KR102227353B1 - 남세균 유래 프로토포르피리노겐 ix 옥시다아제의 변이체를 이용하는 제초제 내성 부여 및/또는 증진을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

남세균 유래 프로토포르피리노겐 ix 옥시다아제의 변이체를 이용하는 제초제 내성 부여 및/또는 증진을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

원핵생물에서 유래한 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제(Protoporphyrinogen IX oxidase)의 아미노산 변이체를 이용하여 식물 및/또는 조류(algae)의 제초제에 대한 보다 강화된 내성을 부여하거나 및/또는 내성을 보다 증진시키는 기술이 제공된다.

Description

남세균 유래 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제의 변이체를 이용하는 제초제 내성 부여 및/또는 증진을 위한 조성물 및 방법{Methods and Compositions for Conferring and/or Enhancing Herbicide Tolerance Using Variants of Protoporphyrinogen IX Oxidase from Cyanobacteria}
원핵생물에서 유래한 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 (Protoporphyrinogen IX oxidase)의 변이체를 이용하여 식물 및/또는 조류 (Algae)의 제초제에 대한 내성을 부여 및/또는 증진시키는 기술이 제공된다.
포르피린 합성 경로는 식물의 대사 과정에서 중요한 엽록소와 헴 (Heme)을 합성하는 과정으로 엽록체에서 이루어진다. 이 경로에서, 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 (Protoporphyrinogen IX oxidase, 이하 PPO; EC:1.3.3.4)는 프로토포르피리노겐 IX (Protoporphyrinogen IX)로부터 프로토포르피린 IX (Protoporphyrin IX)로의 산화과정을 촉매한다. 프로토포르피리노겐 IX이 프로토포르피린 IX로 산화된 후 Mg-chelatase에 의해 마그네슘과 결합하면 엽록소가 합성 되고, Fe-chelatase에 의해 철과 결합하면 헴 (Heme)이 합성된다.
따라서, PPO의 활성이 저해되면 엽록소와 헴의 합성이 억제되고, 기질인 프로토포르피리노겐 IX이 정상적인 포르피린 합성 경로에서 이탈하여 엽록체에서 세포질로 이동하여 빠르게 프로토포르피린 IX으로 산화되면, 광과 산소 분자의 존재 하에서 활성이 높은 단일항산소 (singlet oxygen, 1O2)를 발생시켜 식물의 세포막을 파괴함으로써 급속한 식물 세포 사멸을 일으킨다. 이러한 원리를 이용하여, PPO 활성을 억제하는 제초제가 개발되었으며, 현재까지 화학 구조에 따라 피리미딘디온계 (pyrimidinediones), 디페닐에테르계 (diphenyl-ethers), 페닐피라졸계 (phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계 (N-phenylphthalimides), 티아디아졸계 (thiadiazoles), 옥사디아졸계 (oxadiazoles), 트리아지논 (triazinone), 트리아졸리논계 (triazolinones), 옥사졸리딘디온계 (oxazolidinediones) 및 기타의 10개 계통의 제초제가 사용되고 있다.
또한, 상기 제초제들을 사용하면서도 재배 대상 작물의 생장에는 영향을 미치지 않게 하기 위해서는 재배 대상 작물에 상기 제초제들에 대한 내성을 부여할 필요성이 대두되어 왔다.
한편, 조류 (Algae)는 광합성 생물로서, 빛에너지를 다양한 유용 화합물을 합성할 수 있는 에너지로 전환할 수 있다. 예를 들어, 조류는 광합성에 의하여 탄소를 고정시키며, 이산화탄소를 당, 전분, 지질, 지방 또는 다른 생체분자들로 전환함으로써, 대기 중의 온실가스를 제거할 수 있다. 또한, 조류의 대규모 배양을 통하여 산업적 효소, 치료 화합물 및 단백질, 영양 물질, 상업적 물질, 연료 물질과 같은 다양한 물질들을 생산할 수 있다.
그러나, 생물반응기 (bioreactor) 또는 공개된 또는 폐쇄된 연못에서 조류를 대규모로 배양하는 경우, 원하지 않는 경쟁 생물들, 예를 들어 원치 않는 조류, 곰팡이, 윤충류 (rotifer) 또는 동물성 플랑크톤들에 의하여 오염이 발생할 수 있다.
따라서, 원하는 식물 및/또는 조류에 제초제 내성을 부여한 후, 제초제 내성이 없는 경쟁 생물들의 성장을 저해할 수 있는 농도로 제초제를 처리하여, 원하는 식물 및/또는 조류를 대규모로 수확할 수 있는 기술이 필요하다.
미국특허출원 등록공보 US 6,308,458 (2001.10.30) 미국특허출원 등록공보 US 6,808,904 (2004.10.26) 미국특허출원 등록공보 US 7,563,950 (2009.07.21) 국제특허출원 공개공보 WO2011/085221 (2011.07.14)
Li X, Volrath SL, Chilcott CE, Johnson MA, Ward ER, Law MD, Development of protoporphyrinogen oxidase as an efficient selection marker for agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maize. Plant Physiol. 133:736-747, 2003
본 명세서에서, 원핵생물로부터 hemY 타입의 PPO 유전자를 분리하여 이 유전자 및 이의 아미노산 변이체가 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 (PPO) 활성 저해 제초제들에 대하여 광범위한 제초제 내성을 나타냄이 입증되어, 이를 식물 및/또는 조류 (Algae)에 발현시키면 제초제 내성을 부여 및/또는 내성을 증진시킬 수 있음이 제안된다.
일 예는 서열번호 1의 폴리펩타이드와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 1의 아미노산들 (예컨대, 서열번호 1의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다. 상기 서열번호 1의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 R85, F156, V160, A162, G163, V305, C307, F324, L327, L337, I340 및 F360으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
다른 예는 서열번호 3의 폴리펩타이드와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 3의 아미노산들 (예컨대, 서열번호 3의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다. 상기 서열번호 3의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상은 서열번호 3의 아미노산 서열 중 R88, F160, V164, A166, G167, V304, C306, F323, L326, L336, I339 및 F359로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
다른 예는 상기 폴리펩타이드 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 예는,
서열번호 1의 폴리펩타이드의 변이체, 서열번호 3의 폴리펩타이드의 변이체, 및 이들과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드;
상기 폴리펩타이드 변이체, 및 이들과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및
상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.
일 예에서 상기 서열번호 1의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있고, 서열번호 3의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제초제는 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제일 수 있다.
구체 예로, 상기 제초제는 피리미딘디온계 (pyrimidinediones), 디페닐에테르계 (diphenyl-ethers), 페닐피라졸계 (phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계 (N-phenylphthalimides), 페닐에스테르계 (phenylesters), 티아디아졸계 (thiadiazoles), 옥사디아졸계 (oxadiazoles), 트리아지논계 (triazinone), 트리아졸리논계 (triazolinones), 옥사졸리딘디온계 (oxazolidinediones) 및 기타 제초제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체 예로, 상기 제초제는 부타페나실 (butafenacil), 사플루페나실 (saflufenacil), 벤즈펜디존 (benzfendizone), 티아페나실 (tiafenacil), 포메사펜 (fomesafen), 옥시플루오르펜 (oxyfluorfen), 아클로니펜 (aclonifen), 아시플루오르펜 (acifluorfen), 비페녹스 (bifenox), 에톡시펜 (ethoxyfen), 락토펜 (lactofen), 클로메톡시펜 (chlomethoxyfen), 클로르니트로펜 (chlornitrofen), 플루오로글리코펜-에틸 (fluoroglycofen-ethyl), 할로사펜 (halosafen), 피라플루펜-에틸 (pyraflufen-ethyl), 플루아졸레이트 (fluazolate), 플루미옥사진 (flumioxazin), 시니돈-에틸 (cinidon-ethyl), 플루미클로락-펜틸 (flumiclorac-pentyl), 플루티아셋 (fluthiacet), 티디아지민 (thidiazimin), 옥사디아길 (oxadiargyl), 옥사디아존 (oxadiazon), 카펜트라존 (carfentrazone), 설펜트라존 (sulfentrazone), 트리플루디목사진 (trifludimoxazin), 아자페니딘 (azafenidin), 펜톡사존 (pentoxazone), 피라클로닐 (pyraclonil), 플루펜피르-에틸 (flufenpyr-ethyl), 프로플루아졸 (profluazol), 페노필레이트 (phenopylate; 2,4-dichlorophenyl 1-pyrrolidinecarboxylate), 페노필레이트의 카바메이트 유사체 (예컨대, O-phenylpyrrolidino- and piperidinocarbamate analoges ("Ujjana B. Nandihalli, Mary V. Duke, Stephen O. Duke, Relationships between molecular properties and biological activities of O-phenyl pyrrolidino- and piperidinocarbamate herbicides., J. Agric. Food Chem., 40(10) 1993-2000, 1992 참조)), 이들의 농약적으로 허용가능한 염들, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 식물은 광합성을 하는 다세포 진핵 생물을 의미하는 것으로, 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이거나, 초본 식물 또는 목본 식물일 수 있다. 상기 조류 (Algae)는 광합성을 하는 단세포 생물을 의미하는 것으로, 원핵 (Prokaryotic) 조류 또는 진핵 (Eukaryotic) 조류일 수 있다.
일 예에서, 상기 식물 또는 조류는 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하도록 유전적으로 조작되며 상기 제2의 제초제에 대한 더 넓은 범위의 제초제 내성이 부여되거나 및/또는 증진된 것일 수 있다. 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하도록 유전적으로 조작된 식물 또는 조류는 상기한 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물에 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함시킨 것을 사용하여 제조된 것일 수 있다. 따라서, 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물은 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하는 것일 수 있다.
구체 예로, 상기 제2의 제초제는 세포분열 저해성 제초제, 광합성 저해성 제초제, 아미노산 합성 저해성 제초제, 색소체 저해성 제초제 및 세포막 저해성 제초제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체 예로, 상기 제2의 제초제는 글리포세이트 (glyphosate), 글루포시네이트 (glufosinate), 디캄바 (dicamba), 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), 이속사플루톨 (isoxaflutole), ALS (acetolactate synthase) 저해성 제초제, 제2광계 (photosystem II) 저해성 제초제, 페닐우레아 (phenylurea)계 제초제 또는 브로목시닐 (bromoxynil)계 제초제 또는 이들의 조합을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체 예로, 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드는 글리포세이트 제초제 내성 EPSPS (glyphosate resistant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase), GOX (glyphosate oxidase), GAT (glyphosate-N-acetyltransferase) 또는 글리포세이트 디카복실레이즈 (glyphosate decarboxylase); 글루포시네이트 제초제 내성 PAT (phosphinothricin-N-acetyltransferase); 디캄바 제초제 내성 DMO (dicamba monooxygenase); 2,4-D 제초제 내성 2,4-D 모노옥시게나아제 또는 AAD (aryloxyalkanoate dioxygenase); ALS 저해성 설포닐우레아 (sulfonylurea)계 제초제 내성 ALS (acetolactate synthase), AHAS (acetohydroxyacid synthase), 또는 AtAHASL (Arabidopsis thaliana acetohydroxyacid synthase large subunit); 제2광계 저해성 제초제 내성 광계 II (photosystem II) 단백질 D1; 페닐우레아계 제초제 내성 시토크롬 P450 (cytochrome P450); 색소체 저해성 제초제 내성 HPPD (hydroxyphenylpyruvate dioxygenase); 브로목시닐 제초제 내성 니트릴레이즈 (nitrilase); 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 글리포세이트 제초제 내성 cp4 epsps, epsps (AG), mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 또는 gat4621 유전자; 글루포시네이트 제초제 내성 bar, pat 또는 pat (SYN) 유전자; 디캄바 제초제 내성 dmo 유전자; 2,4-D 제초제 내성 AAD-1, AAD-12 유전자; ALS 저해성 설포닐우레아계 제초제 내성 ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM-HRA, Csr1, Csr1-1, Csr1-2, SurA 또는 SurB; 제2광계 (photosystem II) 저해성 제초제 내성 psbA 유전자; 페닐우레아 제초제 내성 CYP76B1 유전자; 이속사플루톨 제초제 내성 HPPDPF W336 유전자 및 브로목시닐 제초제 내성 bxn 유전자; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된, 제초제 내성 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성이 부여 및/또는 증진된 형질전환체, 이의 클론, 또는 자손을 제공한다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 식물 및/또는 조류에 형질전환하는 단계를 포함하는, 제초제에 대한 내성이 부여 및/또는 증진된 식물 또는 조류를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 식물 및/또는 조류에 형질전환하는 단계를 포함하는, 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성을 부여 및/또는 증진시키는 방법을 제공한다.
상기 형질 전환은 조류, 및/또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초, 또는 전체 (whole body)에 대하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 형질전환체는 조류, 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초, 또는 전체 (whole body)일 수 있다.
다른 예는, 상기 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 변이체, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.
구체 예로, 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계는, 2종 이상의 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하여 수행되는 것일 수 있다.
다른 예로, 상기 식물은 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하도록 유전적으로 조작된 것이고, 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 것일 수 있다.
다른 예는, 상기 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 변이체, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및 상기 배양 배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 원하지 않는 생물들을 제거하는 방법을 제공한다.
식물 또는 조류에 제초제에 대한 내성을 부여 및/또는 증진하는 기술이 제공된다.
본 명세서에서, '식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진' 또는 '식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성 증진' 이란 제초제에 내성이 없는 식물 또는 조류에 대하여 내성을 부여하는 것, 또는 제초제에 내성을 지닌 식물 또는 조류에 대하여 그 내성을 보다 향상시키는 것, 또는 이 모두를 포괄하는 광범위한 의미로 해석된다.
본 명세서에서, '서열로 이루어진' 또는 '서열을 포함하는' 이라 함은 기재된 서열을 포함하거나, 상기 서열을 필수적으로 포함하는 경우를 모두 의미하기 위하여 사용되며, 기재된 서열 이외의 서열을 포함하는 것을 배제하고자 하는 의도로 해석되지 않는다.
일 예에서,
서열번호 1의 폴리펩타이드와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 1의 아미노산들 (예컨대, 서열번호 1의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체; 및
서열번호 3의 폴리펩타이드와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 3의 아미노산들 (예컨대, 서열번호 3의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체
로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 폴리펩타이드 변이체가 제공된다.
다른 예에서, 서열번호 1 또는 3의 폴리펩타이드의 변이체, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 각 아미노산을 암호화하는 코돈들 중에서 형질도입 될 세포에 최적화된 (optimized) 코돈을 포함하도록 설계된 것일 수 있다. 상기 최적화 코돈은 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 알 수 있다 (예컨대, "http://www.genscript.com/codon-opt.html", "http://sg.idtdna.com/CodonOpt" 등 참조).
다른 예에서,
서열번호 1 또는 서열번호 3의 폴리펩타이드의 변이체, 또는 상기 폴리펩타이드 변이체와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드 폴리펩타이드;
상기 폴리펩타이드 변이체 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및
상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.
일 예에서 상기 서열번호 1의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있고, 서열번호 3의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 상기 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된, 제초제에 대한 내성을 가진 형질전환체가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 각 아미노산을 암호화하는 코돈들 중에서 형질도입될 세포에 최적화된 (optimized) 코돈을 포함하도록 설계된 것일 수 있다. 상기 최적화 코돈은 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 알 수 있다 (예컨대, "http://www.genscript.com/codon-opt.html", "http://sg.idtdna.com/CodonOpt" 등 참조).
다른 예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 조류 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초, 또는 식물전체에 형질전환하는 단계를 포함하는, 제초제에 대한 내성을 가지는 식물 또는 조류의 제조 방법이 제공된다.
다른 예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 조류 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물 전체에 형질전환하는 단계를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성을 부여 및/또는 증진시키는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 명세서에서 제공되는 서열번호 1 및 3의 폴리펩타이드는 원핵생물 (예컨대, 남세균)로부터 유래하는 PPO 단백질로서, PPO 저해 제초제에 대하여 내성을 갖는 제초제 내성 PPO 단백질이다. 구체적으로, 스피루리나 서브살사 (Spirulina subsalsa)에서 유래한 PPO 단백질이 제공되며, 이를 CyPPO16으로 명명하고, 이의 아미노산 서열을 서열번호 1로, 이를 암호화하는 유전자의 염기서열을 서열번호 2로 각각 나타낸다. 또한, 써모시네코코커스속 NK55a (Thermosynechococcus sp. NK55a) 균주에서 유래한 PPO가 제공되며, 이를 CyPPO17로 명명하고, 이의 아미노산 서열을 서열번호 3으로, 이를 암호화하는 유전자의 염기서열을 서열번호 4로 각각 나타낸다.
본 명세서에서, 앞서 설명한 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드 변이체는 각각 PPO 계열 제초제에 대하여 내성을 갖는 제초제 내성 PPO 단백질 또는 제초제 내성 PPO 단백질 변이체로도 표현될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 바로서, "제초제 내성 PPO 또는 이의 변이체"는 상기한 제초제 내성 PPO 단백질 또는 제초제 내성 PPO 단백질 변이체, 제초제 내성 PPO 단백질 암호화 유전자 또는 제초제 내성 PPO 단백질 변이체 암호화 유전자, 또는 이들 모두를 의미하기 위하여 사용될 수 있다.
남세균 유래 PPO 단백질은 그 자체로 식물 PPO 보다 효소 활성이 우수한 특성을 가지며 PPO 활성 저해 제초제에 대하여 내성을 부여할 수 있을 뿐 아니라, 이들 PPO 단백질 고유의 효소 활성을 전체적으로 유지시키는 범위 내에서 아미노산 변이를 포함함으로써 야생형 PPO 단백질보다 제초제 내성을 강화시킬 수 있다. 이러한 아미노산 변이는 PPO 단백질과 제초제 간 상호작용 부위의 아미노산 잔기 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 포함하는 것일 수 있다.
상기 PPO 단백질의 변이체를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
일 예는 서열번호 1의 폴리펩타이드 (CyPPO16)와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 1의 아미노산들 (서열번호 1의 폴리펩타이드 (CyPPO16)의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산 (즉, 야생형의 해당 위치의 아미노산)과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다.
상기 서열번호 1의 폴리펩타이드의 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 아미노산 잔기 (예컨대, 서열번호 1의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상)는 서열번호 1의 아미노산 서열 중의 R85 ("85번째 위치의 R(Arg)"을 의미; 이하의 아미노산 잔기의 표현은 이와 동일한 방식으로 해석됨), F156, V160, A162, G163, V305, C307, F324, L327, L337, I340 및 F360로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 중의 R85, F156, V160, A162, G163, V305, C307, F324, L327, L337, I340 및 F360으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이, 각각 독립적으로, 결실 또는 M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), F(Phe), P(Pro), W(Trp), N(Asn), Q(Gln), G(Gly), Y(Tyr), D(Asp), E(Glu), R(Arg), H(His), K(Lys) 등으로 이루어진 군에서 선택되고 해당 위치의 원래 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환 (예컨대, M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), S(Ser), A(Ala) 등으로 이루어진 군에서 선택되고 해당 위치의 원래 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환)된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서, F360M (360번째 위치의 아미노산 잔기가 F(Phe)에서 M(Met)으로 치환됨을 의미함; 이하의 아미노산 변이의 표현은 이와 동일한 방식으로 해석됨), F360L, F360I, F360C, F360V, F360T, V305I, V305L, A162L, A162C, A162I, V305M, R85A, F156A, V160C, V160S, F324V, L327T, 및 I340T, 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서, F360M, F360L, F360I, F360C, F360V, F360T, V305I, V305L, A162L, A162C, A162I, V305M, R85A, F156A, V160C, V160S, F324V, L327T, I340T, R85A+F360M (85번째 잔기의 R에서 A로의 치환 및 360번째 잔기의 F에서 M으로의 치환을 모두 포함; 이하의 2가지 이상의 아미노산 변이의 표현은 이와 동일한 방식으로 해석됨), R85A+F360V, R85A+F360I, F156A+F360M, V160C+F360M, V160C+F360I, V160C+F360V, A162C+F360M, A162C+F360I, A162C+F360V, A162L+F360M, A162L+F360I, A162L+F360V, V305M+F360M, V305M+F360I, V305M+F360V, F324V+F360M, L327T+F360M, L327T+F360I, L327T+F360V, I340T+F360M, R85A+V160C+F360I, R85A+A162L+F360M, R85A+V305M+F360I, R85A+L327T+F360M, V160C+A162L+F360I, V160C+V305M+F360M, V160C+L327T+F360I, A162L+V305M+F360M, A162C+L327T+F360M, V305M+L327T+F360M, A162C+V305M+F360M, A162I+V305M+F360M, V160C+A162C+F360M, V160C+A162L+F360M, R85A+V160C+A162L+F360I, R85A+V160C+V305M+F360M, R85A+V160C+L327T+F360I, R85A+A162C+L327T+F360M, R85A+A162L+V305M+F360M, R85A+V305M+L327T+F360M, V160C+A162L+V305M+F360I, V160C+A162C+L327T+F360M, A162C+V305M+L327T+F360M, R85A+V160C+A162C+L327T+F360M, R85A+V160C+A162L+V305M+F360M, V160C+A162C+V305M+L327T+F360M, 또는 R85A+V160C+A162C+V305M+L327T+F360M의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
다른 예는 서열번호 3의 폴리펩타이드 (CyPPO17)와 PPO 활성 저해 제초제와의 상호작용과 관여하는 서열번호 3의 아미노산들 (서열번호 3의 폴리펩타이드 (CyPPO17)의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 각각 독립적으로 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산 (즉, 야생형의 해당 위치의 아미노산)과 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 변이체를 제공한다.
상기 서열번호 3의 폴리펩타이드의 결실 또는 해당 위치의 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 아미노산 잔기 (예컨대, 서열번호 3의 폴리펩타이드의 PPO 활성 저해 제초제와의 결합 부위에 위치하는 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상)은 서열번호 3의 아미노산 서열 중의 R88, F160, V164, A166, G167, V304, C306, F323, L326, L336, I339 및 F359으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열 중의 R88, F160, V164, A166, G167, V304, C306, F323, L326, L336, I339 및 F359로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 각각 독립적으로, 결실 또는 M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala), S(Ser), F(Phe), P(Pro), W(Trp), N(Asn), Q(Gln), G(Gly), Y(Tyr), D(Asp), E(Glu), R(Arg), H(His), K(Lys) 등으로 이루어진 군에서 선택되고 해당 위치의 원래 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환 (예컨대, M(Met), V(Val), I(Ile), T(Thr), L(Leu), C(Cys), A(Ala) 등으로 이루어진 군에서 선택되고 야생형의 해당 위치의 아미노산과 상이한 아미노산으로 치환)된 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열에 있어서, F359M, F359C, F359L, F359I, F359V, F359T, V304I, V304L, A166L, A166C, A166I, V304M, R88A, F160A, V164C, V164S, F323V, L326T, 및 I339T로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 폴리펩타이드의 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열에 있어서, F359M, F359C, F359L, F359I, F359V, F359T, V304I, V304L, A166L, A166C, A166I, V304M, R88A, F160A, V164C, V164S, F323V, L326T, I339T, R88A+F359I, R88A+F359V, R88A+F359M, V164C+F359I, V164C+F359V, V164C+F359M, A166L+F359I, A166L+F359V, A166L+F359M, A166C+F359I, A166C+F359V, A166C+F359M, F160A+F359M, V304M+F359I, V304M+F359V, V304M+F359M, F323V+F359M, L326T+F359I, L326T+F359V, L326T+F359M, I339T+F359M, R88A+V164C+F359I, R88A+A166L+F359M, R88A+V304M+F359I, R88A+L326T+F359M, V164C+A166L+F359I, V164C+V304M+F359M, V164C+L326T+F359I, A166L+V304M+F359M, A166L+L326T+F359I, V304M+L326T+F359M, A166C+V304M+F359M, A166I+V304M+F359M,V164C+A166C+F359M, V164C+A166L+F359M, R88A+V164C+A166L+F359I, R88A+V164C+V304M+F359I, R88A+V164C+L326T+F359M, R88A+A166L+V304M+F359I, R88A+A166L+L326T+F359M, R88A+V304M+L326T+F359M, V164C+A166L+V304M+F359I, V164C+A166L+L326T+F359M, A166L+V304M+L326T+F359I, R88A+V164C+A166L+V304M+F359I, R88A+V164C+A166L+L326T+F359M, V164C+A166L+V304M+L326T+F359M, 또는 R88A+V164C+A166C+V304M+L326T+F359M의 아미노산 변이를 포함하는 아미노산 서열 또는 이와 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에 기재된 폴리펩타이드의 변이체, 또는 이들과 서열 상동성 (예컨대, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 서열 상동성 판단의 기준이 되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (예컨대, 앞서 설명한 아미노산 서열 또는 아미노산 변이를 갖는 PPO 단백질)와 동등 정도의 효소 활성, 예컨대, 식물 내 (식물체 내, 식물 세포 또는 세포 배양체 내, 식물 조직 내 등), 조류 내, 및/또는 시험관내에서 기준이 되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 효소 활성을 유지하면서 제초제 저항성을 부여하는 기능을 보유하는 것일 수 있으며, 상기와 같은 서열 상동성 기재는 본 명세서에 기재된 제초제 내성 PPO 단백질 또는 변이체가 상기 조건 (효소 활성을 유지하면서 제초제 저항성을 부여하는 기능을 보유)을 만족하는 범위의 모든 서열 변이를 포함할 수 있음을 명확하게 하기 위하여 사용된다.
본 명세서에서 사용된 아미노산의 명명을 아래의 표에 정리하였다:
Figure 112018124016917-pat00001
상기 제초제 내성 PPO 단백질 변이체는 효소 활성은 유지하면서, 야생형과 비교하여 증진된 제초제 내성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 폴리펩타이드 (제초제 내성 PPO 단백질) 및 폴리펩타이드 변이체 (제초제 내성 PPO 단백질 변이체)는 앞서 설명한 바와 같은 서열번호 1 또는 서열번호 3, 또는 앞서 설명한 바와 같은 아미노산 변이를 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드와 생물학적 균등한 활성을 나타내는 변이를 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 추가적 변이는 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 치환일 수 있고, 이러한 아미노산 치환은 당해 분야에 공지되어 있다. 일 예에서, 상기 추가적 치환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 또는 Asp/Gly 간의 치환을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 경우에 따라서, 상기 제초제 내성 PPO 단백질 변이체는 하나 이상의 아미노산이 인산화 (phosphorylation), 황화 (sulfation), 아실화 (acylation), 당화 (glycosylation), 메틸화 (methylation), 파네실화 (farnesylation) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 수식 (modification) 될 수도 있다. 또한, 상기 제초제 내성 PPO 단백질 변이체는 아미노산 변이 및/또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질 변이체를 포함할 수 있다.
용어 "서열 상동성"이란 야생형 (wild type) 또는 기준이 되는 아미노산 서열 또는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 제초제 내성 PPO 단백질 변이체의 아미노산 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 잔기를 포함하면서, 상기 제초제 내성 PPO 단백질 또는 이의 변이체와 생물학적으로 균등한 활성을 보유한다면 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 이러한 단백질 상동물은 목적 단백질과 동일한 활성 부위를 포함할 수 있다.
상기 제초제 내성 PPO 단백질 또는 이들의 변이체는 당 분야에 널리 공지된 방법으로 천연에서 추출 및 정제하여 얻을 수 있다. 또는, 유전자 재조합 기술을 이용한 재조합 단백질로 수득할 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, 제초제 내성 PPO 단백질 또는 이들의 변이체를 암호화하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 목적 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 제초제 내성 PPO 단백질 또는 이들의 변이체를 회수하는 과정으로 수득할 수 있다. 단백질은 선택된 숙주 세포에서 발현시킨 후, 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리 (염석법), 원심분리, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피 (겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들 중 2가지 이상을 조합하여 이용할 수 있다.
상기 제초제 내성 PPO 핵산 분자 (PPO 단백질 또는 이들의 변이체를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드)는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.
구체적인 실시예에서, 상기 제공된 PPO 단백질/핵산분자 또는 이들의 변이체들은 PPO가 결핍된 대장균 BT3(ΔPPO)를 이용한 제초제 내성 검증 시스템을 통하여, 화학 구조에 따라 9개 계통에 속하는 대표적인 PPO 활성 저해 제초제들에 대하여 광범위한 제초제 내성을 나타낸다는 것이 검증되었으며, 트랜지트 펩타이드 (transit peptide, TP)를 사용하면 식물의 엽록체에서 발현될 수 있다는 것이 확인되었다. 또한, 상기 PPO 단백질/핵산분자는 식물 발현용 벡터에 의하여 애기장대 (Arabidopsis thaliana ecotype Columbia-0)와 같은 쌍자엽 식물 또는 벼와 같은 단자엽 식물에서 발현이 가능하며, 이와 같이 형질전환된 식물체에 PPO 활성 저해 제초제를 처리하더라도 식물이 발아 및/또는 생장 가능한 것이 확인되었다. 아울러, 후대 유전성 시험을 통하여 위와 같은 제초제 내성 형질이 다음 세대로 성공적으로 전달되는 것이 확인되었다.
따라서, 본 명세서에서 제공하는 PPO 단백질 또는 이들의 변이체들을 식물 또는 조류에 도입함으로써 식물 또는 조류의 제초제 내성을 부여 및/또는 증진시키는 데 사용될 수 있다.
일 예는
(1) 앞서 설명한 폴리펩타이드 변이체 또는 이들과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드,
(2) 상기 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,
(3) 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 및
(4) 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 및/또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 제초제란, 식물 또는 조류를 사멸시키거나 방제하거나, 또는 식물 또는 조류의 생장을 불리하게 조정하는 활성 성분을 말한다. 또한, 본원에서 제초제 내성이란, 정상 또는 야생형 식물 또는 조류를 정상적으로 사멸시키거나 그의 생장을 정상적으로 억제시키는 제초제를 처리하더라도, 정상 또는 야생형의 식물 또는 조류에 비하여 식물 또는 조류 생장의 저해 정도가 약화되거나 제거되어, 식물 또는 조류의 생장이 지속적으로 이루어지는 것을 말한다. 상기 제초제는 식물 또는 조류의 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제 (PPO) 를 억제하는 제초제를 포함한다. 이러한 PPO 저해 제초제는 화학 구조에 따라 피리미딘디온계 (pyrimidinediones), 디페닐에테르계 (diphenyl-ethers), 페닐피라졸계 (phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계 (N-phenylphthalimides), 페닐에스테르계 (phenylesters), 티아디아졸계 (thiadiazoles), 옥사디아졸계 (oxadiazoles), 트리아지논계 (triazinone), 트리아졸리논계 (triazolinones), 옥사졸리딘디온계 (oxazolidinediones) 및 기타의 제초제를 예시할 수 있다.
구체예로, 피리미딘디온계 제초제는 부타페나실 (butafenacil), 사플루페나실 (saflufenacil), 벤즈펜디존 (benzfendizone) 및 티아페나실 (tiafenacil)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
디페닐에테르계 제초제는 포메사펜 (fomesafen), 옥시플루오르펜 (oxyfluorfen), 아클로니펜 (aclonifen), 아시플루오르펜 (acifluorfen), 비페녹스 (bifenox), 에톡시펜 (ethoxyfen), 락토펜 (lactofen), 클로메톡시펜 (chlomethoxyfen), 클로르니트로펜 (chlornitrofen), 플루오로글리코펜-에틸 (fluoroglycofen-ethyl) 및 할로사펜 (halosafen) 을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
페닐피라졸계 제초제는 피라플루펜-에틸 (pyraflufen-ethyl) 및 플루아졸레이트 (fluazolate)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
페닐프탈이미드계 제초제는 플루미옥사진 (flumioxazin), 시니돈-에틸 (cinidon-ethyl) 및 플루미클로락-펜틸 (flumiclorac-pentyl)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
페닐에스테르계 (phenylesters) 제초제는 페노필레이트 (phenopylate; 2,4-dichlorophenyl 1-pyrrolidinecarboxylate) 및 페노필레이트의 카바메이트 유사체 (예컨대, O-phenylpyrrolidino- and piperidinocarbamate analoges ("Ujjana B. Nandihalli, Mary V. Duke, Stephen O. Duke, Relationships between molecular properties and biological activities of O-phenyl pyrrolidino- and piperidinocarbamate herbicides., J. Agric. Food Chem., 40(10) 1993-2000, 1992" 참조)) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 페노필레이트의 카바메이트 유사체는 피롤리딘-1카르복실산 페닐 에스테르 (pyrrolidine-1-carboxylic acid phenyl ester; CAS No. 55379-71-0), 1-피롤리딘카르복실산, 2-클로로페닐 에스테르 (1-Pyrrolidinecarboxylicacid, 2-chlorophenyl ester; CAS No. 143121-06-6), 4-클로로페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (4-chlorophenyl pyrrolidine-1-carboxylate: CAS No. 1759-02-0), 카르밤산, 디에틸-, 2,4-디클로로-5-(2-프로피닐옥시)페닐 에스테르 (carbamic acid, diethyl-, 2,4-dichloro-5-(2-propynyloxy)phenyl ester (9CI); CAS No. 143121-07-7), 1-피롤리딘카르복시산, 2,4-디클로로-5-하이드로페닐 에스테르 (1-pyrrolidinecarboxylicacid, 2,4-dichloro-5-hydroxyphenyl ester; CAS No. 143121-08-8), 2,4-디클로로-5-(메톡시카르보닐)페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (2,4-dichloro-5-(methoxycarbonyl)phenyl pyrrolidine-1-carboxylate; CAS No. 133636-94-9), 2,4-디클로로-5-[(프로판-2-일옥시)카르보닐]페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (2,4-dichloro-5-[(propan-2-yloxy)carbonyl]phenyl pyrrolidine-1-carboxylate; CAS No. 133636-96-1), 1-피페리딘카르복실산, 2,4-디클로로-5-(2-프로피닐옥시)페닐 에스테르 (1-Piperidinecarboxylic acid, 2,4-dichloro-5-(2-propynyloxy)phenyl ester; CAS No. 87374-78-5), 2,4-디클로로-5-(프로프-2-인-1-일옥시)페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (2,4-dichloro-5-(prop-2-yn-1-yloxy)phenyl pyrrolidine-1-carboxylate; CAS No. 87365-63-7), 2,4-디클로로-5-(프로프-2-인-1-일옥시)페닐 4,4-디플루오로피페리딘-1-카르복실레이트 (2,4-dichloro-5-(prop-2-yn-1-yloxy)phenyl 4,4-difluoropiperidine-1-carboxylate; CAS No. 138926-22-4), 1-피롤리딘카르복실산, 3,3-디클루오로-, 2,4-디클로로-5-(2-프로핀-1-일옥시)페닐 에스테르 (1-pyrrolidinecarboxylicacid, 3,3-difluoro-, 2,4-dichloro-5-(2-propyn-1-yloxy)phenyl ester; CAS No. 143121-10-2), 4-클로로-2-플루오로-5-[(프로판-2-일옥시)카르보닐]페닐 피롤리딘-1-카르복실레이트 (4-chloro-2-fluoro-5-[(propan-2-yloxy)carbonyl]phenyl pyrrolidine-1-carboxylate; CAS No. 133636-98-3) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
티아디아졸계 제초제는 플루티아셋 (fluthiacet) 및 티디아지민(Thidiazimin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
옥사디아졸계 제초제는 옥사디아길 (oxadiargyl) 및 옥사디아존(Oxadiazon)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
트리아지논계 제초제는 트리플루디목사진(trifludimoxazin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
트리아졸리논계 제초제는 카펜트라존 (carfentrazone), 설펜트라존 (sulfentrazone) 및 아자페니딘 (azafenidin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
옥사졸리딘디온계 제초제는 펜톡사존 (pentoxazone)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
기타의 제초제는 피라클로닐 (pyraclonil), 플루펜피르-에틸 (flufenpyr-ethyl) 및 프로플루아졸 (profluazol)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 제공하는 제초제 내성 PPO 유전자 또는 이의 변이체는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의하여 식물체 또는 조류 내에 도입될 수 있으며, 바람직하게는 식물 또는 조류 형질전환용 발현벡터가 이용될 수 있다.
식물체 형질전환의 경우, 벡터에 포함되는 적합한 프로모터로는, 식물체 내 유전자 도입을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 예를 들어, SP6 프로모터, T7 프로모터, T3 프로모터, PM 프로모터, 옥수수의 유비퀴틴 프로모터, 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 노팔린 씬타아제 (nos) 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 수가크레인 바실리폼 바이러스 프로모터, 콤멜리나 엘로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로오스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제 스몰 서브유니트 (ssRUBISCO)의 광유도성 프로모터, 벼 사이토졸 트리오스포스페이트 이소머라아제 (TPI) 프로모터, 아라비돕시스의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터, 옥토파인 신타아제 프로모터 및 BCB (blue copper binding protein) 프로모터 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 벡터는 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 유전자로부터 유래된 것 (NOS 3' end), 아그로박테리움 투메파시엔스의 옥토파인 신타아제 유전자로부터 유래된 터미네이터 (octopine synthase terminator), 토마토 또는 감자의 프로테아제 억제자 I 또는 Ⅱ 유전자의 3' 말단 부분, CaMV 35S 터미네이터, 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터 및 파세올린 (phaseolin) 터미네이터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 조류 형질전환의 경우, 프로모터로서 엽록체 특이적 프로모터, 핵 프로모터, 항시성 프로모터 또는 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 제초제 내성 PPO 유전자 또는 이의 변이체는 5'UTR 또는 3'UTR 에 작동적으로 연결되어 조류의 핵 안에서 기능을 발휘하도록 설계될 수 있다. 또한, 상기 벡터는 조류 형질전환에 적합한 전사 조절 서열을 더욱 포함할 수 있다. 제초제 내성을 부여하는 재조합 유전자는 숙주 조류에서 핵의 게놈 또는 엽록체의 게놈에 통합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 벡터는 제초제 내성 PPO 유전자 또는 이의 변이체를 엽록체에 발현시키기 위하여, 엽록체로의 타겟팅에 필요한 트랜지트 펩타이드를 PPO 유전자 또는 이의 변이체의 5'-위치에 연결시킬 수 있다.
또한, 상기 벡터는 선택적으로, 리포터 분자로서 선택 표지를 암호화하는 유전자를 추가적으로 포함할 수 있으며, 선택 표지의 예로서 항생제 (예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신, 하이그로마이신, 블레오마이신, 앰피실린, 클로람페니콜 등) 또는 제초제 (글리포세이트, 글루포시네이트, 포스피노트리신 등) 내성 유전자 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 식물 발현용 재조합 벡터는 아그로박테리움 (Agrobacterium) 바이너리 벡터, 코인테그레이션 벡터 (cointegration vector) 또는 T-DNA 부위를 포함하지는 않지만 식물에서 발현될 수 있도록 디자인된 일반 벡터가 사용될 수 있다. 이 중, 바이너리 벡터는 Ti (tumor inducing) 플라스미드에서 이동에 필요한 부분인 LB (left border)와 RB (right border)를 가지는 플라스미드와 타겟 뉴클레오타이드를 옮기는데 필요한 유전자를 가진 플라스미드를 포함하는 벡터를 말하며, 그 내부에 식물체에서 발현시키기 위한 프로모터 부위와 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하는 벡터를 사용할 수 있다.
상기에서 바이너리 벡터 또는 코인테그레이션 벡터를 사용하는 경우, 식물체에 상기 재조합 벡터를 도입하기 위한 형질전환용 균주로는 아그로박테리움을 사용하는 것이 바람직하며 (Agrobacterium -mediated transformation), 이때 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스 (Agrobacterium rhizogenes)를 사용할 수 있다. 그 밖에 T-DNA 부위를 포함하지 않는 벡터를 이용하는 경우에는, 전기천공법 (electroporation), 입자 총법 (particle bombardment), 폴리에틸렌 글리콜 침전법 (polyethylene glycol-mediated uptake) 등이 재조합 플라스미드를 식물체로 도입하는데 이용될 수 있다.
상기와 같은 방법으로 유전자가 도입된 형질전환 식물들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 캘러스 유도, 발근 및 토양 순화와 같은 과정을 거쳐 식물체로 재분화시킬 수 있다.
본 명세서에서 형질전환의 대상이 되는 식물은, 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 수 있는 식물세포 (현탁배양 세포 포함), 원형질체 (protoplast), 캘러스 (callus), 배축 (hypocotyl), 종자 (seed), 자엽 (cotyledon), 신초 (shoot) 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.
또한, 본 명세서의 형질전환체의 범주에는 상기 유전자가 도입된 형질전환체 뿐만 아니라 이의 클론 또는 자손 (T1 세대, T2 세대, T3 세대, T4 세대, T5 세대, 또는 그 이상)을 포함하며, 예를 들어, PPO 유전자 또는 이의 변이체가 형질전환된 식물의 무성 또는 유성 자손으로서 제초제 내성 형질이 유전된 식물들도 본 발명의 형질전환 식물의 범주에 포함된다. 또한, 본원의 유전자가 형질전환된 식물의 모든 교배 및 융합 생성물과 함께, 초기 형질전환된 식물의 특성을 나타내는 모든 돌연변이체 및 변이체가 본 발명의 범주에 포함된다. 아울러, 본 발명의 방법으로 미리 형질전환시킨 형질전환된 식물, 또는 이들의 자손으로부터 기원하며 형질전환된 세포의 적어도 일부로 이루어진 종자, 꽃, 줄기, 과실, 잎, 뿌리, 괴경, 및/또는 괴근과 같은 식물의 일부도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명이 적용될 수 있는 식물은 특별히 제한되지 않으며, 단자엽 또는 쌍자엽 식물을 모두 포함하여 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 또한 초본 또는 목본 식물일 수 있다. 상기 단자엽 식물은 택사과 (Alismataceae), 자라풀과 (Hydrocharitaceae), 지채과 (Juncaginaceae), 장지채과 (Scheuchzeriaceae), 가래과 (Potamogetonaceae), 나자스말과 (Najadaceae), 거머리말과 (Zosteraceae), 백합과 (Liliaceae), 지모과 (Haemodoraceae), 용설란과 (Agavaceae), 수선화과 (Amaryllidaceae), 마과 (Dioscoreaceae), 물옥잠과 (Pontederiaceae), 붓꽃과 (Iridaceae), 버먼초과 (Burmanniaceae), 골풀과 (Juncaceae), 닭의장풀과 (Commelinaceae), 곡정초과 (Eriocaulaceae), 화본과 (벼과, Gramineae, Poaceae), 천남성과 (Araceae), 개구리밥과 (Lemnaceae), 흑삼릉과 (Sparganiaceae), 부들과 (Typhaceae), 사초과 (방동사니과, Cyperaceae), 파초과 (Musaceae), 생강과 (Zingiberaceae), 홍초과 (Cannaceae), 난초과 (Orchidaceae)의 식물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 쌍자엽 식물은 암매과 (돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과 (Clethraceae), 노루발과 (Pyrolaceae), 진달래과 (Ericaceae), 자금우과 (Myrsinaceae), 앵초과 (Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과 (Ebenaceae), 때죽나무과 (Styracaceae), 노린재나무과 (Symplocaceae), 회목과 (Symplocaceae), 물푸레나무과 (목서과, Oleaceae), 마전과 (Loganiaceae), 용담과 (Gentianaceae), 조름나물과 (Menyanthaceae), 협죽도과 (마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과 (Asclepiadaceae), 꼭두서니과 (Rubiaceae), 꽃고비과 (Polemoniaceae), 메꽃과 (Convolvulaceae), 지치과 (Boraginaceae), 마편초과 (Verbenaceae), 꿀풀과 (Labiatae), 가지과 (Solanaceae), 현삼과 (Scrophulariaceae), 능소화과 (Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과 (Acanthaceae), 참깨과 (Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과 (Gesneriaceae), 통발과 (Lentibulariaceae), 파리풀과 (Phrymaceae), 질경이과 (Plantaginaceae), 인동과 (Caprifoliaceae), 연복초과 (Adoxaceae), 마타리과 (Valerianaceae), 산토끼꽃과 (Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과 (Compositae), 소귀나무과 (Myricaceae), 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과 (Salicaceae), 자작나무과 (Betulaceae), 너도밤나무과 (참나무과, Fagaceae), 느릅나무과 (Ulmaceae), 뽕나무과 (Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과 (Santalaceae), 겨우살이과 (Loranthaceae), 마디풀과 (여뀌과, Polygonaceae), 자리공과 (상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과 (Nyctaginaceae), 석류풀과 (Aizoaceae), 쇠비름과 (Portulacaceae), 석죽과 (Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과 (Amaranthaceae), 선인장과 (Cactaceae), 목련과 (Magnoliaceae), 붓순나무과 (Illiciaceae), 녹나무과 (Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과 (Ranunculaceae), 매자나무과 (Berberidaceae), 으름덩굴과 (Lardizabalaceae), 새모래덩굴과 (방기과, Menispermaceae), 수련과 (Nymphaeaceae), 붕어마름과 (Ceratophyllaceae), 어항마름과 (Cabombaceae), 삼백초과 (Saururaceae), 후추과 (Piperaceae), 홀아비꽃대과 (Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과 (Aristolochiaceae), 다래나무과 (Actinidiaceae), 차나무과 (동백나무과, Theaceae), 물레나물과 (Guttiferae), 끈끈이주걱과 (Droseraceae), 양귀비과 (Papaveraceae), 풍접초과 (Capparidaceae), 십자화과 (겨자과, Cruciferae), 플라타너스과 (버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과 (금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과 (돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과 (Saxifragaceae), 두충과 (Eucommiaceae), 돈나무과 (Pittosporaceae), 장미과 (Rosaceae), 콩과 (Leguminosae), 괭이밥과 (Oxalidaceae), 쥐손이풀과 (Geraniaceae), 한련과 (Tropaeolaceae), 남가새과 (Zygophyllaceae), 아마과 (Linaceae), 대극과 (Euphorbiaceae), 별이끼과 (Callitrichaceae), 운향과 (Rutaceae), 소태나무과 (Simaroubaceae), 멀구슬나무과 (Meliaceae), 원지과 (Polygalaceae), 옻나무과 (Anacardiaceae), 단풍나무과 (단풍과, Aceraceae), 무환자나무과 (Sapindaceae), 칠엽수과 (Hippocastanaceae), 나도 밤나무과 (Sabiaceae), 봉선화과 (물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과 (Aquifoliaceae), 노박덩굴과 (화살나무과, Celastraceae), 고추나무과 (Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과 (Empetraceae), 갈매나무과 (Rhamnaceae), 포도과 (Vitaceae), 담팔수과 (Elaeocarpaceae), 피나무과 (Tiliaceae), 아욱과 (Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과 (서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과 (Flacourtiaceae), 제비꽃과 (Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과 (Tamaricaceae), 물별과 (Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과 (Cucurbitaceae), 부처꽃과 (배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과 (Punicaceae), 바늘꽃과 (Onagraceae), 개미탑과 (Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과 (산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과 (오갈피나무과, Araliaceae), 산형과 (미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))의 식물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체예로, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 마초, 목초, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채, 잔디 및 피마자를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 소나무, 팜오일 및 유칼립투스를 포함하는 목본류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체 예로, 상기 식물은 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물; 및 벼, 밀, 보리, 옥수수, 수수 등의 단자엽 식물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명이 적용될 수 있는 조류는 특별히 제한되지 않으며, 원핵 (Prokaryotic) 조류 또는 진핵 (Eukaryotic) 조류일 수 있다. 예를 들어, 조류는 시아노박테리아, 녹조류, 홍조류, 갈조류, 대형조류 (macroalgae) 또는 미세조류 (microalgae)일 수 있다.
시아노박테리아류로는, Chroococcales 문 (예, Aphanocapsa, Aphanothece, Chamaesiphon, Chondrocystis, Chroococcus, Chroogloeocystis, Crocosphaera, Cyanobacterium, Cyanobium, Cyanodictyon, Cyanosarcina, Cyanothece, Dactylococcopsis, Gloeocapsa, Gloeothece, Halothece, Johannesbaptistia, Merismopedia, Microcystis, Radiocystis, Rhabdoderma, Snowella, Synechococcus, Synechocystis, Thermosynechococcus, Woronichinia), Gloeobacteria 문, Nostocales 문 (예, Microchaetaceae, Nostocaceae, Rivulariaceae, Scytonemataceae), Oscillatoriales 문 (예, Arthronema, Arthrospira, Blennothrix, Crinalium, Geitlerinema, Halomicronema, Halospirulina, Hydrocoleum, Jaaginema, Katagnymene, Komvophoron, Leptolyngbya, Limnothrix, Lyngbya, Microcoleus,Oscillatoria, Phormidium, Planktothricoides, Planktothrix, Plectonema, Pseudanabaena, Pseudophormidium, Schizothrix, Spirulina, Starria, Symploca, Trichodesmium, Tychonema), Pleurocapsales 문 (예, Chroococcidiopsis, Dermocarpa, Dermocarpella, Myxosarcina, Pleurocapsa, Solentia, Stanieria, Xenococcus), Prochlorales 문, 또는 Stigonematales 문 (예, Capsosira, Chlorogloeopsis, Fischerella, Hapalosiphon, Mastigocladopsis, Mastigocladus, Nostochopsis, Stigonema, Symphyonema, Symphonemopsis, Umezakia, Westiellopsis) 등을 예시할 수 있다.
조류의 다른 예로, Chlorophyta, Chlamydomonas, Volvacales, Dunaliella, Scenedesmus, Chlorella, 또는 Hematococcm 를 예시할 수 있다.
조류의 다른 예로, Phaeodactylum tricornutum, Amphiprora hyaline, Amphora spp., Chaetoceros muelleri, Navicula saprophila, Nitzschia communis, Scenedesmus dimorphus, Scenedesmus obliquus, Tetraselmis suecica, Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella vulgaris, Haematococcus pluvialis, Neochloris oleoabundans, Synechococcus elongatus, Botryococcus braunii, Gloeobacter violaceus, Synechocystis, Thermosynechococcus elongatus, Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis salina, Nannochloropsis gaditana, Isochrysis galbana, Botryococcus sudeticus, Euglena gracilis, Neochloris oleoabundans, Nitzschia palea, Pleurochrysis carterae, Tetraselmis chuii, Pavlova spp., Aphanocapsa spp., Synechosystis spp., Nannochloris spp. 등을 예시할 수 있다. 그러나, 상기 열거한 종류들에 제한 되는 것은 아니며, 그 외 다양한 속 및 종에 속하는 조류들이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 제초제 내성 PPO 또는 이의 변이체가 도입된 식물 또는 조류는 2 종 이상의 PPO 저해 제초제에 대하여 내성을 나타낼 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 제공되는 기술은 2 종 이상의 PPO 저해 제초제를 순차적으로, 또는 동시에 사용함으로써 잡초를 방제하거나 원하지 않는 수생 생물을 제거하는 데 사용될 수 있다.
일 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및 상기 재배지에 2종 이상의 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.
다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및 상기 배양 배지에 2종 이상의 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 단계를 포함하는, 배양 배지에서 원하지 않는 수생 생물들을 제거하는 방법을 제공한다.
또한, 본 명세서에서 제공하는 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자는, 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자와 조합하여 사용될 수 있다.
이에 따라, 본 명세서에서 제공하는 제초제 내성 PPO 또는 이의 변이체가 도입된 식물 또는 조류는 작용기전이 상이한 2 종 이상의 제초제에 대하여 내성을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명은 작용기전이 PPO 저해 제초제를 포함한 상이한 2 종 이상의 제초제를 순서에 상관없이 순차적으로, 또는 동시에 사용함으로써 잡초를 방제하거나 및/또는 원치 않는 수생 생물을 제거하는 데 사용될 수 있다. 이하, PPO 저해 제초제와 작용기전이 상이한 제초제를 "제2의 제초제"라고 지칭한다.
일 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성 부여 및/또는 증진용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는, 식물 또는 조류의 제초제에 대한 내성을 가지는 형질전환체, 이의 클론 또는 자손을 제공한다.
다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 조류, 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물체 전체에 형질전환하는 단계를 포함하는, 제초제에 대한 내성을 가지는 식물 또는 조류를 제조하는 방법을 제공한다.
다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질, 이의 변이체, 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 동시에 또는 순서에 상관없이 순차적으로 적용하는 단계를 포함하는, 재배지에서 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.
다른 예는 상술한 제초제 내성 PPO 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자; 및 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및 상기 배양 배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 동시에 또는 순서에 상관없이 순차적으로 적용하는 단계를 포함하는, 배양 배지에서 원하지 않는 수생 생물을 제거하는 방법을 제공한다.
예컨대, 상기 식물 또는 조류는 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하며 상기 제2의 제초제에 대한 내성이 부여 및/또는 증진된 것일 수 있다.
예컨대, 상기 제2의 제초제는 세포분열 저해성 제초제, 광합성 저해성 제초제, 아미노산 합성 저해성 제초제, 색소체 저해성 제초제, 세포막 저해성 제초제 및/또는 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체 예로, 상기 제2의 제초제는 글리포세이트 (glyphosate), 글루포시네이트 (glufosinate), 디캄바 (dicamba), 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), ALS (acetolactate synthase) 저해성 제초제 (예를 들어, 이미다졸리디논, 설포닐우레아, 트리아졸피리미딘, 설포아닐라이드, 피리미딘 티오벤조에이트 등), 제2광계 (photosystem II) 저해성 제초제, 페닐우레아 (phenylurea)계 제초제, 색소체 저해성 제초제, 브로목시닐 (bromoxynil)계 제초제 및/또는 이들의 조합을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예컨대, 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드는 글리포세이트 제초제 내성 EPSPS (glyphosate resistant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase), GOX (glyphosate oxidase), GAT (glyphosate-N-acetyltransferase) 또는 글리포세이트 디카복실레이즈 (glyphosate decarboxylase); 글루포시네이트 제초제 내성 PAT (phosphinothricin-N-acetyltransferase); 디캄바 제초제 내성 DMO (dicamba monooxygenase); 2,4-D 제초제 내성 2,4-D 모노옥시게나아제 또는 AAD (aryloxyalkanoate dioxygenase); ALS 저해성 설포닐우레아 (sulfonylurea)계 제초제 내성 ALS (acetolactate synthase), AHAS (acetohydroxyacid synthase), 또는 AtAHASL (Arabidopsis thaliana acetohydroxyacid synthase large subunit); 제2광계 저해성 제초제 내성 광계 II (photosystem II) 단백질 D1; 페닐우레아계 제초제 내성 시토크롬 P450 (cytochrome P450); 색소체 저해성 제초제 내성 HPPD (hydroxyphenylpyruvate dioxygenase); 브로목시닐 제초제 내성 니트릴레이즈 (nitrilase); 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는 글리포세이트 제초제 내성 cp4 epsps, epsps (AG), mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 또는 gat4621 유전자; 글루포시네이트 제초제 내성 bar, pat 또는 pat (SYN) 유전자; 디캄바 제초제 내성 dmo 유전자; 2,4-D 제초제 내성 AAD-1, AAD-12 유전자; ALS 저해성 설포닐우레아계 제초제 내성 ALS, GM-HRA, S4-HRA, ZM-HRA, Csr1, Csr1-1, Csr1-2, SurA 또는 SurB; 제2광계(photosystem II) 저해성 제초제 내성 psbA 유전자; 페닐우레아 제초제 내성 CYP76B1 유전자; 이속사플루톨 제초제 내성 HPPDPF W336 유전자; 브로목시닐 제초제 내성 bxn 유전자; 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제공하는 제초제 내성 PPO 단백질의 변이체 또는 이를 암호화하는 유전자를 식물 또는 조류에 적용함으로써 보다 우수한 제초제 내성 형질을 부여 및/또는 증진시키고, 제초제를 이용한 선별적 방제를 통해 경제적으로 잡초를 방제하거나 원하지 않는 수생 생물을 제거할 수 있다.
도 1는 pET303-CT-His벡터의 개열지도이다.
도 2는 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 CyPPO16 wild type 유전자 (CyPPO16 WT로 나타냄) 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 CyPPO16 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, tiafenacil을 0 uM(micromolar)(control), 10 uM, 및 25 uM 의 농도로 각각 처리한 경우 (상단) 및 saflufenacil을 0 uM(control), 25 uM, 및 50 uM 의 농도로 각각 처리한 경우(하단)의 세포 생장 정도를 각각 보여주는 사진이다.
도 3은 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 CyPPO16 wild type 유전자 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 CyPPO16 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, flumioxazin을 0 uM (control), 10 uM, 및 25 uM 의 농도로 각각 처리한 경우 (상단) 및 sulfentrazone을 0 uM(micromolar)(control), 50 uM, 및 100 uM 의 농도로 각각 처리한 경우(하단)의 세포 생장 정도를 각각 보여주는 사진이다.
도 4는 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 CyPPO16 wild type 유전자 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 CyPPO16 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, fomesafen을 0 uM (control), 50 uM, 및 100 uM 의 농도로 각각 처리한 경우 (상단) 및 acifluorfen을 0 uM(micromolar)(control), 5 uM, 및 10 uM 의 농도로 각각 처리한 경우(하단)의 세포 생장 정도를 각각 보여주는 사진이다.
도 5는 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 CyPPO16 wild type 유전자 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 CyPPO16 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, pentoxazone을 0 uM (control), 5 uM, 및 25 uM 의 농도로 각각 처리한 경우 (상단) 및 pyraflufen-ethyl을 0 uM (control), 5 uM, 및 25 uM 의 농도로 각각 처리한 경우 (하단)의 세포 생장 정도를 각각 보여주는 사진이다.
도 6은 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 CyPPO16 wild type 유전자 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 CyPPO16 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, pyraclonil을 0 uM (control), 50 uM, 및 100 uM 의 농도로 각각 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 7 내지 도 17은 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 CyPPO16 wild type 유전자 또는 2개 이상의 아미노산 변이를 유발하는 CyPPO16 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, tiafenacil을 0 uM (control), 50 uM, 및 200 uM 의 농도로 각각 처리한 경우, flumioxazin을 0 uM (control), 25 uM, 및 50 uM 의 농도로 각각 처리한 경우, 및 sulfentrazone 을 0 uM (control), 2000 uM, 및 4000 uM 의 농도로 각각 처리한 경우의 세포 생장 정도를 각각 보여주는 사진이다.
도 18은 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 CyPPO17 wild type 유전자 (CyPPO17 WT로 나타냄) 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 CyPPO17 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, tiafenacil을 0 uM (control), 50 uM, 및 100 uM 의 농도로 각각 처리한 경우 (상단), 및 saflufenacil을 0 uM (control), 50 uM, 및 200 uM 의 농도로 각각 처리한 경우 (하단)의 세포 생장 정도를 각각 보여주는 사진이다.
도 19는 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 CyPPO17 wild type 유전자 (CyPPO17 WT로 나타냄) 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 CyPPO17 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, flumioxazin을 0 uM (control), 50 uM, 및 100 uM 의 농도로 각각 처리한 경우 (상단), 및 sulfentrazone을 0 uM (control), 5 uM, 및 25 uM 의 농도로 각각 처리한 경우 (하단)의 세포 생장 정도를 각각 보여주는 사진이다.
도 20은 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (
Figure 112018124016917-pat00002
PPO)에 CyPPO17 wild type 유전자 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 CyPPO17 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, fomesafen을 0 uM (control), 5 uM, 및 25 uM 의 농도로 각각 처리한 경우 (상단), 및 acifluorfen을 0 uM (control), 5 uM, 및 25 uM 의 농도로 각각 처리한 경우 (하단)의 세포 생장 정도를 각각 보여주는 사진이다.
도 21은 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 CyPPO17 wild type 유전자 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 CyPPO17 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, pyraclonil을 0 uM (control), 5 uM, 및 25 uM 의 농도로 각각 처리한 경우 (상단), 및 pentoxazone을 0 uM (control), 5 uM, 및 25 uM 의 농도로 각각 처리한 경우 (하단)의 세포 생장 정도를 각각 보여주는 사진이다.
도 22는 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 CyPPO17 wild type 유전자 또는 단일 아미노산 변이를 유발하는 CyPPO17 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, pyraflufen-ethyl을 0 uM (control), 5 uM, 및 10 uM 의 농도로 각각 처리한 경우의 세포 생장 정도를 보여주는 사진이다.
도 23 내지 도 33은 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (ΔPPO)에 CyPPO17 wild type 유전자 또는 2개 이상의 아미노산 변이를 유발하는 CyPPO17 변이 유전자들을 형질전환 시킨 후, tiafenacil을 0 uM (control), 50 uM, 및 200 uM 의 농도로 각각 처리한 경우, flumioxazin을 0 uM (control), 100 uM, 및 200 uM 의 농도로 각각 처리한 경우, 및 sulfentrazone 을 0 uM (control), 200 uM, 및 400 uM 의 농도로 각각 처리한 경우의 세포 생장 정도를 각각 보여주는 사진이다.
도 34는 pMAL-c2X 벡터의 개열지도이다.
도 35는 CyPPO16, CyPPO17 야생형 유전자로 형질전환된 애기장대(T2)에 1 uM tiafenacil를 스프레이 처리한 후, 3일차 결과를 보여주는 사진이다.
도 36은 CyPPO16, CyPPO17, 및 이들의 변이 유전자로 형질전환된 애기장대(T2)에 5 uM tiafenacil를 스프레이 처리한 후, 3일차 결과를 보여주는 사진이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. PPO -제초제 복합체 구조 분석을 통한 제초제와 상호작용하는 PPO의 아미노산 정보 획득
Genbank database를 이용하여 스피루리나 서브살사 (Spirulina subsalsa) 및 써모시네코코커스속 NK55a (Thermosynechococcus sp. NK55a) 균주의 PPO 유전자 정보를 획득하였다. 스피루리나 서브살사의 PPO 단백질 (CyPPO16; 서열번호 1)을 암호화하는 유전자로서, 스피루리나 서브살사에서 PPO 유전자(CyPPO16로 명명)를 분리하고 서열최적화하여 서열번호 7의 핵산서열을 갖는 유전자를 준비하였다. 써모시네코코커스속 NK55a 균주의 PPO 단백질 (CyPPO17; 서열번호 3)을 암호화하는 유전자로서, 써모시네코코커스속 NK55a 균주에서 PPO 유전자(CyPPO17로 명명)를 분리하고 서열최적화하여 서열번호 8의 핵산서열을 갖는 유전자를 준비하였다.
PPO 단백질과 제초제의 결합 구조 정보를 확보하기 위해, CyPPO16, CyPPO17 단백질과 PPO 저해 제초제의 대표 예 tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone을 사용하였다. CyPPO10 (써모시네코코커스 에롱가투스 BP-1 (Thermosynechococcus elongatus BP-1) 에서 유래한 PPO 단백질; 서열번호 5)의 구조 정보를 이용하여 SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) 을 이용하여 CyPPO16 및 CyPPO17의 homology model 을 만들었다.
CyPPO10 과 제초제 (tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone)의 결합 정보를 CyPPO16 및 CyPPO17의 구조에 superimpose 하여 각 단백질과 제초제가 결합하는 구조 정보를 확보하였다.
CyPPO10 과 제초제의 결합 정보는 다음의 과정으로 확인하였다: CyPPO10의 단백질을 암호화하는 유전자 (서열번호 6)을 pET29b vector (Catalog Number: 69872-3; EMD Biosciences)에 클로닝하고, 대장균을 사용하여 CyPPO10 단백질을 발현시켰다. 발현된 CyPPO10 단백질을 니켈 친화 크로마토그래피를 통해 순수 분리하였고, 정제된 CyPPO10 단백질에 각 1 mM 농도의 tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone을 첨가하여 CyPPO10 와 tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone 이 결합한 결정을 획득하였다. 단백질-제초제 결합 결정체를 방사광가속기를 이용하여 2.4Å 해상도의 CyPPO10과 tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone 결합체 X-ray 회절데이터를 확보하고, 분자수준의 삼차원 구조를 규명하였다. 이러한 과정을 통해 CyPPO10 단백질 내의 제초제와 결합하는 아미노산 위치에 대한 정보를 획득하였다.
상기 얻어진 CyPPO10 단백질 내의 제초제와 결합하는 아미노산 위치에 대한 정보를 통해서 CyPPO16 및 CyPPO17 단백질의 제초제 저항성을 부여하는 아미노산 변이 위치에 대한 정보를 얻었다.
그 결과, CyPPO16 단백질 (서열번호 1)에서는 R85, F156, V160, A162, G163, V305, C307, F324, L327, L337, I340 및 F360 위치의 아미노산이 tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone 과 상호작용하고 있고, CyPPO17 단백질 (서열번호 3)에서는 R88, F160, V164, A166, G167, V304, C306, F323, L326, L336, I339 및 F359 위치의 아미노산이 tiafenacil, saflufenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone 과 상호작용하는 것으로 판단하였다.
실시예 2. PPO 변이체의 제조
PPO 저해 제초제 내성을 높이기 위하여 CyPPO16 및 CyPPO17의 PPO 아미노산 서열 중 상기 실시예 1에서 얻어진 제초제와 상호작용하는 위치의 아미노산에 변이를 유발하여 CyPPO16 및 CyPPO17의 변이 유전자를 제작하였다. 먼저, BT3 E. coli 에서 효율적인 제초제 저항성 스크리닝을 위해 CyPPO16, CyPPO17 유전자를 코돈 최적화 (codon optimization)하여 합성하였다 (㈜코스모진텍).
구체적인 실험 과정은 다음과 같다:
표 2의 프라이머를 이용, 다음의 조건 하에서 PCR 을 수행하여 PPO 유전자를 분리 및 증폭시켰다:
PCR 반응액 조건
Template (CyPPO16 또는 CyPPO17의 합성 DNA) 1 ㎕
10X buffer 5 ㎕
dNTP mixture (각 10 mM) 1 ㎕
forward primer (10 uM) 1 ㎕
reverse primer (10 uM) 1 ㎕
DDW 40 ㎕
Pfu-X (Solgent, 2.5 units/㎕) 1 ㎕
Total 50 ㎕
PCR 조건
94℃ 4분 1 cycle
94℃ 30초 25 cycles
56℃ 30초
72℃ 1.5분
72℃ 5분 1 cycle
4℃ 5분 1 cycle
pET303-CT His 벡터 클로닝을 위한 프라이머 서열 정보
균주 프라이머 서열 서열번호
Spirulina subsalsa CyPPO16_XbaIF CCCCTCTAGAATGCTAGACTCCCTGATTGT 9
CyPPO16_XhoIR CCCCCTCGAGCTCCCTGCTTCTAATTTTTTG 10
Thermosynechococcus sp. NK55a CyPPO17_XbaIF CCCCTCTAGAATGGAGGTCGATGTTGCAAT 11
CyPPO17_XhoIR CCCCCTCGAGGGATTGCCCCCCACTCAGGT 12
상기 증폭한 유전자 products와 pET303-CT His vector (VT0163; Novagen; 도 1 참조)를 XbaI, XhoI 으로 절단한 후, T4 DNA ligase (RBC, 3 units/㎕)를 이용하여 pET303-CyPPO16과 pET303-CyPPO17 plasmid를 각각 제작하였다.상기 pET303-CT His vector에 클로닝한 CyPPO16과 CyPPO17을 template으로 하여, 아래 표4 및 표 5의 프라이머를 사용하여 다음의 조건 하에서 PCR을 수행하여 CyPPO16과 CyPPO17의 변이 유전자를 제작하였다.
PCR 반응액 조건
Template 1 ㎕
10X buffer 5 ㎕
dNTP mixture (각 10 mM) 1 ㎕
forward primer (10 uM) 1 ㎕
reverse primer (10 uM) 1 ㎕
DDW 40 ㎕
Pfu-X (Solgent, 2.5 units/ ㎕) 1 ㎕
Total 50 ㎕
PCR 조건
94 2분 1cycle
94 30초 17~25cycles
65 40초
72 3.5분
72 5분 1cycle
4 5분 1cycle
CyPPO16 변이 유전자 제작용 프라이머 list
CyPPO16
아미노산 변이 		프라이머 서열 (5'-> 3') 서열번호
F360M F CATCTGCTGACCAATATGATCGGCGGCGCAACG 　13
R CGTTGCGCCGCCGATCATATTGGTCAGCAGATG 　14
F360L F GACCAATTTGATCGGCGGCGCAACGGACCCTG 　15
R CGCCGATCAAATTGGTCAGCAGATGCTCACCC 　16
F360I F CATCTGCTGACCAATATCATCGGCGGCGCAACG 　17
R CGTTGCGCCGCCGATGATATTGGTCAGCAGATG 　18
F360C F TGACCAATTGCATCGGCGGCGCAACGGACCCTG 　19
R CGCCGATGCAATTGGTCAGCAGATGCTCACCC 　20
F360V F CTGACCAATGTCATCGGCGGCGCAACGGACCC 　21
R GCCGATGACATTGGTCAGCAGATGCTCACCCTC 　22
F360T F CATCTGCTGACCAATACCATCGGCGGCGCAACG 　23
R CGTTGCGCCGCCGATGGTATTGGTCAGCAGATG 　24
V305L F TATCCTCCGCTAGCCTGCGTAGTCCTAGCATAC 　25
R CGCAGGCTAGCGGAGGATAGTAAATTTCCTTG 　26
A162L F GTCTCCGGTGTGTATCTTGGCGACGTTGATCAA 　27
R TTGATCAACGTCGCCAAGATACACACCGGAGAC 　28
A162C F GTCTCCGGTGTGTATTGTGGCGACGTTGATCAA 　29
R TTGATCAACGTCGCCACAATACACACCGGAGAC 　30
V305M F ATTTACTATCCTCCGATGGCCTGCGTAGTCCTA 　31
R TAGGACTACGCAGGCCATCGGAGGATAGTAAAT 　32
R85A F GACAGACGTCTACCGGCGTTTGTGTATTGGAAC 　33
R GTTCCAATACACAAACGCCGGTAGACGTCTGTC 　34
F156A F CGTTTAGTCGCACCAGCGGTCTCCGGTGTGTATG 　35
R CATACACACCGGAGACCGCTGGTGCGACTAAACG 　36
V160C F CCATTTGTCTCCGGTTGCTATGCTGGCGACGTTG 　37
R CAACGTCGCCAGCATAGCAACCGGAGACAAATGG 　38
F324V F CGTCCATTGGAAGGTGTGGGTCATCTTATACCC 　39
R GGGTATAAGATGACCCACACCTTCCAATGGACG 　40
L327T F GAAGGTTTTGGTCATACCATACCCAGGAATCAG 　41
R CTGATTCCTGGGTATGGTATGACCAAAACCTTC 　42
I340T F AGGACTCTTGGTACAACCTGGTCCTCCTGTCTC 　43
R GAGACAGGAGGACCAGGTTGTACCAAGAGTCCT 　44
V160C+A162C F TGTCTCCGGTTGCTATTGTGGCGACGTTGATCAAC 45
R GTTGATCAACGTCGCCACAATAGCAACCGGAGACA 46
V160C+A162L F CGCACCATTTGTCTCCGGTTGCTATCTTGGCGACGTTGATCAACTATC 47
R GATAGTTGATCAACGTCGCCAAGATAGCAACCGGAGACAAATGGTGCG 48
CyPPO17 변이 유전자 제작용 프라이머 list
CyPPO17
아미노산 변이 		프라이머 서열 (5'-> 3') 서열번호
F359M F CAAGTTTTTACTTCAATGATCGGTGGAGCAACA 49
R TGTTGCTCCACCGATCATTGAAGTAAAAACTTG 50
F359C F CCACCGATGCATGAAGTAAAAACTTGCCACCC 51
R TTTACTTCATGCATCGGTGGAGCAACAGATCCG 52
F359L F TCCACCGATCAATGAAGTAAAAACTTGCCACCC 53
R TTACTTCATTGATCGGTGGAGCAACAGATCCGG 54
F359I F CAAGTTTTTACTTCAATCATCGGTGGAGCAACA 55
R TGTTGCTCCACCGATGATTGAAGTAAAAACTTG 56
F359V F CAAGTTTTTACTTCAGTCATCGGTGGAGCAACA 57
R TGTTGCTCCACCGATGACTGAAGTAAAAACTTG 58
F359T F CAAGTTTTTACTTCAACCATCGGTGGAGCAACAG 59
R CTGTTGCTCCACCGATGGTTGAAGTAAAAACTTG 60
V304L F TATCCAACACTGGCCTGTGTAGTACTCGCC 61
R CACAGGCCAGTGTTGGATACGGAATGGCCGC 62
A166L F GTCTCTGGCGTGTATCTGGGAGATCCCCAGCAA 63
R TTGCTGGGGATCTCCCAGATACACGCCAGAGAC 64
A166C F GTCTCTGGCGTGTATTGCGGAGATCCCCAGCAA 65
R TTGCTGGGGATCTCCGCAATACACGCCAGAGAC 66
V304M F ATTCCGTATCCAACAATGGCCTGTGTAGTACTC 67
R GAGTACTACACAGGCCATTGTTGGATACGGAAT 68
R88A F GATCGACATCTACCGGCGTACATTTATTGGCGAG 69
R CTCGCCAATAAATGTACGCCGGTAGATGTCGATC 70
F160A F CGTCTGGTGGCACCTGCGGTCTCTGGCGTGTATG 71
R CATACACGCCAGAGACCGCAGGTGCCACCAGACG 72
V164C F CCTTTCGTCTCTGGCTGCTATGCGGGAGATCCC 73
R GGGATCTCCCGCATAGCAGCCAGAGACGAAAGG 74
F323V F GTCAGTACGACCAGGCGTGGGCGTCCTTATACCC 75
R GGGTATAAGGACGCCCACGCCTGGTCGTACTGAC 76
L326T F GGCTTTGGCGTCACTATACCCCGTGGCCAAGGTATCCGTACA 77
R GCCACGGGGTATAGTGACGCCAAAGCCTGGTCGTACTGACCT 78
I339T F CGTACACTCGGCACTACCTGGTCTAGCTGCTTA 79
R TAAGCAGCTAGACCAGGTAGTGCCGAGTGTACG 80
V164C+A166L F CCTTTCGTCTCTGGCTGCTATCTGGGAGATCCCCAGCAA 81
R TTGCTGGGGATCTCCCAGATAGCAGCCAGAGACGAAAGG 82
V164C+A166C F TTCGTCTCTGGCTGCTATTGCGGAGATCCCCAG 83
R CTGGGGATCTCCGCAATAGCAGCCAGAGACGAA 84
상기 얻어진 PCR 용액 10 ㎕에 DpnI(NEB) 1 ㎕을 처리하고, 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 상기 반응 용액을 DH5α competent cell (Biofact)에 열충격 방법으로 형질전환하여 카베니실린 (Gold Biotechnology)이 포함된 LB agar 배지에 배양하였다. 상기 형질전환된 DH5α cell에서 plasmid를 추출하여 sequence를 확인하였다 (㈜코스모진텍).
실시예 3. PPO 및 이의 변이체의 PPO 저해 제초제 내성 검증 (대장균에서 실험)
상기 실시예 2에서 얻어진 변이 PPO 유전자를 PPO가 결핍된 BT3 대장균 (BT3(
Figure 112018124016917-pat00003
PPO))에 형질전환한 후, PPO 저해 제초제를 처리한 환경에서 배양하여, 형질전환 대장균의 생장 저해 여부를 확인하였다. BT3(ΔPPO) 균주는 Hokkaido University (일본)에서 제공받았으며, hemG type PPO가 결여된 대장균이며 카나마이신(kanamycin)에 내성을 가지는 균주이다 ("Watanabe N,　Che FS,　Iwano M,　Takayama S,　Yoshida S,　Isogai A. Dual targeting of spinach protoporphyrinogen oxidase II to mitochondria and chloroplasts by alternative use of two in-frame initiation codons. J. Biol. Chem. 276(23):20474-20481, 2001; Che FS,　Watanabe N,　Iwano M,　Inokuchi H,　Takayama S,　Yoshida S,　Isogai A. Molecular characterization and subcellular localization of protoporphyrinogen oxidase in spinach chloroplasts. Plant Physiol.. 124(1):59-70, 2000" 참조).
구체적인 실험 과정은 다음과 같다:
상기 실시예 2에서 제작된 pET303-CyPPO16과 pET303-CyPPO17 plasmid 및 각각의 변이 유전자들이 포함된 plasmid를 BT3 competent cell에 열충격 방법으로 형질전환하여 카베니실린 (Gold Biotechnology)이 포함된 LB agar 배지에서 배양하였다.
각 유전자가 삽입된 BT3 형질전환체의 종배양은, LB broth (LPSS, 3 ml)에 단일 콜로니를 접종하여 12시간 이상 배양하고, 이 배양액 50~100 ㎕를 새로운 LB broth에 계대하여 흡광도 (OD600)가 0.5~1이 될 때까지 배양, 이 배양액을 LB broth로 희석하여 흡광도를 0.5로 일정하게 맞춰준 후, LB broth로 1/10배씩 4번 희석하여 형질전환 대장균 배양 희석액을 준비하였다.
LB 25g/l, Bacto agar 15g/l, 카베니실린 (100 ㎍/ml) 및 다양한 제초제를 농도별 (최종 0~4,000 uM)로 혼합하여 제초제를 포함하는 배지를 준비하였다. 상기 제초제 stock은 모두 DMSO를 이용하여 제초제를 용해한 것이다.
상기 준비된 형질전환 대장균 배양 희석액을 제초제 배지에 10 ㎕씩 떨어뜨리고, 37℃ 및 광조건 (표 7, 표 9, 도 2 내지 도 6, 도 18 내지 도 22) 또는 암조건 (표 8, 표 10, 도 7 내지 도 17, 도 23 내지 도 33) 하에서 16~20시간 동안 배양하고, 각 유전자를 포함한 형질전환 대장균들의 생장 정도를 육안으로 확인하여, 형질전환 대장균의 PPO 저해 제초제에 대한 내성을 평가하였다.
실험에 사용된 제초제를 아래의 표 6에 정리하였다:
Family 제초제
Pyrimidinedione계 제초제 tiafenacil
saflufenacil
Diphenyl ether계 제초제 fomesafen
acifluorfen
N-phenylphthalimides계 제초제 flumioxazin
Triazolinones계 제초제 sulfentrazone
Oxazolidinediones계 제초제 pentoxazone
Phenylpyrazoles계 제초제 pyraflufen-ethyl
기타 pyraclonil
상기 얻어진 CyPPO16 및 CyPPO17의 변이 유전자들의 제초제 내성을 CyPPO16 및 CyPPO17 야생형과 상대 평가하여 아래의 표 7 내지 표 10 및 도 2 내지 도 33 에 나타내었다:
변이 CyPPO16 단백질 종류별 제초제 내성 평가
No. Mutation site tiafenacil saflufenacil flumioxazin sulfentrazone fomesafen
1 A162C(AC) + +++ ++ + ++
2 A162L(AL) + +++ +++ + ++
3 V305M(VM) + +++ + N.T ++
4 F360V(FV) +++ +++ +++ + +
5 F360C(FC) ++ +++ + ++ ++
6 F360L(FL) +++ +++ +++ + +++
7 F360M(FM) +++ +++ +++ + +++
8 F360I(FI) +++ +++ +++ ++ +
WT - - - - -
No. Mutation site acifluorfen pentoxazone pyraflufen -ethyl pyraclonil
1 A162C(AC) ++ ++ +++ ++
2 A162L(AL) ++ ++ +++ ++
3 V305M(VM) ++ + +++ +
4 F360V(FV) + + ++ +
5 F360C(FC) ++ ++ +++ ++
6 F360L(FL) + + ++ +
7 F360M(FM) + + ++ +
8 F360I(FI) + + ++ +
WT - - - -
N. T (Not tested)
변이 CyPPO16 단백질 종류별 제초제 내성 평가
No. Mutation site tiafenacil flumioxazin sulfentrazone
1 R85A+F360I +++++ +++++ +++
2 R85A+F360V +++ +++ +++
3 R85A+F360M +++ +++ +++
4 V160C+F360I +++ ++++ +++
5 V160C+F360V +++ +++ +++
6 V160C+F360M +++ ++++ +++
7 A162L+F360I ++++ ++++ +
8 A162L+F360V ++++ ++++ ++++
9 A162L+F360M +++++ +++++ +++
10 A162C+F360I ++++ +++ +++
11 A162C+F360V ++++ ++++ +++
12 A162C+F360M +++++ +++++ ++++
13 V305M+F360I +++++ +++++ ++
14 V305M+F360V ++++ ++++ +
15 V305M+F360M +++ ++++ +
16 L327T+F360I +++++ +++++ +++
17 L327T+F360V ++++ ++++ +++++
18 L327T+F360M ++++ ++++ ++
19 R85A+V160C+F360I +++++ +++++ ++++
20 R85A+A162L+F360M +++++ +++++ ++++
21 R85A+V305M+F360I +++++ +++++ ++++
22 R85A+L327T+F360M +++++ +++++ ++++
23 V160C+A162L+F360I ++++ ++++ +++
24 V160C+V305M+F360M +++++ +++++ +++
25 V160C+L327T+F360I +++++ +++++ ++++
26 A162L+V305M+F360M +++++ +++++ ++++
27 A162C+L327T+F360M +++++ +++++ ++++
28 V305M+L327T+F360M +++++ +++++ ++++
29 R85A+V160C+A162L+F360I +++++ +++++ +++++
30 R85A+V160C+V305M+F360M +++++ +++++ ++++
31 R85A+V160C+L327T+F360I +++++ +++++ +++++
32 R85A+A162L+V305M+F360M +++++ +++++ ++++
33 R85A+V305M+L327T+F360M +++++ +++++ +++++
34 V160C+A162L+V305M+F360I +++++ +++++ +++++
35 V160C+A162C+L327T+F360M +++++ +++++ +++++
36 A162C+V305M+L327T+F360M +++++ +++++ ++++
37 R85A+V160C+A162L+V305M+F360M +++++ +++++ +++++
38 V160C+A162C+V305M+L327T+F360M +++++ +++++ +++++
WT - - -
변이 CyPPO17 단백질 종류별 제초제 내성 평가
No. Mutation site tiafenacil saflufenacil flumioxazin sulfentrazone fomesafen
1 A166C(AC) + +++ ++ + +
2 A166L(AL) ++ +++ ++ ++ ++
3 V304M(VM) ++ +++ ++ N.T ++
4 V304L(VL) + + N.T N.T N.T
5 F359M(FM) ++ +++ ++ ++ ++
6 F359I(FI) ++ +++ ++ ++ +
7 F359L(FL) ++ +++ ++ ++ +
8 F359C(FC) ++ +++ ++ + +
9 F359V(FV) ++ +++ ++ ++ +
WT - - - - -
No. Mutation site acifluorfen pyraclonil pentoxazone pyraflufen -ethyl
1 A166C(AC) +++ N.T + ++
2 A166L(AL) +++ + ++ ++
3 V304M(VM) +++ N.T + +
4 V304L(VL) N.T N.T N.T N.T
5 F359M(FM) +++ + ++ ++
6 F359I(FI) + + ++ ++
7 F359L(FL) + + + ++
8 F359C(FC) + + + +
9 F359V(FV) + + ++ ++
WT - - - -
N. T (Not tested)
변이 CyPPO17 단백질 종류별 제초제 내성 평가
No. Mutation site tiafenacil flumioxazin sulfentrazone
1 R88A+F359I ++ ++ ++
2 R88A+F359V ++ ++ ++
3 R88A+F359M ++++ ++++ ++++
4 V164C+F359I ++ +++ +++
5 V164C+F359V ++ +++ +++
6 V164C+F359M ++ ++ ++
7 A166L+F359I ++++ ++++ +++
8 A166L+F359V ++++ +++ +++
9 A166L+F359M ++++ ++++ +++
10 A166C+F359I ++++ ++++ ++++
11 A166C+F359V +++ +++ ++++
12 A166C+F359M +++ +++ +++
13 V304M+F359I +++ +++ ++
14 V304M+F359V +++ +++ ++
15 V304M+F359M +++ +++ ++
16 L326T+F359I ++++ ++++ +++
17 L326T+F359V ++++ ++++ +++
18 L326T+F359M ++++ ++++ +++
19 R88A+V164C+F359I ++++ ++++ ++++
20 R88A+A166L+F359M +++++ +++++ ++++
21 R88A+V304M+F359I ++++ ++++ +++
22 R88A+L326T+F359M +++++ +++++ ++++
23 V164C+A166L+F359I +++++ +++++ ++++
24 V164C+V304M+F359M ++++ ++++ +++
25 V164C+L326T+F359I ++++ ++++ +++
26 A166L+V304M+F359M ++++ ++++ +++
27 A166L+L326T+F359I +++++ +++++ ++++
28 V304M+L326T+F359M ++++ ++++ +++
29 R88A+V164C+A166L+F359I +++++ +++++ ++++
30 R88A+V164C+V304M+F359I +++++ +++++ ++++
31 R88A+V164C+L326T+F359M +++++ +++++ ++++
32 R88A+A166L+V304M+F359I +++++ +++++ +++
33 R88A+A166L+L326T+F359M +++++ +++++ ++++
34 R88A+V304M+L326T+F359M +++++ +++++ ++++
35 V164C+A166L+V304M+F359I +++++ +++++ ++++
36 V164C+A166L+L326T+F359M +++++ +++++ ++++
37 A166L+V304M+L326T+F359I +++++ +++++ ++++
38 R88A+V164C+A166L+V304M+F359I +++++ +++++ ++++
39 R88A+V164C+A166L+L326T+F359M +++++ +++++ ++++
40 V164C+A166L+V304M+L326T+F359M +++++ +++++ ++++
41 R88A+V164C+A166C+V304M+L326T+F359M +++++ +++++ ++++
WT - - -
상기 표 7 내지 표 10에서, 야생형의 제초제 내성 수준을 "-"으로 표시하고, 내성 수준이 높을수록 "+"를 덧붙여 최대 "+++++"까지 등급을 정하여 평가하였다 (각 실험마다 처리한 제초제의 최종처리 농도에서 wild type PPO의 형질전환 대장균의 생장정도를 기준으로, wild type PPO 대비 1~9배 수준을 "+", 10~99배 수준을 "++", 100~999배 수준을 "+++", 1,000~9,999배 수준을 "++++", 10,000배 이상 수준을 "+++++"로 평가함).
도 2 내지 도 17 (CyPPO16의 야생형 또는 변이체) 및 도 18 내지 도 33 (CyPPO17의 야생형 또는 변이체)은 CyPPO 유전자 (야생형 또는 변이체)가 형질전환된 대장균의 배양 결과를 보여주는 사진으로, 상단에 기재된 농도는 제초제 처리 농도이며, 각 농도별 5개의 컬럼은 대장균 배양액을 10배씩 희석한 결과를 나타낸 것으로, 가장 왼쪽 컬럼이 OD600=0.5인 대장균 배양액의 실험 결과이고, 오른쪽으로 갈수록 10배씩 희석된 배양액의 실험 결과이다.
상기 표 7 내지 표 10 및 도 2 내지 도 33 에서 보여지는 바와 같이, CyPPO16 및 CyPPO17의 변이 유전자가 도입된 형질전환체는 모두 다양한 종류의 제초제에 대하여 야생형 유전자가 도입된 형질전환체 대비 높은 수준의 제초제 내성을 나타냄을 확인할 수 있다.
실시예 4: PPO의 효소 활성 및 제초제별 IC 50 값 측정
PPO 단백질 및 특정 위치의 아미노산을 변이시킨 PPO 단백질 변이체의 효소 활성을 측정하고 PPO저해 제초제에 의한 inhibition assay를 수행하였다. PPO 단백질은 수용성이 낮지만, MBP (maltose binding protein)와 함께 fusion protein (MBP-PPO)으로 발현시킬 경우 안정적으로 수용성 단백질이 발현되는 것을 확인하여, 하기의 야생형 및 변이형 단백질을 MBP와의 융합 단백질 형태로 발현시켜서 본 실험에 사용하였다.
CyPPO16 및 CyPPO17의 야생형 유전자 및 변이 유전자를 발현시키기 위하여, 다음의 조건으로 pMAL-c2x-CyPPO16, pMAL-c2x-CyPPO17 를 제작하였다.
구체적인 실험 과정은 다음과 같다:
표 12의 프라이머를 이용, 다음의 조건 하에서 PCR 을 수행하여 PPO 유전자를 분리 및 증폭시켰다:
PCR 반응액 조건
Template (CyPPO16 또는 CyPPO17의 합성 DNA) 1 ㎕
10X buffer 5 ㎕
dNTP mixture (각 10 mM) 1 ㎕
Forward primer (10 uM) 1 ㎕
Reverse primer (10 uM) 1 ㎕
DDW 40 ㎕
Pfu-X (Solgent, 2.5 units/ ㎕) 1 ㎕
Total 50 ㎕
PCR 조건
94 ℃ 4분 1 cycle
94 ℃ 30초 27 cycles
56 ℃ 30초
72 ℃ 2분
72 ℃ 5분 1 cycle
4 ℃ 5분 1 cycle
pMAL-c2x 벡터에 클로닝 하기 위한 프라이머 서열 정보
균주 프라이머 서열 서열번호
Spirulina subsalsa CyPPO16_BamHIF CCCCGGATCCATGCTAGACTCCCTGATTGT 85
CyPPO16_SalIR CCCCGTCGACTCACTCCCTGCTTCTAATTTTTTG 86
Thermosynechococcus sp. NK55a CyPPO17_BamHIF CCCCGGATCCATGGAGGTCGATGTTGCAAT 87
CyPPO17_SalIR CCCCGTCGACTCAGGATTGCCCCCCACTCAGGT 88
상기 증폭한 유전자 products와 pMAL-c2x vector (도 34 참조)를 BamHI, SalI 으로 절단한 후, T4 DNA ligase (RBC, 3 units/㎕)를 이용하여 pMAL-c2x-CyPPO16과 pMAL-c2x-CyPPO17 plasmid를 각각 제작하였다.상기 pMAL-c2x vector에 클로닝 한 CyPPO16과 CyPPO17을 template으로 하여, 표 4 및 표 5의 프라이머를 사용하여 다음의 조건 하에서 PCR을 수행하여 CyPPO16과 CyPPO17의 변이 유전자를 제작하였다.
PCR 반응액 조건
Template 1 ㎕
10X buffer 5 ㎕
dNTP mixture (각 10 mM) 1 ㎕
Forward primer (10 uM) 1 ㎕
Reverse primer (10 uM) 1 ㎕
DDW 40 ㎕
Pfu-X (Solgent, 2.5 units/㎕) 1 ㎕
Total 50 ㎕
제작된 변이 plasmid를 BL21CodonPlus(DE3) 대장균에 형질전환하였다.
상기 얻어진 형질전환 대장균을 다음의 조건으로 배양하여 PPO 유전자를 발현시켰다:
Induction: OD600=0.2, 최종농도 0.3 mM IPTG 첨가;
발현온도: 23 ℃, 200 rpm의 진탕 배양;
발현시간: 16hrs;
배양규모: 200 ml/1,000 ml flask.
상기 배양된 형질전환 대장균에 대하여 다음의 과정으로 세포 파쇄 및 단백질 추출을 수행하였다:
추출 버퍼: Column buffer (50 mM Tris-Cl, pH8.0, 200 mM NaCl) 5 ml buffer/g cell;
Sonication: SONICS&MATERIALS社 VCX130 (130 watts);
15 sec ON, 10 sec OFF for 5 min on ice;
4 ℃ 및 20분 조건 하에서 원심분리 (20,000 x g); 및
상기 원심분리로 얻어진 상층액을 column buffer를 사용하여 1:6 비율로 희석하였다.
상기 얻어진 단백질 추출물에 대하여 다음의 과정을 4 ℃ 에서 수행하여 PPO 단백질의 정제를 수행하였다. 1.5 x 15 cm column (Bio-Rad Econo Columns 1.5 x 15 cm, glass chromatography column, max. vol)에 amylose resin (New England Biolabs)을 부어 컬럼을 packing하고, 상기 얻어진 단백질 추출물을 컬럼에 0.2 ml/min의 속도로 로딩하였다. 상기 컬럼을 컬럼 부피 기준으로 3부피배의 column buffer로 washing 후 washing액 내의 단백질 양을 확인하여 더 이상 단백질이 검출되지 않으면 washing을 종료하였다. 상기 컬럼 부피 기준으로 약 2부피배의 20 mM maltose 를 포함하는 column buffer로 MBP-PPO 단백질을 elution (1.5 ml tube에 각 fraction을 분취)하면서 각 eluant의 단백질 농도를 확인하였다. 더 이상 단백질이 검출되지 않으면 elution을 종료시켰다. 각 fraction을 10 ㎕의 양으로 취하여 단백질 정량 후 단백질이 검출된 fraction을 SDS-PAGE로 분석하고, 순도가 높은 fraction을 취하여 효소 활성 분석 실험에 사용하였다.
PPO 단백질의 기질인 프로토포르피리노겐 IX (Protoporphyrinogen IX)를 합성하였다. 이 과정은 질소기체가 streaming 되는 공간에서 수행되었다. 프로토포르피린 IX (protoporphyrin IX) 9 mg을 20% (v/v) EtOH 20 ml에 용해시키고, dark condition에서 30분간 교반하였다. 상기 얻어진 프로토포르피린 IX 용액을 15 ml screw tube에 800 ㎕의 양으로 넣고 5분간 질소 기체를 flushing하였다. 여기에 아말감나트륨 (sodium amalgam) 1.5 g을 넣고 2분간 vigorous shaking하였다. Tube 안의 수소 기체를 배출하기 위해 뚜껑을 열어두었다. 그 후, 뚜껑을 닫고 3분간 인큐베이션한 후, syringe와 cellulose membrane filter를 이용해 프로토포르피리노겐 IX 용액을 filtering하였다. 상기 얻어진 프로토포르피리노겐 IX 용액 600 ㎕에 2M MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]를 약 300 ㎕의 양으로 첨가하여 pH를 8.0으로 조절하였다. PPO 단백질의 효소 활성을 측정하기 위하여 다음의 조성으로 reaction mixture를 준비하였다 (10 ml 기준: 50 mM Tris-Cl (pH 8.0); 50 mM NaCl; 0.04% (v/v) Tween 20; 40 mM glucose (0.072g); 5 units glucose oxidase (16.6 mg); 및 10 units catalase (1 ㎕)).
상기 reaction mixture 180 ㎕를 96 well plates에 넣고 앞서 정제된 PPO 단백질 (상기 MBP-fusion 단백질을 정제한 산물) 20 ㎕를 첨가하였으며, 약 50 ㎕의 mineral oil로 표면을 커버하였다. 기질인 프로토포르피리노겐 IX 용액을 최종농도 50 uM이 되도록 첨가하고 실온에서 30분간 반응시켰다. Microplate reader (Hidex社 sense)를 이용하여 프로토포르피린 IX 의 형광을 측정하였다 (excitation: 405 nm; emission: 633 nm). PPO 효소 활성값을 계산하기 위해, 상기 프로토포르피리노겐 IX 용액이 들어있는 튜브를 공기중에 개방하여 용액을 12 시간 이상 산화시켰다. 여기에 2.7 N HCl를 첨가하고 408 nm에서의 흡광도 (absorbance)를 측정하였다. Standard 프로토포르피린 IX을 이용해 standard curve를 작성하고 이를 이용해 프로토포르피리노겐 IX의 농도를 calibration하여 PPO 활성을 측정하였다.
상기 얻어진 PPO 야생형 및 변이체의 효소 활성은 아래의 표 14, 표 15와 같다. 변이체 활성은 야생형 대비 상대적 활성값으로 표기하였다.
한편, CyPPO16과 CyPPO17의 효소활성능력을 평가하기 위해 각 효소의 최대반응속도 (Vmax, The maximal velocity) 값을 구하였다. 초기반응속도는 기질 농도를 달리하여 농도에 따라 반응속도가 비례하는 구간을 선정하였으며, 상온에서 20분간 time course로 효소 반응 산물인 프로토포르피린 IX의 생성량을 측정하였다. Vmax값은 미카엘리스-멘텐식에 의해 enzyme kinetics 분석프로그램으로 계산하였으며, 대조군으로 애기장대 PPO를 사용하였다. 상기 얻어진 결과를 표 13에 나타내었다:
CyPPO16과 CyPPO17의 Vmax
CyPPO16 CyPPO17 AtPPO1
Vmax (nmole mg protein-1 min-1) 336 378 135
상기 결과로부터 CyPPO16과 CyPPO17의 Vmax 값이 애기장대 PPO보다 약 두 배 이상 높은 것을 확인 할 수 있었다. 결론적으로 CyPPO16과 CyPPO17의 PPO 단백질이 식물 유래의 애기장대 PPO 보다 PPO 효소로써의 능력이 더 뛰어남을 보여준다.또한, 변이체별 PPO 효소 활성을 50% 저해하는 농도(IC50)를 각 제초제별로 측정하였으며, 각 제초제의 최종 처리 농도는 아래와 같이 하였다:
- 제초제 (tiafenacil, flumioxazin, 또는 sulfentrazone)의 최종농도: 0, 10, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000 nM
IC50값은 상기한 효소 활성 측정 과정에 제초제를 상기 농도로 첨가하여 PPO 효소 활성을 제초제 첨가 전의 50%로 저해하는 제초제의 농도를 의미한다.
이와 같이 얻어진 제초제 별 IC50을 아래의 표14 및 표 15에 나타내었다:
변이 CyPPO16 단백질 종류별 제초제 IC50 측정
No. Mutation site Activity (%) tiafenacil (nM) flumioxazin (nM) sulfentrazone (nM)
1 WT 100 26 14 245
2 R85A 94 119 59 1,036
3 F156A 57 60 N.T　 N.T　
4 V160C 96 45 57 584
5 A162C 80 79 N.T　 N.T　
6 A162L 69 193 578 1,096
7 V305M 72 43 38 305
8 F324V 23 103 N.T　 N.T　
9 L327T 68 40 780 1,827
10 I340T 22 230 N.T　 N.T　
11 F360M 83 168 472 1,203
12 F360I 74 1,738 835 1,363
13 F360V 69 939 667 1,962
14 F360T 25 2,500 N.T N.T
15 R85A + F360M 63 1,022 567 >10,000　
16 F156A + F360M 18 237 N.T　 N.T　
17 V160C + F360M 67 405 1,002 4,371
18 A162C + F360M 56 2,162 N.T　 N.T　
19 A162L + F360M 45 >5,000 4,058 >10,000　
20 V305M + F360M 35 476 1,182 3,631
21 F324V + F360M 13 4,056 N.T　 N.T　
22 L327T + F360M 21 3,763 5,000 >10,000　
23 I340T + F360M 16 >5,000 N.T　 N.T　
24 A162C + L327T + F360M 17 3,915 >5,000 >10,000
25 R85A + A162C + L327T + F360M 15 4,683 >5,000 >10,000
26 R85A + V160C + A162C + L327T + F360M 15 >5,000 >5,000 >10,000
27 R85A + V160C + A162C + V305M + L327T + F360M 13 >5,000 >5,000 >10,000
N.T (Not tested)
변이 CyPPO17 단백질 종류별 제초제 IC50 측정
No. Mutation site Activity (%) tiafenacil (nM) flumioxazin (nM) sulfentrazone (nM)
1 WT 100 44 26 326
2 R88A 70 152 95 4,426
3 F160A 63 115 N. T　 N. T　
4 V164C 73 87 58 920
5 A166C 77 219 N. T　 N. T　
6 A166L 70 1,129 2,828 >10,000　
7 V304M 82 102 63 1,089
8 F323V 16 152 N. T　 N. T　
9 L326T 96 194 139 >10,000　
10 I339T 48 122 N. T　 N. T　
11 F359M 90 1,189 379 696
12 F359I 92 1,531 825 >10,000　
13 F359V 84 932 2,052 >10,000　
14 F359T 56 >5,000 N. T　 N. T　
15 R88A + F359M 53 1,284 690 >10,000　
16 F160A + F359M 56 3,927 N. T　 N. T　
17 V164C + F359M 71 2,737 576 1,281
18 A166C + F359M 72 >5,000 N. T N. T
19 A166L + F359M 65 >5,000 >5,000　 >10,000　
20 V304M + F359M 68 >5,000 486 4,536
21 F323V + F359M 8 4,247 N. T　 N. T　
22 L326T + F359M 74 4,792 933 >10,000　
23 I339T + F359M 44 >5,000 N. T　 N. T　
N.T (Not tested)상기 표 14 및 표 15에서 확인되는 바와 같이, CyPPO16과 CyPPO17 모두에서 변이체의 경우에 야생형과 비교하여 tiafenacil의 IC50값이 현저하게 상승하는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 PPO 단백질이 특정 위치의 아미노산 변이에 의하여 제초제에 대한 내성이 증가됨을 입증하는 것이다. 본 실험 결과에서 CyPPO 단백질 변이체가 대체적으로 야생형에 비하여 감소된 효소활성을 갖는 것으로 나타났는데, 이는 PPO 효소가 존재하는 식물의 엽록체 환경과 실험 조건이 동일하지 않아 CyPPO 단백질간 효소 활성의 차이가 크게 나는 것으로, 실제 식물에 형질전환 되어 엽록체에 정상적으로 발현되면 효소 활성 감소가 크지 않을 것으로 예상된다.
실시예 5. CyPPO 변이체를 이용한 애기장대 형질전환체 제작 및 제초제 내성 실험
5-1. 애기장대 형질전환 벡터 제작 및 애기장대 형질전환체 제작
애기장대 형질전환은 선별 마커인 Bar 유전자 (glufosinate 내성 유전자)의 ORF와 각각의 CyPPO16 또는 CyPPO17의 아미노산 변이체 유전자의 ORF를 가진 이원벡터 (binary vector)를 제작하여 수행하였다. 또한, Bar 유전자는 PPO 저해 제초제와 작용 기전이 다른 제초제를 교차 사용하는 경우 그 효과를 확인하기 위하여 사용하였으며, 형질전환한 유전자가 후대에 안정적으로 유전되고 있는지 여부를 검증하는 데에도 사용하였다. Bar 유전자의 발현을 위하여 NOS 프로모터와 전사 종결을 위한 E9 터미네이터를 사용하였다.
CyPPO16, CyPPO16 변이체, CyPPO17, 및 CyPPO17 변이체 각각을 식물체에서 발현시키기 위하여 CaMV35S 프로모터와 NOS 터미네이터를 사용하였다. CyPPO16, CyPPO16 변이체, CyPPO17, 및 CyPPO17 변이체 유전자는 XhoI, BamHI 제한효소를 이용하여 삽입하였다. 또한, 발현된 단백질의 확인을 위해 헤마글루티닌 (hemagglutinin, HA) tag을 BamHI, SacI 제한효소를 이용하여 PPO 유전자의 3' 말단 부위에 삽입하였다. HA tag 뒤에 NOS terminator 가 삽입되어 PPO 유전자의 전사 종결을 유도하였다. 또한, 엽록체로 단백질의 이동과 발현을 유도하기 위해 Arabidopsis thaliana 유래의 PPO 유전자인 AtPPO1 유전자 (서열번호 89)의 transit peptide (TP; 서열번호 90)를 XbaI, XhoI 제한효소를 이용하여 PPO 유전자의 5' 앞에 삽입하였다. 상기에서 제작한 각각의 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) GV3101 competent cell에 freeze-thaw 방법으로 도입하여 형질전환 시켰다. GV3101 competent cell 을 제조하기 위하여, GV3101 균주를 5 ml LB media 에 30 ℃ 및 200 rpm 조건에서 12시간 배양하였다. 이 배양액을 200 ml LB media 에 접종하여 30℃ 및 200 rpm 조건에서 3~4시간 배양하고, 3000 xg, 4℃ 에서 20분간 원심분리 하였다. 멸균 증류수로 pellet을 씻어 준 뒤 20 ml LB media 로 재현탁 (resuspension)하였다. 200 ㎕씩 aliquot 하여 액체 질소에 snap freezing 한 뒤, 초저온 냉동고에 보관하였다.
각각의 형질전환 아그로박테리움을 항생제 배지 (spectinomycin을 포함한 LB agar)에서 배양 및 선별하였다. 상기 선별된 콜로니를 LB broth에서 액체 배양하였다. 이 배양액으로부터 아그로박테리움 cell을 harvest 한 후, 5% (w/v) sucrose 용액에 흡광도 (OD600) 0.8의 농도로 현탁한 후, 0.05% (v/v) Silwet L-77 (Momentive Performance Materials)를 첨가하였다. Floral dipping 방법으로 Col-0 ecotype 애기장대 wild type에 형질전환하여 형질전환 애기장대를 제작하고, 1~2달 후 종자 (T1)를 수확하였다.
형질전환 개체 선발을 위해 삽입된 Bar 유전자를 이용하여 형질전환 개체를 선발하였다. 상기 얻어진 T1 종자를 50 uM glufosinate가 첨가된 1/2 MS 배지 (2.25g/l MS salt, 10g/l sucrose, 7g/l Agar)에 파종하고, 파종 7일 후 생존한 개체를 선발하여 흙으로 이식하고 성장시켜 T1 식물체를 수득하였다.
이식한 T1 식물체들의 PPO 저해 제초제 내성을 판단하기 위해 3~4주 키운 후 추대 전 tiafenacil을 처리하였다. 40 x 60 cm 면적 (0.24 m2) 에 tiafenacil 용액 100 ml (1 uM tiafenacil + 0.05%(v/v) Silwet L-77)을 골고루 분사하였다. 야생형 애기장대 (Col-0 ecotype)의 경우 상기와 동일한 농도 및 양으로 tiafenacil을 처리하면 사멸한다. 상기와 같은 tiafenacil 처리 후 4~7일 경과 후 각 형질전환체들의 PPO 저해 제초제 내성 여부를 판별하였다.
내성을 나타내어 살아남는 식물체는 지속적으로 키워 종자를 수확하였고 (T2 종자), 상기 T2 종자를 50 uM glufosinate를 첨가한 1/2 MS 배지 (2.25g/l MS salt, 10g/l sucrose, 7g/l Agar)에 파종하여 6~7일간 키운 뒤, 생존 개체를 선발하였다.
5-2. 형질전환 애기장대(T 2 )의 제초제 저항성 검증
CyPPO16, CyPPO16 변이체 (F360I, F360M, F360V, A162C+F360M), CyPPO17, 또는 CyPPO17 변이체 (F359I, F359M, F359V, V304M+F359I)를 암호화하는 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체 (T2)에 대하여 제초제 저항성을 테스트하였다.
CyPPO16 또는 CyPPO17의 야생형 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체 (CyPPO16 wild type, CyPPO17 wild type, T2)에 40 x 60 cm 면적 (0.24 m2) 당, tiafenacil 용액 100 ml (1 uM tiafenacil + 0.05% (v/v) Silwet L-77)을 처리하고, 3일 후에 식물의 약해 정도를 판단하였다. 야생형 애기장대 (Col-0 ecotype)을 대조군으로 사용하였다.
상기 얻어진 1 uM tiafenacil 처리 후 3일째의 애기장대 형질전환체(T2)의 성장 정도를 도 35에 나타내었다.
CyPPO16 변이체 또는 CyPPO17 변이체를 암호화하는 변이 유전자가 각각 삽입된 애기장대 형질전환체 (T2)에 40 x 60 cm 면적 (0.24 m2) 당, tiafenacil 용액 100 ml (5 uM tiafenacil + 0.05% (v/v) Silwet L-77)을 처리하고, 3일 후에 식물의 약해 정도를 판단하였다. 야생형 애기장대 (Col-0 ecotype), CyPPO16 wild type 및 CyPPO17 wild type 을 대조군으로 사용하였다.
상기 얻어진 5 uM tiafenacil 처리 후 3일째의 애기장대 형질전환체(T2)의 성장 정도를 도 36에 나타내었다.
상기 도 35, 도 36의 결과를 기초로, 각 형질전환 식물체의 제초제 저항성을 아래의 표 16에 기재된 Injury index의 평가 기준에 의하여 평가하였다:
약해 수준의 정의
Injury index 증상
0 약해가 없음
1 잎 끝이 마른 상태 또는 20% 미만이 누렇게 마름
2 식물체의 20% 이상 30% 미만이 누렇게 마름
2.5 식물체의 30% 이상 50% 미만이 누렇게 마름
3 식물체의 50% 이상 70% 미만이 누렇게 마름
4 식물체의 70% 이상이 누렇게 마름
5 식물 전체가 말라서 죽음
상기와 같이 평가된 각 형질전환 식물체의 제초제 약해 수준 (Injury index)을 아래의 표 17, 표 18 및 표 19에 나타내었다.
CyPPO16 및 CyPPO17 야생형 유전자 형질전환체의 Injury index (1 uM tiafenacil)
Col-0 CyPPO16 wild type CyPPO17 wild type
Injury index 5 2 2
CyPPO16 변이 유전자 형질전환체의 Injury index (5 uM tiafenacil)
Col-0 CyPPO16
Wild type 		F360I F360M F360V A162C
+F360M
Injury index 5 4 2 2 2 2
CyPPO17 변이 유전자 형질전환체의 Injury index (5 uM tiafenacil)
Col -0 CyPPO17
Wild type 		F359I F359M F359V V304M
+ F359I
Injury index 5 4 1 2 1 1
<110> FarmHannong Co., Ltd. <120> Methods and Compositions for Conferring and/or Enhancing Herbicide Tolerance Using Variants of Protoporphyrinogen Oxidase from Cyanobacteria <130> DPP20184867KR <150> 10-2017-0173633 <151> 2017-12-15 <160> 90 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Protoporphyrinogen IX oxidase (CyPPO16) of Spirulina subsalsa) <400> 1 Met Leu Asp Ser Leu Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Leu Ser Ala 1 5 10 15 Ala His Thr Leu Gln Lys Gln Gln Thr Gln Phe Leu Val Thr Glu Ser 20 25 30 Gln Gly Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Asn Arg Gln Gly Asp Tyr 35 40 45 Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Ala Pro Thr Glu Asp Leu Leu 50 55 60 Arg Leu Ala Val Glu Val Gly Leu Lys Glu Asp Leu Val Phe Ala Asp 65 70 75 80 Arg Arg Leu Pro Arg Phe Val Tyr Trp Asn Gln Gln Leu His Pro Val 85 90 95 Pro Met Ser Pro Pro Ala Ala Leu Lys Thr Gln Leu Leu Ser Glu Ala 100 105 110 Gly Lys Trp Arg Ala Ala Leu Gly Ala Leu Gly Phe Val Gly Gly Leu 115 120 125 Val Gly Arg Glu Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Phe Thr Arg His Leu 130 135 140 Gly Thr Glu Val Thr Glu Arg Leu Val Ala Pro Phe Val Ser Gly Val 145 150 155 160 Tyr Ala Gly Asp Val Asp Gln Leu Ser Ala Gln Ala Ala Phe Arg Arg 165 170 175 Val Phe Glu Phe Ala Gln Leu Gly Gly Gly Leu Ala Ala Gly Gly Ile 180 185 190 Leu Ala Arg Arg Gln Ala Pro Pro Lys Ala Pro Pro Asp Pro Ser Leu 195 200 205 Pro Glu Thr Lys Thr Gly Gln Leu Gly Ser Phe Arg Glu Gly Leu Glu 210 215 220 Met Leu Pro Arg Ala Ile Ala Ser Gln Leu Gly Asp Arg Leu Lys Leu 225 230 235 240 Gln Trp Arg Leu Thr His Leu Glu Ile Thr Pro Gln Gln Thr Tyr Leu 245 250 255 Ala His Phe Asn Thr Pro Asp Gly Pro Gln Gln Ile Ala Thr Arg Thr 260 265 270 Leu Ile Leu Thr Thr Pro Ala Pro Ile Thr Ala Asp Leu Leu Lys Pro 275 280 285 Leu Thr Pro Ala Leu His Gly Val Leu Lys Glu Ile Tyr Tyr Pro Pro 290 295 300 Val Ala Cys Val Val Leu Ala Tyr Pro Arg Ala Ala Ser Ala Arg Pro 305 310 315 320 Leu Glu Gly Phe Gly His Leu Ile Pro Arg Asn Gln Gly Ile Arg Thr 325 330 335 Leu Gly Thr Ile Trp Ser Ser Cys Leu Phe Pro Gly Arg Thr Pro Glu 340 345 350 Gly Glu His Leu Leu Thr Asn Phe Ile Gly Gly Ala Thr Asp Pro Gly 355 360 365 Ile Ala Gln Leu Asp Pro Glu Glu Ile Ala Gln Ala Val His Gln Asp 370 375 380 Leu Cys Lys Ile Leu Ile Arg Pro Glu Phe Thr Pro Lys Ile Leu Ala 385 390 395 400 Val Arg Leu Trp Lys Gln Ala Ile Pro Gln Tyr Thr Leu Gly His Leu 405 410 415 Gln Arg Leu Ala Thr Leu Glu Gln Glu Leu Ser Lys Phe Pro Gly Leu 420 425 430 His Ile Leu Ala Asn Tyr Thr Asp Gly Val Ala Leu Gly Asp Cys Val 435 440 445 Lys Arg Gly Val Ala Val Ala Gln Lys Ile Arg Ser Arg Glu 450 455 460 <210> 2 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (CyPPO16 coding gene from Spirulina subsalsa) <400> 2 atgctagact ccctgattgt aggggccgga atatcaggac tctcagctgc acacaccctt 60 cagaagcagc agactcagtt tctggtcacg gaatcccaag ggcgtgtggg tggcaatata 120 acgacgaacc gtcaaggtga ttacttgtgg gaggaaggtc ccaattcttt tgcgccaaca 180 gaggaccttt tacgacttgc tgtcgaggta gggctcaaag aggatctggt attcgccgac 240 agacgtctac cgaggtttgt gtattggaac caacagttac accctgtacc catgagccct 300 cctgcggcgt tgaagactca actactgtca gaagctggaa agtggagagc agcattgggg 360 gcgctgggat ttgtaggcgg ccttgtcgga agagaggaag aaacggttcg acaatttttt 420 acgcgtcatc ttggtacgga agttaccgag cgtttagtcg caccatttgt ctccggtgtg 480 tatgctggcg acgttgatca actatccgcg caagcggcgt ttcgtagagt ctttgagttc 540 gcacagctcg gcggggggtt ggccgcgggg gggattcttg cgcgtcgtca ggccccccca 600 aaagccccac ccgatcccag tttacccgaa accaagactg ggcagttagg ctcttttcgt 660 gaagggctag aaatgctccc cagagcaata gccagccaac tcggagacag gttaaagcta 720 cagtggcgac taacgcatct ggagataact ccccaacaaa cttatttggc gcattttaat 780 actccggatg gcccgcagca aatcgcaaca aggactctga tcctaacaac ccccgctcct 840 atcactgctg atcttcttaa acctttgacg cccgcgcttc atggggtgct caaggaaatt 900 tactatcctc cggtagcctg cgtagtccta gcatacccaa gggccgcgag tgcgcgtcca 960 ttggaaggtt ttggtcatct tatacccagg aatcagggga taaggactct tggtacaatc 1020 tggtcctcct gtctcttccc gggcaggacg cctgagggtg agcatctgct gaccaatttc 1080 atcggcggcg caacggaccc tggtatagcc cagctagatc ctgaggaaat cgctcaagcc 1140 gtccatcaag atttgtgcaa gatactgatc agaccagaat tcactcccaa aatcttagcc 1200 gtcaggctgt ggaagcaagc tattcctcag tatacgctag ggcacttgca gcgacttgca 1260 accttggaac aggagttgtc caagtttcct gggcttcata tcctagctaa ttatacggat 1320 ggtgttgcgc tcggcgattg cgtcaaacgt ggagttgcag tggctcaaaa aattagaagc 1380 agggagtga 1389 <210> 3 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Protoporphyrinogen IX oxidase (CyPPO17) of Thermosynechococcus sp. NK55a) <400> 3 Met Glu Val Asp Val Ala Ile Val Gly Gly Gly Leu Ser Gly Leu Ser 1 5 10 15 Val Ala Trp Arg Leu Gln Gln Ser Ala Pro Gln Tyr Ser Gly Val Leu 20 25 30 Leu Glu Ala Ser Asp Arg Leu Gly Gly Asn Ile Thr Thr Gln Gly Ala 35 40 45 Glu Gly Phe Val Trp Glu Leu Gly Pro Asn Ser Phe Ala Pro Thr Pro 50 55 60 Ala Leu Leu Gln Leu Ile Ala Glu Val Gly Leu His Ser Glu Leu Ile 65 70 75 80 Arg Gly Asp Arg His Leu Pro Arg Tyr Ile Tyr Trp Arg Gly Glu Leu 85 90 95 Tyr Pro Leu Glu Pro Thr Arg Pro Leu Ala Leu Ala Thr Ser Asn Leu 100 105 110 Leu Ser Pro Trp Gly Lys Val Arg Ala Ala Leu Gly Ala Leu Gly Phe 115 120 125 Val Pro Pro Tyr Leu Gly Ser Gly Asp Glu Ser Val Asn Ser Phe Phe 130 135 140 Arg Arg His Leu Gly Gln Glu Val Ala Glu Arg Leu Val Ala Pro Phe 145 150 155 160 Val Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Gln Gln Leu Ser Ala Ala Ala 165 170 175 Ala Phe Arg Arg Ile Ala Gln Leu Glu Lys Leu Gly Gly Gly Leu Ile 180 185 190 Ala Gly Ala Leu Arg Leu Arg Arg Gln Gln Pro Pro Lys Pro Arg Pro 195 200 205 Pro Ala Glu Val Gln Met Arg Pro Gly Glu Leu Gly Ser Phe Lys Glu 210 215 220 Gly Leu Ala Ala Leu Pro Arg Ala Ile Ala Gln Gln Leu Lys Ala Pro 225 230 235 240 Val His Leu Gln Thr Pro Val Glu Ala Ile Thr Pro Glu Pro Asn Gly 245 250 255 Gly Tyr Leu Leu Arg Ser Gly Glu Gln Thr Trp Gln Ala Arg Ser Val 260 265 270 Val Leu Ala Thr Pro Ala Tyr Gln Thr Ala Ala Leu Val Ala Pro Phe 275 280 285 Gln Pro Ala Ile Ala Arg Val Leu Ala Ala Ile Pro Tyr Pro Thr Val 290 295 300 Ala Cys Val Val Leu Ala Tyr Pro Ala Gly Leu Gly Arg Ser Val Arg 305 310 315 320 Pro Gly Phe Gly Val Leu Ile Pro Arg Gly Gln Gly Ile Arg Thr Leu 325 330 335 Gly Thr Ile Trp Ser Ser Cys Leu Phe Pro Gln Arg Thr Pro Ala Gly 340 345 350 Trp Gln Val Phe Thr Ser Phe Ile Gly Gly Ala Thr Asp Pro Asp Leu 355 360 365 Ala Ser Leu Arg Glu Glu Ala Ile Val Gln Gln Val Gln Gln Asp Leu 370 375 380 Thr Arg Leu Leu Asp Leu Pro Ala Ala Lys Ala Arg Leu Leu Gly Met 385 390 395 400 Lys Val Trp Arg Arg Ala Ile Pro Gln Tyr Leu Val Gly Tyr Pro Gln 405 410 415 Gln Trp Gln Gln Val Thr His Ala Leu Ser Gln Thr Pro Gly Leu Phe 420 425 430 Leu Cys Ser Asn Tyr Ala Glu Gly Val Ala Leu Gly Asp Arg Val Glu 435 440 445 His Gly Asn Arg Thr Ala Ala Ala Val Ala Ala Tyr Leu Ser Gly Gly 450 455 460 Gln Ser 465 <210> 4 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (CyPPO17 coding gene from Thermosynechococcus sp. NK55a) <400> 4 atggaggtcg atgttgcaat tgtcggcggc ggcctgtcag gcttgagcgt tgcctggcgt 60 ctccagcagt ctgctcctca atacagtggc gttctattgg aagcgtcaga ccgtctaggt 120 gggaacatta ctacgcaagg ggcagagggg ttcgtgtggg aactaggccc taacagcttc 180 gctccgactc ccgcgctttt acagcttata gcagaagtag ggcttcactc cgagcttata 240 cgtggcgatc gacatctacc gcgatacatt tattggcgag gcgaacttta tccattggag 300 ccgaccaggc cgcttgcttt ggcaacaagc aatctcctct ctccatgggg taaggtcaga 360 gcagcgttgg gcgccctcgg gtttgtcccc ccgtatctcg gatctggcga tgaatccgtt 420 aattcatttt tccgacgaca cctaggtcag gaggtagccg aacgtctggt ggcacctttc 480 gtctctggcg tgtatgcggg agatccccag caactgtccg ccgccgctgc atttagacga 540 atagcgcagc tggaaaaact aggtggggga ctcatagcag gagcattgag gctgaggaga 600 cagcaacccc ccaaacccag gcccccggca gaggttcaaa tgcgacccgg tgagttgggg 660 tctttcaaag agggattggc cgccttgcca cgtgcaatag ctcaacagct gaaagcacca 720 gtgcacctac aaaccccagt cgaagcaatc acgccggagc ccaacggagg ttatctactc 780 agatccggcg aacagacttg gcaagcgaga agcgtcgtcc tagcaacacc tgcctatcag 840 accgcagcat tagtggcgcc gtttcaacct gcaatagcgc gagtgttagc ggccattccg 900 tatccaacag tggcctgtgt agtactcgcc tatcccgcgg gactaggcag gtcagtacga 960 ccaggctttg gcgtccttat accccgtggc caaggtatcc gtacactcgg cactatatgg 1020 tctagctgct tatttccaca gcgaactcca gctgggtggc aagtttttac ttcattcatc 1080 ggtggagcaa cagatccgga cctcgcctca ctgagggaag aagcgatcgt tcaacaggtg 1140 caacaggact tgacccgtct acttgatctt cctgccgcca aggcgagact cctcggtatg 1200 aaagtgtggc gaagggcgat cccacaatac ttggtagggt atccacagca atggcagcaa 1260 gtaacccatg cccttagtca gacgccgggc cttttcctgt gtagtaacta cgccgagggc 1320 gtggcattag gcgacagggt tgaacatggt aacaggaccg ctgcggcagt ggccgcgtac 1380 ctgagtgggg ggcaatcctg a 1401 <210> 5 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Protoporphyrinogen IX oxidase (CyPPO10) of Thermosynechococcus elongatus BP-1) <400> 5 Met Ile Glu Val Asp Val Ala Ile Val Gly Gly Gly Leu Ser Gly Leu 1 5 10 15 Ser Val Ala Trp Arg Leu Gln Arg Ser Ala Pro His Tyr Ser Gly Val 20 25 30 Leu Leu Glu Ala Ser Asp Arg Leu Gly Gly Asn Ile Thr Thr Gln Ala 35 40 45 Ala Glu Gly Phe Val Trp Glu Leu Gly Pro Asn Ser Phe Ala Pro Thr 50 55 60 Pro Ala Leu Leu Gln Leu Ile Ala Glu Val Gly Leu His Ser Glu Leu 65 70 75 80 Ile Arg Gly Asp Arg His Leu Pro Arg Tyr Ile Tyr Trp Arg Gly Glu 85 90 95 Leu Tyr Pro Leu Glu Pro Thr Arg Pro Leu Ala Leu Ala Thr Ser Asn 100 105 110 Leu Leu Ser Pro Trp Gly Lys Val Arg Ala Ala Leu Gly Ala Leu Gly 115 120 125 Phe Val Pro Pro Tyr Leu Gly Ser Gly Asp Glu Ser Val Asp Ser Phe 130 135 140 Phe Arg Arg His Leu Gly Gln Glu Val Ala Glu Arg Leu Val Ala Pro 145 150 155 160 Phe Val Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Gln Gln Leu Ser Ala Ala 165 170 175 Ala Ala Phe Arg Arg Ile Ala Gln Leu Glu Lys Leu Gly Gly Ser Leu 180 185 190 Ile Ala Gly Ala Leu Arg Leu Arg Arg Gln Gln Pro Pro Gln Pro Lys 195 200 205 Pro Pro Ala Gln Val Gln Met Arg Pro Gly Glu Leu Gly Ser Phe Arg 210 215 220 Glu Gly Leu Ala Ala Leu Pro Arg Ala Ile Ala Gln Gln Leu Lys Ala 225 230 235 240 Pro Leu His Leu Gln Thr Pro Val Glu Ala Ile Thr Pro Glu Pro Lys 245 250 255 Gly Gly Tyr Leu Leu Arg Ser Gly Glu Gln Thr Trp His Ala Arg Ser 260 265 270 Val Val Leu Ala Thr Pro Ala Tyr Gln Thr Ala Glu Leu Val Ala Pro 275 280 285 Phe Gln Pro Ala Ile Ala Arg Ala Leu Ala Thr Ile Pro Tyr Pro Thr 290 295 300 Val Ala Cys Val Val Leu Ala Tyr Pro Ala Gly Leu Gly Arg Ser Val 305 310 315 320 Arg Pro Gly Phe Gly Val Leu Val Pro Arg Gly Gln Gly Ile Arg Thr 325 330 335 Leu Gly Thr Ile Trp Ser Ser Cys Leu Phe Pro Gln Arg Thr Pro Ala 340 345 350 Gly Trp Gln Val Phe Thr Ser Phe Ile Gly Gly Ala Thr Asp Pro Asp 355 360 365 Leu Ala Ser Leu Arg Glu Glu Ala Ile Val Glu Gln Val Gln Gln Asp 370 375 380 Leu Thr Arg Leu Leu Asp Leu Pro Ala Ala Lys Ala Arg Leu Leu Gly 385 390 395 400 Met Lys Val Trp Arg Arg Ala Ile Pro Gln Tyr Ile Val Gly Tyr Pro 405 410 415 Gln Gln Trp Gln Gln Val Thr His Ala Leu Thr Gln Thr Pro Gly Leu 420 425 430 Phe Leu Cys Ser Asn Tyr Ala Glu Gly Val Ala Leu Gly Asp Arg Val 435 440 445 Glu His Gly Asn Arg Thr Ala Ala Ala Val Ala Ala Tyr Leu Ala Gly 450 455 460 Gly Gln Ser 465 <210> 6 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (CyPPO10 coding gene) <400> 6 atgattgaag tggatgtggc tattgttggt ggtggtctta gtggattgtc agtggcttgg 60 agattacaga ggagtgctcc tcattattct ggagttcttc ttgaggcttc tgatagactt 120 ggaggtaata tcactacaca agctgctgaa ggatttgtgt gggagcttgg tccaaacagt 180 ttcgctccta ctccagcact cttacagttg attgctgaag ttggactcca ttctgagtta 240 atcagaggag ataggcacct tccaagatat atatactgga ggggagaact ttatcctttg 300 gagccaacta ggcctcttgc tttggcaaca tcaaatcttt tgagtccttg gggaaaggtt 360 agagctgcac tcggagcttt aggttttgtg cctccatatc ttggatctgg agatgaaagt 420 gttgattctt tctttagaag gcatcttgga caagaagttg ctgagagatt ggtggcacca 480 tttgtttcag gagtgtacgc tggagatcct caacagcttt ctgctgctgc tgcttttaga 540 aggattgctc aacttgagaa gttgggaggt tcattgatcg ctggagcact cagattaaga 600 aggcaacagc ctccacagcc aaaacctcca gctcaagtgc agatgagacc tggagaactc 660 ggtagtttta gggagggtct cgctgcatta cctagagcta tcgcacaaca gttgaaggca 720 ccacttcatt tgcaaacacc tgttgaagct attacccctg agccaaaagg aggttatctc 780 ttaaggagtg gtgaacagac ttggcacgct agatcagttg tgttggctac tccagcatac 840 caaactgctg aacttgttgc accattccag cctgctatcg ctagagcttt ggctaccata 900 ccttatccaa ctgttgcttg tgttgtgctt gcttaccctg ctggattggg tagatcagtt 960 agacctggat ttggtgtttt ggtgcctaga ggacaaggta taaggacact cggaaccatt 1020 tggtcttcat gcttattccc acaaagaact cctgctggtt ggcaggtttt tacctctttc 1080 ataggaggtg ctactgatcc tgatcttgca tcattgagag aagaggctat tgttgaacaa 1140 gtgcaacagg atctcacaag gcttcttgat cttcctgctg caaaggcaag actcttgggt 1200 atgaaggttt ggagaagggc tattccacaa tatatcgttg gttaccctca acagtggcaa 1260 caggtgacac acgctcttac ccagactcct ggtctcttct tatgttcaaa ctacgctgag 1320 ggagttgcat tgggagatag agtggaacac ggaaatagga ctgctgctgc tgtggctgct 1380 tacctcgctg gtggacaatc ataa 1404 <210> 7 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Optimized codon encoding CyPPO16) <400> 7 atgctagact ccctgattgt aggggccgga atatcaggac tctcagctgc acacaccctt 60 cagaagcagc agactcagtt tctggtcacg gaatcccaag ggcgtgtggg tggcaatata 120 acgacgaacc gtcaaggtga ttacttgtgg gaggaaggtc ccaattcttt tgcgccaaca 180 gaggaccttt tacgacttgc tgtcgaggta gggctcaaag aggatctggt attcgccgac 240 agacgtctac cgaggtttgt gtattggaac caacagttac accctgtacc catgagccct 300 cctgcggcgt tgaagactca actactgtca gaagctggaa agtggagagc agcattgggg 360 gcgctgggat ttgtaggcgg ccttgtcgga agagaggaag aaacggttcg acaatttttt 420 acgcgtcatc ttggtacgga agttaccgag cgtttagtcg caccatttgt ctccggtgtg 480 tatgctggcg acgttgatca actatccgcg caagcggcgt ttcgtagagt ctttgagttc 540 gcacagctcg gcggggggtt ggccgcgggg gggattcttg cgcgtcgtca ggccccccca 600 aaagccccac ccgatcccag tttacccgaa accaagactg ggcagttagg ctcttttcgt 660 gaagggctag aaatgctccc cagagcaata gccagccaac tcggagacag gttaaagcta 720 cagtggcgac taacgcatct ggagataact ccccaacaaa cttatttggc gcattttaat 780 actccggatg gcccgcagca aatcgcaaca aggactctga tcctaacaac ccccgctcct 840 atcactgctg atcttcttaa acctttgacg cccgcgcttc atggggtgct caaggaaatt 900 tactatcctc cggtagcctg cgtagtccta gcatacccaa gggccgcgag tgcgcgtcca 960 ttggaaggtt ttggtcatct tatacccagg aatcagggga taaggactct tggtacaatc 1020 tggtcctcct gtctcttccc gggcaggacg cctgagggtg agcatctgct gaccaatttc 1080 atcggcggcg caacggaccc tggtatagcc cagctagatc ctgaggaaat cgctcaagcc 1140 gtccatcaag atttgtgcaa gatactgatc agaccagaat tcactcccaa aatcttagcc 1200 gtcaggctgt ggaagcaagc tattcctcag tatacgctag ggcacttgca gcgacttgca 1260 accttggaac aggagttgtc caagtttcct gggcttcata tcctagctaa ttatacggat 1320 ggtgttgcgc tcggcgattg cgtcaaacgt ggagttgcag tggctcaaaa aattagaagc 1380 agggagtga 1389 <210> 8 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Optimized codon encoding CyPPO17) <400> 8 atggaggtcg atgttgcaat tgtcggcggc ggcctgtcag gcttgagcgt tgcctggcgt 60 ctccagcagt ctgctcctca atacagtggc gttctattgg aagcgtcaga ccgtctaggt 120 gggaacatta ctacgcaagg ggcagagggg ttcgtgtggg aactaggccc taacagcttc 180 gctccgactc ccgcgctttt acagcttata gcagaagtag ggcttcactc cgagcttata 240 cgtggcgatc gacatctacc gcgatacatt tattggcgag gcgaacttta tccattggag 300 ccgaccaggc cgcttgcttt ggcaacaagc aatctcctct ctccatgggg taaggtcaga 360 gcagcgttgg gcgccctcgg gtttgtcccc ccgtatctcg gatctggcga tgaatccgtt 420 aattcatttt tccgacgaca cctaggtcag gaggtagccg aacgtctggt ggcacctttc 480 gtctctggcg tgtatgcggg agatccccag caactgtccg ccgccgctgc atttagacga 540 atagcgcagc tggaaaaact aggtggggga ctcatagcag gagcattgag gctgaggaga 600 cagcaacccc ccaaacccag gcccccggca gaggttcaaa tgcgacccgg tgagttgggg 660 tctttcaaag agggattggc cgccttgcca cgtgcaatag ctcaacagct gaaagcacca 720 gtgcacctac aaaccccagt cgaagcaatc acgccggagc ccaacggagg ttatctactc 780 agatccggcg aacagacttg gcaagcgaga agcgtcgtcc tagcaacacc tgcctatcag 840 accgcagcat tagtggcgcc gtttcaacct gcaatagcgc gagtgttagc ggccattccg 900 tatccaacag tggcctgtgt agtactcgcc tatcccgcgg gactaggcag gtcagtacga 960 ccaggctttg gcgtccttat accccgtggc caaggtatcc gtacactcgg cactatatgg 1020 tctagctgct tatttccaca gcgaactcca gctgggtggc aagtttttac ttcattcatc 1080 ggtggagcaa cagatccgga cctcgcctca ctgagggaag aagcgatcgt tcaacaggtg 1140 caacaggact tgacccgtct acttgatctt cctgccgcca aggcgagact cctcggtatg 1200 aaagtgtggc gaagggcgat cccacaatac ttggtagggt atccacagca atggcagcaa 1260 gtaacccatg cccttagtca gacgccgggc cttttcctgt gtagtaacta cgccgagggc 1320 gtggcattag gcgacagggt tgaacatggt aacaggaccg ctgcggcagt ggccgcgtac 1380 ctgagtgggg ggcaatcctg a 1401 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (CyPPO16_XbaIF primer) <400> 9 cccctctaga atgctagact ccctgattgt 30 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (CyPPO16_XhoIR primer) <400> 10 ccccctcgag ctccctgctt ctaatttttt g 31 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (CyPPO17_XbaIF primer) <400> 11 cccctctaga atggaggtcg atgttgcaat 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (CyPPO17_XhoIR primer) <400> 12 ccccctcgag ggattgcccc ccactcaggt 30 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F360M forward primer) <400> 13 catctgctga ccaatatgat cggcggcgca acg 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F360M reverse primer) <400> 14 cgttgcgccg ccgatcatat tggtcagcag atg 33 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F360L forward primer) <400> 15 gaccaatttg atcggcggcg caacggaccc tg 32 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F360L reverse primer) <400> 16 cgccgatcaa attggtcagc agatgctcac cc 32 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F360I forward primer) <400> 17 catctgctga ccaatatcat cggcggcgca acg 33 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F360I reverse primer) <400> 18 cgttgcgccg ccgatgatat tggtcagcag atg 33 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F360C forward primer) <400> 19 tgaccaattg catcggcggc gcaacggacc ctg 33 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F360C reverse primer) <400> 20 cgccgatgca attggtcagc agatgctcac cc 32 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F360V forward primer) <400> 21 ctgaccaatg tcatcggcgg cgcaacggac cc 32 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F360V reverse primer) <400> 22 gccgatgaca ttggtcagca gatgctcacc ctc 33 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F360T forward primer) <400> 23 catctgctga ccaataccat cggcggcgca acg 33 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F360T reverse primer) <400> 24 cgttgcgccg ccgatggtat tggtcagcag atg 33 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V305L forward primer) <400> 25 tatcctccgc tagcctgcgt agtcctagca tac 33 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V305L reverse primer) <400> 26 cgcaggctag cggaggatag taaatttcct tg 32 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (A162L forward primer) <400> 27 gtctccggtg tgtatcttgg cgacgttgat caa 33 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (A162L reverse primer) <400> 28 ttgatcaacg tcgccaagat acacaccgga gac 33 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (A162C forward primer) <400> 29 gtctccggtg tgtattgtgg cgacgttgat caa 33 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (A162C reverse primer) <400> 30 ttgatcaacg tcgccacaat acacaccgga gac 33 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V305M forward primer) <400> 31 atttactatc ctccgatggc ctgcgtagtc cta 33 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V305M reverse primer) <400> 32 taggactacg caggccatcg gaggatagta aat 33 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (R85A forward primer) <400> 33 gacagacgtc taccggcgtt tgtgtattgg aac 33 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (R85A reverse primer) <400> 34 gttccaatac acaaacgccg gtagacgtct gtc 33 <210> 35 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F156A forward primer) <400> 35 cgtttagtcg caccagcggt ctccggtgtg tatg 34 <210> 36 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F156A reverse primer) <400> 36 catacacacc ggagaccgct ggtgcgacta aacg 34 <210> 37 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V160C forward primer) <400> 37 ccatttgtct ccggttgcta tgctggcgac gttg 34 <210> 38 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V160C reverse primer) <400> 38 caacgtcgcc agcatagcaa ccggagacaa atgg 34 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F324V forward primer) <400> 39 cgtccattgg aaggtgtggg tcatcttata ccc 33 <210> 40 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F324V reverse primer) <400> 40 gggtataaga tgacccacac cttccaatgg acg 33 <210> 41 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (L327T forward primer) <400> 41 gaaggttttg gtcataccat acccaggaat cag 33 <210> 42 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (L327T reverse primer) <400> 42 ctgattcctg ggtatggtat gaccaaaacc ttc 33 <210> 43 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (I340T forward primer) <400> 43 aggactcttg gtacaacctg gtcctcctgt ctc 33 <210> 44 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (I340T reverse primer) <400> 44 gagacaggag gaccaggttg taccaagagt cct 33 <210> 45 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V160C+A162C forward primer) <400> 45 tgtctccggt tgctattgtg gcgacgttga tcaac 35 <210> 46 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V160C+A162C reverse primer) <400> 46 gttgatcaac gtcgccacaa tagcaaccgg agaca 35 <210> 47 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V160C+A162L forward primer) <400> 47 cgcaccattt gtctccggtt gctatcttgg cgacgttgat caactatc 48 <210> 48 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V160C+A162L reverse primer) <400> 48 gatagttgat caacgtcgcc aagatagcaa ccggagacaa atggtgcg 48 <210> 49 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F359M forward primer) <400> 49 caagttttta cttcaatgat cggtggagca aca 33 <210> 50 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F359M reverse primer) <400> 50 tgttgctcca ccgatcattg aagtaaaaac ttg 33 <210> 51 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F359C forward primer) <400> 51 ccaccgatgc atgaagtaaa aacttgccac cc 32 <210> 52 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F359C reverse primer) <400> 52 tttacttcat gcatcggtgg agcaacagat ccg 33 <210> 53 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F359L forward primer) <400> 53 tccaccgatc aatgaagtaa aaacttgcca ccc 33 <210> 54 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F359L reverse primer) <400> 54 ttacttcatt gatcggtgga gcaacagatc cgg 33 <210> 55 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F359I forward primer) <400> 55 caagttttta cttcaatcat cggtggagca aca 33 <210> 56 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F359I reverse primer) <400> 56 tgttgctcca ccgatgattg aagtaaaaac ttg 33 <210> 57 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F359V forward primer) <400> 57 caagttttta cttcagtcat cggtggagca aca 33 <210> 58 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F359V reverse primer) <400> 58 tgttgctcca ccgatgactg aagtaaaaac ttg 33 <210> 59 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F359T forward primer) <400> 59 caagttttta cttcaaccat cggtggagca acag 34 <210> 60 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F359T reverse primer) <400> 60 ctgttgctcc accgatggtt gaagtaaaaa cttg 34 <210> 61 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V304L forward primer) <400> 61 tatccaacac tggcctgtgt agtactcgcc 30 <210> 62 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V304L reverse primer) <400> 62 cacaggccag tgttggatac ggaatggccg c 31 <210> 63 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (A166L forward primer) <400> 63 gtctctggcg tgtatctggg agatccccag caa 33 <210> 64 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (A166L reverse primer) <400> 64 ttgctgggga tctcccagat acacgccaga gac 33 <210> 65 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (A166C forward primer) <400> 65 gtctctggcg tgtattgcgg agatccccag caa 33 <210> 66 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (A166C reverse primer) <400> 66 ttgctgggga tctccgcaat acacgccaga gac 33 <210> 67 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V304M forward primer) <400> 67 attccgtatc caacaatggc ctgtgtagta ctc 33 <210> 68 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V304M reverse primer) <400> 68 gagtactaca caggccattg ttggatacgg aat 33 <210> 69 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (R88A forward primer) <400> 69 gatcgacatc taccggcgta catttattgg cgag 34 <210> 70 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (R88A reverse primer) <400> 70 ctcgccaata aatgtacgcc ggtagatgtc gatc 34 <210> 71 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F160A forward primer) <400> 71 cgtctggtgg cacctgcggt ctctggcgtg tatg 34 <210> 72 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F160A reverse primer) <400> 72 catacacgcc agagaccgca ggtgccacca gacg 34 <210> 73 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V164C forward primer) <400> 73 cctttcgtct ctggctgcta tgcgggagat ccc 33 <210> 74 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V164C reverse primer) <400> 74 gggatctccc gcatagcagc cagagacgaa agg 33 <210> 75 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F323V forward primer) <400> 75 gtcagtacga ccaggcgtgg gcgtccttat accc 34 <210> 76 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (F323V reverse primer) <400> 76 gggtataagg acgcccacgc ctggtcgtac tgac 34 <210> 77 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (L326T forward primer) <400> 77 ggctttggcg tcactatacc ccgtggccaa ggtatccgta ca 42 <210> 78 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (L326T reverse primer) <400> 78 gccacggggt atagtgacgc caaagcctgg tcgtactgac ct 42 <210> 79 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (I339T forward primer) <400> 79 cgtacactcg gcactacctg gtctagctgc tta 33 <210> 80 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (I339T reverse primer) <400> 80 taagcagcta gaccaggtag tgccgagtgt acg 33 <210> 81 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V164C+A166L forward primer) <400> 81 cctttcgtct ctggctgcta tctgggagat ccccagcaa 39 <210> 82 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V164C+A166L reverse primer) <400> 82 ttgctgggga tctcccagat agcagccaga gacgaaagg 39 <210> 83 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V164C+A166C forward primer) <400> 83 ttcgtctctg gctgctattg cggagatccc cag 33 <210> 84 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (V164C+A166C reverse primer) <400> 84 ctggggatct ccgcaatagc agccagagac gaa 33 <210> 85 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (CyPPO16_BamHIF primer) <400> 85 ccccggatcc atgctagact ccctgattgt 30 <210> 86 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (CyPPO16_SalIR primer) <400> 86 ccccgtcgac tcactccctg cttctaattt tttg 34 <210> 87 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (CyPPO17_BamHIF primer) <400> 87 ccccggatcc atggaggtcg atgttgcaat 30 <210> 88 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (CyPPO17_SalIR primer) <400> 88 ccccgtcgac tcaggattgc cccccactca ggt 33 <210> 89 <211> 1614 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gene for AtPPO1 of Arabidopsis thaliana <400> 89 atggagttat ctcttctccg tccgacgact caatcgcttc ttccgtcgtt ttcgaagccc 60 aatctccgat taaatgttta taagcctctt agactccgtt gttcagtggc cggtggacca 120 accgtcggat cttcaaaaat cgaaggcgga ggaggcacca ccatcacgac ggattgtgtg 180 attgtcggcg gaggtattag tggtctttgc atcgctcagg cgcttgctac taagcatcct 240 gatgctgctc cgaatttaat tgtgaccgag gctaaggatc gtgttggagg caacattatc 300 actcgtgaag agaatggttt tctctgggaa gaaggtccca atagttttca accgtctgat 360 cctatgctca ctatggtggt agatagtggt ttgaaggatg atttggtgtt gggagatcct 420 actgcgccaa ggtttgtgtt gtggaatggg aaattgaggc cggttccatc gaagctaaca 480 gacttaccgt tctttgattt gatgagtatt ggtgggaaga ttagagctgg ttttggtgca 540 cttggcattc gaccgtcacc tccaggtcgt gaagaatctg tggaggagtt tgtacggcgt 600 aacctcggtg atgaggtttt tgagcgcctg attgaaccgt tttgttcagg tgtttatgct 660 ggtgatcctt caaaactgag catgaaagca gcgtttggga aggtttggaa actagagcaa 720 aatggtggaa gcataatagg tggtactttt aaggcaattc aggagaggaa aaacgctccc 780 aaggcagaac gagacccgcg cctgccaaaa ccacagggcc aaacagttgg ttctttcagg 840 aagggacttc gaatgttgcc agaagcaata tctgcaagat taggtagcaa agttaagttg 900 tcttggaagc tctcaggtat cactaagctg gagagcggag gatacaactt aacatatgag 960 actccagatg gtttagtttc cgtgcagagc aaaagtgttg taatgacggt gccatctcat 1020 gttgcaagtg gtctcttgcg ccctctttct gaatctgctg caaatgcact ctcaaaacta 1080 tattacccac cagttgcagc agtatctatc tcgtacccga aagaagcaat ccgaacagaa 1140 tgtttgatag atggtgaact aaagggtttt gggcaattgc atccacgcac gcaaggagtt 1200 gaaacattag gaactatcta cagctcctca ctctttccaa atcgcgcacc gcccggaaga 1260 attttgctgt tgaactacat tggcgggtct acaaacaccg gaattctgtc caagtctgaa 1320 ggtgagttag tggaagcagt tgacagagat ttgaggaaaa tgctaattaa gcctaattcg 1380 accgatccac ttaaattagg agttagggta tggcctcaag ccattcctca gtttctagtt 1440 ggtcactttg atatccttga cacggctaaa tcatctctaa cgtcttcggg ctacgaaggg 1500 ctatttttgg gtggcaatta cgtcgctggt gtagccttag gccggtgtgt agaaggcgca 1560 tatgaaaccg cgattgaggt caacaacttc atgtcacggt acgcttacaa gtaa 1614 <210> 90 <211> 155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Gene for Transit Peptide of AtPPO1) <400> 90 atggagttat tcttctccgt ccgacgactc aatcgcttct tccgtcgttt tcgaagccca 60 atctccgatt aaatgtttat aagcctctta gactccgttg ttcagtggcc ggtggaccaa 120 ccgtcggatc ttcaaaaatc gaaggcggag gaggc 155

Claims (23)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 서열번호 1의 아미노산 서열이,
    A162L 또는 A162C,
    F360M, F360L, F360I, F360C, F360V, 또는 F360T,
    V305M,
    R85A,
    F156A,
    V160C,
    F324V,
    L327T, 및
    I340T
    로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 변이된 아미노산 서열로 이루어진, 폴리펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열이, F360M, F360L, F360I, F360C, F360V, F360T, A162L, A162C, V305M, R85A, F156A, V160C, F324V, L327T, I340T, R85A+F360M, R85A+F360V, R85A+F360I, F156A+F360M, V160C+F360M, V160C+F360I, V160C+F360V, A162C+F360M, A162C+F360I, A162C+F360V, A162L+F360M, A162L+F360I, A162L+F360V, V305M+F360M, V305M+F360I, V305M+F360V, F324V+F360M, L327T+F360M, L327T+F360I, L327T+F360V, I340T+F360M, R85A+V160C+F360I, R85A+A162L+F360M, R85A+V305M+F360I, R85A+L327T+F360M, V160C+A162L+F360I, V160C+V305M+F360M, V160C+L327T+F360I, A162L+V305M+F360M, A162C+L327T+F360M, V305M+L327T+F360M, A162C+V305M+F360M, V160C+A162C+F360M, V160C+A162L+F360M, R85A+V160C+A162L+F360I, R85A+V160C+V305M+F360M, R85A+V160C+L327T+F360I, R85A+A162C+L327T+F360M, R85A+A162L+V305M+F360M, R85A+V305M+L327T+F360M, V160C+A162L+V305M+F360I, V160C+A162C+L327T+F360M, A162C+V305M+L327T+F360M, R85A+V160C+A162C+L327T+F360M, R85A+V160C+A162L+V305M+F360M, V160C+A162C+V305M+L327T+F360M, 또는 R85A+V160C+A162C+V305M+L327T+F360M의 아미노산 변이로 변이된 아미노산 서열로 이루어진, 폴리펩타이드.
  5. 제3항 또는 제4항의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제5항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
  7. 제6항의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
  8. 제3항 또는 제4항의 폴리펩타이드; 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 식물 또는 조류(algae)의 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제에 대한 저항성 부여 또는 증진용 조성물.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서, 상기 제초제는 피리미딘디온계(pyrimidinediones), 페닐에테르계(diphenyl-ethers), 페닐피라졸계(phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계(N-phenylphthalimides), 페닐에스테르계 (phenylesters), 티아디아졸계(thiadiazoles), 옥사디아졸계(oxadiazoles), 트리아졸리논계(triazolinones), 옥사졸리딘디온계(oxazolidinediones), 피라클로닐(pyraclonil), 플루펜피르-에틸(flufenpyr-ethyl) 및 프로플루아졸(profluazol)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제초제는 부타페나실(butafenacil), 사플루페나실(saflufenacil), 벤즈펜디존(benzfendizone), 티아페나실(tiafenacil), 포메사펜(fomesafen), 옥시플루오르펜(oxyfluorfen), 아클로니펜(aclonifen), 아시플루오르펜 (acifluorfen), 비페녹스(bifenox), 에톡시펜(ethoxyfen), 락토펜(lactofen), 클로메톡시펜(chlomethoxyfen), 클로르니트로펜(chlornitrofen), 플루오로글리코펜-에틸(fluoroglycofen-ethyl), 할로사펜(halosafen), 피라플루펜-에틸(pyraflufen-ethyl), 플루아졸레이트(fluazolate), 플루미옥사진 (flumioxazin), 시니돈-에틸(cinidon-ethyl), 플루미클로락-펜틸(flumiclorac-pentyl), 플루티아셋(fluthiacet), 티디아지민(thidiazimin), 옥사디아길(oxadiargyl), 옥사디아존(oxadiazon), 카펜트라존(carfentrazone), 설펜트라존(sulfentrazone), 아자페니딘(azafenidin), 펜톡사존(pentoxazone), 피라클로닐(pyraclonil), 플루펜피르-에틸(flufenpyr-ethyl), 프로플루아졸(profluazol), 페노필레이트(phenopylate), 페노필레이트의 카바메이트 유사체, 이들의 농약적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물.
  12. 제8항에 있어서, 상기 식물 또는 조류는 제2의 제초제 저항성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하며 상기 제2의 제초제에 대한 저항성이 부여 또는 증진된 것인, 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 제2의 제초제는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트(glufosinate), 디캄바(dicamba), 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 이속사플루톨(isoxaflutole), ALS(acetolactate synthase) 저해성 제초제, 제2광계(photosystem II) 저해성 제초제, 페닐우레아(phenylurea)계 제초제, 브로목시닐(bromoxynil)계 제초제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드는
    글리포세이트(glyphosate) 제초제 내성 EPSPS(glyphosate resistant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase), GOX(glyphosate oxidase), GAT (glyphosate-N-acetyltransferase) 또는 글리포세이트 디카복실레이즈(glyphosate decarboxylase);
    글루포시네이트(glufosinate) 제초제 내성 PAT(phosphinothricin-N-acetyltransferase);
    디캄바(dicamba) 제초제 내성 DMO(dicamba monooxygenase);
    2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) 제초제 내성 2,4-D 모노옥시게나아제 또는 AAD(aryloxyalkanoate dioxygenase);
    ALS(acetolactate synthase) 저해성 설포닐우레아계 제초제 내성 ALS(acetolactate synthase), AHAS(acetohydroxyacid synthase), 또는 AtAHASL (Arabidopsis thaliana acetohydroxyacid synthase large subunit);
    제2광계(photosystem II) 저해성 제초제 내성 광계 II(photosystem II) 단백질 D1;
    페닐우레아(phenylurea) 제초제 내성 시토크롬 P450(cytochrome P450);
    색소체 저해성 제초제 내성 HPPD(hydroxyphenylpyruvate dioxygenase);
    브로목시닐(bromoxynil) 제초제 내성 니트릴레이즈 (nitrilase); 및
    이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는
    글리포세이트(glyphosate) 제초제 내성 cp4 epsps, epsps(AG), mepsps, 2mepsps, goxv247, gat4601 또는 gat4621 유전자;
    글루포시네이트(glufosinate) 제초제 내성 bar 또는 pat, 또는 pat (SYN) 유전자;
    디캄바(dicamba) 제초제 내성 dmo 유전자;
    2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) 제초제 내성 AAD-1 또는 AAD-12 유전자;
    이속사플루톨 제초제 내성 HPPDPF W336 유전자;
    설포닐 우레아 제초제 내성 ALS, Csr1, Csr1-1, Csr1-2, GM-HRA, S4-HRA, Zm-HRA, SurA 또는 SurB 유전자;
    제2광계(photosystem II) 저해성 제초제 내성 psbA 유전자;
    페닐우레아(phenylurea) 제초제 내성 CYP76B1 유전자;
    브로목시닐(bromoxynil) 제초제 내성 bxn 유전자; 및
    이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물.
  16. 제3항 또는 제4항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제에 대한 저항성을 가지는 식물 또는 조류의 형질전환체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 형질전환체는 조류, 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초, 식물체 전체, 또는 상기 형질전환체의 자손인, 형질전환체.
  18. 제3항 또는 제4항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 조류, 또는 식물의 세포, 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물체 전체에 형질전환하는 단계를 포함하는,
    프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제에 대한 내성을 가지는 식물 또는 조류의 제조 방법.
  19. 제3항 또는 제4항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 조류, 또는 식물의 원형질체, 캘러스, 배축, 종자, 자엽, 신초 또는 식물체 전체에 형질전환하는 단계를 포함하는,
    식물 또는 조류의 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제에 대한 내성을 부여 또는 증진시키는 방법.
  20. 제3항 또는 제4항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 식물을 재배지에 제공하는 단계, 및
    상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는,
    재배지에서 잡초를 방제하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계는, 2종 이상의 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 것인, 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 식물은 제2의 제초제 내성 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 유전자를 더욱 포함하는 것이고,
    상기 재배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제 및 제2의 제초제의 유효량을 순차적으로 또는 동시에 적용하는 것인, 방법.
  23. 제3항 또는 제4항의 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조류를 배양 배지에 제공하는 단계, 및
    상기 배양 배지에 프로토포르피리노겐 IX 옥시다아제를 억제하는 제초제의 유효량을 적용하는 단계를 포함하는,
    배양 배지에서 원하지 않는 수생 생물을 제거하는 방법.
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