 μM saflufenacil을 각각 화분이 놓인 트레이 (40 x 60 cm, 0.24 cm²)당 100 mL (0.05% Silwet L-77) 씩 스프레이 처리하였다.

상기 제초제 처리 전과 처리 7일 후의 결과를 도 54 (tiafenacil 처리 결과) 및 도 55 (saflufenacil 처리 결과)에 나타내었다. 도 54 및 도 55에서, 야생형 영산 유채는 "영산"으로 표시하였다.

또한, 제초제 처리 7일 후, 약해 정도를 Injury Index 0-5 (약해 없음-사멸; 표 17 참조)로 평가하여 아래의 표 23에 나타내었다:

	10 μM Tiafenacil	10 μM Saflufenacil
WT	4	4
CyPPO8 F363M 2-4	2	NT
CyPPO8 F363M 2-7	2	NT
CyPPO8 F363M 2-8	1	NT
CyPPO8 F363M 2-6	NT	0
CyPPO8 F363M 2-9	NT	0
CyPPO8 F363M 2-10	NT	0

(NT: Not tested)

표 19에, 영산 (야생형 유채, 대조군)은 제초제 처리시 4 수준으로 사멸에 가까운 약해를 보이는 반면, 형질전환 유채는 라인별로 정도의 차이는 있으나 전체적으로 저항성을 보이는 것으로 나타났다. 구체적으로, CyPPO8 F363M-2 라인은 10 μM tiafenacil에 대한 약해 지수가 1-2 정도로 확인되었다 (도 54). 또한, 10 μM saflufenacil에 대해서, CyPPO8 F363M-2 라인은 약해가 없었다 (도 55).

8-3. 형질전환 유채의 단백질 발현 검증

CyPPO8 F363M 변이 유전자 형질전환 유채 내에서 삽입 유전자의 발현 확인하고 유전자의 발현과 제초제 저항성 발현 사이의 관계를 확인하였다.

형질전환 유채의 2번 라인에서 제초제 저항성을 확인한 5개체 (2-1, 2-2, 2-6, 2-9, 2-10)를 선정하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.

각 식물체의 잎 약 200 mg을 액체질소와 막자를 이용하여 마쇄한 뒤, 0.8 mL phenol (Tris-buffered, pH 8.0)과 0.8 mL dense SDS buffer (30% (w/v) sucrose, 2% (w/v) SDS, 0.1 M Tris-Cl, pH 8.0, 5% (v/v) beta-mercaptoethanol)을 넣고 30초간 vortex 하여 섞고, 10,000 xg에서 3분간 원심분리였다. 상층액을 새 튜브로 옮기고, 옮긴 시료의 5배 량의 메탄올 (4 ℃, 0.1 M ammonium acetate 포함)을 넣어 잘 섞은 후, -20 ℃에서 30분간 방치하였다. 10,000 xg에서 5분간 원심분리 하여 단백질을 침전시키고, 1 mL 메탄올 (4 ℃, 0.1 M ammonium acetate 포함)로 두 번, 80% 아세톤 (4 ℃)으로 두 번 씻은 뒤, 건조시켰다. 상기 얻어진 건조된 단백질은 2% (w/v) SDS buffer (50 mM Tris-Cl, pH 6.8, 1 mM DTT)로 용해시켰다.

형질전환 벡터는 CyPPO8 F363M 단백질 뒤에 hemagglutinin (HA)이 부착되어 발현되도록 구성되어 있으므로 (실시예 5-1 참조), CyPPO8 F363M 단백질을 확인하기 위해, 상기 얻어진 단백질을 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane에 전이한 뒤 HA antibody (Santa cruz)를 이용하여 웨스턴블랏을 수행하였다.

상기 얻어진 단백질에 대한 웨스턴블랏 결과를 도 56 상단에 나타내었다. 도 56 상단에 나타난 바와 같이, CyPPO8 단백질은 영산 (야생형 유채, 대조군)을 제외한 모든 개체에서 발현되는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 삽입 유전자의 단백질 발현으로 인해 제초제 저항성이 유도됨을 보여주는 것이라고 할 수 있다.

추가적으로, 상기 웨스턴블랏 분석에 이용한 PVDF membrane을 쿠마시 블루로 염색한 결과를 도 56 하단에 나타내었다. 도 56 하단에 나타난 바와 같이, SDS-PAGE에 사용한 각 시료의 단백질 양이 거의 차이가 없음을 확인할 수 있다.

<110> FarmHannong Co., Ltd. <120> Protoporphyrinogen Oxidase Variants and Methods and Compositions for Conferring and/or Enhancing Herbicide Tolerance Using the Same <130> DPP20174891KR <150> KR 10-2016-0075357 <151> 2016-06-16 <160> 164 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 486 <212> PRT <213> Oscillatoria nigroviridis PCC 7112 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(486) <223> CyPPO2 <400> 1 Met Glu Leu Leu Asp Thr Leu Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Leu 1 5 10 15 Ser Leu Ala His Ala Leu His Lys Glu Ala Thr Ser Ala Ser Pro Leu 20 25 30 Lys Ile Leu Val Ala Glu Ser Gln Gly Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr 35 40 45 Thr Val Thr Ala Glu Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe 50 55 60 Ser Pro Thr Pro Glu Leu Met Lys Leu Ala Val Asp Val Gly Leu Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Ile Phe Ala Asp Arg Lys Leu Pro Arg Phe Val Tyr Trp 85 90 95 Glu Asn Lys Leu Gln Pro Val Pro Met Thr Pro Pro Ala Met Ile Gln 100 105 110 Ser Gln Leu Leu Ser Phe Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Phe Gly Ala 115 120 125 Leu Gly Phe Val Ala Pro Ala Met Gly Asp Arg Leu Ser Gln Gln Gly 130 135 140 Asn Glu Glu Thr Val Ser Gln Phe Phe Arg Arg His Leu Gly Thr Glu 145 150 155 160 Val Met Gln Arg Leu Val Glu Pro Phe Val Ser Gly Val Tyr Ala Gly 165 170 175 Asp Pro Gln Gln Leu Ser Ala Ala Ala Ala Phe Gly Arg Val Ala Lys 180 185 190 Met Ala Asp Val Gly Gly Gly Leu Val Ala Gly Ala Leu Leu Ser Ala 195 200 205 Lys Asn Arg Pro Lys Lys Met Pro Ala Asp Pro Asn Val Pro Lys Thr 210 215 220 Lys Pro Gly Glu Leu Gly Ser Phe Lys Gln Gly Leu Lys Ala Leu Pro 225 230 235 240 Glu Ala Ile Ala Ala Lys Leu Gly Asp Arg Val Lys Leu Asn Trp His 245 250 255 Leu Thr Arg Leu Gln Arg Thr Glu Arg Glu Thr Tyr Ile Ala Glu Phe 260 265 270 Ser Thr Pro Asp Gly Gln Gln Glu Val Glu Ala Arg Thr Val Val Leu 275 280 285 Thr Thr Pro Ala Tyr Val Thr Ala Asp Leu Leu Gln Pro Leu Glu Pro 290 295 300 Gln Val Ser Ser Ala Leu Gln Ala Phe Thr Tyr Pro Thr Val Ala Ser 305 310 315 320 Val Val Leu Ala Tyr Pro Gln Ser Asp Val Lys Gly Lys Leu Val Gly 325 330 335 Phe Gly Asn Leu Ile Pro Arg Gly Gln Gly Ile Arg Cys Leu Gly Thr 340 345 350 Ile Trp Thr Ser Ser Leu Phe Pro Asp Arg Ala Pro Ala Gly Trp Gln 355 360 365 Thr Leu Thr Ser Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asp Ser Glu Ile Gly Asn 370 375 380 Leu Asp Ser Glu Gln Ile Val Arg Glu Val His Arg Asp Leu Ser Arg 385 390 395 400 Ile Leu Leu Lys Pro Asp Val Pro Gln Pro Lys Val Leu Thr Val Lys 405 410 415 Leu Trp Lys Arg Ala Ile Pro Gln Tyr Asn Leu Gly His Phe Asp Arg 420 425 430 Leu Gln Gln Ile Asp Glu Gly Leu Lys Ser Leu Pro Gly Val Tyr Leu 435 440 445 Cys Ser Asn Tyr Val Gly Gly Val Ala Leu Gly Asp Cys Val Arg Arg 450 455 460 Gly Phe Asp Arg Ala Arg Glu Val Gly Glu Tyr Leu Gln Lys Lys Gln 465 470 475 480 Ser Asp Thr Arg Ser Ile 485 <210> 2 <211> 1461 <212> DNA <213> Oscillatoria nigroviridis PCC 7112 <220> <221> gene <222> (1)..(1461) <223> CyPPO2 <400> 2 atggaactat tagatacctt gattgtgggt gcgggtatta gcggtttgag tttggcgcac 60 gcacttcaca aggaagcaac gagtgcatcg ccgctgaaga ttttagtcgc tgagagtcag 120 ggacgtgtgg gcgggaacat cacgactgtg acagcagagg ggtttctctg ggaggagggc 180 ccgaacagtt tttcgccgac gccggaattg atgaagttgg ctgtggatgt gggattgaag 240 caggagttga tttttgccga tcgcaaattg cctcgttttg tgtattggga aaataagctg 300 caaccggtgc cgatgactcc accggcgatg attcagtctc agttgctgag ttttccgggg 360 aaactgcggg cgttgttcgg ggctttgggg tttgtcgcgc cggcaatggg cgatcgactt 420 tcgcagcagg gtaacgagga aacagtttct caatttttcc gccgtcatct cggtacggaa 480 gtgatgcagc ggttggtgga accttttgtt tctggggttt atgccggcga tccgcaacaa 540 cttagcgcgg cggcggcttt tggccgggta gccaagatgg ctgatgtggg tggcgggctg 600 gtggcggggg cgctgctttc tgctaaaaac agaccgaaga aaatgcctgc agacccgaat 660 gttcctaaaa ctaagccggg ggagttgggt tcgttcaagc aggggttgaa ggctttgcca 720 gaggcgatcg ctgctaagtt gggcgatcga gtgaaactca actggcactt gactcgcctc 780 cagcgcacag aacgcgaaac ttacattgct gaattctcga cgcccgacgg acagcaggaa 840 gttgaggcgc gcaccgtggt tttgacaacg cccgcttacg ttacagccga tttgttgcaa 900 cctctggaac cgcaagttag cagcgcttta caagctttta cttatcctac ggttgcctcc 960 gttgtcttag catacccgca gtcggatgtc aagggtaaat tagtgggttt tggaaattta 1020 attccgaggg ggcagggaat tcgctgtctc gggacgattt ggacatcgag tttatttccc 1080 gatcgcgcgc ctgcagggtg gcaaactctc accagttaca tcggcggggc aacagactcg 1140 gaaattggca atctcgactc agaacaaatc gttcgggagg tacaccgaga tttgtctcgg 1200 attttgctga aaccagatgt gccacagcca aaagttttaa cggtgaagct gtggaaacgg 1260 gcgattcctc agtacaattt ggggcatttc gatcgcctgc aacaaatcga tgagggctta 1320 aaatctttgc ctggagtgta tttgtgcagc aactacgttg gcggagtggc tttgggagat 1380 tgcgtgcgaa ggggtttcga tcgtgcgcga gaagtgggcg agtatttgca gaagaaacaa 1440 tcagatactc gatcgatctg a 1461 <210> 3 <211> 479 <212> PRT <213> Lyngbya sp. PCC 8106 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(479) <223> CyPPO4 <400> 3 Met Thr His Val Leu Asp Ser Leu Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly 1 5 10 15 Leu Ala Leu Ala His Ala Leu His Gln Asn Gln Asp His Gln Leu Pro 20 25 30 Leu Asn Ile Leu Val Ser Glu His Gln Gly Arg Val Gly Gly Asn Ile 35 40 45 Thr Thr Val Ser Glu Gly Glu Phe Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser 50 55 60 Phe Ser Pro Thr Pro Glu Leu Leu Lys Leu Ala Val Glu Val Gly Leu 65 70 75 80 Lys Pro Glu Leu Val Phe Ala Asp Arg Lys Leu Pro Arg Tyr Val Tyr 85 90 95 Trp Asn Gly Gln Leu Met Pro Val Pro Met Ser Pro Pro Ala Leu Leu 100 105 110 Ser Thr Lys Leu Leu Ser Pro Gly Gly Lys Leu Arg Ala Leu Thr Gly 115 120 125 Ala Leu Gly Phe Val Gln Pro Ala Met Gly Glu Ser Leu Ser Gln Gln 130 135 140 Asn Gly Glu Glu Thr Ile Ser Gln Phe Phe Glu Arg His Leu Gly Ser 145 150 155 160 Glu Val Leu Lys Arg Leu Val Glu Pro Phe Val Ser Gly Val Tyr Ala 165 170 175 Gly Asp Pro Gln Gln Leu Glu Ile Ser Ser Ala Phe Ala Arg Val Ala 180 185 190 Arg Met Ala Tyr Ser Gly Gly Gly Leu Val Ala Gly Ala Val Leu Ser 195 200 205 Arg Arg Gln Asn Lys Ser Pro Arg Ser Pro Ala Asp Pro Ser Ile Pro 210 215 220 Gln Thr Lys Arg Gly Glu Leu Gly Ser Phe Arg Gln Gly Ile Gly Ala 225 230 235 240 Leu Pro Asn Ala Ile Ala Lys Gln Leu Gly Asp Gln Leu Lys Leu Asn 245 250 255 Trp Gln Leu Thr Arg Leu Glu Arg Thr Glu Asn Gln Thr Tyr Arg Ala 260 265 270 Glu Phe Ser Thr Pro Glu Gly Val Gln Gln Val Glu Thr Arg Thr Val 275 280 285 Val Leu Thr Thr Pro Ala Tyr Val Thr Ala Glu Ile Leu Lys Pro Leu 290 295 300 Gln Leu Gln Val Ser Gln Thr Leu Thr Glu Ile Pro Tyr Pro Pro Val 305 310 315 320 Ala Cys Val Val Leu Ala Tyr Pro Val Ser Ala Leu Lys Gln Lys Leu 325 330 335 Thr Gly Phe Gly Asn Leu Val Pro Arg Gly Gln Gly Ile Arg Thr Leu 340 345 350 Gly Thr Ile Trp Thr Ser Ser Leu Phe Pro Gly Arg Ala Pro Gln Gly 355 360 365 Trp Gln Val Leu Thr Ser Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asp Pro Glu Ile 370 375 380 Gly Glu Leu Glu Asp Asp Gln Ile Val Glu Ala Val His Gln Asp Leu 385 390 395 400 Arg His Ile Leu Leu Lys Glu Asp Ile Ser Pro Lys Val Leu Ala Val 405 410 415 His Leu Trp Lys Arg Ala Ile Pro Gln Tyr Asn Leu Gly His Gln Gln 420 425 430 Arg Leu Gln His Val Asn Glu Gly Leu Glu Ala Met Pro Gly Leu Tyr 435 440 445 Leu Cys Ser Asn Tyr Ile Asp Gly Val Ala Leu Gly Asp Cys Val Arg 450 455 460 Arg Ser Ile Gly Gln Ala Asn Glu Ile Leu Ser Phe Leu Gly Gln 465 470 475 <210> 4 <211> 1440 <212> DNA <213> Lyngbya sp. PCC 8106 <220> <221> gene <222> (1)..(1440) <223> CyPPO4 <400> 4 atgactcacg tactcgatag tttaatcgtc ggtgcaggca ttagcggcct ggcgttagct 60 catgctctcc atcagaacca agatcatcaa ttgcctctca acattcttgt cagcgagcat 120 caaggacggg taggaggaaa tataaccaca gtatccgaag gagaatttct ttgggaagaa 180 ggccccaata gtttttctcc aacccctgag ttactgaagt tagcggtaga agtaggtctt 240 aagcctgagc tagtctttgc cgatcgcaag ttacctcggt acgtttactg gaatggtcaa 300 ctcatgcctg tgccgatgag tcctccggct ttgttgagta caaaactctt aagtcctgga 360 ggtaaacttc gagcattaac gggggcattg gggtttgtac aacccgcgat gggagaatcg 420 ttaagtcaac aaaatgggga agaaacgatc tcgcagtttt ttgagcgtca tttgggttca 480 gaagttctca agcgactggt tgaacccttt gtttctggtg tttatgcagg cgatccccag 540 caactcgaaa ttagctcggc ttttgcccga gtcgcacgta tggcttacag tggcggtgga 600 ttggttgctg gagcggtttt atcgcgtcgt cagaacaaat ctccgcgatc gcctgccgac 660 ccgtctattc cccaaactaa acggggagag ttggggtctt ttcgtcaggg gattggagcc 720 ttacccaatg cgatcgccaa acagttaggc gatcaactca aattaaactg gcaactcacc 780 cgtctcgaac ggactgaaaa ccaaacctat cgggctgaat tttcgactcc agaaggggtt 840 caacaggtag aaactcgaac ggtggtgttg acgactccgg cctatgtcac agcagaaatt 900 ctcaaaccgt tgcaactcca agtcagtcaa acgttaactg aaattcccta tcccccggtg 960 gcttgcgtcg ttttagccta tcccgtttca gctttaaagc agaaattaac cggatttggc 1020 aatttagttc cccgaggaca agggattcgg acgttaggca cgatttggac atcgagttta 1080 tttcctggtc gcgcccccca aggctggcaa gtcctcacca gttatattgg cggagcgacg 1140 gatccagaaa ttggagagtt agaagatgat caaattgttg aggcggttca tcaagatttg 1200 cgtcacattt tactcaaaga agatatctct cccaaagtgc tagccgtgca tctgtggaaa 1260 cgtgctatcc ctcaatacaa tctcggacac caacaacggt tacaacacgt taatgagggt 1320 ctagaggcaa tgccggggtt atatctgtgt agcaactata tcgacggtgt agcgttggga 1380 gattgtgtgc gtcgttctat cggacaagct aacgaaattc tcagtttttt gggtcaatag 1440 1440 <210> 5 <211> 466 <212> PRT <213> Halothece sp. PCC 7418 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(466) <223> CyPPO8 <400> 5 Met Ile Asp Thr Leu Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Leu Ser Ala 1 5 10 15 Ala Tyr Arg Leu Asp Glu Lys Gln Arg Gln Val Leu Val Ala Glu Lys 20 25 30 Arg Asp Arg Ala Gly Gly Asn Ile Thr Ser Gln Gln Ser Gly Asp Phe 35 40 45 Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Ser Pro Thr Pro Glu Leu Leu 50 55 60 Lys Leu Ala Val Asp Ala Gly Leu Arg Asn Glu Leu Ile Phe Ala Asp 65 70 75 80 Arg Gly Leu Pro Arg Tyr Val Tyr Trp Glu Gly Lys Leu Arg Pro Val 85 90 95 Pro Met Ser Pro Pro Thr Ala Val Thr Ser Gln Leu Leu Ser Pro Ile 100 105 110 Gly Lys Leu Arg Ala Leu Thr Gly Ala Leu Gly Phe Ile Pro Pro Gln 115 120 125 Val Ser Ser Gln Glu Glu Thr Val Ala Asp Phe Phe Thr Arg His Leu 130 135 140 Gly Ser Glu Val Ala Gln Arg Leu Val Ser Pro Phe Val Ser Gly Val 145 150 155 160 Tyr Ala Gly Asp Val Asp Gln Leu Ser Ala Glu Ala Ala Phe Gly Arg 165 170 175 Val Thr Gln Leu Ala Asp Val Gly Gly Gly Leu Val Ala Gly Ala Ile 180 185 190 Leu Cys Arg Arg Gln Lys Pro Lys Ser Thr Pro Lys Thr Ala Lys Pro 195 200 205 Ser Asp Ile Pro Glu Thr Lys Ser Gly Gln Leu Gly Ser Phe Lys Glu 210 215 220 Gly Leu Gln Gln Leu Pro Ser Ala Ile Val Ser Gln Leu Gly Asp Lys 225 230 235 240 Val Lys Phe Gln Trp Glu Leu Lys Asn Ile Ser Pro His Pro Glu Ser 245 250 255 Gly Tyr Val Ala Thr Phe Ser Thr Pro Glu Gly Glu Gln Thr Val Glu 260 265 270 Ala Lys Thr Val Ile Leu Thr Thr Pro Ala Tyr Val Thr Ala Ser Leu 275 280 285 Val Lys Asp Leu Ser Pro Gln Ala Ser Gln Ala Leu Asn Glu Ile Ser 290 295 300 Tyr Pro Pro Val Ala Cys Val Val Leu Ala Tyr Pro Asp Glu Ala Leu 305 310 315 320 Arg Phe Pro Leu Lys Gly Phe Gly Asn Leu Asn Pro Arg Ser Gln Gly 325 330 335 Ile Arg Thr Leu Gly Thr Ile Trp Ser Ser Thr Leu Phe Pro Gly Arg 340 345 350 Thr Pro Lys Gly Trp His Leu Leu Thr Asn Phe Ile Gly Gly Ala Thr 355 360 365 Asp Pro Ala Ile Ala Glu Leu Ser Glu Asp Gln Ile Ile Glu Gln Val 370 375 380 His Gln Asp Leu Gln Gln Ala Val Ile Lys Ser Gly Ser Ile Pro Lys 385 390 395 400 Pro Leu Ala Val His Leu Trp Ser Lys Ala Ile Pro Gln Tyr Asn Leu 405 410 415 Gly His Leu Lys Arg Leu Glu Thr Ile Arg Asn His Leu Lys Pro Phe 420 425 430 Ser Gly Leu Phe Leu Ser Ser Asn Tyr Leu Asp Gly Val Ala Leu Gly 435 440 445 Asp Cys Val Arg Arg Gly Glu Glu Ser Ser Gln Ala Val Leu Asp Tyr 450 455 460 Leu Gly 465 <210> 6 <211> 1401 <212> DNA <213> Halothece sp. PCC 7418 <220> <221> gene <222> (1)..(1401) <223> CyPPO8 <400> 6 atgatagata ctttaattgt gggagcaggg attagtggtt taagtgctgc gtatcgactc 60 gatgagaagc agcgccaagt gctggttgca gaaaagcgcg atcgcgctgg gggaaatatc 120 accagccaac aaagtggcga tttcctctgg gaagaaggac cgaacagttt ttctcccaca 180 ccagaactcc taaaactagc ggttgatgcg ggcttaagaa atgagttaat ctttgctgat 240 cgcggacttc cccgttatgt ttattgggag gggaaactgc gccctgttcc tatgagtccc 300 cccacagccg tgacatccca gttgctgagt ccaatcggga aactacgggc gttaacgggt 360 gcattaggct ttattccccc gcaagtgtcg agtcaggaag aaacggttgc ggactttttt 420 acccgtcatc tcggttcaga agtagcccaa cggttagtga gtccgtttgt gtctggggtt 480 tatgcagggg atgtggatca actcagtgcg gaagctgcat ttggacgagt tacccaactg 540 gcggatgtgg gcggtggact ggtcgcaggt gcgattttat gtcgtcgtca aaagccaaag 600 tcaaccccaa aaacggctaa accgtctgat attccagaaa caaagtctgg acagttaggt 660 tcatttaagg aaggattaca acaattaccc agcgcgatcg tttctcaact gggagacaaa 720 gtaaagtttc aatgggaact gaaaaatatc tcccctcatc cagaatcggg ttacgtcgcg 780 acattttcca caccagaggg agaacaaaca gtcgaagcca aaaccgttat cctcaccact 840 cccgcctacg ttaccgcctc tctggtcaaa gatttatcac ctcaagccag tcaagcctta 900 aacgaaattt cctatccccc cgtagcttgt gtggtcttag cctatcccga tgaagccctc 960 cgttttcccc tcaaaggatt tggtaatctt aaccctcgca gtcaaggaat ccgcactctt 1020 ggtacaattt ggagttcaac actctttcca ggacgcacgc cgaaaggttg gcatctctta 1080 accaatttta ttggcggtgc aactgatccc gcaattgctg aactcagtga agatcaaatt 1140 attgaacaag tccatcaaga cttacaacaa gcggtgatta aatcgggaag tatcccgaaa 1200 cccttagccg ttcatttgtg gtcaaaagcg attccgcaat acaatctcgg acatctgaaa 1260 cggttagaaa ccatccgcaa tcacttaaaa cccttctctg gactcttttt atcgagtaac 1320 tatctcgatg gcgttgcgtt gggtgattgt gtgcgccgag gggaagagag tagtcaagcc 1380 gtgttagatt atttgggtta a 1401 <210> 7 <211> 537 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(537) <223> Wild type AtPPO1 <400> 7 Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro Thr Thr Gln Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Phe Ser Lys Pro Asn Leu Arg Leu Asn Val Tyr Lys Pro Leu Arg Leu 20 25 30 Arg Cys Ser Val Ala Gly Gly Pro Thr Val Gly Ser Ser Lys Ile Glu 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Thr Thr Ile Thr Thr Asp Cys Val Ile Val Gly Gly 50 55 60 Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Pro 65 70 75 80 Asp Ala Ala Pro Asn Leu Ile Val Thr Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly 85 90 95 Gly Asn Ile Ile Thr Arg Glu Glu Asn Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly 100 105 110 Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met Leu Thr Met Val Val Asp 115 120 125 Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val Leu Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg 130 135 140 Phe Val Leu Trp Asn Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Leu Thr 145 150 155 160 Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Gly Gly Lys Ile Arg Ala 165 170 175 Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Ser Pro Pro Gly Arg Glu Glu 180 185 190 Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Glu 195 200 205 Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser 210 215 220 Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Lys Leu Glu Gln 225 230 235 240 Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe Lys Ala Ile Gln Glu Arg 245 250 255 Lys Asn Ala Pro Lys Ala Glu Arg Asp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Gln 260 265 270 Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu Arg Met Leu Pro Glu 275 280 285 Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Ser Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu 290 295 300 Ser Gly Ile Thr Lys Leu Glu Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Thr Tyr Glu 305 310 315 320 Thr Pro Asp Gly Leu Val Ser Val Gln Ser Lys Ser Val Val Met Thr 325 330 335 Val Pro Ser His Val Ala Ser Gly Leu Leu Arg Pro Leu Ser Glu Ser 340 345 350 Ala Ala Asn Ala Leu Ser Lys Leu Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val 355 360 365 Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg Thr Glu Cys Leu Ile Asp 370 375 380 Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His Pro Arg Thr Gln Gly Val 385 390 395 400 Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala 405 410 415 Pro Pro Gly Arg Ile Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ser Thr Asn 420 425 430 Thr Gly Ile Leu Ser Lys Ser Glu Gly Glu Leu Val Glu Ala Val Asp 435 440 445 Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Lys Pro Asn Ser Thr Asp Pro Leu 450 455 460 Lys Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Gln Ala Ile Pro Gln Phe Leu Val 465 470 475 480 Gly His Phe Asp Ile Leu Asp Thr Ala Lys Ser Ser Leu Thr Ser Ser 485 490 495 Gly Tyr Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala 500 505 510 Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu Thr Ala Ile Glu Val Asn 515 520 525 Asn Phe Met Ser Arg Tyr Ala Tyr Lys 530 535 <210> 8 <211> 1614 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> gene <222> (1)..(1614) <223> Wild type AtPPO1 <400> 8 atggagttat ctcttctccg tccgacgact caatcgcttc ttccgtcgtt ttcgaagccc 60 aatctccgat taaatgttta taagcctctt agactccgtt gttcagtggc cggtggacca 120 accgtcggat cttcaaaaat cgaaggcgga ggaggcacca ccatcacgac ggattgtgtg 180 attgtcggcg gaggtattag tggtctttgc atcgctcagg cgcttgctac taagcatcct 240 gatgctgctc cgaatttaat tgtgaccgag gctaaggatc gtgttggagg caacattatc 300 actcgtgaag agaatggttt tctctgggaa gaaggtccca atagttttca accgtctgat 360 cctatgctca ctatggtggt agatagtggt ttgaaggatg atttggtgtt gggagatcct 420 actgcgccaa ggtttgtgtt gtggaatggg aaattgaggc cggttccatc gaagctaaca 480 gacttaccgt tctttgattt gatgagtatt ggtgggaaga ttagagctgg ttttggtgca 540 cttggcattc gaccgtcacc tccaggtcgt gaagaatctg tggaggagtt tgtacggcgt 600 aacctcggtg atgaggtttt tgagcgcctg attgaaccgt tttgttcagg tgtttatgct 660 ggtgatcctt caaaactgag catgaaagca gcgtttggga aggtttggaa actagagcaa 720 aatggtggaa gcataatagg tggtactttt aaggcaattc aggagaggaa aaacgctccc 780 aaggcagaac gagacccgcg cctgccaaaa ccacagggcc aaacagttgg ttctttcagg 840 aagggacttc gaatgttgcc agaagcaata tctgcaagat taggtagcaa agttaagttg 900 tcttggaagc tctcaggtat cactaagctg gagagcggag gatacaactt aacatatgag 960 actccagatg gtttagtttc cgtgcagagc aaaagtgttg taatgacggt gccatctcat 1020 gttgcaagtg gtctcttgcg ccctctttct gaatctgctg caaatgcact ctcaaaacta 1080 tattacccac cagttgcagc agtatctatc tcgtacccga aagaagcaat ccgaacagaa 1140 tgtttgatag atggtgaact aaagggtttt gggcaattgc atccacgcac gcaaggagtt 1200 gaaacattag gaactatcta cagctcctca ctctttccaa atcgcgcacc gcccggaaga 1260 attttgctgt tgaactacat tggcgggtct acaaacaccg gaattctgtc caagtctgaa 1320 ggtgagttag tggaagcagt tgacagagat ttgaggaaaa tgctaattaa gcctaattcg 1380 accgatccac ttaaattagg agttagggta tggcctcaag ccattcctca gtttctagtt 1440 ggtcactttg atatccttga cacggctaaa tcatctctaa cgtcttcggg ctacgaaggg 1500 ctatttttgg gtggcaatta cgtcgctggt gtagccttag gccggtgtgt agaaggcgca 1560 tatgaaaccg cgattgaggt caacaacttc atgtcacggt acgcttacaa gtaa 1614 <210> 9 <211> 537 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant type AtPPO1 <400> 9 Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro Thr Thr Gln Ser Leu Leu Pro Ser 1 5 10 15 Phe Ser Lys Pro Asn Leu Arg Leu Asn Val Tyr Lys Pro Leu Arg Leu 20 25 30 Arg Cys Ser Val Ala Gly Gly Pro Thr Val Gly Ser Ser Lys Ile Glu 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Thr Thr Ile Thr Thr Asp Cys Val Ile Val Gly Gly 50 55 60 Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Pro 65 70 75 80 Asp Ala Ala Pro Asn Leu Ile Val Thr Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly 85 90 95 Gly Asn Ile Ile Thr Arg Glu Glu Asn Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly 100 105 110 Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met Leu Thr Met Val Val Asp 115 120 125 Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val Leu Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg 130 135 140 Phe Val Leu Trp Asn Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Leu Thr 145 150 155 160 Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Gly Gly Lys Ile Arg Ala 165 170 175 Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Ser Pro Pro Gly Arg Glu Glu 180 185 190 Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Glu 195 200 205 Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser 210 215 220 Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Lys Leu Glu Gln 225 230 235 240 Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe Lys Ala Ile Gln Glu Arg 245 250 255 Lys Asn Ala Pro Lys Ala Glu Arg Asp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Gln 260 265 270 Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu Arg Met Leu Pro Glu 275 280 285 Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Ser Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu 290 295 300 Leu Gly Ile Thr Lys Leu Glu Ser Gly Gly Tyr Asn 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CyPPO4_R primer <400> 15 ccccctcgag ctgtcctaaa aatgataaaa tctcg 35 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CyPPO8_F primer <400> 16 ccccggatcc atgatagata ctcttatagt ggg 33 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CyPPO8_R primer <400> 17 ccccctcgag tcctaagtaa tctaaaactg 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_Y373M <400> 18 gacctctatg attggtggag ctactgatag 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_Y373M <400> 19 accaatcata gaggtcaatg tttgccatcc 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_Y373V <400> 20 gacctctgtg attggtggag ctactgatag 30 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_Y373V <400> 21 accaatcaca gaggtcaatg tttgccatcc 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_Y373I <400> 22 gacctctatc attggtggag ctactgatag 30 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_Y373I <400> 23 accaatgata gaggtcaatg tttgccatcc 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_Y373T <400> 24 gacctctaca attggtggag ctactgatag 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_Y373T <400> 25 accaattgta gaggtcaatg tttgccatcc 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_Y373L <400> 26 gacctctttg attggtggag ctactgatag 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_Y373L <400> 27 accaatcaaa gaggtcaatg tttgccatcc 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_Y373C <400> 28 gacctcttgt attggtggag ctactgatag 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_Y373C <400> 29 accaatacaa gaggtcaatg tttgccatcc 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_A175C <400> 30 ggtgtgtact gtggagatcc tcaacagctc 30 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer forCyPPO2_ A175C <400> 31 aggatctcca cagtacacac cagaaacaaa 30 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_A175L <400> 32 ggtgtgtact tgggagatcc tcaacagctc 30 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_A175L <400> 33 aggatctccc aagtacacac cagaaacaaa 30 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_V318M <400> 34 tatccaacaa tggcttcagt tgtgttggca 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_V318M <400> 35 aactgaagcc attgttggat aagtgaatgc 30 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_G351A <400> 36 cgctgtctcg ctacgatttg gacatcgagt 30 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_G351A <400> 37 ccaaatcgta gcgagacagc gaattccctg 30 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_S63T <400> 38 gcccgaacac tttttcgccg acgccggaat tg 32 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_S63T <400> 39 ggcgaaaaag tgttcgggcc ctcctcccag 30 <210> 40 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_R92A <400> 40 caaattgcct gcttttgtgt attgggaaaa taag 34 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_R92A <400> 41 atacacaaaa gcaggcaatt tgcgatcggc 30 <210> 42 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_V173S <400> 42 gtttctggga gttatgccgg cgatccgcaa c 31 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_V173S <400> 43 ccggcataac tcccagaaac aaaaggttcc 30 <210> 44 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_V173C <400> 44 gtttctgggt gttatgccgg cgatccgcaa c 31 <210> 45 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_V173C <400> 45 ccggcataac acccagaaac aaaaggttcc ac 32 <210> 46 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_V173T <400> 46 gtttctggga cttatgccgg cgatccgcaa c 31 <210> 47 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_V173T <400> 47 ccggcataag tcccagaaac aaaaggttcc ac 32 <210> 48 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_L229F <400> 48 actaagccgg gggagttcgg ttcgttcaag cag 33 <210> 49 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_L229F <400> 49 ctgcttgaac gaaccgaact cccccggctt agt 33 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_L340I <400> 50 ttttggaaat ataattccga gggggcaggg 30 <210> 51 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_L340I <400> 51 ctcggaatta tatttccaaa acccactaat ttac 34 <210> 52 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_I353T <400> 52 tcgggacgac ttggacatcg agtttatttc c 31 <210> 53 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_I353T <400> 53 gatgtccaag tcgtcccgag acagcgaatt c 31 <210> 54 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_I353L <400> 54 ctcgggacgc tttggacatc gagtttattt 30 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_I353L <400> 55 atgtccaaag cgtcccgaga cagcgaattc 30 <210> 56 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_I353V <400> 56 actaagccgg gggagttcgg ttcgttcaag cag 33 <210> 57 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_I353V <400> 57 ctgcttgaac gaaccgaact cccccggctt agt 33 <210> 58 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_I353C <400> 58 tcgggacgtg ttggacatcg agtttatttc c 31 <210> 59 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_I353C <400> 59 gatgtccaac acgtcccgag acagcgaatt c 31 <210> 60 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_V318T <400> 60 tatcctacga ctgcctccgt tgtcttagca 30 <210> 61 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_V318T <400> 61 aacggaggca gtcgtaggat aagtaaaagc 30 <210> 62 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_E228A <400> 62 aaaactaagc cgggggcgtt gggttcgttc aag 33 <210> 63 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_E228A <400> 63 cttgaacgaa cccaacgccc ccggcttagt ttt 33 <210> 64 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_P91L <400> 64 aaacttctta gattcgtgta ttgggaaaac 30 <210> 65 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_P91L <400> 65 acgaatctaa gaagttttct atctgcgaat 30 <210> 66 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_P316A+V318L <400> 66 gcttttactt atgctacgct tgcctccgtt 30 <210> 67 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_P316A+V318L <400> 67 gacaacggag gcaagcgtag cataagtaaa 30 <210> 68 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_P316L+V318L <400> 68 gcttttactt atcttacgct tgcctccgtt 30 <210> 69 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_P316L+V318L <400> 69 gacaacggag gcaagcgtaa gataagtaaa 30 <210> 70 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_F337V <400> 70 ttagtgggtg ttggaaattt aattccgagg gg 32 <210> 71 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aaaccccaga 30 <210> 78 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_L340V <400> 78 ttttggaaat gttattccaa gaggtcaagg aatc 34 <210> 79 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_L340V <400> 79 cttggaataa catttccaaa acccacgagt tt 32 <210> 80 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_L340T <400> 80 ttttggaaat actattccaa gaggtcaagg 30 <210> 81 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_L340T <400> 81 cttggaatag tatttccaaa acccacgagt tttc 34 <210> 82 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO2_F169A <400> 82 ccagaaacag caggttccac caaccgctgc atc 33 <210> 83 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO2_F169A <400> 83 gtggaacctg ctgtttctgg ggtttatgcc g 31 <210> 84 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO4_Y375M <400> 84 cttacatcta tgattggtgg agctaccgat 30 <210> 85 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO4_Y375M <400> 85 ccaccaatca tagatgtaag aacctgccat 30 <210> 86 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO4_Y375V <400> 86 cttacatctg ttattggtgg agctaccgat 30 <210> 87 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO4_Y375V <400> 87 ccaccaataa cagatgtaag aacctgccat 30 <210> 88 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO4_Y375I <400> 88 cttacatcta tcattggtgg agctaccgat 30 <210> 89 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO4_Y375I <400> 89 ccaccaatga tagatgtaag aacctgccat 30 <210> 90 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO4_Y375T <400> 90 cttacatcta ccattggtgg agctaccgat 30 <210> 91 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO4_Y375T <400> 91 ccaccaatgg tagatgtaag aacctgccat 30 <210> 92 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO4_Y375C <400> 92 cttacatctt gtattggtgg agctaccgat 30 <210> 93 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO4_Y375C <400> 93 ccaccaatac aagatgtaag aacctgccat 30 <210> 94 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO4_A176C <400> 94 ggtgtgtatt gtggagatcc acaacagctt 30 <210> 95 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO4_A176C <400> 95 tggatctcca caatacacac cagaaacaaa 30 <210> 96 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO4_A176L <400> 96 ggtgtgtatt tgggagatcc acaacagctt 30 <210> 97 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO4_A176L <400> 97 tggatctccc aaatacacac cagaaacaaa 30 <210> 98 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO4_P318L+V320L <400> 98 attccttatt tgccattggc ttgtgttgtg ctc 33 <210> 99 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO4_P318L+V320L <400> 99 aacacaagcc aatggcaaat aaggaatttc tgta 34 <210> 100 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO4_V320M <400> 100 tatcctccaa tggcttgtgt tgtgctcgca 30 <210> 101 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO4_V320M <400> 101 aacacaagcc attggaggat aaggaatttc 30 <210> 102 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO4_P318A+V320L <400> 102 attccttatg ctccattggc ttgtgttgtg ctc 33 <210> 103 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO4_P318A+V320L <400> 103 aacacaagcc aatggagcat aaggaatttc tgta 34 <210> 104 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_F363M <400> 104 ttgacaaata tgattggtgg agctaccgat 30 <210> 105 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_F363M <400> 105 caccaatcat atttgtcaaa aggtgccatc 30 <210> 106 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_F363V <400> 106 cttttgacaa atgttattgg tggagctacc 30 <210> 107 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_F363V <400> 107 agctccacca ataacatttg tcaaaaggtg 30 <210> 108 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_F363L <400> 108 cttttgacaa atcttattgg tggagctacc 30 <210> 109 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_F363L <400> 109 agctccacca ataagatttg tcaaaaggtg 30 <210> 110 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_F363C <400> 110 cttttgacaa attgtattgg tggagctacc 30 <210> 111 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_F363C <400> 111 agctccacca atacaatttg tcaaaaggtg 30 <210> 112 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_A162C <400> 112 tctggtgtgt attgtggaga tgttgatcaa 30 <210> 113 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_A162C <400> 113 atcaacatct ccacaataca caccagaaac 30 <210> 114 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_A162L <400> 114 tctggtgtgt atcttggaga tgttgatcaa 30 <210> 115 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_A162L <400> 115 atcaacatct ccaagataca caccagaaac 30 <210> 116 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_P306L+V308L <400> 116 atctcatatc ttccacttgc ttgcgttgtg 30 <210> 117 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_P306L+V308L <400> 117 aacgcaagca agtggaagat atgagatttc 30 <210> 118 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_V308M <400> 118 tcatatcctc caatggcttg cgttgtgctc 30 <210> 119 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_V308M <400> 119 cacaacgcaa gccattggag gatatgagat 30 <210> 120 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_P306A+V308L <400> 120 atttcctatg cccccctagc ttgtgtggtc ttagcc 36 <210> 121 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_P306A+V308L <400> 121 cacacaagct aggggggcat aggaaatttc gtttaagg 38 <210> 122 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_V160S <400> 122 gtgtctgggt cttatgcagg ggatgtggat c 31 <210> 123 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_V160S <400> 123 cctgcataag acccagacac aaacggactc ac 32 <210> 124 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_I343T <400> 124 ttggtacaac ttggagttca acactctttc c 31 <210> 125 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_I343T <400> 125 gaactccaag ttgtaccaag agtgcggatt c 31 <210> 126 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_F363I <400> 126 cttttgacaa atattattgg tggagctacc 30 <210> 127 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_F363I <400> 127 agctccacca ataatatttg tcaaaaggtg 30 <210> 128 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_F363T <400> 128 cttttgacaa atactattgg tggagctacc 30 <210> 129 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_F363T <400> 129 agctccacca atagtatttg tcaaaaggtg 30 <210> 130 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_R85A <400> 130 ggacttcccg cttatgttta ttgggagggg 30 <210> 131 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_R85A <400> 131 caataaacat aagcgggaag tccgcgatca gc 32 <210> 132 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_I343V <400> 132 cttggtacag tttggagttc aacactcttt c 31 <210> 133 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_I343V <400> 133 aactccaaac tgtaccaaga gtgcggattc 30 <210> 134 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_P84L <400> 134 aggtttactt aggtatgttt actgggaggg 30 <210> 135 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_P84L <400> 135 catacctaag taaacctcta tctgcaaaga 30 <210> 136 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_R85C <400> 136 gacttccctg ttatgtttat tgggagggga aac 33 <210> 137 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_R85C <400> 137 taaacataac agggaagtcc gcgatcagca aag 33 <210> 138 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_R85H <400> 138 acttccccat tatgtttatt gggaggggaa ac 32 <210> 139 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_R85H <400> 139 caataaacat aatggggaag tccgcgatca gc 32 <210> 140 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_R85L <400> 140 acttcccctt tatgtttatt gggaggggaa ac 32 <210> 141 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_R85L <400> 141 caataaacat aaaggggaag tccgcgatca gc 32 <210> 142 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_R85T <400> 142 gacttcccac ttatgtttat tgggagggga aac 33 <210> 143 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_R85T <400> 143 ataaacataa gtgggaagtc cgcgatcagc aaag 34 <210> 144 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_R85V <400> 144 gacttcccgt ttatgtttat tgggagggga aac 33 <210> 145 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_R85V <400> 145 ataaacataa acgggaagtc cgcgatcagc aaag 34 <210> 146 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_F156A <400> 146 gtgagtccgg ctgtgtctgg ggtttatgca 30 <210> 147 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_F156A <400> 147 cccagacaca gccggactca ctaaccgttg 30 <210> 148 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_V160C <400> 148 ccgtttgtgt ctgggtgcta tgcaggggat gtg 33 <210> 149 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_V160C <400> 149 cacatcccct gcatagcacc cagacacaaa cgg 33 <210> 150 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_Q179G <400> 150 tccgccagtc cggtaactcg tccaaatgca g 31 <210> 151 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_Q179G <400> 151 cgagttaccg gactggcgga tgtgggcggt g 31 <210> 152 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_F327V <400> 152 gttttcccct caaaggagtg ggtaatctta accctc 36 <210> 153 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_F327V <400> 153 gagggttaag attacccact cctttgaggg gaaaac 36 <210> 154 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_L330T <400> 154 tttggtaata ctaaccctcg cagtcaagga 30 <210> 155 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_L330T <400> 155 gcgagggtta gtattaccaa atcctttgag 30 <210> 156 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for CyPPO8_F363M+N362S <400> 156 cttttgacat caatgattgg tggagctacc 30 <210> 157 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for CyPPO8_F363M+N362S <400> 157 ccaatcattg atgtcaaaag gtgccatcct 30 <210> 158 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CyPPO8 F363M probe <400> 158 gcgttaacgg gtgcattagg c 21 <210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CyPPO8 F363M probe <400> 159 tggaaagagt gttgaactcc 20 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TOPO-cTP_F primer <400> 160 caccatggag ttatctcttc 20 <210> 161 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TOPO-CyPPO2_R primer <400> 161 tcagatcgat cgagtatctg 20 <210> 162 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TOPO-CyPPO8_R primer <400> 162 ttaacccaaa taatctaaca 20 <210> 163 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for bar probe <400> 163 ttccgtaccg agccgcagga 20 <210> 164 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for bar probe <400> 164 cgttgggcag cccgatgaca 20

Claims (23)

1. 다음의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드:
   (1) 서열번호 1의 아미노산 서열에서, Y373이 M(Met), I(Ile), L(Leu), 또는 V(Val)으로 치환된 아미노산 서열, R92가 A(Ala)으로 치환된 아미노산 서열, V173이 S(Ser) 또는 C(Cys)으로 치환된 아미노산 서열, A175가 L(Leu) 또는 C(Cys)로 치환된 아미노산 서열, 또는 V318이 M(Met)으로 치환된 아미노산 서열; 또는
   (2) 서열번호 1의 아미노산 서열에서, Y373이 M(Met), I(Ile), L(Leu), 또는 V(Val)으로 치환되고, 다음 중에서 선택된 하나 이상의 치환을 추가로 포함하는 아미노산 서열:
   R92가 A(Ala)으로 치환,
   V173이 S(Ser) 또는 C(Cys)으로 치환,
   A175가 L(Leu) 또는 C(Cys)으로 치환, 및
   V318이 M(Met)으로 치환.
2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열로 이루어진 것인 폴리펩타이드:
   (1) 서열번호 1의 아미노산 서열에서, Y373이 M(Met), I(Ile), L(Leu), 또는 V(Val)으로 치환된 아미노산 서열; 또는
   (2) 서열번호 1의 아미노산 서열에서, Y373이 M(Met), I(Ile), L(Leu), 또는 V(Val)으로 치환되고, 다음 중에서 선택된 하나 이상의 치환을 추가로 포함하는 아미노산 서열:
   R92가 A(Ala)으로 치환,
   V173이 S(Ser) 또는 C(Cys)으로 치환,
   A175가 L(Leu) 또는 C(Cys)으로 치환, 및
   V318이 M(Met)으로 치환.
3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는, 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서,
   R92A, V173C, V173S, A175C, A175L, V318M, Y373M, Y373I, Y373L, Y373V, R92A+Y373M, V173C+Y373V, V173S+Y373L, A175C+Y373M, A175C+Y373I, A175L+Y373M, A175L+Y373I, V318M+Y373M, V318M+Y373I, V318M+Y373L, V318M+Y373V, R92A+Y373I, R92A+Y373L, R92A+Y373V, V173S+Y373M, V173S+Y373I, V173C+Y373L, A175L+Y373L, A175L+Y373V, V173S+A175L+Y373M, V173S+V318M+Y373M, A175C+V318M+Y373M, R92A+V173S+Y373M, R92A+V173S+Y373I, R92A+V173S+Y373L, R92A+V173C+Y373M, R92A+V173C+Y373L, R92A+A175C+Y373M, R92A+A175C+Y373I, R92A+A175C+Y373L, R92A+A175L+Y373M, R92A+A175L+Y373L, R92A+V318M+Y373M, R92A+V318M+Y373I, R92A+V318M+Y373L, R92A+V318M+Y373V, V173S+A175C+Y373M, V173S+A175C+Y373I, V173S+A175C+Y373L, V173C+A175L+Y373M, V173C+A175L+Y373I, V173C+A175L+Y373L, V173S+V318M+Y373I, V173S+V318M+Y373L, A175C+V318M+Y373L, R92A+V173S+A175C+Y373M, R92A+V173C+A175L+Y373L, R92A+V173S+V318M+Y373M, R92A+V173C+V318M+Y373I, R92A+V173C+V318M+Y373L, R92A+A175C+V318M+Y373M, V173S+A175C+V318M+Y373M, V173C+A175L+V318M+Y373I, V173C+A175L+V318M+Y373L, 또는 R92A+V173S+A175C+V318M+Y373M의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드인, 폴리펩타이드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
5. 제4항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
6. 제5항의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
7. (1) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드;
   (2) 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
   (3) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및
   (4) 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포
   로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고,
   식물 또는 조류(Algae)에 티아페나실 (Tiafenacil), 사플루페나실 (Saflufenacil), 플루미옥사진 (Flumioxazin), 포메사펜 (Fomesafen), 및 설펜트라존 (Sulfentrazone)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제에 대한 내성을 부여하거나 증진시키는 것을 특징으로 하는,
   식물 또는 조류(Algae)의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제에 대한 내성 부여 또는 증진용 조성물.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 제7항에 있어서, 상기 식물 또는 조류는 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하며 상기 제2의 제초제에 대한 내성이 부여 또는 증진된 것인, 조성물.
12. 제11항에 있어서, 상기 제2의 제초제는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트(glufosinate), 디캄바(dicamba), 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 이속사플루톨(isoxaflutole), ALS(acetolactate synthase) 저해성 제초제, 제2광계(photosystem II) 저해성 제초제, 페닐우레아(phenylurea)계 제초제, 브로목시닐(bromoxynil)계 제초제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
13. 제11항에 있어서, 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드는
    글리포세이트(glyphosate) 제초제 내성 EPSPS(glyphosate resistant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase), GOX(glyphosate oxidase), GAT (glyphosate-N-acetyltransferase) 또는 글리포세이트 디카복실레이즈(glyphosate decarboxylase);
    글루포시네이트(glufosinate) 제초제 내성 PAT(phosphinothricin-N-acetyltransferase);
    디캄바(dicamba) 제초제 내성 DMO(dicamba monooxygenase);
    2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 제초제 내성 2,4-D 모노옥시게나아제 또는 AAD(aryloxyalkanoate Dioxygenase);
    ALS(acetolactate synthase) 저해성 설포닐우레아계 제초제 내성 ALS (acetolactate synthase), AHAS(acetohydroxyacid synthase), 또는 Atahasl(acetohydroxyacid synthase large subunit);
    제2광계(photosystem II) 저해성 제초제 내성 광계 II(photosystem II) 단백질 D1;
    페닐우레아(phenylurea) 제초제 내성 시토크롬 P450(cytochrome P450);
    색소체 저해성 제초제 내성 HPPD(hydroxyphenylpyruvate dioxygenase);
    브로목시닐(bromoxynil) 제초제 내성 니트릴레이즈 (nitrilase); 및
    이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물.
14. 제11항에 있어서, 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는
    글리포세이트(glyphosate) 제초제 내성 cp4 epsps, mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 또는 gat4621 유전자;
    글루포시네이트(glufosinate) 제초제 내성 bar 또는 pat 유전자;
    디캄바(dicamba) 제초제 내성 dmo 유전자;
    2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 제초제 내성 AAD-1 또는 AAD-12유전자;
    이속사플루톨 제초제 내성 HPPDPF W336 유전자;
    ALS (acetolactate synthase) 저해성 설포닐 우레아 제초제 내성 ALS, Csr1, Csr1-1, Csr1-2, GM-HRA, S4-HRA, Zm-HRA, SurA 또는 SurB 유전자;
    제2광계(photosystem II) 저해성 제초제 내성 psbA 유전자;
    페닐우레아(phenylurea) 제초제 내성 CYP76B1 유전자;
    브로목시닐(bromoxynil) 제초제 내성 bxn 유전자; 및
    이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물.
15. (1) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 (2) 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는,
    티아페나실 (Tiafenacil), 사플루페나실 (Saflufenacil), 플루미옥사진 (Flumioxazin), 포메사펜 (Fomesafen), 및 설펜트라존 (Sulfentrazone)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제에 대한 내성을 가지는 식물 또는 조류의 형질전환체.
16. 제15항에 있어서, 상기 형질전환체는 조류, 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물체 전체인, 형질전환체.
17. (1) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 (2) 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는,
    티아페나실 (Tiafenacil), 사플루페나실 (Saflufenacil), 플루미옥사진 (Flumioxazin), 포메사펜 (Fomesafen), 및 설펜트라존 (Sulfentrazone)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제에 대한 내성을 가지는 식물 또는 조류의 형질전환체의 자손.
18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 조류, 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물체 전체에 형질전환하는 단계를 포함하는,
    티아페나실 (Tiafenacil), 사플루페나실 (Saflufenacil), 플루미옥사진 (Flumioxazin), 포메사펜 (Fomesafen), 및 설펜트라존 (Sulfentrazone)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제에 대한 내성을 가지는 식물 또는 조류의 제조 방법.
19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 조류, 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물체 전체에 형질전환하는 단계를 포함하는,
    식물 또는 조류의 티아페나실 (Tiafenacil), 사플루페나실 (Saflufenacil), 플루미옥사진 (Flumioxazin), 포메사펜 (Fomesafen), 및 설펜트라존 (Sulfentrazone)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제에 대한 내성을 부여 또는 증진시키는 방법.
20. (1) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 (2) 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및
    상기 재배지에 티아페나실 (Tiafenacil), 사플루페나실 (Saflufenacil), 플루미옥사진 (Flumioxazin), 포메사펜 (Fomesafen), 및 설펜트라존 (Sulfentrazone)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는,
    재배지에서 잡초를 방제하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계는, 2종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 것인, 방법.
22. 제20항에 있어서,
    상기 식물은 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하는 것이고,
    상기 재배지에 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 것인, 방법.
23. (1) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 또는 (2) 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및
    상기 배양 배지에 티아페나실 (Tiafenacil), 사플루페나실 (Saflufenacil), 플루미옥사진 (Flumioxazin), 포메사펜 (Fomesafen), 및 설펜트라존 (Sulfentrazone)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는,
    배양 배지에서 원하지 않는 수생 생물을 제거하는 방법.

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