EA029356B1 - Растения с повышенной устойчивостью к гербицидам - Google Patents

Растения с повышенной устойчивостью к гербицидам Download PDF

Info

Publication number
EA029356B1
EA029356B1 EA201390842A EA201390842A EA029356B1 EA 029356 B1 EA029356 B1 EA 029356B1 EA 201390842 A EA201390842 A EA 201390842A EA 201390842 A EA201390842 A EA 201390842A EA 029356 B1 EA029356 B1 EA 029356B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
ppo
plant
amino acid
herbicide
benzoxazinone
Prior art date
Application number
EA201390842A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201390842A1 (ru
Inventor
Ёханнес Хутцлер
Рафаель Апонтэ
Томас Митцнер
Маттиас Витшель
Анья Зимон
Енс Лерхль
Штефан Треш
С. Люк Мэнкин
Original Assignee
Басф Агро Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Басф Агро Б.В. filed Critical Басф Агро Б.В.
Publication of EA201390842A1 publication Critical patent/EA201390842A1/ru
Publication of EA029356B1 publication Critical patent/EA029356B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/32—Ingredients for reducing the noxious effect of the active substances to organisms other than pests, e.g. toxicity reducing compositions, self-destructing compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12N9/0059—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5097—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving plant cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Abstract

Настоящее изобретение касается способа борьбы с нежелательной растительностью на месте произрастания растений, при этом способ включает этапы предоставления на указанном месте растения, которое содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую протопорфириноген оксидазу (РРО) дикого типа или мутированную, которая является стойкой или устойчивой к гербициду - производному бензоксазинона, путем нанесения на указанное место эффективного количества указанного гербицида. Изобретение далее касается растений, содержащих ферменты РРО дикого типа или мутированные, и способов получения таких растений.

Description

изобретение относится, в целом, к способам, позволяющим повысить устойчивость сельскохозяйственных культур к гербициду. В частности, изобретение относится к растениям с повышенной устойчивостью к гербицидам - производным бензоксазинона. В частности, настоящее изобретение относится к способам и растениям, полученным мутагенезом, кроссбридингом и трансформацией, которые имеют повышенную устойчивость к гербицидам - производным бензоксазинона.
Предпосылки к созданию изобретения
Гербициды, которые ингибируют протопорфириноген оксидазу (здесь и далее - Рго!ох или РРО; ЕС: 1.3.3.4), главный фермент в биосинтезе протопорфирина IX, используют для селективной борьбы с сорняками с 1960-х годов. РРО катализирует конечную общую стадию биосинтеза гема и хлорофилла, которая представляет собой окисление протопорфириногена IX в протопорфирин IX (Мабшде е! а1., 1989. Вюсйет. 1. 260: 231). Гербициды-ингибиторы РРО включают множество различных структурных классов молекул (Энке е! а1., 1991. \Уееб 8с1. 39: 465; ЫапбШаШ е! а1., 1992. Рекбшбе Вюсйеш. Рйукю1. 43: 193; Мабтпде е! а1., 1989. РЕВ8 Ье!!. 245: 35; Уаиаке апб Апбой. 1989. Рекбабе Вюсйеш. Рйукю1. 35: 70). Эти гербицидные соединения включают соединения из группы дифенилэфиров {например, лактофен, (+-)-2этокси-1-метил-2-оксоэтил 5-{2-хлор-4-(трифторметил)фенокси}-2-нитробензоат; ацифлуорфен, 5-{2хлор-4-(трифторметил)фенокси}-2-нитробензойная кислота; ее метиловый эфир; или оксифлуорфен, 2хлор-1-(3-этокси-4-нитрофенокси)-4-(трифторбензол)}, оксидазолы, (например, оксидазон, 3-{2,4-дихлорхлор-5-(1-метилэтокси)фенил}-5-(1,1-диметилэтил)-1,3,4-оксидиазол-2-(3Н)-он), циклические имиды (например, 8-23142, Ы-(4-хлор-2-фтор-5-пропаргилоксифенил)-3,4,5,6-тетрагидрофталимид; хлорфталим, Ы-(4-хлорфенил)-3,4,5,6-тетрагидрофталимид), фенилпиразолы (например, ΤΝΡΡ-этил, этил 2-{1(2,3,4-трихлорфенил)-4-нитропиразолил-5-окси}пропионат; М&В 39279), производные пиридина (например, Ь8 82-556), и фенопилат, а также О-фенилпирролидин- и пиперидинкарбаматные аналоги фенопилата. Многие из этих соединений конкурентно ингибируют обычную реакцию, катализируемую ферментом, выступая в качестве аналогов субстрата.
Применение гербицидов-ингибиторов РРО приводит к накоплению протопорфириногена IX в хлоропласте и митохондриях, причем считается, что он затем попадает в цитиозоль, где окисляется пероксидазой. При воздействии на него светом протопорфирин IX приводит к образованию в цитозоле синглетного кислорода, а также к образованию других активных форм кислорода, что может вызвать перекисное окисление липидов и разрушение мембраны, и это может привести к быстрой гибели клеток (Ьее е! а1., 1993. Р1ап! Рйукю1. 102: 881).
Не все ферменты РРО являются чувствительными к гербицидам, ингибирующим растительные ферменты РРО. Ферменты РРО ЕксйебсЫа сой и ВасШик киЫббк (8акагтеп е! а1., 1993. Сап. 1. МютоЫю1. 39: 1155; Эабеу е! а1., 1994. 1. Вю1. Сйет. 269: 813) являются устойчивыми к этим ингибиторамгербицидам. Также из литературы известны мутанты одноклеточной водоросли Сй1атуботопак ге1пйагб!ίί, устойчивые к такому гербициду фенилимиду 8-23142 (Ка!аока е! а1., 1990. 1. Рекбабе 8а. 15: 449; 8ЫЫа1а е! а1. 1992. Щ Рекеатсй щ Рйо!окуп!йек1к, том III, Ν. Мига!а, еб. К1и№ег:№!йег1апбк, стр. 567-70). По-видимому, по меньшей мере один из этих мутантов обладает измененной активностью РРО, с устойчивостью не только к гербицидному ингибитору, в отношении которого производилась селекция этого мутанта, но также к другим классам ингибиторов протопорфириноген оксидазы (Окйю е! а1. 1993. Ζ. №!шТотксй. 48с: 339; 8а!о е! а1., 1994. Ш АС8 8утрокшт оп Рогрйубс Рекбабек, 8. Энке. еб. АС8 Ргекк: ХУакйбщЮп. Э.С.). Также из литературы известна линия клеток-мутантов табака, устойчивая к ингибитору 8-21432 (Сйе е! а1., 1993. Ζ. №ЧигГогксй. 48с: 350). Ауксотрофные мутанты Е. соб ти!ап!к используют для того, чтобы придать ферментам РРО клонированного растения устойчивость к гербицидам.
Существуют три основные стратегии повышения устойчивости растений к гербицидам, а именно: (1) детоксификация гербицида ферментами, которые трансформируют гербицид или его активный метаболит в нетоксичные продукты, такими как, например, ферменты для повышения устойчивости к бромоксинилу или баста (ЕР 242236, ЕР 337899); (2) мутация целевого фермента в функциональный фермент, который будет менее чувствителен к гербицидам или его активному метаболиту, например, ферменты для повышения устойчивости к глифосату (ЕР 293356, Рабде!!е 8.Р. е! а1., ТВю1. Сйет., 266, 33, 1991); или (3) сверхэкспрессия чувствительного фермента для получения достаточного количества целевого фермента в растении относительно гербицида с точки зрения кинетических констант этого фермента, чтобы получить достаточное количество функционального фермента, несмотря на присутствие его ингибитора. Сообщается о положительных результатах третьей стратегии, в результате которой были получены растения с устойчивостью к ингибиторам РРО (см., например, патенты И8 5767373 или И8 5939602, и другие члены семейства патентов-аналогов). Кроме того, в патентах И8 2010/0100988 и \УО 2007/024739 описаны нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности с ферментной активностью, которая приводит к устойчивости аминокислотных последовательностей к гербицидным химикатам, ингибиторам РРО, в частности РРО-мутанты, специфические к ингибиторам группы 3-фенилурацила.
Однако в известном уровне техники не описаны растения, устойчивые к гербицидам - производным бензоксазинона, содержащие по меньшей мере одну РРО нуклеиновую кислоту дикого типа или мутиро- 1 029356
вавшую РРО нуклеиновую кислоту. Также в известном уровне техники не описаны сельскохозяйственные культуры, устойчивые к гербицидам - производным бензоксазинона, содержащие мутации геномов, за исключением генома, из которого был получен РРО-ген. Таким образом, для научных целей необходимо определить гены, устойчивые к гербицидам - производным бензоксазинона, в дополнительных геномах и видах. Также для научных целей необходимы сельскохозяйственные культуры и сельскохозяйственные культуры с повышенной устойчивостью к гербицидам, таким как гербициды - производные бензоксазинона и гербициды, содержащие по меньшей мере одну РРО нуклеиновую кислоту дикого типа и/или мутировавшую РРО нуклеиновую кислоту. Также необходимы способы контроля роста сорняков среди сельскохозяйственных культур или сельскохозяйственных культур. Данные композиции и способы позволят использовать опрыскивание вместо техники при применении гербицидов на территории, где растут сельскохозяйственные культуры, или к самим сельскохозяйственным культурам.
Краткое изложение сущности изобретения
Данная проблема решается с помощью данного изобретения, которое относится к способу борьбы с нежелательной растительностью на месте произрастания растения, при этом способ включает следующие этапы:
a) предоставление на указанном месте растения, которое содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую протопорфириноген оксидазу (РРО) дикого типа или мутированную протопорфириноген оксидазу (мут-РРО), которая является стойкой или устойчивой к гербициду - производному бензоксазинона и/или
b) нанесение на указанное место эффективного количества указанного гербицида.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу определения гербицида - производного бензоксазинона с использованием РРО дикого типа или мут-РРО, кодированной нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность §ЕЦ ГО N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 или 45 или ее вариант.
Данный способ включает следующие этапы:
a) образование трансгенной клетки или растения, содержащего мут-РРО-кодирующую нуклеиновую кислоту, где мут-РРО экспрессирована;
b) нанесение производного бензоксазинона на трансгенную клетку или растение пункта а) и на контрольную клетку или растение того же сорта;
c) определение роста или жизнеспособности трансгенной клетки или растения и контрольной клетки или растения после нанесения указанного испытуемого соединения, и
4) отбор испытуемых соединений, которые придают уменьшенный рост контрольной клетке или растению по сравнению с ростом трансгенной клетки или растения.
Другая задача настоящего изобретения относится к способу идентификации нуклеотидной последовательности, кодирующей мут-РРО, которая является стойкой или устойчивой к гербициду - производному бензоксазинона, при этом способ включает следующие этапы:
a) создание библиотеки мут-РРО-кодирующих нуклеиновых кислот,
b) скрининг популяции полученных мут-РРО-кодирующих нуклеиновых кислот путем экспрессии каждой из указанных нуклеиновых кислот в клетке или растении и обработки указанной клетки или растения гербицидом - производным бензоксазинона,
c) сравнение уровней устойчивости к производному бензоксазинона, предоставляемых указанной популяцией мут-РРО-кодирующих нуклеиновых кислот с уровнем устойчивости к гербициду - производному бензоксазинона, предоставляемым контрольной РРО-кодирующей нуклеиновой кислотой,
4) отбор по меньшей мере одной мут-РРО-кодирующей нуклеиновой кислоты, которая предоставляет значительно повышенный уровень устойчивости к гербициду - производному бензоксазинона по сравнению с уровнем, предоставляемым контрольной РРО-кодирующей нуклеиновой кислотой.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения мут-РРО-кодирующая нуклеиновая кислота, отобранная на этапе 4), показывает устойчивость к гербициду - производному бензоксазинона выше по меньшей мере в два раза по сравнению с устойчивостью контрольной мут-РРО-кодирующей нуклеиновой кислоты.
Стойкость или устойчивость может быть определена путем получения трансгенного растения с последовательностью нуклеиновой кислоты из библиотеки на этапе а) и путем сравнения этого трансгенного растения с контрольным растением.
Другая задача настоящего изобретения относится к способу идентификации растения или водоросли, которые содержат мут-РРО-кодирующую нуклеиновую кислоту, которая является стойкой или устойчивой к гербициду - производному бензоксазинона, при этом способ включает следующие этапы:
a) определение эффективного количества гербицида - производного бензоксазинона в культуре клеток растения или зеленой водоросли.
b) обработка указанных клеток растения или зеленой водоросли мутирующим агентом,
c) воздействие на указанные мутировавшие клеточные популяции эффективным количеством гербицида - производного бензоксазинона, определенным на этапе а),
4) отбор по меньшей мере одной клетки, выжившей после этих испытаний,
- 2 029356
е) ПЦР-амплификация и секвенирование РРО генов из клеток, отобранных на этапе б), и сравнение этих последовательностей с генными последовательностями РРО дикого типа соответственно.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения мутирующим агентом является этилметансульфонат.
Другая задача изобретения относится к изолированной мут-РРО-кодирующей нуклеиновой кислоте, при этом нуклеиновая кислота может быть идентифицирована описанным выше способом.
В еще одном варианте осуществления, изобретение относится к клетке растения, трансформированной нуклеиновой кислотой РРО дикого типа или мут-РРО нуклеиновой кислотой, или растения, которое подвергли мутации для получения растения с экспрессией, предпочтительно со сверхэкспрессией нуклеиновой кислоты РРО дикого типа или мут-РРО нуклеиновой кислоты, причем экспрессия нуклеиновой кислоты в клетке растения приводит к повышению стойкости или устойчивости к гербициду производному бензоксазинона по сравнению с клеткой растения дикого типа.
В еще одном варианте осуществления, изобретение относится к растению с клеткой растения в соответствии с настоящим изобретением, в котором экспрессия нуклеиновой кислоты приводит к повышению стойкости растения к гербициду - производному бензоксазинона по сравнению с растением дикого типа.
Растения, описанные в настоящем изобретении, могут быть трансгенными или нетрансгенными.
Предпочтительно экспрессия нуклеиновой кислоты в растении приводит к повышению стойкости растения к гербициду - производному бензоксазинона по сравнению с растением дикого типа.
В другом варианте осуществления, изобретение относится к семени, полученному из трансгенного растения, содержащего клетку растения по настоящему изобретению, в котором семя является чистосортным для повышения стойкости растения к гербициду - производному бензоксазинона по сравнению с семенем дикого типа.
В еще одном варианте осуществления изобретение относится к способу получения клетки трансгенного растения с повышенной стойкостью к гербициду - производному бензоксазинона по сравнению с клеткой растения дикого типа, включая трансформирование клетки растения кассетой экспрессии с нуклеиновой кислотой РРО дикого типа или мут-РРО нуклеиновой кислотой.
В еще одном варианте осуществления изобретение относится к способу получения трансгенного растения, включающему: (а) трансформирование клетки растения кассетой экспрессии, содержащей нуклеиновую кислоту РРО дикого типа или мут-РРО нуклеиновую кислоту, (Ь) получение растения с повышенной стойкостью к гербициду - производному бензоксазинона из клетки растения.
Предпочтительно кассета экспрессии далее содержит регуляторный участок инициации транскрипции и регуляторный участок инициации трансляции, которые являются функциональными в растении.
В еще одном варианте осуществления изобретение относится к использованию мут-РРО по изобретению в качестве маркера отбора. Изобретение предоставляет способ идентификации или отбора трансформированной клетки растения, ткани растения, растения или его части, включающий а) предоставление трансформированной клетки растения, ткани растения, растения или его части, в которых указанные клетки растения, ткани растения, растения или его части содержат изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид мут-РРО по изобретению, как описано ниже по тексту, при этом полипептид используют в качестве маркера отбора, и в которых указанные трансформированные клетки растения, ткани растения, растения или его части могут, при необходимости, содержать другую целевую изолированную нуклеиновую кислоту; Ь) соединение трансформированной клетки растения, ткани растения, растения или его части по меньшей мере с одним соединением, ингибирующим производное бензоксазинона; с) определение воздействия на клетку растения, ткань растения, растение или его часть ингибитора или ингибирующего соединения; б) идентификация или отбор трансформированной клетки растения, ткани растения, растения или его части.
Изобретение также реализуется в очищенных белках мут-РРО, содержащих описанные в настоящем документе мутации, которые могут использоваться в молекулярном моделировании для дальнейших улучшений, связанных с устойчивостью к гербицидам. Способы очищения белков хорошо известны и могут быть легко реализованы с использованием доступных с научной точки зрения продуктов или специальных способов, как описано, например, в Рто1еш В|о1есНпо1оду. \УаЫ1 апб Неабоп (кУПеу, 1994).
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показано выравнивание аминокислотных последовательностей РРО Атагапбшв 1иЬетси1а(А.1иЬетси1а1и8), Атагапбшв 1иЬетси1а1и8, с устойчивостью (А.1иЬетси1а1и8_К), АтаЫбор818 ГОаНапа, длинная (А.1ЬаПапа_2), §р1паша о1егасеа, короткая (§.о1етасеа_2), №собапа 1аЬасиш, короткая (ШаЬасиш_2), О1усте тах (О1усше_тах), АгаЫбор818 ГОаПапа, короткая (А.1НаИапа_ 1), №сойапа 1аЬасиш, длинная (ШаЬасит_1), СЫатуботопак те1пЬагб1й, длинная (С.те1пЬагб1й_1), 2еа таук (2.тау§), Огу/а кайуа (О.8айуа_1), 8о1апит ГОЬетокит (З.ГОЬетокит), Сисит® вабуик (С.кабуик), СасНогшт нИуЬиз (С.1йуЬи8_1), 8ршааа о1егасеа, длинная (§.о1егасеа_1), Ро1уЮте11а кр. РтшдкНет 198.80 (Ро1у1оте11а).
Консервативные области отмечены светло-серым, серым и черным цветами.
На фиг. 2 показан отбор штаммов СЫатубошопак тешЬатбШ, стойких к гербициду - производному бензоксазинона 1.а.35. (А) Мутировавшие клетки, высеянные на плотную среду без селективного агента.
- 3 029356
(В) Мутировавшие клетки, высеянные на плотную среду, содержащую 1х10-7 М производного бензоксазинона 1.а.35. Клетки, являющиеся устойчивыми к гербициду - производному бензоксазинона, образуют колонии (обведены в кружки, под номерами 33, 34, 35 и 36), в то время как восприимчивые к гербициду клетки прекращают расти. Более высокое количество колоний в чашке А по сравнению с В указывает на то, что колонии в чашке В являются устойчивыми к производному бензоксазинона 1.а.35.
На фиг. 3 показано возобновление роста выбранных штаммов СЫашубошопаз гешЬагйШ, показанных на фиг. 2, стойких к гербициду - производному бензоксазинона 1.а.35. (А) Клетки дикого типа, высеянные на жидкую среду без селективного агента. (В) Клетки дикого типа в жидкой среде, содержащей повышенное количество производного бензоксазинона Еа.35 (в диапазоне 1х10-9 - 5х10-6 моль). (С) Мутировавшие клетки, высеянные на жидкую среду без селективного агента. (Ό1, Ό2, Е1, Е2) Мутировавшие и выбранные штаммы в жидкой среде, содержащей повышенное количество производного бензоксазинона 1.а.35 (в диапазоне х10-9 - 5х10-6 моль). Штаммы, устойчивые к гербициду - производному бензоксазинона 1.а.35, развиваются и становятся более темного цвета, что указывает на их рост. Штаммы, подверженные воздействию гербицида, не развиваются и сохраняют светлый цвет. Более темный цвет обусловлен более высокой плотностью растущих клеток в жидкой среде. Культуры с более низкой плотностью имеют более светлый цвет или полностью прозрачны.
Перечень последовательностей
_ Таблица 1
ЗЕО ГО N0: Описание Организм Ген Номер доступа
1 РРО нуклеиновая кислота А т ага η 1К и % ΡΡΧ2Ε_λ¥Ο 00386114
2 РРО аминокислота А т ага η 1К и % АВО52326
3 РРО нуклеиновая кислота А т ага η 1К и % РРХ2Е_АС 00386117
4 РРО аминокислота А т ага η 1К и % АВО52329
5 РРО нуклеиновая кислота А т ага η 1К и % РРХ2Е_СС_К 00386118
6 РРО аминокислота А т ага η 1К и % АВО52330
7 РРО нуклеиновая кислота Атагапбшз РРХ2Е_АС_К 00386116
8 РРО аминокислота А т ага η 1К и % АВО52328
9 РРО нуклеиновая кислота АгаЪк1ор$1$ РРХ АВ007650
10 РРО аминокислота АгаЬМор818 ВАВО83О1
11 РРО нуклеиновая кислота №соРаиа ρρχΐ АР044128
12 РРО аминокислота №соРаиа АА002290
13 РРО нуклеиновая кислота СюЬопит РРХ1 АР160961
14 РРО аминокислота СюЬопит АР160961_1
15 РРО нуклеиновая кислота 8ртас1а 8О-РОХ1 АВ029492
16 РРО аминокислота Зртас1а ВАА96808
17 РРО нуклеиновая кислота Зртас1а 8О-РОХ2 АВ046993
18 РРО аминокислота Зртас1а ВАВ60710
19 РРО нуклеиновая кислота Зо1апит РРОХ А1225107
20 РРО аминокислота Зо1апит САА12400
21 РРО нуклеиновая кислота 7еа ΖΜ_ΒΡε0091Β03 ВТ063659
22 РРО аминокислота геа ΑΟΝ28356
23 РРО нуклеиновая кислота 7еа ргро2 ΝΜ-001111534
24 РРО аминокислота 7еа ΝΡ_001105004
25 РРО нуклеиновая кислота СЫату0ошопа8 Ррх1 АР068635
26 РРО аминокислота СЫатус1отопа8 ААС79685
27 РРО нуклеиновая кислота Ро1у1оте11а РРО АР332964
28 РРО аминокислота Ро1у1оте11а АР332964_1
29 РРО нуклеиновая кислота ЗогеНит Нур. Рго1ет ХМ_002446665
30 РРО аминокислота ЗогеНит ХР_002446710
31 РРО нуклеиновая кислота СЫоге11а
32 РРО аминокислота СЫоге11а 51538
33 РРО нуклеиновая кислота Огу/а РРОХ1 АВ057771
34 РРО аминокислота Огу/а ВАВ39760
35 РРО нуклеиновая кислота Атагапй1и8 РРХ2 00386113
36 РРО аминокислота Атагапй1и8 АВО52325
37 РРО нуклеиновая кислота АгаЬМор818 РРОХ ΝΜ_178952
38 РРО аминокислота АгаЬМор818 ΝΡ.849283
39 РРО нуклеиновая кислота №соРапа ρρχΙΙ АР044129
40 РРО аминокислота №соРапа ААО02291
41 РРО нуклеиновая кислота О1усте ЬетО АВ025102
42 РРО аминокислота О1усте ВАА76348
43 РРО нуклеиновая кислота Сисшгн8 С8РРО АВ512426
44 РРО аминокислота Сисиггн8 ВАН84864.1
45 РРО нуклеиновая кислота Огу/а Нур. Рго1ет АР606613
46 РРО аминокислота Огу/а САЕ01661
- 4 029356
Подробное описание изобретения
Неопределенные артикли, используемые в настоящем изобретении, относятся к одному или более (т.е. по меньшей мере одному) грамматическому объекту артикля. Например, неопределенный артикль со словом "элемент" означает один или более элементов.
Согласно использованию в настоящем изобретении слово "содержание" или его вариации, такие как "содержит" или "содержащий" подразумевает включение указанного элемента, целого числа или этапа или группы элементов, целых чисел или этапов, но не исключение какого либо другого элемента, целого числа или этапа или группы элементов, целых чисел или этапов.
Настоящее изобретение относится к способу борьбы с нежелательной растительностью на месте произрастания растения, при этом способ включает следующие этапы:
a) предоставление на указанном месте растения, которое содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую протопорфириноген оксидазу дикого типа или мутированную протопорфириноген оксидазу (мут-РРО), которая является стойкой или устойчивой к гербициду - производному бензоксазинона,
b) нанесение на указанное место эффективного количества указанного гербицида.
Понятие "борьба с нежелательной растительностью" подразумевает уничтожение сорняков и/или замедление или препятствование их нормальному росту. Сорняки, в широком смысле, понимают как все растения, растущие там, где это нежелательно. Сорняки настоящего изобретения включают, например, двудольные и однодольные сорняки. Двудольные сорняки включают, но не ограничиваются ими, сорняки следующих сортов:
8тар1§, ЬерИшт, 0а1шт,
31е11апа, МаШсапа, Αηύιεηύδ, ОаНп§о§а, СНепоросПит, РГгЦса, Зепесю, АтагапШик,
Рог1и1аса, Хапйпит, Сопуо1уи1и§, 1ротоеа, Ро1у§опит, ЗечЬата, АтЬгсДа,
СпАит, Сагскшч, ЗопсНич, Зо1апит, Копрра, Ко1а1а, Ьтбегта, Ьагшит, Уеготса,
АЬиШоп, Етех, Оа1ига, Ую1а, Оа1еор§1§, Рарауег, Сеп1аигеа, ΤπΙοΙίιιιη, Капипси1и§ и Тагахасит. Однодольные сорняки включают, но не ограничиваются ими, сорняки следующих сортов: ЕсЬтосЫоа, 8е1апа, Рашсиш, ОЦйапа, РЫеит, Роа,
РеМиса, Е1еи§те, ВгасЫапа, ЬоНит, Вготи§, Ауепа, Сурегик, ЗогеНит, Ащоругоп,
Супобоп, МопосЬопа, ΡΐηιΒπδΙγδΙΐδ, ЗаДНапа, Е1еосЬап8, Зскрич, Ра§ра1ит,
ЕсНаетит, 8рЬепос1еа, Оас1у1ос1етит, ΑβΓΟδύδ, А1оресиги§ и Арега.
Кроме того, сорняки настоящего изобретения могут включать, например, сельскохозяйственные культуры, произрастающие в нежелательном месте. Например, произвольно растущая кукуруза на поле, где главным образом растет соя, может считаться сорняком, если она там нежелательна.
Понятие "растение" используется в широком смысле, так как оно подразумевает органический материал и эукариотические организмы, принадлежащие Царству растений, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, сосудистые растения, овощи, хлебные злаки, цветы, деревья, травы, кусты, дерн, виноградную лозу, папоротник, мох, грибы и водоросли и т.д., а также клоны, отростки и части растений, используемые для вегетативного размножения (например, побеги, стебли, побеги, корневище, подземные корни, комки, венчики, луковицы, клубнелуковицы, клубни, растения/ткани, полученные при культивировании ткани и т.д.). Понятие "растение" также обозначает целое растение, предков и потомство растений и их частей, включая семена, побеги, стебли, листья, корни (включая клубни), цветки, соцветия, фрукты, цветоножки, плодоножки, тычинку, пыльнику, рыльце, завязь, чашелистик, плодолистик, корневой кончик, корневой чехлик, корневой волосок, листовой волосок, растительное волокно, пыльцевое зерно, микроспоры, семядолю, гипокотиль, эпикотиль, ксилему, флоэму, паренхиму, эндосперму, клетку-спутник, замыкающую клетку и другие известные органы, ткани и клетки растения, и ткани и органы, где каждый из вышеперечисленного содержит интересующий ген/нуклеиновую кислоту. Понятие "растение" также включает клетки растений, суспензионные культуры, ткань каллюсов, эмбрионы, меристемные области, гаметофиты, спорофиты, пыльцу и микроспоры, где каждый из вышеперечисленного содержит интересующий ген/нуклеиновую кислоту.
Растения, особенно пригодные для способов данного изобретения, включают все растения, которые относятся к суперсемейству УтШр1аи1:ае, в частности, однодольные и двудольные растения, включая кормовые растения или кормовые бобовые культуры, декоративные растения, продовольственные культуры, деревья или кустарники, выбранные из списка, помимо прочего, включающего
- 5 029356
Асег δρρ., Асйпкйа δρρ., АЬе1то8сйи8 δρρ., А§ауе 818а1апа, Адгоругоп 8рр., А§го8Й8 81о1ош£ега, АИшш δρρ., АтагапЙтш δρρ., Атторййа агепапа, Апапа8 сото8и8, Аппопа δρρ., Аршт §гауео1еп8, АгасЫ8 δρρ, Аг1осагри8 δρρ., А8рага§и8 оШстайз, Ауепа δρρ. (например, Ауепа 8айуа, Ауепа Га1иа, Ауепа Ьугапйпа, Ауепа Га1иа уаг.8айуа, Ауепа йуЪпйа), Ауеггйоа сагатЬо1а, ВатЬи8а δρ., Вептса8а Ы8рМа,
ВегЙюИейа ехсеБеа, Ве1а уи1§ап8, Вга881са δρρ. (например, Вга881са пари8, Вга881са гара δδρ. [канола, масличный рапс, репа масличная]), СайаЬа £агто8а, СатеШа δΐηεηδΐδ, Саппа тсйса, СаппаЫ8 8айуа, Сар81сит δρρ., Сагех е1а1а, Сапса рарауа,
Сап88а тасгосагра, Сагуа δρρ., СагЙтагтш Йпс1огш8, Са81апеа δρρ., СеЛа реп1апйга,
С1сйогшт епсйлла, Стпатотит δρρ., Сйги11и8 1апа1и8, Сйги8 δρρ., Сосо8 δρρ., Сойеа δρρ., Со1оса81а е8си1еп1а, Со1а δρρ., Согсйоги8 δρ., Сопапйгит 8айуит, Согу1и8 δρρ.,
Сга1ае§и8 δρρ., Сгоси8 8айуи8, СисигЬйа δρρ., Сисшт δρρ., Супага δρρ., Оаиси8 саго1а, Ое8тойшт δρρ., Ошюсагри8 1оп§ап, Ою8согеа δρρ., Цю8руго8 δρρ.,
ЕсйтосЫоа δρρ., Е1ае18 (например, Е1ае18 §итееп818, Е1ае18 о1ейега), Е1еи8те согасапа, Ега§го8Й8 1е£, ЕпапЙшз δρ., ЕпоЬойуа ]аротса, Еиса1ур1и8 δρ., Еидета итйога, Еадоругит δρρ., Еа§и8 δρρ., Ее81иса агипйтасеа, Ргсик сапса, ЕогйтеИа δρρ., Егадапа δρρ., Откдо ЬйоЬа, О1усте δρρ. (например, О1усте шах, 8о]а 1Й8рк1а или 5о]а тах), Оо88уршт Ыг8и1ит, НеНапЙшз δρρ. (например, НеНапЙшз аппииз),
Нетегоса1Й8 1и1уа, ΗίΗίδοιίδ δρρ., Ногйеит δρρ. (например, Ногйеит уи1§аге),
1ротоеа Ьа1а1а8, 1и§1ап8 δρρ., Еасйюа 8айуа, ЬаЛугиз δρρ., Εεηδ сиНпапз, Пиит 118ЙаЙ881Гшт, П1сЫ εΐιΐηεηδΐδ, Ео1и8 δρρ., Еийа аси1ап§и1а, Еирти8 δρρ., Еи/и1а 8у1уайса, йусорегасоп δρρ. (например, йусорегасоп е8си1еп1ит, йусорегасоп 1усорег81сит, йусорегасоп рупГогте), Масго1у1ота δρρ., Ма1и8 δρρ., Ма1рфГпа етагфпаГа, Маттеа атепсапа, МапфГега тсйса, МапйюГ δρρ., Мапйкага /аро1а,
Месйсадо 8айуа, МеШойт δρρ., МепГйа δρρ., М18сап1йи8 δΐηεηδΐδ, МотогсПса δρρ.,
Моги8 тдга, Ми8а δρρ., №сойапа δρρ., Ока δρρ., Орипйа δρρ., ОгтЙюри8 δρρ., Огу/а δρρ. (например, Огуга 8айуа, Огу/а 1ай£ойа), Ратсит тШасеит, Ратсит йгдаГит,
Ра881Йога ейиЙ8, Ра8Йпаса 8айуа, РешЙ8е1ит δρ., Рег8еа δρρ., Рейо8е1тит сп8рит,
Рйа1ап8 агипйтасеа, Рйа8ео1и8 δρρ., РЫеит рга1еп8е, Рйоетх δρρ., Рйга§пл1е8 аи8йаЙ8, Рйу8аЙ8 δρρ., Рти8 δρρ., Р181ас1а уега, Р18ит δρρ., Роа δρρ., Ροριιΐιΐδ δρρ.,
Ρτοδορίδ δρρ., Ρπιηιΐδ δρρ., Ρδίάππη δρρ., Ритса дгапаГит, Ругик соттит8, 0иегси8 δρρ., КарЬапиз чайуиц РНеит гйаЬагЬагит, ΡίΗοδ δρρ., Ρίείηιΐδ соттитв, РиЬи8 δρρ.,
Зассйагит δρρ., Зайх δρ., 8атЬиси8 δρρ., 8еса1е сегеа1е, Зе8атит δρρ., Зтар18 δρ.,
Зо1апит δρρ. (например, Зо1апит 1иЬего8ит, Зо1апит тГедгйойшп или Зо1апит 1усорег81сит), Зогдйит Ысо1ог, Зртас1а δρρ., Зу/уфит δρρ., Та§е1е8 δρρ., Татаппйи8 тШса, ТйеоЬгота сасао, ТгйоНит δρρ., Тпр8асит йас1у1оМе8, Тййсо8еса1е птраш,
Тпйсит δρρ. (например, Тпйсит ае8Йуит, Тпйсит йигит, Тпйсит Шгфйит,
Тпйсит йуЬегпит, Тпйсит тасйа, Тпйсит 8айуит, Тпйсит топососсит или Тпйсит уи1§аге), Тгораео1ит ιπϊηιΐδ, Тгораео1ит та]и8, Уасстшт δρρ., Угаа δρρ.,
Уфпа δρρ., Ую1а ойогаГа, ΥίΙίδ δρρ., Ζεη тау8, Ζίζηηίη ра1и8й18, Ζί/ίρΓιιΐδ δρρ.,
щирица, артишок посевной, спаржа, брокколи, брюссельская капуста, капуста, канола, морковь, цветная капуста, сельдерей, листовая капуста, лен, капуста кормовая, чечевица, маслиничная культура, окра, лук, картофель, рис, соя, клубника, сахарная свекла, сахарный тростник, подсолнечник, томат, тыква, чай и морская водоросль. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения растение является сельскохозяйственной культурой. Примеры сельскохозяйственных культур включают сою, подсолнечник, канолу, люцерну, семена рапса, хлопок, томат, картофель обыкновенный или табак. Более предпочтительно растение является однодольным растением, таким как сахарный тростник. Более предпочтительно растение является зерновой культурой, такой как рис, кукуруза, пшеница, ячмень, просо, рожь, сорго или овес.
- 6 029356
В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение предварительно было получено в процессе, включающем рекомбинантную подготовку растения путем введения и сверхэкспрессии трансгена РРО дикого типа или трансгена мут-РРО, что описано более подробно далее.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, растение предварительно было получено в процессе, включающем мутагенез клеток растения ίη κίΐιι для получения клеток растения, которые экспрессируют мут-РРО.
Как описано в настоящем документе, нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут использоваться для повышения устойчивости к гербицидам растений, включающих в своих геномах ген, кодирующий белок РРО дикого типа или белок мут-РРО, устойчивый к гербицидам. Согласно настоящему изобретению этот ген может быть эндогенным или трансгенным. Также в некоторых вариантах осуществления изобретения, нуклеиновые кислоты настоящего изобретения можно сгруппировать с помощью любой комбинации интересующих полинуклеотидных последовательностей для создания растений с желаемым фенотипом. Например, нуклеиновые кислоты настоящего изобретения можно сгруппировать с помощью любых других полинуклеотидов, кодирующих полипептиды с пестицидной и/или инсектицидной активностью, таких как, например, токсиновые белки ВасШик Ошгшщепдк (описано в патентах США № 5366892; 5747450; 5737514; 5723756; 5593881; и Се1кет е! а1. (1986) Сепе 48: 109). Полученные комбинации могут также включать множественные копии любого из интересующих полинуклеотидов.
В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения, растение содержит по меньшей мере одну дополнительную гетерологичную нуклеиновую кислоту, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент устойчивости к гербициду, выбранный, например, из группы, включающей 5-энолпирувилшикимат-3-фосфат синтазу (ΕΡδΡδ), глифосат ацетилтрансферазу (САТ), цитохром Р450, фосфинотрицин ацетилтрансфазу (РАТ), ацетогидроксиацид-синтазу (ΑΗΑδ; ЕС 4.1.3.18, также известную как ацетолактат синтаза или АЬ§), гидроксифенилпируват дионксигеназу (ΗΡΡΌ), фитоин-десатуразу (ΡΌ) и дикамба-разрушающие ферменты, описанные в АО 02/068607, или ферменты, разрушающие производные феноксиуксусной кислоты или феноксипропионовой кислоты, как описано в АО 2008141154 или АО 2005107437.
В целом, под понятием "гербицид" в настоящем изобретении подразумевается ингредиент, который уничтожает, контролирует или каким-либо способом препятствует росту растения. Предпочтительным количеством или концентрацией гербицида является "эффективное количество" или "эффективная концентрация". Под "эффективным количеством" или "эффективной концентрацией" подразумевается количество или концентрация, соответственно, достаточные для уничтожения или препятствования росту подобного, дикого типа, растения, ткани растения, клетки растения или клетки-хозяина, но это количество не уничтожает или не препятствует таким же образом росту растений, тканей растения, клеток растения и клетки-хозяина, стойких к гербицидам, которые описаны в настоящем изобретении. Также эффективное количество гербицида означает количество, которое обычно используется в системах сельскохозяйственного производства для уничтожения интересующих сорняков. Специалистам хорошо известно такое количество. Гербициды - производные бензоксазинона - проявляют свою активность при непосредственном нанесении на растение или на место произрастания растения на любом этапе роста или до его насаждения или прорастания. Эффект зависит от вида растения, этапа роста, применяемые параметры раствора и размер капель при опрыскивании, размера частиц твердых компонентов, внешних условий во время использования, использованного специфического состава, вспомогательных средств и носителей, типа почвы и т.д., а также количества используемых химических веществ. Эти и другие факторы можно регулировать способом, известным специалистам, чтобы вызвать селективную или неселективную активность гербицидов. В целом, предпочтительно для получения максимального контроля над сорняками использовать гербицид - производное бензоксазинона после того, как нежелательные растения только что взошли.
Под растениями, "устойчивыми к гербициду" или "стойкими к гербициду", подразумевается то, что эти растения устойчивы или стойки, по меньшей мере, к одному гербициду, который в данном количестве обычно уничтожает обычные или дикие растения или препятствует их росту. Под "мут-РРО белком, устойчивым к гербициду" или "мут-РРО белком, стойким к гербициду" подразумевается такой мут-РРО белок, который проявляет большую РРО-активность по сравнению с РРО-активностью мут-РРО белка дикого типа в присутствии по меньшей мере одного гербицида, который обычно влияет на активность РРО, и при концентрации или уровне гербицида, которые обычно препятствуют активности РРО белка мут-РРО дикого типа. Более того, активность РРО такого белка мут-РРО, устойчивого или стойкого к гербициду, можно назвать активностью РРО, "устойчивой к гербициду" или "стойкой к гербициду".
"Гербициды - производные бензоксазинона" настоящего изобретения включают бензоксазиноны формулы I в соответствии со следующим описанием:
- 7 029356
где
К1 означает водород или галоген;
К2 означает галоген;
К3 означает водород или галоген;
К4 означает водород, С1-С6-алкил, С1-С6-галогеналкил, С3-С6-циклоалкил, С3-С6-алкенил, С3-С6галоалкенил, С3-С6-алкинил, С3-С6-галоалкинил, С1-С6-алкокси или С3-С6-циклоалкил-С1-С6-алкил;
К5 означает водород, ΝΗ2, С1-С6-алкил или С3-С6-алкинил;
К6 означает водород или С1-С6-алкил; и означает О или δ;
Ζ означает О или δ;
В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения "гербициды - производные бензоксазинона" настоящего изобретения включают бензоксазиноны формулы I в соответствии со следующим описанием:
А) по меньшей мере один бензоксазинон формулы I
гд1е
К1 означает водород или галоген;
К2 означает галоген;
К3 означает водород или галоген;
К4 означает водород, С1-С6-алкил, С1-С6-галогеналкил, С3-С6-циклоалкил, С3-С6-алкенил, С3-С6галоалкенил, С3-С6-алкинил, С3-С6-галоалкинил, С1-С6-алкокси или С3-С6-циклоалкил-С1-С6-алкил;
К5 означает водород, ΝΗ2, С1-С6-алкил или С3-С6-алкинил;
К6 означает водород или С1-С6-алкил; и
X означает О или δ;
Υ означает О или δ;
и, по меньшей мере, другое активное соединение, выбранное из:
В) гербициды класса Ы) - Ы5):
Ы) ингибиторы биосинтеза липидов;
Ь2) ингибиторы ацетолактат синтазы (ингибиторы ΑΕδ);
Ь3) ингибиторы фотосинтеза;
Ь4) ингибиторы протопорфириноген-ΙΧ оксидазы,
Ь5) отбеливающие гербициды;
Ь6) ингибиторы энолпирувилшикимат 3-фосфат-синтазы (ингибиторы ΕΡδΡ);
Ь7) ингибиторы глутаминсинтетазы;
Ь8) ингибиторы 7,8-дигидроптероатсинтазы (ингибиторы ΌΗΡ);
Ь9) ингибиторы митоза;
Ь10) ингибиторы синтеза очень длинноцепочных жирных кислот (УЕСЕА ингибиторы);
Ь11) ингибиторы биосинтеза целлюлозы;
Ь12) разобщающие гербициды;
Ь13) ауксиновые гербициды;
Ь14) ингибиторы транспорта ауксинов; и
Ь15) другие гербициды, выбранные из группы, включающей бромобутид, хлорфлуренол, хлорфлуренол-метил, цинметилин, кумилурон, далапон, дазомет, дифензокват, дифензокват-метилсульфат, диметипин, ΌδΜΑ (ДНАМ, двунатриевый арсенат метила), димрон, эндотал и его соли, этобензанид, флампроп, флампроп-изопропил, флампроп-метил, флампроп-М-изопропил, флампроп-М-метил, флуренол, флуренол-бутил, флурпримидол, фосамин, фосамин-аммоний, инданофан, индазифлам, гидразид малеиновой кислоты, мефлуидид, метам, метилазид, метилбромид, метил-димрон, метилйодид, ΜδΜΑ (ММНА), олеиновую кислоту, оксазикломефон, пеларгоновую кислоту, пирибутикарб, хинокламин, триазифлам, тридифан и 6-хлор-3-(2-циклопропил-6-метилфенокси)-4-пиридазинол (ΕΑδ 499223-49-3) и его соли и эфиры; и
- 8 029356
С) антидоты.
Гербицидами - производными бензоксазинона, которые используются в настоящем изобретении, могут также являться композиции в форме составов, обладающих гербицидной активностью, для защиты сельскохозяйственных культур, содержащих гербицидно-эффективное количество комбинации активных соединений, содержащей по меньшей мере один бензоксазинон формулы I и по меньшей мере еще одно соединение, выбранное из гербицидов В и антидотов С, в соответствии с определением выше, а также по меньшей мере один жидкий и/или твердый носитель и/или одно или несколько ПАВ и, при желании, также одно или несколько вспомогательных веществ, обычно использующихся при изготовлении препаратов для защиты сельскохозяйственных культур.
Также гербицидами - производными бензоксазинона, которые используются в настоящем изобретении, могут также являться композиции в форме составов для защиты сельскохозяйственных культур в виде состава с одним компонентом, содержащего комбинацию активных соединений, содержащую по меньшей мере один бензоксазинон формулы I и по меньшей мере еще одно активное соединение, выбранное из гербицидов В и антидотов С, а также по меньшей мере один твердый или жидкий носитель и/или одно или несколько ПАВ и, при желании, также одно или несколько вспомогательных веществ, обычно использующихся при изготовлении препаратов для защиты сельскохозяйственных культур.
Также гербицидами - производными бензоксазинона, которые используются в настоящем изобретении, могут также являться композиции в форме составов для защиты сельскохозяйственных культур в виде состава с двумя компонентами, содержащего первый компонент, содержащий по меньшей мере один бензоксазинон формулы I, твердый или жидкий носитель и/или одно или несколько ПАВ, и второй компонент, содержащий по меньшей мере еще одно активное соединение, выбранное из гербицидов В и антидотов С, твердый или жидкий носитель и/или одно или несколько ПАВ, причем дополнительно в состав обоих компонентов могут входить другие вспомогательные вещества, обычно использующиеся при изготовлении препаратов для защиты сельскохозяйственных культур.
В случае если бензоксазиноны формулы I в соответствии с определением, приведенным в настоящем документе, способны образовывать геометрические изомеры, например, Ε/Ζ изомеры, в композициях по изобретению допустимо использование как чистых изомеров, так и их смесей.
В случае если бензоксазиноны формулы I в соответствии с определением, приведенным в настоящем документе, имеют один или несколько хиральных центров и, как следствие, присутствуют в виде энантиомеров или диастереоизомеров, в композициях по изобретению допустимо использование как чистых энантиомеров и диастереоизомеров, так и их смесей.
Органические группы, указанные в определении переменных Р'-Р6. являются (как, например, термин "галоген") собирательными понятиями для перечисления отдельных членов группы. Термин "галоген" означает в каждом случае фтор, хлор, бром или йод. Все углеводородные цепочки, т.е. алкилы, могут быть неразветвленными, либо разветвленными, причем приставка Сп-Ст в каждом случае означает возможное число атомов углерода в группе.
Примерами таких значений являются
С1-С4-алкил, а также С-Сд-алкильные группы Сз-С6-циклоалкил-С1-С4-алкила: например, СН3, С2Н5, н-пропил и СН(СНз)2 н-бутил, СН(СНз)-С2Н5, СН2-СН(СНз)2 и С(СНз)з;
С1-С6-алкил, а также С1-С6-алкильные группы С1-С6-алкокси-С1-С6-алкила: С1-С4-алкил, как указано выше, а также, например, н-пентил, 1-метилбутил, 2-метилбутил, з-метилбутил, 2,2-диметилпропил, 1этилпропил, н-гексил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 1-метилпентил, 2-метилпентил, зметилпентил, 4-метилпентил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 1,з-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 2,з-диметилбутил, з,з-диметилбутил, 1-этилбутил, 2-этилбутил, 1,1,2-триметилпропил, 1,2,2триметилпропил, 1 -этил-1-метилпропил или 1-этил-2-метилпропил, предпочтительно метил, этил, нпропил, 1-метилэтил, н-бутил, 1,1-диметилэтил, н-пентил или н-гексил; С1-С4-галогеналкил: С1-С4алкильные радикалы, как указано выше, которые могут быть полностью или частично замещены фтором, хлором, бромом и/или йодом, например, хлорметил, дихлорметил, трихлорметил, фторметил, дифторметил, трифторметил, хлорфторметил, дихлорфторметил, хлордифторметил, бромметил, йодметил, 2фторэтил, 2-хлорэтил, 2-бромэтил, 2-йодэтил, 2,2-дифторэтил, 2,2,2-трифторэтил, 2-хлор-2-фторэтил, 2хлор-2,2-дифторэтил, 2,2-дихлор-2-фторэтил, 2,2,2-трихлорэтил, пентафторэтил, 2-фторпропил, зфторпропил, 2,2-дифторпропил, 2,з-дифторпропил, 2-хлорпропил, з-хлорпропил, 2,з-дихлорпропил, 2бромпропил, з-бромпропил, з,з,з-трифторпропил, з,з,з-трихлорпропил, 2,2,з,з,з-пентафторпропил, гептафторпропил, С1-Сз-галогеналкильные радикалы, как указано выше, а также, например, 1-(фторметил)2-фторэтил, 1-(хлорметил)-2-хлорэтил, 1-(бромметил)-2-бромэтил, 4-фторбутил, 4-хлорбутил, 4-бромбутил, нонафторбутил, 1,1,2,2,-тетрафторэтил и 1-трифторметил-1,2,2,2-тетрафторэтил;
С1-С6-галогеналкил: С1-С4-галогеналкил, как указано выше, а также, например, 5-фторпентил, 5хлорпентил, 5-бромпентил, 5-йодпентил, ундекафторпентил, 6-фторгексил, 6-хлоргексил, 6-бромгексил, 6-йодгексил и додекафторгексил;
Сз-С6-циклоалкил, а также циклоалкильные группы Сз-С6-циклоалкил-С1-С4-алкила: моноциклические насыщенные углеводороды с кольцом, содержащим з-6 членов, такие как циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил;
- 9 029356
Сз-Сб-алкенил: например, 1-пропенил, 2-пропенил, 1-метилэтенил, 1-бутенил, 2-бутенил, 3-бутенил, 1-метил-1-пропенил, 2-метил-1-пропенил, 1-метил-2-пропенил, 2-метил-2-пропенил, 1-пентенил, 2пентенил, 3-пентенил, 4-пентенил, 1-метил-1-бутенил, 2-метил-1-бутенил, 3-метил-1-бутенил, 1-метилбутенил, 2-метил-2-бутенил, 3-метил-2-бутенил, 1-метил-3-бутенил, 2-метил-3-бутенил, 3-метил-3бутенил, 1,1-диметил-2-пропенил, 1,2-диметил-1-пропенил, 1,2-диметил-2-пропенил, 1-этил-1-пропенил, 1-этил-2-пропенил, 1-гексенил, 2-гексенил, 3-гексенил, 4-гексенил, 5-гексенил, 1-метил-1-пентенил, 2метил-1-пентенил, 3-метил-1-пентенил, 4-метил-1-пентенил, 1-метил-2-пентенил, 2-метил-2-пентенил, 3метил-2-пентенил, 4-метил-2-пентенил, 1-метил-3-пентенил, 2-метил-3-пентенил, 3-метил-3-пентенил, 4метил-3-пентенил, 1-метил-4-пентенил, 2-метил-4-пентенил, 3-метил-4-пентенил, 4-метил-4-пентенил,
1.1- диметил-2-бутенил, 1,1-диметил-3-бутенил, 1,2-диметил-1-бутенил, 1,2-диметил-2-бутенил, 1,2диметил-3-бутенил, 1,3-диметил-1-бутенил, 1,3-диметил-2-бутенил, 1,3-диметил-3-бутенил, 2,2-диметил3-бутенил, 2,3-диметил-1-бутенил, 2,3-диметил-2-бутенил, 2,3-диметил-3-бутенил, 3,3-диметил-1бутенил, 3,3-диметил-2-бутенил, 1-этил-1-бутенил, 1-этил-2-бутенил, 1-этил-3-бутенил, 2-этил-1бутенил, 2-этил-2-бутенил, 2-этил-3-бутенил, 1,1,2-триметил-2-пропенил, 1-этил-1-метил-2-пропенил, 1этил-2-метил-1-пропенил и 1-этил-2-метил-2-пропенил; С3-Сб-галоалкенил: С3-Сб-алкенильные радикалы, как указано выше, которые могут быть полностью или частично замещены фтором, хлором, бромом и/или йодом, например, 2-хлорпроп-2-ен-1-ил, 3-хлорпроп-2-ен-1-ил, 2,3-дихлорпроп-2-ен-1-ил, 3,3дихлорпроп-2-ен-1-ил, 2,3,3-трихлор-2-ен-1-ил, 2,3-дихлорбут-2-ен-1-ил, 2-бромпроп-2-ен-1-ил, 3бромпроп-2-ен-1-ил, 2,3-дибромпроп-2-ен-1-ил, 3,3-дибромпроп-2-ен-1-ил, 2,3,3-трибром-2-ен-1-ил или 2,3-дибромбут-2-ен-1 -ил;
С3-Сб-алкинил: например, 1-пропинил, 2-пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 3-бутинил, 1-метил-2пропинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-пентинил, 4-пентинил, 1-метил-2-бутинил, 1-метил-3-бутинил, 2метил-3-бутинил, 3-метил-1-бутинил, 1,1-диметил-2-пропинил, 1-этил-2-пропинил, 1-гексинил, 2гексинил, 3-гексинил, 4-гексинил, 5-гексинил, 1-метил-2-пентинил, 1-метил-3-пентинил, 1-метил-4пентинил, 2-метил-3-пентинил, 2-метил-4-пентинил, 3-метил-1-пентинил, 3-метил-4-пентинил, 4-метил1- пентинил, 4-метил-2-пентинил, 1,1-диметил-2-бутинил, 1,1-диметил-3-бутинил, 1,2-диметил-3-бутинил, 2,2-диметил-3-бутинил, 3,3-диметил-1-бутинил, 1-этил-2-бутинил, 1-этил-3-бутинил, 2-этил-3-бутинил и 1-этил-1-метил-2-пропинил;
С3-Сб-галоалкинил: С3-Сб-алкинильные радикалы, как указано выше, которые могут быть полностью или частично замещены фтором, хлором, бромом и/или йодом, например, 1,1-дифторпроп-2-ин-1ил, 3-хлорпроп-2-ин-1-ил, 3-бромпроп-2-ин-1-ил, 3-йодпроп-2-ин-1-ил, 4-фторбут-2-ин-1-ил, 4-хлорбут2- ин-1-ил, 1,1-дифторбут-2-ин-1-ил, 4-йодбут-3-ин-1-ил, 5-фторпент-3-ин-1-ил, 5-йодпент-4-ин-1-ил, бфторгекс-4-ин-1-ил или б-йодгекс-5-ин-1-ил;
С1-С4-алкокси, а также С1-С4-алкокси группы гидроксикарбонил-С1-С4-алкокси, С1-С6алкоксикарбонил-С1-С4-алкокси: например, метокси, этокси, пропокси, 1-метилэтокси бутокси, 1метилпропокси, 2-метилпропокси и 1,1-диметилэтокси;
С1-Сб-алкокси, а также С1-Сб-алкоксигруппы С1-Сб-алкоксикарбонил-С1-С4-алкокси: С1-С4-алкокси, как указано выше, а также, например, пентокси, 1-метилбутокси, 2-метилбутокси, 3-метоксилбутокси,
1.1- диметилпропокси, 1,2-диметил пропокси, 2,2-диметилпропокси, 1-этилпропокси, гексокси, 1метилпентокси, 2-метилпентокси, 3-метилпентокси, 4-метилпентокси, 1,1-диметил-бутокси, 1,2диметилбутокси, 1,3-диметилбутокси, 2,2-диметилбутокси, 2,3-диметилбутокси, 3,3-диметилбутокси, 1этилбутокси, 2-этилбутокси, 1,1,2-триметилпропокси, 1,2,2-триметилпропокси, 1-этил-1-метилпропокси и 1-этил-2-метилпропокси.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения предпочтение отдается производным бензоксазинона формулы I, где переменные либо независимо друг от друга, либо в комбинации друг с другом имеют следующие значения:
К1 означает водород;
также предпочтительно означает галоген, предпочтительно Р или С1, особенно предпочтительно Р;
К2 означает Р;
К3 означает водород или Р, предпочтительно водород; также предпочтительно Р;
К4 означает С3-Сб-алкинил или С3-Сб-галоалкинил, предпочтительно С3-алкинил или С3-галоалкинил, особенно предпочтительно СН2С^СН, СН2С^СС1 или СН2С^СВг;
также предпочтительно С3-Сб-алкинил или С3-Сб-циклоалкил-С1-Сб-алкил, особенно предпочтительно пропаргил или циклопропилметил;
также предпочтительно С3-Сб-алкинил, предпочтительно С3-алкинил; особенно предпочтительно СН2С^СН;
также предпочтительно С3-Сб-галоалкинил, предпочтительно С3-галоалкинил, особенно предпочтительно СН2С^СС1 или СН2С^СВг;
К5 означает ΝΗ2, С1-Сб-алкил или С3-Сб-алкинил; предпочтительно С1-Сб-алкил; более предпочтительно С1-С4-алкил; наиболее предпочтительно СН3;
- 10 029356
К6 означает С1-С6-алкил; предпочтительно СгС4-алкил; наиболее предпочтительно СН3; означает О, также предпочтительно означает δ;
Ζ означает О, также предпочтительно означает δ.
Особенное предпочтение отдается производным бензоксазинона формулы 1.а (соответствует формуле I, где К2 - Р, К5 и К6 - СН3, - О и Ζ - δ),
где переменные К1, К3 и К4 имеют значения значениях, в частности предпочтительные значения, как определено выше.
Наибольшее предпочтение отдается производным бензоксазинона формул 1.а.1 - 1.а.48, приведенным в табл. А ниже, где переменные К1, К3 и К4 вместе имеют значения, которые даны в одном ряду в таблице (бензоксазиноны 1.а.1 - 1.а.54); и где определения переменных К1, К2, К3 и К4 имеют особенное значение для соединений согласно данному изобретению не только в комбинации друг с другом, но также в каждом случае, по отдельности.
Таблица А
- 11 029356
1.3.50. С1 Р СН(СНз)2
1.3.51. С1 Р СН2-СН2-(СН3)2
Ι.3.52. С1 Р сн2-сн=сн2
Ι.3.53. С1 Р СН2С=СН
Ι.3.54. С1 Р СН2С=С-Вг
Особенно предпочтительным бензоксазиноном формулы I, который в качестве компонента А входит в состав композиции по изобретению, является бензоксазинон формулы 1.а.35, как определено выше.
В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления изобретения, композиция, применимая в способах настоящего изобретения, содержит в качестве компонента А бензоксазинон формулы 1.а.35.
Вышеуказанные производные бензоксазинона и композиции подробно описаны в заявке на европейский патент 09163242.2, в частности, описание на стр. 1-7, относящееся к производным бензоксазинона и к их возможным заместителям, включено в настоящий документ во всей полноте посредством ссылки.
Производные бензоксазинона настоящего изобретения обычно лучше всего используются в сочетании с одним или несколькими другими гербицидами для борьбы с большим количеством видов нежелательной растительности. При использовании в сочетании с другими целевыми гербицидами, заявленные в настоящем изобретении соединения могут быть использоваться в одной препаративной форме с другим гербицидом или гербицидами, смешаны в емкости с другим гербицидом или гербицидами или использованы последовательно с другим гербицидом или гербицидами.
Гербицидные соединения настоящего изобретения могут также использоваться в соединении с дополнительными гербицидами, к которым злаковая культура обычно устойчива или стойка в результате экспрессии одного или более дополнительных трансгенов, как описано выше. Некоторые гербициды, которые могут быть использованы в связывании с соединениями настоящего изобретения, включают сульфонамиды, такие как метосулам, флуметсулам, хлорансулам-метил, диклосулам, пенокссулам и флорасулам, производные сульфонилмочевины, такие как хлоримурон, трибенурон, сульфометурон, никосульфурон, хлорсульфурон, амидосульфурон, триасульфурон, просульфурон, тритосульфурон, тифенсульфурон, сульфосульфурон и метсульфурон, имидазолиноны, такие как имазаквин, имазапик, имазетапир, имзапир, имзаметабенз и имазамокс, феноксиалкановые кислоты, такие как 2,4-Ό, МХФУ (2метил-4-хлорфеноксиуксусная кислота), дихлорпроп и мекопроп, пиридинилоксиуксусные кислоты, такие как триклопир и флуроксипир, карбоновые кислоты, такие как клопиралид, пиклорам, аминопиралид и дикамба, динитроанилины, такие как трифлуралин, бенефин, бенфлуралин и пендиметалин, хлороацетанилиды, такие как алахлор, ацетохлор и метолахлор, семикарбазоны (ингибиторы-переносчики ауксина), такие как хлорфлуренол и дифлуфензопир, арилоксифеноксипропионаты, такие как флуазифоп, галоксифоп, диклофоп, клодинафоп и феноксапроп и другие распространенные гербициды, включающие глифосат, глуфосинат, ацифторфен, бентазон, кломазон, фумиклорак, флуометурон, фомесафен, лактофен, линурон, изопротурон, симазин, норфлуразон, паракват, диурон, дифлуфеникан, пиколинафен, цинидон, сетоксидим, тралкоксидим, квинмерак, изоксабен, бромоксинил, метрибузин и мезотрион.
Например, гербициды - производные бензоксазинона, использующиеся в способах настоящего изобретения, могут также применяться в сочетании с глифосатом и глюфосинатом к культурам, устойчивым к глифосату или глюфосинату.
Если не было упомянуто выше, гербициды - производные бензоксазинона, использующиеся в способах настоящего изобретения, могут также применяться в сочетании с соединениями:
Ы) из группы ингибиторов биосинтеза липидов
АСС-гербициды, такие как аллоксидим, аллоксидим-натрий, бутроксидим, клетодим, клодинафоп, клодинафоп-пропаргил, циклоксидим, цигалофоп, цигалофоп-бутил, диклофоп, диклофоп-метил, феноксапроп, феноксапроп-этил, феноксапроп-Р, феноксапроп-Р-этил, флуазифоп, флуазифоп-бутил, флуазифоп-Р, флуазифоп-Р-бутил, галоксифоп, галоксифоп-метил, галоксифоп-Р, галоксифоп-Р-метил, метамифоп, пиноксаден, профоксидим, пропаквизафоп, квизалофоп, квизалофоп-этил, квизалофоп-тефурил, квизалофоп-Р, квизалофоп-Р-этил, квизалофоп-Р-тефурил, сетоксидим, тепралоксидим и тралкоксидим, и гербициды, не принадлежащие к группе АСС-гербицидов, такие как бенфуресат, бутилат, циклоат, далапон, димепиперат, ЕРТС, эспрокарб, этофумесат, флупропанат, молинат, орбенкарб, пебулат, просульфокарб, ТСА, тиобенкарб, тиокарбазил, триаллат и вернолат;
Ь2) из группы ингибиторов ЛЬ8
Сульфонилмочевины, такие как амидосульфурон, азимсульфурон, бенсульфурон, бенсульфуронметил, хлоримурон, хлоримурон-этил, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфамурон, этаметсуль- 12 029356
фурон, этаметсульфурон-метил, этоксисульфурон, флазасульфурон, флуцетосульфурон, флупирсульфурон, флупирсульфурон-метил-натрий, форамсульфурон, галосульфурон, галосульфурон-метил, имазосульфурон, иодосульфурон, иодосульфурон-метил-натрий, мезосульфурон, метазосульфурон, метсульфурон, метсульфурон-метил, никосульфурон, ортосульфамурон, оксасульфурон, примисульфурон, примисульфурон-метил, пропирисульфурон, просульфурон, пиразосульфурон, пиразосульфурон-этил, римсульфурон, сульфометурон, сульфометурон-метил, сульфосульфурон, тифенсульфурон, тифенсульфурон-метил, триасульфурон, трибенурон, трибенурон-метил, трифлоксисульфурон, трифлусульфурон, трифлусульфурон-метил и тритосульфурон; имидазолиноны, такие как имазаметабенз, имазаметабензметил, имазамокс, имазапик, имазапир, имазахин и имазетапир, гербициды группы триазолопиримидина и сульфонанилиды, такие как хлорансулам, хлорансулам-метил, диклосулам, флуметсулам, флорасулам, метосулам, пеноксулам, пиримисульфан и пироксулам;
пиримидинилбензоаты, такие как биспирибак, биспирибак-натрий, пирибензоксим, пирифталид, пириминобак, пириминобак-метил, пиритиобак, пиритиобак-натрий, 4-[[[2-[(4,6-диметокси-2-пиримидинил)окси]фенил]метил]амино]бензойной кислоты-1-метилэтиловый эфир (СА8 420138-41-6), 4-[[[2[(4,6-диметокси-2-пиримидинил)окси]фенил]метил]амино]бензойной кислоты пропиловый эфир (СА8 420138-40-5), ^(4-бромфенил)-2-[(4,6-диметокси-2-пиримидинил)окси]бензолметанамин (СА8 42013801-8) и гербициды группы сульфониламинокарбонил-триазолинона, такие как флукарбазон, флукарбазон-натрий, пропоксикарбазон, пропоксикарбазон-натрий, тиенкарбазон и тиенкарбазон-метил. В том числе, предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к таким композициям, содержащим по меньшей мере один гербицид из группы имидазолинонов;
Ь3) из группы ингибиторов фотосинтеза
амикарбазон, ингибиторы фотосистемы II, например, гербициды группы триазинов, включая хлортриазин, триазиноны, триазиндионы, метилтиотриазины и пиридазиноны, такие как аметрин, атразин, хлоридазон, цианазин, десметрин, диметаметрин, гексазинон, метрибузин, прометон, прометрин, пропазин, симазин, симетрин, тербуметон, тербутилазин, тербутрин и триэтазин, арилмочевины, такие как хлорбромурон, хлортолурон, хлорксурон, димефурон, диурон, флуометурон, изопротурон, изоурон, линурон, метамитрон, метабензтиазурон, метобензурон, метоксурон, монолинурон, небурон, сидурон, тебутиурон и тиадиазурон, фенилкарбаматы, такие как десмедифам, карбутилат, фенмедифам, фенмедифам-этил, нитриловые гербициды, такие как бромфеноксим, бромоксинил и его соли и сложные эфиры, иоксинил и его соли и сложные эфиры, урацилы, такие как бромацил, ленацил и тербацил, и бентазон и бентазон-натрий, пиридат, пиридафол, пентанохлор и пропанил и ингибиторы фотосистемы I такие как дикват, дикват-дибромид, паракват, паракват-дихлорид и паракват-диметилсульфат. В том числе, предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к таким композициям, содержащим по меньшей мере один гербицид - производное арилмочевины. В том числе, таким же образом, предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к таким композициям, содержащим по меньшей мере один гербицид группы триазинов. В том числе, таким же образом, предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к таким композициям, содержащим по меньшей мере один гербицид группы нитрилов;
Ь4) из группы ингибиторов протопорфириноген-ΙΧ оксидазы: ацифторфен, ацифторфен-натрий, азафенидин, бенкарбазон, бензфендизон, бифенокс, бутафенацил, карфентразон, карфентразон-этил, хлометоксифен, цинидон-этил, флуазолат, флуфенпир, флуфенпир-этил, флумиклорак, флумиклоракпентил, флумиоксазин, фторгликофен, фторгликофен-этил, флутиацет, флутиацет-метил, фомесафен, галосафен, лактофен, оксадиаргил, оксадиазон, оксифторфен, пентоксазон, профлуазол, пираклонил, пирафлуфен, пирафлуфен-этил, сафлуфенацил, сульфентразон, тидиазимин, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1метил-6-трифторметил-2,4-диоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-3 -ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетат (СА8 353292-31-6; 8-3100), ^этил-3-(2,6-дихлор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-1Н-пиразол-1карбоксамид (СА8 452098-92-9), ^тетрагидрофурфурил-3-(2,6-дихлор-4-трифторметилфенокси)-5метил-1Н-пиразол-1 -карбоксамид (СА8 915396-43-9), ^этил-3 -(2-хлор-6-фтор-4-трифторметилфенокси)5-метил-1Н-пиразол-1-карбоксамид (СА8 452099-05-7), ^тетрагидрофурфурил-3-(2-хлор-6-фтор-4трифторметилфенокси)-5-метил-1Н-пиразол-1-карбоксамид (СА8 45100-03-7) и 3-[7-фтор-3-оксо-4(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2Н-бензо [1,4]оксазин-6-ил]- 1,5-диметил-6-тиоксо-[1,3,5]триазинан-2,4-дион;
Ь5) из группы отбеливающих гербицидов
ингибиторы фитоен десатуразы (ΡΌδ): бефлубутамид, дифлуфеникан, флуридон, фторхлоридон, флуртамон, норфлуразон, пиколинафен и 4-(3-трифторметилфенокси)-2-(4-трифторметилфенил)пиримидин (СА8 180608-33-7), ингибиторы ΗΡΡΌ: бензобициклон, бензофенап, изоксафлутол, мезотрион, пирасульфотол, пиразолинат, пиразоксифен, сулькотрион, тефурилтрион, темботрион, топрамезони бициклопирон, гербицид-отбеливатель, целевой фермент неизвестен: аклонифен, амитрол, кломазон и флуметурон;
Ь6) из группы ингибиторов ΕΡδΡ синтазы
глифосат, глифосат-изопропиламмоний и глифосат-тримезиум (сульфосат);
Ь7) из группы ингибиторов глутамин-синтазы
биланафос (биалафос), биланафос-натрий, глюфосинат, глюфосинат-Р и глуфосинат-аммоний;
- 13 029356
Ь8) из группы ингибиторов ΌΗΡ синтазы асулам;
Ь9) из группы ингибиторов митоза
соединения группы К1: динитроанилины, такие как бенфлуралин, бутралин, динитрамин, эталфлуралин, флухлоралин, оризалин, пендиметалин, продиамин и трифлуралин, фосфорамидаты, такие как амипрофос, амипрофос-метил и бутамифос, гербициды - производные бензойной кислоты, такие как хлортал, хлортал-диметил, пиридины, такие как дитиопир и тиазопир, бензамиды, такие как пропизамид и тебутам; соединения группы К2: хлорпрофам, профам и карбетамид, в том числе, соединения группы К1, в частности динитроанилины являются предпочтительными;
Ь10) из группы ингибиторов синтеза очень длинноцепочных жирных кислот (УЬСРА ингибиторов) хлорацетамиды, такие как ацетохлор, алахлор, бутахлор, диметахлор, диметенамид, диметенамид-Р,
метазахлор, метолахлор, метолахлор-5, пентоксамид, претилахлор, пропахлор, пропизохлор и тенихлор, оксиацетанилиды, такие как флуфенацет и мефенацет, ацетанилиды, такие как дифенамид, напроанилид и напроамид, тетразолины, такие как фентразамид и другие гербициды, такие как анилофос, кафенстрол, феноксасульфон, ипфенкарбазон, пиперофос, пироксасульфон и соединения изоксалина формулы II,
где К7, К8, К9, К10, ^, Ζ и п имеют следующие значения:
К7, К8, К9, К10 независимо друг от друга означают водород, галоген или
С1-С4-алкил; X означает кислород или ΝΗ;
Υ означает фенил или моноциклический 5-, 6-, 7-, 8-, 9- или 10-членный гетероциклил, содержащий, в дополнение к членам углеродного кольца, один, два или три одинаковых или различных гетероатома, выбранных из кислорода, азота и серы, в качестве членов кольца, где фенил и гетероциклил не замещены или несут 1, 2 или 3 заместителя Куу, выбранных из галогена, С1-С4-алкила, С1-С4-алкокси, С1С4-галогеналкила и С1-С4-галоалкокси;
предпочтительно фенил или 5- или 6-членный ароматический гетероциклил (гетарил), который содержит, в дополнение к членам углеродного кольца, один, два или три атома азота, в качестве членов кольца, где фенил и гетарил не замещены или несут 1, 2 или 3 заместителя Куу; и
η означает 0 или 1;
среди соединений изоксазолина формулы II, предпочтение отдается соединениям изоксазолина формулы II, где
К7, К8, К9, К10 независимо друг от друга означают Н, Р, С1 или метил;
X означает кислород; η означает 0 или 1; и
Υ означает фенил, пиразолил или 1,2,3-триазолил, где три последних названных радикала являются незамещенными или несут один, два или три заместителя Куу, в особенности, один из следующих радикалов
гд1е1
К11 означает галоген, С1-С4-алкил или С1-С4-галогеналкил;
К12 означает С1-С4-алкил;
К13 означает галоген, С1-С4-алкокси или С1-С4-галоалкокси;
К14 означает галоген, С1-С4-алкил, С1-С4-галогеналкил или С1-С4-галоалкокси; т означает 0, 1, 2 или 3; а также
# указывает точку присоединения к группе СК13К14;
среди соединений изоксазолина формулы II, особенное предпочтение отдается соединениям изоксазолина формулы II, где
К7 означает водород;
К8 означает фтор;
К9 означает водород или фтор;
К10 означает водород или фтор;
X означает кислород;
Υ означает один из радикалов формул Υ1, Υ2, Υ3 или Υ4
- 14 029356
где # указывает точку присоединения к группе СК9К10; η означает ноль или 1, в частности 1; и
среди этих соединений особенно предпочтительными являются соединения изоксазолина формул П.1, ΙΙ.2, П.3, ΙΙ.4, П.5, П.б, П.7, ΙΙ.8 и П.9
соединения изоксазолина формулы ΙΙ известны специалистам, например, из ШО 2006/024820, ШО 2006/037945, ШО 2007/071900 и ШО 2007/096576;
среди УЬСРА ингибиторов, особенное предпочтение отдается хлорацетамидам и оксиацетамидам, в особенности, пироксасульфону;
Ы1) из группы ингибиторов биосинтеза целлюлозы
хлортиамид, дихлобенил, флупоксам, изоксабен, 1-циклогексил-5-пентафторфенилокси-1[1,2,4,6]тиатриазин-3-иламин и соединения пиперазина формулы ΙΙΙ,
где
А означает фенил или пиридил, где Ка прикреплено в орто-положении к точке присоединения А к атому углерода;
Ка означает СК, КО2, С1-С4-алкил, Э-С3-С6-циклоалкил, С1-С4-галогеналкил, С1-С4-алкокси, С1-С4галоалкокси, О-О-С3-С6-циклоалкил, 8(О)аКу, С2-С6-алкенил, Э-С3-С6-циклоалкенил, С3-С6-алкенилокси, С2-С6-алкинил, С3-С6-алкинилокси, ΝΚΑΚ , три-С1-С4-алкилсилил, Э-С(=О)-Ка1, Э-Р(=О)(Ка1)2, фенил, нафтил, 3-7-членный моноциклический или 9-10-членный бициклический насыщенный, ненасыщенный или ароматический гетероцикл, который присоединен с помощью углерода или азота и который содержит 1, 2, 3 или 4 гетероатома, выбранных из группы, включающей О, N и 8, и который может быть частично или полностью замещен группами Каа и/или Ка1, и дополнительно, в случае, если Ка присоединен к атому углерода, - галоген;
Ку означает С1-С6-алкил, С3-С4-алкенил, С3-С4-алкинил, ΝΚΑΚΒ или С1-С4-галогеналкил, и ς означает 0, 1 или 2;
- 15 029356
КА, Кв независимо друг от друга означают водород, С1-С6-алкил, С3-С6-алкенил и С3-Сб-алкинил; вместе с атомом азота, к которому они прикреплены, КА, Кв могут также образовывать пяти- или шестичленное насыщенное или частично или полностью ненасыщенное кольцо, которое в дополнение к атомам углерода может содержать 1, 2 или 3 гетероатома, выбранных из группы, включающей О, N и δ, и которое может быть замещено 1-3 группами Каа;
Ό означает ковалентную связь, С1-С4-алкилен, С2-С6-алкенил или С2-С6-алкинил;
Ка1 означает водород, ОН, С1-С8-алкил, С1-С4-галогеналкил, С3-С6-циклоалкил, С2-С8-алкенил, С5С6-циклоалкенил, С2-С8-алкинил, С1-С6-алкокси, С1-С4-галоалкокси, С3-С8-алкенилокси, С3-С8алкинилокси, ΝΚΑΚΒ, С1-С6-алкоксиамино, С1-С6-алкилсульфониламино, С1-С6-алкиламиносульфониламино, [ди-(С1-С6)алкиламино]сульфониламино, С3-С6-алкениламино, С3-С6-алкиниламино, №(С2-С6алкенил)^-(С1-С6-алкил)амино. ^(С2-С6-алкинил)^-(С1-С6-алкил)амино. ^(О-Сб-алкоксиЕ^О-Сбалкил)амино, ^(С^С^алкенилр^^-С^алкокс^амино, ^(С^С^алкинилр^^-С^алкоксиПмино, С1-С6-алкилсульфонил, три-С1-С4-алкилсилил, фенил, фенокси, фениламино или 5- или 6-членный моноциклический или 9- или 10-членный бициклический гетероцикл, который содержит 1, 2, 3 или 4 гетероатома, выбранных из группы, включающей О, N и δ, где циклические группы не замещены или замещены 1, 2, 3 или 4 группами Каа;
Каа означает галоген, ОН, ΟΝ, ΝΟ2, С1-С4-алкил, С1-С4-галогеналкил, С1-С4-алкокси, С1-С4галоалкокси, §(О)ЧКУ, О-С(=О)-Ка1 и три-С1-С4-алкилсилил; Кь независимо друг от друга означают водород, ΌΝ, ΝΟ2, галоген, С1-С4-алкил, С1-С4-галогеналкил, С2-С4-алкенил, С3-С6-алкинил, С1-С4-алкокси, С1-С4-галоалкокси, бензил или §(О)ЧКУ,
Кь вместе с группой Ка или Кь, присоединенной к прилегающему атому кольца, может образовывать пяти- или шестичленное насыщенное или частично или полностью ненасыщенное кольцо, которое в дополнение к атомам углерода может содержать 1, 2, или 3 гетероатома, выбранных из группы, включающей О, N и δ, и которое может быть Каа;
р означает 0, 1, 2 или 3;
К15 означает водород, ОН, ίΝ, С1-С4-алкил, С3-С4-алкенил, С3-С12-алкинил, С1-С4-алкокси, С3-С6циклоалкил, С5-С6-циклоалкенил, ΝΚΑΚΒ, §(О)ПКУ, δ(Ο)ηΝΚΑΚΒ, С(=О)К25, СОНГОК1/ фенил или 5- или 6-членный моноциклический или 9- или 10-членный бициклический ароматический гетероцикл, который содержит 1, 2, 3 или 4 гетероатома, выбранных из группы, включающей О, Ν и δ, где циклические группы присоединены с помощью Ό и не замещены или замещены 1, 2, 3 или 4 группами Каа, а также следующие группы, частично или полностью замещенные Каа: С1-С4-алкил, С3-С4-алкенил, С3-С4-алкинил, С1-С4-алкокси, С3-С6-циклоалкил, С5-С6-циклоалкенил, ΝΚΑΚΒ, §(О)ПКУ, δ(Ό)ηΝΚΑΚΒ, С(=О)К25, СО^ КАКв;
предпочтительно означает водород, ОН, С№, С1-С4-алкил, С3-С12-алкенил, С3-С4-алкинил, С1-С4алкокси, С3-С6-циклоалкил, С5-С6-циклоалкенил, ΝΚΑΚΒ, §(О)ПКУ, δ^^Ν^Κ® С(=О)К25, фенил или 5- или 6-членный моноциклический или 9- или 10-членный бициклический ароматический гетероцикл, который содержит 1, 2, 3 или 4 гетероатома, выбранных из группы, включающей О, Ν и δ, где циклические группы присоединены с помощью Ό1 и не замещены или замещены 1, 2, 3 или 4 группами Каа, а также следующие группы, частично или полностью замещенные Каа: С1-С4-алкил, С3-С4-алкенил и С3-С4-алкинил;
К25 означает водород, С1-С4-алкил, С1-С4-галогеналкил, С1-С4-алкокси или С1-С4-галоалкокси;
Ό1 означает карбонил или группу Ό;
где в группах К15, Ка и их заместителях, углеродные цепочки и/или циклические группы могут нести 1, 2, 3 или 4 заместителя Каа и/или Ка1;
К16 означает С1-С4-алкил, С3-С4-алкенил или С3-С4-алкинил;
К17 означает ОН, ΝΗ2, С1-С4-алкил, С3-С6-циклоалкил, С3-С6-алкенил, С3-С6-алкинил, С1-С4гидроксиалкил, С1-С4-цианоалкил, С1-С4-галогеналкил, С1-С4-алкокси-С1-С4-алкил или С(=О)К25;
К18 означает водород, галоген, С1-С4-алкил или С1-С4-галогеналкил, или К18 и К19 вместе означают ковалентную связь;
К19, К20, К21, К21 независимо друг от друга означают водород, галоген, ОН, СН NΟ2, С1-С4-алкил, С1-С4-галогеналкил, С2-С6-алкенил, С2-С6-алкинил, С1-С4-алкокси, С1-С4-галоалкокси, С3-С6-циклоалкил, С3-С6-циклоалкенил и С3-С6-циклоалкинил;
К23, К24 независимо друг от друга означают водород, галоген, ОН, галогеналкил, NΚΑΚΒ, NΚΑС(Ο)Κ26, СН NΟ2, С1-С4-алкил, С1-С4-галогеналкил, С2-С4-алкенил, С3-С6-алкинил, С1-С4-алкокси, С1-С4-галоалкокси, О-С(О)К26, фенокси или бензилокси, где в группах К23 и К24 углеродные цепочки и/или циклические группы могут нести 1, 2, 3 или 4 заместителя Каа;
К26 означает С1-С4-алкил или Ν^^;
среди соединений изоксазолина соединений пиперазина формулы III, предпочтение отдается соединениям пиперазина формулы III, где
А означает фенил или пиридил, где Ка прикреплено в орто-положении к точке присоединения А к атому углерода;
Ка означает СН NΟ2, С1-С4-алкил, С1-С4-галогеналкил, С1-С4-алкокси, С1-С4-галоалкокси или Ό- 16 029356
С(=О)-Ка1;
Ку означает С1-С6-алкил, С3-С4-алкенил, С3-С4-алкинил, ΝΚΑΚΒ или С1-С4-галогеналкил и ц - 0, 1 или 2;
ΚΑ, Кв независимо друг от друга означают водород, С1-С6-алкил, С3-С6-алкенил и С3-С6-алкинил; вместе с атомом азота, к которому они прикреплены, КА, Кв могут также образовывать пяти- или шестичленное насыщенное или частично или полностью ненасыщенное кольцо, которое в дополнение к атомам углерода может содержать 1, 2 или 3 гетероатома, выбранных из группы, включающей О, N и 8, и которое может быть замещено 1-3 группами Каа;
Ό означает ковалентную связь или С1-С4-алкилен;
Ка1 означает водород, ОН, С1-С8-алкил, С1-С4-галогеналкил, С3-С6-циклоалкил;
Каа означает галоген, ОН, ΟΝ, ΝΟ2, С1-С4-алкил, С1-С4-галогеналкил, С1-С4-алкокси, С1-С4галоалкокси, 8(О)чКу, О-С(=О)-Ка| и три-С1-С4-алкилсилил;
Кь независимо друг от друга означают водородом СУ N0^ галогеном,
С1-С4-алкилом, С1-С4-галогеналкилом, С2-С4-алкенилом, С3-С6-алкинилом, С1-С4-алкокси, С1-С4галоалкокси, бензилом или 8(О)чКу, Кь вместе с группой Ка или Кь, присоединенной к прилегающему атому кольца, может образовывать пяти- или шестичленное насыщенное или частично или полностью ненасыщенное кольцо, которое в дополнение к атомам углерода может содержать 1, 2 или 3 гетероатома, выбранных из группы, включающей О, N и 8, и которое может быть частично или полностью замещено Каа;
р означает 0 или 1;
К15 означает водород, С1-С4-алкил, С3-С12-алкенил, С3-С12-алкинил, С1-С4-алкокси или С(=О)К25, которые могут быть частично или полностью замещены Каа-группами; означает предпочтительно водород, С1-С4-алкил, С3-С12-алкенил, С3-С4-алкинил, С1-С4-алкокси или С(=О)К25;
К25 означает водород, С1-С4-алкил, С1-С4-галогеналкил, С1-С4-алкокси или С1-С4-галоалкокси; где в группах К15, Ка и их заместителях, углеродные цепочки и/или циклические группы могут нести 1, 2, 3 или 4 заместителя Каа и/или Ка1;
К16 означает С1-С4-алкил; К17 означает ОН, ΝΗ2, С1-С4-алкил, С3-С6-циклоалкил, С1-С4-галогеналкил или С(=О)К25;
К18 означает водород, или К18 и К19 вместе означают ковалентную связь;
19 20 21 21
К , К , К , К независимо друг от друга означают водород;
К23, К24 независимо друг от друга означают водород, галоген или ОН;
Ы2) из группы разобщающих гербицидов
диносеб, динотерб и динитро-о-крезол (^NΟС) и его соли;
Ы3) из группы ауксиновых гербицидов
2,4-0 и его соли и сложные эфиры, 2,4-ΟΒ и его соли и сложные эфиры, аминопиралид и его соли, такие как аминопиралид-трис(2-гидроксипропил)аммоний и его сложные эфиры, беназолин, беназолинэтил, хлорамбен и его соли и сложные эфиры, кломепроп, клопиралид и его соли и сложные эфиры, дикамба и его соли и сложные эфиры, дихлорпроп и его соли и сложные эфиры, дихлорпроп-Р и его соли и сложные эфиры, флуроксипир, флуроксипир-бутометил, флуроксипир-мептил, МСРА (2-метил-4-хлорфеноксиуксусная кислота) и ее соли и сложные эфиры, МСРА-тиоэтил, МСРВ (2-метил-4- хлорфеноксиизобутановая кислота) и ее соли и сложные эфиры, мекопрок и его соли и сложные эфиры, мекопрок-Р и его соли и сложные эфиры, пиклорам и его соли и сложные эфиры, квинклорак, квинмерак, трибутиламин (ТБА) (2,3,6) и его соли и сложные эфиры, триклопир и его соли и сложные эфиры, и аминоциклопирахлор и его соли и сложные эфиры;
Ы4) из группы ингибиторов транспорта ауксинов: дифлуфензопир, дифлуфензопир-натрий, напталам и напталам-натрий;
Ы5) из группы других гербицидов: бромобутид, хлорфлуренол, хлорфлуренол-метил, цинметилин, кумилурон, далапон, дазомет, дифензокват, дифензокват-метилсульфат, диметипин, Ώ8ΜΑ (ДНАМ, двунатриевый арсенат метила), димрон, эндотал и его соли, этобензанид, флампроп, флампроп-изопропил, флампроп-метил, флампроп-М-изопропил, флампроп-М-метил, флуренол, флуренол-бутил, флурпримидол, фосамин, фосамин-аммоний, инданофан, индазифлам, гидразид малеиновой кислоты, мефлуидид, метам, метилазид, метилбромид, метил-димрон, метилйодид, Μ8ΜΑ (ММНА), олеиновая кислота, оксазикломефон, пеларгоновая кислота, пирибутикарб, хинокламин, триазифлам, тридифан и 6-хлор-3-(2циклопропил-6-метилфенокси)-4-пиридазинол ^Α8 499223-49-3) и его соли и эфиры.
Более того, эффективно использовать бензоксазиноны формулы I в комбинации с антидотами. Антидоты представляют собой химические соединения, предотвращающие или уменьшающие повреждения эффективных растений, при этом не оказывая значительного влияния на гербицидное действие бензоксазинонов формулы I на нежелательные растения. Они могут применяться либо перед засевом (например, при обработке семян, побегов или сеянцев) или в предвсходовый или послевсходовый период эффективных растений.
Кроме того, антидоты С, бензоксазиноны I и/или гербициды В могут использоваться одновременно или по очереди.
- 17 029356
К подходящим антидотам относятся, например, (хинолин-8-окси)уксусные кислоты, 1-фенил-5галогеналкил-1 Н-1,2,4-триазол-3-карбоновые кислоты, 1 -фенил-4,5-дигидро-5-алкил-1Н-пиразол-3,5-дикарбоновые кислоты, 4,5-дигидро-5,5-диарил-3-изоксазол карбоновые кислоты, дихлорацетамиды, альфа-оксиминофенилацетонитрилы, ацетофеноноксимы, 4,6-дигалоген-2-фенилпиримидины, К-[[4-(аминокарбонил)фенил]сульфонил]-2-бензойные амиды, 1,8-нафтойный ангидрид, 2-гало-4-(галогеналкил)-5тиазолкарбоновые кислоты, фосфотиоаты и Ν-алкил-О-фенилкарбаматы, их агрономически допустимые соли, а также их агрономически допустимые производные, такие как амиды, эфиры, тиоэфиры при наличии кислотной группы.
Примерами предпочтительных антидотов С являются беноксакор, клоквинтоцет, циометринил, ципросульфамид, дихлормид, дициклонон, диэтолат, фенхлоразол, фенклорим, флуразол, флуксофеним, фурилазол, изоксадифен, мефенпир, мефенат, нафтойный ангидрид, оксабетринил, 4-(дихлорацетил)-1окса-4-азаспиро[4.5]декан (ΜΟΝ4660, СΑδ 71526-07-3) и 2,2,5-триметил-3-(дихлорацетил)-1,3-оксазолидин (К-29148, СΑδ 52836-31-4) и ^(2-метоксибензоил)-4-[(метиламинокарбонил)амино]бензолсульфонамид ^Αδ 129531-12-0).
Особенно предпочтительными антидотами С являются беноксакор, клоквинтоцет, ципросульфамид, дихлормид, фенхлоразол, фенклорим, флуразол, флуксофеним, фурилазол, изоксадифен, мефенпир, нафтойный ангидрид, оксабетринил, 4-(дихлорацетил)-1-окса-4-азаспиро[4.5]декан (ΜΟΝ4660, СΑδ 7152607-3) и 2,2,5-триметил-3-(дихлорацетил)-1,3-оксазолидин (К-29148, СΑδ 52836-31-4) и N-(2метоксибензоил)-4-[(метиламинокарбонил)амино] бензол-сульфонамид ^Αδ 129531-12-0).
Еще более предпочтительными антидотами С являются беноксакор, клоквинтоцет, ципросульфамид, дихлормид, фенхлоразол, фенклорим, фурилазол, изоксадифен, мефенпир, 4-(дихлорацетил)-1-окса4-азаспиро[4.5]декан (ΜΟΝ4660, СΑδ 71526-07-3) и 2,2,5-триметил-3-(дихлорацетил)-1,3-оксазолидин (К-29148, СΑδ 52836-31-4) и ^(2-метоксибензоил)-4-[(метиламинокарбонил)-амино]бензолсульфонамид ^Αδ 129531-12-0).
Особенно предпочтительными антидотами С, которые входят в состав композиции по изобретению, в качестве компонента С, являются антидоты С, в соответствии с определением выше; в частности, антидоты С.1 - С.13, перечень которых приведен ниже в табл. С
Таблица С
Антидот С
С Л беноксакор
С.2 клоквинтоцет
С.З ципросульфамид
С.4 дихлормид
С.5 фенхлоразол
С. 6 фенклорим
С.7 фурилазол
С. 8 изоксадифен
С.9 мефенпир
СЛ0 ангидрид нафтойной кислоты
СЛ1 4-(дихлорацетил)-1-окса-4-азаспиро[4.5]декан (ΜΟΝ4660, САЗ 71526-07-3)
СЛ2 2,2,5-триметил-3-(дихлорацетил)-1,3-оксазолидин (К-29148, САЗ 52836-31-4)
СЛЗ М-(2-метоксибензоил)-4[(метиламинокарбонил)амино]бензолсульфонамид (САЗ 129531-12-0)
Активные соединения В групп Ы) - Ы5) и активные соединения С являются известными гербицидами и антидотами, см., например, ТЕе Сотрепдшт о Г РезВщде Соттоп №тез (И11р://ммм.а1апмоод.пе1/ре8Ис1де8/); Рагт СЕетюаЕ НапдЬоок 2000 том 86, Ме18£ег РиЬЕзЕтд Сотрапу, 2000; В. Носк, С. Ее&ке, К. К. δсЕт^дί, НегЬ1/1де [НегЫщдез], Оеогд ТЫете Уег1а§, δΙιΟΙρηΠ 1995; Ш. Н. АЕгепз, НегЪнлбе НапдЬоок, 7ое изд., Шеед δс^епсе δос^еίу о£ Атепса, 1994; и К. К. На&юз, НегЫщде НапдЬоок, дополнение к 7ому изд., Шеед δс^епсе δос^еίу о£ Атепса, 1998. 2,2,5-триметил-3(дихлорацетил)-1,3-оксазолидин ^Αδ Νθ. 52836-31-4] также называют К-29148. 4-(дихлорацетил)-1окса-4-азаспиро[4.5]декан ^Αδ Νθ. 71526-07-3] также называют ΑΏ-67 и ΜΟΝ 4660. Другие гербицидные активные соединения известны из Ш(9 96/26202, Ш(9 97/41116, Ш(9 97/41117, Ш(9 97/41118 и Ш(9 01/83459, а также из Ш. Кгатег е! а1. (ед.) '^одет Сгор Рго4есЕоп Сотроипдз", том 1, ШВеу УСН, 2007, кроме того из литературы, которая приведена в качестве цитируемых источников в указанных документах.
- 18 029356
В целом, предпочтительно использовать соединения изобретения в комбинации с гербицидами, которые являются селективными для интересующих культур и которые дополняют спектр сорняков, с которыми борются эти соединения при данной норме введения. Также в целом предпочтительно применять соединения изобретения и другие дополнительные гербициды одновременно в виде комбинированного состава или баковой смеси.
Термин "нуклеиновая кислота мут-РРО" относится к нуклеиновой кислоте РРО, которая имеет последовательность, мутировавшую из нуклеиновой кислоты РРО дикого типа, и придает повышенную устойчивость растения к гербицидам - производным бензоксазинона. Кроме того, понятие "мутированная протопорфириноген оксидаза (мут-РРО)" подразумевает замещение аминокислоты первичных последовательностей дикого типа §ЕЦ ГО N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 или 46, или ее варианта, производной, гомолога, ортолога или паралога, другой аминокислотой. Выражение "мутированная аминокислота" будет использоваться ниже для определения аминокислоты, которая замещается другой аминокислотой, обозначая тем самым место мутации в первичной последовательности белка.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность РРО включает последовательность §ЕЦ ГО N0: 1, 25, 37 или 39 или ее вариант или производную.
Кроме того, для специалистов в данной области будет понятно, что нуклеотидные последовательности РРО включают гомологи, паралоги и ортологи 5>Е0 ГО N0: 1, 25, 37 или 39 в соответствии с определением приведенным ниже.
Термин "вариант" в отношении последовательности (например, последовательность полипептидной или нуклеиновой кислоты, такая как, например, транскрипция, регулирующая нуклеотидную последовательность изобретения) подразумевает существенно схожие последовательности. Для нуклеотидных последовательностей, включающих открытую рамку считывания варианты подразумевают те последовательности, которые вследствие дегенерации генетического кода, кодируют идентичную аминокислотную последовательность нативного белка. Такие природные аллельные варианты могут быть идентифицированы при помощи молекулярных биологических методов, как, например, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) и метод гибридизации. Вариантные нуклеотидные последовательности также включают нуклеотидные последовательности, полученные синтетическим методом, такие как последовательности, образованные, например, путем направленного мутагенеза и для открытых рамок считывания, кодируют нативный белок, а также последовательности, кодирующие полипептид с аминокислотными замещениями относительно нативного белка. В целом, варианты нуклеотидной последовательности по изобретению будут иметь по меньшей мере 30, 40, 50, 60 и до 70%, например, предпочтительно 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% и до 79%, в целом, по меньшей мере 80%, например, 81%-84%, по меньшей мере, 85%, например, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, по меньшей мере 94%, 95%, 96%, 97%, до 98% и 99% идентичности последовательности по отношению к нуклеотидной последовательности §ЕЦ ГО N0: 5ЕО ГО N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 или 45. Под термином "вариант полипептида" подразумевается полипептид, полученный из белка 8ЕЦ ГО N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 или 46 путем удаления (т.н. усечение) или добавления одной или более аминокислот к ^концевой и/или С-концевой области нативного белка; путем удаления или добавления одной или более аминокислот на одном или более участках нативного белка; или путем замены одной или более аминокислот на одном или более участках нативного белка. Такие варианты получают, например, в результате генетического полиморфизма или манипуляций, совершенных человеком. Способы таких манипуляций хорошо известны специалистам.
Установлено, что полинуклеотидные молекулы и полипептиды изобретения охватывают полинуклеотидные молекулы и полипептиды с нуклеотидной или аминокислотной последовательностью, достаточно идентичной нуклеотидным последовательностям, представленным далее в §ЕЦ ГО N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 или 45, или аминокислотным последовательностям, представленным далее в §ЕЦ ГО N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 или 46. Понятие "достаточно идентичный" подразумевает в настоящем документе первую аминокислотную или нуклеотидную последовательность, которая содержит достаточное или минимальное число аминокислотных радикалов или нуклеотидов, идентичных или эквивалентных (например, с похожей боковой цепочкой) второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности таким образом, что первая и вторая аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют общий структурный домен и/или общую функциональную активность.
"Идентичность последовательности" подразумевает ту меру, в какой две оптимально выровненные последовательности ДНК или аминокислоты неизменны на участке расположения компонентов, например, нуклеотидов или аминокислот. Понятие "относительное идентичное количество" для выровненных сегментов испытуемой или стандартной последовательности означает число идентичных компонентов в двух выровненных последовательностях, разделенное на общее число компонентов в сегменте стандартной последовательности, т.е. целой стандартной последовательности или меньшей определенной части стандартной последовательности. "Идентичное процентное отношение" означает относительное идентичное количество, умноженное на 100. Оптимальное выравнивание последовательностей для выравни- 19 029356
вания сравнительного участка хорошо известно специалистам и может осуществляться с помощью таких инструментов, как алгоритм локальной гомологии Смита и Ватермана, алгоритм гомологического выравнивания Нидлмана и Вунша, метод поиска сходства Пирсона и Липмана, и предпочтительно с помощью компьютеризированного обеспечения этих алгоритмов, такого как САР, ВЕ8ТР1Т, РА8ТА и ТРА8ТА, доступного как часть программного пакета ССС. ^ΐδοοηδΐη Раскаде (компания "Ассейуз 1пс. ВигНпдΐοη", Массачусетс).
Понятие "полинуклеотид", "последовательность нуклеиновой кислоты", "нуклеотидная последовательность", "нуклеиновая кислота", "молекула нуклеиновой кислоты" взаимозаменяемы и подразумевают в настоящем документе нуклеотиды, рибонуклеотиды и деоксирибонуклеотиды или их комбинацию, в полимерной неразветвленной форме любой длины.
"Производные" белка включают пептиды, олигопептиды, полипептиды, белки и ферменты, имеющие аминокислотные замещения, делеции и/или вставки относительно интересующего немодифицированного белка и имеющие схожую биологическую и функциональную активность, как у немодифицированного белка, из которого они получены.
"Гомологи" белка включают пептиды, олигопептиды, полипептиды, белки и ферменты, имеющие аминокислотные замещения, делеции и/или вставки относительно интересующего немодифицированного белка и имеющие схожую биологическую и функциональную активность, как у немодифицированного белка, из которого они получены.
Удаление относится к устранению одной или более аминокислот из белка.
Термин "вставка" относится к одному или более аминокислотному остатку, который вводят в установленное место в белке. Вставки могут включать слияния Ν- и/или С-конца, а также вставки единичных или множественных аминокислот внутрь последовательности. Обычно, введения внутри аминокислотной последовательности будут меньше, чем объединения Ν- и С-конца, порядка примерно от 1 до 10 радикалов. Примеры белков или пептидов слияний Ν- и С-конца включают связывающий или активационный домен транскрипционного активатора, что использовано в двухгибридной системе дрожжей, фаговых белках оболочки, гистидин-6-маркере, глютатион 8-трансфераза-маркере, белке А, связывающем мальтозу белке, дигидрофолат редуктазе, Тад· 100 эпитопе, с-мик эпитопе, РЬАС®-эпитоп, 1ас2, СМР (калмодулин-связывающий белок), НА эпитопе, белок С эпитиопе и У8У эпитопе.
Замещение означает замену аминокислот белков другими аминокислотами со схожими характеристиками (такими как схожая гидрофобность, гидрофильность, антигенность, склонность к формированию или разрушению α-спиральных или β-пластинчатых структур). Замещаются обычно аминокислоты единичными радикалами, но могут группироваться в зависимости от функциональных ограничений, наложенных на полипептид, и могут варьироваться от 1 до 10 аминокислот; вставки обычно составляют от 1 до 10 радикалов аминокислот. Замещения аминокислот предпочтительно консервативные. Таблицы консервативных замещений хорошо известны специалистам (например, см. ОшдЫоп (1984) Рго1еш8. А.Н. Ргеетап апд Сотрапу (Εάδ).
Таблица 2. Примеры консервативных аминокислотных замещений
Остаток Консервативные замещения Остаток Консервативные замещения
А1а 5ег Ьеи Пе; Уа1
Ат§ Ι^δ ^уδ Аг§; О1п
Αδη 01η; Ηΐδ Ме1 Ьеи; Пе
Αδρ О1и РЬе Мер Ьеи; Туг
О1п Αδη 5ег ТЬг; О1у
Су8 5ег ТЬг 5ег; Уа1
О1и Αδρ Тгр Туг
О1у Рго Туг Тгр; РЬе
Ηΐδ Αδη; О1п Уа1 Пе; Ьеи
Пе Ьеи, Уа1
Аминокислотные замещения, делеции и/или вставки могут осуществляться с использованием технологий синтеза пептидов, хорошо известных специалистам, например, пептидный синтез на твердой фазе, либо с помощью манипуляции с рекомбинантной ДНК. Методы манипуляции с последовательностями ДНК для осуществления замещения, делеции и/или вставки вариантов белков, хорошо известны в технологии. Например, методы создания мутантов путем замещений на предопределенных сайтах ДНК известны специалистам и включают М13 мутагенез, Т7-Сеп ш νίίτο мутагенез (И8В, С1еуе1апд, ОН), сайт-специфический мутагенез по методу ^и^скСйаηде (8!га!адепе, 8ап Р1едо, СА), ПЦР-опосредованный сайт-специфический мутагенез или другие протоколы сайт-специфического мутагенеза.
" Производные" включают пептиды, олигопептиды, полипептиды, которые по сравнению с аминокислотной последовательностью природной формы белка, такого как интересующий белок, могут вклю- 20 029356
чать аминокислотные замещения с неестественно образующимися аминокислотными радикалами, либо присоединения неестественно образующихся аминокислотных радикалов. "Производные" белка также включают пептиды, олигопептиды, полипептиды, которые включают природные измененные (гликозилированные, ацилированные, пренилированные, фосфорилированные, миристоилированные, сульфатированные и др.) или неестественно измененные аминокилсотные радикалы по сравнению с аминокислотной последовательностью природной формы полипептида. Производное может также содержать один или более неаминокислотный заместитель или присоединение, по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой оно получено, например, молекулу репортер или другой лиганд, ковалентно или не ковалентно связанный с аминокислотной последовательностью, такой как молекула репортер, которая связана для облегчения ее обнаружения, и неестественно образованные аминокислотные остатки, родственные аминокислотной последовательности природного белка. Кроме того, "производные" также включают слияния природной формы белка с маркерными пептидами, такими как РЬАС, ΗΙδ6 или тиоредоксин (см. Тегре, Арр1. МюгоЪю1. Вю1есЬпо1. 60, 523-533, 2003).
"Ортологи" и "паралоги" включают эволюционные понятия, описывающие наследственные взаимосвязи генов. Паралоги представляют собой гены одного и того же вида, образовавшиеся в результате дупликации наследственного гена; ортологи представляют собой гены разных организмов, образовавшиеся в результате видообразования, и также происходят от общего наследственного гена. Список примеров таких ортологов, не имеющий ограничительного характера, представлен в табл. 1.
Специалистам хорошо известно, что паралоги и ортологи могут иметь общие домены, содержащие подходящие аминокислотные радикалы на данных участках, такие как связывающие карманы для определенных субстратов или связывающие мотивы для взаимодействия с другими белками.
Понятие "домен" относится к набору аминокислот, которые являются консервативными на определенных позициях в выравнивании последовательностей эволюционно родственных белков. В то время как аминокислоты на других позициях могут различаться между гомологами, аминокислоты, являющиеся крайне консервативными в конкретных позициях, указывают на аминокислоты, которые вероятно имеют необходимую структуру, стабильность или функцию белка. Они идентифицируются по высокой степени консерватизма в выравниваемых последовательностях семейства белковых гомологов и могут использоваться в качестве идентификаторов для определения, принадлежит ли данный полипептид к ранее идентифицированному семейству полипептидов.
Понятие "мотив" или "согласованная последовательность" относится к короткому консервативному участку в последовательности эволюционных белков. Часто мотивы представляют собой особо сохраненные части доменов, могут включать только часть домена или находиться вне консервативного домена (если все аминокислоты мотива оказываются вне данного домена).
Для определения доменов существует специализированные базы данных, например, 8МАКТ (5>с1ш11/ е! а1. (1998) Ργθο. Ν;·ιΐ1. Асаб. δα. И6А 95, 5857-5864; Ье!итс е! а1. (2002) Ыис1ею Ас1бк Кек 30, 242-244), Ιη^ΓΡιο (Ми1бег е! а1. (2003) Ыис1. АсШк. Кек. 31, 315-318), ΡγοκιΚ (ВисЬег апб ВаиосН (1994), Общий синтаксис профиля для мотивов биомолекулярных последовательностей и их функционирования при автоматизированной интерпретации последовательностей. (В) ΙδΜΒ-94; Ρ^οсееб^η§к 2пб 1п!егпа!юпа1 СопГегепсе оп 1п!еШдеп! δук!етк Гог Мо1еси1аг Вю1оду. А1!тап К., Вги!1ад Ό., Кагр Ρ., ЬаШгор К., δеа^1к Ό., Ебк., стр. 53-61, ААА1 Ριόκκ, Меп1о Ρη6<; Ни1о е! а1., Ыис1. АсШк. Кек. 32:Ό134-Ό137, (2004)), или ΡГат (Ва!етап е! а1., Ыискю АсШк КекеагсЬ 30(1): 276-280 (2002)). Набор средств для т кШсо анализа белковых последовательностей доступен на сервере по протеомике ΕxΡΑδу (Шведский институт биоинформатики ((Сак!е1дег е! а1., ΕxΡΑδу: Не ргоЮописк кегуег Гог ш-берГО рго!еш кпо\у1ебде апб апа1ук1к, Ыискю АсШк Кек. 31:3784-3788(2003)). Домены и мотивы могут определяться с помощью стандартных техник, таких как выравнивание последовательностей.
Методы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны специалистам в данной области, эти методы включают СΑΡ, ΒΕδТΡIТ, Β^ΑδТ, ΡΑδТΑ и ТΡΑδТΑ. В методе СΑΡ используется алгоритм Нидлмана и Вунша ((1970) 1 Мо1 Вю1 48: 443-453) для нахождения глобального (т.е. охватывающего последовательности целиком) выравнивания двух последовательностей, что делает число совпадений максимальным, а число пробелов - минимальным. С помощью алгоритма метода Β^ΑδТ (А1!ксЬи1 е! а1. (1990) 1 Мо1 Вю1 215: 403-10) производит подсчет идентичности последовательности в процентном отношении и производит статистический анализ сходства двух последовательностей. Программное обеспечение для проведения Β^ΑδТ анализа находится в открытом доступе в Национальном центре биотехнологической информации (ЫСВ1). Гомологи можно легко определить с помощью, например, алгоритма программы С1ик!а1А для множественного выравнивания последовательностей (версия 1.83) с установленными по умолчанию параметрами попарного выравнивания и с помощью метода расчета процентного соотношения. Глобальное процентное соотношение схожести и идентичности можно также определить с помощью одного из методов, доступных в пакете программы Ма!САТ (Сатрапе11а е! а1., ВМС Вю шГогтайск. 2003 1и1 10;4:29. Ма!САТ: приложение, которое образует матрицы схожести/идентичности, используя последовательности белков или ДНК). Специалисту известно, что может быть осуществлено небольшое изменение настроек для оптимизации выравнивания между консервативными мотивами. Кроме того, при идентификации гомологов вместо последовательностей с полной дли- 21 029356
ной могут использоваться отдельные домены. Значение идентичности последовательности может быть определено по всей нуклеотидной или аминокислотной последовательности или выбранным доменам или консервативному мотиву (мотивам) с использованием упомянутых выше программ с параметрами по умолчанию. Для локального выравнивания, в частности, применим алгоритм Смита-Ватермана (διηίΐΐι ТЕ, Ш!егшап Μδ (1981) I Μοί. ΒίοΙ 147(1); 195-7).
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что замещая один или несколько ключевых аминокислотных радикалов можно значительно повысить устойчивость или стойкость к гербицидам по сравнению с активностью ферментов РРО дикого типа с δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 или 46. Предпочтительными замещениями мут-РРО являются те, которые повышают устойчивость растения к гербицидам, но существенно не влияют на биологическую активность оксидазы.
Соответственно согласно еще одной цели настоящего изобретения ключевые аминокислотные остатки РРО фермента, его варианта, производного, ортолога, паралога или гомолога замещаются любой другой аминокислотой.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, ключевые аминокислотные остатки РРО фермента, его варианта, производного, ортолога, паралога или гомолога замещаются консервативной аминокислотой, что показано в табл. 2.
Для специалистов будет понятно, что аминокислоты, расположенные близко к позициям указанных далее аминокислот, также могут быть замещены. Таким образом, в другом варианте осуществления изобретения вариант δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 или 46, его вариант, производное, ортолог, паралог или гомолог включают мут-РРО, причем ±3, ±2 или ±1 аминокислотные позиции из ключевой аминокислоты замещается любой другой аминокислотой.
С помощью методов, хорошо известных специалистам, можно создать очень характерный образец последовательности, с помощью которого можно осуществлять поиск других вариантов мут-РРО с желаемой активностью.
Поиск других вариантов мут-РРО с помощью соответствующего образца последовательности также охватывается настоящим изобретением. Для специалиста будет очевидно, что данный образец последовательности не ограничивается точным расстоянием между двумя смежными аминокислотными радикалами этого образца. Каждое расстояние между двумя соседними радикалами в упомянутом образце может, например, варьироваться независимо друг от друга и составлять до ±10, ±5, ±3, ±2 или ±1 аминокислотных позиций, что не влияет существенно на желаемую активность.
Наряду с упомянутым выше функциональным и пространственным анализом индивидуальных аминокислотных остатков, основанном на кристаллографических данных, полученных согласно настоящему изобретению, может определяться характеристика уникальных частичных аминокислотных последовательностей для потенциально применимых вариантов мут-РРО.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения, вариант или производное мутРРО δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2 выбирают из следующей табл. 3а, а комбинированные аминокислотные замещения мут-РРО δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2 - из табл. 3Ь.
Таблица 3а. Последовательность δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2, 26, 38, 40: замещения единичных аминокислот
δΕζ) ГО ΝΟ: Ключевая аминокислота Предпочтительное замещение Общее замещение
2 Аг§128 Ееи, А1а, Уа1 Ееи, А1а, Уа1, Не, РЬе, Тгр, Азр, Азп
2 О1у175 делеция, А1а, Уа1, Рго делеция, А1а, Уа1, Рго, Ееи, Не, Мер 8ег, ТЬг
- 22 029356
2 О1у209 деле ция, А1а, Уа1, Рго деле ция, А1а, Уа1, Рго, Ьеи, Пе, Ме1, Зег, ТЬг
2 О1у2Ю деле ция, А1а, Уа1, Рго деле ция, А1а, Уа1, Рго, Ьеи, Пе, Ме1, Зег, ТЬг
2 Ьеи295 Зег, Ме1, А1а Зег, Ме1, А1а, Уа1, Азр, Азп ТЬг
2 8ег296 Ьеи, Ме1, СПу Ьеи, Ме1, СПу, Уа1, Азр, Азп ТЬг
2 Ьеи334 Уа1, Пе, РЬе Уа1, Пе, РЬе, Туг, Азп, Азр, ТЬг
2 РЬе353 Туг, Ьеи Туг, Ьеи, Уа1, Пе, Азп
2 О1у382 А1а, Зег,ТЬг А1а, Зег,ТЬг, Суз, Уа1, Азр
2 Ьеи384 А1а, Уа1, Пе А1а, Уа1, Пе, Азп, Азр, ТЬг
2 Ьеи397 А1а, Уа1, Пе А1а, Уа1, Пе, Азп, Азр, ТЬг
2 О1у398 А1а, Зег,ТЬг А1а, Зег,ТЬг, Суз, Уа1, Азр
2 ТЬг399 Зег, Суз Зег, Суз, Ме1, А1а, Азп
2 Ьеи400 А1а, Уа1, Пе, РЬе А1а, Уа1, Пе, РЬе, Азп, Азр, ТЬг
2 Зег402 СПу, А1а, Суз СПу, А1а, Суз, Азр, РНз
2 Зег4ОЗ СПу, А1а, Су8 СПу, А1а, Суз, Азр, РНз
2 Ме1404 Зег, Су8, ТЬг Зег, Суз, ТЬг, СПу, А1а
2 Ме1405 Ьеи, А1а, Уа1 Ьеи, А1а, Уа1, СПу, Суз, Зег
2 РНе420 Ме1, Су8, Пе, Туг, Тгр Ме1, Суз, Пе, Туг, Тгр, Ьеи, ТЬг
2 РЬе439 Туг, Тгр Туг, Тгр, А1а, Уа1, Пе
26 Уа1389 Ме1, А1а, Су8 Ме1, А1а, Суз, РНз
38 А1а220 деле ция, Уа1, ТЬг, Ьеи, Су8, Пе деле ция, Уа1, ТЬг, Ьеи, Суз, Пе, Ме1
38 8305 Ьеи, А1а, Уа1 Ьеи, А1а, Уа1
38 Туг426 Ме1, Су8, Пе, Ме1, Суз, Пе, Ьеи, ТЬг
40 О1у178 деле ция, А1а, Уа1, Рго деле ция, А1а, Уа1, Рго, Ьеи, Пе, Ме1, Зег, ТЬг
40 О1у179 деле ция, А1а, Уа1, Рго деле ция, А1а, Уа1, Рго,
Ьеи, Пе, Ме1, Зег, ТЬг
40 РЬе372 Ме1, Су8, Пе, Туг, Тгр, РЬе Ме1, Суз, Пе, Туг, Тгр, РЬе, Ьеи, ТЬг
40 РЬе392 МеС, Су8, Пе, Туг, Тгр Ме1, Суз, Пе, Туг, Тгр, Ьеи ТЬг
- 2З 029356
Таблица 3Ы. 8Е^ , Ю N0: 2 (комбинированные аминокислотные замещения)
Комбинация № Ключевая аминокислотная позиция Предпочтительные Общие
Замещения
1 О1у209 или О1у2Ю делеция, А1а, Уа1, Рго делеция, А1а, Уа1, Рго, Ьеи, Не, Ме1, Зег, ТЬг
Агд128 Ьеи, А1а, Уа1 Ьеи, А1а, Уа1, Не, РЬе, Тгр, Αδρ, Αδη
2 РЬе420 Ме1, Су§, Не, Ме1, Су8, Не, Ьеи, ТЬг
Ьеи295 8ег, Ме1, А1а Зег, Ме1, А1а, Уа1, Αδρ, Αδη ТЬг
3 РЬе420 Ме1, Су8, Не, Ме1, Су8, Не, Ьеи, ТЬг
8ег296 Ьеи, Ме1, О1у Ьеи, Ме1, О1у, Уа1, Αδρ, Αδη ТЬг
4 Агд128 Ьеи, А1а, Уа1 Ьеи, А1а, Уа1, Не, РЬе, Тгр, Αδρ, Αδη
РНе420 Ме1, Су8, Не, Ме1, Су8, Не, Ьеи, ТЬг
5 О1у209 или О1у2Ю делеция, А1а, Уа1, Рго делеция, А1а, Уа1, Рго, Ьеи, Не, Ме1, Зег, ТЬг
РНе420 Ме1, Су8, Не, Ме1, Су8, Не, Ьеи, ТЬг
Следует понимать, что любая аминокислота, кроме указанных выше в табл. 3, может использоваться в качестве заместителя. Образцы для тестирования функциональности таких мутантов доступны в уровне техники и, соответственно, описаны в разделе Примеры настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, аминокислотная последовательность отличается от аминокислотной последовательности РРО 8Е^ ГО N0: 2 в одном или нескольких следующих положениях: 128, 175, 209, 210, 295, 296, 334, 353, 382, 384, 397, 398, 399, 400, 402, 403, 404, 405, 420, 439.
Примеры различий в данных аминокислотных положениях включают, помимо прочего, одно или несколько из следующих различий: аминокислота в положении 128 не является аргинином; аминокислота в положении 175 не является глицином; аминокислота в положении 209 не является глицином; аминокислота в положении 210 не является глицином; аминокислота в положении 295 не является лейцином; аминокислота в положении 296 не является серином; аминокислота в положении 334 не является лейцином; аминокислота в положении 353 не является фенилаланином; аминокислота в положении 382 не является глицином; аминокислота в положении 384 не является лейцином; аминокислота в положении 397 не является лейцином, аминокислота в положении 398 не является глицином, аминокислота в положении 399 не является треонином, аминокислота в положении 400 не является лейцином, аминокислота в положении 402 не является серином, аминокислота в положении 403 не является серином, аминокислота в положении 404 не является метионином, аминокислота в положении 405 не является метионином, аминокислота в положении 420 не является фенилаланином, аминокислота в положении 439 не является фенилаланином.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, РРО ферменты 8Е^ ГО N0: 2 содержат один или несколько следующих элементов:
аминокислота в положении 128 - Ьеи, А1а, Уа1, Не, Рйе, Тгр, Акр или Акп; аминокислота в положении 175 удалена, А1а, Уа1, Рго, Ьеи, Не, Ме1, 8ег или Тйг; аминокислота в положении 209 удалена, А1а, Уа1, Рго, Ьеи, Не, Ме1, 8ег или Тйг; аминокислота в положении 210 удалена, А1а, Уа1, Рго, Ьеи, Не, Ме1, 8ег или Тйг; аминокислота в положении 295 - 8ег, Ме1, А1а, Уа1, Акр, Акп или Тйг; аминокислота в положении 296 - Ьеи, Ме1, О1у, Уа1, Акр, Акп или Тйг; аминокислота в положении 334 - Уа1, Не, Рйе, Туг, Акп, Акр или Тйг; аминокислота в положении 353 - Туг, Ьеи, Уа1, Не или Акп; аминокислота в положении 382 А1а, 8ег,Тйг, Сук, Уа1 или Акр; аминокислота в положении 384 - А1а, Уа1, Не, Акп, Акр, или Тйг; аминокислота в положении 397 - А1а, Уа1, Не, Акп, Акр или Тйг, аминокислота в положении 398 - А1а, 8ег,Тйг, Сук, Уа1 или Акр, аминокислота в положении 399 - 8ег, Сук, Ме1, А1а или Акп, аминокислота в положении 400 - А1а, Уа1, Не, Рйе, Акп, Акр или Тйг, аминокислота в положении 402 - О1у, А1а, Сук, Акр, или №к, аминокислота в положении 403 - О1у, А1а, Сук, Акр или Н1к, аминокислота в положении 404 - 8ег, Сук, Тйг, О1у или А1а, аминокислота в положении 405 - Ьеи, А1а, Уа1, О1у, Сук или 8ег, аминокислота в положении 420 - Ме1, Сук, Не, Туг, Тгр, Ьеи или Тйг, аминокислота в положении 439 - Туг, Тгр, А1а, Уа1 или Не.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, аминокислотная последовательность отличается от аминокислотной последовательности РРО 8Е^ ГО N0: 26 в положении 389. Предпочтительно аминокислота в положении 389 не является валином. Более предпочтительно аминокислота в положении 389 - Ме1, А1а, Сук или Н1к.
- 24 029356
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, аминокислотная последовательность отличается от аминокислотной последовательности РРО 8ЕЦ ГО N0: 38 в одном или нескольких следующих положениях: 220, 305, 42б. Предпочтительно аминокислота в положении 220 не является аланином, аминокислота в положении 305 не является серином, аминокислота в положении 42б не является тирозином.
Более предпочтительно аминокислота в положении 220 удалена, Уа1, ТЬг, Ьеи, Су 5. 11е или Мс1; аминокислота в положении 305 - Ьеи, А1а, Уа1, аминокислота в положении 42б - Мер Су5, 11е, Ьеи или ТЬг.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, аминокислотная последовательность отличается от аминокислотной последовательности РРО 8ЕЦ ГО N0: 40 в одном или нескольких следующих положениях: 178, 179, 372, 392. Предпочтительно аминокислота в положении 178 не является глицином, аминокислота в положении 179 не является глицином, аминокислота в положении 372 не является фенилаланином, аминокислота в положении 392 не является фенилаланином.
Более предпочтительно аминокислота в положении 178 удалена, А1а, Уа1, Рго, Ьеи, 11е, Мер 8ег или ТЬг; аминокислота в положении 179 удалена, А1а, Уа1, Рго, Ьеи, 11е, Мер 8ег или ТЬг; аминокислота в положении 372 - Мер Су5, 11е, Туг, Тгр, РЬе, Ьеи или ТЬг; аминокислота в положении 392 - Мер Су5, 11е, Туг, Тгр или Ьеи.
Специалистам в данной области известно, как определить консервативные участки и мотивы, общие для гомологов, ортологов и паралогов 8ЕЦ ГО N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 или 45, такие как те, что приведены в табл. 1. После определения таких консервативных участков, которые могут представлять собой подходящие связывающие мотивы, можно выбрать аминокислоты, соответствующие аминокислотам, перечисленным в табл. 3а и 3Ь, которые можно заменить любой другой аминокислотой, предпочтительно консервативными аминокислотами, указанными в табл. 2, и более предпочтительно аминокислотами из табл. 3а и 3Ь.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу определения гербицида - производного бензоксазинона с использованием мут-РРО, кодированной нуклеиновой кислотой с нуклеотидной последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 или 45 или ее вариантом или производной.
Данный способ включает следующие этапы:
a) образование трансгенной клетки или растения, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую мут-РРО, где мут-РРО экспрессирована;
b) нанесение гербицида - производного бензоксазинона на трансгенную клетку или растение пункта
а) и на контрольную клетку или растение того же сорта;
c) определение роста или жизнеспособности трансгенной клетки или растения и контрольной клетки или растения после нанесения указанного гербицида - производного бензоксазинона, и
ά) отбор "гербицидов - производных бензоксазинона", придают уменьшенный рост контрольной клетке или растению по сравнению с ростом трансгенной клетки или растения.
Под "контрольной клеткой" или "похожим, дикого типа, растением, тканью растения, клеткой растения или клеткой-хозяином" подразумевается растение, ткань растения, клетка растения или клеткахозяин, соответственно, у которых отсутствуют характеристики стойкости к гербицидам и/или особый нуклеотид, что описано в настоящем изобретении. Понятие "дикий тип", таким образом, не подразумевает, что растение, ткань растения, клетка растения или другая клетка-хозяин не имеет рекомбинантную ДНК в геноме, и/или не обладает характеристикой стойкости к гербицидам, отличной от тех, которые описаны в настоящем документе.
Другая задача настоящего изобретения относится к способу идентификации нуклеотидной последовательности, кодирующей мут-РРО, которая является стойкой или устойчивой к гербициду - производному бензоксазинона. Способ включает следующее:
a) создание библиотеки мут-РРО-кодирующих нуклеиновых кислот,
b) скрининг популяции полученных мут-РРО-кодирующих нуклеиновых кислот путем экспрессии каждой из указанных нуклеиновых кислот в клетке или растении и обработки указанной клетки или растения производным бензоксазинона,
c) сравнение уровней устойчивости к производному бензоксазинона, предоставляемых указанной популяцией мут-РРО-кодирующих нуклеиновых кислот с уровнем устойчивости к производному бензоксазинона, предоставляемым контрольной РРО-кодирующей нуклеиновой кислотой,
ά) отбор по меньшей мере одной мут-РРО-кодирующей нуклеиновой кислоты, которая предоставляет значительно повышенный уровень устойчивости к производному бензоксазинона по сравнению с уровнем, предоставляемым контрольной РРО-кодирующей нуклеиновой кислотой.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения мут-РРО-кодирующая нуклеиновая кислота, выбранная на этапе ά), показывает устойчивость или стойкость клетки или растения к гербициду производному бензоксазинона выше по меньшей мере в два раза по сравнению с устойчивостью контрольной мут-РРО-кодирующей нуклеиновой кислоты.
В более предпочтительном варианте осуществления изобретения мут-РРО-кодирующая нуклеино- 25 029356
вая кислота, выбранная на этапе ά), показывает стойкость или устойчивость клетки или растения к гербициду - производному бензоксазинона, выше по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере во 100 раз, по меньшей мере в 500 раз по сравнению с устойчивостью, которая обеспечивается контрольной РРОкодирующей нуклеиновой кислотой.
Стойкость или устойчивость может быть определена путем получения трансгенного растения или клетки-хозяина, предпочтительно клетки растения с последовательностью нуклеиновой кислоты из библиотеки на этапе а), и путем сравнения этого трансгенного растения с контрольным растением или клеткой-хозяином, предпочтительно клеткой растения.
Другая задача изобретения относится к способу идентификации растения или водоросли, которые содержат нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую РРО дикого типа или мут-РРО, которые являются стойкой или устойчивой к гербициду - производному бензоксазинона. Способ включает следующее:
a) определение эффективного количества гербицида - производного бензоксазинона в культуре клеток растения или зеленой водоросли, которое ведет к гибели указанной клетки.
b) обработка указанных клеток растения или зеленой водоросли мутирующим агентом,
c) воздействие на указанные мутировавшие клеточные популяции эффективным количеством гербицида - производного бензоксазинона, определенным на этапе а),
ά) отбор по меньшей мере одной клетки, выжившей после этих испытаний,
е) ПЦР-амплификация и секвенирование РРО генов из клеток, отобранных на этапе ά), и сравнение этих последовательностей с генными последовательностями РРО дикого типа соответственно.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным мутирующим агентом является этилметансульфонат (ЭМС).
Специалистам в данной области хорошо известны методы для получения подходящих вариантов нуклеиновых кислот для идентификации нуклеотидной последовательности, кодирующей мут-РРО, из множества различных потенциальных материнских организмов, включающих микробы, растения, грибы, водоросли, смешанные культуры и т.д., а также из природных источников ДНК, таких как почва. Эти методы включают, помимо прочего, подготовку библиотек кДНК или геномной ДНК, использование подходящих дегенеративных олигонуклеотидных праймеров, использование зондов, основываясь на известных последовательностях или структурном анализе комплементации (например, рост под воздействием тирозина), а также использование мутагенеза и смешения для получения рекомбинантных или смешанных последовательностей, кодирующих мут-РРО.
Нуклеиновые кислоты, содержащие вариантные или контрольные последовательности, кодирующие РРО, могут экспрессироваться в дрожжах, в бактериальном штамм-хозяине, водорослях или высших растениях, таких как табак или арабидопсис, и проходят проверку на относительные уровни наследственной устойчивости последовательностей, кодирующих РРО, основанную на визуальном определении фенотипа трансформированного штамма или растения в присутствии разных концентраций выбранного гербицида - производного бензоксазинона. Данные о зависимости между дозой и эффектом или изменения в эффекте доз, связанные с такими индикаторными фенотипами (формирование коричневого цвета на листьях, подавление роста растений, воздействие гербицидов и т.д.) удобно выражать в виде значений ОК50 (концентрация, при которой скорость роста растений снижается на 50%) или МИК (минимальная ингибирующая концентрация), где увеличение значений соответствует повышению врожденной устойчивости экспрессированной РРО. Например, при системе экспресс-анализа, основанной на трансформации бактерии, такой как Е. соН, каждая последовательность, кодирующая мут-РРО, может экспрессироваться, например, как последовательность ДНК под экспрессионным контролем контролируемого промотора, такого как промотор 1;κΖ. учитывая такие показатели (например, с использованием синтетической ДНК), как частота использования кодонов, для получения по возможности аналогичного для разных последовательностей РРО уровня экспрессии. Такие штаммы, экспрессирующие нуклеиновые кислоты, включающие альтернативные варианты последовательностей РРО, могут быть высеяны при различных концентрациях выбранного гербицида - производного бензоксазинона, дополнительно, в среде с тирозином, и можно определить относительные уровни наследственной устойчивости экспрессированных РРО ферментов на основе степени и минимальной ингибирующей концентрации (МИК, МПК) ингибирования образования с коричневым охронотическим пигментом.
В другом варианте осуществления изобретения возможные аминокислоты трансформируются в растительный материал для получения трансгенного растения, который регенеририруется в морфологически нормальные плодоносные растения, у которых затем измеряют дифференциальную устойчивость к выбранным гербицидам - производным бензоксазинона. Специалистам хорошо известны многие подходящие методы трансформации, в которых используются маркеры отбора, такие как канамицин, бинарные векторы, такие как векторы, полученные из агробактерии и регенерации растения, например, из листовых дисков табака. Дополнительно, контрольная популяция растений таким же образом трансформируется нуклеиновой кислотой, экспрессирующей контрольную РРО. В качестве альтернативы, в качестве контрольного может использоваться нетрансформированное двудольное растение, такое как арабидопсис
- 26 029356
или табак, так как оно, в любом случае, экспрессирует свою собственную эндогенную РРО. Среднее значение и распределение уровней устойчивости к гербициду, характеризующих результаты первичной трансформации растения или его потомства, на которое влияет производное бензоксазинона, описанное выше, рассчитывают обычным способом, учитывая повреждение растения, симптомы меристемного отбеливания и т.д., при различных концентрациях гербицидов. Эти данные могут быть выражены в виде, например, значений СК50, полученных из кривой зависимости "доза-эффект", где значение дозы отмечается на оси абсцисс, а на оси ординат отмечаются "процент погибших растений", "эффект гербицида", "количество молодых всходов" и т.д., где увеличение значений СК50 соответствует повышению уровня врожденной устойчивости экспрессированной РРО. Гербициды можно применять до всхода растений или после.
Другая задача изобретения относится к изолированной мут-РРО-кодирующей нуклеиновой кислоте, при этом нуклеиновая кислота может быть идентифицирована описанным выше методом.
В еще одном варианте осуществления изобретение относится к клетке растения, трансформированной нуклеиновой кислотой РРО дикого типа или мут-РРО нуклеиновой кислотой, или к клетке растения, которую подвергли мутации для получения растения с экспрессией нуклеиновой кислоты РРО дикого типа или мут-РРО нуклеиновой кислоты, причем экспрессия нуклеиновой кислоты в клетке растения приводит к повышению стойкости или устойчивости к гербициду - производному бензоксазинона по сравнению с клеткой растения дикого типа.
Понятие "экспрессия/экспрессирование" или "экспрессия генов" означает транскрипцию специфического гена или генов или генетической конструкции. Понятие "экспрессия" или "экспрессия генов", в частности, означает транскрипцию специфического гена или генов или генетической конструкции в структурную РНК (рРНК, тРНК) или мРНК с последующей трансляцией последней в белок или без трансляции. Этот процесс включает транскрипцию ДНК и обработку полученного продукта мРНК.
Для получения желаемого эффекта, т. е. растений, устойчивых или стойких к гербицидам - производным бензоксазинона, описанным в настоящем изобретении, по меньшей мере одна нуклеиновая кислота подвергается сверхэкспрессии методами и способами, известными специалистам в данной области.
Понятие "повышенная экспрессия" или "сверхэкспрессия", используемое в настоящем документе, означает любую форму экспрессии, которая является дополнительной к первоначальному уровню экспрессии растения дикого типа. Методы повышения экспрессии генов или генных продуктов описаны в документах данной области и включают, например, сверхэкспрессию, которой способствуют соответствующие промоторы, усилители транскрипции или трансляции. Изолированные нуклеиновые кислоты, которые служат промоторами или усилительными элементами, могут быть введены в соответствующую позицию (обычно против хода транскрипции) негетерологичной формы полинуклеотида для повышающей регуляции экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей целевой полипептид. Например, эндогенные промоторы можно изменить в естественных условиях путем мутации, удаления и/или замещения (см. Кш1ес, υδ 5565350; Ζηιΐίηβ с1 а1., XVО 9322443), или изолированные промоторы можно ввести в клетку растения в надлежащем направлении и на надлежащем расстоянии от гена настоящего изобретения для контролирования экспрессии гена.
Если необходима экспрессия полипептида, желательно включить полиаденильный участок 3'-конца на участке, кодирующем полинуклеотид. Полиаденильный участок можно получить из природного гена, набора других растительных генов или Т-ДНК. Добавляемую последовательность 3'-концаможно получить, например, из генов нопалин синтазы или октопин синтазы, или также из другого растительного гена, или, менее предпочтительно из любого другого эукариотического гена.
Для увеличения количества готовой информации, которая накапливается в цитозоли, к 5' нетранслируемой области (ИТК) или кодирующей последовательности частично кодирующей последовательности может быть также добавлена интронная последовательность. Включение связывающего интрона в транскрипционный элемент как в растительные, так и животные экспрессионные конструкты повысило экспрессию генов на уровнях мРНК и белков до 1000-кратного уровня (ВисЬтап ап4 Вегд (1988) Мо1. Се11 Ью1. 8: 4395-4405; СаШк е! а1. (1987) Сепек Эсу 1:1183-1200). Такое интронное увеличение генной экспрессии обычно максимально возле 5'-конца транскрипционного элемента. Использование кукурузных интронов А4Ь1-8 интрон 1, 2 и 6, интрон Вгоп/е-1 известны специалистам. Для получения общей информации см.: ТЬе Ма1/е Нап4Ьоок, СЬар!ег 116, РгееЬпд ап4 Vа1Ьоΐ, Е4к., 8ргшдег, Ν.Υ. (1994).
Понятия "внедрение" и "трансформация" обозначают здесь перенос экзогенного полинуклеотида в клетку-хозяина, независимо от способа передачи. Ткань растения, способная к дальнейшему клоновому размножению, путем органогенеза либо эмбриогенеза, может быть трансформирована с генетическим конструктом настоящего изобретения и всем растением, регенерированным из него. Определенная выбранная ткань будет различаться в зависимости от систем клонового размножения, доступных и наиболее подходящих определенным видам, проходящим трансформацию. Образцы целевых тканей включают листовые диски, пыльцу, зародыши, семядоли, гипокотилы, мегагаметофиты, ткани каллюсов, существующую меристемную ткань (например, верхушечная меристема, пазушные почки и корневые меристемы) и индуцированную меристемную ткань (например, семядольная меристема и гипокотиловая меристема). Полинуклеотид может быть внедрен в клетку-хозяина на время или постоянно и может сохра- 27 029356
няться в неизменном виде, например, в виде плазмида. Либо он может быть интегрирован в главный геном. Полученная трансформированная растительная клетка может использоваться для регенерации трансформированного растения, способами, которые известны специалистам в данной области.
Перенос инородных генов в геном растения называется трансформацией. В настоящее время трансформация растительных видов является широко распространенной технологией. Преимущественно, любой из способов трансформации может использоваться для внедрения интересующего гена в подходящую клетку-предка. Описанные способы трансформации и регенерации растений из тканей и клеток растения могут использоваться для переходной или устойчивой трансформации. Способы трансформации включают использование липосом, электропорацию, химикаты, увеличивающие поглощение свободной ДНК, ввод ДНК непосредственно в растение, обстрел из генной пушки, трансформацию с использованием вирусов, пыльцы или микропроекции. Также может использоваться один из способов использования кальция/полиэтилен гликоля для протопластов (Кгепк, Р.А. е! а1. (1982) №Лиге 296, 72-74; №дгийи Ι е! а1. (1987) Р1ап! Μο1 Βίο1 8: 363-373); электропорация протопластов (81ί11ί!ο К. Ό. е! а1. (1985) Вю/ТесЬпо1 3, 1099-1102); микроинъекция в растительный материал (Сгокк^ау А е! а1., (1986) Μο1. Сеп Сепе! 202: 179185); обстрел частиц, покрытых ДНК или РНК (К1еш Т.М. е! а1., (1987) №Лиге 327: 70) заражение (неинтегративными) вирусами и другие подобные способы. Трансгенные растения, включая трансгенные сельскохозяйственные культуры, предпочтительно производятся с помощью АдгоЪас!ейит-зависимой трансформации.
Предпочтительный способ трансформации представляет собой трансформацию ίη р1ап!а. Для этой цели можно позволить агробактериям действовать на семенах растения или произвести инокуляцию меристемы растения агробактериями. Для целей настоящего изобретения, было признано особенно целесообразным, чтобы суспензия трансформированных агробактерий воздействовала на целое растение или на зачаток цветка. Затем происходит развитие растения до появления семян (С1оидк апй Веп!, Р1ап! 1. (1998) 16, 735-743). Способы трансформации риса с помощью АдгоЪас!ейит включают известные способы трансформации риса, например, описанные в любом из следующих источников: Заявка на европейский патент ЕР 1198985 А1, А1йетйа апй Нойдек (Р1ап!а 199: 612-617, 1996); С1ап е! а1. (Р1ап! Μο1 Βίο1 22 (3): 491-506, 1993), Ше1 е! а1. (Р1ап! 1 6 (2): 271-282, 1994), чьи сообщения с раскрытием информации включены в отсылочном порядке, как если бы они были полностью изложены в тексте документа. В случае трансформации кукурузы, предпочтительно используется способ, описанный либо в работах Ыийа е! а1. (ΝηΙ. 14(6): 745-50, 1996) либо Ргате е! а1. (Р1ап! РЬукю1 129(1): 13-22, 2002), данные документы включены в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Указанные методы также описаны, например, в В. 1епек е! а1., ТесЬшциек Гог Сепе ТгапкГег, а также в: Тгапкдешс Р1ап!к, Том 1, Епдшеейпд апй υΐίП/аИоп. ейк. 8.Ό. Кипд апй К. Ши, Асайетю Ргекк (1993) 128-143 и в Ройукик Аппи. Кеу.Р1ап! РЬукю1. Р1ап! Мо1ес. Βίο1. 42 (1991) 205-225). Нуклеиновые кислоты или конструкт, подлежащий экспрессии, предпочтительно клонируется в вектор, который подходит для трансформации АдгоЪас!егшт !итеГааепк, например, ρΒίπ19 (Пеуап е! а1., №с1. Аскк Кек. 12 (1984) 8711). Агробактерий, трансформированные таким вектором, могут затем использоваться известным способом для трансформации растений, например, растений, используемых в качестве модели, например, АгаЪкорык (АгаЪкорык (НаПапа в рамках настоящего изобретения не считается сельскохозяйственной культурой), или сельскохозяйственных культур, таких как, к примеру, табак, путем, например, погружения дробленных или рубленых листьев в агробактериальные растворы и затем культивирования их в подходящей среде. Трансформация растений посредством АдгоЪас!егшт (итеГааепк описана, например, НбГдеп апй ШШтй/ег в №с1. Аск Кек. (1988) 16, 9877 или, помимо прочего, известны из Р.Р. ШЫ!е, Уес!огк Гог Сепе ТгапкГег ш Шдкег Р1ап!к; ш Тгапкдетс Р1ап!к, том 1, Епдтеегшд апй ийН/айот ейк. 8.Ό. Кипд апй К. Ши, Асайетю Ргекк, 1993, стр. 15-38.
В дополнение к трансформации соматических клеток, которые затем регенерируются в целое растение, существует возможность трансформации клеток растительных меристем, в особенности тех клеток, которые становятся гаметами. В данном случае, развитие трансформированных гамет происходит естественным путем, образуя трансгенные растения. Так, например, семена АгаЪкорык обрабатывают агробактериями, и из развивающихся растений получают семена, определенное количество которых являются трансформированными, т.е. трансгенными [Ре1йтап, К.А. апй Магкк Μ.Ό. (1987). Мо1 Сеп Сепе! 208:274-289; Ре1йтапп К. (1992). Β:ί'.’ Копс/, Ν-Н С1ша апй 1 8Ье11, ейк, Μе!Ьοйк ш АгаЪкорык Кекеагсй Шогй 8аепййс, 8шдароге, стр. 274-289]. Альтернативные способы основаны на повторяющемся удалении соцветий и выращивании области вырезания в центре розетки с трансформированными агробактериями, таким образои, трансформированные семена могут быть получены на более поздних сроках (С1апд (1994). Р1ап! 1. 5: 551-558; Какую (1994). Μο1 Сеп Сепе!, 245: 363-370). Однако особенно эффективным является способ вакуум-инфильтрации с такими модификациями как способ "цветочного погружения". В случае вакуум-инфильтрации АгаЪкорык, целые растения обрабатываются под сниженным давлением суспензией агробактерий ^Λί1ο1φ N. (1993). С. К. Асай 8а Райк Ьйе 8а, 316: 1194-1199], тогда как в случае протокола, называемого "йогаЕйр" (обмакивание цветков в раствор) развивающаяся цветочная ткань инкубируется с использованием обработанной сурфактантом агробактериальной суспензии [С1оидк, 8.1. апй Βеη! А.Р. (1998) ТНе Р1ап! 1. 16, 735-743]. В обоих случаях собирается определенное количество трансгенных семян, данные семена отличаются от нетрансгенных семян, тем, что вы- 28 029356
ращиваются в вышеописанных селекционных условиях. Кроме того, устойчивая трансформация пластидов является предпочтительной, так как пластиды наследуются по материнской линии, следовательно, для большинства культур сокращается или исключается риск трансгенного потока через пыльцу. Трансформация хлоропластного генома обычно достигается благодаря процессу, схематически описанному в работах К1аик с! а1., 2004 [Ыа1иге В|о1ссНпо1оду 22 (2), 225-229]. Последовательности, подлежащие трансформации, клонируются вместе с геномом селектируемого маркера между фланкирующими последовательностями, которые являются гомологическими по отношению к геному хлоропласта. Данные гомологические фланкирующие последовательности попадают в пластом путем прямой специфической интеграции. Пластидная трансформация описана для многих видов растений, общий обзор которой дан в Воск (2001) Тгапкдешс рЫкйбк ίη ЬаЧс гекеагсЬ апб р1ап! Ь|о1есНпо1оду. ί Мо1 Βίο1. 2001 8ер 21; 312 (3):425-38 или МаПда, Р (2003) Ргодгекк 1о\уагбк соттегшаП/аПоп оГ рЫкйб 1гапкГогта11оп 1есНпо1оду. Тгепбк Вю1ес1то1. 21, 20-28. Результатом дальнейшего биотехнологического развития стали пластидные трансформанты без маркеров, которые могут быть получены переходным коинтегрированным геноммаркером (К1аик е! а1., 2004, ЫаШге Вю1есЬпо1оду 22(2), 225-229). Генетически модифицированные клетки растений могут быть регенерированы с помощью любых способов, известных специалистам. Подходящие способы можно найти в вышеперечисленных публикациях 8.Ό. Кипд апб К. XVи, Ройукик или НбГдеп апб \νί11ιηί^Γ.
Обычно после трансформации клетки растений или группы клеток выбирают по наличию одного или более маркеров, закодированных экспрессируемыми в растении генами, которые переносятся вместе с целевым геном, после чего данный трансформированный материал регенерируется в целое растение. Чтобы выбрать трансформированные растения, растительный материал, полученный в ходе трансформации, как правило, подвергается таким селективным условиям, чтобы трансформированные растения можно было отличить от ^трансформированных. Например, семена, полученные описанным способом, могут быть засеяны, а после начального этапа роста подвергнуты подходящему способу селекции путем распыления. Еще один возможный способ заключается в выращивании семян, при необходимости прошедших стерилизацию, в чаше с агаром с использованием подходящего селективного вещества, так, чтобы в растениях произрастали только трансформированные семена. В качестве альтернативы, может быть произведен скриннинг трансформированных растений на наличие вышеописанного селектируемого маркера.
После переноса ДНК и регенерации, предположительно трансформированные растения могут быть также исследованы с использованием Саузерн анализа на наличие целевого гена, номера копии и/или геномной организации. В качестве альтернативы или дополнения, уровни экспрессии вновь введенной ДНК могут исследоваться с использованием Нозерн-анализа и/или Вестерн-анализа, оба способа хорошо известны специалистам.
Генерированные трансформированные растения могут размножаться различными способами, например, клональным размножением или классическим способом разведения растений. Например, первое поколение (или Т1) трансформированного растения может иметь способность к самооплодотворению, могут быть выбраны трансформированные клетки гомозиготного второго поколения (или Т2), а растения Т2 могут затем размножаться классическими способами разведения растений. Генерированные трансформированные организмы могут принимать различные формы. Например, это могут быть гибриды трансформированных и ^трансформированных клеток; клоновые трансформированные клетки (например, все трансформированные клетки содержат экспрессию кассет); графты трансформированных и нетрансформированных тканей (например, в растениях трансформированный корневой отпрыск пересаживается в нетрансформированный побег).
Предпочтительно нуклеиновая кислота дикого типа или мут-РРО нуклеиновая кислота содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей: а) полинуклеотид, как показано в 8ЕО ГО N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 или 45 или его вариант или производное; Ь) полинуклеотид, кодирующий полипептид, как показано в 8ЕО ГО N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 или 46 или его вариант или производное; с) полинуклеотид, содержащий по меньшей мере 60 последовательных нуклеотидов а) или Ь); и б) полинуклеотид, являющийся комплементарным по отношению к полинуклеотиду по любому из пп. а) - с).
Предпочтительно экспрессия нуклеиновой кислоты в растении приводит к повышению стойкости растения к гербициду - производному бензоксазинона по сравнению с растением дикого типа.
В другом варианте осуществления, изобретение относится к растению, предпочтительно трансгенному растению, включающему растительную клетку согласно настоящему изобретению, в котором экспрессия нуклеиновой кислоты в растении приводит к повышению стойкости растения к гербицидам производным бензоксазинона по сравнению с растениями дикого типа.
Растения, описанные в настоящем документе, могут быть как трансгенными зерновыми культурами, так и нетрансгенными растениями.
Для целей настоящего изобретения, "трансгенный", "трансген" или "рекомбинантный" означает в отношении, например, последовательности нуклеиновой кислоты, экспрессионную кассету, генный кон- 29 029356
структ или вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, или организм, трансформированный последовательностями нуклеиновой кислоты, экспрессионными кассетами или векторами согласно настоящему изобретению, все эти конструкции, полученные рекомбинантными методами, в которых:
(a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие белки, использованные в методах настоящего изобретения, или
(b) генетическая контрольная последовательность(и), которая функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты по данному изобретению, например, промотор, или
(c) а) и Ь)
не расположены в их естественной генетической среде или были изменены рекомбинантными методами, причем модификация может иметь форму, например, замены, добавления, делеции, инверсии или вставки одного или более нуклеотидных остатков. Под естественной генетической средой подразумевают естественный геномный или хромосомный локус в исходном растении или нахождение в геномной библиотеке. В случае геномной библиотеки, естественная генетическая среда последовательности нуклеиновой кислоты предпочтительно сохраняется, по меньшей мере, частично. Среда примыкает к последовательности нуклеиновой кислоты по меньшей мере с одной стороны и имеет последовательность длиной по меньшей мере 50 п.о., предпочтительно по меньшей мере 500 п.о., особенно предпочтительно по меньшей мере 1000 п.о. и наиболее предпочтительно по меньшей мере 5000 п.о. Природная кассета экспрессии- например, природная комбинация природного промотора последовательностей нуклеиновой кислоты с соответствующей последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, подходящий для способов настоящего изобретения, как определено выше, становится трансгенной кассетой экспрессии, когда кассета экспрессии изменяется с помощью не природных, синтетических ("искусственных") методов, таких как, например, мутагенная обработка. Подходящие методы описаны, например, в И8 5565350 или \УО 00/15815.
Таким образом, при использовании понятия "трансгенное растение" в целях изобретения подразумевается, как указано выше, что нуклеиновые кислоты, используемые в способе изобретения, находятся не в естественном локусе генома указанного растения, поэтому нуклеиновые кислоты могут экспрессироваться гомологически или гетерологически. Тем не менее, как было отмечено, трансгенный означает также, что, так как нуклеиновые кислоты согласно изобретению или используемому методу находятся в природной позиции в геноме растения, последовательность была изменена по отношению к природной последовательности, и/или регуляторные последовательности природных последовательностей были изменены. Под понятием "трансгенный" предпочтительно понимается экспрессия нуклеиновых кислот по изобретению в неестественном локусе генома, т.е. происходит гомологическая или предпочтительно гетерологическая экспрессия нуклеиновых кислот. Предпочтительные трансгенные растения указаны в данном документе. Также понятие "трансгенный" относится к любому растению, клетке растения, каллюсу, ткани растения или части растения, которые содержат все или часть по меньшей мере одного рекомбинантного полинуклеотида. Во многих случаях, все или часть рекомбинантного полинуклеотида прочно интегрирована в хромосому или стабильный внехромосомный элемент для того, чтобы передаться следующим поколениям. Для целей настоящего изобретения, понятие "рекомбинантный полинуклеотид" относится к полинуклеотиду, который был изменен, перегруппирован или изменен с помощью генной инженерии. Примеры включают любой клонированный полинуклеотид или полинуклеотиды, соединенные или присоединенные к гетерологичным последовательностям. Понятие "рекомбинантный" не относится к изменениям полинуклеотидов, которые были получены в результате естественных процессов, таких как спонтанные мутации, или в результате неспонтанного мутагененза, а затем селекции.
Растения, содержащие мутации в результате неспонтанного мутагенеза и селекции, являются в настоящем документе нетрансгенными растениями и включены в настоящее изобретение. В вариантах осуществления изобретения, где растение является трансгенным и включает множество мут-РРО нуклеиновых кислот, нуклеиновые кислоты можно получить из разных геномов или одного и того же генома. В качестве альтернативы, в вариантах осуществления изобретения, где растение является нетрансгенным и включает множество нуклеиновых кислот мут-РРО, нуклеиновые кислоты расположены в разных геномах или одном и том же геноме.
В определенных вариантах осуществления изобретения, настоящее изобретение включает стойкие к гербицидам растения, полученные мутационным разведением. Такие растения включают полинуклеотид, кодирующий мут-РРО, и являются устойчивыми к одному или нескольким гербицидам - производным бензоксазинона. Такие методы могут включать, например, воздействие на растения или семена мутагеном, в частности, химическим мутагеном, таким как, например, этил метансульфонат (ЭМС), и отбор растений с повышенной устойчивостью по меньшей мере к одному или нескольким гербицидам - производным бензоксазинона.
Тем не менее, настоящее изобретение не ограничивается устойчивыми к гербицидам растениями, полученными методом мутагенеза, включающим химический мутаген ЭМС. Любой метод мутагенеза, известный специалистам, может быть использован для получения стойких к гербицидам растений настоящего изобретения. Такие методы мутагенеза могут включать, например, использование любого или
- 30 029356
нескольких из следующих мутагенов: излучение, такое как рентгеновское излучение, гамма-излучение (например, кобальт 60 или цезий 137), нейтроны (например, продукт ядерного распада урана 235 в атомном реакторе), бета-излучение (например, от радиоизотопов, таких как фосфор 32 или углерод 14) и ультрафиолетовое излучение (предпочтительно от 2500 до 2900 нм), и химические мутагены, такие как основные аналоги (например, 5-бром-урацил), сопутствующие соединения (например, 8-этокси кофеин), антибиотики (например, стрептонигрин), алкилирующие агенты (например, сернистые иприты, азотные иприты, эпоксиды, этиленамины, сульфаты, сульфонаты, сульфоны, лактоны), азид, гидроксиламин, азотистая кислота Растения, стойкие к гербицидам, можно также получить с использованием методов разведения тканей для отбора клеток растения, включающих стойкие к гербицидам мутации, а затем регенирирования из них растений, стойких к гербицидам. См., например, патенты США № 5773702 и 5859348, которые оба включены в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме. Остальные детали разведения мутацией можно найти в работе "Ргшщрак оГ СиНАат Осус1ортсШ" Рейт, 1993 МаетШап РийЙ8Й1п§ Сотрапу, которая включена в настоящий документ посредством ссылки.
В дополнение к описанному выше определению, понятие "растение" включает сельскохозяйственные культуры на любой стадии спелости или развития, а также любые ткани или органы (части растения), полученные от любого такого растения, если контекстом не подразумевается иное. Части растений включают, помимо прочего, стебли, корни, цветы, семяпочки, тычинки, листья, зародыши, меристематические участки, ткань каллюса, культуры с пыльником, гаметофиты, спорофиты, цветень, микроспоры, протопласты и т. д.
Растение настоящего изобретения включает по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту мут-РРО или сверхэкспрессированную нуклеиновую кислоту РРО дикого типа, и имеет повышенную устойчивость к гербицидам - производным бензоксазинона по сравнению с растением дикого типа. Растения настоящего изобретения могут иметь сложно структурированные РРО нуклеиновые кислоты дикого типа или мут-РРО из разных геномов, так как эти растения могут содержать более одного генома. Например, растение содержит два генома, которые обычно называют геномами А и В. Так как РРО является необходимым метаболическим ферментом, принято считать, что каждый геном содержит по меньшей мере один ген, кодирующий РРО фермент (т.е. по меньшей мере один ген РРО). В настоящем документе понятие "локус гена РРО" относится к позиции гена РРО в геноме, а понятие "ген РРО" и "нуклеиновая кислота РРО" относятся к нуклеиновой кислоте, кодирующей фермент РРО. Нуклеиновая кислота РРО в каждом геноме отличается своей нуклеотидной последовательностью от нуклеиновой кислоты РРО в другом геноме. Специалист может определить геном происхождения каждой нуклеиновой кислоты РРО с помощью генетического скрещивания и/или методов секвенирования или методов расщепления экзонуклеазы, хорошо известных специалистам.
Настоящее изобретение включает растения с одним, двумя, тремя или более мут-РРО аллелями, причем эти растения повысили устойчивость к гербициду на производному бензоксазинона по сравнению с растениями дикого типа. Эти мут-РРО аллели могут содержать нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей полинуклеотид, как определено в 8ЕО ГО N0: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 или 45, или его вариант или производное, полинуклеотид, кодирующий полипептид, как определено в 8Е0 ГО N0: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 или 46 или его вариант или производное, гомолог, ортолог, паралог, полинуклеотид, включающий по меньшей мере 60 последовательных нуклеотидов любого из вышеупомянутых полинуклеотидов; полинуклеотид, являющийся комплементарным к любому из вышеупомянутых полинуклеотидов.
"Аллели" или "аллельные варианты" являются альтернативными формами определенного гена, расположенные в одинаковой хромосомной позиции. Такие варианты включают Полиморфизмы единичного нуклеотида (ПЕН) и Полиморфизмы малого введения/удаления (ПВУ). Размер ПВУ обычно менее 100 п.о. ПЕН и ПВУ образуют самую большую группу вариантов последовательности в природных полиморфных цепочках большинства организмов.
Понятие "вид" относится к группе растений одной разновидности, определенной наличием общих характеристик или черт, которые специалисты считают достаточными для отделения одного сорта или разнообразия растений от другого. Ни одним понятием не подразумевается, что все растения какого либо сорта или разнообразия будут генетически идентичными по отношению к целому гену или молекулярному уровню, или что любое растение будет гомозиготным во всех локусах. Сорт или вид считаются чистой линией для определенной черты, если притом, что сорт или разнообразие чистой линии самооплодотворяется, все потомство содержит эту черту. Понятие "линия разведения" или "линия" относятся к группе растений одного вида, определенной наличием общих характеристик или черт, которые специалисты считают достаточными для отделения одной линии разведения или линии от другой. Ни под одним понятием не подразумевается, что все растения любой линии разведения или линии будут генетически идентичными по отношению к целому гену или молекулярному уровню, или что любое растение будет гомозиготным во всех локусах. Линия разведения или линия считаются чистой линией для определенной черты, если притом, что сорт или разнообразие чистой линии самооплодотворяется, все потомство содержит эту черту. В настоящем изобретении черта появляется в результате мутации в гене РРО рас- 31 029356
тения или семени.
Растения настоящего изобретения, стойкие к гербицидам, включающие полинуклеотиды, кодирующие полипептиды мут-РРО, также используются в способах повышения стойкости растений к гербицидам путем стандартного разведения растений, включая половое размножение. Эти способы включают скрещивание первого растения, которое является стойким к гербицидам растением изобретения, со вторым растением, которое может быть или может не быть стойким, как и первое растение, к тому же гербициду или гербицидам или может быть стойким к другому гербициду или гербицидам в отличие от первого растения. Вторым растением может быть любое растение, способное производить жизнеспособное потомство (т.е. семена) после скрещивания с первым растением. Чаще всего, но необязательно, первое и второе растения являются растениями одного вида. Эти способы при необходимости могут включать отбор растений-потомков, содержащих полипептиды мут-РРО первого растения и характеристики стойкости к гербицидам второго растения. Растения-потомки, полученные данным методом настоящего изобретения, повысили стойкость к гербицидам по сравнению с первым или вторым растением или обоими растениями. Если первое и второе растения являются стойкими к разным гербицидам, растенияпотомки будут иметь комбинированные характеристики устойчивости к гербицидам, свойственные первому и второму растениям. Методы изобретения могут включать одно или несколько поколений обратного скрещивания растений-потомков первого скрещивания с растением той же линии или генотипа, как у первого или второго растения. В качестве альтернативы, потомство первого скрещивания или любого последующего скрещивания может быть скрещено с третьим растением, которое имеет другую линию или генотип по сравнению с первым или вторым растением. Настоящее изобретение также предоставляет растения, органы растения, ткани растения, клетки растения, семена и нечеловеческие клетки хозяина, которые трансформированы по меньшей мере одной полинуклеотидной молекулой, кассетой экспрессии или трансформационным вектором изобретения. Такие трансформированные растения, органы растения, ткани растения, клетки растения, семена и нечеловеческие клетки хозяина повысили устойчивость или стойкость по меньшей мере к одному гербициду при уровнях гербицида, которые убивают или препятствуют росту нетрансформированного растения, ткани растения, клетки растения, семян или нечеловеческих клеток хозяина. Предпочтительно трансформированные растения, ткани растения, клетки растения и семена изобретения представляют собой ЛгаЫбор818 (НаПапа и сельскохозяйственные культуры.
Следует понимать, что растение настоящего изобретения может включать нуклеиновую кислоту РРО дикого типа в дополнение к нуклеиновой кислоте мут-РРО. Предполагается, что линии, устойчивые к гербициду - производному бензоксазинона, могут содержать мутацию только в одном из множественных РРО изоферментов. Таким образом, настоящее изобретение включает растение с одной или несколькими нуклеиновыми кислотами мут-РРО в дополнение к одной или нескольким нуклеиновым кислотам мут-РРО дикого типа.
В другом варианте осуществления, изобретение относится к семени, полученному из трансгенного растения с клеткой растения по настоящему изобретению, в котором семя прорастает благодаря повышению стойкости растения к гербициду - производному бензоксазинона по сравнению с семенем дикого типа.
В еще одном варианте осуществления изобретение относится к способу получения клетки трансгенного растения с повышенной стойкостью к гербициду - производному бензоксазинона по сравнению с клеткой растения дикого типа, включая трансформирование клетки растения кассетой экспрессии с мутРРО нуклеиновой кислотой.
В еще одном варианте осуществления изобретение относится к способу получения трансгенного растения, включающему: (а) трансформирование клетки растения кассетой экспрессии с мут-РРО нуклеиновой кислотой и (Ь) получение растения из клетки растения с повышенной стойкостью к гербициду производному бензоксазинона.
Следовательно, мут-РРО нуклеиновые кислоты изобретения представлены в кассетах экспрессии для экспрессии в целевом растении. Кассета будет включать регуляторные последовательности, функционально связанные с мут-РРО нуклеотидной последовательностью изобретения. Понятие "регуляторный элемент" в настоящем документе относится к полинуклеотиду, способному регулировать транскрипцию функционально связанного полинуклеотида. Он включает, помимо прочего, промоторы, усилители, интроны и 3" НТО. Под "функционально связан" подразумевается функциональная связь между промотором и второй последовательностью, причем последовательность промотора инициирует и способствует транскрипции последовательности ДНК, соответствующей второй последовательности. Обычно, "функционально связан" означает, что последовательности нуклеиновой кислоты, будучи связанными, являются смежными и, при необходимости, объединяют два участка кодирования белка, смежных и в рамке считывания. Кассета может также содержать по меньшей мере один дополнительный ген для котрансформации в организм. В альтернативном случае, дополнительный ген(ы) может быть представлен в сложно структурированных кассетах экспрессии.
Такая кассета экспрессии предусмотрена со множеством сайтов рестрикции для вставки последовательности мут-РРО нуклеиновой кислоты, которая будет подвержена транскрипционной регуляции регуляторных участков. Кассета экспрессии может также содержать селектируемый маркёр ген.
- 32 029356
Кассета экспрессии будет включать по направлению транскрипции от 5'- к З'-концу, область инициации трансляции или транскрипции (т.е. промотор), последовательность нуклеиновой кислоты мутРРО по настоящему изобретению и участок терминации транскрипции или трансляции (т.е. участок терминации), являющийся функциональным в растениях. Промотор может быть нативным или аналогическим, инородным или гетерологичным, по отношению к растению-хозяину и/или нуклеиновой кислоте мут-РРО изобретения. Также промотор может быть естественной последовательности или, альтернативно, синтетической последовательности. Когда промотор является "инородным" или "гетерологичным" по отношению к растению-хозяину, подразумевается, что промотор не найден в нативном растении, в которое его ввели. Когда промотор является "инородным" или "гетерологичным" по отношению к последовательности мут-РРО нуклеиновой кислоты в настоящем изобретении, подразумевается, что промотор не является нативным или природным промотором для функционально связанной последовательности мутРРО нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Согласно использованию в настоящем документе химерный ген содержит кодирующую последовательность, функционально связанную с участком инициации транскрипции, который является гетерологичным по отношению к кодирующей последовательности.
Так как предпочтительно экспрессировать нуклеиновые кислоты мут-РРО настоящего изобретения с помощью гетерологичных промоторов, можно использовать нативные промоторные последовательности. Такие конструкты изменят уровни экспрессии белка мут-РРО в растении или клетке растения. Таким образом, изменяется фенотип растения или его клетки.
Участок терминации может быть нативным с участком инициации транскрипции, нативным с функционально связанной целевой последовательностью мут-РРО, нативным с растением-хозяином или может быть получен из другого источника (т.е. может быть инородным или гетерологичным к промотору, целевой последовательности нуклеиновой кислоты мут-РРО, растению-хозяину или их комбинации). Подходящие участки терминации можно получить из Τί-плазмиды бактерий А. 1итеГас1еп5. такие как участки терминации октопин синтаза и нопалин синтаза. См. также Сиегтеаи е! а1. (1991) Мо1. Сеп. Сепе!. 262: 141-144; РгоибГоо! (1991) Се11 64:671-674; 8апГасоп е! а1. (1991) Сепек 1)е\. 5: 141-149; Модеп е! а1. (1990) Р1ап! Се11 2: 1261-1272; Мипгое е! а1. (1990) Сепе 91: 151-158; Ва11ак е! а1. (1989) Ыискю Ас1бк Кек. 17:7891-7903; и 1окЫ е! а1. (1987) Ыис1е1с Лаб Кек. 15:9627-9639. При необходимости ген или гены могут быть оптимизированы для повышенной экспрессии в трансформированном растении. Другими словами, гены можно синтезировать с помощью предпочтительно растительных кодонов для улучшения экспрессии. См., например, СатрЬе11 апб Со\уп (1990) Р1ап! РЬукю1. 92: 1-11 обсуждение использования предпочтительно базовых кодонов. Существуют методы для синтезирования предпочтительно растительных генов. См., например, патенты США № 5380831 и 5436391 и Миггау е! а1. (1989) Ыис1е1с АсШк Кек. 5380831, которые включены в настоящий документ посредством ссылки.
Известно, что дополнительные модификации последовательностей улучшают генную экспрессию в клетке-хозяине. Они включают удаление последовательностей, кодирующих ложные сигналы полиаденилирования, сигналы участка сплайсирования экзонов и интронов, повторения, подобные транспозонам, и другие так же четко характеризующиеся последовательности, которые могут быть разрушительными по отношению к генной экспрессии. Содержание С-С последовательности может быть скорректировано до уровней, средних для указанной клетки-хозяина, что рассчитывается с помощью известных генов, экспрессированных в клетке-хозяине. Если это возможно, последовательность модифицируют таким образом, чтобы в ней не было шпилечных вторичных мРНК структур. Нуклеотидные последовательности для улучшения генной экспрессии могут также использоваться в векторах экспрессии растения. Они включают интроны кукурузы АбЫ, интронные гены (СаШк е! а1. Сепек апб Иеуе1ортеп! 1: 1183-1200, 1987), и ведущие последовательности, (^-последовательность) из вируса табачной мозаики (ВТМ), вируса хлорозной пятнистости кукурузы (ВХПК) и вируса мозаики люцерны (СаШе е! а1., Иискю АсШ Кек. 15:8693-8711, 1987 и 5>ки/ек1б е! а1., Р1ап! Мо1. Вю1. 15:65-79, 1990). Первый интрон из "сморщенного"-1 локуса кукурузы демонстрирует повышение экспрессии генов в конструктах химерного гена. В патентах США № 5424412 и 5593874 описывается использование специфических интронов в конструктах генной экспрессии, и СаШе е! а1. (Р1ап! РЬукю1. 106:929-939, 1994) также доказывают, что интроны могут использоваться для регулирования генной экспрессии на тканеспецифической основе. Для дальнейшего улучшения или оптимизации мут-РРО генной экспрессии, векторы экспрессии растения настоящего изобретения могут также содержать последовательности ДНК с участками МАКк (участки прикрепления к матриксу). Растительные клетки, трансформированные такими модифицированными системами экспрессии, могут в дальнейшем проявить сверхэкспрессию или конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности изобретения.
Кассеты экспрессии могут также содержать 5'-концевые лидерные последовательности в конструкте кассеты экспрессии. Такие лидерные последовательности могут улучшать трансляцию. Трансляционные лидреные последовательности хорошо известны специалистам в данной области и включают: лидерные последовательности пикорнавируса, например, ЕМСУ лидерные последовательности (некодирующий участок 5'-конца энцефаломиокардита) (Е1гоу-8!еш е! а1. (1989) Ргос. №Ш. Асаб. 8сЬ И8А 86:6126-6130); лидерные последовательности потивируса, например, лидер вируса гравировки табака
- 33 029356
(ТБУ) (СаШе е1 а1. (1995) Сепе 165(2):233-238), лидерные последовательности вируса карликовой мозаики кукурузы (МЭМУ) (У1го1оду 154:9-20), и белок, связывающий тяжелую цепь иммуноглобулина (ΒίΡ) (Масе)ак е1 а1. (1991) №Циге 353:90-94); нетранслируемую лидреную последовательность из вирусного белка мРНК вируса мозаики люцерны (АМУ ΡΝΑ 4) (ЛоЬПпд е1 а1. (1987) №1иге 325:622-625); лидерную последовательность вируса табачной мозаики (ТМУ) (СаШе е1 а1. (1989) в Мо1еси1аг Вю1оду οί КNΑ, еб. СесН (Ь188, №\ν Υογ1<). стр. 237-256); и лидерную последовательность вируса хлорозной пятнистости кукурузы (МСМУ) (Έοιηιικ1 е1 а1. (1991) УнцШду 81:382-385). См. также, ОеПа-Сюрра е1 а1. (1987) Ρίπιΐ Ροδιοί 84:965-968. Также могут быть использованы другие методы, улучшающие трансляцию, например, интроны и т. д.
При подготовке кассеты экспрессии, различные фрагменты ДНК можно изменить таким образом, чтобы получить последовательности ДНК с необходимой ориентацией и, при необходимости, рамкой чтения. С этой целью, могут использоваться адаптеры или линкеры для соединения фрагментов ДНК или другие манипуляции для обеспечения подходящих участков рестрикции, удаления избыточных ДНК, удаление участков рестрикции и т.д. Для этих целей, можно использовать мутагенез ίη νίίΓο, восстановление праймеров, рестрикцию, отжиг, повторную замену, например, транзиции и трансверсии.
При практическом применении изобретения может использоваться несколько промоторов. Промоторы можно выбрать в зависимости от желаемого результата. Нуклеиновые кислоты могут комбинироваться с конститутивными, предпочтительно тканевыми или другими промоторами для экспрессии в растениях. Такие конститутивные промоторы включают, например, ядерный промотор промотора Ρδνπ7 и другие конститутивные промоторы, описанные в ΥΟ 99/43838 и патенте США № 6072050; ядерный СаМУ 35δ промотор ЮбеП е1 а1. (1985) №Циге 313:810-812); рисовый актин (МсБ1гоу е1 а1. (1990) Ρίπιΐ Се11 2: 163-171); убиквитин (ОиЩегъеп е1 а1. (1989) Ρίπιΐ Μο1. Βίο1. 12:619-632 и СЬ^^δίеηδеη е1 а1. (1992) ΡΕηΐ Мс1. Βίο1. 18:675-689); рБМИ (Ьгнй е1 а1. (1991) Τ^ογ. Арр1. Сепе1. 81:581-588); ΜΑδ (Уе11еп е1 а1. (1984) ΕΜΒΟ 1. 3:2723-2730); Αί·δ промотор (в патенте США № 5659026), и т.д. Другие конститутивные промоторы включают, например, описанные в патентах США № 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463; 5608142 и 6177611.
Для нацеливания в определенной ткани растения повышенной экспрессии мут-РРО можно использовать тканеспецифичные промоторы. Такие промоторы на уровне тканей включают, помимо прочего, промоторы на уровне листьев, корней, семян и стеблей. Промоторы на уровне тканей включают Υататοίο е1 а1. (1997) Ρ^ί 1. 12(2):255-265; Ка^ата1а е1 а1. (1997) ΡΕηί Се11 ГЬу8ю1. 38(7):792-803; Натаеп е1 а1. (1997) Μο1. Сеп Сепе1. 254(3):337-343; Киδδе11 е1 а1. (1997) Тгащдетс ^δ. 6(2): 157-168; КшеНаб е1 а1. (1996) ΡΕώ ГЬу8ю1. 112(3): 1331-1341; Уап Сатр е1 а1. (1996) Ρ^ί ГЬу8ю1. 112(2):525-535; Саηеνаδс^η^ е1 а1. (1996) Ρίπιΐ ГЬу8ю1. 112(2):513-524; Υататοίο е1 а1. (1994) Ρ^ί Се11 ГЬу8ю1. 35(5):773-778; Лам (Ьат) (1994) Се11 М1ёг. 20: 181-196; Ογο/γο е1 а1. (1993) ИаШ Мс1 Βΐο1. 23(6): 1129-1138; Матсуока (Μаίδиοка) е/[а1рНа]/. (1993) Ριο Νηΐ1. Αсаб. δΑ. υδΑ 90(20):9586-9590; и Сие\'ага-Сагаа е1 а1. (1993) ΡΡιπΙ 1. 4(3):495-505. Такие промоторы можно модифицировать таким образом, чтобы экспрессия была меньше. В одном из вариантов осуществления, целевые нуклеиновые кислоты направляют в хлоропласт для экспрессии. Таким образом, там, где целевая нуклеиновая кислота вставляется в хлоропласт не напрямую, кассета экспрессии будет также содержать последовательность, направленную на хлоропласт, которая кодирует хлоропластовый транзитный пептид, направляющий целевой генный продукт в хлоропласты. Такие транзитные пептиды хорошо известны специалистам. Относительно последовательностей, нацеленных на хлоропласт, "функционально связанный" означает, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая транзитный пептид (т.е. последовательность, нацеленная на хлоропласт), связана с мут-РРО нуклеиновой кислотой изобретения так, что две последовательности являются смежными и находятся в одной рамке считывания. См., например, Уοη Неупе е1 а1. (1991) Ρίπιΐ Μο1. Βίο1. Кер. 9: 104126; С1агк е1 а1. (1989) 1. Βίο1. СНет. 264:17544-17550; Пе11а-Сюрра е1 а1. (1987) ИаШ ГЬу8ю1. 84:965-968; Ροιικγ е1 а1. (1993) ΒюсЬет. Β^^δ. ^δ. Ссттиа 196:1414-1421; и δΐιηΐι е1 а1. (1986) δ^ι^ 233:478481. Так как мут-РРО белки по изобретению включают нативный хлоропластный транзитный пептид, любой известный хлоропластный транзитный пептид можно соединить с аминокислотной последовательностью зрелого мут-РРО белка по изобретению путем функционального связывания последовательности, нацеленной на хлоропласт, с 5'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей зрелый мут-РРО белок по изобретению. Последовательности, направленные на хлоропласт, хорошо известны специалистам и включают хлоропластный малый элемент рибулоза-1,5-бифосфат карбоксилазы (КиПвсю) (бе Саδί^ο δί1νη ΡίΠιο е1 а1. (1996) Ρίπιΐ Μο1. Βίο1. 30:769-780; δсЬηе11 е1 а1. (1991) 1. Βίο1. СНет. 266(5):3335-3342); 5-(энолпирувил)шикимат-3-фосфат синтазы (ΕΡδΡδ) (ΑγοΗογ е1 а1. (1990) 1. Β^^γ§. Βίοιικιηό. 22(6):789-810); триптофан синтазы (Ζ1ιηο е1 а1. (1995) 1. Βίο1. СНет. 270(11):6081-6087); пластоцианина (Ъа\\гепсе е1 а1. (1997) 1. Βίο1. СНет. 272(33):20357-20363); хоризмат синтазы АсШШб1 е1 а1. (1993) 1. Βίο1. СНет. 268(36):27447-27457); и флуоресцирующий белок, связывающий хлорофилл а/Ь φΗΒΡ) (Ьатрра е1 а1. (1988) 1. Βίο1. СНет. 263: 14996-14999). См. также Уοη Неупе е1 а1. (1991) ΡΕώ Мс1. Βίο1. Кер. 9: 104-126; С1агк е1 а1. (1989) 1. Βίο1. СНет. 264:17544-17550; Пе11а-Сюрра е1 а1. (1987) ΡΕώ Ροδιοί 84:965-968; Ροιικγ е1 а1. (1993) ΒюсЬет. БюрНуз. ^δ. Сетти. 196: 1414-1421; и δΠΛ е1 а1. (1986) δα^'ΐ^' 233:478-481.
- 34 029356
Методы трансформации хлоропластов хорошо известны специалистам. См., например, 8уаЬ с1 а1. (1990) Ргос. №б. Αοπά. 8сЬ υ8Α 87:8526-8530; 8уаЬ апб Майда (1993) Ргос. №11. Αсаб. 8α. υ8Α 90:913917; 8уаЬ апб Майда (1993) ЕМВО 1. 12:601-606. Метод основывается на внедрении с помощью генной пушки ДНК, содержащей селектируемый маркер, и нацеливании ДНК в пластидный геном путем гомологической рекомбинации. Также пластидную трансформацию можно осуществить с помощью трансактивации нефункционирующего трансгена, несущего пластиду, путем экспрессии на уровне ткани РНК полимеразы, закодированной в зародыше и направленной на пластиду. О такой системе сообщается в МсВпбе е1 а1. (1994) Ргос. Νίώ. Αοπ6. 8α. υ8Α 91:7301-7305.
Целевые нуклеиновые кислоты, которые необходимо направить к хлоропласту, можно оптимизировать для экспрессии в хлоропласте, чтобы оценить разницу при использовании кодона между зародышем растения и этой органеллой. Таким образом, целевые нуклеиновые кислоты можно синтезировать с помощью предпочтительно хлоропластных кодонов. См., например, в патенте США № 5380831, который включен в настоящий документ посредством ссылки.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, нуклеиновая кислота мут-РРО нуклеиновая кислота содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей: а) полинуклеотид, как показано в 81 У) ГО 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 или 45 или его вариант или производное; Ь) полинуклеотид, кодирующий полипептид, как показано в 81 У) ГО 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 или 46 или его вариант или производное; с) полинуклеотид, содержащий по меньшей мере 60 последовательных нуклеотидов а) или с); и б) полинуклеотид, являющийся комплементарным к полинуклеотиду по любому из пп. а) - с).
Предпочтительно кассета экспрессии далее включает регуляторный участок инициации транскрипции и регуляторный участок инициации трансляции, которые функционируют в растении.
Так как полинуклеотиды изобретения используются в качестве селектируемых маркерных генов для трансформации растений, кассеты экспрессии изобретения могут включать селектируемый маркерный ген для селекции трансформированных клеток. Селектируемые маркерные гены, включая гены настоящего изобретения, используются для селекции трансформированных клеток или тканей. Маркерные гены включают, помимо прочего, гены, кодирующие стойкость к антибиотикам, такие как гены, кодирующие неомицин фосфотрансферазу II (НЕО) и гидромицин фосфотрансферазу (ГФТ), а также гены, имеющие стойкость к гербицидным соединениям, таким как глюфосинат аммоний, бромоксинил, имидазолиноны и 2,4-дихлорофеноксиацетат (2,4-Д). См., в основном, Уаггайоп (1992) Сшт. Орш. Вю1есй. 3 :506-511; Сйг1к1орйегк оп е1 а1. (1992) Протоколы №б. Αсаб. 8сЬ υ8Α 89:6314-6318; Уао е1 а1. (1992) Се11 71:63-72; Ре/шкоГГ (1992) Мо1 М1сгоЫо1 6:2419-2422; Вагк1еу е1 а1. (1980) т Тйе Орегоп, стр. 177-220; Ни е1 а1. (1987) Се11 48:555-566; Вгочп е1 а1. (1987) Се11 49:603-612; Идде е1 а1. (1988) Се11 52:713-722; 1)еиксй1е е1 а1 (1989) Ргос. №б Αсаб. Α^· υ8Α 86:5400-5404; Риегк1 е1 а1. (1989) Ргос. №11 Αсаб. 8сЬ υ8Α 86:2549-2553; ЭенксЫе е1 а1. (1990) 8аепсе 248:480-483; Ооккеп (1993) РйГО. Тйек1к, υп^νе^κ^1у ой Не1бе1Ьегд; Кешек е1 а1. (1993) Ргос. №б Αсаб. 8сЬ υ8Α 90: 1917-1921; ЬаЬоте е1 а1. (1990) Мо1 Се11 Вю1 10:3343-3356; гатЬгеШ е1 а1. (1992) Ргос. №11 Αсаб. 8сЬ υ8Α 89:3952-3956; Вайп е1 а1. (1991) Ргос. №11 Αсаб. 8сЬ υ8Α 88:5072-5076; ^уЬогкк1 е1 а1. (1991) №с1ею Ααάκ Кек. 19:4647-4653; НШепапб-ХУйктап (1989) Торюк Мо1 81гис. Вю1 10: 143- 162; Эедепко1Ь е1 а1. (1991) Αп1^т^с^оЬ. Αдеп1к Сйето1йег. 35: 15911595; К1етксйтб1 е1 а1. (1988) ВюсйетУгу 27: 1094-1104; Вотп (1993) РйГО. Тйекй, υп^νе^к^1у ой Не1бе1Ьегд; Ооккеп е1 а1. (1992) Ргос. №б Αсаб. 8сЬ υ8Α 89:5547- 5551; Ойуа е1 а1. (1992) Αп1^т^с^оЬ. Αдеп1к Сйето1йег. 36:913-919; Н1аука е1 а1. (1985) НапбЬоок ой Ехрептеп1а1 Рйагтасо1оду, том 78 (8ргтдегУег1ад, Вегйп); ОШ е1 а1. (1988) №1иге 334:721-724. На данные источники в настоящем документе есть ссылки. Перечень выше перечисленных маркерных генов не является исчерпывающим. Любой селектируемый маркерный ген может использоваться в настоящем изобретении.
Изобретение также предоставляет изолированный вектор рекомбинантной экспрессии, включающий кассету экспрессии с мут-РРО нуклеиновой кислотой, как описано выше, причем экспрессия вектора в клетке-хозяине приводит к повышению устойчивости к гербициду - производному бензоксазинона по сравнению с клеткой-хозяином дикого типа. В данном контексте, понятие "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним из видов вектора является "плазмида", которая относится к сегментам двухцепочечной петли ДНК, которые можно лигировать в вирусный геном. Еще одним видом вектора является вирусный вектор, отличающийся тем, что дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они были внесены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальное происхождение репликации, и эписомные векторы, относящиеся к млекопитающим). Другие векторы (например, не эписомные векторы, относящиеся к млекопитающим) интегрируются в геном клетки-хозяина при внесении в клетку-хозяина и реплицируются вместе с геномом-хозяином. Более того, определенные векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы, в данном контексте, называются "экспрессиоиными векторами". Обычно, используемые экспрессионные векторы в методах, связанных с рекомбинантной ДНК, принимают форму плазмид. В настоящем описании изобретения, поня- 35 029356
тие "плазмида" и "вектор" являются взаимозаменяемыми, так как плазмида чаще всего используется в форме вектора. Тем не менее, изобретение включает и другие формы экспрессионных векторов, такие как вирусные векторы (например, ретровирус с дефективной репликацией, аденовирусы и вирусы, связанные с адено), выполняющих те же функции.
Рекомбинантные экспрессионные векторы изобретения включают нуклеиновую кислоту изобретения в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает, что рекомбинантные экспрессионные векторы включают одну или несколько регуляторных последовательностей, выбранных на основе клеток хозяина, которые должны использоваться в экспрессии, которая функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты для экспрессии. Регуляторные последовательности включают последовательности, которые направляют конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности во многих видах клеток хозяина и последовательности, которые направляют конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности только в определенных клетках хозяина или при определенных условиях. Специалисты в данной области обнаружат, что вид экспрессионного вектора может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого полипептида и т.д. Векторы экспрессии по изобретению могут быть введены в клетки-хозяева для производства таким способом полипептидов или пептидов, включая полипептиды или пептиды слияния, закодированных нуклеиновыми кислотами, согласно настоящему документу (например, мут-РРО полипептиды, полипептиды слияния и т.д.).
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения мут-РРО полипептиды экспрессируются в растениях и их клетках, таких как одноклеточные растительные клетки (например, водоросли) (см. РаЩаГОге е! а1., 1999, Магше В1о1есЬио1оду 1(3):239-251 и ссылки в указанном документе) и клетки из высших растений (например, сперматофитов, таких как сельскохозяйственные культуры). МутРРО полинуклеотид можно "ввести" в клетку растения любым из способов, включающих трансфекцию, трансформацию или трансдукцию, электропорацию, бомбардировку частицами, агроинфекцию, баллистическую трансфекцию и т.д.
Подходящие методы для трансформации или трансфекции клеток-хозяев, включая растительные клетки, можно найти в работах 8атЬгоок е! а1. (Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаГОгу Мапиа1. 2-е, изд., Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаГОгу, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаГОгу Ргекк, Со1б 8ргшд НагЬог, ΝΥ, 1989) и других лабораторных справочниках, таких как Методы в Молекулярной биологии, 1995, том 44, АдгоЬаДегшт протоколы, изд.: Сайаиб апб Иауеу, Нитапа Ргекк, ТоЮ^а, Νον 1егкеу. Так как повышенная устойчивость к гербицидам - производным бензоксазинона, является общей желаемой наследственной чертой для множества растений, таких как кукуруза, пшеница, рожь, овес, тритикале, рис, ячмень, соя, арахис, хлопок, семена рапса и канола, маниока, перец, подсолнечник и бархатцы, пасленовые растения, такие как картофель обыкновенный, табак, баклажан и томат, растения рода горошек, горох, люцерна, кустарниковые растения (кофейное дерево, какао настоящее, чай), ивовые виды, деревья (масличная пальма, кокосовое дерево), многолетние травы, и кормовые растения, эти сельскохозяйственные культуры также являются предпочтительными целевыми растениями для генной инженерии в качестве еще одного варианта осуществления настоящего изобретения. В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение является сельскохозяйственной культурой Кормовые культуры включают, помимо прочего, пырей, канареечник канарский, костер, пырейник, мятлик, ежу сборную, люцерну, 8а1Гош, лядвенец рогатый, клевер гибридный, клевер луговой и сладкий клевер.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, трансфекция мут-РРО полинуклеотида в растение осуществляется путем агробактериального переноса генов (переноса генов с помощью АдгоЬайегшт). Одним из методов трансформации, известным специалистам, является погружение цветущего растения в раствор АдгоЬаДепа, причем АдгоЬаДеба содержат мут-РРО нуклеиновую кислоту, а затем размножение трансформированных гамет. Трансформацию растения с помощью АдгоЬайегшт можно осуществить, используя, например, СУ3101(рМР90) (Копс/ апб 8сНе11, 1986, Мо1. Сеп.Сепе!. 204:383-396) или ЬВА4404 (С1оп1есН), штаммы АдгоЬасЮгшт ЩтеГаДепк. Трансформацию можно осуществить с помощью стандартных методов трансформации и регенерации (ИеЫаеге е! а1., 1994, Жс1. АДбк. Кек. 13:4777-4788; ОеМп, 81апЮп В. апб 8сббрегоой, КоЬей А, Р1ап1 Мо1еси1аг Вю1оду Мапиа1, 2пб Еб. - ЭогбгесШ : К1и\уег Асабетю РиЬ1., 1995. - ш 8еД., КтдЬис 2еШга1е 81цпа1иг: ВТ11-Р I8ВN 0-79232731-4; Ойск, Ветагб К. апб Тботркоп, 1оЬп Е., Мебюбк ш Р1аШ Мо1еси1аг Вю1оду апб В^есЬпоГОду, Воса КаГОп : СКС Ргекк, 1993 360 8., I8ВN 0-8493-5164-2). Например, семена рапса можно трансформировать с помощью трансформации котиледона или гипокотиля (Мо1опеу е! а1., 1989, Р1аШ Се11 Кероб 8:238-242; Эе В1оск е! а1., 1989, Р1аШ Рбукю1. 91:694-701). Использование антибиотиков для АдгоЬаДегшт и отбор растений зависит от бинарного вектора и штамма А^^аДеНит, использованного для трансформации. При отборе семян рапса обычно используют канамицин в качестве селектируемого растигельного маркера. Генный трансфер с помощью А^^аДеНит в лен можно осуществить с помощью, например, метода, описанного М1упагоуа е! а1., 1994, Р1аШ Се11 Кероб 13:282-285. Дополнительно, трансформацию сои можно осуществить с помощью, например, метода, описанного в Европейском патенте № 0424047, патенте США № 5322783, Европейском патенте № 0397687, патенте США № 5376543 или патенте США № 5169770. Трансформацию кукурузы можно осуществить с помощью бомбардировки час- 36 029356
тицами, поглощения ДНК посредством полиэтилен гликоля или метода, использующего карбиднокремниевое волокно. (См., например, РгееПпд αηά Аа1Ьо! "ТНе т;Н/е НаМЬоок" §ргш§ег Уег1ад: Νον Уогк (1993) ΣδΒΝ 3-540-97826-7.) Конкретный пример трансформации кукурузы приведен в патенте США № 5990387, а конкретный пример трансформации пшеницы - в международной заявке № АО 93/07256.
Согласно настоящему изобретению, введенный полинуклеотид мут-РРО может оставаться в клетке растения неизменным, если он включен в нехромосомный автономный репликон или интегрирован в растительные хромосомы. В качестве альтернативы, введенный полинуклеотид мут-РРО может присутствовать на внехромосомном нерепликационном векторе и может временно экспрессироваться или быть временно активным. В одном из вариантов осуществления изобретения, может быть создан гомологический рекомбинантный микроорганизм, в котором полинуклеотид мут-РРО интегрирован в хромосому, создается вектор, содержащий по меньшей мере часть гена РРО, в отношении которого были осуществлены делеция, добавление или замена для изменения, например, функционального нарушения, эндогенного гена РРО и создания мут-гена РРО. Для создания точечной мутации посредством гомологической рекомбинации гибриды ДНК-РНК могут использоваться в методе, известном как химерапластика (Со1е§1гаи88 е! а1., 1999, ШсШс ΑΟάδ КекеагсН 27(5): 1323-1330 αηά Кт1ес, 1999, Оепе Легару Атепсап §аепίίδί 87(3):240-247). Другие процедуры гомологической рекомбинации в виде ТпНсит (пшеница) также известны специалистам и рассматриваются в настоящем документе с точки зрения использования.
В гомологическом векторе рекомбинации ген мут-РРО может примыкать к 5' и 3'-концу дополнительной молекулой нуклеиновой кислоты гена РРО, что делает возможным гомологическую рекомбинацию между экзогенным геном мут-РРО, который несет вектор, и эндогенным геном РРО, в микроорганизме или растении. Дополнительная примыкающая молекула нуклеиновой кислоты РРО имеет достаточную длину для успешной гомологической рекомбинации с эндогенным геном. Как правило, от нескольких сотен пар оснований до 1000 гетероциклических оснований примыкающей ДНК (на 5'- и 3'концах) включены в вектор (см., например, ТНотак, К.К., ;·ιηά СарессЫ, М. К., 1987, Се11 51:503 для описания векторов гомологической рекомбинации или §1герр е! а1., 1998, ΡΝΑδ, 95(8):4368-4373 для рекомбинации на основе к ДНК в РНуксотНгеПа ра!еш!). Тем не менее, так как ген мут-РРО обычно отличается от гена РРО малым количеством нуклеиновых кислот, примыкающая последовательность не всегда является необходимой. Вектор гомологической рекомбинации вводится в микроорганизм или клетку растения (например, проникновение ДНК с использованием полиэтиленгликоля), и клетки, в которых введенный мут-РРО ген гомологически рекомбинирован с эндогенным геном РРО, отбирают с помощью известных методов.
В другом варианте осуществления изобретения, могут быть получены рекомбинантные микроорганизмы, которые содержать выбранные системы, позволяющие регулировать экспрессию введенного гена. Например, включение гена мут-РРО на векторе, с помещением его под контроль 1ас-оперона, делает возможным экспрессию гена мут-РРО только в присутствии изопропилтиогалактозида (ГРТО). Такие регулирующие системы хорошо известны специалистам.
Другой аспект изобретения относится к клеткам-хозяевам, в которые был введен вектор рекомбинантной экспрессии. Понятие "клетка-хозяин" и "рекомбинантная клетка-хозяин" в настоящем документе являются взаимозаменяемыми. Подразумевается, что эти понятие относятся не только к определенной клетке субъекта, но и к ее потомству или потенциальному потомству. Так как возможны определенные модификации в последующих поколениях вследствие мутации или влияния окружающей среды, такое потомство может, фактически, не быть идентичным материнской клетке, но оно все равно входит в понятие, используемое в настоящем документе. Клеткой-хозяином может являться любая прокариотическая или эукариотическая клетка. Например, полинуклеотид мут-РРО может быть экспрессирован в клетках бактерий, таких как С. д1Ыатюит, клетках насекомых, грибов, или клетках млекопитающих (таких как овариальные клетки китайского хомячка (ОКХ) или СО8 клетки), клетках водорослей, инфузорий, клетках растений, грибах или других микроорганизмах, подобных С. д1и1атюит). Другие подходящие клетки-хозяева известны специалистам в данной области.
Клетка-хозяин изобретения по изобретению, такая как прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин в культуре, может быть использована для получения (т.е. экспрессии) полипептида мутРРО. Соответственно, изобретение также предоставляет способы получения полипептидов мут-РРО с помощью клеток-хозяев по изобретению. В одном из случаев осуществления изобретения, метод включает культивирование клетки-хозяина по изобретению (в которую был введен вектор рекомбинантной экспрессии, кодирующий полипептид мут-РРО, или в геном которой был введен ген, кодирующий полипептид РРО дикого типа или полипептид мут-РРО) в подходящей среде, пока не будет получен полипептид мут-РРО. В еще одном варианте осуществления изобретения, способ также включает выделение полипептидов мут-РРО из среды или клетки-хозяина. Другой аспект изобретения относится к изолированным полипептидам мут-РРО и их биологически активным частям. "Изолированный" или "очищенный" полипептид или его биологически активная часть свободна от клеточного материала, когда получена методом, связанным с рекомбинантной ДНК, или химических предшественников или других химических веществ, когда химически синтезируется. Формулировка "в основном свободный от клеточного материала" включает приготовление композиции полипептида мут-РРО, в которой полипептид отделяют от не- 37 029356
которых клеточных компонентов клеток, в которых он получен естественным или рекомбинантным путем. В одном из вариантов осуществления изобретения формулировка "в основном свободный от клеточного материала" включает препараты полипептида мут-РРО с менее чем 30% (сухого веса) не мутРРО материала (также называемый в настоящем документе как "загрязняющий полипептид"), более предпочтительно менее чем 20% не мут-РРО материала, также более предпочтительно менее чем 10% не мут-РРО материала и наиболее предпочтительно менее чем 5% не мут-РРО материала.
Когда полипептид мут-РРО или его биологически активную часть получают с помощью рекомбинантного метода, он также является предпочтительно в основном свободным от культурной среды, т.е. она составляет приблизительно менее 20%, более предпочтительно приблизительно менее 10% и наиболее предпочтительно приблизительно менее 5% объема композиции полипептида. Формулировка "в основном свободный от химических предшественников или других химических веществ" включает приготовление композиции полипептида мут-РРО, в которой полипептид отделен от химических предшественников или других химических веществ, участвующих в синтезе полипептида. В одном из вариантов осуществления изобретения, формулировка "в основном свободный от химических предшественников или других химических веществ" включает препараты полипептида мут-РРО с менее чем 30% (сухого веса) химических предшественников или не мут-РРО химических веществ, более предпочтительно менее чем 20% химических предшественников или не мут-РРО химических веществ, также более предпочтительно менее чем 10% химических предшественников или не мут-РРО химических веществ и наиболее предпочтительно менее чем 5% химических предшественников или не мут-РРО химических веществ. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, изолированные полипептиды или их биологически активные части не имеют загрязняющих полипептидов из того же организма, из которого был получен полипептид мут-РРО. Обычно такие полипептиды получают рекомбинантной экспрессией, например, полипептида мут-РРО в растениях кроме, или в микроорганизмах, таких как С. д1и1аш1сит, инфузории, водоросли или грибы.
Как описано выше, настоящее изобретение предоставляет информацию о композициях и способах повышения устойчивости сельскохозяйственного растения или семени к производным бензоксазинона по сравнению с растением или семенем дикого типа. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, устойчивость сельскохозяйственного растения или семени к производным бензоксазинона повысилась так, что растение или семя может противостоять применению гербицида - производного бензоксазинона в количестве предпочтительно 1-1000 г активного вещества/га-1, более предпочтительно 201б0 г активного вещества/га-1 и наиболее предпочтительно 40-80 г активного вещества/га-1. При использовании по тексту настоящего документа, "противостоять" применению гербицида - производного бензоксазинона означает, что растение либо не уничтожается, либо не повреждается после такого применения.
Кроме того, настоящее изобретение предоставляет способы, которые включают использование по меньшей мере одного гербицида - производного бензоксазинона, как подробно описано выше.
В этих способах гербицид - производное бензоксазинона может применяться любым методом, известным специалистам, включая, помимо прочего, обработку семян, почвы и листьев. До применения гербицид - производное бензоксазинона можно преобразовать в стандартные препаративные формы, например, растворы, эмульсии, суспензии, пылевидные составы, порошки, пасты и гранулы. Выбор формы состава зависит от конкретной цели; в любом случае, она должна обеспечивать качественное и ровное распределение соединения в соответствии с изобретением.
Получив растения с повышенной устойчивостью к гербициду - производному бензоксазинона, можно использовать большое разнообразие соединений для защиты растений от сорняков, чтобы таким образом улучшить рост растений и уменьшить борьбу за питательные вещества. Гербицид - производное бензоксазинона может использоваться для контроля над сорняками до всхода, после всхода, до посева и во время выращивания сельскохозяйственных культур, описанных в настоящем документе, в районах их произрастания, или могут использоваться препараты, содержащие гербицид - производное бензоксазинона и другие добавки. Гербициды - производные бензоксазинона могут также использоваться для обработки семян. Добавки в гербицидных препаратах на основе производных бензоксазинона включают другие гербициды, детергенты, адъюванты, лиофилизирующие агенты, склеивающие агенты, стабилизирующие агенты и другие, подобные вещества. Препаративные формы гербицидов - производных бензоксазинона могут представлять собой влажные или сухие препараты и включать, помимо прочего, сыпучие порошки, концентраты эмульсии и жидкие концентраты. Гербицид производное бензоксазинона и гербицидные препараты можно применять в соответствии со стандартными методами, например, путем обрызгивания, орошения, опыления или другими подобными методами.
Подходящие соединения подробно описаны в РСТ/ЕР 2009/0б3387 и РСТ/ЕР 2009/0б338б, которые включены в настоящую заявку посредством ссылки.
Следует обратить внимание на то, что следующая информация относится к вариантам осуществления настоящего изобретения и многочисленные изменения могут быть внесены без отклонения от цели изобретения. Далее изобретение поясняется примерами, которые не должны подразумеваться как ограничивающие цель изобретения. В противном случае, следует понимать, что возможно прибегнуть к дру- 38 029356
гим различным вариантам осуществления изобретения, модификациям и их эквивалентам, которые после прочтения могут пожелать использовать специалисты без отклонения от общего смысла настоящего изобретения и/или цели прилагаемых формул.
Примеры
Пример 1. Сайт-направленный мутагенез РРО Атагайбик
Клонирование РРО Атагайбик
Кодирующие последовательности АтагаШбик (иЬегсикЦик изоформ РРО, подверженных воздействию гербицида и устойчивых к гербициду и мутантных комбинаций, (8ЕЦ ГО N0: 1, 3, 5, 7) были синтезированы и клонированы компанией СспсаП (Оепеаг! АО, Регенсбург, Германия).
Плазмиды выделяли из Е. соб Т0Р10 путем минивыделения плазмиды и подтверждали правильность структуры путем секвенирования ДНК.
Экспрессия и очистка рекомбинантных РРО дикого типа и мутантных РРО
(Взято из: Ргапск Е. Эауап. Рапка.) К. Эада. §1ербеп О. Энке. Куап М. бее, Рабгск I. Тгапе1, РоЬеП I. Эоегккеп. Вюсбетка1 апб к1гис1ига1 сопкедиепсек оЕ а д1усше бе1ебоп ίη 1бе а-8 бебх оГ рго!орогрбубподеп ох1баке. ВюсЫтка е! Вюрбуыса Айа 1804 (2010), 1548-56.)
Клоны в векторе рК§ЕТ были трансформированы в штамм ВЬ21(ПЕ3)-рЬук8 Е. соб. Клетки выращивали в 250 мл ЬВ с 100 мкг мл-1 карбенициллина, при встряхивании в течение ночи при температуре 37°С. Культуры разбавили в 1 л ЬВ с антибиотиком и выращивали при температуре 37°С при встряхивании в течение 2 ч, индуцировали 1 ммоль 1РТО и выращивали при температуре 25°С при встряхивании в течение еще 5 ч. Сбор клеток производился с помощью центрифугирования при 1600х§, их промыли 0,09% №С1, и выдерживали при температуре -80°С.
Лизис клеток осуществлялся с использованием френч-пресса при 140 МПа в 50 ммоль фосфата натрия рН 7.5, 1 моль №С1, 5 ммоль имидазола, 5% глицерина и 1 мкг-мл-1 лейпептина. После лизиса, добавили 0,5 ед. бензоназы (Иоуадеп, ЕМИ Сбетйак, 1пс., Гиббстаун, Нью-Джерси) и РМ8Р (конечная концентрация 1 ммоль). Клеточный дебрис удалили центрифугированием при 3000хд. Ηίκ-меченые белки РРО очистили на активированной никелем колонке Нбгар Сбе1абп§ НР (ОЕ Неаббсаге Вю-Заепсек Согр., Пискатауэй, Нью-Джерси), уравновешенной 20 ммоль фосфата натрия рН 8.0, 50 ммоль №С1, 5 ммоль имидазола, 5 ммоль М§С12, 0,1 ммоль ЕЭТА и 17% глицерина.
РО элюировали 250 ммоль имидазола. Активный белок обессолили на колонке РЭ-10 (ОЕ Неаббсаге Вю-Зшепсек Согр., Пискатауэй, Нью-Джерси), уравновешенной 20 ммоль натрий-фосфатного буфера, рН 7.5, 5 ммоль М§С12, 1 ммоль ЕЭТА и 17% глицерина. Из каждого литра культуры было получено приблизительно 10 мг чистой РРО, которую хранили при температуре -20°С до использования в анализах.
Анализ активности РРО
Ферментный анализ РРО (не рекомбинантный) Белок РРО (ЕС 1.3.3.4) экстрагировали из колеоптилей или ростков (150 г сырого веса) выращенной в темноте кукурузы, паслена черного, утреннего сияния и сеянцев канатника Теофраста в соответствии с описанием приведенным ранее (Огокктапп е( а1., 2010). Перед сбором сеянцы оставили для позеленения в течение 2 ч на свету для того, чтобы достичь наиболее высокого уровня специфической ферментативной активности в тилакоидных фракциях при низких концентрациях хлорофилла. При высоких концентрациях хлорофилла происходит значительное тушение флуоресценции, которое ограничивает количество зеленых тилакоидов, которые могут использоваться в тестировании. Растительные материалы гомогенизировали в холоде с помощью блендера Вгаип с использованием отношения свежего веса к объему 1:4. В состав буфера для гомогенизации входил трис(гидроксиметил)аминометан (трис)-НС1 (50 ммоль; рН 7.3), сахароза (0,5 моль), хлорид магния (1 мМ), этилендиаминтетрауксусная кислота (ЕИТА) (1 ммоль) и бычий сывороточный альбумин (2 г-л-1). После фильтрации через четыре слоя Мбас1о1б, были получены неочищенные пластидные препараты после центрифугирования при 10000хд в течение 5 мин и ресуспендирования в буфере для гомогенизации перед центрифугированием при 150хд в течение 2 мин для удаления неочищенного клеточного дебриса. Супернатант центрифугировали при 4000хд в течение 15 мин, осадочную фракцию ресуспендировали в 1 мл буфера, содержащего трис-НС1 (50 ммоль; рН 7.3), ЕЭТА (2 ммоль), лейпептин (2 мкмоль), пепстатин (2 мкмоль) и глицерин (200 мл-л-1), и хранили при температуре -80°С до использования. Содержание белка в ферментных экстрактах определяли, используя бычий сывороточный альбумин как стандарт. Активность РРО анализировалась способом флуориметрии путем мониторинга скорости формирования протопорфирина из химически восстановленного протопорфириногена IX при условиях начальной скорости. В состав смеси для анализа входил Трис-НС1 (100 ммоль; рН 7.3), ЕИТА (1 ммоль), дитиотреитол (5 ммоль), Т\уееп 80 (0,085%), протопорфириноген IX (2 мкмоль) и 40 мкг экстрагированого белка в общем общеме 200 мкл. Реакцию инициировали путем добавления субстрата протопорфириногена IX при температуре 22°С. Сафлуфенацил, флумиоксазин и бутафенацил приготовили в растворе диметилсульфоксида (ИМ80) (концентрация ИМ80 в смеси для анализа - 0,1 ммоль), затем добавили в смесь для анализа в концентрациях 0,005 пмоль - 5 мкмоль перед инкубированием. Мониторинг флуоресценции осуществлялся непосредственно из смеси для анализа с использованием Р0ЬАКк1аг 0рбта/Оа1аху
- 39 029356
(ВМС) при возбуждении на длине волны 405 нм и мониторингом излучения на длине волны 630 нм. Неферментативная активность в присутствии экстракта, инактивированного нагреванием, была пренебрежимо мала. Степень ингибирования ферментативной активности, индуцицированного гербицидом, выражалась в виде процентного отношения степени ингибирования по сравнению с необработанной контрольной группой. Молярные концентрации соединения, при которых активность фермента составляет 50% от исходной (значения 1С50), рассчитывали путем подставления значений в уравнение "доза - эффект" с использованием нелинейного регрессионного анализа.
Ферментный анализ РРО (рекомбинантный)
Использовали протопорфирин (Ριόϊό) приобретенный у 81§та-А14псЬ (МП\Ааикее,Ш1). Протопорфириноген (Ρι-оФдеп) приготовили в соответствии со способом, описанным в работах 1асоЬк ап4 1асоЬк (Ν.Ι. 1асоЬк, 1.М. 1асоЬк, Аккау Гог еи/утаОс рго!орогрЬуппо§еп ох14а!юп, а 1а!е к!ер ίη Ьете куп!Ьек1к, Еп/уте 28 (1982) 206-219). Анализы проводились в 100 ммоль фосфата натрия рН 7.4 с 0,1 ммоль ЕЭТА, 0,1% Тхуееп 20, 5 мкмоль РАО и 500 ммоль имидазола. Кривые доза-эффект при применении ингибиторов РРО, ацифлуорфена, лактофена, бензоксазинона 1.а.35, или предпочтительных производных бензоксазинона (где X означает О или 8, К4 означает водород, С1-С6-алкил, С1-С6-галогеналкил, С3-С6циклоалкил, С3-С6-алкенил, С3-С6-галоалкенил, С3-С6-алкинил, С3-С6-галоалкинил, С1-С6-алкокси или С3С6-циклоалкил-С1-С6-алкил, К5 означает водород, Ν^, С1-С6-алкил или С3-С6-алкинил, К6 означает водород или С1-С6-алкил, или их комбинацию), строят в присутствии 150 мкмоль Ρ^о!о§еη. Ширина спектра возбуждения и ширина спектра излучения были установлены на 1,5 и 30 нм соответственно. Все анализы производились в двух или трех параллельных испытаниях, измерения производились с использованием ΡО^АКк!а^ ОрЬта/Са1аху (ВМС) при возбуждении на длине волны 405 нм и мониторингом излучения на длине волны 630 нм.
Значения доза-эффект (1С50) для ферментов РРО с замещением выше, чем значение 1С50 для фермента РРО дикого типа (без замещения) РРО (табл. 4а и 4аЬ). Это указывает на то, что эти ферменты РРО с замещением обладают внутренней устойчивостью к бензоксазинону и к некоторым тестировавшимся производным бензоксазинона. Ферменты РРО с замещением 4С210 и К128Ь являются известными ферментами РРО с замещением, которые могут быть обнаружены в АтагапФик !иЬегси1а!ик, и которые ответственны за т р1ап!а устойчивость РРО к множеству гербицидов-ингибиторов РРО (Эауап е! а1., 2010, ВюсЫтюа е! ВюрЬуыса Ас1а, 1804:1548). Это указывает на то, что остальные приведенные в перечне ферменты РРО с замещением с большим значением 1С50, чем 4С210 или К128Ь, являются также ферментами РРО с замещением, которые ответственны за т р1ап!а устойчивость к множеству гербицидовингибиторов, включая бензоксазинон 1.а.35 (табл. 4а) и перечисленные производные бензоксазинона (табл. 4Ь). Все ферменты РРО с замещением демонстрируют сопоставимую ферментативную активность (измеряемую изменением количества единиц флуоресценции в минуту (ЕФ/мин)) по сравнению с ферментами РРО дикого типа (табл. 4а). Дополнительно, все значения активности для ферментов РРО с замещением являются более высокими, чем для фермента РРО с замещением 4С210. Фермент РРО 4С210 с замещением является в значительной степени активным для функционирования т р1ап!а. Это указывает на то, что все другие указанные ферменты РРО с замещением являются в значительной степени активными для функционирования т р1ап!а.
Таблица 4а. Значения 1С50 (М) для РРО ферментов дикого типа и с замещением аминокислот для ингибитора, бензоксазинона 1.а.35.
Замещение 1С50 (М), бензоксазинон Активность (ЕФ/мин.)
Дикий тип 1Д0Е-10 800
К.128А 1Д0Е-10 731
К128Р 7,73Е-10 750
ύΟ210 2Д2Е-09 80
Ρ397ϋ 2,72Е-10 250
Ρ397Ν 2Д5Е-10 165
Р420М 2,75Е-10 353
Ρ420Ι 4,95Е-10 179
Р420Р 9,93Е-10 203
Р420У 2,45Е-09 200
К.128А, Р420М 6,24Е-09 378
К.128А, Ρ420Ι Ρ98Ε-08 330
К.128А, Р420Р 2Д8Е-08 281
- 40 029356
Таблица 4Ь. Значения 1С50 (М) для РРО ферментов дикого типа и с замещением аминокислот для перечисленных производных бензоксазинона
Замеще ние 1Сбо (М) аналоги бензоксазинона Активность (ЕФ/мин.)
X означает О К4 означает водород; X означает о, К4 означает водород; К5 означает водород; К6 означает водород; X означает о, К5 означает водород; X означает о, К6 означает водород;
Дикий 2,20Е- 2,99Е- 2,04Е- 1,78Е- 1,78Е- 2,27Е- 2,27Е- 800
тип 10 10 08 09 09 08 08
К128Ь 3,82Е08 2,02Е07 3,57Е06 750
ύΟ210 3,ЗЗЕ08 1Д0Е07 1,64Е06 80
Ь397О 4,41Е07 4,41Е07 2,43Е06 2,43Е06 250
Ρ420Ι 6Д7Е07 6Д7Е07 1,00Е05 1,00Е05 179
К128А, Ρ420Ι 1,00Е05 1,00Е05 1,00Е05 1,00Е05 330
Пример 2. Скрининг мутагенизированных клеток водорослей для идентификации клонов с устойчивостью к гербицидам и каузативных мутаций в генах РРО.
Чтобы получить мутации, придающие стойкость к гербицидам - производным бензоксазинона в РРО генах, может использоваться химический или УФ-мутагенез. Для идентификации доминантных мутаций, стойких к гербицидам, особенно применимы одноклеточные организмы, такие как Сй1атуботопаз гетйагбШ или Зсепебезтиз оЬБцииз.
Клетки водоросли штаммов Сй1атуботопаз гетйагбШ СС-503 и СС-1691 (Университет Дьюка, Дарем, США) размножают в среде ТАФ (трисацетатфосфат) (Оогтап апб Беуте (1965) ΡΝΑ3 54: 16651669) путем постоянного встряхивания при 100 об/мин, 22°С и 30 ммоль Рйохт-2хз-2 световом облучении. Зсепебезтиз оЬБцииз (Университет Геттингена, Германия) размножают в среде водорослей, как описано в Водег апб Запбтапп, (1993): Тагде! аззауз £ог тобегп йегЬЮбез апб 15 ге1а!еб рйу1о!ох1е сотроипбз, Гешз РиЬНзйегз при тех же условиях культивации, как отмечено для Сй1атуботопаз. Скриннинг соединения осуществляют при 450 ммоль Рйохт-2хз-2 световом облучении.
Чувствительные штаммы Сй1атуботопаз гетйагбШ или Зсепебезтиз оЬНцииз мутируют при добавлении 0,14 моль этилметансульфоната (ЭМС) в течение 1 ч, как описано Ьоррез (1969, 20 Мо1 Оеп Оепе! 104: 172-177) Устойчивые штаммы идентифицируют с помощью скриннинга мутировавших клеток на чашках с твердым питательным раствором, содержащим целевые гербициды - производные бензоксазинона, при концентрациях, от низких до смертельных, в зависимости от активности воздействия соединения на определенный штамм водоросли.
Амплификация генов РРО из дикого типа и стойкой Сй1атуботопаз гетйагбШ из геномной ДНК или кДНК в качестве образца была получена стандартными техниками ПЦР с использованием ДНК олигонуклеотидов. Мутации идентифицируют путем сравнения последовательностей РРО дикого типа и мутировавших последовательностей РРО с помощью программы выравнивания последовательностей ЛНдп X (Уес1ог ΝΤΙ Абуапсе Зойшаге Уегзюп 10.3, 1пуИгодепе, Карлсбад, Калифорния, США).
На фиг. 2 показан отбор штаммов Сй1атуботопаз гетйагбйц стойких к гербициду - произволному бензоксазинона 1.а.35. (А) Мутировавшие клетки, высеянные на плотную среду без селективного агента. (В) Мутировавшие клетки, высеянные на плотную среду, содержащую 1х10-7 М производного бензоксазинона 1.а.35. Клетки, являющиеся устойчивыми к гербициду - производному бензоксазинона, образуют колонии (обведены в кружки, под номерами 33, 34, 35 и 36), в то время как восприимчивые к гербициду клетки прекращают расти. Более высокое количество колоний в чашке А по сравнению с В указывает на то, что колонии в чашке В являются устойчивыми к производному бензоксазинона 1.а.35.
На фиг. 3 показано возобновление роста выбранных штаммов Сй1атуботопаз гетйагбйц стойких к гербициду - произволному бензоксазинона 1.а.35. (А) Клетки дикого типа, высеянные на жидкую среду без селективного агента. (В) Клетки дикого типа в жидкой среде, содержащей повышенное количество производного бензоксазинона 1.а.35 (в диапазоне 1х10-9 - 5х10-6 моль). (С) Мутировавшие клетки, высеянные на жидкую среду без селективного агента. (Ό1, Ό2, Е1, Е2) Мутировавшие и выбранные штаммы в жидкой среде, содержащей повышенное количество производного бензоксазинона 1.а.35 (в диапазоне х10-9 - 5х10-6 моль). Штаммы, устойчивые к гербициду - производному бензоксазинона 1.а.35, развиваются и становятся более темного цвета, что указывает на их рост. Штаммы, подверженные воздействию гербицида, не развиваются и сохраняют светлый цвет. Более темный цвет обусловлен более высокой
- 41 029356
плотностью растущих клеток в жидкой среде. Культуры с более низкой плотностью имеют более светлый цвет или полностью прозрачны.
Пример 3. Скрининг мутагенизированной с помощью ЭМС популяции АгаЫборык ЫаПапа для идентификации растений, устойчивых к гербицидам, и идентификация каузативных мутаций в генах РРО
М2 популяция растений АгаЫборык ГОайапа, обработанных ЭМС, получена из ЬеЬ1е δеебк (РаундРок, Техас, США). Скрининг проводят путем помещения в чашу семян АгаЫборык в полуконцетрированный питательный раствор Мурасиге-Скуга, содержащий 0,5% желирующего агента Се1гбе® и от 0,1 до 500 мкмоль гербицида - производного бензоксазинона, в зависимости от активности соединения. Содержимое чаш инкубируют в камере для роста в условиях 16 ч на свету и 8 ч в темноте при 22°С сроком до трех недель. Устойчивые растения с менее интенсивными отбеливающими фенотипами сажают в почву и выращивают до спелости в тепличных условиях. На стадии появления розеток, у устойчивых к гербицидам - производным бензоксазинона растений собирают листовые диски для выделения геномной ДНК с помощью комплекта БЫеаку Ρ1;·ιπΙ Мш1 Κι! (Ц1адеп, Хильден, Германия) или общей мРНК с помощью КЫеаку Ρ1;·ιπΙ МШ Κι! (Циадеп, Хильден, Германия).
Последовательности РРО амплифицируют с использованием стандартных техник ПЦР из геномной ДНК с соответствующими олигонуклеотидами. Для амплификации РРО из мРНК, кДНК синтезируют ш νίΙΐΌ с помощью δире^кс^^р! III Кеуегке ТгапкспрЫке (ЫуЦгодепе, Карлсбад, Калифорния, США). После клонирования ПЦР продуктов с использованием стандартной плазмиды для секвенирования, ДНК последовательность мутировавших генов РРО идентифицируется с помощью стандартных техник секвенирования. Мутации идентифицируют путем сравнения последовательностей РРО дикого типа и мутировавших последовательностей РРО с помощью программы выравнивания последовательностей Айдп X (Уес!ог ΝΉ Абуапсе δοГι\νа^е Уегыоп 10.3, ЫуЦгодепе, Карлсбад, Калифорния, США).
Пример 4. Создание растений с устойчивостью к гербицидам - производным бензоксазинона с последовательностями РРО дикого типа или мутировавшими последовательностями РРО
Соя (С1усше тах), устойчивая к гербицидам - производным бензоксазинона, может быть получена способом, описанным О11оГ! е! а1. (патент США 2009/0049567). Мутировавшие последовательности РРО клонируют с использованием стандартных техник клонирования, как описано у δатЪ^οοк е! а1. (Мо1еси1аг с1отпд (2001) Со1б δίΓΓίΓ^ НагЪог ЬаЪога!огу Ριόκκ) в бинарный вектор, содержащий кассету маркерного гена устойчивости (ΑΗΑδ) и мутировавшую последовательность РРО (маркированную как СОЦ между убиквитиновым промотором (Ρχ-υΕι) и терминаторной последовательностью нопалин синтазы (NОδ). Для трансформации растения бинарные плазмиды интродуцируют в АдгоЪас!егшт ЫтеГааепк. Плазмидные конструкты интродуцируют в пазушные меристемные клетки сои в первичном узле ростковых эксплантатов с использованием агробактериальной трансформации (трансформация посредством АдгоЪас!егшт). После инокуляции и совместной культивации с АдгоЪас!епа эксплантаты переносят в среду интродукции ростков без селекции на одну неделю. Эксплантаты впоследствии переносят в среду для индукции ростков с 1-3 мкмоль имазапира (Агкепа1) на 3 недели для селекции трансформированных клеток. Эксплантаты со здоровыми каллюсными/ростковыми подушками в первичном узле затем переносят в среду для элонгации побегов, содержащую 1-3 мкмоль имазапира до тех пор, пока корни не удлиняться или эксплантат не погибнет. Трансгенные ростки укореняют, подвергают анализу ТацМап на присутствие трансгена, переносят в почву и выращивают в теплице до зрелости. Трансформация растений кукурузы осуществляется с помощью метода, описанного МсЕ1уег апб δίπ§1ι (АО 2008/124495). Векторные конструкты трансформации растения, содержащие мутировавшие последовательности РРО, интродуцируют в незрелые зародыши кукурузы с помощью трансформации посредством АдгоЪас!егшт.
Трансформированные клетки выбирают в среде селекции, в которую добавляют 0.5-1.5 мкмоль имазетапира, на 3-4 недели. Трансгенные ростки регенерируют в среде регенерации растений и впоследствии пускают корни.
Трансгенные ростки подвергают анализу ТацМап на присутствие трансгена до трансплантации в герметизирующую смесь и выращивают до спелости в теплице. АгаЫборык Ыайапа трансформируют последовательностями РРО способом "цветочного погружения", как описано МсЕ1уег апб δίπ§1ι (АО 2008/124495). Трансформацию Огу/а кайуа (риса) осуществляют путем трансформации протопластов, как описано в работах Ρеηд е! а1. (υδ 6653529) Т0 или Т1 трансгенное растение сои, кукурузы, риса и АгаЫборык ЫаПапа, содержащее мутировавшие последовательности РРО, тестируют на улучшение устойчивости к гербицидам на основе РРО в вегетационных испытаниях.
Пример 5. Анализ функциональной комплементации и скрининговое исследование
(см. также: Аббат Ь. Ρа!ζο1б!, Аагоп С. Надег, бое1 δ. МсСогтюк, апб Ρа!^^ск 1. Тгапе1. А собоп бе1е!юп сопГегк геык!апсе !о НегЫабек шЫЪЫпд ргоЮрогрЫпподеп ох1баке. ΡNΑδ 103 (33), 12329-34)
Создание библиотеки РРО
Генные библиотеки РРО создают с помощью случайного мутагенеза (ПЦР с внесением ошибок) или насыщающего мутагенеза гена РРО (Сепеаг! АС, Регенсбург, ФРГ) и клонируют в векторы экспрессии (рΒΑ^-ТОΡО) для скрининга ш У1уо. В дополнение, в вектор экспрессии рΒΑ^-ТОΡО (ЫуЫодеп) клонируют укороченные версии генов РРО дикого типа и мутантных генов РРО, так, что трансляция началась у второго стартового кодона АТС. РРО кДНК амплифицируют методом ПЦР с использованием
- 42 029356
- δ ΓΑΩΩΑ ΑΤΑ ΑΩΤΑ ΑΤΩΩΟΓΑ ΑΓΑΤΤΤΓΤΩΑΩ- 7 ~ прямого праймера ± ± λαλαι νινινιν^ΎΛΛ.^1 ΐ ινι л, который содержит как сайт
связывания рибосомы (АССА) и стартовый кодон АТС, так и обратный праймер 5-ОААОААТТАСОСООТСТТСТС АТС-3, содержащий стоп-кодон. Для трансформации мутантного штамма ЬетС Ε. сой используются восприимчивые и предположительно устойчивые плазмиды РРО, 8А8Х38, любезно предоставлены Наггу Эайеу (Университет штата Джорджия, Афины, Джорджия, США). Штамм 8А8Х38 Е. сой выдерживают в среде ЬВ с добавлением 20 мкг· мл-1 гематина. Трансформированные колонии 8А8Х38, и ^трансформированные контрольные группы, тестируют на способность роста в среде ЬВ по отдельности или с добавлением 20 мкг· мл-1 гематина или ингибитора РРО, лактофена и гербицидов - производных бензоксазинона при концентрациях в диапазоне 0,01-500 мкмоль и инкубируют при температуре 37°С в течение 14 ч.
При анализе комплементации и скрининговом исследовании использовался мутантный штамм ЬетС (РРО) ЕзсйепсЫа сой, 8А8Х38, (8азагтап, А., С’ЬаПгапЗ, Р., ^аνο^е, М., ТагсЫ'. □., Ргозсйек, К. & Ьарот!:е, С. (1979) I. Сеп. М1сгоЫо1. 113, 297-303) для оценки влияния мутаций РРО тЩайопз в отношении реакции РРО на гербицид. Рост штамма 8А8Х38 происходит крайне медленно, если на него не влияют с помощью экзогенного гема, или его не "спасают" с помощью альтернативного источника РРО. Кроме того, так как Е. сой дикого типа проявляют природную устойчивость к ингибиторам РРО, применение штамма 8А8Х38 позволило осуществить относительно прямой анализ чувствительности к гербициду РРО дикого типа и мутантных РРО из А шЬегсЫаШз. Штамм 8А8Х38 Е. сой трансформируют с использованием плазмидных конструктов, кодирующих РРО дикого типа и мутантную РРО. Конструкты способны помогать росту штамма 8А8Х38 Е. сой, что указывает на то, что гены РРО кодируют функциональные белки. Тем не менее, при добавлении в среду для роста гербицидов - производных бензоксазинона рост Е. сой, трансформированной с использованием РРО дикого типа, значительно замедлился, однако этого не произошло с Е. сой, трансформированной с использованием мутантных РРО.
Пример 6. Условия культуры ткани
Разработан анализ мутагенеза в культуре ткани т \'йго для выделения и определения характеристик ткани растения (например, ткани кукурузы или риса), обладающей устойчивостью к гербицидамингибиторам протопорфириноген оксидазы (например, к сафлуфенацилу, бифеноксу, диурону, лактофену,бутафенацилу). В этом анализе используется сомаклональный вариант, который находится в культуре ткани т \'йго. Спонтанные мутации, полученные из сомаклонального варианта, могут быть усилены с помощью химического мутагенеза и последующей селекции, поэтапно, или путем повышения концентраций гербицида.
Настоящее изобретение предоставляет условия культуры ткани для стимулирования роста мягкого эмбриогенного каллуса кукурузы или риса, имеющего способность регенерации. Каллюсы получают из 4 различных сортов кукурузы или риса, включая /еа тауз, сорта ,1арошса (Та1ре1 309, \|рропЬаге, КозЫЫкагг) и 1пФса (1пФса 1) соответственно. Семена подвергают поверхностной стерилизации в 70% растворе этанола в течение приблизительно 1 мин, а затем в течение 20 мин - в 20% коммерчески доступном отбеливающем растворе С1огох. Семена промывают стерилизованной водой и высеивают в среду для индукции каллюсов. Производилось тестирование различных сред для индукции каллюсов. Перечни ингредиентов тестировавшихся сред представлены в табл. 5.
- 43 029356
Таблица 5
Ингредиент Поставщик К001М К025М К026М К327М К008М М8711К
витамины В5 81§та 1.0 X
М3 соли 81§та 1.0 X 1.0 X 1.0 X 1.0 X
витамины М3 81§та 1.0 X 1.0 X
соли N6 РНуйДесН 4,0 г/л 4,0 г/л
витамины N6 Ь-пролин Казаминовые кислоты Казеиновый гидролизат Ь-Аспарагина моногидрат Никотиновая кислота Пиридоксин НС1 Тиамин НС1 Мио-инозитол МЕЗ Мальтоза Сорбит Сахароза РНуйДесН 81§та ВИ 81§та РНуйДесН 81§та 81§та Зхдгпа 81§та 81§та У\УВ ИисНеГа У\УВ 1.0 X 2,9 г/л 0,3 г/л 500 мг/л 30 г/л 1.0 X 0,5 г/л 0,3 г/л 500 мг/л 30 г/л 2 г/л 500 мг/л 30 г/л 30 г/л 500 мг/л 30 г/л 500 мг/л 10 г/л 1,2 г/л 1,0 г/л 150 мг/л 0,5 мг/л 0,5 мг/л 1,0 мг/л 100 мг/л 500 мг/л 30 г/л
ΝΑΑ ОисНеГа 50 мкг/л
2,4-ϋ 81§та 2,0 мг/л 1,0 мг/л
М§С12-6Н2О У\УВ 750 мг/л
—»рН 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,7
Гельрит (Ое1п1е) ОисНеГа 4,0 г/л 2,5 г/л
Агароза, тип 1 81§та 7,0 г/л 10 г/л 10 г/л
—►Автоклав 15 мин. 15 мин. 15 мин. 15 мин. 15 мин. 20 мин.
Кинетин 81§та 2,0 мг/л 2,0 мг/л
ΝΑΑ ОисНеГа 1,0 мг/л 1,0 мг/л
АВА 81§та 5,0 мг/л
Цефотаксим ОисНеГа 0,1 г/л 0,1 г/л 0,1 г/л
Ванкомицин ОисНеГа 0,1 г/л 0,1 г/л 0,1 г/л
Дисульфат 0418 81§та 20 мг/л 20 мг/л 20 мг/л
После тестирования нескольких вариантов выбрана Η()()1Μ среда для индукции каллюсов. Культуры выдерживают в темноте при температуре 30°С. Через 10-14 дней эмбриогенные каллюсы инокулируют в свежую среду.
Пример 7. Селекция каллюсов, устойчивых к гербициду
После того как условия культуры ткани определены, производится дальнейшее определение селекционных условий путем анализа выживаемости ткани в соответствии с кривыми поражения при использовании сафлуфенацила, бифенокса, диурона, лактофена, бутафенацила, ацифлуорфена, гербицидов производных бензоксазинона. Осуществляется тщательное изучение накопления гербицида в ткани, а также сохранения его эффекта и стойкости в клетках и культуральной среде. Путем этих опытов была определена сублетальная доза для предварительной селекции мутировавшего материала.
После определения начальной дозы сафлуфенацила, бифенокса, диурона, лактофена, бутафенацила, ацифлуорфена и гербицидов - производных бензоксазинона в селекционной среде, осуществляется поэтапная селекция тканей путем повышения концентрации ингибитора РРО с каждым переносом до тех пор, пока не будут получены клетки, активный рост которых происходит в присутствии токсичных доз. Полученные каллюсы затем инокулируют каждые 3-4 недели в К00Ш с селективным агентом. Селекции подвергаются свыше 26000 каллюсов с 4-5 пересевами до тех пор, пока селективное давление не превысит токсических уровней в соответствии с кривыми поражения и наблюдениями за продолжаемой культурой.
В качестве альтернативы, жидкие культуры инициировали из каллюсов в Μδ711Ι< при медленном встряхивании и при еженедельных пересевах. После того как жидкие культуры созданы, селекционный агент добавляют непосредственно в колбу при каждом пересеве. Через 2-4 цикла селекции жидких куль- 44 029356
тур, культуры переносят на фильтры на твердой К001М среде для дальнейшего роста.
Пример 8. Регенерация растений
Устойчивая ткань регенерирует, и ее характеризуют молекулярно для поиска мутаций генных последовательностей РРО и/или биохимически для поиска измененной активности РРО в присутствии селекционного агента. В дополнение, гены, участвующие прямо и/или косвенно в тетрапиррольном биосинтезе и/или в метаболических путях также подвергают секвенированию для характеризации мутаций. В заключение, ферменты, влияющие на основные процессы (такие, например, как метаболизм, транслокация, транспорт), также подвергают секвенированию для характеризации мутаций.
После гербицидной селекции, каллюсы регенерируют с использованием режима среды К025М в течение 10-14 дней, К026М в течение около 2 недель, К327М до тех пор, пока не разовьются хорошо сформированные побеги, и Ρ008δ до тех пор, пока побеги не укоренятся для переноса в теплицу. Регенерация производится на свету. При регенерации селекционный агент не используется.
После того, как образуются сильные корни, М0 регенераты переносят в теплицу в квадратных или круглых вегетационных сосудах. Пока пересаженные растения не адаптируются к условиям в теплице, их сохраняют под прозрачным пластиковым стаканом. В теплице устанавливают цикл дня и ночи при температуре 27°С/21°С (80°Р/70°Р) с натриевыми лампами высокого давления, мощностью 600 Вт, для освещения, чтобы поддерживать долготу дня 14 ч. Полив растений осуществляют по мере необходимости, в зависимости от погоды. Растения удобряют ежедневно.
Пример 9. Анализ последовательностей
Ткань листьев собирают из клонированных растений, разделяют для трансплантирования и анализируют по отдельности. Геномную ДНК экстрагируют с использованием набора \νίζ;·ΐΓύ® 96 Мадпейс ΌΝΑ Р1ап1 δу8ΐет (Рготеда, патенты США № 6027945 и 6368800) в соответствии с инструкциями производителя. Выделенную ДНК амплифицируют путем ПЦР с использованием соответствующего прямого и обратного праймера.
ПЦР амплификацию осуществляют с использованием НоГкГаг Тае.] ΌΝΑ РоКтегахе (ф1адеп) с использованием тачдаун программы для термоциклирования в следующем порядке: 96°С в течение 15 мин, после чего следует 35 циклов (96°С, 30 с; 58°С-0,2°С на один цикл, 30 с; 72°С, 3 мин и 30 с), в течение 10 мин при 72°С.
ПЦР продукты верифицируют в отношении концентрации и размера фрагментов путем электрофореза в агарозном геле. Дефосфорилированные ПЦР продукты анализируют прямым секвенированием с использованием ПЦР праймеров (ΌΝΑ Ьапйтагкк или ЕпГе1есйоп). Файлы хроматографии (.зсГ) анализируют на мутацию, относительно гена дикого типа с использованием УесГог ΝΉ Αйνаηсе 10™ Цпуйгодеп). На основании данных секвенирования в нескольких отдельных растениях идентифицируют мутации. Анализ последовательностей осуществляется с использованием репрезентативных хроматограмм и с использованием соответствующего программного обеспечения для выравнивания последовательностей ЛПдпХ с установками параметров по умолчанию, результаты корректируют для того, чтобы определить вторичные пики.
Пример 10. Демонстрация устойчивости к гербицидам
Выбранные мутанты и устойчивые растения переносят в маленькие вегетационные сосуды. Сорта дикого типа выращивают из семян для того, чтобы они служили в качестве контрольных групп.
По прошествии после переноса приблизительно трех недель, с помощью машины для разбрызгивания химикатов М0 регенераты опрыскивают сафлуфенацилом (ΒΑδ 800Η) или производным бензоксазинона ка.35 с добавлением 0,1% метилированного масла из семян. После того как растения адаптируются к условиям в теплице, субпопуляцию дополнительно опрыскивают сафлуфенацилом (ΒΑδ 800Η) или производным бензоксазинона ка.35. После опрыскивания растения выдерживают в условиях недостатка влаги в течение 24 ч, перед тем как их снова поливают и удобряют. Опрысканные растения фотографируют и оценивают степень поражения гербицидом через 1 и 2 недели после обработки.
Пример 11. Гербицидная селекция с использованием культуры ткани
Выбор используемой среды, а также построение кривых поражения осуществляют в соответствии с определением, приведенным выше. Для селекции используются различные техники. Применяется либо поэтапная селекция, либо сразу же применяется летальный уровень гербицида. В любом случае все каллюсы переносят для каждого нового цикла селекции. Селекция осуществляется в ходе 4-5 циклов культивирования, при этом каждый цикл длится 3-5 недель. Каллюсы помещают на нейлоновые мембраны для того, чтобы упростить перенос (листы с порами 200 мкм, Гю^елди Сако, Мэн). Мембраны вырезают таким образом, чтобы они соответствовали чашкам Петри 100x20 мм, и подвергают паровой стерилизации перед использованием с 25-35 каллюсами (средний вес/каллюс - 22 мг) на каждой чашке. В дополнение, один набор каллюсов подвергают селекции в жидкой культуральной среде с еженедельным пересевом, после чего следует дальнейшая селекция на полутвердой среде.
Селекция мутантных линий осуществляется с использованием сафлуфенацила (ΒΑδ 800Η) или производного бензоксазинона ка.35. Эффективность получения мутантов - высокая, на основании процентного отношения каллюсов, давших регенерируемую мутантную линию, или количества линий в со- 45 029356
ответствии с определением по грамму использованной ткани. В целом, частота мутаций выше в пять раз по сравнению с Ракра1ит уадша!ит и в два раз по сравнению с кукурузой.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> БАСФ СЕ
<120> РАСТЕНИЯ С ПОВЫШЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ГЕРБИЦИДАМ
<130> РЕ71580
<150> из 61/423604
<151> 2010-12-16
<150> ЕР 10195296.8
<151> 2010-12-16
<160> 46
<170> РаЬепЫп уегзЧоп 3.4
<210> 1
<211> 1605
<212> ДНК
<213> АтагапЬИиз ЬиЬегси1аЬиз
<400> 1
аЬддЬааЬЬс ааЬссаЬЬас ссассЬЬЬса ссааассЬЬд саЬЬдссаЬс дссаЬЬдЬса 60
дЬЬЬсаасса адаасЬассс адЬадсЬдЬа аЬдддсааса ЬЬЬсЬдадсд ддаадаассс 120
асЬЬсЬдсЬа ааадддЬЬдс ЬдЬЬдЬЬддЬ дсЬддадЬЬа дЬддасЬЬдс ЬдсЬдсаЬаЬ 180
аадсЬааааЬ сссаЬддЬЬЬ дадЬдЬдаса ЬЬдЬЬЬдаад сЬдаЬЬсЬад адсЬддаддс 240
ааасЬЬаааа сЬдЬЬааааа адаЬддЬЬЬЬ аЬЬЬдддаЬд адддддсааа ЬасЬаЬдаса 300
дааадЬдадд сададдЬсЬс дадЬЬЬдаЬс даЬдаЬсЬЬд ддсЬЬсдЬда даадсаасад 360
ЬЬдссааЬЬЬ сасааааЬаа аадаЬасаЬа дсЬададасд дЬсЬЬссЬдЬ дсЬасЬассЬ 420
ЬсаааЬсссд сЬдсасЬасЬ сасдадсааЬ аЬссЬЬЬсад сааааЬсааа дсЬдсаааЬЬ 480
аЬдЬЬддаас саЬЬЬсЬсЬд дадаааасас ааЬдсЬасЬд аасЬЬЬсЬда ЬдадсаЬдЬЬ 540
саддааадсд ЬЬддЬдааЬЬ ЬЬЬЬдадсда саЬЬЬЬддда аададЬЬЬдЬ ЬдаЬЬаЬдЬЬ 600
аЬсдасссЬЬ ЬЬдЬЬдсддд ЬасаЬдЬддЬ ддадаЬссЬс ааЬсдсЬЬЬс саЬдсассаЬ 660
асаЬЬЬссад аадЬаЬддаа ЬаЬЬдааааа аддЬЬЬддсЬ сЬдЬдЬЬЬдс ЬддасЬааЬЬ 720
сааЬсаасаЬ ЬдЬЬаЬсЬаа дааддаааад ддЬддадааа аЬдсЬЬсЬаЬ ЬаадаадссЬ 780
сдЬдЬасдЬд дЬЬсаЬЬЬЬс аЬЬЬсааддЬ ддааЬдсада сасЬЬдЬЬда сасааЬдЬдс 840
ааасадсЬЬд дЬдаадаЬда асЬсааасЬс садЬдЬдадд ЬдсЬдЬссЬЬ дЬсаЬаЬаас 900
садаадддда ЬссссЬсаЬЬ адддааЬЬдд ЬсадЬсЬсЬЬ сЬаЬдЬсааа ЬааЬассадЬ 960
даадаЬсааЬ сЬЬаЬдаЬдс ЬдЬддЬЬдЬс асЬдсЬссаа ЬЬсдсааЬдЬ сааадаааЬд 1020
аадаЬЬаЬда ааЬЬЬддааа ЬссаЬЬЬЬса сЬЬдасЬЬЬа ЬЬссададдЬ дасдЬасдЬа 1080
- 46 029356
ссссРРРссд РРаРдаРРас РдсаРРсааа ааддаРааад Рдаададасс РсРРдадддс 1140
РРсддадРРс РРаРссссРс Рааададсаа саРааРддас РдаадасРсР РддРасРРРа 1200
РРРРссРсса РдаРдРРРсс РдаРсдРдсР ссаРсРдаса РдРдРсРсРР РасРасаРРР 1260
дРсддаддаа дсадаааРад аааасРРдса аасдсРРсаа сддаРдааРР даадсаааРа 1320
дРРРсРРсРд ассРРсадса дсРдРРдддс асРдаддасд аассРРсаРР РдРсааРсаР 1380
сРсРРРРдда дсаасдсаРР сссаРРдРаР ддасасааРР асдаРРсРдР РРРдададсс 1440
аРадасаада Рддаааадда РсРРссРдда РРРРРРРаРд саддРаасса РаадддРдда 1500
сРРРсадРдд даааадсдаР ддссРссдда РдсааддсРд сддаасРРдР ааРаРссРаР 1560
сРддасРсРс аРаРаРасдР даадаРддаР дадаадассд сдРаа 1605
<210> 2
<211> 534
<212> РКТ
<213> АтагапРЬиз РиЬегси1аРит
<400> 2 Ьеи А1а Ьеи 15 Рго
МеР 1 Уа1 11е О1п Зег 5 11е ТЬг Н1з Ьеи Зег 10 Рго Азп
Зег Рго Ьеи Зег 20 Уа1 Зег ТЬг Ьуз Азп 25 Туг Рго Уа1 А1а Уа1 30 МеР О1у
Азп 11е Зег 35 О1и Агд О1и О1и Рго 40 ТЬг Зег А1а Ьуз Агд 45 Уа1 А1а Уа1
Уа1 О1у 50 А1а О1у Уа1 Зег О1у 55 Ьеи А1а А1а А1а Туг 60 Ьуз Ьеи Ьуз Зег
Ηΐ3 65 О1у Ьеи Зег Уа1 ТЬг 70 Ьеи РЬе О1и А1а Азр 75 Зег Агд А1а О1у О1у 80
Ьуз Ьеи Ьуз ТЬг Уа1 85 Ьуз Ьуз Азр О1у РЬе 90 11е Тгр Азр О1и О1у 95 А1а
А3п ТЬг МеР ТЬг 100 О1и Зег О1и А1а О1и 105 Уа1 Зег Зег Ьеи 11е 110 Азр Азр
Ьеи О1у Ьеи 115 Агд О1и Ьуз О1п О1п 120 Ьеи Рго 11е Зег О1п 125 Азп Ьуз Агд
Туг 11е 130 А1а Агд Азр О1у Ьеи 135 Рго Уа1 Ьеи Ьеи Рго 140 Зег Азп Рго А1а
А1а Ьеи Ьеи ТЬг Зег Азп 11е Ьеи Зег А1а Ьуз Зег Ьуз Ьеи О1п 11е
- 47 029356
145 150 155 160
МеЬ Ьеи О1и Рго РЬе 165 Ьеи Тгр Агд Ьуз Н1з 170 Азп А1а ТЬг О1и Ьеи 175 Зег
Азр О1и Н1з Уа1 О1п О1и Зег Уа1 О1у О1и РЬе РЬе О1и Агд Н1з РЬе
180 185 190
О1у Ьуз О1и РЬе Уа1 Азр Туг Уа1 11е Азр Рго РЬе Уа1 А1а О1у ТЬг
195 200 205
Суз О1у С1у Азр Рго О1п Зег Ьеи Зег МеЬ Н1з Н1з ТЬг РЬе Рго О1и
210 215 220
Уа1 Тгр Азп 11е О1и Ьуз Агд РЬе О1у Зег Уа1 РЬе А1а О1у Ьеи 11е
225 230 235 240
О1п Зег ТЬг Ьеи Ьеи Зег Ьуз Ьуз О1и Ьуз О1у О1у О1и Азп А1а Зег
245 250 255
11е Ьуз Ьуз Рго Агд Уа1 Агд О1у Зег РЬе Зег РЬе О1п О1у О1у МеЬ
260 265 270
О1п ТЬг Ьеи Уа1 Азр ТЬг МеЬ Суз Ьуз О1п Ьеи О1у О1и Азр О1и Ьеи
275 280 285
Ьуз Ьеи О1п Суз О1и Уа1 Ьеи Зег Ьеи Зег Туг Азп О1п Ьуз О1у 11е
290 295 300
Рго Зег Ьеи С1у Азп Тгр Зег Уа1 Зег Зег МеЬ Зег Азп Азп ТЬг Зег
305 310 315 320
О1и Азр О1п Зег Туг Азр А1а Уа1 Уа1 Уа1 ТЬг А1а Рго 11е Агд Азп
325 330 335
Уа1 Ьуз О1и МеЬ Ьуз 11е МеЬ Ьуз РЬе О1у Азп Рго РЬе Зег Ьеи Азр
340 345 350
РЬе 11е Рго О1и Уа1 ТЬг Туг Уа1 Рго Ьеи Зег Уа1 МеЬ 11е ТЬг А1а
355 360 365
РЬе Ьуз Ьуз Азр Ьуз Уа1 Ьуз Агд Рго Ьеи О1и О1у РЬе О1у Уа1 Ьеи
370 375 380
11е Рго Зег Ьуз О1и О1п Н1з Азп О1у Ьеи Ьуз ТЬг Ьеи О1у ТЬг Ьеи
385 390 395 400
- 48 029356
РЬе Зег Зег МеЬ МеЬ 405 РЬе Рго Азр Агд А1а 410 Рго Зег Азр МеЬ Суз 415 Ьеи
РЬе ТЬг ТЬг РЬе Уа1 О1у О1у Зег Агд Азп Агд Ьуз Ьеи А1а Азп А1а
420 425 430
Зег ТЬг Азр О1и Ьеи Ьуз О1п 11е Уа1 Зег Зег Азр Ьеи О1п О1п Ьеи
435 440 445
Ьеи О1у ТЬг О1и Азр О1и Рго Зег РЬе Уа1 Азп Н1з Ьеи РЬе Тгр Зег
450 455 460
Азп А1а РЬе Рго Ьеи Туг О1у Н1з Азп Туг Азр Зег Уа1 Ьеи Агд А1а
465 470 475 480
11е Азр Ьуз МеЬ О1и Ьуз Азр Ьеи Рго О1у РЬе РЬе Туг А1а О1у Азп
485 490 495
Ηΐ3 Ьуз О1у О1у Ьеи Зег Уа1 О1у Ьуз А1а МеЬ А1а Зег О1у Суз Ьуз
500 505 510
А1а А1а О1и Ьеи Уа1 11е Зег Туг Ьеи Азр Зег Н1з 11е Туг Уа1 Ьуз
515 520 525
МеЬ Азр О1и Ьуз ТЬг А1а
530
<210> 3
<211> 1605
<212> ДНК
<213> АшагапНиз ЬиЬегси1аЬиз
<400> 3
аЬддЬааЬЬс ааЬссаЬЬас ссассЬЬЬса ссааассЬЬд саЬЬдссаЬс дссаЬЬдЬса 60
дЬЬЬсаасса адаасЬассс адЬадсЬдЬа аЬдддсааса ЬЬЬсЬдадсд ддаадаассс 120
асЬЬсЬдсЬа ааадддЬЬдс ЬдЬЬдЬЬддЬ дсЬддадЬЬа дЬддасЬЬдс ЬдсЬдсаЬаЬ 180
аадсЬааааЬ сссаЬддЬЬЬ дадЬдЬдаса ЬЬдЬЬЬдаад сЬдаЬЬсЬад адсЬддаддс 240
ааасЬЬаааа сЬдЬЬааааа адаЬддЬЬЬЬ аЬЬЬдддаЬд адддддсааа ЬасЬаЬдаса 300
дааадЬдадд сададдЬсЬс дадЬЬЬдаЬс даЬдаЬсЬЬд ддсЬЬсдЬда даадсаасад 360
ЬЬдссааЬЬЬ сасааааЬаа аадаЬасаЬа дсЬададссд дЬсЬЬссЬдЬ дсЬасЬассЬ 420
ЬсаааЬсссд сЬдсасЬасЬ сасдадсааЬ аЬссЬЬЬсад сааааЬсааа дсЬдсаааЬЬ 480
аЬдЬЬддаас саЬЬЬсЬсЬд дадаааасас ааЬдсЬасЬд аасЬЬЬсЬда ЬдадсаЬдЬЬ 540
саддааадсд ЬЬддЬдааЬЬ ЬЬЬЬдадсда саЬЬЬЬддда аададЬЬЬдЬ ЬдаЬЬаЬдЬЬ 600
аЬЬдасссЬЬ ЬЬдЬЬдсддд ЬасаЬдЬддЬ ддадаЬссЬс ааЬсдсЬЬЬс саЬдсассаЬ 660
- 49 029356
асаЕЕЕссад аадЕаЕддаа ЕаЕЕдааааа аддЕЕЕддсЕ сЕдЕдЕЕЕдс сддасЕааЕЕ 720
сааЕсаасаЕ ЕдЕЕаЕсЕаа дааддаааад ддЕддадааа аЕдсЕЕсЕаЕ ЕаадаадссЕ 780
сдЕдЕасдЕд дЕЕсаЕЕЕЕс аЕЕЕсааддЕ ддааЕдсада сасЕЕдЕЕда сасааЕдЕдс 840
ааасадсЕЕд дЕдаадаЕда асЕсааасЕс садЕдЕдадд ЕдсЕдЕссЕЕ дЕсаЕаЕаас 900
садаадддда ЕссссЕсасЕ адддааЕЕдд ЕсадЕсЕсЕЕ сЕаЕдЕсааа ЕааЕассадЕ 960
даадаЕсааЕ сЕЕаЕдаЕдс ЕдЕддЕЕдЕс асЕдсЕссаа ЕЕсдсааЕдЕ сааадаааЕд 1020
аадаЕЕаЕда ааЕЕЕддааа ЕссаЕЕЕЕса сЕЕдасЕЕЕа ЕЕссададдЕ дасдЕасдЕа 1080
ссссЕЕЕссд ЕЕаЕдаЕЕас ЕдсаЕЕсааа ааддаЕааад Едаададасс ЕсЕЕдадддс 1140
ЕЕсддадЕЕс ЕЕаЕссссЕс Еааададсаа саЕааЕддас ЕдаадасЕсЕ ЕддЕасЕЕЕа 1200
ЕЕЕЕссЕсса ЕдаЕдЕЕЕсс ЕдаЕсдЕдсЕ ссаЕсЕдаса ЕдЕдЕсЕсЕЕ ЕасЕасаЕЕЕ 1260
дЕсддаддаа дсадаааЕад аааасЕЕдса аасдсЕЕсаа сддаЕдааЕЕ даадсаааЕа 1320
дЕЕЕсЕЕсЕд ассЕЕсадса дсЕдЕЕдддс асЕдаддасд аассЕЕсаЕЕ ЕдЕсааЕсаЕ 1380
сЕсЕЕЕЕдда дсаасдсаЕЕ сссаЕЕдЕаЕ ддасасааЕЕ асдаЕЕсЕдЕ ЕЕЕдададсс 1440
аЕадасаада Еддаааадда ЕсЕЕссЕдда ЕЕЕЕЕЕЕаЕд саддЕаасса ЕаадддЕдда 1500
сЕЕЕсадЕдд даааадсдаЕ ддссЕссдда ЕдсааддсЕд сддаасЕЕдЕ ааЕаЕссЕаЕ 1560
сЕддасЕсЕс аЕаЕаЕасдЕ даадаЕддаЕ дадаадассд сдЕаа 1605
<210> 4
<211> 534
<212> РКТ
<213> АтагапЕЬиз ЕиЬегси1аЕит
<400> 4
МеЕ 1 Уа1 11е О1п Зег 5 11е ТЬг Н1з Ьеи Зег 10 Рго Азп Ьеи А1а Ьеи 15 Рго
Зег Рго Ьеи Зег Уа1 Зег ТЬг Ьуз Азп Туг Рго Уа1 А1а Уа1 МеЕ О1у
20 25 30
Азп 11е Зег О1и Агд О1и О1и Рго ТЬг Зег А1а Ьуз Агд Уа1 А1а Уа1
35 40 45
Уа1 О1у А1а О1у Уа1 Зег О1у Ьеи А1а А1а А1а Туг Ьуз Ьеи Ьуз Зег
50 55 60
Ηΐ3 О1у Ьеи Зег Уа1 ТЬг Ьеи РЬе О1и А1а Азр Зег Агд А1а О1у О1у
65 70 75 80
Ьуз Ьеи Ьуз ТЬг Уа1 Ьуз Ьуз Азр О1у РЬе 11е Тгр Азр О1и О1у А1а
85 90 95
- 50 029356
Азп ТЬг МеЬ ТЬг О1и 100 Зег О1и А1а О1и 105 Уа1 Зег Зег Ьеи 11е 110 Азр Азр
Ьеи О1у Ьеи Агд О1и Ьуз О1п О1п Ьеи Рго 11е Зег О1п Азп Ьуз Агд
115 120 125
Туг 11е А1а Агд А1а О1у Ьеи Рго Уа1 Ьеи Ьеи Рго Зег Азп Рго А1а
130 135 140
А1а Ьеи Ьеи ТЬг Зег Азп 11е Ьеи Зег А1а Ьуз Зег Ьуз Ьеи О1п 11е
145 150 155 160
МеЬ Ьеи О1и Рго РЬе Ьеи Тгр Агд Ьуз Н1з Азп А1а ТЬг О1и Ьеи Зег
165 170 175
Азр О1и Н1з Уа1 О1п О1и Зег Уа1 О1у О1и РЬе РЬе О1и Агд Н1з РЬе
180 185 190
О1у Ьуз О1и РЬе Уа1 Азр Туг Уа1 11е Азр Рго РЬе Уа1 А1а О1у ТЬг
195 200 205
Суз О1у О1у Азр Рго О1п Зег Ьеи Зег МеЬ Н1з Н1з ТЬг РЬе Рго О1и
210 215 220
ναι Тгр Азп 11е О1и Ьуз Агд РЬе О1у Зег Уа1 РЬе А1а О1у Ьеи 11е
225 230 235 240
О1п Зег ТЬг Ьеи Ьеи Зег Ьуз Ьуз О1и Ьуз О1у О1у О1и Азп А1а Зег
245 250 255
11е Ьуз Ьуз Рго Агд Уа1 Агд О1у Зег РЬе Зег РЬе О1п О1у О1у МеЬ
260 265 270
О1п ТЬг Ьеи Уа1 Азр ТЬг МеЬ Суз Ьуз О1п Ьеи О1у О1и Азр О1и Ьеи
275 280 285
Ьуз Ьеи О1п Суз О1и Уа1 Ьеи Зег Ьеи Зег Туг Азп О1п Ьуз О1у 11е
290 295 300
Рго Зег Ьеи О1у Азп Тгр Зег Уа1 Зег Зег МеЬ Зег Азп Азп ТЬг Зег
305 310 315 320
О1и Азр О1п Зег Туг Азр А1а Уа1 Уа1 Уа1 ТЬг А1а Рго 11е Агд Азп
325 330 335
Уа1 Ьуз О1и МеЬ Ьуз 11е МеЬ Ьуз РЬе О1у Азп Рго РЬе Зег Ьеи Азр
- 51 029356
340 345 350
РЬе 11е Рго О1и Уа1 ТЬг Туг Уа1 Рго Ьеи Бег Уа1 МеО 11е ТЬг А1а
355 360 365
РЬе Ьуз Ьуз Азр Ьуз Уа1 Ьуз Агд Рго Ьеи О1и О1у РЬе О1у Уа1 Ьеи
370 375 380
11е Рго Бег Ьуз О1и С1п Н1з Азп О1у Ьеи Ьуз ТЬг Ьеи О1у ТЬг Ьеи
385 390 395 400
РЬе Бег Бег МеО МеО РЬе Рго Азр Агд А1а Рго Бег Азр МеО Суз Ьеи
405 410 415
РЬе ТЬг ТЬг РЬе Уа1 О1у О1у Бег Агд Азп Агд Ьуз Ьеи А1а Азп А1а
420 425 430
Бег ТЬг Азр О1и Ьеи Ьуз О1п 11е Уа1 Бег Бег Азр Ьеи О1п О1п Ьеи
435 440 445
Ьеи О1у ТЬг О1и Азр О1и Рго Бег РЬе Уа1 Азп Н1з Ьеи РЬе Тгр Бег
450 455 460
Азп А1а РЬе Рго Ьеи Туг О1у Н1з Азп Туг Азр Бег Уа1 Ьеи Агд А1а
465 470 475 480
11е Азр Ьуз МеО О1и Ьуз Азр Ьеи Рго О1у РЬе РЬе Туг А1а О1у Азп
485 490 495
Ηΐ3 Ьуз О1у О1у Ьеи Бег Уа1 О1у Ьуз А1а МеО А1а Бег О1у Суз Ьуз
500 505 510
А1а А1а О1и Ьеи Уа1 11е Бег Туг Ьеи Азр Бег Нтз 11е Туг Уа1 Ьуз
515 520 525
МеО Азр О1и Ьуз ТЬг А1а
530
<210> 5
<211> 1602
<212> ДНК
<213> АтагапОЬиз ОиЬегси1аОиз
<400> 5
аОддОааООс ааОссаООас ссассОООса ссааассООд саООдссаОс дссаООдОса 60
дОООссасса адаасОассс адОадсОдОа аОдддсааса ОООсОдадсд адаадаассс 120
асООсОдсОа ааадддООдс ОдООдООддО дсОддадООа дОддасООдс ОдсОдсаОаО 180
- 52 029356
аадсЕааааЕ сссаЕддЕЕЕ дадЕдЕдаса ЕЕдЕЕЕдаад сЕдаЕЕсЕад адсЕддаддс 240
ааасЕЕаааа сЕдЕЕааааа адаЕддЕЕЕЕ аЕЕЕдддаЕд адддддсааа ЕасЕаЕдаса 300
дааадЕдадд сададдЕсЕс дадЕЕЕдаЕс даЕдаЕсЕЕд ддсЕЕсдЕда даадсаасад 360
ИдссааГГГ сасааааЕаа аадаЕасаЕа дсЕададасд дЕсЕЕссЕдЕ дсЕасЕассЕ 420
ЕсаааЕсссд сЕдсасЕасЕ сасдадсааЕ аЕссЕЕЕсад сааааЕсааа дсЕдсаааЕЕ 480
аЕдЕЕддаас саЕЕЕсЕсЕд дадаааасас ааЕдсЕасЕд аасЕЕЕсЕда ЕдадсаЕдЕЕ 540
саддааадсд ЕЕддЕдааЕЕ ЕЕЕЕдадсда саЕЕЕЕддда аададЕЕЕдЕ ЕдаЕЕаЕдЕЕ 600
аГГдасссГГ ЕЕдЕЕдсддд ЕасаЕдЕдда даЕссЕсааЕ сдсЕЕЕссаЕ дсассаЕаса 660
Шссадаад ЕаЕддааЕаЕ Едаааааадд ЕЕЕддсЕсЕд ЕдЕЕЕдсЕдд асЕааЕЕсаа 720
ЕсаасаЕЕдЕ ЕаЕсЕаадаа ддаааадддЕ ддадааааЕд сЕЕсЕаЕЕаа даадссЕсдЕ 780
дЕасдЕддЕЕ саЕЕЕЕсаЕЕ ЕсааддЕдда аЕдсадасас ЕЕдЕЕдасас ааЕдЕдсааа 840
садсЕЕддЕд аадаЕдаасЕ сааасЕссад ЕдЕдаддЕдс ЕдЕссЕЕдЕс аЕаЕаассад 900
ааддддаЕсс ссЕсаЕЕадд дааЕЕддЕса дЕсЕсЕЕсЕа ЕдЕсаааЕаа ЕассадЕдаа 960
даЕсааЕсЕЕ аЕдаЕдсЕдЕ ддЕЕдЕсасЕ дсЕссааЕЕс дсааЕдЕсаа адаааЕдаад 1020
аЕЕаЕдаааЕ ЕЕддаааЕсс аЕЕЕЕсасЕЕ дасЕЕЕаЕЕс сададдЕдас дЕасдЕассс 1080
сЕЕЕссдЕЕа ЕдаЕЕасЕдс аЕЕсааааад даЕааадЕда ададассЕсЕ ЕдадддсЕЕс 1140
ддадЕЕсЕЕа ЕссссЕсЕаа ададсаасаЕ ааЕддасЕда адасЕсЕЕдд ЕасЕЕЕаЕЕЕ 1200
ЕссЕссаЕда ЕдЕЕЕссЕда ЕсдЕдсЕсса ЕсЕдасаЕдЕ дЕсЕсЕЕЕас ЕасаЕЕЕдЕс 1260
ддаддаадса даааЕадааа асЕЕдсааас дсЕЕсаасдд аЕдааЕЕдаа дсаааЕадЕЕ 1320
ЕсЕЕсЕдасс ЕЕсадсадсЕ дЕЕдддсасЕ даддасдаас сЕЕсаЕЕЕдЕ сааЕсаЕсЕс 1380
ЕЕЕЕддадса асдсаЕЕссс аЕЕдЕаЕдда сасааЕЕасд аЕЕдЕдЕЕЕЕ дададссаЕа 1440
дасаадаЕдд ааааддаЕсЕ ЕссЕддаЕЕЕ ЕЕЕЕаЕдсад дЕаассаЕаа дддЕддасЕЕ 1500
ЕсадЕдддаа аадсдаЕддс сЕссддаЕдс ааддсЕдсдд аасЕЕдЕааЕ аЕссЕаЕсЕд 1560
дасЕсЕсаЕа ЕаЕасдЕдаа даЕддаЕдад аадассдсдЕ аа 1602
<210> 6
<211> 533
<212> РКТ
<213> АшагапГЬиз ЕиЪегси1аЕит
<400> 6
МеЕ 1 Уа1 11е О1п Зег 5 11е ТЬг Ηΐ3 Ьеи Зег 10 Рго Азп Ьеи А1а Ьеи 15 Рго
Зег Рго Ьеи Зег Уа1 Зег ТЬг Ьуз Азп Туг Рго Уа1 А1а Уа1 МеЕ О1у
20 25 30
- 53 029356
Азп 11е Зег 35 О1и Агд О1и О1и Рго 40 ТЬг Зег А1а Ьуз Агд 45 Уа1 А1а Уа1
ναι О1у А1а С1у Уа1 Зег О1у Ьеи А1а А1а А1а Туг Ьуз Ьеи Ьуз Зег
50 55 60
Ηΐ3 О1у Ьеи Зег Уа1 ТЬг Ьеи РЬе О1и А1а Азр Зег Агд А1а О1у О1у
65 70 75 80
Ьуз Ьеи Ьуз ТЬг Уа1 Ьуз Ьуз Азр О1у РЬе 11е Тгр Азр О1и О1у А1а
85 90 95
Азп ТЬг МеЬ ТЬг О1и Зег О1и А1а О1и Уа1 Зег Зег Ьеи 11е Азр Азр
100 105 110
Ьеи О1у Ьеи Агд О1и Ьуз О1п О1п Ьеи Рго 11е Зег О1п Азп Ьуз Агд
115 120 125
Туг 11е А1а Агд Азр С1у Ьеи Рго Уа1 Ьеи Ьеи Рго Зег Азп Рго А1а
130 135 140
А1а Ьеи Ьеи ТЬг Зег Азп 11е Ьеи Зег А1а Ьуз Зег Ьуз Ьеи О1п 11е
145 150 155 160
МеЬ Ьеи О1и Рго РЬе Ьеи Тгр Агд Ьуз Н1з Азп А1а ТЬг О1и Ьеи Зег
165 170 175
Азр О1и Н1з Уа1 О1п О1и Зег Уа1 О1у О1и РЬе РЬе О1и Агд Н1з РЬе
180 185 190
О1у Ьуз О1и РЬе Уа1 Азр Туг Уа1 11е Азр Рго РЬе Уа1 А1а О1у ТЬг
195 200 205
Суз О1у Азр Рго О1п Зег Ьеи Зег МеЬ Н1з Н1з ТЬг РЬе Рго О1и Уа1
210 215 220
Тгр Азп 11е О1и Ьуз Агд РЬе О1у Зег Уа1 РЬе А1а О1у Ьеи 11е О1п
225 230 235 240
Зег ТЬг Ьеи Ьеи Зег Ьуз Ьуз О1и Ьуз О1у О1у О1и Азп А1а Зег 11е
245 250 255
Ьуз Ьуз Рго Агд Уа1 Агд О1у Зег РЬе Зег РЬе О1п О1у О1у МеЬ О1п
260 265 270
ТЬг Ьеи Уа1 Азр ТЬг МеЬ Суз Ьуз О1п Ьеи О1у О1и Азр О1и Ьеи Ьуз
275 280 285
- 54 029356
Ьеи Ο1η 290 Суз О1и Уа1 Ьеи Зег 295 Ьеи Зег Туг Азп Ο1η 300 Ьуз О1у 11е Рго
Зег Ьеи О1у Азп Тгр Зег Уа1 Зег Зег МеЬ Зег Азп Азп ТЬг Зег О1и
305 310 315 320
Азр Ο1η Зег Туг Азр А1а Уа1 Уа1 Уа1 ТЬг А1а Рго 11е Агд Азп Уа1
325 330 335
Ьуз О1и МеЬ Ьуз 11е МеЬ Ьуз РЬе О1у Азп Рго РЬе Зег Ьеи Азр РЬе
340 345 350
11е Рго О1и Уа1 ТЬг Туг Уа1 Рго Ьеи Зег Уа1 МеЬ 11е ТЬг А1а РЬе
355 360 365
Ьуз Ьуз Азр Ьуз Уа1 Ьуз Агд Рго Ьеи О1и О1у РЬе О1у Уа1 Ьеи 11е
370 375 380
Рго Зег Ьуз О1и Ο1η Н1з Азп О1у Ьеи Ьуз ТЬг Ьеи О1у ТЬг Ьеи РЬе
385 390 395 400
Зег Зег МеЬ МеЬ РЬе Рго Азр Агд А1а Рго Зег Азр МеЬ Суз Ьеи РЬе
405 410 415
ТЬг ТЬг РЬе Уа1 О1у О1у Зег Агд Азп Агд Ьуз Ьеи А1а Азп А1а Зег
420 425 430
ТЬг Азр О1и Ьеи Ьуз Ο1η 11е Уа1 Зег Зег Азр Ьеи Ο1η Ο1η Ьеи Ьеи
435 440 445
О1у ТЬг О1и Азр О1и Рго Зег РЬе Уа1 Азп Н1з Ьеи РЬе Тгр Зег Азп
450 455 460
А1а РЬе Рго Ьеи Туг О1у Н1з Азп Туг Азр Суз Уа1 Ьеи Агд А1а 11е
465 470 475 480
Азр Ьуз МеЬ О1и Ьуз Азр Ьеи Рго О1у РЬе РЬе Туг А1а О1у Азп Н1з
485 490 495
Ьуз О1у О1у Ьеи Зег Уа1 О1у Ьуз А1а МеЬ А1а Зег О1у Суз Ьуз А1а
500 505 510
А1а О1и Ьеи Уа1 11е Зег Туг Ьеи Азр Зег Н1з 11е Туг Уа1 Ьуз МеЬ
515 520 525
Азр О1и Ьуз ТЬг А1а
- 55 029356
530
<210> 7 <211> 1602 <212> ДНК <213> АтагапЕЬиз ЕиЬегси1аЕиз
<400> 7
аЕддЕааЕЕс ааЕссаЕЕас ссассЕЕЕса ссааассЕЕд саЕЕдссаЕс дссаЕЕдЕса 60
дЕЕЕссасса адаасЕассс адЕадсЕдЕа аЕдддсааса ЕЕЕсЕдадсд ддаадаассс 120
асЕЕсЕдсЕа ааадддЕЕдс ЕдЕЕдЕЕддЕ дсЕддадЕЕа дЕддасЕЕдс ЕдсЕдсаЕаЕ 180
аадсЕааааЕ сссаЕддЕЕЕ дадЕдЕдаса ЕЕдЕЕЕдаад сЕааЕЕсЕад адсЕддаддс 240
ааасЕЕаааа сЕдЕЕааааа адаЕддЕЕЕЕ аЕЕЕдддаЕд адддддсааа ЕасЕаЕдаса 300
дааадЕдадд сададдЕсЕс дадЕЕЕдаЕс даЕдаЕсЕЕд ддсЕЕсдЕда даадсаасад 360
ЕЕдссааЕЕЕ сасааааЕаа аадаЕасаЕа дсЕададасд дЕсЕЕссЕдЕ дсЕасЕассЕ 420
ЕсаааЕсссд сЕдсасЕасЕ сасдадсааЕ аЕссЕЕЕсад сааааЕсааа дсЕдсаааЕЕ 480
аЕдЕЕддаас саЕЕЕсЕсЕд дадаааасас ааЕдсЕасЕд аасЕЕЕсЕда ЕдадсаЕдЕЕ 540
саддааадсд ЕЕддЕдааЕЕ ЕЕЕЕдадсда саЕЕЕЕддда аададЕЕЕдЕ ЕдаЕЕаЕдЕЕ 600
аЕЕдасссЕЕ ЕЕдЕЕдсддд ЕасаЕдЕдда даЕссЕсааЕ сдсЕЕЕссаЕ дЕассаЕаса 660
ЕЕЕссадаад ЕаЕддааЕаЕ Едаааааадд ЕЕЕддсЕсЕд ЕдЕЕЕдсЕдд асЕааЕЕсаа 720
ЕсаасаЕЕдЕ ЕаЕсЕаадаа ддаааадддЕ ддадааааЕд сЕЕсЕаЕЕаа даадссЕсдЕ 780
дЕасдЕддЕЕ саЕЕЕЕсаЕЕ ЕсааддЕдда аЕдсадасас ЕЕдЕЕдасас ааЕдЕдсааа 840
садсЕЕддЕд аадаЕдаасЕ сааасЕссад ЕдЕдаддЕдс ЕдЕссЕЕдЕс аЕаЕаассад 900
ааддддаЕсс ссЕсаЕЕадд дааЕЕддЕса дЕсЕсЕЕсЕа ЕдЕсаааЕаа ЕассадЕдаа 960
даЕсааЕсЕЕ аЕдаЕдсЕдЕ ддЕЕдЕсасЕ дсЕссааЕЕс дсааЕдЕсаа адаааЕдаад 1020
аЕЕаЕдаааЕ ЕЕддаааЕсс аЕЕЕЕсасЕЕ дасЕЕЕаЕЕс сададдЕдас дЕасдЕассс 1080
сЕЕЕссдЕЕа ЕдаЕЕасЕдс аЕЕсааааад даЕааадЕда ададассЕсЕ ЕдадддсЕЕс 1140
ддадЕЕсЕЕа ЕссссЕсЕаа ададсаасаЕ ааЕддасЕда адасЕсЕЕдд ЕасЕЕЕаЕЕЕ 1200
ЕссЕссаЕда ЕдЕЕЕссЕда ЕсдЕдсЕсса ЕсЕдасаЕдЕ дЕсЕсЕЕЕас ЕасаЕЕЕдЕс 1260
ддаддаадса даааЕадааа асЕЕдсааас дсЕЕсаасдд аЕдааЕЕдаа дсаааЕадЕЕ 1320
ЕсЕЕсЕдасс ЕЕсадсадсЕ дЕЕдддсасЕ даддасдаас сЕЕсаЕЕЕдЕ сааЕсаЕсЕс 1380
ЕЕЕЕддадса асдсаЕЕссс аЕЕдЕаЕдда сасааЕЕасд аЕЕсЕдЕЕЕЕ дададссаЕа 1440
дасаадаЕдд ааааддаЕсЕ ЕссЕддаЕЕЕ ЕЕЕЕаЕдсад дЕаассаЕаа дддЕддасЕЕ 1500
ЕсадЕдддаа аадсдаЕддс сЕссддаЕдс ааддсЕдсдд аасЕЕдЕааЕ аЕссЕаЕсЕд 1560
дасЕсЕсаЕа ЕаЕасдЕдаа даЕддаЕдад аадассдсдЕ аа 1602
- 56 029356
<210> 8
<211> 533
<212> РКТ
<213> АтагапЬЬиз ЬиЪегси1аЬит
<400> 8
МеЬ 1 Уа1 11е О1п Зег 5 11е ТЬг Н1з Ьеи Зег 10 Рго Азп Ьеи А1а Ьеи 15 Рго
Зег Рго Ьеи Зег Уа1 Зег ТЬг Ьуз Азп Туг Рго Уа1 А1а Уа1 МеЬ О1у
20 25 30
Азп 11е Зег О1и Агд О1и О1и Рго ТЬг Зег А1а Ьуз Агд Уа1 А1а Уа1
35 40 45
Уа1 С1у А1а С1у Уа1 Зег О1у Ьеи А1а А1а А1а Туг Ьуз Ьеи Ьуз Зег
50 55 60
Ηΐ3 С1у Ьеи Зег Уа1 ТЬг Ьеи РЬе О1и А1а Азп Зег Агд А1а О1у О1у
65 70 75 80
Ьуз Ьеи Ьуз ТЬг Уа1 Ьуз Ьуз Азр О1у РЬе 11е Тгр Азр О1и О1у А1а
85 90 95
Азп ТЬг МеЬ ТЬг О1и Зег О1и А1а О1и Уа1 Зег Зег Ьеи 11е Азр Азр
100 105 110
Ьеи С1у Ьеи Агд О1и Ьуз О1п О1п Ьеи Рго 11е Зег О1п Азп Ьуз Агд
115 120 125
Туг 11е А1а Агд Азр С1у Ьеи Рго Уа1 Ьеи Ьеи Рго Зег Азп Рго А1а
130 135 140
А1а Ьеи Ьеи ТЬг Зег Азп 11е Ьеи Зег А1а Ьуз Зег Ьуз Ьеи О1п 11е
145 150 155 160
МеЬ Ьеи О1и Рго РЬе Ьеи Тгр Агд Ьуз Н1з Азп А1а ТЬг О1и Ьеи Зег
165 170 175
Азр О1и Н1з Уа1 О1п О1и Зег Уа1 О1у О1и РЬе РЬе О1и Агд Н1з РЬе
180 185 190
О1у Ьуз О1и РЬе Уа1 Азр Туг Уа1 11е Азр Рго РЬе Уа1 А1а О1у ТЬг
195 200 205
Суз О1у Азр Рго О1п Зег Ьеи Зег МеЬ Туг Н1з ТЬг РЬе Рго О1и Уа1
210 215 220
- 57 029356
Тгр 225 Азп 11е О1и Ьуз Агд 230 РЬе О1у Бег Уа1 РЬе А1а О1у Ьеи 235 11е О1п 240
Бег ТЬг Ьеи Ьеи Бег Ьуз Ьуз О1и Ьуз О1у О1у О1и Азп А1а Бег 11е
245 250 255
Ьуз Ьуз Рго Агд Уа1 Агд О1у Бег РЬе Бег РЬе О1п О1у О1у МеЕ О1п
260 265 270
ТЬг Ьеи Уа1 Азр ТЬг МеЕ Суз Ьуз О1п Ьеи О1у О1и Азр О1и Ьеи Ьуз
275 280 285
Ьеи О1п Суз О1и Уа1 Ьеи Бег Ьеи Бег Туг Азп О1п Ьуз О1у 11е Рго
290 295 300
Бег Ьеи О1у Азп Тгр Бег Уа1 Бег Бег МеЕ Бег Азп Азп ТЬг Бег О1и
305 310 315 320
Азр О1п Бег Туг Азр А1а Уа1 Уа1 Уа1 ТЬг А1а Рго 11е Агд Азп Уа1
325 330 335
Ьуз О1и МеЕ Ьуз 11е МеЕ Ьуз РЬе О1у Азп Рго РЬе Бег Ьеи Азр РЬе
340 345 350
11е Рго О1и Уа1 ТЬг Туг Уа1 Рго Ьеи Бег Уа1 МеЕ 11е ТЬг А1а РЬе
355 360 365
Ьуз Ьуз Азр Ьуз Уа1 Ьуз Агд Рго Ьеи О1и О1у РЬе О1у Уа1 Ьеи 11е
370 375 380
Рго Бег Ьуз О1и О1п Н1з Азп О1у Ьеи Ьуз ТЬг Ьеи О1у ТЬг Ьеи РЬе
385 390 395 400
Бег Бег МеЕ МеЕ РЬе Рго Азр Агд А1а Рго Бег Азр МеЕ Суз Ьеи РЬе
405 410 415
ТЬг ТЬг РЬе Уа1 О1у О1у Бег Агд Азп Агд Ьуз Ьеи А1а Азп А1а Бег
420 425 430
ТЬг Азр О1и Ьеи Ьуз О1п 11е Уа1 Бег Бег Азр Ьеи О1п О1п Ьеи Ьеи
435 440 445
О1у ТЬг О1и Азр О1и Рго Бег РЬе Уа1 Азп Н1з Ьеи РЬе Тгр Бег Азп
450 455 460
А1а РЬе Рго Ьеи Туг О1у Нгз Азп Туг Азр Бег Уа1 Ьеи Агд А1а 11е
465 470 475 480
- 58 029356
Азр Ьуз МеЬ О1и Ьуз 485 Азр Ьеи Рго О1у РЬе 490 РЬе Туг А1а О1у Азп 495 Н1з
Ьуз О1у О1у Ьеи 500 Зег Уа1 О1у Ьуз А1а 505 МеЬ А1а Зег О1у Суз 510 Ьуз А1а
А1а О1и Ьеи 515 Уа1 11е Зег Туг Ьеи 520 Азр Зег Нгз 11е Туг 525 Уа1 Ьуз МеЬ
Азр О1и Ьуз ТЬг А1а
530
<210> 9 <211> 1644 <212> ДНК <213> АгаЫЬорз1з ЬЬаНапа <400> 9 аЬдддссЬда ЬЬааааасдд ЬасссЬЬЬаЬ ЬдЬсдЬЬЬЬд ддаЬаадсЬд дааЬЬЬЬдсс 60
дсЬдЬдЬЬЬЬ ЬЬЬсЬасЬЬа ЬЬЬссдЬсас ЬдсЬЬЬсдас ЬддЬсадада ЬЬЬЬдасЬсЬ 120
дааЬЬдЬЬдс адаЬадсааЬ ддсдЬсЬдда дсадЬадсад аЬсаЬсаааЬ ЬдаадсддЬЬ 180
Ьсаддааааа дадЬсдсадЬ сдЬаддЬдса ддЬдЬаадЬд дасЬЬдсддс ддсЬЬасаад 240
ЬЬдаааЬсда ддддЬЬЬдаа ЬдЬдасЬдЬд ЬЬЬдаадсЬд аЬддаададЬ аддЬдддаад 300
ЬЬдадаадЬд ЬЬаЬдсаааа ЬддЬЬЬдаЬЬ ЬдддаЬдаад дадсааасас саЬдасЬдад 360
дсЬдадссад аадЬЬдддад ЬЬЬасЬЬдаЬ даЬсЬЬдддс ЬЬсдЬдадаа асаасааЬЬЬ 420
ссааЬЬЬсас адааааадсд дЬаЬаЬЬдЬд сддааЬддЬд ЬассЬдЬдаЬ дсЬассЬасс 480
ааЬсссаЬад адсЬддЬсас аадЬадЬдЬд сЬсЬсЬассс ааЬсЬаадЬЬ ЬсаааЬсЬЬд 540
ЬЬддаассаЬ ЬЬЬЬаЬддаа дааааадЬсс ЬсаааадЬсЬ садаЬдсаЬс ЬдсЬдаадаа 600
адЬдЬаадсд адЬЬсЬЬЬса асдссаЬЬЬЬ ддасаададд ЬЬдЬЬдасЬа ЬсЬсаЬсдас 660
ссЬЬЬЬдЬЬд дЬддаасаад ЬдсЬдсддас ссЬдаЬЬссс ЬЬЬсааЬдаа дсаЬЬсЬЬЬс 720
ссадаЬсЬсЬ ддааЬадЬЬЬ ЬддсЬсЬаЬЬ аЬадЬсддЬд сааЬсадаас ааадЬЬЬдсЬ 780
дсЬаааддЬд дЬаааадЬад адасасааад адЬЬсЬссЬд дсасаааааа дддЬЬсдсдЬ 840
дддЬсаЬЬсЬ сЬЬЬЬааддд дддааЬдсад аЬЬсЬЬссЬд аЬасдЬЬдЬд саааадЬсЬс 900
ЬсасаЬдаЬд адаЬсааЬЬЬ адасЬссаад дЬасЬсЬсЬЬ ЬдЬсЬЬасаа ЬЬсЬддаЬса 960
адасаддада асЬддЬсаЬЬ аЬсЬЬдЬдЬЬ ЬсдсаЬааЬд ааасдсадад асаааасссс 1020
саЬЬаЬдаЬд сЬдсЬссЬсЬ дЬдсааЬдЬд ааддадаЬда аддЬЬаЬдаа аддаддасаа 1080
сссЬЬЬсадс ЬааасЬЬЬсЬ ссссдадаЬЬ ааЬЬасаЬдс сссЬсЬсддЬ ЬЬЬааЬсасс 1140
асаЬЬсасаа аддадааадЬ ааададассЬ сЬЬдааддсЬ ььддддЬась саЬЬссаЬсЬ 1200
- 59 029356
ааддадсааа адсаРддРРР саааасРсРа ддРасасРРР РРРсаРсааР даРдРРРсса 1260
даРсдРРссс сРадРдасдР РсаРсРаРаР асаасРРРРа РРддРдддад Раддаассад 1320
даасРадсса аадсРРссас РдасдааРРа ааасаадРРд РдасРРсРда ссРРсадсда 1380
сРдРРддддд РРдааддРда асссдРдРсР дРсаассаРР асРаРРддад дааадсаРРс 1440
ссдРРдРаРд асадсадсРа РдасРсадРс аРддаадсаа РРдасаадаР ддадааРдаР 1500
сРассРдддР РсРРсРаРдс аддРааРсаР сдаддддддс РсРсРдРРдд даааРсааРа 1560
дсаРсаддРР дсааадсадс РдассРРдРд аРсРсаРасс РддадРсРРд сРсаааРдас 1620
аадааассаа аРдасадсРР аРаа 1644
<210> 10
<211> 547
<212> РКТ
<213> АгаЬШорз1з РЬаНапа
<400> 10
МеР 1 О1у Ьеи 11е Ьуз 5 Азп О1у ТЬг Ьеи Туг 10 Суз Агд РЬе О1у 11е 15 Зег
Тгр Азп РЬе А1а А1а Уа1 РЬе РЬе Зег ТЬг Туг РЬе Агд Н1з Суз РЬе
20 25 30
Агд Ьеи Уа1 Агд Азр РЬе Азр Зег О1и Ьеи Ьеи О1п 11е А1а МеР А1а
35 40 45
Зег О1у А1а Уа1 А1а Азр Н1з О1п 11е О1и А1а Уа1 Зег О1у Ьуз Агд
50 55 60
Уа1 А1а Уа1 Уа1 О1у А1а О1у Уа1 Зег О1у Ьеи А1а А1а А1а Туг Ьуз
65 70 75 80
Ьеи Ьуз Зег Агд О1у Ьеи Азп Уа1 ТЬг Уа1 РЬе О1и А1а Азр О1у Агд
85 90 95
Уа1 О1у О1у Ьуз Ьеи Агд Зег Уа1 МеР О1п Азп О1у Ьеи 11е Тгр Азр
100 105 110
О1и О1у А1а Азп ТЬг МеР ТЬг О1и А1а О1и Рго О1и Уа1 О1у Зег Ьеи
115 120 125
Ьеи Азр Азр Ьеи О1у Ьеи Агд О1и Ьуз О1п О1п РЬе Рго 11е Зег О1п
130 135 140
Ьуз Ьуз Агд Туг 11е Уа1 Агд Азп О1у Уа1 Рго Уа1 МеР Ьеи Рго ТЬг
145 150 155 160
- б0 029356
Азп Рго 11е О1и ^еи 165 Уа1 ТЬг Зег Зег Уа1 170 ^еи Зег ТЬг О1п Зег 175 ^уз
РЬе О1п 11е ^еи ^еи О1и Рго РЬе ^еи Тгр ^уз ^уз ^уз Зег Зег ^уз
180 185 190
ναι Зег Азр А1а Зег А1а О1и О1и Зег Уа1 Зег О1и РЬе РЬе О1п Агд
195 200 205
Ηΐ3 РЬе О1у О1п О1и Уа1 Уа1 Азр Туг ^еи 11е Азр Рго РЬе Уа1 О1у
210 215 220
О1у ТЬг Зег А1а А1а Азр Рго Азр Зег ^еи Зег Ме5 ^уз Н1з Зег РЬе
225 230 235 240
Рго Азр ^еи Тгр Азп Зег РЬе О1у Зег 11е 11е Уа1 О1у А1а 11е Агд
245 250 255
ТЬг ^уз РЬе А1а А1а ^уз О1у О1у ^уз Зег Агд Азр ТЬг ^уз Зег Зег
260 265 270
Рго О1у ТЬг ^уз ^уз О1у Зег Агд О1у Зег РЬе Зег РЬе ^уз О1у О1у
275 280 285
МеЬ О1п 11е ^еи Рго Азр ТЬг ^еи Суз ^уз Зег ^еи Зег Н1з Азр О1и
290 295 300
11е Азп ^еи Азр Зег ^уз Уа1 ^еи Зег ^еи Зег Туг Азп Зег О1у Зег
305 310 315 320
Агд О1п О1и Азп Тгр Зег ^еи Зег Суз Уа1 Зег Н1з Азп О1и ТЬг О1п
325 330 335
Агд О1п Азп Рго ΗΪ8 Туг Азр А1а А1а Рго ^еи Суз Азп Уа1 ^уз О1и
340 345 350
Ме5 ^уз Уа1 Ме5 ^уз О1у О1у О1п Рго РЬе О1п ^еи Азп РЬе ^еи Рго
355 360 365
О1и 11е Азп Туг Ме5 Рго ^еи Зег Уа1 ^еи 11е ТЬг ТЬг РЬе ТЬг ^уз
370 375 380
О1и ^уз Уа1 ^уз Агд Рго ^еи О1и О1у РЬе О1у Уа1 ^еи 11е Рго Зег
385 390 395 400
^уз О1и О1п ^уз ΗΪ8 О1у РЬе ^уз ТЬг ^еи О1у ТЬг ^еи РЬе Зег Зег
- 61 029356
405 410 415
МеЕ МеЕ РЬе Рго Азр Агд Зег Рго Зег Азр Уа1 Нбз Ьеи Туг ТЬг ТЬг
420 425 430
РЬе 11е О1у О1у Зег Агд Азп О1п О1и Ьеи А1а Ьуз А1а Зег ТЬг Азр
435 440 445
О1и Ьеи Ьуз О1п Уа1 Уа1 ТЬг Зег Азр Ьеи О1п Агд Ьеи Ьеи О1у Уа1
450 455 460
О1и О1у О1и Рго Уа1 Зег Уа1 Азп Нбз Туг Туг Тгр Агд Ьуз А1а РЬе
465 470 475 480
Рго Ьеи Туг Азр Зег Зег Туг Азр Зег Уа1 МеЕ О1и А1а 11е Азр Ьуз
485 490 495
МеЕ О1и Азп Азр Ьеи Рго О1у РЬе РЬе Туг А1а О1у Азп Нбз Агд О1у
500 505 510
О1у Ьеи Зег Уа1 О1у Ьуз Зег 11е А1а Зег О1у Суз Ьуз А1а А1а Азр
515 520 525
Ьеи Уа1 11е Зег Туг Ьеи О1и Зег Суз Зег Азп Азр Ьуз Ьуз Рго Азп
530 535 540
Азр Зег Ьеи 545
<210> 11
<211> 1647
<212> ДНК
<213> Ы1соЕ1апа ЕаЬасит.
<400> 11
аЕдасаасаа сЕсссаЕсдс сааЕсаЕссЕ ааЕаЕЕЕЕса сЕсассадЕс дЕсдЕсаЕсд 60
ссаЕЕддсаЕ ЕсЕЕааассд ЕасдадЕЕЕс аЕсссЕЕЕсЕ сЕЕсааЕсЕс саадсдсааЕ 120
адЕдЕсааЕЕ дсааЕддсЕд дадаасасда ЕдсЕссдЕЕд ссааадаЕЕа сасадЕЕссЕ 180
ЕссЕсадсдд Есдасддсдд асссдссдсд дадсЕддасЕ дЕдЕЕаЕадЕ Еддадсадда 240
аЕЕадЕддсс ЕсЕдсаЕЕдс дсаддЕдаЕд ЕссдсЕааЕЕ ассссааЕЕЕ даЕддЕаасс 300
даддсдадад аЕсдЕдссдд ЕддсаасаЕа асдасЕдЕдд ааададасдд сЕаЕЕЕдЕдд 360
даадааддЕс ссаасадЕЕЕ ссадссдЕсс даЕссЕаЕдЕ ЕдасЕаЕддс адЕадаЕЕдЕ 420
ддаЕЕдаадд аЕдаЕЕЕддЕ дЕЕдддадаЕ ссЕааЕдсдс сссдЕЕЕсдЕ ЕЕЕдЕддаад 480
ддЕаааЕЕаа ддсссдЕссс сЕсаааасЕс асЕдаЕсЕЕс ссЕЕЕЕЕЕда ЕЕЕдаЕдадс 540
- 62 029356
аЕЕссЕддса адЕЕдададс ЕддЕЕЕЕддЕ дссаЕЕддсс ЕссдсссЕЕс ассЕссаддЕ 600
саЕдаддааЕ садЕЕдадса дЕЕсдЕдсдЕ сдЕааЕсЕЕд дЕддсдаадЕ сЕЕЕдаасдс 660
ЕЕдаЕадаас саЕЕЕЕдЕЕс ЕддЕдЕЕЕаЕ дсЕддЕдаЕс ссЕсаааасЕ дадЕаЕдааа 720
дсадсаЕЕЕд ддааадЕЕЕд даадЕЕддаа дааасЕддЕд дЕадсаЕЕаЕ Еддаддаасс 780
ЕЕЕааадсаа Еаааддадад аЕссадЕаса ссЕааадсдс сссдсдаЕсс дсдЕЕЕассЕ 840
ааассаааад дасадасадЕ ЕддаЕсаЕЕс аддаадддЕс ЕсадааЕдсЕ дссддаЕдса 900
аЕсадЕдсаа даЕЕдддаад саааЕЕаааа сЕаЕсаЕдда адсЕЕЕсЕад саЕЕасЕаад 960
Есадааааад даддаЕаЕса сЕЕдасаЕас дадасассад ааддадЕадЕ ЕЕсЕсЕЕсаа 1020
адЕсдаадса ЕЕдЕсаЕдас ЕдЕдссаЕсс ЕаЕдЕадсаа дсаасаЕаЕЕ асдЕссЕсЕЕ 1080
ЕсддЕЕдссд садсадаЕдс асЕЕЕсаааЕ ЕЕсЕасЕаЕс ссссадЕЕдд адсадЕсаса 1140
аЕЕЕсаЕаЕс сЕсаадаадс ЕаЕЕсдЕдаЕ дадсдЕсЕдд ЕЕдаЕддЕда асЕаааддда 1200
ЕЕЕдддсадЕ ЕдсаЕссасд Еасасаддда дЕддааасас ЕаддаасдаЕ аЕаЕадЕЕса 1260
ЕсасЕсЕЕсс сЕаассдЕдс сссааааддЕ сдддЕдсЕас ЕсЕЕдаасЕа саЕЕддадда 1320
дсааааааЕс сЕдаааЕЕЕЕ дЕсЕаадасд дададссаас ЕЕдЕддаадЕ адЕЕдаЕсдЕ 1380
дассЕсадаа аааЕдсЕЕаЕ аааасссааа дсЕсаадаЕс сЕсЕЕдЕЕдЕ дддЕдЕдсда 1440
дЕаЕддссас аадсЕаЕссс асадЕЕЕЕЕд дЕЕддЕсаЕс ЕддаЕасдсЕ аадЕасЕдса 1500
ааадсЕдсЕа ЕдааЕдаЕаа ЕдддсЕЕдаа дддсЕдЕЕЕс ЕЕдддддЕаа ЕЕаЕдЕдЕса 1560
ддЕдЕадсаЕ ЕддддаддЕд ЕдЕЕдааддЕ дсЕЕаЕдаад ЕЕдсаЕссда ддЕаасадда 1620
ЕЕЕсЕдЕсЕс ддЕаЕдсаЕа саааЕда 1647
<210> 12
<211> 548
<212> РКТ
<213> Ы1соЕ1апа ЕаЬасиш.
<400> 12
МеЕ 1 ТЬг ТЬг ТЬг Рго 5 11е А1а Азп Ηΐ3 Рго 10 Азп 11е РЬе ТЬг Ηΐ3 15 О1п
Зег Зег Зег Зег 20 Рго Ьеи А1а РЬе Ьеи 25 Азп Агд ТЬг Зег РЬе 30 11е Рго
РЬе Зег Зег 35 11е Зег Ьуз Агд Азп 40 Зег Уа1 Азп Суз Азп 45 О1у Тгр Агд
ТЬг Агд 50 Суз Зег Уа1 А1а Ьуз 55 Азр Туг ТЬг Уа1 Рго 60 Зег Зег А1а Уа1
Азр О1у О1у Рго А1а А1а О1и Ьеи Азр Суз Уа1 11е Уа1 О1у А1а О1у
- 63 029356
65 70 75 80
11е Зег О1у Ьеи Суз 85 11е А1а О1п Уа1 МеЬ 90 Зег А1а Азп Туг Рго 95 Азп
Ьеи МеЬ Уа1 ТЬг О1и А1а Агд Азр Агд А1а О1у О1у Азп 11е ТЬг ТЬг
100 105 110
Уа1 О1и Агд Азр О1у Туг Ьеи Тгр О1и О1и О1у Рго Азп Зег РЬе О1п
115 120 125
Рго Зег Азр Рго МеЬ Ьеи ТЬг МеЬ А1а Уа1 Азр Суз О1у Ьеи Ьуз Азр
130 135 140
Азр Ьеи Уа1 Ьеи О1у Азр Рго Азп А1а Рго Агд РЬе Уа1 Ьеи Тгр Ьуз
145 150 155 160
О1у Ьуз Ьеи Агд Рго Уа1 Рго Зег Ьуз Ьеи ТЬг Азр Ьеи Рго РЬе РЬе
165 170 175
Азр Ьеи МеЬ Зег 11е Рго О1у Ьуз Ьеи Агд А1а О1у РЬе О1у А1а 11е
180 185 190
О1у Ьеи Агд Рго Зег Рго Рго О1у Н1з О1и О1и Зег Уа1 О1и О1п РЬе
195 200 205
Уа1 Агд Агд Азп Ьеи О1у О1у О1и Уа1 РЬе О1и Агд Ьеи 11е О1и Рго
210 215 220
РЬе Суз Зег О1у Уа1 Туг А1а О1у Азр Рго Зег Ьуз Ьеи Зег МеЬ Ьуз
225 230 235 240
А1а А1а РЬе О1у Ьуз Уа1 Тгр Ьуз Ьеи О1и О1и ТЬг О1у О1у Зег 11е
245 250 255
11е О1у О1у ТЬг РЬе Ьуз А1а 11е Ьуз О1и Агд Зег Зег ТЬг Рго Ьуз
260 265 270
А1а Рго Агд Азр Рго Агд Ьеи Рго Ьуз Рго Ьуз О1у О1п ТЬг Уа1 О1у
275 280 285
Зег РЬе Агд Ьуз О1у Ьеи Агд МеЬ Ьеи Рго Азр А1а 11е Зег А1а Агд
290 295 300
Ьеи О1у Зег Ьуз Ьеи Ьуз Ьеи Зег Тгр Ьуз Ьеи Зег Зег 11е ТЬг Ьуз
305 310 315 320
- 64 029356
Зег О1и Ьуз О1у О1у 325 Туг Н1з Ьеи ТЬг Туг 330 О1и ТЬг Рго О1и О1у 335 Уа1
Уа1 Зег Ьеи О1п Зег Агд Зег 11е Уа1 МеЬ ТЬг Уа1 Рго Зег Туг Уа1
340 345 350
А1а Зег Азп 11е Ьеи Агд Рго Ьеи Зег Уа1 А1а А1а А1а Азр А1а Ьеи
355 360 365
Зег Азп РЬе Туг Туг Рго Рго Уа1 О1у А1а Уа1 ТЬг 11е Зег Туг Рго
370 375 380
О1п О1и А1а 11е Агд Азр О1и Агд Ьеи Уа1 Азр О1у О1и Ьеи Ьуз О1у
385 390 395 400
РЬе О1у О1п Ьеи Н1з Рго Агд ТЬг О1п О1у Уа1 О1и ТЬг Ьеи О1у ТЬг
405 410 415
11е Туг Зег Зег Зег Ьеи РЬе Рго Азп Агд А1а Рго Ьуз О1у Агд Уа1
420 425 430
Ьеи Ьеи Ьеи Азп Туг 11е О1у О1у А1а Ьуз Азп Рго О1и 11е Ьеи Зег
435 440 445
Ьуз ТЬг О1и Зег О1п Ьеи Уа1 О1и Уа1 Уа1 Азр Агд Азр Ьеи Агд Ьуз
450 455 460
МеЬ Ьеи 11е Ьуз Рго Ьуз А1а О1п Азр Рго Ьеи Уа1 Уа1 О1у Уа1 Агд
465 470 475 480
Уа1 Тгр Рго О1п А1а 11е Рго О1п РЬе Ьеи Уа1 О1у Н1з Ьеи Азр ТЬг
485 490 495
Ьеи Зег ТЬг А1а Ьуз А1а А1а МеЬ Азп Азр Азп О1у Ьеи О1и О1у Ьеи
500 505 510
РЬе Ьеи О1у О1у Азп Туг Уа1 Зег О1у Уа1 А1а Ьеи О1у Агд Суз Уа1
515 520 525
О1и О1у А1а Туг О1и Уа1 А1а Зег О1и Уа1 ТЬг О1у РЬе Ьеи Зег Агд
530 535 540
Туг А1а Туг Ьуз 545
<210> 13
<211> 1668 <212> ДНК
- 65 029356
<213> С1сЬог1ит 1пЕуЬиз
<400> 13
аЕдасаЕсЕс ЕсасадасдЕ ЕЕдЕЕсссЕс аасЕдЕЕдсс дЕадсЕддЕс ЕЕсссЕЕссд 60
ссассддЕЕЕ сЕддЕдддЕс дЕЕдасдЕса аадааЕссЕа ддЕассЕааЕ сасдЕаЕадЕ 120
ссддсдсаЕс дсаааЕдсаа ЕаддЕддадд ЕЕссдсЕдсЕ сЕаЕадссаа ддаЕЕсссса 180
аЕЕасЕссЕс ссаЕЕЕсааа ЕдадЕЕсаас ЕсЕсадссаЕ ЕдЕЕддасЕд ЕдЕсаЕЕдЕд 240
ддсдссддса ЕЕадсддссЕ ЕЕдсаЕЕдсд саддсссЕад сдасЕаааса сдссЕссдЕс 300
ЕсЕссддаЕд ЕдаЕсдЕсас сдаддсасда дасададЕсд ддддЕааЕаЕ аЕсаасддЕЕ 360
дааадддаЕд дсЕаЕсЕсЕд ддаадааддЕ ссЕаасадсЕ ЕссадссаЕс ЕдаЕдссаЕд 420
сЕсассаЕдд ЕддЕддаЕад ЕдддЕЕдаад даЕдаЕЕЕдд ЕдЕЕаддЕда сссаасадса 480
ссссдсЕЕЕд ЕаЕЕаЕдддд аддЕдаЕЕЕд ааассддЕЕс сЕЕссааасс ддсЕдассЕс 540
ссЕЕЕсЕЕЕд ассЕсаЕдад сЕЕЕссЕдда ааасЕсадад ссддЕЕЕЕдд ЕдсЕсЕЕдда 600
ЕЕссдЕссЕЕ сассЕссада Есдсдаадаа ЕсддЕЕдадд адЕЕЕдЕЕад асдЕааЕсЕЕ 660
ддадаЕдаад ЕЕЕЕсдаасд сЕЕдаЕадаа ссЕЕЕЕЕдсЕ саддЕдЕЕЕа ЕдсЕддЕдаЕ 720
ссаЕсаааас ЕЕадЕаЕдаа адсадсаЕЕЕ дддааддЕсЕ ддааЕсЕдда дсааааЕддЕ 780
ддЕадсаЕЕд ЕЕддЕддадс сЕЕсааддсЕ аЕЕсаддаса дааадааЕад ЕсаааадссЕ 840
ссасдддасс сдаддЕЕасс дааассааад ддссааасЕд ЕЕддаЕсЕЕЕ Еаддааадда 900
саадсдаЕдЕ ЕдссЕааЕдс ааЕсЕсаасд аддЕЕаддЕа дсададЕдаа аЕЕдЕдЕЕдд 960
аадсЕсасда дЕаЕЕЕсааа аЕЕддадааЕ ададдЕЕаЕа аЕЕЕдасаЕа Едааасасса 1020
сааддаЕЕЕд ааадЕсЕдса дасЕаааасЕ аЕсдЕдаЕда сЕдЕЕссаЕс сЕасдЕддсд 1080
адЕдасЕЕдЕ ЕдсдЕссдсЕ ЕЕсдЕЕдддЕ дсадсадаЕд саЕЕдЕсааа аЕЕЕЕаЕЕаЕ 1140
ссЕссддЕЕд садсЕдЕаЕс ааЕЕЕсаЕаЕ ссаааадасд сааЕЕсдЕдс ЕдассддсЕд 1200
аЕЕдаЕддЕс аасЕсааадд ЕЕЕЕдддсаа ЕЕдсаЕссас даадЕсаадд ддЕддааасЕ 1260
ЕЕаддЕасда ЕсЕасадЕЕс аЕсЕсЕЕЕЕс ссЕаассдад сдссассЕдд аадддЕЕсЕд 1320
сЕсЕЕдаасЕ асаЕсддадд ддсЕасаааЕ ссЕдаааЕЕс ЕаЕсааадас ддадддсдаа 1380
аЕЕдЕддаЕд сддЕддассд ддассЕасдд асдаЕдсЕда ЕааддсдЕда ЕдсддаадаЕ 1440
ссаЕЕдасдЕ ЕдддддЕдсд ддЕдЕддссЕ сдадсааЕсс сдсадЕЕЕсЕ даЕсддЕсаЕ 1500
ЕаЕдасаЕЕс ЕадаЕЕсЕдс аааадсЕдсЕ сЕдадЕадсд дЕддаЕЕсса аддЕаЕдЕЕЕ 1560
сЕЕддЕддса асЕаЕдЕдЕс ЕддЕдЕддсЕ ЕЕаддЕаааЕ дЕдЕсдаддс ЕдсЕЕаЕдаЕ 1620
дЕЕдссдсЕд аддЕааЕдаа сЕЕЕЕЕдЕсд сааддддЕдЕ асаадЕда 1668
<210> 14
<211> 555
<212> РКТ
- 66 029356
<213> С1сЬог1ит
<400> 14
МеЕ 1 ТЬг Зег Ьеи ТЬг 5 Азр Уа1 Суз Зег Ьеи 10 Азп Суз Суз Агд Зег 15 Тгр
Зег Зег Ьеи Рго Рго Рго Уа1 Зег О1у О1у Зег Ьеи ТЬг Зег Ьуз Азп
20 25 30
Рго Агд Туг Ьеи 11е ТЬг Туг Зег Рго А1а Ηΐ3 Агд Ьуз Суз Азп Агд
35 40 45
Тгр Агд РЬе Агд Суз Зег 11е А1а Ьуз Азр Зег Рго 11е ТЬг Рго Рго
50 55 60
Не Зег Азп О1и РЬе Азп Зег О1п Рго Ьеи Ьеи Азр Суз Уа1 11е Уа1
65 70 75 80
О1у А1а О1у 11е Зег О1у Ьеи Суз 11е А1а О1п А1а Ьеи А1а ТЬг Ьуз
85 90 95
Ηΐ3 А1а Зег Уа1 Зег Рго Азр Уа1 11е Уа1 ТЬг О1и А1а Агд Азр Агд
100 105 110
Уа1 О1у О1у Азп 11е Зег ТЬг Уа1 О1и Агд Азр О1у Туг Ьеи Тгр О1и
115 120 125
О1и О1у Рго Азп Зег РЬе О1п Рго Зег Азр А1а МеЕ Ьеи ТЬг МеЕ Уа1
130 135 140
Уа1 Азр Зег О1у Ьеи Ьуз Азр Азр Ьеи Уа1 Ьеи О1у Азр Рго ТЬг А1а
145 150 155 160
Рго Агд РЬе Уа1 Ьеи Тгр О1у О1у Азр Ьеи Ьуз Рго Уа1 Рго Зег Ьуз
165 170 175
Рго А1а Азр Ьеи Рго РЬе РЬе Азр Ьеи МеЕ Зег РЬе Рго О1у Ьуз Ьеи
180 185 190
Агд А1а О1у РЬе О1у А1а Ьеи О1у РЬе Агд Рго Зег Рго Рго Азр Агд
195 200 205
О1и О1и Зег Уа1 О1и О1и РЬе Уа1 Агд Агд Азп Ьеи О1у Азр О1и Уа1
210 215 220
РЬе О1и Агд Ьеи 11е О1и Рго РЬе Суз Зег О1у Уа1 Туг А1а О1у Азр
225 230 235 240
- 67 029356
Рго Зег Ьуз Ьеи Зег 245 МеЬ Ьуз А1а А1а РЬе 250 О1у Ьуз Уа1 Тгр Азп 255 Ьеи
О1и О1п Азп О1у О1у Зег 11е Уа1 О1у О1у А1а РЬе Ьуз А1а 11е О1п
260 265 270
Азр Агд Ьуз Азп Зег О1п Ьуз Рго Рго Агд Азр Рго Агд Ьеи Рго Ьуз
275 280 285
Рго Ьуз О1у О1п ТЬг Уа1 О1у Зег РЬе Агд Ьуз О1у О1п А1а МеЬ Ьеи
290 295 300
Рго Азп А1а 11е Зег ТЬг Агд Ьеи О1у Зег Агд Уа1 Ьуз Ьеи Суз Тгр
305 310 315 320
Ьуз Ьеи ТЬг Зег 11е Зег Ьуз Ьеи О1и Азп Агд О1у Туг Азп Ьеи ТЬг
325 330 335
Туг О1и ТЬг Рго О1п О1у РЬе О1и Зег Ьеи О1п ТЬг Ьуз ТЬг 11е Уа1
340 345 350
МеЬ ТЬг Уа1 Рго Зег Туг Уа1 А1а Зег Азр Ьеи Ьеи Агд Рго Ьеи Зег
355 360 365
Ьеи О1у А1а А1а Азр А1а Ьеи Зег Ьуз РЬе Туг Туг Рго Рго Уа1 А1а
370 375 380
А1а Уа1 Зег 11е Зег Туг Рго Ьуз Азр А1а 11е Агд А1а Азр Агд Ьеи
385 390 395 400
11е Азр О1у О1п Ьеи Ьуз О1у РЬе О1у О1п Ьеи Н1з Рго Агд Зег О1п
405 410 415
О1у Уа1 О1и ТЬг Ьеи О1у ТЬг 11е Туг Зег Зег Зег Ьеи РЬе Рго Азп
420 425 430
Агд А1а Рго Рго О1у Агд Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи Азп Туг 11е О1у О1у А1а
435 440 445
ТЬг Азп Рго О1и 11е Ьеи Зег Ьуз ТЬг О1и О1у О1и 11е Уа1 Азр А1а
450 455 460
Уа1 Азр Агд Азр Ьеи Агд ТЬг МеЬ Ьеи 11е Агд Агд Азр А1а О1и Азр
465 470 475 480
Рго Ьеи ТЬг Ьеи О1у Уа1 Агд Уа1 Тгр Рго Агд А1а 11е Рго О1п РЬе
485 490 495
- 68 029356
Ьеи 11е О1у Ηΐ3 Туг Азр 11е Ьеи Азр Зег А1а Ьуз А1а А1а Ьеи Зег
500 505 510
Зег О1у О1у РЬе О1п О1у МеЕ РЬе Ьеи О1у О1у Азп Туг Уа1 Зег О1у
515 520 525
Уа1 А1а Ьеи О1у Ьуз Суз Уа1 О1и А1а А1а Туг Азр Уа1 А1а А1а О1и
530 535 540
Уа1 МеЕ Азп РЬе Ьеи Зег О1п О1у Уа1 Туг Ьуз
545 550 555
<210> 15 <211> 1689 <212> ДНК <213> Зртпаста о1егасеа
<400> 15 аЕдадсдсЕа ЕддсдЕЕаЕс дадЕасааЕд дсссЕЕЕсдЕ ЕдссдсааЕс ЕЕсЕаЕдЕса 60
ЕЕаЕсссаЕЕ дЕаддсасаа ссдЕаЕсасс аЕЕЕЕдаЕЕс саЕсЕЕсдЕс дсЕЕсдаада 120
сдаддаддаа дсЕсЕаЕссд сЕдсЕсЕаса аЕсЕсаассЕ сЕааЕЕссдс ддсЕдсадсс 180
ааЕЕассада асааааасаЕ аддсасааас ддадЕЕдасд дсддсддадд сддаддаддЕ 240
дЕдЕЕадасЕ дЕдЕдаЕЕдЕ аддаддЕдда аЕсадЕддас ЕЕЕдсаЕЕдс асаддсЕсЕа 300
ЕсЕасЕаааЕ асЕссаассЕ сЕссасдааЕ ЕЕсаЕЕдЕса ссдаддсЕаа ддаЕсдадЕЕ 360
ддсдддааса ЕсасЕассаЕ ддаадсЕдаЕ дддЕаЕЕЕаЕ дддаададдд ЕссЕааЕадс 420
ЕЕЕсадссаЕ сЕдаЕдсадЕ дсЕсассаЕд дсЕдЕЕдаса дЕддЕЕЕдаа ададдааЕЕд 480
дЕдсЕдддад аЕсссааЕЕс дссЕсдсЕЕЕ дЕдсЕдЕдда аЕддсаааЕЕ ааддссЕдЕа 540
ссЕЕссаадс ЕсасЕдассЕ сссЕЕЕсЕЕЕ даЕсЕсаЕда дсЕЕсссЕдд ааадаЕЕадд 600
дсЕддЕсЕЕд дЕдсЕсЕЕдд сЕЕасдасса ЕсЕссЕссдд сЕсаЕдадда аЕссдЕЕдаа 660
сааЕЕЕдЕсс дЕсдЕааЕсЕ ЕддЕдаЕдад дЕсЕЕЕдаас дсЕЕдаЕсда ассЕЕЕЕЕдЕ 720
ЕсаддЕдЕдЕ аЕдсЕддЕда ЕссЕЕссаад ЕЕдадЕаЕда аадсЕдсЕЕЕ ЕддсадддЕЕ 780
ЕдддЕсЕЕдд адсааааддд ЕддЕадЕаЕс аЕЕддЕддса сссЕсаааас ааЕссаддаа 840
адаааддаЕа аЕссЕаадсс ассЕсдадас ссдсдссЕсс ссааассааа дддссадаса 900
дЕЕддаЕссЕ Есаддааадд асЕдадЕаЕд ЕЕдссаассд ссаЕЕЕсЕда ааддсЕЕддс 960
аасааадЕда аадЕаЕсаЕд дасссЕЕЕсЕ ддЕаЕЕдсЕа адЕсдЕсдаа сддададЕаЕ 1020
ааЕсЕдасЕЕ аЕдааасасс адаЕддасЕд дЕЕЕссдЕЕа ддассаааад ЕдЕЕдЕдаЕд 1080
асЕдЕсссдЕ саЕаЕдЕЕдс аадЕадссЕс сЕЕсдЕссас ЕЕЕсадаЕдЕ сдссдсадаа 1140
ЕсЕсЕЕЕсаа ааЕЕЕсаЕЕа ЕссассадЕЕ дсадсЕдЕдЕ сасЕЕЕссЕа ЕссЕааадаа 1200
- 69 029356
дсааЕЕадаЕ сададЕдсЕЕ даЕЕдасддЕ даасЕЕааад даЕЕсдддса аЕЕасаЕЕсс 1260
сдсадЕсаад дЕдЕддааас сЕЕдддааса аЕЕЕаЕадЕЕ саЕсЕсЕЕЕЕ сссЕдддсда 1320
дсассассЕд дЕаддассЕЕ даЕЕЕЕдаас ЕасаЕЕддад дЕдаЕасЕаа сссЕддсаЕа 1380
ЕЕадасаада сдааадаЕда асЕадсЕдаа дсадЕЕдаса дддаЕЕЕдад аадааЕЕсЕс 1440
аЕааасссЕа аЕдсаааадс ЕссссдддЕЕ ЕЕдддЕдЕда дадЕаЕддсс асаадсааЕЕ 1500
ссссааЕЕЕЕ ЕааЕЕддсса сЕЕЕдаЕсЕд сЕсдаЕдсад саааадсЕдс ЕЕЕдасЕдаЕ 1560
ддЕддасаса ааддаЕЕдЕЕ ЕсЕЕддЕдда аасЕаЕдЕаЕ саддЕдЕЕдс ЕЕЕдддссда 1620
ЕдЕаЕададд дЕдсЕЕаЕда аЕсЕдсадсс даддЕЕдЕад аЕЕЕЕсЕдЕс асадЕасЕсд 1680
даЕаааЕад 1689
<210> 16 <211> 562
<212> РКТ <213> Зр1пас1а
<400> 16
МеЕ 1 Зег А1а МеЕ А1а 5 Ьеи Зег Зег ТЬг МеЕ 10 А1а Ьеи Зег Ьеи Рго 15 О1п
Зег Зег МеЕ Зег Ьеи Зег Н1з Суз Агд Н1з Азп Агд 11е ТЬг 11е Ьеи
20 25 30
11е Рго Зег Зег Зег Ьеи Агд Агд Агд О1у О1у Зег Зег 11е Агд Суз
35 40 45
Зег ТЬг 11е Зег ТЬг Зег Азп Зег А1а А1а А1а А1а Азп Туг О1п Азп
50 55 60
Ьуз Азп 11е О1у ТЬг Азп О1у Уа1 Азр О1у О1у О1у О1у О1у О1у О1у
65 70 75 80
Уа1 Ьеи Азр Суз Уа1 11е Уа1 О1у О1у О1у 11е Зег О1у Ьеи Суз 11е
85 90 95
А1а О1п А1а Ьеи Зег ТЬг Ьуз Туг Зег Азп Ьеи Зег ТЬг Азп РЬе 11е
100 105 110
Уа1 ТЬг О1и А1а Ьуз Азр Агд Уа1 О1у О1у Азп 11е ТЬг ТЬг МеЕ О1и
115 120 125
А1а Азр О1у Туг Ьеи Тгр О1и О1и О1у Рго Азп Зег РЬе О1п Рго Зег
130 135 140
- 70 029356
Азр 145 А1а Уа1 Ьеи ТЬг МеЬ 150 А1а Уа1 Азр Зег О1у 155 Ьеи Ьуз О1и О1и Ьеи 160
Уа1 Ьеи О1у Азр Рго Азп Зег Рго Агд РЬе Уа1 Ьеи Тгр Азп О1у Ьуз
165 170 175
Ьеи Агд Рго Уа1 Рго Зег Ьуз Ьеи ТЬг Азр Ьеи Рго РЬе РЬе Азр Ьеи
180 185 190
МеЬ Зег РЬе Рго О1у Ьуз 11е Агд А1а О1у Ьеи О1у А1а Ьеи О1у Ьеи
195 200 205
Агд Рго Зег Рго Рго А1а Н1з О1и О1и Зег Уа1 О1и О1п РЬе Уа1 Агд
210 215 220
Агд Азп Ьеи О1у Азр О1и Уа1 РЬе О1и Агд Ьеи 11е О1и Рго РЬе Суз
225 230 235 240
Зег О1у Уа1 Туг А1а О1у Азр Рго Зег Ьуз Ьеи Зег МеЬ Ьуз А1а А1а
245 250 255
РЬе О1у Агд Уа1 Тгр Уа1 Ьеи О1и О1п Ьуз О1у О1у Зег 11е 11е О1у
260 265 270
О1у ТЬг Ьеи Ьуз ТЬг 11е О1п О1и Агд Ьуз Азр Азп Рго Ьуз Рго Рго
275 280 285
Агд Азр Рго Агд Ьеи Рго Ьуз Рго Ьуз О1у О1п ТЬг Уа1 О1у Зег РЬе
290 295 300
Агд Ьуз О1у Ьеи Зег МеЬ Ьеи Рго ТЬг А1а 11е Зег О1и Агд Ьеи О1у
305 310 315 320
Азп Ьуз Уа1 Ьуз Уа1 Зег Тгр ТЬг Ьеи Зег О1у 11е А1а Ьуз Зег Зег
325 330 335
Азп О1у О1и Туг Азп Ьеи ТЬг Туг О1и ТЬг Рго Азр О1у Ьеи Уа1 Зег
340 345 350
Уа1 Агд ТЬг Ьуз Зег Уа1 Уа1 МеЬ ТЬг Уа1 Рго Зег Туг Уа1 А1а Зег
355 360 365
Зег Ьеи Ьеи Агд Рго Ьеи Зег Азр Уа1 А1а А1а О1и Зег Ьеи Зег Ьуз
370 375 380
РЬе Нтз Туг Рго Рго Уа1 А1а А1а Уа1 Зег Ьеи Зег Туг Рго Ьуз О1и
385 390 395 400
- 71 029356
А1а 11е Агд Зег О1и Суз 405 Ьеи 11е Азр О1у О1и Ьеи 410 Ьуз О1у РЬе 415 О1у
О1п Ьеи Н1з Зег Агд Зег О1п О1у Уа1 О1и ТЬг Ьеи О1у ТЬг 11е Туг
420 425 430
Зег Зег Зег Ьеи РЬе Рго О1у Агд А1а Рго Рго О1у Агд ТЬг Ьеи 11е
435 440 445
Ьеи Азп Туг 11е О1у О1у Азр ТЬг Азп Рго О1у 11е Ьеи Азр Ьуз ТЬг
450 455 460
Ьуз Азр О1и Ьеи А1а О1и А1а Уа1 Азр Агд Азр Ьеи Агд Агд 11е Ьеи
465 470 475 480
11е Азп Рго Азп А1а Ьуз А1а Рго Агд Уа1 Ьеи О1у Уа1 Агд Уа1 Тгр
485 490 495
Рго О1п А1а 11е Рго О1п РЬе Ьеи 11е О1у Н1з РЬе Азр Ьеи Ьеи Азр
500 505 510
А1а А1а Ьуз А1а А1а Ьеи ТЬг Азр О1у О1у Н1з Ьуз О1у Ьеи РЬе Ьеи
515 520 525
О1у О1у Азп Туг Уа1 Зег О1у Уа1 А1а Ьеи О1у Агд Суз 11е О1и О1у
530 535 540
А1а Туг О1и Зег А1а А1а О1и Уа1 Уа1 Азр РЬе Ьеи Зег О1п Туг Зег
545 550 555 560
Азр Ьуз
<210> 17
<211> 1596
<212> ДНК
<213> Зр1пас1а о1егасеа
<400> 17
аЬддЬааЬас ЬассддЬЬЬс ссадсЬаЬса асЬааЬсЬдд дЬЬЬаЬсдсЬ ддЬЬЬсассс 60
ассаадааса асссадЬЬаЬ дддсаасдЬЬ ЬсЬдадсдаа аЬсаадЬсаа ЬсаасссаЬЬ 120
ЬсЬдсЬаааа дддЬЬдсЬдЬ ЬдЬЬддЬдсЬ ддЬдЬЬадЬд дасЬЬдсЬдс ддсдЬаЬаад 180
сЬааааЬсда аЬддсЬЬдаа ЬдЬдасаЬЬд ЬЬЬдаадсЬд аЬадЬададс ЬддЬдддааа 240
сЬсаааасЬд ЬЬдЬааадда ЬддЬЬЬдаЬЬ ЬдддаЬдаад дддсаааЬас саЬдасадад 300
адсдаЬдадд аддЬсасдад ЬЬЬдЬЬЬдаЬ даЬсЬсддда ЬЬсдЬдадаа дсЬасадсЬа 360
- 72 029356
ссааОООсас аааасаааад аОасаООдсс ададаОддОс ООссОдОдсО дООассООса 420
ааОссадООд сдсОссОдаа дадсааОаОс сОООсадсаа ааОсОаадсО асаааООаОд 480
ООддаассОО ООсОООддаа аааасасааО ддОдсОаадд ОООсОдасда дааОдсссаа 540
дааадОдОдд сОдадООООО ОдадсддсаО ОООдддааад адОООдООда ООаОООааОО 600
даОссООООд ОсдсдддОас аадОддОдда даОссОсааО сОсОООсОаО дсдОсаОдса 660
ОООссадааО ОаОддааОаО Одадаасадд ОООддООсад ОдаОООсОдд аООсаООсад 720
ОсОааасОдО саОссаадаа ддаааадддО ддадаааадс ааОсООсОаа Оаадаадсса 780
сдОдОасдОд дООсдООООс ООООсадддО ддааОдсада сасОадООда сасОаОаОдс 840
ааададОООд дОдаадаОда асОсааасОс садОсОдадд ООсОООсаОО дОсаОасадс 900
саОааОддаа дссООасаОс ададааООдд ОсадОдОсОО сОаОдОсааа садсассаОс 960
саадаОсаас саОаОдаОдс ОдОсдООдОд ассдссссаа ОсааОааОдО сааадаасОд 1020
аадаООаОда аадОддаааа сссаООООсО сООдасООса ООссададдО дадсОдОсОа 1080
ссссОсОсОд ООаООаООас ОасаООсаад аадассааОд Одаададасс ОсООдадддО 1140
ОООддОдООс ООдОасссОс ОааОдадсаа саОааОдддс ОдаадасОсО ОддОасОООд 1200
ООООссОсаа ОдаОдОООсс ОдаОсдОдсО сссОсОдаОд ОдОаОсОаОа сасОассООО 1260
дООддаддОа дсадаааОад адаасООдса ааадсООсаа сддаОдаасО даадсаааОа 1320
дОООсООсОд ассОссадса дсОдООдддс ассдадддсд аассОасООО ОдОдааОсаО 1380
ООООасОдда дсааадсаОО сссОсОООаО ддасдсааОО асдасОсадО ОсООададса 1440
аОададаада Оддаааддда ссООссОдда сООООООасд саддОаасса ОаадддОдда 1500
сОдОсОдОдд дааадОсааО адссОсОдда ОасааадсОд ссдадсООдс даОаОссОаО 1560
сОсдадОсОа асаадаОдас сдаддадасО аОаОаа 1596
<210> 18 <211> 531
<212> РКТ <213> Бр1пас1а
<400> 18
МеО 1 Уа1 11е Ьеи Рго 5 Уа1 Бег О1п Ьеи Бег 10 ТЬг Азп Ьеи О1у Ьеи 15 Бег
Ьеи Уа1 Бег Рго 20 ТЬг Ьуз Азп Азп Рго 25 Уа1 МеО О1у Азп Уа1 30 Бег О1и
Агд Азп О1п 35 Уа1 Азп О1п Рго 11е 40 Бег А1а Ьуз Агд Уа1 45 А1а Уа1 Уа1
О1у А1а О1у Уа1 Бег О1у Ьеи А1а А1а А1а Туг Ьуз Ьеи Ьуз Бег Азп
- 73 029356
50 55 60
О1у 65 Ьеи Азп Уа1 ТЬг Ьеи 70 РЬе О1и А1а Азр Зег Агд А1а 75 О1у О1у Ьуз 80
Ьеи Ьуз ТЬг Уа1 Уа1 Ьуз Азр О1у Ьеи 11е Тгр Азр О1и О1у А1а Азп
85 90 95
ТЬг МеЬ ТЬг О1и Зег Азр О1и О1и Уа1 ТЬг Зег Ьеи РЬе Азр Азр Ьеи
100 105 110
О1у 11е Агд О1и Ьуз Ьеи О1п Ьеи Рго 11е Зег О1п Азп Ьуз Агд Туг
115 120 125
11е А1а Агд Азр О1у Ьеи Рго Уа1 Ьеи Ьеи Рго Зег Азп Рго Уа1 А1а
130 135 140
Ьеи Ьеи Ьуз Зег Азп 11е Ьеи Зег А1а Ьуз Зег Ьуз Ьеи О1п 11е МеЬ
145 150 155 160
Ьеи О1и Рго РЬе Ьеи Тгр Ьуз Ьуз Н1з Азп О1у А1а Ьуз Уа1 Зег Азр
165 170 175
О1и Азп А1а О1п О1и Зег Уа1 А1а О1и РЬе РЬе О1и Агд Н1з РЬе О1у
180 185 190
Ьуз О1и РЬе Уа1 Азр Туг Ьеи 11е Азр Рго РЬе Уа1 А1а О1у ТЬг Зег
195 200 205
О1у О1у Азр Рго О1п Зег Ьеи Зег МеЬ Агд Н1з А1а РЬе Рго О1и Ьеи
210 215 220
Тгр Азп 11е О1и Азп Агд РЬе О1у Зег Уа1 11е Зег О1у РЬе 11е О1п
225 230 235 240
Зег Ьуз Ьеи Зег Зег Ьуз Ьуз О1и Ьуз О1у О1у О1и Ьуз О1п Зег Зег
245 250 255
Азп Ьуз Ьуз Рго Агд Уа1 Агд О1у Зег РЬе Зег РЬе О1п О1у О1у МеЬ
260 265 270
О1п ТЬг Ьеи Уа1 Азр ТЬг 11е Суз Ьуз О1и РЬе О1у О1и Азр О1и Ьеи
275 280 285
Ьуз Ьеи О1п Зег О1и Уа1 Ьеи Зег Ьеи Зег Туг Зег Н1з Азп О1у Зег
290 295 300
- 74 029356
Ьеи 305 ТЬг Зег О1и Азп Тгр 310 Зег Уа1 Зег Зег МеР 315 Зег Азп Зег ТЬг 11е 320
О1п Азр О1п Рго Туг Азр А1а Уа1 Уа1 Уа1 ТЬг А1а Рго 11е Азп Азп
325 330 335
Уа1 Ьуз О1и Ьеи Ьуз 11е МеР Ьуз Уа1 О1и Азп Рго РЬе Зег Ьеи Азр
340 345 350
РЬе 11е Рго О1и Уа1 Зег Суз Ьеи Рго Ьеи Зег Уа1 11е 11е ТЬг ТЬг
355 360 365
РЬе Ьуз Ьуз ТЬг Азп Уа1 Ьуз Агд Рго Ьеи О1и О1у РЬе О1у Уа1 Ьеи
370 375 380
Уа1 Рго Зег Азп О1и О1п Н1з Азп О1у Ьеи Ьуз ТЬг Ьеи О1у ТЬг Ьеи
385 390 395 400
РЬе Зег Зег МеР МеР РЬе Рго Азр Агд А1а Рго Зег Азр Уа1 Туг Ьеи
405 410 415
Туг ТЬг ТЬг РЬе Уа1 О1у О1у Зег Агд Азп Агд О1и Ьеи А1а Ьуз А1а
420 425 430
Зег ТЬг Азр О1и Ьеи Ьуз О1п 11е Уа1 Зег Зег Азр Ьеи О1п О1п Ьеи
435 440 445
Ьеи О1у ТЬг О1и О1у О1и Рго ТЬг РЬе Уа1 Азп Н1з РЬе Туг Тгр Зег
450 455 460
Ьуз А1а РЬе Рго Ьеи Туг О1у Агд Азп Туг Азр Зег Уа1 Ьеи Агд А1а
465 470 475 480
11е О1и Ьуз МеР О1и Агд Азр Ьеи Рго О1у Ьеи РЬе Туг А1а О1у Азп
485 490 495
Н1з Ьуз О1у О1у Ьеи Зег Уа1 О1у Ьуз Зег 11е А1а Зег О1у Туг Ьуз
500 505 510
А1а А1а О1и Ьеи А1а 11е Зег Туг Ьеи О1и Зег Азп Ьуз МеР ТЬг О1и
515 520 525
О1и ТЬг 11е
530
<210> 19
<211> 1674
<212> ДНК
- 75 029356
<213> Зо1апит ЬиЬегозит
<400> 19
аЬдасаасаа сддссдЬсдс саассаЬссЬ адсаЬЬЬЬса сЬсассддЬс дссдсЬдссд 60
ЬсдссдЬсдЬ ссЬссЬссЬс аЬсдссдЬса ЬЬЬЬЬаЬЬЬЬ ЬааассдЬас дааЬЬЬсаЬЬ 120
ссЬЬасЬЬЬЬ ссассЬссаа дсдсааЬадЬ дЬсааЬЬдса аЬддсЬддад аасасдаЬдЬ 180
ЬссдЬЬдсса аддаЬЬаЬас адЬЬссЬссс ЬсддаадЬсд асддЬааЬса дЬЬсссддад 240
сЬддаЬЬдЬд ЬддЬадЬЬдд адсаддааЬЬ адЬддасЬсЬ дсаЬЬдсЬаа ддЬдаЬЬЬсд 300
дсЬааЬЬаЬс ссааЬЬЬдаЬ ддЬдасддад дсдадддаЬс дЬдссддЬдд ааасаЬаасд 360
асддЬддааа дадаЬддаЬа сЬЬаЬдддаа дааддЬссЬа асадЬЬЬсса дссЬЬсддаЬ 420
ссЬаЬдЬЬда сааЬддсЬдЬ адаЬЬдЬдда ЬЬдааддаЬд аЬЬЬддЬдЬЬ дддадаЬссЬ 480
даЬдсдссЬс дсЬЬЬдЬсЬЬ дЬддааддаЬ ааасЬааддс сЬдЬЬсссдд саадсЬсасЬ 540
даЬсЬЬсссЬ ЬсЬЬЬдаЬЬЬ даЬдадЬаЬс ссЬддсаадс ЬсададсЬдд ЬЬЬЬддЬдсс 600
аЬЬддссЬЬс дсссЬЬсасс ЬссаддЬЬаЬ даддааЬсад ЬЬдадсадЬЬ сдЬдсдЬсдЬ 660
ааЬсЬЬддЬд садаадЬсЬЬ ЬдаасдЬЬЬд аЬЬдаассаЬ ЬЬЬдЬЬсЬдд ЬдЬЬЬасдсс 720
ддЬдассссЬ сааааЬЬдаЬ ЬаЬдааадса дсаЬЬЬддда аадЬдЬддаа дсЬадаасаа 780
асЬддЬддЬа дсаЬЬаЬЬдд дддаассЬЬЬ ааадсааЬЬа аддададаЬс садЬаасссЬ 840
ааассдссЬс дЬдаЬссдсд ЬЬЬассааса ссааааддас ааасЬдЬЬдд аЬсаЬЬЬадд 900
аадддЬсЬда дааЬдсЬдсс ддаЬдсааЬЬ ЬдЬдааадас Ьдддаадсаа адЬаааасЬа 960
ЬсаЬддаадс ЬЬЬсЬадсаЬ ЬасааадЬса даааааддад даЬаЬсЬсЬЬ дасаЬасдад 1020
асассадаад дадЬадЬЬЬс ЬсЬдсдаадЬ сдаадсаЬЬд ЬсаЬдасЬдЬ ЬссаЬссЬаЬ 1080
дЬадсаадса асаЬаЬЬасд сссЬсЬЬЬсд дЬсдсЬдсад садаЬдсасЬ ЬЬсаадЬЬЬс 1140
ЬасЬаЬсссс садЬадсадс адЬдасааЬЬ ЬсаЬаЬссЬс аададдсЬаЬ ЬсдЬдаЬдад 1200
сдЬсЬддЬЬд аЬддЬдаасЬ ааадддаЬЬЬ дддсадЬЬдс аЬссасдЬЬс асадддадЬд 1260
дааасасЬад даасааЬаЬа ЬадЬЬсаЬса сЬсЬЬЬссЬа ассдЬдсЬсс аааЬддссдд 1320
дЬдсЬасЬсЬ ЬдаасЬасаЬ Ьддаддадса асаааЬасЬд аааЬЬдЬдЬс Ьаадасддад 1380
адссаасЬЬд ЬддаадсадЬ ЬдассдЬдас сЬсадааааа ЬдсЬЬаЬааа асссааадса 1440
саадаЬсссЬ ЬЬдЬЬасддд ЬдЬдсдадЬа Ьддссасаад сЬаЬсссаса дЬЬЬЬЬддЬс 1500
ддасаЬсЬдд аЬасасЬадд ЬасЬдсаааа асЬдсЬсЬаа дЬдаЬааЬдд дсЬЬдасддд 1560
сЬаЬЬссЬЬд ддддЬааЬЬа ЬдЬдЬсЬддЬ дЬадсаЬЬдд дааддЬдЬдЬ ЬдааддЬдсЬ 1620
ЬаЬдаааЬад саЬсЬдаддЬ аасЬддаЬЬЬ сЬдЬсЬсадЬ аЬдсаЬасаа аЬда 1674
<210> 20
<211> 557
<212> РКТ
- 76 029356
<213> Зо1апит ЕиЬегозит.
<400> 20
МеЕ 1 ТЬг ТЬг ТЬг А1а 5 Уа1 А1а Азп Нбз Рго 10 Зег 11е РЬе ТЬг Нбз 15 Агд
Зег Рго Ьеи Рго Зег Рго Зег Зег Зег Зег Зег Зег Рго Зег РЬе Ьеи
20 25 30
РЬе Ьеи Азп Агд ТЬг Азп РЬе 11е Рго Туг РЬе Зег ТЬг Зег Ьуз Агд
35 40 45
Азп Зег Уа1 Азп Суз Азп О1у Тгр Агд ТЬг Агд Суз Зег Уа1 А1а Ьуз
50 55 60
Азр Туг ТЬг Уа1 Рго Рго Зег О1и Уа1 Азр О1у Азп О1п РЬе Рго О1и
65 70 75 80
Ьеи Азр Суз Уа1 Уа1 Уа1 О1у А1а О1у 11е Зег О1у Ьеи Суз 11е А1а
85 90 95
Ьуз Уа1 11е Зег А1а Азп Туг Рго Азп Ьеи МеЕ Уа1 ТЬг О1и А1а Агд
100 105 110
Азр Агд А1а О1у О1у Азп 11е ТЬг ТЬг Уа1 О1и Агд Азр О1у Туг Ьеи
115 120 125
Тгр О1и О1и О1у Рго Азп Зег РЬе О1п Рго Зег Азр Рго МеЕ Ьеи ТЬг
130 135 140
МеЕ А1а Уа1 Азр Суз О1у Ьеи Ьуз Азр Азр Ьеи Уа1 Ьеи О1у Азр Рго
145 150 155 160
Азр А1а Рго Агд РЬе Уа1 Ьеи Тгр Ьуз Азр Ьуз Ьеи Агд Рго Уа1 Рго
165 170 175
О1у Ьуз Ьеи ТЬг Азр Ьеи Рго РЬе РЬе Азр Ьеи МеЕ Зег 11е Рго О1у
180 185 190
Ьуз Ьеи Агд А1а О1у РЬе О1у А1а 11е О1у Ьеи Агд Рго Зег Рго Рго
195 200 205
О1у Туг О1и О1и Зег Уа1 О1и О1п РЬе Уа1 Агд Агд Азп Ьеи О1у А1а
210 215 220
О1и Уа1 РЬе О1и Агд Ьеи 11е О1и Рго РЬе Суз Зег О1у Уа1 Туг А1а
225 230 235 240
- 77 029356
О1у Азр Рго Зег Ьуз 245 Ьеи 11е МеЬ Ьуз А1а 250 А1а РЬе О1у Ьуз Уа1 255 Тгр
Ьуз Ьеи О1и Ο1η ТЬг О1у О1у Зег 11е 11е О1у О1у ТЬг РЬе Ьуз А1а
260 265 270
11е Ьуз О1и Агд Зег Зег Азп Рго Ьуз Рго Рго Агд Азр Рго Агд Ьеи
275 280 285
Рго ТЬг Рго Ьуз О1у Ο1η ТЬг Уа1 О1у Зег РЬе Агд Ьуз О1у Ьеи Агд
290 295 300
МеЬ Ьеи Рго Азр А1а 11е Суз О1и Агд Ьеи О1у Зег Ьуз Уа1 Ьуз Ьеи
305 310 315 320
Зег Тгр Ьуз Ьеи Зег Зег 11е ТЬг Ьуз Зег О1и Ьуз О1у О1у Туг Ьеи
325 330 335
Ьеи ТЬг Туг О1и ТЬг Рго О1и О1у Уа1 Уа1 Зег Ьеи Агд Зег Агд Зег
340 345 350
11е Уа1 МеЬ ТЬг Уа1 Рго Зег Туг Уа1 А1а Зег Азп 11е Ьеи Агд Рго
355 360 365
Ьеи Зег Уа1 А1а А1а А1а Азр А1а Ьеи Зег Зег РЬе Туг Туг Рго Рго
370 375 380
Уа1 А1а А1а Уа1 ТЬг 11е Зег Туг Рго Ο1η О1и А1а 11е Агд Азр О1и
385 390 395 400
Агд Ьеи Уа1 Азр О1у О1и Ьеи Ьуз О1у РЬе О1у Ο1η Ьеи Н1з Рго Агд
405 410 415
Зег Ο1η О1у Уа1 О1и ТЬг Ьеи О1у ТЬг 11е Туг Зег Зег Зег Ьеи РЬе
420 425 430
Рго Азп Агд А1а Рго Азп О1у Агд Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи Азп Туг 11е О1у
435 440 445
О1у А1а ТЬг Азп ТЬг О1и 11е Уа1 Зег Ьуз ТЬг О1и Зег Ο1η Ьеи Уа1
450 455 460
О1и А1а Уа1 Азр Агд Азр Ьеи Агд Ьуз МеЬ Ьеи 11е Ьуз Рго Ьуз А1а
465 470 475 480
Ο1η Азр Рго РЬе Уа1 ТЬг О1у Уа1 Агд Уа1 Тгр Рго Ο1η А1а 11е Рго
485 490 495
- 78 029356
О1п РЬе Ьеи Уа1 О1у Н1з Ьеи Азр ТЬг Ьеи О1у ТЬг А1а Ьуз ТЬг А1а
500 505 510
Ьеи Зег Азр Азп О1у Ьеи Азр О1у Ьеи РЬе Ьеи О1у О1у Азп Туг Уа1
515 520 525
Зег О1у Уа1 А1а Ьеи О1у Агд Суз Уа1 О1и О1у А1а Туг О1и 11е А1а
530 535 540
Зег О1и Уа1 ТЬг О1у РЬе Ьеи Зег О1п Туг А1а Туг Ьуз
545 550 555
<210> 21 <211> 1608 <212> ДНК <213> Ьеа 1 тауз
<400> 21 аЬддЬсдссд ссасадссас сдссаЬддсс ассдсЬдсаЬ сдссдсЬасЬ саасдддасс 60
сдааЬассЬд сдсддсЬссд ссаЬсдадда сЬсадсдЬдс дсЬдсдсЬдс ЬдЬддсдддс 120
ддсдсддссд аддсассддс аЬссассддс дсдсддсЬдЬ ссдсддасЬд сдЬсдЬддЬд 180
ддсддаддса ЬсадЬддссЬ сЬдсассдсд саддсдсЬдд ссасдсддса сддсдЬсддд 240
дасдЬдсЬЬд Ьсасддаддс ссдсдсссдс сссддсддса асаЬЬассас сдЬсдадсдс 300
сссдаддаад ддЬассЬсЬд ддаддадддЬ сссаасадсЬ ЬссадсссЬс сдассссдЬЬ 360
сЬсассаЬдд ссдЬддасад сддасЬдаад даЬдасЬЬдд ЬЬЬЬЬдддда сссааасдсд 420
ссдсдЬЬЬсд ЬдсЬдЬддда ддддаадсЬд аддсссдЬдс саЬссаадсс сдссдассЬс 480
ссдЬЬсЬЬсд аЬсЬсаЬдад саЬсссаддд аадсЬсаддд ссддЬсЬадд сдсдсЬЬддс 540
аЬссдсссдс сЬссЬссадд ссдсдаадад ЬсадЬддадд адЬЬсдЬдсд ссдсаассЬс 600
ддЬдсЬдадд ЬсЬЬЬдадсд ссЬсаЬЬдад ссЬЬЬсЬдсЬ саддЬдЬсЬа ЬдсЬддЬдаЬ 660
ссЬЬсЬаадс ЬсадсаЬдаа ддсЬдсаЬЬЬ дддааддЬЬЬ ддсддЬЬдда адааасЬдда 720
ддЬадЬаЬЬа ЬЬддЬддаас саЬсаадаса аЬЬсаддада ддадсаадаа Ьссаааасса 780
ссдадддаЬд сссдссЬЬсс даадссаааа дддсадасад ЬЬдсаЬсЬЬЬ саддаадддЬ 840
сЬЬдссаЬдс ЬЬссаааЬдс саЬЬасаЬсс адсЬЬдддЬа дЬааадЬсаа асЬаЬсаЬдд 900
ааасЬсасда дсаЬЬасааа аЬсадаЬдас аадддаЬаЬд ЬЬЬЬддадЬа Ьдааасдсса 960
дааддддЬЬд ЬЬЬсддЬдса ддсЬаааадЬ дЬЬаЬсаЬда сЬаЬЬссаЬс аЬаЬдЬЬдсЬ 1020
адсаасаЬЬЬ ЬдсдЬссасЬ ЬЬсаадсдаЬ дсЬдсадаЬд сЬсЬаЬсаад аЬЬсЬаЬЬаЬ 1080
ссассддЬЬд сЬдсЬдЬаас ЬдЬЬЬсдЬаЬ ссаааддаад сааЬЬадааа адааЬдсЬЬа 1140
аЬЬдаЬдддд аасЬссаддд сЬЬЬддссад ЬЬдсаЬссас дЬадЬсаадд адЬЬдадаса 1200
- 79 029356
ЕЕаддаасаа ЕаЕасадЕЕс сЕсасЕсЕЕЕ ссаааЕсдЕд сЕссЕдасдд ЕадддЕдЕЕа 1260
сЕЕсЕааасЕ асаЕаддадд ЕдсЕасааас асаддааЕЕд ЕЕЕссаадас ЕдааадЕдад 1320
сЕддЕсдаад садЕЕдассд ЕдассЕссда ааааЕдсЕЕа ЕаааЕЕсЕас адсадЕддас 1380
ссЕЕЕадЕсс ЕЕддЕдЕЕсд адЕЕЕддсса саадссаЕас сЕсадЕЕссЕ ддЕаддасаЕ 1440
сЕЕдаЕсЕЕс Еддаадссдс аааадсЕдсс сЕддассдад дЕддсЕасда ЕдддсЕдЕЕс 1500
сЕаддаддда асЕаЕдЕЕдс аддадЕЕдсс сЕдддсадаЕ дсдЕЕдаддд сдсдЕаЕдаа 1560
адЕдссЕсдс аааЕаЕсЕда сЕЕсЕЕдасс аадЕаЕдссЕ асаадЕда 1608
<210> 22 <211> 535
<212> РКТ <213> Ьеа тауз
<400> 22
МеЕ 1 Уа1 А1а А1а ТЬг 5 А1а ТЬг А1а МеЕ А1а ТЬг А1а А1а 10 Бег Рго 15 Ьеи
Ьеи Азп О1у ТЬг Агд 11е Рго А1а Агд Ьеи Агд Н1з Агд О1у Ьеи Бег
20 25 30
Уа1 Агд Суз А1а А1а Уа1 А1а О1у О1у А1а А1а О1и А1а Рго А1а Бег
35 40 45
ТЬг О1у А1а Агд Ьеи Бег А1а Азр Суз Уа1 Уа1 Уа1 О1у О1у О1у 11е
50 55 60
Бег О1у Ьеи Суз ТЬг А1а О1п А1а Ьеи А1а ТЬг Агд Н1з О1у Уа1 О1у
65 70 75 80
Азр Уа1 Ьеи Уа1 ТЬг О1и А1а Агд А1а Агд Рго О1у О1у Азп 11е ТЬг
85 90 95
ТЬг Уа1 О1и Агд Рго О1и О1и О1у Туг Ьеи Тгр О1и О1и О1у Рго Азп
100 105 110
Бег РЬе О1п Рго Бег Азр Рго Уа1 Ьеи ТЬг МеЕ А1а Уа1 Азр Бег О1у
115 120 125
Ьеи Ьуз Азр Азр Ьеи Уа1 РЬе О1у Азр Рго Азп А1а Рго Агд РЬе Уа1
130 135 140
Ьеи Тгр О1и О1у Ьуз Ьеи Агд Рго Уа1 Рго Бег Ьуз Рго А1а Азр Ьеи
145 150 155 160
- 80 029356
Рго РЬе РЬе Азр Ьеи 165 МеЬ Зег 11е Рго О1у 170 Ьуз Ьеи Агд А1а О1у 175 Ьеи
О1у А1а Ьеи О1у 11е Агд Рго Рго Рго Рго О1у Агд О1и О1и Зег Уа1
180 185 190
О1и О1и РЬе Уа1 Агд Агд Азп Ьеи О1у А1а О1и Уа1 РЬе О1и Агд Ьеи
195 200 205
11е О1и Рго РЬе Суз Зег О1у Уа1 Туг А1а О1у Азр Рго Зег Ьуз Ьеи
210 215 220
Зег МеЬ Ьуз А1а А1а РЬе О1у Ьуз Уа1 Тгр Агд Ьеи О1и О1и ТЬг О1у
225 230 235 240
О1у Зег 11е 11е О1у О1у ТЬг 11е Ьуз ТЬг 11е О1п О1и Агд Зег Ьуз
245 250 255
Азп Рго Ьуз Рго Рго Агд Азр А1а Агд Ьеи Рго Ьуз Рго Ьуз О1у О1п
260 265 270
ТЬг Уа1 А1а Зег РЬе Агд Ьуз О1у Ьеи А1а МеЬ Ьеи Рго Азп А1а 11е
275 280 285
ТЬг Зег Зег Ьеи О1у Зег Ьуз Уа1 Ьуз Ьеи Зег Тгр Ьуз Ьеи ТЬг Зег
290 295 300
11е ТЬг Ьуз Зег Азр Азр Ьуз О1у Туг Уа1 Ьеи О1и Туг О1и ТЬг Рго
305 310 315 320
О1и О1у Уа1 Уа1 Зег Уа1 О1п А1а Ьуз Зег Уа1 11е МеЬ ТЬг 11е Рго
325 330 335
Зег Туг Уа1 А1а Зег Азп 11е Ьеи Агд Рго Ьеи Зег Зег Азр А1а А1а
340 345 350
Азр А1а Ьеи Зег Агд РЬе Туг Туг Рго Рго Уа1 А1а А1а Уа1 ТЬг Уа1
355 360 365
Зег Туг Рго Ьуз О1и А1а 11е Агд Ьуз О1и Суз Ьеи 11е Азр О1у О1и
370 375 380
Ьеи О1п О1у РЬе О1у О1п Ьеи Н1з Рго Агд Зег О1п О1у Уа1 О1и ТЬг
385 390 395 400
Ьеи О1у ТЬг 11е Туг Зег Зег Зег Ьеи РЬе Рго Азп Агд А1а Рго Азр
405 410 415
- 81 029356
О1у Агд Уа1 Ьеи 420 Ьеи Ьеи Азп Туг 11е 425 О1у О1у А1а ТЬг Азп 430 ТЬг О1у
11е Уа1 Зег Ьуз ТЬг О1и Зег О1и Ьеи Уа1 О1и А1а Уа1 Азр Агд Азр
435 440 445
Ьеи Агд Ьуз МеЕ Ьеи 11е Азп Зег ТЬг А1а Уа1 Азр Рго Ьеи Уа1 Ьеи
450 455 460
О1у Уа1 Агд Уа1 Тгр Рго О1п А1а 11е Рго О1п РЬе Ьеи Уа1 О1у Н1з
465 470 475 480
Ьеи Азр Ьеи Ьеи О1и А1а А1а Ьуз А1а А1а Ьеи Азр Агд О1у О1у Туг
485 490 495
Азр О1у Ьеи РЬе Ьеи О1у О1у Азп Туг Уа1 А1а О1у Уа1 А1а Ьеи О1у
500 505 510
Агд Суз Уа1 О1и О1у А1а Туг О1и Зег А1а Зег О1п 11е Зег Азр РЬе
515 520 525
Ьеи ТЬг Ьуз Туг А1а Туг Ьуз
530 535
<210> 23 <211> 1635 <212> ДНК <213> Ьеа тауз
<400> 23 аЕдсЕсдсЕЕ ЕдасЕдссЕс адссЕсаЕсс дсЕЕсдЕссс аЕссЕЕаЕсд ссасдссЕсс 60
дсдсасасЕс дЕсдсссссд ссЕасдЕдсд дЕссЕсдсда ЕддсдддсЕс сдасдасссс 120
сдЕдсадсдс ссдссадаЕс ддЕсдссдЕс дЕсддсдссд дддЕсадсдд дсЕсдсддсд 180
дсдЕасаддс Есадасадад сддсдЕдаас дЕаасддЕдЕ Есдаадсддс сдасадддсд 240
ддаддааада Еасддассаа ЕЕссдадддс дддЕЕЕдЕсЕ дддаЕдаадд адсЕаасасс 300
аЕдасадаад дЕдааЕддда ддссадЕада сЕдаЕЕдаЕд аЕсЕЕддЕсЕ асаадасааа 360
садсадЕаЕс сЕаасЕссса асасаадсдЕ ЕасаЕЕдЕса аадаЕддадс ассадсасЕд 420
аЕЕссЕЕсдд аЕсссаЕЕЕс дсЕааЕдааа адсадЕдЕЕс ЕЕЕсдасааа аЕсааадаЕЕ 480
дсдЕЕаЕЕЕЕ ЕЕдаассаЕЕ ЕсЕсЕасаад ааадсЕааса саадааасЕс ЕддаааадЕд 540
ЕсЕдаддадс асЕЕдадЕда дадЕдЕЕддд адсЕЕсЕдЕд аасдссасЕЕ Еддаададаа 600
дЕЕдЕЕдасЕ аЕЕЕЕдЕЕда ЕссаЕЕЕдЕа дсЕддаасаа дЕдсаддада ЕссададЕса 660
сЕаЕсЕаЕЕс дЕсаЕдсаЕЕ сссадсаЕЕд ЕддааЕЕЕдд ааадааадЕа ЕддЕЕсадЕЕ 720
- 82 029356
аЬЬдЬЬддЬд ссаЬсЬЬдЬс ЬаадсЬадса
даЬЬсаЬсад ддаааадаад дааЬадасда
ЬсасЬааЬаа аЬдсасЬЬса сааЬдаадЬЬ
дЬдЬЬдЬсаЬ ЬддсаЬдЬас аЬЬЬдаЬдда
дЬЬдаЬЬсда аддаЬадсдд Ьдасааддас
аЬааЬдасад сЬссаЬЬдЬс аааЬдЬссдд
дЬЬдЬЬсЬЬд асЬЬЬсЬЬсс ЬаадаЬддаЬ
ЬЬЬаадаадд аЬдаЬдЬсаа дааассЬсЬд
даасадсааа аасаЬддЬсЬ даааасссЬЬ
даЬсдадсЬс сЬдаЬдасса аЬаЬЬЬаЬаЬ
даЬсЬЬдсЬд дадсЬссаас дЬсЬаЬЬсЬд
сЬсЬЬдддсд Ьададдддса ассаасЬЬЬЬ
ссЬЬЬдЬаЬд дссаЬдаЬЬа ЬадЬЬсЬдЬа
сЬЬссадддЬ ЬсЬЬсЬасдс аддаааЬадс
дсЬЬсаддаа дсааддсЬдс ЬдассЬЬдса
ааЬааЬЬсас аЬЬда
<210> 24 <211> 544 <212> РКТ <213> Ьеа тауз
<400> 24
дсЬаааддЬд аЬссадЬааа дасаадасаЬ 780
дЬдЬсдЬЬЬЬ саЬЬЬсаЬдд ЬддааЬдсад 840
ддадаЬдаЬа аЬдЬдаадсЬ ЬддЬасадаа 900
дЬЬссЬдсас ЬаддсаддЬд дЬсааЬЬЬсЬ 960
сЬЬдсЬадЬа ассааассЬЬ ЬдаЬдсЬдЬЬ 1020
аддаЬдаадЬ Ьсассааадд ЬддадсЬссд 1080
ЬаЬсЬассас ЬаЬсЬсЬсаЬ ддЬдасЬдсЬ 1140
дааддаЬЬЬд дддЬсЬЬааЬ ассЬЬасаад 1200
дддасЬсЬсЬ ЬЬЬссЬсааЬ даЬдЬЬссса 1260
асаасаЬЬЬд ЬЬдддддЬад ссасааЬада 1320
ааасаасЬЬд ЬдассЬсЬда ссЬЬаааааа 1380
дЬсаадсаЬд ЬаЬасЬдддд аааЬдсЬЬЬЬ 1440
ЬЬддаадсЬа ЬадаааадаЬ ддадааааас 1500
ааддаЬдддс ЬЬдсЬдЬЬдд аадЬдЬЬаЬа 1560
аЬсЬсаЬаЬс ЬЬдааЬсЬса сассаадсаЬ 1620 1635
МеЬ 1 Ьеи А1а Ьеи ТЬг 5 А1а Зег А1а
Агд Н1з А1а Зег 20 А1а Н1з ТЬг Агд
А1а МеЬ А1а 35 О1у Зег Азр Азр Рго 40
А1а Уа1 50 Уа1 О1у А1а О1у Уа1 55 Зег
Агд 65 О1п Зег О1у Уа1 Азп 70 Уа1 ТЬг
О1у О1у Ьуз 11е Агд 85 ТЬг Азп Зег
Зег Зег 10 А1а Зег Зег Н1з Рго 15 Туг
Агд 25 Рго Агд Ьеи Агд А1а 30 Уа1 Ьеи
Агд А1а А1а Рго А1а 45 Агд Зег Уа1
О1у Ьеи А1а А1а 60 А1а Туг Агд Ьеи
Уа1 РЬе О1и 75 А1а А1а Азр Агд А1а 80
О1и О1у 90 О1у РЬе Уа1 Тгр Азр 95 О1и
- 83 029356
О1у А1а Азп ТЬг МеЕ ТЬг О1и О1у О1и 105 Тгр О1и А1а Зег Агд 110 Ьеи 11е
100
Азр Азр Ьеи О1у Ьеи О1п Азр Ьуз О1п О1п Туг Рго Азп Зег О1п Н1з
115 120 125
Ьуз Агд Туг 11е Уа1 Ьуз Азр О1у А1а Рго А1а Ьеи 11е Рго Зег Азр
130 135 140
Рго 11е Зег Ьеи МеЕ Ьуз Зег Зег Уа1 Ьеи Зег ТЬг Ьуз Зег Ьуз 11е
145 150 155 160
А1а Ьеи РЬе РЬе О1и Рго РЬе Ьеи Туг Ьуз Ьуз А1а Азп ТЬг Агд Азп
165 170 175
Зег О1у Ьуз Уа1 Зег О1и О1и Н1з Ьеи Зег О1и Зег Уа1 О1у Зег РЬе
180 185 190
Суз О1и Агд Н1з РЬе О1у Агд О1и Уа1 Уа1 Азр Туг РЬе Уа1 Азр Рго
195 200 205
РЬе Уа1 А1а О1у ТЬг Зег А1а О1у Азр Рго О1и Зег Ьеи Зег 11е Агд
210 215 220
Н1з А1а РЬе Рго А1а Ьеи Тгр Азп Ьеи О1и Агд Ьуз Туг О1у Зег Уа1
225 230 235 240
11е Уа1 О1у А1а 11е Ьеи Зег Ьуз Ьеи А1а А1а Ьуз О1у Азр Рго Уа1
245 250 255
Ьуз ТЬг Агд Н1з Азр Зег Зег О1у Ьуз Агд Агд Азп Агд Агд Уа1 Зег
260 265 270
РЬе Зег РЬе Н1з О1у О1у МеЕ О1п Зег Ьеи 11е Азп А1а Ьеи Н1з Азп
275 280 285
О1и Уа1 О1у Азр Азр Азп Уа1 Ьуз Ьеи О1у ТЬг О1и Уа1 Ьеи Зег Ьеи
290 295 300
А1а Суз ТЬг РЬе Азр О1у Уа1 Рго А1а Ьеи О1у Агд Тгр Зег 11е Зег
305 310 315 320
Уа1 Азр Зег Ьуз Азр Зег О1у Азр Ьуз Азр Ьеи А1а Зег Азп О1п ТЬг
325 330 335
РЬе Азр А1а Уа1 11е МеЕ ТЬг А1а Рго Ьеи Зег Азп Уа1 Агд Агд МеЕ
340 345 350
- 84 029356
^уз РЬе ТЬг 355 ^уз О1у О1у А1а Рго 360 Уа1 Уа1 ^еи Азр РЬе 365 ^еи Рго ^уз
МеЬ Азр Туг ^еи Рго ^еи Зег ^еи МеЬ Уа1 ТЬг А1а РЬе ^уз ^уз Азр
370 375 380
Азр Уа1 ^уз ^уз Рго ^еи О1и О1у РЬе О1у Уа1 ^еи 11е Рго Туг ^уз
385 390 395 400
О1и О1п О1п ^уз Н1з О1у ^еи ^уз ТЬг ^еи О1у ТЬг ^еи РЬе Зег Зег
405 410 415
МеЬ МеЬ РЬе Рго Азр Агд А1а Рго Азр Азр О1п Туг ^еи Туг ТЬг ТЬг
420 425 430
РЬе Уа1 О1у О1у Зег Н1з Азп Агд Азр ^еи А1а О1у А1а Рго ТЬг Зег
435 440 445
11е ^еи ^уз О1п ^еи Уа1 ТЬг Зег Азр ^еи ^уз ^уз ^еи ^еи О1у Уа1
450 455 460
О1и О1у О1п Рго ТЬг РЬе Уа1 ^уз Н1з Уа1 Туг Тгр О1у Азп А1а РЬе
465 470 475 480
Рго ^еи Туг О1у Н1з Азр Туг Зег Зег Уа1 ^еи О1и А1а 11е О1и ^уз
485 490 495
МеЬ О1и ^уз Азп ^еи Рго О1у РЬе РЬе Туг А1а О1у Азп Зег ^уз Азр
500 505 510
О1у ^еи А1а Уа1 О1у Зег Уа1 11е А1а Зег О1у Зег ^уз А1а А1а Азр
515 520 525
^еи А1а 11е Зег Туг ^еи О1и Зег Нтз ТЬг ^уз Н1з Азп Азп Зег Нтз
530 535 540
<210> 25
<211> 1692
<212> ДНК
<213> СЫатуДотопаз ге1пЬагДЬИ
<400> 25
айдайдСйда сссадасЬсс Ьдддассдсс асддсЁйсйа дссддсддЬс дсадаЬссдс 60
йсддсйдсдс асдЬсЬссдс сааддЬсдсд ссйсддссса сдссаЬЬсЬс ддЬсдсдадс 120
сссдсдассд сЬдсдадссс сдсдассдсд дсддсссдсс дсасасЬсса ссдсасЬдсЬ 180
дсддсддсса сЬддЬдсЬсс сасддсдЬсс ддадссддсд Ьсдссаадас дсЬсдасааЬ 240
- 85 029356
дЬдЬаЬдасд ЬдаЬсдЬддЬ сддЬддаддЬ сЬсЬсдддсс ЬддЬдассдд ссаддсссЬд 300
дсддсЬсадс асааааЬЬса даасЬЬссЬЬ дЬЬасддадд сЬсдсдадсд сдЬсддсддс 360
аасаЬЬасдЬ ссаЬдЬсддд сдаЬддсЬас дЬдЬдддадд адддсссдаа садсЬЬссад 420
сссаасдаЬа дсаЬдсЬдса даЬЬдсддЬд дасЬсЬддсЬ дсдадаадда ссЬЬдЬдЬЬс 480
ддЬдасссса сддсЬссссд сЬЬсдЬдЬдд Ьдддадддса адсЬдсдссс сдЬдсссЬсд 540
ддссЬддасд ссЬЬсассЬЬ сдассЬсаЬд ЬссаЬссссд дсаадаЬссд сдссдддсЬд 600
ддсдссаЬсд дссЬсаЬсаа сддадссаЬд сссЬссЬЬсд аддададЬдЬ ддадсадЬЬс 660
аЬссдссдса ассЬдддсда ЬдаддЬдЬЬс ЬЬссдссЬда ЬсдадсссЬЬ сЬдсЬссддс 720
дЬдЬасдсдд дсдассссЬс саадсЬдЬсс аЬдааддсдд ссЬЬсаасад даЬсЬддаЬЬ 780
сЬддадаада асддсддсад ссЬддЬддда ддЬдссаЬса адсЬдЬЬсса ддаасдссад 840
Ьссаасссдд ссссдссдсд ддасссдсдс сЬдссдссса адсссааддд ссадасддЬд 900
ддсЬсдЬЬсс дсаадддссЬ даадаЬдсЬд ссддасдсса ЬЬдадсдсаа саЬссссдас 960
аадаЬссдсд ЬдаасЬддаа дсЬддЬдЬсЬ сЬдддссдсд аддсддасдд дсддЬасддд 1020
сЬддЬдЬасд асасдсссда дддссдЬдЬс ааддЬдЬЬЬд сссдсдссдЬ ддсЬсЬдасс 1080
дсдсссадсЬ асдЬддЬддс ддассЬддЬс ааддадсадд сдсссдссдс сдссдаддсс 1140
сЬдддсЬссЬ ЬсдасЬассс дссддЬдддс дссдЬдасдс ЬдЬсдЬассс дсЬдадсдсс 1200
дЬдсдддадд адсдсааддс сЬсддасддд ЬссдЬдссдд дсЬЬсддЬса дсЬдсасссд 1260
сдсасдсадд дсаЬсассас ЬсЬдддсасс аЬсЬасадсЬ ссадссЬдЬЬ ссссддссдс 1320
дсдсссдадд дссасаЬдсЬ дсЬдсЬсаас ЬасаЬсддсд дсассассаа ссдсддсаЬс 1380
дЬсаассада ссассдадса дсЬддЬддад саддЬддаса аддассЬдсд саасаЬддЬс 1440
аЬсаадсссд асдсдсссаа дссссдЬдЬд дЬдддсдЬдс дсдЬдЬддсс дсдсдссаЬс 1500
ссдсадЬЬса ассЬдддсса ссЬддадсад сЬддасаадд сдсдсааддс дсЬддасдсд 1560
дсддддсЬдс адддсдЬдса ссЬддддддс аасЬасдЬса дсддЬдЬддс ссЬдддсаад 1620
дЬддЬддадс асддсЬасда дЬссдсадсс аассЬддсса ададсдЬдЬс сааддссдса 1680
дЬсааддссЬ аа 1692
<210> 26
<211> 563
<212> РКТ
<213> СЬ1ату0.отопаз
<400> 26
МеЬ МеЬ Ьеи ТЬг О1п ТЬг Рго О1у ТЬг А1а ТЬг А1а Зег Зег Агд Агд 1 5 10 15
- 86 029356
Зег О1п 11е Агд 20 Зег А1а А1а ΗΪ8 Уа1 25 Зег А1а Ьуз Уа1 А1а 30 Рго Агд
Рго ТЬг Рго РЬе Зег Уа1 А1а Зег Рго А1а ТЬг А1а А1а Зег Рго А1а
35 40 45
ТЬг А1а А1а А1а Агд Агд ТЬг Ьеи Ηίδ Агд ТЬг А1а А1а А1а А1а ТЬг
50 55 60
О1у А1а Рго ТЬг А1а Зег О1у А1а О1у Уа1 А1а Ьуз ТЬг Ьеи Азр Азп
65 70 75 80
Уа1 Туг Азр Уа1 11е Уа1 Уа1 О1у О1у О1у Ьеи Зег О1у Ьеи Уа1 ТЬг
85 90 95
О1у О1п А1а Ьеи А1а А1а О1п ΗΪ8 Ьуз 11е О1п Азп РЬе Ьеи Уа1 ТЬг
100 105 110
О1и А1а Агд О1и Агд Уа1 О1у О1у Азп 11е ТЬг Зег МеЕ Зег О1у Азр
115 120 125
О1у Туг Уа1 Тгр О1и О1и О1у Рго Азп Зег РЬе О1п Рго Азп Азр Зег
130 135 140
МеЕ Ьеи О1п 11е А1а Уа1 Азр Зег О1у Суз О1и Ьуз Азр Ьеи Уа1 РЬе
145 150 155 160
О1у Азр Рго ТЬг А1а Рго Агд РЬе Уа1 Тгр Тгр О1и О1у Ьуз Ьеи Агд
165 170 175
Рго Уа1 Рго Зег О1у Ьеи Азр А1а РЬе ТЬг РЬе Азр Ьеи МеЕ Зег 11е
180 185 190
Рго О1у Ьуз 11е Агд А1а О1у Ьеи О1у А1а 11е О1у Ьеи 11е Азп О1у
195 200 205
А1а МеЕ Рго Зег РЬе О1и О1и Зег Уа1 О1и О1п РЬе 11е Агд Агд Азп
210 215 220
Ьеи О1у Азр О1и Уа1 РЬе РЬе Агд Ьеи 11е О1и Рго РЬе Суз Зег О1у
225 230 235 240
Уа1 Туг А1а О1у Азр Рго Зег Ьуз Ьеи Зег МеЕ Ьуз А1а А1а РЬе Азп
245 250 255
Агд 11е Тгр 11е Ьеи О1и Ьуз Азп О1у О1у Зег Ьеи Уа1 О1у О1у А1а
260 265 270
- 87 029356
11е Ьуз Ьеи 275 РЬе О1п О1и Агд О1п 280 Бег Азп Рго А1а Рго 285 Рго Агд Азр
Рго Агд Ьеи Рго Рго Ьуз Рго Ьуз О1у О1п ТЬг Уа1 О1у Бег РЬе Агд
290 295 300
Ьуз О1у Ьеи Ьуз МеО Ьеи Рго Азр А1а 11е О1и Агд Азп 11е Рго Азр
305 310 315 320
Ьуз 11е Агд Уа1 Азп Тгр Ьуз Ьеи Уа1 Бег Ьеи О1у Агд О1и А1а Азр
325 330 335
О1у Агд Туг О1у Ьеи Уа1 Туг Азр ТЬг Рго О1и О1у Агд Уа1 Ьуз Уа1
340 345 350
РЬе А1а Агд А1а Уа1 А1а Ьеи ТЬг А1а Рго Бег Туг Уа1 Уа1 А1а Азр
355 360 365
Ьеи Уа1 Ьуз О1и О1п А1а Рго А1а А1а А1а О1и А1а Ьеи О1у Бег РЬе
370 375 380
Азр Туг Рго Рго Уа1 О1у А1а Уа1 ТЬг Ьеи Бег Туг Рго Ьеи Бег А1а
385 390 395 400
Уа1 Агд О1и О1и Агд Ьуз А1а Бег Азр О1у Бег Уа1 Рго О1у РЬе О1у
405 410 415
О1п Ьеи Н1з Рго Агд ТЬг О1п О1у 11е ТЬг ТЬг Ьеи О1у ТЬг 11е Туг
420 425 430
Бег Бег Бег Ьеи РЬе Рго О1у Агд А1а Рго О1и О1у Н1з МеО Ьеи Ьеи
435 440 445
Ьеи Азп Туг 11е О1у О1у ТЬг ТЬг Азп Агд О1у 11е Уа1 Азп О1п ТЬг
450 455 460
ТЬг О1и О1п Ьеи Уа1 О1и О1п Уа1 Азр Ьуз Азр Ьеи Агд Азп МеО Уа1
465 470 475 480
11е Ьуз Рго Азр А1а Рго Ьуз Рго Агд Уа1 Уа1 О1у Уа1 Агд Уа1 Тгр
485 490 495
Рго Агд А1а 11е Рго О1п РЬе Азп Ьеи О1у Н1з Ьеи О1и О1п Ьеи Азр
500 505 510
Ьуз А1а Агд Ьуз А1а Ьеи Азр А1а А1а О1у Ьеи О1п О1у Уа1 Нтз Ьеи
515 520 525
- 88 029356
О1у О1у Азп 530 Туг Уа1 Зег О1у Уа1 535 А1а Ьеи О1у Ьуз 540 Уа1 Уа1 О1и Нгз
О1у Туг О1и Зег А1а А1а Азп Ьеи А1а Ьуз Зег Уа1 Зег Ьуз А1а А1а
545 550 555 560
Уа1 Ьуз А1а
<210> 27 <211> 1734 <212> ДНК <213> Ро1уЬоте11а зр <400> 27 аЬдЬсдадЬЬ ссдсасЬаад дсЬаЬЬаЬдс дддсдаасаа дЬЬЬсЬЬЬаа ЬЬЬаЬдссаа 60
аааЬаЬссЬс сЬЬссЬЬЬсЬ дЬсасааЬЬд ЬсдассЬЬаа аЬЬЬсЬсаас ссаЬЬсдссЬ 120
ЬЬсдаЬадса сЬЬаЬдаЬдЬ сдЬсдЬсдЬЬ ддЬдссддаа ЬсЬсЬдддЬЬ дЬсЬасЬдсс 180
саадсасЬЬа дсаЬЬсааса ЬаадаЬсдаЬ ааЬдЬЬсЬдд ЬЬасЬдаадс ЬдаЬсаЬсдЬ 240
дЬаддсддЬа аааЬЬасдас дааааддааЬ ааадаЬЬЬсс ЬдЬдддадда дддЬссаааЬ 300
адЬЬдссЬаа Ьдаасдасдс ЬЬЬаЬаЬсдс дсЬдсссдад аЬдссддсдЬ ддааЬссааа 360
аЬЬсЬаЬсдд сддаЬссааа аЬЬассасдЬ ЬддаЬЬсЬдЬ ддддЬсдЬсд ЬЬЬдсдЬдЬд 420
дсссссаЬЬд даадсЬасдс ЬЬЬааааЬсс дассЬЬЬЬаЬ сЬасссаадд ссЬасЬссдЬ 480
дссаЬссдад дадЬсасадд ЬЬЬЬддЬдЬд ЬсассддсЬс сассЬааддд Ьсаддаддад 540
адсдЬддадд дсЬЬЬдЬЬсд асддассЬЬа ддадасдада ЬЬЬЬЬдадсд асЬсдЬЬдад 600
сссЬЬЬЬдсЬ ссддддЬЬЬа ЬдсдддддаЬ ссЬадсаааЬ ЬдЬссаЬдсд ЬдсЬдсЬЬЬс 660
ддаааасЬЬд ЬддааЬЬсда ададасдддЬ даЬддЬадсЬ ЬасЬЬсдсдд сдЬсЬЬЬсдЬ 720
ЬасдЬааЬда асааасдасд сдааадаадд асдддсдддд сдааадасдд ддасасддЬс 780
ссЬЬЬдаасд адасддссаа ддсасссааа ЬсаЬссЬсЬд дсссаасадЬ аЬсдЬсЬЬЬс 840
даддддддаа ЬсдадаЬссЬ дсссааддсс аЬЬдсдсааа адсЬдддЬда ЬсдадЬЬсдЬ 900
сЬЬддссЬас дасЬсдЬдсд саЬсдаЬссс асдсадсЬсд сддаЬддЬас дасадсдЬас 960
сдЬсЬдЬсдЬ ассдЬсддаЬ дадЬсаЬсаа ддсдаЬдасд асЬсдадЬсд ЬасддсаддЬ 1020
дсЬдЬассдс дЬасддсдда дддддаЬдЬс дсддсддддд асдаддасдс сдЬддЬддад 1080
дЬддЬддсда адааддЬсдЬ дсЬдасдасд ссддсаЬЬсд асдссдсдда саЬсЬЬдЬсд 1140
сдЬЬссддсЬ ЬддЬддсддс ддсдаасссд ЬЬдааддадд ЬддаЬЬассс дссадЬадсд 1200
ЬЬддЬсдЬЬс ЬЬЬсдЬасда сдЬсдасЬсд аЬЬЬссдсса ЬасассдсдЬ дадЬсасдЬд 1260
дсЬсаЬддсс ЬсадсддсЬЬ ЬддссаасЬс сасссЬсдсс сададддЬсЬ ссдЬасаЬЬа 1320
- 89 029356
ддаассаЕЕЕ асддсадЕас аЕЕаЕЕЕссс аассдЕЕссс ссдЕадсЕсд ЕасдасдсЕЕ 1380
ЕЕаааЕЕЕсд ЕЕддЕддаЕс сассдассдЕ дсадЕддддЕ ссдсддаЕсс ааЕддсЕЕЕд 1440
дсдаЕддадд ЕддаЕсЕдда ЕсЕдааааад адсдддЕЕда Ессдададдд адсЕдсдаад 1500
ссадаадЕсс ЕсддддЕдаа адЕаЕаЕсса ааддсЕаЕЕс сЕсадЕЕЕда ЕаЕЕддЕсаЕ 1560
ЕЕддаЕсдад Еддааааддс сааааЕдаЕд ЕЕааадаасд аааддддддд ЕдсадаЕЕдд 1620
адЕддддЕса ааЕЕддсддд аааЕЕаЕдЕд ЕдсддсдЕсд садЕдддсад аЕдсаЕадаа 1680
ЕЕЕддаЕЕсд аааЕЕдсдда даасЕЕддсд саддааЕЕдд сдадаааааа аЕад 1734
<210> 28 <211> 577 <212> РКТ <213> Ро1уЕоте11а
<400> 28
МеЕ 1 Зег Зег Зег А1а 5 Ьеи Агд Ьеи Ьеи Суз 10 О1у Агд ТЬг Зег РЬе 15 РЬе
Азп Ьеи Суз О1п Ьуз Туг Рго Рго Зег РЬе Ьеи Зег О1п Ьеи Зег ТЬг
20 25 30
Ьеи Азп РЬе Зег ТЬг Н1з Зег Рго РЬе Азр Зег ТЬг Туг Азр Уа1 Уа1
35 40 45
Уа1 Уа1 О1у А1а О1у 11е Зег О1у Ьеи Зег ТЬг А1а О1п А1а Ьеи Зег
50 55 60
11е О1п Н1з Ьуз 11е Азр Азп Уа1 Ьеи Уа1 ТЬг О1и А1а Азр Н1з Агд
65 70 75 80
Уа1 О1у О1у Ьуз 11е ТЬг ТЬг Ьуз Агд Азп Ьуз Азр РЬе Ьеи Тгр О1и
85 90 95
О1и О1у Рго Азп Зег Суз Ьеи МеЕ Азп Азр А1а Ьеи Туг Агд А1а А1а
100 105 110
Агд Азр А1а О1у Уа1 О1и Зег Ьуз 11е Ьеи Зег А1а Азр Рго Ьуз Ьеи
115 120 125
Рго Агд Тгр 11е Ьеи Тгр О1у Агд Агд Ьеи Агд Уа1 А1а Рго 11е О1у
130 135 140
Зег Туг А1а Ьеи Ьуз Зег Азр Ьеи Ьеи Зег ТЬг О1п О1у Ьеи Ьеи Агд
145 150 155 160
- 90 029356
А1а 11е Агд О1у Уа1 165 ТЬг О1у РЬе О1у Уа1 170 Зег Рго А1а Рго Рго 175 Ьуз
О1у О1п О1и О1и Зег Уа1 О1и О1у РЬе Уа1 Агд Агд ТЬг Ьеи О1у Азр
180 185 190
О1и 11е РЬе О1и Агд Ьеи Уа1 О1и Рго РЬе Суз Зег О1у Уа1 Туг А1а
195 200 205
О1у Азр Рго Зег Ьуз Ьеи Зег МеЕ Агд А1а А1а РЬе О1у Ьуз Ьеи Уа1
210 215 220
О1и РЬе О1и О1и ТЬг О1у Азр О1у Зег Ьеи Ьеи Агд О1у Уа1 РЬе Агд
225 230 235 240
Туг Уа1 МеЕ Азп Ьуз Агд Агд О1и Агд Агд ТЬг О1у О1у А1а Ьуз Азр
245 250 255
О1у Азр ТЬг Уа1 Рго Ьеи Азп О1и ТЬг А1а Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Зег
260 265 270
Зег О1у Рго ТЬг Уа1 Зег Зег РЬе О1и О1у О1у 11е О1и 11е Ьеи Рго
275 280 285
Ьуз А1а 11е А1а О1п Ьуз Ьеи О1у Азр Агд Уа1 Агд Ьеи О1у Ьеи Агд
290 295 300
Ьеи Уа1 Агд 11е Азр Рго ТЬг О1п Ьеи А1а Азр О1у ТЬг ТЬг А1а Туг
305 310 315 320
Агд Ьеи Зег Туг Агд Агд МеЕ Зег Нйз О1п О1у Азр Азр Азр Зег Зег
325 330 335
Агд ТЬг А1а О1у А1а Уа1 Рго Агд ТЬг А1а О1и О1у Азр Уа1 А1а А1а
340 345 350
О1у Азр О1и Азр А1а Уа1 Уа1 О1и Уа1 Уа1 А1а Ьуз Ьуз Уа1 Уа1 Ьеи
355 360 365
ТЬг ТЬг Рго А1а РЬе Азр А1а А1а Азр 11е Ьеи Зег Агд Зег О1у Ьеи
370 375 380
Уа1 А1а А1а А1а Азп Рго Ьеи Ьуз О1и Уа1 Азр Туг Рго Рго Уа1 А1а
385 390 395 400
Ьеи Уа1 Уа1 Ьеи Зег Туг Азр Уа1 Азр Зег 11е Зег А1а 11е Нйз Агд
405 410 415
- 91 029356
Уа1 Зег Н1з Уа1 420 А1а Н1з О1у Ьеи Зег 425 О1у РЬе О1у О1п Ьеи 430 Н1з Рго
Агд Рго О1и О1у Ьеи Агд ТЬг Ьеи О1у ТЬг 11е Туг О1у Зег ТЬг Ьеи
435 440 445
РЬе Рго Азп Агд Зег Рго Уа1 А1а Агд ТЬг ТЬг Ьеи Ьеи Азп РЬе Уа1
450 455 460
О1у О1у Зег ТЬг Азр Агд А1а Уа1 О1у Зег А1а Азр Рго МеЕ А1а Ьеи
465 470 475 480
А1а МеЕ О1и Уа1 Азр Ьеи Азр Ьеи Ьуз Ьуз Зег О1у Ьеи 11е Агд О1и
485 490 495
О1у А1а А1а Ьуз Рго О1и Уа1 Ьеи О1у Уа1 Ьуз Уа1 Туг Рго Ьуз А1а
500 505 510
11е Рго О1п РЬе Азр 11е О1у Н1з Ьеи Азр Агд Уа1 О1и Ьуз А1а Ьуз
515 520 525
МеЕ МеЕ Ьеи Ьуз Азп О1и Агд О1у О1у А1а Азр Тгр Зег О1у Уа1 Ьуз
530 535 540
Ьеи А1а О1у Азп Туг Уа1 Суз О1у Уа1 А1а Уа1 О1у Агд Суз 11е О1и
545 550 555 560
РЬе О1у РЬе О1и 11е А1а О1и Азп Ьеи А1а О1п О1и Ьеи А1а Агд Ьуз
565 570 575
Ьуз
<210> 29
<211> 1635
<212> ДНК
<213> ЗогдЬит Ысо1ог
<400> 29
аЕдсЕсдсЕс ддасЕдссас ддЕсЕссЕсс асЕЕсдЕссс асЕсссаЕсс ЕЕаЕсдсссс 60
ассЕссдсЕс дсадЕсЕссд ссЕасдЕссд дЕссЕсдсда ЕддсдддсЕс сдасдасЕсс 120
сдсдсадсЕс ссдссаддЕс ддЕсдссдЕс дЕсддсдссд дддЕсадсдд дсЕсдЕддсд 180
дсдЕасаддс Есаддаадад сддсдЕдааЕ дЕдасддЕдЕ Есдаддсддс сдасадддсд 240
ддаддааада Еасддассаа ЕЕссдадддс дддЬЬЬсЬсЬ дддаЕдаадд адсдаасасс 300
аЕдасадаад дЬдааЬЬдда ддссадЕада сЬдаЬадаЬд аЬсЬсддЬсЬ асаадасааа 360
- 92 029356
садсадЬаЬс сЬаасЬссса асасаадсдЬ ЬасаЬЬдЬса аадаЬддадс ассадсасЬд 420
аЬЬссЬЬсдд аЬсссаЬЬЬс дсЬдаЬдааа адсадЬдЬЬс ЬЬЬсЬасааа аЬсааадаЬЬ 480
дсдЬЬаЬЬЬЬ ЬЬдаассаЬЬ ЬсЬсЬасаад ааадсЬааса саадааассс ЬддаааадЬа 540
ЬсЬдаЬдадс аЬЬЬдадЬда дадЬдЬЬддд адсЬЬсЬЬЬд аасдссасЬЬ сддаададаа 600
дЬЬдЬЬдасЬ аЬсЬЬаЬЬда ЬссаЬЬЬдЬа дсЬддаасаа дЬдсаддада ЬссададЬса 660
сЬаЬсЬаЬЬЬ дЬсаЬдсаЬЬ сссадсасЬд ЬддааЬЬЬдд ааадааааЬа ЬддЬЬсадЬЬ 720
дЬЬдЬЬддЬд ссаЬсЬЬдЬс ЬаадсЬааса дсЬаааддЬд аЬссадЬааа дасаадасдЬ 780
даЬЬсаЬсад сдаааадаад дааЬадасдс дЬдЬсдЬЬЬЬ саЬЬЬсаЬдд ЬддааЬдсад 840
ЬсасЬааЬаа аЬдсасЬЬса сааЬдаадЬЬ ддадаЬдаЬа аЬдЬдаадсЬ ЬддЬасадаа 900
дЬдЬЬдЬсаЬ ЬддсдЬдЬас аЬЬадаЬдда дссссЬдсас саддсдддЬд дЬсааЬЬЬсЬ 960
даЬдаЬЬсда аддаЬдсЬад Ьддсааддас сЬЬдсЬаааа ассааассЬЬ ЬдаЬдсЬдЬЬ 1020
аЬааЬдасад сЬссаЬЬдЬс аааЬдЬссад аддаЬдаадЬ Ьсасаааадд ЬддадсЬссЬ 1080
ЬЬЬдЬЬсЬад асЬЬЬсЬЬсс ЬааддЬддаЬ ЬаЬсЬассас ЬаЬсЬсЬсаЬ ддЬдасЬдсЬ 1140
ЬЬЬаадаадд аадаЬдЬсаа дааассЬсЬд дааддаЬЬЬд дсдЬсЬЬааЬ асссЬасаад 1200
даасадсааа аасаЬддЬсЬ ааааасссЬЬ дддасЬсЬсЬ ЬсЬссЬсааЬ даЬдЬЬссса 1260
даЬсдадсЬс сЬдасдасса аЬаЬЬЬаЬаЬ асаасаЬЬЬд ЬЬдддддЬад ссасааЬада 1320
даЬсЬЬдсЬд дадсЬссаас дЬсЬаЬЬсЬд ааасаасЬЬд ЬдассЬсЬда ссЬЬаааааа 1380
сЬсЬЬаддсд Ьасаддддса ассаасЬЬЬЬ дЬсаадсаЬа ЬаЬасЬдддд аааЬдсЬЬЬЬ 1440
ссЬЬЬдЬаЬд дЬсаЬдаЬЬа сааЬЬсЬдЬа ЬЬддаадсЬа ЬадаааадаЬ ддадаааааЬ 1500
сЬЬссадддЬ ЬсЬЬсЬасдс аддаааЬаас ааддаЬдддс ЬЬдсЬдЬЬдд дадЬдЬЬаЬа 1560
дсЬЬсаддаа дсааддсЬдс ЬдассЬЬдса аЬсЬсдЬаЬс ЬЬдааЬсЬса сассаадсаЬ 1620
ааЬааЬЬЬас аЬЬда 1635
<210> 30
<211> 544
<212> РКТ <213> ЗогдЬит
<400> 30
МеЬ Ьеи А1а Агд ТЬг А1а ТЬг Уа1 Зег Зег ТЬг Зег Зег Н1з Зег Н1з
1 5 10 15
Рго Туг Агд Рго ТЬг Зег А1а Агд Зег Ьеи Агд Ьеи Агд Рго Уа1 Ьеи 20 25 30
А1а МеЬ А1а О1у Зег Азр Азр Зег Агд А1а А1а Рго А1а Агд Зег Уа1 35 40 45
- 93 029356
А1а Уа1 50 Уа1 О1у А1а О1у Уа1 55 Зег О1у Ьеи Уа1 А1а 60 А1а Туг Агд Ьеи
Агд Ьуз Зег О1у Уа1 Азп Уа1 ТЬг Уа1 РЬе О1и А1а А1а Азр Агд А1а
65 70 75 80
О1у О1у Ьуз 11е Агд ТЬг Азп Зег О1и О1у О1у РЬе Ьеи Тгр Азр О1и
85 90 95
О1у А1а Азп ТЬг МеР ТЬг О1и О1у О1и Ьеи О1и А1а Зег Агд Ьеи 11е
100 105 110
Азр Азр Ьеи О1у Ьеи О1п Азр Ьуз О1п О1п Туг Рго Азп Зег О1п Н1з
115 120 125
Ьуз Агд Туг 11е Уа1 Ьуз Азр О1у А1а Рго А1а Ьеи 11е Рго Зег Азр
130 135 140
Рго 11е Зег Ьеи МеР Ьуз Зег Зег Уа1 Ьеи Зег ТЬг Ьуз Зег Ьуз 11е
145 150 155 160
А1а Ьеи РЬе РЬе О1и Рго РЬе Ьеи Туг Ьуз Ьуз А1а Азп ТЬг Агд Азп
165 170 175
Рго О1у Ьуз Уа1 Зег Азр О1и Н1з Ьеи Зег О1и Зег Уа1 О1у Зег РЬе
180 185 190
РЬе О1и Агд Н1з РЬе О1у Агд О1и Уа1 Уа1 Азр Туг Ьеи 11е Азр Рго
195 200 205
РЬе Уа1 А1а О1у ТЬг Зег А1а О1у Азр Рго О1и Зег Ьеи Зег 11е Суз
210 215 220
Н1з А1а РЬе Рго А1а Ьеи Тгр Азп Ьеи О1и Агд Ьуз Туг О1у Зег Уа1
225 230 235 240
Уа1 Уа1 О1у А1а 11е Ьеи Зег Ьуз Ьеи ТЬг А1а Ьуз О1у Азр Рго Уа1
245 250 255
Ьуз ТЬг Агд Агд Азр Зег Зег А1а Ьуз Агд Агд Азп Агд Агд Уа1 Зег
260 265 270
РЬе Зег РЬе Н1з О1у О1у МеР О1п Зег Ьеи 11е Азп А1а Ьеи Н1з Азп
275 280 285
О1и Уа1 О1у Азр Азр Азп Уа1 Ьуз Ьеи О1у ТЬг О1и Уа1 Ьеи Зег Ьеи
290 295 300
- 94 029356
А1а 305 Суз ТЬг Ьеи Азр О1у А1а 310 Рго А1а Рго О1у 315 О1у Тгр Зег 11е Зег 320
Азр Азр Зег Ьуз Азр А1а Зег О1у Ьуз Азр Ьеи А1а Ьуз Азп О1п ТЬг
325 330 335
РЬе Азр А1а Уа1 11е МеЕ ТЬг А1а Рго Ьеи Зег Азп Уа1 О1п Агд МеЕ
340 345 350
Ьуз РЬе ТЬг Ьуз О1у О1у А1а Рго РЬе Уа1 Ьеи Азр РЬе Ьеи Рго Ьуз
355 360 365
Уа1 Азр Туг Ьеи Рго Ьеи Зег Ьеи МеЕ Уа1 ТЬг А1а РЬе Ьуз Ьуз О1и
370 375 380
Азр Уа1 Ьуз Ьуз Рго Ьеи О1и О1у РЬе О1у Уа1 Ьеи 11е Рго Туг Ьуз
385 390 395 400
О1и О1п О1п Ьуз Нтз О1у Ьеи Ьуз ТЬг Ьеи О1у ТЬг Ьеи РЬе Зег Зег
405 410 415
МеЕ МеЕ РЬе Рго Азр Агд А1а Рго Азр Азр О1п Туг Ьеи Туг ТЬг ТЬг
420 425 430
РЬе Уа1 О1у О1у Зег Нтз Азп Агд Азр Ьеи А1а О1у А1а Рго ТЬг Зег
435 440 445
11е Ьеи Ьуз О1п Ьеи Уа1 ТЬг Зег Азр Ьеи Ьуз Ьуз Ьеи Ьеи О1у Уа1
450 455 460
О1п О1у О1п Рго ТЬг РЬе Уа1 Ьуз Нтз 11е Туг Тгр О1у Азп А1а РЬе
465 470 475 480
Рго Ьеи Туг О1у Нтз Азр Туг Азп Зег Уа1 Ьеи О1и А1а 11е О1и Ьуз
485 490 495
МеЕ О1и Ьуз Азп Ьеи Рго О1у РЬе РЬе Туг А1а О1у Азп Азп Ьуз Азр
500 505 510
О1у Ьеи А1а Уа1 О1у Зег Уа1 11е А1а Зег О1у Зег Ьуз А1а А1а Азр
515 520 525
Ьеи А1а 11е Зег Туг Ьеи О1и Зег Нтз ТЬг Ьуз Нтз Азп Азп Ьеи Нтз
530 535 540
<210> 31
- 95 029356
<211> 1017
<212> ДНК
<213> СЬ1оге11а зр
<400> 31
аЕддссЕсса садсаасасЕ дсасддсдсд сссЕдсЕдсЕ сддсдсддсс сдЕдддссдс 60
сддсаЕаЕЕд садсассдад саЕссадсас ааЕдддссдс дссЕддсддс садддЕдсад 120
садсддаадд дддсадддда дсддсдсЕсд дсасЕдсдЕд ЕдсаддссдЕ ссаддссссЕ 180
сссдадаадд сдддддсдад сасадддадс дсадсадасд асадсддсдЕ ЕЕасдасдЕЕ 240
дЕддЕсдЕдд дсдссддсаЕ сЕссддссЕс ассассдссс аддсдсЕдас сасдсадсас 300
адсддсдЕдд сдсддсдддЕ дсЕддЕдасс дадддссдсд ассдсдЕддд сддсаасаЕс 360
ассЕссдЕдЕ ссаасаадда ддаддддсЕд сЕдЕдддадд аддддсссаа сЕссЕЕссад 420
ссааасдасЕ ссаЕссЕдса ддссдсддЕд дасдссддсд Еддсддасса дсЕддЕасЕд 480
ддсдасссса сддсдссдсд ЕЕЕЕдЕдЕас Едддасаада адсЕдсдссс сасдсссЕсс 540
ддссссдасд сдсЕсасдЕЕ сдассЕдаЕд адсаЕсдЕдд дсаадаЕссд ддсддддсЕд 600
ддсдсдсЕдд дсЕЕсааддс дсссаЕдсса дасЕаЕдадд ададсдЕдда дсадЕаЕдЕд 660
сддсдсаасс Едддддссда ддЕдЕЕЕдад сдссЕдаЕсд адсссЕЕсЕд садсддсдЕд 720
Еасдссддсд ассссаадаа дсЕдЕссаЕд ааддсддссЕ ЕЕддсааддЕ дЕасдассЕд 780
дадаадаадд дсддсадсаЕ сдЕдддсддс дЕдаЕсаадс ЕдаЕЕсадда дсддсдсдсс 840
аасссдссдс сдссдсдсад сссадсдсЕд ссдсссаадс ссдсдддсса дасддЕдддс 900
ЕссЕЕссдсЕ ссддссЕдсд сасдсЕдссд даЕдссаЕдд сддсдсддсЕ дддадасдсд 960
дЕдсдсасса дсЕддсадсЕ сааддадсЕс адсааддаад дддаддссЕа саадЕда 1017
<210> 32
<211> 338
<212> РКТ
<213> СЬ1оге11а
<400> 32
МеЕ А1а Бег ТЬг .
1
10
15
Рго Уа1 О1у Агд Агд Н1з 11е А1а А1а Рго Бег 11е О1п Н1з Азп О1у 20 25 30
Рго Агд Ьеи А1а А1а Агд Уа1 О1п О1п Агд Ьуз О1у А1а О1у О1и Агд 35 40 45
Агд Бег А1а Ьеи Агд Уа1 О1п А1а Уа1 О1п А1а Рго Рго О1и Ьуз А1а 50 55 60
- 96 029356
О1у А1а 65 Зег ТЬг О1у Зег 70 А1а А1а Азр Азр Зег О1у Уа1 75 Туг Азр Уа1 80
Уа1 Уа1 Уа1 О1у А1а О1у 11е Зег О1у Ьеи ТЬг ТЬг А1а О1п А1а Ьеи
85 90 95
ТЬг ТЬг О1п Нбз Зег О1у Уа1 А1а Агд Агд Уа1 Ьеи Уа1 ТЬг О1и О1у
100 105 110
Агд Азр Агд Уа1 О1у О1у Азп 11е ТЬг Зег Уа1 Зег Азп Ьуз О1и О1и
115 120 125
О1у Ьеи Ьеи Тгр О1и О1и О1у Рго Азп Зег РЬе О1п Рго Азп Азр Зег
130 135 140
11е Ьеи О1п А1а А1а Уа1 Азр А1а О1у Уа1 А1а Азр О1п Ьеи Уа1 Ьеи
145 150 155 160
О1у Азр Рго ТЬг А1а Рго Агд РЬе Уа1 Туг Тгр Азр Ьуз Ьуз Ьеи Агд
165 170 175
Рго ТЬг Рго Зег О1у Рго Азр А1а Ьеи ТЬг РЬе Азр Ьеи МеЕ Зег 11е
180 185 190
Уа1 О1у Ьуз 11е Агд А1а О1у Ьеи О1у А1а Ьеи О1у РЬе Ьуз А1а Рго
195 200 205
МеЕ Рго Азр Туг О1и О1и Зег Уа1 О1и О1п Туг Уа1 Агд Агд Азп Ьеи
210 215 220
О1у А1а О1и Уа1 РЬе О1и Агд Ьеи 11е О1и Рго РЬе Суз Зег О1у Уа1
225 230 235 240
Туг А1а О1у Азр Рго Ьуз Ьуз Ьеи Зег МеЕ Ьуз А1а А1а РЬе О1у Ьуз
245 250 255
Уа1 Туг Азр Ьеи О1и Ьуз Ьуз О1у О1у Зег 11е Уа1 О1у О1у Уа1 11е
260 265 270
Ьуз Ьеи 11е О1п О1и Агд Агд А1а Азп Рго Рго Рго Рго Агд Зег Рго
275 280 285
А1а Ьеи Рго Рго Ьуз Рго А1а О1у О1п ТЬг Уа1 О1у Зег РЬе Агд Зег
290 295 300
О1у Ьеи Агд ТЬг Ьеи Рго Азр А1а МеЕ А1а А1а Агд Ьеи О1у Азр А1а
305 310 315 320
- 97 029356
Уа1 Агд ТЬг Зег Тгр О1п Ьеи Ьуз О1и Ьеи Зег Ьуз О1и О1у О1и А1а
Туг Ьуз 325 330 335
<210> 33 <211> 1611 <212> ДНК <213> Огуда заГОиа <400> 33 аЬддссдссд ссдссдсадс саЬддссасс дссассЬссд ссасддсадс дссдссдсЬс 60
сдсаЬЬсдсд асдссдсдад даддасссдс сдасдсддсс асдЬЬсдсЬд сдссдЬсдсс 120
адсддсдсдд ссдаддсдсс сдсддсдссс ддддсдсддд ЬдЬсддсдда сЬдсдЬсдЬд 180
дЬдддсддсд дсаЬсадсдд дсЬсЬдсасс дсдсаддсдс Ьддссасааа дсасддсдЬс 240
ддсдасдЬдс ЬсдЬсасдда ддсссдсдсс сдссссддсд дсаасаЬсас сассдссдад 300
сдсдссддсд адддсЬассЬ сЬдддаддад дддсссааса дсЬЬссадсс ЬЬссдасссс 360
дЬссЬсасса ЬддссдЬдда садсдддсЬс ааддасдаЬс ЬсдЬдЬЬсдд ддассссаас 420
дсдссдсддЬ ЬсдЬдсЬдЬд ддаддддаад сЬааддссдд ЬдссдЬссаа дсссддсдас 480
сЬдссдЬЬсЬ ЬсдассЬсаЬ дадсаЬсссс ддсаадсЬса дддссддссЬ ЬддсдсдсЬс 540
ддсдЬЬсдад сдссассЬсс адддсдЬдад дадЬсддЬдд аддасЬЬсдЬ дсддсдсаас 600
сЬсддсдсдд аддЬсЬЬЬда дсдссЬсаЬЬ дадссЬЬЬсЬ дсЬсаддЬдЬ дЬаЬдсЬддЬ 660
даЬссЬЬсаа адсЬсадЬаЬ дааддсЬдса ЬЬЬдддаадд ЬдЬддаддсЬ ддаддаЬасЬ 720
ддаддЬадса ЬЬаЬЬддЬдд аассаЬсааа асааЬссадд ададддддаа ааассссааа 780
ссдссдаддд аЬссссдссЬ Ьссаасдсса ааддддсада садЬЬдсаЬс ЬЬЬсаддаад 840
ддЬсЬдасЬа ЬдсЬсссдда ЬдсЬаЬЬаса ЬсЬаддЬЬдд дЬадсааадЬ сааасЬЬЬса 900
ЬддаадЬЬда саадсаЬЬас ааадЬсадас аасаааддаЬ аЬдсаЬЬадЬ дЬаЬдаааса 960
ссадаадддд ЬддЬсЬсддЬ дсаадсЬааа асЬдЬЬдЬса ЬдассаЬссс аЬсаЬаЬдЬЬ 1020
дсЬадЬдаЬа ЬсЬЬдсддсс асЬЬЬсаадЬ даЬдсадсад аЬдсЬсЬдЬс ааЬаЬЬсЬаЬ 1080
ЬаЬссассад ЬЬдсЬдсЬдЬ аасЬдЬЬЬса ЬаЬссаааад аадсааЬЬад аааадааЬдс 1140
ЬЬааЬЬдасд дададсЬсса дддЬЬЬсддс садсЬдсаЬс сдсдЬадЬса дддадЬЬдад 1200
асЬЬЬаддаа сааЬаЬаЬад сЬсаЬсасЬс ЬЬЬссаааЬс дЬдсЬссадс ЬддаадддЬд 1260
ЬЬасЬЬсЬда асЬасаЬадд аддЬЬсЬаса ааЬасаддда ЬЬдЬЬЬссаа дасЬдааадЬ 1320
дадсЬддЬад аадсадЬЬда ссдЬдассЬс аддаадаЬдс ЬдаЬаааЬсс ЬааадсадЬд 1380
дасссЬЬЬдд ЬссЬЬддсдЬ ссдддЬаЬдд ссасаадсса ЬассасадЬЬ ссЬсаЬЬддс 1440
- 98 029356
саЕсЕЕдаЕс аЕсЕЕдаддс ЕдсааааЕсЕ дсссЕдддса ааддЕддЕЕа ЕдаЕддаЕЕд 1500
ЕЕссЕсддад ддаасЕаЕдЕ ЕдсаддадЕЕ дсссЕдддсс даЕдсдЕЕда аддЕдсаЕаЕ 1560
дададЕдссЕ сасаааЕаЕс ЕдасЕасЕЕд ассаадЕасд ссЕасаадЕд а 1611
<210> 34
<211> 536
<212> РКТ
<213> 0гу2а заЬв/а
<400> 34
МеЕ 1 А1а А1а А1а А1а А1а 5 А1а МеЕ А1а ТЬг А1а 10 ТЬг Зег А1а ТЬг 15 А1а
А1а Рго Рго Ьеи Агд 11е Агд Азр А1а А1а Агд Агд ТЬг Агд Агд Агд
20 25 30
О1у Н1з Уа1 Агд Суз А1а Уа1 А1а Зег О1у А1а А1а О1и А1а Рго А1а
35 40 45
А1а Рго О1у А1а Агд Уа1 Зег А1а Азр Суз Уа1 Уа1 Уа1 О1у О1у О1у
50 55 60
11е Зег О1у Ьеи Суз ТЬг А1а О1п А1а Ьеи А1а ТЬг Ьуз Н1з О1у Уа1
65 70 75 80
О1у Азр Уа1 Ьеи Уа1 ТЬг О1и А1а Агд А1а Агд Рго О1у О1у Азп 11е
85 90 95
ТЬг ТЬг А1а О1и Агд А1а О1у О1и О1у Туг Ьеи Тгр О1и О1и О1у Рго
100 105 110
Азп Зег РЬе О1п Рго Зег Азр Рго Уа1 Ьеи ТЬг МеЕ А1а Уа1 Азр Зег
115 120 125
О1у Ьеи Ьуз Азр Азр Ьеи Уа1 РЬе О1у Азр Рго Азп А1а Рго Агд РЬе
130 135 140
Уа1 Ьеи Тгр О1и О1у Ьуз Ьеи Агд Рго Уа1 Рго Зег Ьуз Рго О1у Азр
145 150 155 160
Ьеи Рго РЬе РЬе Азр Ьеи МеЕ Зег 11е Рго О1у Ьуз Ьеи Агд А1а О1у
165 170 175
Ьеи О1у А1а Ьеи О1у Уа1 Агд А1а Рго Рго Рго О1у Агд О1и О1и Зег
180 185 190
Уа1 О1и Азр РЬе Уа1 Агд Агд Азп Ьеи О1у А1а О1и Уа1 РЬе О1и Агд
- 99 029356
195 200 205
Ьеи 11е О1и Рго РЬе Суз Зег О1у Уа1 Туг А1а О1у Азр Рго Зег Ьуз
210 215 220
Ьеи Зег МеЕ Ьуз А1а А1а РЬе О1у Ьуз Уа1 Тгр Агд Ьеи О1и Азр ТЬг
225 230 235 240
О1у О1у Зег 11е 11е О1у О1у ТЬг 11е Ьуз ТЬг 11е О1п О1и Агд О1у
245 250 255
Ьуз Азп Рго Ьуз Рго Рго Агд Азр Рго Агд Ьеи Рго ТЬг Рго Ьуз О1у
260 265 270
О1п ТЬг Уа1 А1а Зег РЬе Агд Ьуз О1у Ьеи ТЬг МеЕ Ьеи Рго Азр А1а
275 280 285
11е ТЬг Зег Агд Ьеи О1у Зег Ьуз Уа1 Ьуз Ьеи Зег Тгр Ьуз Ьеи ТЬг
290 295 300
Зег 11е ТЬг Ьуз Зег Азр Азп Ьуз О1у Туг А1а Ьеи Уа1 Туг О1и ТЬг
305 310 315 320
Рго О1и О1у Уа1 Уа1 Зег Уа1 О1п А1а Ьуз ТЬг Уа1 Уа1 МеЕ ТЬг 11е
325 330 335
Рго Зег Туг Уа1 А1а Зег Азр 11е Ьеи Агд Рго Ьеи Зег Зег Азр А1а
340 345 350
А1а Азр А1а Ьеи Зег 11е РЬе Туг Туг Рго Рго Уа1 А1а А1а Уа1 ТЬг
355 360 365
Уа1 Зег Туг Рго Ьуз О1и А1а 11е Агд Ьуз О1и Суз Ьеи 11е Азр О1у
370 375 380
О1и Ьеи О1п О1у РЬе О1у О1п Ьеи Н1з Рго Агд Зег О1п О1у Уа1 О1и
385 390 395 400
ТЬг Ьеи О1у ТЬг 11е Туг Зег Зег Зег Ьеи РЬе Рго Азп Агд А1а Рго
405 410 415
А1а О1у Агд Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи Азп Туг 11е О1у О1у Зег ТЬг Азп ТЬг
420 425 430
О1у 11е Уа1 Зег Ьуз ТЬг О1и Зег О1и Ьеи Уа1 О1и А1а Уа1 Азр Агд
435 440 445
- 100
029356
Азр Ьеи 450 Агд Ьуз МеЬ Ьеи 11е Азп Рго 455 Ьуз А1а Уа1 460 Азр Рго Ьеи Уа1
Ьеи О1у Уа1 Агд Уа1 Тгр Рго Ο1η А1а 11е Рго Ο1η РЬе Ьеи 11е О1у
465 470 475 480
Н1з Ьеи Азр Н1з Ьеи О1и А1а А1а Ьуз Зег А1а Ьеи О1у Ьуз О1у О1у
485 490 495
Туг Азр О1у Ьеи РЬе Ьеи О1у О1у Азп Туг Уа1 А1а О1у Уа1 А1а Ьеи
500 505 510
О1у Агд Суз Уа1 О1и О1у А1а Туг О1и Зег А1а Зег Ο1η 11е Зег Азр
515 520 525
Туг Ьеи ТЬг Ьуз Туг А1а Туг Ьуз
530 535
<210> 35 <211> 1518 <212> ДНК <213> АтагапЬЬиз ЬиЬегси1аЬиз
<400> 35 аЬдддсааса ЬЬЬсЬдадсд ддаЬдаассс асЬЬсЬдсЬа ааадддЬЬдс ЬдЬЬдЬЬддЬ 60
дсЬддадЬЬа дЬддасЬЬдс ЬдсЬдсаЬаЬ аадсЬааааЬ сссаЬддЬЬЬ дааЬдЬдаса 120
ЬЬдЬЬЬдаад сЬдаЬЬсЬад адсЬддаддс ааасЬЬаааа сЬдЬЬааааа адаЬддЬЬЬЬ 180
аЬЬЬдддаЬд адддддсааа ЬасЬаЬдаса дааадЬдадд садаадЬсЬс дадЬЬЬдаЬс 240
даЬдаЬсЬЬд ддсЬЬсдЬда даадсаасад ЬЬдссааЬЬЬ сасааааЬаа аадаЬасаЬа 300
дсЬададаЬд дЬсЬЬссЬдЬ дсЬасЬассЬ ЬсаааЬсссд сЬдсасЬдсЬ сасдадсааЬ 360
аЬссЬЬЬсад сааааЬсааа дсЬдсаааЬЬ аЬдЬЬддаас саЬЬЬЬЬсЬд дадаааасас 420
ааЬдсЬасЬд адсЬЬЬсЬда ЬдадсаЬдЬЬ саддааадсд ЬЬддЬдааЬЬ ЬЬЬЬдадсда 480
саЬЬЬЬддда аададЬЬЬдЬ ЬдаЬЬаЬдЬЬ аЬЬдасссЬЬ ЬЬдЬЬдсддд ЬасаЬдЬддЬ 540
ддадаЬссЬс ааЬсдсЬЬЬс ЬаЬдсассаЬ асаЬЬЬссад аадЬаЬддаа ЬаЬЬдааааа 600
аддЬЬЬддсЬ сЬдЬдЬЬЬдс ЬддасЬааЬЬ сааЬсаасаЬ ЬдЬЬаЬсЬаа дааддаааад 660
ддЬддаддад даааЬдсЬЬс ЬаЬсаадаад ссЬсдЬдЬас дЬддЬЬсаЬЬ ЬЬсаЬЬссаЬ 720
ддЬддааЬдс адасасЬЬдЬ ЬдасасааЬа Ьдсааасадс ЬЬддЬдаада ЬдаасЬсааа 780
сЬссадЬдЬд аддЬдсЬдЬс сЬЬдЬсаЬас аассадаадд ддаЬсссЬЬс аЬЬадддааЬ 840
ЬддЬсадЬсЬ сЬЬсЬаЬдЬс аааЬааЬасс адЬдаадаЬс ааЬсЬЬаЬда ЬдсЬдЬддЬЬ 900
дЬсасЬдсЬс сааЬЬсдсаа ЬдЬсааадаа аЬдаадаЬЬа ЬдаааЬЬсдд аааЬссаЬЬЬ 960
ЬсасЬЬдасЬ ЬЬаЬЬссада ддЬдадЬЬас дЬассссЬсЬ сЬдЬЬаЬдаЬ ЬасЬдсаЬЬс 1020
- 101 029356
аадааддаЬа аадЬдаадад ассасЬсдад ддсЬЬЬддад ЬЬсЬЬаЬссс сЬсЬааадад 1080
саасаЬааЬд дасЬдаадас ЬсЬЬддЬасЬ ЬЬаЬЬЬЬссЬ ссаЬдаЬдЬЬ ЬсссдаЬсдЬ 1140
дсЬссаЬсЬд асаЬдЬдЬсЬ сЬЬЬасЬаса ЬЬЬдЬсддад даадсадааа ЬадаааасЬЬ 1200
дсааасдсЬЬ саасддаЬда аЬЬдаадсаа аЬадЬЬЬсЬЬ сЬдассЬЬса дсадсЬдЬЬд 1260
ддсасЬдадд асдаассЬЬс аЬЬЬдЬсааЬ саЬсЬсЬЬЬЬ ддадсаасдс аЬЬсссдЬЬд 1320
ЬаЬддасаса аЬЬасдаЬЬс ЬдЬЬЬЬдада дссаЬадаса адаЬддаааа ддаЬсЬЬссЬ 1380
ддаЬЬЬЬЬЬЬ аЬдсаддЬаа ссаЬаадддЬ ддасЬЬЬсад Ьдддаааадс даЬддссЬсс 1440
ддаЬдсаадд сЬдсддаасЬ ЬдЬааЬаЬсс ЬаЬсЬддасЬ сЬсаЬаЬаЬа ЬдЬдаадаЬд 1500
даЬдадаада ссдсдЬаа 1518
<210> 36
<211> 505
<212> РКТ <213> АтагапЬЬиз
<400> 36
МеЬ О1у Азп 11е Зег О1и Агд Азр О1и Рго ТЬг Зег А1а Ьуз Агд Уа1
1 5 10 15
А1а Уа1 Уа1 О1у А1а О1у Уа1 Зег О1у Ьеи А1а А1а А1а Туг Ьуз Ьеи
20 25 30
Ьуз Зег Н1з О1у Ьеи Азп Уа1 ТЬг Ьеи РЬе О1и А1а Азр Зег Агд А1а
35 40 45
О1у О1у Ьуз Ьеи Ьуз ТЬг Уа1 Ьуз Ьуз Азр О1у РЬе 11е Тгр Азр О1и
50 55 60
О1у А1а Азп ТЬг МеЬ ТЬг О1и Зег О1и А1а О1и Уа1 Зег Зег Ьеи 11е
65 70 75 80
Азр Азр Ьеи О1у Ьеи Агд О1и Ьуз О1п О1п Ьеи Рго 11е Зег О1п Азп
85 90 95
Ьуз Агд Туг 11е А1а Агд Азр О1у Ьеи Рго Уа1 Ьеи Ьеи Рго Зег Азп
100 105 110
Рго А1а А1а Ьеи Ьеи ТЬг Зег Азп 11е Ьеи Зег А1а Ьуз Зег Ьуз Ьеи
115 120 125
О1п 11е МеЬ Ьеи О1и Рго РЬе РЬе Тгр Агд Ьуз Н1з Азп А1а ТЬг О1и
130 135 140
- 102
029356
Ьеи 145 Зег Азр О1и Н1з Уа1 150 О1п О1и Зег Уа1 О1у 155 О1и РЬе РЬе О1и Агд 160
Н1з РЬе О1у Ьуз О1и РЬе Уа1 Азр Туг Уа1 11е Азр Рго РЬе Уа1 А1а
165 170 175
О1у ТЬг Суз О1у О1у Азр Рго О1п Зег Ьеи Зег МеЬ Н1з Н1з ТЬг РЬе
180 185 190
Рго О1и Уа1 Тгр Азп 11е О1и Ьуз Агд РЬе О1у Зег Уа1 РЬе А1а О1у
195 200 205
Ьеи 11е О1п Зег ТЬг Ьеи Ьеи Зег Ьуз Ьуз О1и Ьуз О1у О1у О1у О1у
210 215 220
Азп А1а Зег 11е Ьуз Ьуз Рго Агд Уа1 Агд О1у Зег РЬе Зег РЬе Н1з
225 230 235 240
О1у О1у МеЬ О1п ТЬг Ьеи Уа1 Азр ТЬг 11е Суз Ьуз О1п Ьеи О1у О1и
245 250 255
Азр О1и Ьеи Ьуз Ьеи О1п Суз О1и Уа1 Ьеи Зег Ьеи Зег Туг Азп О1п
260 265 270
Ьуз О1у 11е Рго Зег Ьеи О1у Азп Тгр Зег Уа1 Зег Зег МеЬ Зег Азп
275 280 285
Азп ТЬг Зег О1и Азр О1п Зег Туг Азр А1а Уа1 Уа1 Уа1 ТЬг А1а Рго
290 295 300
11е Агд Азп Уа1 Ьуз О1и МеЬ Ьуз 11е МеЬ Ьуз РЬе О1у Азп Рго РЬе
305 310 315 320
Зег Ьеи Азр РЬе 11е Рго О1и Уа1 Зег Туг Уа1 Рго Ьеи Зег Уа1 МеЬ
325 330 335
11е ТЬг А1а РЬе Ьуз Ьуз Азр Ьуз Уа1 Ьуз Агд Рго Ьеи О1и О1у РЬе
340 345 350
О1у Уа1 Ьеи 11е Рго Зег Ьуз О1и О1п Н1з Азп О1у Ьеи Ьуз ТЬг Ьеи
355 360 365
О1у ТЬг Ьеи РЬе Зег Зег МеЬ МеЬ РЬе Рго Азр Агд А1а Рго Зег Азр
370 375 380
МеЬ Суз Ьеи РЬе ТЬг ТЬг РЬе Уа1 О1у О1у Зег Агд Азп Агд Ьуз Ьеи
385 390 395 400
- 103
029356
А1а Азп А1а Зег ТЬг 405 Азр О1и Ьеи Ьуз О1п 410 11е Уа1 Зег Зег Азр 415 Ьеи
О1п О1п Ьеи Ьеи О1у ТЬг О1и Азр О1и Рго Зег РЬе Уа1 Азп Н1з Ьеи
420 425 430
РЬе Тгр Зег Азп А1а РЬе Рго Ьеи Туг О1у Н1з Азп Туг Азр Зег Уа1
435 440 445
Ьеи Агд А1а 11е Азр Ьуз МеЬ О1и Ьуз Азр Ьеи Рго О1у РЬе РЬе Туг
450 455 460
А1а О1у Азп Н1з Ьуз О1у О1у Ьеи Зег Уа1 О1у Ьуз А1а МеЬ А1а Зег
465 470 475 480
О1у Суз Ьуз А1а А1а О1и Ьеи Уа1 11е Зег Туг Ьеи Азр Зег Н1з 11е
485 490 495
Туг Уа1 Ьуз МеЬ Азр О1и Ьуз ТЬг А1а
500 505
<210> 37 <211> 1521 <212> ДНК <213> АгаЫДорз1з ЬЬаНапа <400> 37 аЬддадЬЬаЬ сЬсЬЬсЬссд ЬссдасдасЬ сааЬсдсЬЬс ЬЬссдЬсдЬЬ ЬЬсдаадссс 60
ааЬсЬссдаЬ ЬаааЬдЬЬЬа ЬаадссЬсЬЬ адасЬссдЬЬ дЬЬсадЬддс сддЬддасса 120
ассдЬсддаЬ сЬЬсаааааЬ сдааддсдда ддаддсасса ссаЬсасдас ддаЬЬдЬдЬд 180
аЬЬдЬсддсд даддЬаЬЬад ЬддЬсЬЬЬдс аЬсдсЬсадд сдсЬЬдсЬас ЬаадсаЬссЬ 240
даЬдсЬдсЬс сдааЬЬЬааЬ ЬдЬдассдад дсЬааддаЬс дЬдЬЬддадд саасаЬЬаЬс 300
асЬсдЬдаад адааЬддЬЬЬ ЬсЬсЬдддаа дааддЬссса аЬадЬЬЬЬса ассдЬсЬдаЬ 360
ссЬаЬдсЬса сЬаЬддЬддЬ адаЬадЬддЬ ЬЬдааддаЬд аЬЬЬддЬдЬЬ дддадаЬссЬ 420
асЬдсдссаа ддЬЬЬдЬдЬЬ дЬддааЬддд аааЬЬдаддс сддЬЬссаЬс даадсЬааса 480
дасЬЬассдЬ ЬсЬЬЬдаЬЬЬ даЬдадЬаЬЬ ддЬдддаада ЬЬададсЬдд ЬЬЬЬддЬдса 540
сЬЬддсаЬЬс дассдЬсасс ЬссаддЬсдЬ даадааЬсЬд ЬддаддадЬЬ ЬдЬасддсдЬ 600
аассЬсддЬд аЬдаддЬЬЬЬ ЬдадсдссЬд аЬЬдаассдЬ ЬЬЬдЬЬсадд ЬдЬЬЬаЬдсЬ 660
ддЬдаЬссЬЬ саааасЬдад саЬдааадса дсдЬЬЬддда аддЬЬЬддаа асЬададсаа 720
ааЬддЬддаа дсаЬааЬадд ЬддЬасЬЬЬЬ ааддсааЬЬс аддададдаа ааасдсЬссс 780
ааддсадаас дадасссдсд ссЬдссаааа ссасадддсс ааасадЬЬдд ЬЬсЬЬЬсадд 840
- 104 029356
аадддасЬЬс дааЬдЬЬдсс адаадсааЬа ЬсЬдсаадаЬ ЬаддЬадсаа адЬЬаадЬЬд 900
ЬсЬЬддаадс ЬсЬсаддЬаЬ сасЬаадсЬд дададсддад даЬасаасЬЬ аасаЬаЬдад 960
асЬссадаЬд дЬЬЬадЬЬЬс сдЬдсададс аааадЬдЬЬд ЬааЬдасддЬ дссаЬсЬсаЬ 1020
дЬЬдсаадЬд дЬсЬсЬЬдсд СССЁСЬЬЬСЬ дааЬсЬдсЬд саааЬдсасЬ сЬсаааасЬа 1080
ЬаЬЬасссас садЬЬдсадс адЬаЬсЬаЬс ЬсдЬасссда аадаадсааЬ ссдаасадаа 1140
ЬдЬЬЬдаЬад аЬддЬдаасЬ ааадддЬЬЬЬ дддсааЬЬдс аЬссасдсас дсааддадЬЬ 1200
дааасаЬЬад даасЬаЬсЬа садсЬссЬса сЬсЬЬЬссаа аЬсдсдсасс дсссддаада 1260
аЬЬЬЬдсЬдЬ ЬдаасЬасаЬ ЬддсдддЬсЬ асааасассд дааЬЬсЬдЬс саадЬсЬдаа 1320
ддЬдадЬЬад ЬддаадсаЬЬ ЬсЬадЬЬддЬ сасЬЬЬдаЬа ЬссЬЬдасас ддсЬаааЬса 1380
ЬсЬсЬаасдЬ сЬЬсдддсЬа сдаадддсЬа ЬЬЬЬЬдддЬд дсааЬЬасдЬ сдсЬддЬдЬа 1440
дссЬЬаддсс ддЬдЬдЬада аддсдсаЬаЬ дааассдсда ЬЬдаддЬсаа саасЬЬсаЬд 1500
ЬсасддЬасд сЬЬасаадЬа а 1521
<210> 38
<211> 506
<212> РКТ <213> АгаЫДорзтз
<400> 38
МеЬ 1 О1и Ьеи Зег Ьеи 5 Ьеи Агд Рго ТЬг ТЬг 10 О1п Зег Ьеи Ьеи Рго 15 Зег
РЬе Зег Ьуз Рго 20 Азп Ьеи Агд Ьеи Азп 25 Уа1 Туг Ьуз Рго Ьеи 30 Агд Ьеи
Агд Суз Зег 35 Уа1 А1а О1у О1у Рго 40 ТЬг Уа1 О1у Зег Зег 45 Ьуз 11е О1и
О1у О1у 50 О1у О1у ТЬг ТЬг 11е 55 ТЬг ТЬг Азр Суз Уа1 60 11е Уа1 О1у О1у
О1у 65 11е Зег О1у Ьеи Суз 70 11е А1а О1п А1а Ьеи 75 А1а ТЬг Ьуз Н1з Рго 80
Азр А1а А1а Рго Азп 85 Ьеи 11е Уа1 ТЬг О1и 90 А1а Ьуз Азр Агд Уа1 95 О1у
О1у Азп 11е 11е 100 ТЬг Агд О1и О1и Азп 105 О1у РЬе Ьеи Тгр О1и 110 О1и О1у
Рго Азп Зег 115 РЬе О1п Рго Зег Азр 120 Рго МеЬ Ьеи ТЬг МеЬ 125 Уа1 Уа1 Азр
- 105
029356
Зег О1у ^еи ^уз Азр Азр ^еи 135 Уа1 ^еи О1у Азр Рго 140 ТЬг А1а Рго Агд
130
РЬе Уа1 ^еи Тгр Азп О1у ^уз ^еи Агд Рго Уа1 Рго Зег ^уз ^еи ТЬг
145 150 155 160
Азр ^еи Рго РЬе РЬе Азр ^еи МеЬ Зег 11е О1у О1у ^уз 11е Агд А1а
165 170 175
О1у РЬе О1у А1а ^еи О1у 11е Агд Рго Зег Рго Рго О1у Агд О1и О1и
180 185 190
Зег Уа1 О1и О1и РЬе Уа1 Агд Агд Азп ^еи О1у Азр О1и Уа1 РЬе О1и
195 200 205
Агд ^еи 11е О1и Рго РЬе Суз Зег О1у Уа1 Туг А1а О1у Азр Рго Зег
210 215 220
^уз ^еи Зег МеЬ ^уз А1а А1а РЬе О1у ^уз Уа1 Тгр ^уз ^еи О1и О1п
225 230 235 240
Азп О1у О1у Зег 11е 11е О1у О1у ТЬг РЬе ^уз А1а 11е О1п О1и Агд
245 250 255
^уз Азп А1а Рго ^уз А1а О1и Агд Азр Рго Агд ^еи Рго ^уз Рго О1п
260 265 270
О1у О1п ТЬг Уа1 О1у Зег РЬе Агд ^уз О1у ^еи Агд МеЬ ^еи Рго О1и
275 280 285
А1а 11е Зег А1а Агд ^еи О1у Зег ^уз Уа1 ^уз ^еи Зег Тгр ^уз ^еи
290 295 300
Зег О1у 11е ТЬг ^уз ^еи О1и Зег О1у О1у Туг Азп ^еи ТЬг Туг О1и
305 310 315 320
ТЬг Рго Азр О1у ^еи Уа1 Зег Уа1 О1п Зег ^уз Зег Уа1 Уа1 МеЬ ТЬг
325 330 335
Уа1 Рго Зег Н1з Уа1 А1а Зег О1у ^еи ^еи Агд Рго ^еи Зег О1и Зег
340 345 350
А1а А1а Азп А1а ^еи Зег ^уз ^еи Туг Туг Рго Рго Уа1 А1а А1а Уа1
355 360 365
Зег 11е Зег Туг Рго ^уз О1и А1а 11е Агд ТЬг О1и Суз ^еи 11е Азр
370 375 380
- 106
029356
О1у О1и 385 Ьеи Ьуз О1у РЬе 390 О1у О1п Ьеи Нгз Рго Агд ТЬг О1п О1у Уа1
395 400
О1и ТЬг Ьеи О1у ТЬг 11е Туг Зег Зег Зег Ьеи РЬе Рго Азп Агд А1а
405 410 415
Рго Рго О1у Агд 11е Ьеи Ьеи Ьеи Азп Туг 11е О1у О1у Зег ТЬг Азп
420 425 430
ТЬг О1у 11е Ьеи Зег Ьуз Зег О1и О1у О1и Ьеи Уа1 О1и А1а РЬе Ьеи
435 440 445
Уа1 О1у Н1з РЬе Азр 11е Ьеи Азр ТЬг А1а Ьуз Зег Зег Ьеи ТЬг Зег
450 455 460
Зег О1у Туг О1и О1у Ьеи РЬе Ьеи О1у О1у Азп Туг Уа1 А1а О1у Уа1
465 470 475 480
А1а Ьеи О1у Агд Суз Уа1 О1и О1у А1а Туг О1и ТЬг А1а 11е О1и Уа1
485 490 495
Азп Азп РЬе МеЬ Зег Агд Туг А1а Туг Ьуз
500 505
<210> 39 <211> 1515 <212> ДНК <213> Ы1соЬ1апа ЬаЬасиш.
<400> 39 аЬддсЬссЬЬ сЬдссддада адаЬааасас адЬЬсЬдсда адададЬсдс адЬсаЬЬддЬ 60
дсаддсдЬса дЬдддсЬЬдс ЬдсадсаЬас аадЬЬдаааа ЬссаЬддсЬЬ дааЬдЬдаса 120
дЬаЬЬЬдаад садаадддаа адсЬддаддд аадЬЬасдЬа дсдЬдадсса адаЬддссЬд 180
аЬаЬдддаЬд ааддддсааа ЬасЬаЬдасЬ дааадЬдаад дЬдаЬдЬЬас аЬЬЬЬЬдаЬЬ 240
даЬЬсЬсЬЬд дасЬссдада ааадсаасаа ЬЬЬссасЬЬЬ сасаааасаа дсдсЬасаЬЬ 300
дссадаааЬд дЬасЬссЬдЬ асЬдЬЬассЬ ЬсаааЬссаа ЬЬдаЬсЬдаЬ саааадсааЬ 360
ЬЬЬсЬЬЬсса сЬддаЬсааа дсЬЬсадаЬд сЬЬсЬддаас сааЬаЬЬаЬд даадааЬааа 420
аадсЬсЬссс аддЬдЬсЬда сЬсасаЬдаа адЬдЬсадЬд даЬЬсЬЬсса дсдЬсаЬЬЬЬ 480
ддаааддадд ЬЬдЬЬдасЬа ЬсЬааЬЬдас ссЬЬЬЬдЬЬд сЬддаасдЬд ЬддЬддЬдаЬ 540
ссЬдасЬсдс ЬЬЬсааЬдса ссаЬЬсаЬЬЬ ссададЬЬдЬ ддааЬЬЬада дааааддЬЬЬ 600
ддсЬсадЬса ЬасЬЬддадс ЬаЬЬсдаЬсЬ аадЬЬаЬссс сЬаааааЬда ааадаадсаа 660
дддссассса ааасЬЬсадс аааЬаадаад сдссадсддд даЬсЬЬЬЬЬс сЬЬЬЬЬдддс 720
- 107 029356
ддааЕдсааа сасЕЕасЕда ЕдсааЕаЕдс ааадаЕсЕса дадаадаЕда асЕЕадасЕа 780
аасЕсЕадад ЕЕсЕддааЕЕ аЕсЕЕдЕадс ЕдЕасЕдадд асЕсЕдсдаЕ адаЕадсЕдд 840
ЕсааЕЕаЕЕЕ сЕдссЕсЕсс асасаааадд сааЕсадаад аадааЕсаЕЕ ЕдаЕдсЕдЕа 900
аЕЕаЕдасдд ссссасЕсЕд ЕдаЕдЕЕаад адЕаЕдаада ЕЕдсЕаадад аддаааЕсса 960
ЕЕЕсЕасЕса асЕЕЕаЕЕсс ЕдаддЕЕдаЕ ЕаЕдЕассдс ЕаЕсЕдЕЕдЕ ЕаЕаассаса 1020
ЕЕЕаададдд аааасдЕааа дЕаЕссссЕЕ дадддЕЕЕЕд дддЕЕсЕЕдЕ ассЕЕссаад 1080
дадсаасаас аЕддЕсЕсаа дасасЕаддс асссЕсЕЕсЕ сЕЕсЕаЕдаЕ дЕЕЕссадаЕ 1140
сдддсассаа асааЕдЕЕЕа ЕсЕсЕаЕасЕ асЕЕЕЕдЕЕд дЕддаадссд аааЕададаа 1200
сЕЕдсаааад ссЕсааддас ЕдадсЕдааа дадаЕадЕаа сЕЕсЕдассЕ ЕаадсадсЕд 1260
ЕЕдддЕдсЕд адддададсс аасаЕаЕдЕд ааЕсаЕсЕаЕ асЕддадЕаа адсаЕЕЕсса 1320
ЕЕдЕасдддс аЕаасЕаЕда ЕЕсадЕссЕа даЕдсааЕЕд асааааЕдда даааааЕсЕЕ 1380
ссЕддаЕЕаЕ ЕсЕаЕдсадд Еаассасадд дддддаЕЕдЕ садЕЕддсаа адсаЕЕаЕсЕ 1440
ЕсЕддаЕдса аЕдсадсЕда ЕсЕЕдЕЕаЕа ЕсаЕаЕсЕЕд ааЕссдЕсЕс аасЕдасЕсс 1500
аааадасаЕЕ дсЕда 1515
<210> 40
<211> 504
<212> РКТ <213> Ы1соЕ1апа
<400> 40
МеЕ А1а 1 Рго Бег А1а 5 О1у О1и Азр Ьуз Н1з 10 Бег Бег А1а Ьуз Агд 15 Уа1
А1а Уа1 11е О1у А1а О1у Уа1 Бег О1у Ьеи А1а А1а А1а Туг Ьуз Ьеи
20 25 30
Ьуз 11е Н1з О1у Ьеи Азп Уа1 ТЬг Уа1 РЬе О1и А1а О1и О1у Ьуз А1а
35 40 45
О1у О1у Ьуз Ьеи Агд Бег Уа1 Бег О1п Азр О1у Ьеи 11е Тгр Азр О1и
50 55 60
О1у А1а Азп ТЬг МеЕ ТЬг О1и Бег О1и О1у Азр Уа1 ТЬг РЬе Ьеи 11е
65 70 75 80
Азр Бег Ьеи О1у Ьеи Агд О1и Ьуз О1п О1п РЬе Рго Ьеи Бег О1п Азп
85 90 95
Ьуз Агд Туг 11е А1а Агд Азп О1у ТЬг Рго Уа1 Ьеи Ьеи Рго Бег Азп
100 105 110
- 108
029356
Рго 11е Азр 115 Ьеи 11е Ьуз Бег Азп 120 РЬе Ьеи Бег ТЬг О1у 125 Бег Ьуз Ьеи
О1п МеО Ьеи Ьеи О1и Рго 11е Ьеи Тгр Ьуз Азп Ьуз Ьуз Ьеи Бег О1п
130 135 140
Уа1 Бег Азр Бег Н1з О1и Бег Уа1 Бег О1у РЬе РЬе О1п Агд Н1з РЬе
145 150 155 160
О1у Ьуз О1и Уа1 Уа1 Азр Туг Ьеи 11е Азр Рго РЬе Уа1 А1а О1у ТЬг
165 170 175
Суз О1у О1у Азр Рго Азр Бег Ьеи Бег МеО Н1з Н1з Бег РЬе Рго О1и
180 185 190
Ьеи Тгр Азп Ьеи О1и Ьуз Агд РЬе О1у Бег Уа1 11е Ьеи О1у А1а 11е
195 200 205
Агд Бег Ьуз Ьеи Бег Рго Ьуз Азп О1и Ьуз Ьуз О1п О1у Рго Рго Ьуз
210 215 220
ТЬг Бег А1а Азп Ьуз Ьуз Агд О1п Агд О1у Бег РЬе Бег РЬе Ьеи О1у
225 230 235 240
О1у МеО О1п ТЬг Ьеи ТЬг Азр А1а 11е Суз Ьуз Азр Ьеи Агд О1и Азр
245 250 255
О1и Ьеи Агд Ьеи Азп Бег Агд Уа1 Ьеи О1и Ьеи Бег Суз Бег Суз ТЬг
260 265 270
О1и Азр Бег А1а 11е Азр Бег Тгр Бег 11е 11е Бег А1а Бег Рго Н1з
275 280 285
Ьуз Агд О1п Бег О1и О1и О1и Бег РЬе Азр А1а Уа1 11е МеО ТЬг А1а
290 295 300
Рго Ьеи Суз Азр Уа1 Ьуз Бег МеО Ьуз 11е А1а Ьуз Агд О1у Азп Рго
305 310 315 320
РЬе Ьеи Ьеи Азп РЬе 11е Рго О1и Уа1 Азр Туг Уа1 Рго Ьеи Бег Уа1
325 330 335
Уа1 11е ТЬг ТЬг РЬе Ьуз Агд О1и Азп Уа1 Ьуз Туг Рго Ьеи О1и О1у
340 345 350
РЬе О1у Уа1 Ьеи Уа1 Рго Бег Ьуз О1и О1п О1п Нтз О1у Ьеи Ьуз ТЬг
- 109
029356
355 360 365
Ьеи О1у ТЬг Ьеи РЬе Зег Зег МеЕ МеЕ РЬе Рго Азр Агд А1а Рго Азп
370 375 380
Азп Уа1 Туг Ьеи Туг ТЬг ТЬг РЬе Уа1 О1у О1у Зег Агд Азп Агд О1и
385 390 395 400
Ьеи А1а Ьуз А1а Зег Агд ТЬг О1и Ьеи Ьуз О1и 11е Уа1 ТЬг Зег Азр
405 410 415
Ьеи Ьуз О1п Ьеи Ьеи О1у А1а О1и О1у О1и Рго ТЬг Туг Уа1 Азп Щз
420 425 430
Ьеи Туг Тгр Зег Ьуз А1а РЬе Рго Ьеи Туг О1у Щз Азп Туг Азр Зег
435 440 445
Уа1 Ьеи Азр А1а 11е Азр Ьуз МеЕ О1и Ьуз Азп Ьеи Рго О1у Ьеи РЬе
450 455 460
Туг А1а О1у Азп Ηίδ Агд О1у О1у Ьеи Зег Уа1 О1у Ьуз А1а Ьеи Зег
465 470 475 480
Зег О1у Суз Азп А1а А1а Азр Ьеи Уа1 11е Зег Туг Ьеи О1и Зег Уа1
485 490 495
Зег ТЬг Азр Зег Ьуз Агд Щз Суз
500
<210> 41 <211> 1509 <212> ДНК <213> О1ус Дпе тах
<400> 41 аЕддсЕЕссЕ сЕдсаасада сдаЕаассса адаЕсЕдЕаа ааададЕадс ЕдЕЕдЕЕддЕ 60
дсЕддддЕаа дЕдддсЕЕдс ЕдсддсЕЕас аааЕЕдаааЕ сасаЕддЕсЕ ддаЕдЕсасЕ 120
дЕаЕЕЕдаад сЕдадддаад адсЕддаддд аддЕЕдадаа дЕдЕЕЕсЕса ддаЕддЕсЕа 180
аЕЕЕдддаЕд адддадсЕаа ЕасааЕдасЕ дааадЕдааа ЕЕдаддЕЕаа аддЕЕЕдаЕЕ 240
даЕдсЕсЕЕд дасЕЕсаада ааадсадсад ЕЕЕссааЕаЕ сасадсаЕаа дсдсЕаЕаЕЕ 300
дЕдаааааЕд дддсассасЕ ЕсЕддЕассс асаааЕссЕд сЕдсасЕасЕ даададЕааа 360
сЕдсЕЕЕсЕд сасааЕсааа даЕссаЕсЕс аЕЕЕЕЕдаас саЕЕЕаЕдЕд даааадаадЕ 420
дассссЕсЕа аЕдЕдЕдЕда ЕдааааЕЕсЕ дЕддааадЕд ЕаддсаддЕЕ сЕЕЕдаасдЕ 480
саЕЕЕЕддаа аададдЕЕдЕ ддасЕаЕсЕд аЕЕдаЕссЕЕ ЕЕдЕЕддддд сасЕадЕдса 540
- 110 029356
дсадаЕссЕд
аддЕЕЕддсЕ
асЕддадааа
садддЕддда
аааЕЕаааЕд
аасЕддЕсЕа
асддсЕссЕс
сЕЕааЕЕЕЕс
ааддадааЕд
аааааЕддЕЕ
ссЕадЕдаЕЕ
саадсЕЕсаа
дсададдддд
ддасдЕаасЕ
ЕЕЕЕЕсЕЕЕд
Едсааадсад
даЕаааЕда
ааЕсЕсЕсЕс
ссаЕЕаЕадс
аЕаддасЕдс
ЕдсадасасЕ
ааааддЕЕЕЕ
ЕЕасЕадЕдс
ЕаЕаЕааЕдЕ
ЕЕсссдаддЕ
Еааададасс
ЕааааасссЕ
ЕаЕаЕсЕсЕа
сЕдасдадсЕ
аассаасаЕЕ
аЕдддЕсадЕ
саддЕаасЕа
сЕдаЕсЕЕдЕ
ЕаЕдсдссаЕ
сддддсаЕЕд
асЕаадаааа
дасадаЕаса
дасаЕЕадсЕ
ЕЕсЕаассаа
сааддасаЕс
аадсЕасдЕд
ЕЕЕддаддда
ЕддЕасасЕЕ
ЕассассЕЕс
ЕаддааааЕЕ
ЕдЕЕаассаЕ
ЕсЕЕсаадса
саааддЕдда
даЕаЕссЕас
ЕсЕЕЕсссад
сааЕсЕаадЕ
аасааасаса
ЕЕдЕдсааад
ЕаЕддЕсаЕд
адЕасасаад
аадаЕсасаа
ссааЕсЕсад
ЕЕЕддадЕЕс
ЕЕЕЕссЕсЕа
аЕЕддсддаа
дЕЕасЕЕсЕд
ЕЕсЕаЕЕдда
аЕЕдаЕаада
сЕсЕсадЕЕд
сЕсаасЕсЕд
адсЕаЕддаа
ЕаЕЕсдссаа
адсдЕддЕЕс
адсЕЕддсаа
аЕддаадЕЕс
аЕдЕЕдаЕдс
аааддддаас
ЕсаЕдаЕЕас
ЕЕдЕЕссЕЕс
ЕдаЕдЕЕссс
сЕсаааасад
ассЕдадааа
дЕаааддсЕЕ
Еадааааада
дсааадсааЕ
сЕЕсадасаа
ЕЕЕддадааа
аадддааааа
дЕЕЕЕсЕЕЕс
адасдассЕЕ
сЕсЕЕсасаа
адЕааЕсаЕд
ЕсссЕЕЕсса
ЕассЕЕсааа
Еааададсаа
адаЕсдЕдса
ддаасЕЕдсЕ
дЕЕдЕЕддда
ЕссЕЕЕдЕаЕ
ЕсЕЕсссдда
адссЕсаддс
сасадЕдссЕ
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1509
<210> 42
<211> 502
<212> РКТ <213> О1ус1пе
<400> 42
МеЕ 1 А1а Зег Зег А1а 5 ТЬг Азр Азр Азп Рго 10 Агд Зег Уа1 Ьуз Агд 15 Уа1
А1а Уа1 Уа1 О1у А1а О1у Уа1 Зег О1у Ьеи А1а А1а А1а Туг Ьуз Ьеи
20 25 30
Ьуз Зег Н1з О1у Ьеи Азр Уа1 ТЬг Уа1 РЬе О1и А1а О1и О1у Агд А1а
35 40 45
О1у О1у Агд Ьеи Агд Зег Уа1 Зег О1п Азр О1у Ьеи 11е Тгр Азр О1и
50 55 60
О1у А1а Азп ТЬг МеЕ ТЬг О1и Зег О1и 11е О1и Уа1 Ьуз О1у Ьеи 11е
65 70 75 80
Азр А1а Ьеи О1у Ьеи О1п О1и Ьуз О1п О1п РЬе Рго 11е Зег О1п Нтз
- 111
029356
85 90 95
Ьуз Агд Туг 11е 100 Уа1 Ьуз Азп О1у А1а 105 Рго Ьеи Ьеи Уа1 Рго 110 ТЬг Азп
Рго А1а А1а Ьеи Ьеи Ьуз Зег Ьуз Ьеи Ьеи Зег А1а О1п Зег Ьуз 11е
115 120 125
Н1з Ьеи 11е РЬе О1и Рго РЬе МеЕ Тгр Ьуз Агд Зег Азр Рго Зег Азп
130 135 140
Уа1 Суз Азр О1и Азп Зег Уа1 О1и Зег Уа1 О1у Агд РЬе РЬе О1и Агд
145 150 155 160
Н1з РЬе О1у Ьуз О1и Уа1 Уа1 Азр Туг Ьеи 11е Азр Рго РЬе Уа1 О1у
165 170 175
О1у ТЬг Зег А1а А1а Азр Рго О1и Зег Ьеи Зег МеЕ Агд Н1з Зег РЬе
180 185 190
Рго О1и Ьеи Тгр Азп Ьеи О1и Ьуз Агд РЬе О1у Зег 11е 11е А1а О1у
195 200 205
А1а Ьеи О1п Зег Ьуз Ьеи РЬе А1а Ьуз Агд О1и Ьуз ТЬг О1у О1и Азп
210 215 220
Агд ТЬг А1а Ьеи Агд Ьуз Азп Ьуз Н1з Ьуз Агд О1у Зег РЬе Зег РЬе
225 230 235 240
О1п О1у О1у МеЕ О1п ТЬг Ьеи ТЬг Азр ТЬг Ьеи Суз Ьуз О1и Ьеи О1у
245 250 255
Ьуз Азр Азр Ьеи Ьуз Ьеи Азп О1и Ьуз Уа1 Ьеи ТЬг Ьеи А1а Туг О1у
260 265 270
Н1з Азр О1у Зег Зег Зег Зег О1п Азп Тгр Зег 11е ТЬг Зег А1а Зег
275 280 285
Азп О1п Зег ТЬг О1п Азр Уа1 Азр А1а Уа1 11е МеЕ ТЬг А1а Рго Ьеи
290 295 300
Туг Азп Уа1 Ьуз Азр 11е Ьуз 11е ТЬг Ьуз Агд О1у ТЬг Рго РЬе Рго
305 310 315 320
Ьеи Азп РЬе Ьеи Рго О1и Уа1 Зег Туг Уа1 Рго 11е Зег Уа1 МеЕ 11е
325 330 335
- 112
029356
ТЬг ТЬг РЬе Ьуз 340 Ьуз О1и Азп Уа1 Ьуз 345 Агд Рго Ьеи О1и О1у 350 РЬе О1у
Уа1 Ьеи Уа1 Рго Зег Ьуз О1и О1п Ьуз Азп О1у Ьеи Ьуз ТЬг Ьеи О1у
355 360 365
ТЬг Ьеи РЬе Зег Зег МеЕ МеЕ РЬе Рго Азр Агд А1а Рго Зег Азр Ьеи
370 375 380
Туг Ьеи Туг ТЬг ТЬг РЬе 11е О1у О1у ТЬг О1п Азп Агд О1и Ьеи А1а
385 390 395 400
О1п А1а Зег ТЬг Азр О1и Ьеи Агд Ьуз 11е Уа1 ТЬг Зег Азр Ьеи Агд
405 410 415
Ьуз Ьеи Ьеи О1у А1а О1и О1у О1и Рго ТЬг РЬе Уа1 Азп Н1з РЬе Туг
420 425 430
Тгр Зег Ьуз О1у РЬе Рго Ьеи Туг О1у Агд Азп Туг О1у Зег Уа1 Ьеи
435 440 445
О1п А1а 11е Азр Ьуз 11е О1и Ьуз Азр Ьеи Рго О1у РЬе РЬе РЬе А1а
450 455 460
О1у Азп Туг Ьуз О1у О1у Ьеи Зег Уа1 О1у Ьуз А1а 11е А1а Зег О1у
465 470 475 480
Суз Ьуз А1а А1а Азр Ьеи Уа1 11е Зег Туг Ьеи Азп Зег А1а Зег Азр
485 490 495
Азп ТЬг Уа1 Рго Азр Ьуз
500
<210> 43 <211> 1205 <212> ДНК <213> Сиситиз заЕгуиз
<400> 43 адсЕЕссаас сЕЕссдаЕсс ЕаЕЕсЕсасс аЕддЕддЕдд аЕадЕддсЕЕ аааадаЕдаЕ 60
ЕЕадЕЕсЕдд дадасссада ЕдсассЕсда ЕЕЕдЕаЕЕдЕ ддааЕддааа дсЕсадасса 120
дЕдссЕдсда аассЕааЕда ЕсЕассЕЕЕс ЕЕЕдассЕда ЕдадсаЕЕдд ЕддаааааЕс 180
ададсаддсЕ ЕЕддЕдсссЕ дддсаЕЕсдс ссЕссЕссЕс саддЕсдада ддааЕсадЕЕ 240
даадааЕЕЕд ЕссдЕсддаа ссЕЕддсааЕ даадЕЕЕЕЕд аасдЕЕЕдаЕ ададссаЕЕЕ 300
ЕдЕЕсЕддЕд ЕаЕасдсЕдд ЕдасссЕЕса аадсЕаадса Едааадсадс ЕЕЕЕддЕаад 360
дЕЕЕддаддс Еададсаааа ЕддЕддЕадЕ аЕЕаЕЕддЕд ддасЕЕЕсаа адсасЕЕсаа 420
- 113 029356
даааддааЕа ааасЕассаа ассассаада даЕссдсдЕс Еассааадсс Еаадддссаа 480
асЕдЕЕддаЕ сЕЕЕЕсддаа аддасЕЕасс аЕдЕЕдссаа аЕдсЕаЕЕЕс ЕасЕЕдЕЕЕд 540
дддадЕааад ЕаааадЕаЕс ЕЕддаадсЕа ЕсЕадЕаЕса дЕааадЕдда ЕдасддаддЕ 600
ЕаЕадЕЕЕда саЕасдааас ассадаадда сЕадЕсЕсса ЕасЕаадсад аадЕдЕсаЕс 660
аЕдасддЕЕс сЕЕсЕЕаЕаЕ ЕдсЕддсасЕ сЕдЕЕдсдЕс сааЕсЕсддд дааадсЕдса 720
даЕдсасЕЕЕ сааааЕЕЕЕа ЕЕаЕссасса дЕЕдсаЕсад ЕдассаЕаЕс аЕаЕссаааа 780
ддадсааЕЕа ддааадааЕд сЕЕдаЕЕдаЕ ддЕдаасЕаа аддддЕЕЕдд ЕсааЕЕдсас 840
ссЕсдЕадсс адддддЕдас ЕасЕЕЕддда асЕаЕаЕаса дсЕсаЕсасЕ ЕЕЕЕссЕааЕ 900
сдадсдссад аЕддаадддЕ аЕЕдсЕсЕЕд аасЕасаЕЕд даддддсЕас ЕааЕасЕдда 960
аЕЕсЕЕЕсЕс адасададад сдадсЕсаЕа даадЕадЕЕд аЕсдддаЕЕЕ аадаааааЕс 1020
сЕсаЕааасс сааасдсада ддаЕссЕсЕа ссаЕЕдадсд ЕдадддЕдЕд дссасаадсс 1080
аЕЕссасадЕ ЕсЕЕдаЕЕдд ссаЕсЕсдаЕ дЕЕсЕадаса ссдссааддс сддасЕдада 1140
даддсЕддаа ЕддаддддсЕ аЕЕЕЕЕаддЕ ддааасЕаЕд ЕаЕдсддЕдЕ ддссЕЕдддд 1200
адаЕд 1205
<210> 44
<211> 401
<212> РКТ <213> Сиситпз
<400> 44
Зег 1 РЬе О1п Рго Зег 5 Азр Рго 11е Ьеи ТЬг 10 МеЕ Уа1 Уа1 Азр Зег 15 О1у
Ьеи Ьуз Азр Азр Ьеи Уа1 Ьеи О1у Азр Рго Азр А1а Рго Агд РЬе Уа1
20 25 30
Ьеи Тгр Азп О1у Ьуз Ьеи Агд Рго Уа1 Рго А1а Ьуз Рго Азп Азр Ьеи
35 40 45
Рго РЬе РЬе Азр Ьеи МеЕ Зег 11е О1у О1у Ьуз 11е Агд А1а О1у РЬе
50 55 60
О1у А1а Ьеи О1у 11е Агд Рго Рго Рго Рго О1у Агд О1и О1и Зег Уа1
65 70 75 80
О1и О1и РЬе Уа1 Агд Агд Азп Ьеи О1у Азп О1и Уа1 РЬе О1и Агд Ьеи
85 90 95
11е О1и Рго РЬе Суз Зег О1у Уа1 Туг А1а О1у Азр Рго Зег Ьуз Ьеи
100 105 110
- 114
029356
Зег МеЕ Ьуз 115 А1а А1а РЬе О1у Ьуз 120 Уа1 Тгр Агд Ьеи О1и 125 О1п Азп О1у
О1у Зег 11е 11е О1у О1у ТЬг РЬе Ьуз А1а Ьеи О1п О1и Агд Азп Ьуз
130 135 140
ТЬг ТЬг Ьуз Рго Рго Агд Азр Рго Агд Ьеи Рго Ьуз Рго Ьуз О1у О1п
145 150 155 160
ТЬг Уа1 О1у Зег РЬе Агд Ьуз О1у Ьеи ТЬг МеЕ Ьеи Рго Азп А1а 11е
165 170 175
Зег ТЬг Суз Ьеи О1у Зег Ьуз Уа1 Ьуз Уа1 Зег Тгр Ьуз Ьеи Зег Зег
180 185 190
11е Зег Ьуз Уа1 Азр Азр О1у О1у Туг Зег Ьеи ТЬг Туг О1и ТЬг Рго
195 200 205
О1и О1у Ьеи Уа1 Зег 11е Ьеи Зег Агд Зег Уа1 11е МеЕ ТЬг Уа1 Рго
210 215 220
Зег Туг 11е А1а О1у ТЬг Ьеи Ьеи Агд Рго 11е Зег О1у Ьуз А1а А1а
225 230 235 240
Азр А1а Ьеи Зег Ьуз РЬе Туг Туг Рго Рго Уа1 А1а Зег Уа1 ТЬг 11е
245 250 255
Зег Туг Рго Ьуз О1у А1а 11е Агд Ьуз О1и Суз Ьеи 11е Азр О1у О1и
260 265 270
Ьеи Ьуз О1у РЬе О1у О1п Ьеи Нтз Рго Агд Зег О1п О1у Уа1 ТЬг ТЬг
275 280 285
Ьеи О1у ТЬг 11е Туг Зег Зег Зег Ьеи РЬе Рго Азп Агд А1а Рго Азр
290 295 300
О1у Агд Уа1 Ьеи Ьеи Ьеи Азп Туг 11е О1у О1у А1а ТЬг Азп ТЬг О1у
305 310 315 320
11е Ьеи Зег О1п ТЬг О1и Зег О1и Ьеи 11е О1и Уа1 Уа1 Азр Агд Азр
325 330 335
Ьеи Агд Ьуз 11е Ьеи 11е Азп Рго Азп А1а О1и Азр Рго Ьеи Рго Ьеи
340 345 350
Зег Уа1 Агд Уа1 Тгр Рго О1п А1а 11е Рго О1п РЬе Ьеи 11е О1у Нтз
- 115
029356
355 360 365
Ьеи Азр Уа1 Ьеи Азр ТЬг А1а Ьуз А1а О1у Ьеи Агд О1и А1а О1у МеЕ
370 375 380
О1и О1у Ьеи РЬе Ьеи О1у О1у Азп Туг Уа1 Суз О1у Уа1 А1а Ьеи О1у
385 390 395 400
Агд
<210> 45 <211> 1521 <212> ДНК <213> 0гу2а заЕ1уа <400> 45 аЕддссдссЕ ссдасдассс ссдсддсддд аддЕссдЕсд ссдЕсдЕсдд сдссддсдЕс 60
адЕдддсЕсд сддсддсдЕа саддсЕдадд аадсдсддсд ЕдсаддЕдас ддЕдЕЕсдад 120
дсддссдаса дддсдддЕдд даадаЕасдд ассаасЕссд адддсдддЕЕ саЕсЕдддас 180
дааддддсса асассаЕдас адададЕдаа ЕЕддаддсаа дсаддсЕЕаЕ ЕдасдаЕсЕЕ 240
ддссЕасаад дсааасадса дЕаЕссЕаас Есасаасаса адсдЕЕасаЕ ЕдЕсааадаЕ 300
ддадсассаа сасЕдаЕЕсс сЕсадаЕссс аЕЕдсдсЕса Едаааадсас ЕдЕЕсЕЕЕсЕ 360
асааааЕсаа адсЕсаадсЕ аЕЕЕсЕддаа ссаЕЕЕсЕсЕ аЕдадаааЕс Еадсадаадд 420
ассЕсдддаа аадЕдЕсЕда ЕдаасаЕЕЕа адЕдададЕд ЕдаЕЕЕЕЕсЕ дЕдЕаЕаЕдЕ 480
ададаЕааЕс аддЕЕдЕЕда ЕЕаЕсЕЕаЕЕ даЕссаЕЕЕд ЕддсЕддаас аадсддадда 540
даЕссЕдадЕ саЕЕаЕсааЕ ЕсдЕсаЕдса ЕЕЕссадсаЕ ЕаЕддааЕЕЕ ддадааЕаад 600
ЕаЕддсЕсЕд ЕсаЕЕдсЕдд ЕдссаЕсЕЕд ЕссааасЕаЕ ссасЕааддд ЕдаЕЕсадЕд 660
аадасаддад дЕдсЕЕсдсс адддааадда аддааЕааас дЕдЕдЕсаЕЕ ЕЕсаЕЕЕсаЕ 720
ддЕддааЕдс адЕсасЕааЕ адаЕдсасЕЕ сасааЕдаад ЕЕддадаЕдд ЕаасдЕдаад 780
сЕЕддЕасад аадЕдЕЕдЕс аЕЕддсаЕдЕ ЕдсЕдЕдаЕд дадЕсЕсЕЕс ЕЕсЕддЕддЕ 840
ЕддЕсааЕЕЕ сЕдЕЕдаЕЕс аааадаЕдсЕ ааадддааад аЕсЕсадааа даассааЕсЕ 900
ЕЕсдаЕдсЕд ЕЕаЕааЕдас ЕдсЕссаЕЕд ЕсЕааЕдЕсс ададдаЕдаа дЕЕЕасаааа 960
ддЕддадЕЕс ссЕЕЕдЕдсЕ адасЕЕЕсЕЕ ссЕааддЕсд аЕЕаЕсЕасс асЕаЕсЕсЕс 1020
аЕддЕаасад сЕЕЕЕаадаа ддаадаЕдЕс аааааассаЕ ЕддааддаЕЕ ЕддЕдссЕЕд 1080
аЕасссЕаЕа аддаасадса ааадсаЕддЕ сЕсаааассс ЕЕдддасссЕ сЕЕсЕссЕсд 1140
аЕдаЕдЕЕЕс садаЕсдадс ЕссЕааЕдаЕ сааЕаЕсЕаЕ аЕасаЕсЕЕЕ саЕЕдддддд 1200
адссаЕааЕа дадассЕсдс ЕддддсЕсса асддсЕаЕЕс ЕдааасаасЕ ЕдЕдассЕсЕ 1260
- 116 029356
дассРаадаа адсРсРРддд РдРРдаддда саассРасРР РРдРдаадса РдРасаРРдд 1320
адаааРдсРР РРссРРРаРа РддссадааР РаРдаРсРдд РасРддаадс РаРадсаааа 1380
аРддадааса аРсРРссадд дРРсРРРРас дсаддаааРа асааддаРдд дРРддсРдРР 1440
ддаааРдРРа РадсРРсадд аадсааддсР дсРдассРРд РдаРсРсРРа РсРРдааРсР 1500
РдсасадаРс аддасааРРа д 1521
<210> 46
<211> 506
<212> РКТ
<213> 0гу2а заР.в/а
<400> 46
МеР 1 А1а А1а Зег Азр 5 Азр Рго Агд О1у О1у Агд 10 Зег Уа1 А1а Уа1 15 Уа1
О1у А1а О1у Уа1 Зег О1у Ьеи А1а А1а А1а Туг Агд Ьеи Агд Ьуз Агд
20 25 30
О1у Уа1 О1п Уа1 ТЬг Уа1 РЬе О1и А1а А1а Азр Агд А1а О1у О1у Ьуз
35 40 45
11е Агд ТЬг Азп Зег О1и О1у О1у РЬе 11е Тгр Азр О1и О1у А1а Азп
50 55 60
ТЬг МеР ТЬг О1и Зег О1и Ьеи О1и А1а Зег Агд Ьеи 11е Азр Азр Ьеи
65 70 75 80
О1у Ьеи О1п О1у Ьуз О1п О1п Туг Рго Азп Зег О1п Н1з Ьуз Агд Туг
85 90 95
11е Уа1 Ьуз Азр О1у А1а Рго ТЬг Ьеи 11е Рго Зег Азр Рго 11е А1а
100 105 110
Ьеи МеР Ьуз Зег ТЬг Уа1 Ьеи Зег ТЬг Ьуз Зег Ьуз Ьеи Ьуз Ьеи РЬе
115 120 125
Ьеи О1и Рго РЬе Ьеи Туг О1и Ьуз Зег Зег Агд Агд ТЬг Зег О1у Ьуз
130 135 140
Уа1 Зег Азр О1и Н1з Ьеи Зег О1и Зег Уа1 11е РЬе Ьеи Суз 11е Суз
145 150 155 160
Агд Азр Азп О1п Уа1 Уа1 Азр Туг Ьеи 11е Азр Рго РЬе Уа1 А1а О1у
165 170 175
ТЬг Зег О1у О1у Азр Рго О1и Зег Ьеи Зег 11е Агд Нтз А1а РЬе Рго
- 117
029356
180 185 190
А1а Ьеи Тгр Азп Ьеи О1и Азп Ьуз Туг О1у Зег Уа1 11е А1а О1у А1а
195 200 205
11е Ьеи Зег Ьуз Ьеи Зег ТЬг Ьуз О1у Азр Зег Уа1 Ьуз ТЬг О1у О1у
210 215 220
А1а Зег Рго О1у Ьуз О1у Агд Азп Ьуз Агд Уа1 Зег РЬе Зег РЬе Нбз
225 230 235 240
О1у О1у МеЕ О1п Зег Ьеи 11е Азр А1а Ьеи Нбз Азп О1и Уа1 О1у Азр
245 250 255
О1у Азп Уа1 Ьуз Ьеи О1у ТЬг О1и Уа1 Ьеи Зег Ьеи А1а Суз Суз Суз
260 265 270
Азр О1у Уа1 Зег Зег Зег О1у О1у Тгр Зег 11е Зег Уа1 Азр Зег Ьуз
275 280 285
Азр А1а Ьуз О1у Ьуз Азр Ьеи Агд Ьуз Азп О1п Зег РЬе Азр А1а Уа1
290 295 300
11е МеЕ ТЬг А1а Рго Ьеи Зег Азп Уа1 О1п Агд МеЕ Ьуз РЬе ТЬг Ьуз
305 310 315 320
О1у О1у Уа1 Рго РЬе Уа1 Ьеи Азр РЬе Ьеи Рго Ьуз Уа1 Азр Туг Ьеи
325 330 335
Рго Ьеи Зег Ьеи МеЕ Уа1 ТЬг А1а РЬе Ьуз Ьуз О1и Азр Уа1 Ьуз Ьуз
340 345 350
Рго Ьеи О1и О1у РЬе О1у А1а Ьеи 11е Рго Туг Ьуз О1и О1п О1п Ьуз
355 360 365
Нбз О1у Ьеи Ьуз ТЬг Ьеи О1у ТЬг Ьеи РЬе Зег Зег МеЕ МеЕ РЬе Рго
370 375 380
Азр Агд А1а Рго Азп Азр О1п Туг Ьеи Туг ТЬг Зег РЬе 11е О1у О1у
385 390 395 400
Зег Нбз Азп Агд Азр Ьеи А1а О1у А1а Рго ТЬг А1а 11е Ьеи Ьуз О1п
405 410 415
Ьеи Уа1 ТЬг Зег Азр Ьеи Агд Ьуз Ьеи Ьеи О1у Уа1 О1и О1у О1п Рго
420 425 430
- 118
029356
ТЬг РЬе Уа1 435 Ьуз Н1з Уа1 Н1з Тгр 440 Агд Азп А1а РЬе Рго 445 Ьеи Туг О1у
О1п Азп Туг Азр Ьеи Уа1 Ьеи О1и А1а 11е А1а Ьуз МеЬ О1и Азп Азп
450 455 460
Ьеи Рго О1у РЬе РЬе Туг А1а О1у Азп Азп Ьуз Азр О1у Ьеи А1а Уа1
465 470 475 480
О1у Азп Уа1 11е А1а Зег О1у Зег Ьуз А1а А1а Азр Ьеи Уа1 11е Зег
485 490 495
Туг Ьеи О1и Зег Суз ТЬг Азр О1п Азр Азп
500 505

Claims (11)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ борьбы с сорняками в месте произрастания растения, содержащего по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую мутированную протопорфириноген оксидазу (мут-РРО), устойчивую к гербициду, который является РРОингибирующим производным бензоксазинона, включающий нанесение на указанное место эффективного количества указанного гербицида, причем указанная нуклеотидная последовательность содержит последовательность ЗЕО ГО N0: 1 или ее вариант, последовательность которого по меньшей мере на 80% идентична последовательности 8Е0 ГО N0: 1, а мут-РРО представляет собой вариант ЗЕО ГО N0: 2, в которой аминокислота в положении 128 представляет собой А1а, а аминокислота в положении 420 представляет собой МеЕ Сук, 11е, Туг, Тгр, Ьеи или ТЬг.
  2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гербицид - производное бензоксазинона наносят в сочетании с одним или более РРО-ингибирующими гербицидами, выбранными из группы, состоящей из ацифторфена, ацифторфеннатрия, азафенидина, бенкарбазона, бензфендизона, бифенокса, бутафенацила, карфентразона, карфентразонэтила, хлометоксифена, цинидонэтила, флуазолата, флуфенпира, флуфенпирэтила, флумиклорака, флумиклоракпентила, флумиоксазина, фторгликофена, фторгликофенэтила, флутиацета, флутиацетметила, фомесафена, галосафена, лактофена, оксадиаргила, оксадиазона, оксифторфена, пентоксазона, профлуазола, пираклонила, пирафлуфена, пирафлуфенэтила, сафлуфенацила, сульфентразона, тидиазимина, этил [3-[2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-6-трифторметил-2,4-диоксо-1,2,3,4тетрагидропиримидин-3-ил)фенокси]-2-пиридилокси]ацетата, Шэтил-3-(2,6-дихлор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-1Н-пиразол-1-карбоксамида, Штетрагидрофурфурил-3-(2,6-дихлор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-1Н-пиразол-1 -карбоксамида, Шэтил-3 -(2-хлор-6-фтор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-1Нпиразол-1-карбоксамида, Штетрагидрофурфурил-3-(2-хлор-6-фтор-4-трифторметилфенокси)-5-метил1Н-пиразол-1-карбоксамида и 3-[7-фтор-3-оксо-4-(проп-2-инил)-3,4-дигидро-2Н-бензо[1,4]оксазин-6-ил]1,5-диметил-6-тиоксо-[1,3,5]триазинан-2,4-диона.
  3. 3. Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая мут-РРО, содержащую вариант 8Е0 ГО N0: 2, в котором аминокислота в положении 128 представляет собой А1а; а аминокислота в положении 420 представляет собой Ме!, Сук, 11е, Туг, Тгр, Ьеи или ТЬг.
  4. 4. Клетка трансгенного растения, трансформированная мут-РРО, по п.3, экспрессия которой в клетке растения приводит к повышенной устойчивости растения к гербициду, который является производным бензоксазинона, по сравнению с клеткой растения дикого типа.
  5. 5. Трансгенное растение, содержащее клетку растения по п.4, обладающее повышенной устойчивостью к гербициду, который является производным бензоксазинона, по сравнению с растением дикого типа.
  6. 6. Растение, которое экспрессирует мут-РРО, содержащую вариант 8Е0 ГО N0: 2, в котором аминокислота в положении 128 представляет собой А1а; а аминокислота в положении 420 представляет собой Ме!, Сук, 11е, Туг, Тгр, Ьеи или ТЬг.
  7. 7. Семя трансгенного растения по п.6, включающее нуклеиновую кислоту, кодирующую мут-РРО, представляющую собой вариант 8Е0 ГО N0: 2, в котором аминокислота в положении 128 представляет собой А1а; а аминокислота в положении 420 представляет собой Ме!, Сук, 11е, Туг, Тгр, Ьеи или ТЬг.
  8. 8. Способ получения клетки трансгенного растения с повышенной устойчивостью к гербициду, который является производным бензоксазинона, по сравнению с клеткой растения дикого типа, включаю- 119 029356
    щий трансформацию клетки растения кассетой экспрессии, содержащей нуклеиновую кислоту по п.3.
  9. 9. Способ получения трансгенного растения с повышенной устойчивостью к гербициду, который является производным бензоксазинона, включающий трансформацию клетки растения кассетой экспрессии, содержащей нуклеиновую кислоту по п.3, и регенерацию растения из трансформированной клетки растения.
  10. 10. Способ по п.8 или 9, где нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность 8Ер ГО N0: 1 или ее вариант, последовательность которого по меньшей мере на 80% идентична последовательности 8Ер ГО N0: 1.
  11. 11. Способ по любому из пп.8-10, где кассета экспрессии также содержит регуляторный участок инициации транскрипции и регуляторный участок инициации трансляции, которые являются функционально активными в растении.
    А. 1з иЬ е г си1 аСиг
    А. сиЪ е г си1 аСиг_Р.
    А.СЬ.а11апа_2
    5.о1егасеа_£
    Н.СаЬасизй_2
    С-1ус1пе_шак
    А.сЬ.аИапа_1
    1'Г.1за±5ас1Лй_1
    С. ге1пЪ.агс11з11_1
    З.СиЪегогит С. гасхтгиг С. 1пСуЪи£_1 £.о1егасеа_1 Ро1уС.оше11а
    * £0 * 40 * 60 * 80 * 100
    ---------------------------МУ1031ТНЬЗРетЬАЬРЗРЬЗУЗТКЫ¥Р1ГАЦНСЫ13ЕРЕ-----------------------ЕРТЗАКРЛГА^И
    ---------------------------М71031ТНЬЗР11ЬАЬРЗРЬЗУЗТКЫ¥РУАга(Ж13ЕПЕ-----------------------ΕΡΤ3ΑΚΙΐνΑ^Η
    -----------Η(;ΙιΙΚΗ&ΤΙιΥΟΡΡΟΙ3ΐαΝΡΑΑνΡΕ3ΤΥΡΡΗΟΡΡΙινΡΙ)ΡΡ3ΕΙιΙιΟΙΑΗΑ30ΑνΑΙ>Η--------------01------ЕА^ЗСКРУаИ
    ---------------------------му1ьрузоьзтиьсьзъ7зртк1га----ргастгзЕыю--------------νυ------ор13акрлга^И
    ------------------------------------------------------------НАР ЗАО--------------ЕЕ------ΚΗΞΞΑΚΓΐϋΑ^Η
    ------------НЕЬЗЪЬРРТТОЗЬЪРЗРЗК--------------РНЫП.тГ?КР1.Ы|ЬС37А(;-----------ΟΡΤν&33ΚΙΕ&ΟΟΟΤΤΙΤΤΕ0ν^Β
    ΗΤΤΤΡΙΑΗΗΡΗΙΡΤΗΟ-------- Е-Ь РЬНГТ ΡΙΙΡ I НИ ТЧИ III ПЕТР I т Л1------------ΤνΡΞΞΑνΕΟΟ-ΡΑΑΕΙΕΟν^Η
    МНЬТОТРСТАТ. .ΙΕ.ιιΙΙ ^ЛГ . Л’1" Ε11 ΤΙ Р тт I Ю I Т^ЕЕТЪНЕТ^ТГ------------ΑΡΤΑΞΟΑΟνΑΚΤΙ,ΕΝνΥΕνίΗ
    -----------------------Н7ААТАТАТАНАТААЗРЪЬНСТР1РАРЬЕНРС;Ъ37РСАА7АСС;------------ААЕАРАЗТС—АРЬ ЗАЕСТСЯ
    ----------------------НААААААНАТАТЗАТААРРЬР1РЕААРРТРРРС-НЛГРСА1ГАЗС-------------ААЕАРААРС—АР^ЗАЕСХГ^Н
    ΜΤΤΤΑνΑΗΗΡΕΙΡΤΗΕ.ΕΙιΙ.Ε......I . РЪРЬНЕ ΤΗΡΙΙ ι Р. ТЛИкИПИ ТТЕТИ .тт ЛЛ ι------------ПГРРЗЕТОСН-ОРРЕЬЕСДтН
    --НТЗЬТЕ^СЗЫИ ι Е-----ТТ ЫЕЕТ II ЬТЕНЕРхЫТх ЕЛРЛНЕТТЕРИ I ЛИ ------------Р1ТРР13НЕРН30РЬЬЕСУ^И
    ------------м. чл„ь.. тн—ь.ъг и^и. ь.ы· енне1Т1ЫЕ...ьееи ι ..т .τι.τ.ιι. лЛкАНУОнкыютноиЕосооссоиьЕстЩ
    -----------------------нзззаърьъсортзгрыъсокуррзръзоъзтъырзтнзррез--------------------------туеуЛЯ
    д
    50
    50 69 49 20 20 63 78 88 63 62 37
    81
    33
    51
    А. 1з иЬ е г си1 аСиг
    А. СиЪ е г си1 аСиг_Р.
    А.СЬ.аИапа_2
    3.о1егасеа_£
    Ы.1заЬаси1й_2
    С-1ус1пе_шак
    А.сЕа11апа_1
    1'Г.1за±5ас1Лй_1
    С. ге1пЪ.агс11з11_1
    З.СиЪегогит
    С. 1п1зуЪи£_1 3.о1егасеа_1 РоТусоне11а
    144
    144 163 143 114 114 160 171
    160
    159
    130
    46
    178
    135
    145
    243
    242
    253
    242
    211
    213
    253
    264
    276
    253
    252
    273
    139
    271
    273
    242
EA201390842A 2010-12-16 2011-12-15 Растения с повышенной устойчивостью к гербицидам EA029356B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US42360410P 2010-12-16 2010-12-16
PCT/IB2011/055701 WO2012080975A1 (en) 2010-12-16 2011-12-15 Plants having increased tolerance to herbicides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201390842A1 EA201390842A1 (ru) 2013-12-30
EA029356B1 true EA029356B1 (ru) 2018-03-30

Family

ID=46244173

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201390842A EA029356B1 (ru) 2010-12-16 2011-12-15 Растения с повышенной устойчивостью к гербицидам

Country Status (17)

Country Link
US (2) US11274313B2 (ru)
EP (1) EP2652139B1 (ru)
JP (1) JP6334169B2 (ru)
KR (1) KR102085133B1 (ru)
CN (1) CN103261424B (ru)
AU (1) AU2011342759B2 (ru)
BR (1) BR112013014778A2 (ru)
CA (1) CA2818917C (ru)
CR (1) CR20130296A (ru)
DE (1) DE112011104396T5 (ru)
EA (1) EA029356B1 (ru)
ES (1) ES2903230T3 (ru)
MX (1) MX347362B (ru)
MY (1) MY169304A (ru)
UA (1) UA121371C2 (ru)
WO (1) WO2012080975A1 (ru)
ZA (1) ZA201305262B (ru)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA121371C2 (uk) 2010-12-16 2020-05-25 Басф Агро Б. В. Стійка до гербіцидів трансгенна рослина, яка містить мутантну протопорфіриногеноксидазу
AR091489A1 (es) * 2012-06-19 2015-02-11 Basf Se Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno oxidasa (ppo)
US10041087B2 (en) 2012-06-19 2018-08-07 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
WO2014177992A2 (en) * 2013-04-30 2014-11-06 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
CN104107437B (zh) * 2013-06-09 2015-08-26 厦门成坤生物技术有限公司 一种用于治疗乙型病毒性肝炎的rna干扰组合物及其制备方法
UA123757C2 (uk) 2013-08-12 2021-06-02 Басф Агро Б. В. Мутована протопорфіриногеноксидаза, що надає рослинам стійкості до ппо-інгібуючого гербіциду
BR112016002851B1 (pt) 2013-08-12 2022-02-22 BASF Agro B.V. Molécula de ácido nucleico, constructo de ácido nucleico, vetor, polipeptídeo ppo, método para controlar vegetação indesejada e uso do ácido nucleico
BR112016014174B1 (pt) * 2013-12-18 2022-03-15 BASF Agro B.V. Método de controle de vegetação indesejada e método de produção de uma célula vegetal transgênica
KR101827545B1 (ko) * 2014-12-16 2018-02-08 주식회사 팜한농 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 이용한 식물 및/또는 조류의 제초제 저항성 부여 또는 증진 방법
PE20181026A1 (es) * 2015-08-03 2018-06-27 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para tolerancia a los herbicidas en plantas
US10378023B2 (en) 2015-09-01 2019-08-13 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for herbicide tolerance in plants
MA45030A (fr) 2016-05-20 2019-03-27 Basf Agro Bv Peptides à double transit pour le ciblage de polypeptides
JP6875426B2 (ja) * 2016-06-16 2021-05-26 ファームハンノン・カンパニー・リミテッドＦａｒｍｈａｎｎｏｎｇ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ変異体およびこれを用いる除草剤耐性付与および／または増進のための組成物および方法
CA3024985A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Farmhannong Co., Ltd. Methods and compositions for conferring and/or enhancing herbicide tolerance using protoporphyrinogen oxidase or variant thereof
CN109790153A (zh) * 2016-07-27 2019-05-21 巴斯夫农业公司 具有增加的除草剂耐受性的植物
PE20190838A1 (es) * 2016-07-29 2019-06-17 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para la expresion genica en plantas
EP3559243A1 (en) 2016-12-20 2019-10-30 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
WO2019106568A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
CA3085594C (en) * 2017-12-15 2023-10-10 Farmhannong Co., Ltd. Composition and method for conferring and/or enhancing tolerance against herbicides by using variants of ppo
AU2018385130B2 (en) 2017-12-15 2022-07-14 Farmhannong Co., Ltd. Composition and method for conferring and/or enhancing herbicide tolerance using variants of protoporphyrinogen ix oxidase from cyanobacteria
KR102048841B1 (ko) * 2017-12-26 2019-11-27 대한민국 제초제 내성을 갖는 남일 돌연변이 후대 계통, Namil(SA)-gla1, 및 이의 용도
KR102048838B1 (ko) * 2017-12-26 2019-11-27 대한민국 제초제 내성을 갖는 남일 돌연변이 후대 계통, Namil(EMS)-gla1, 및 이의 용도
AU2020292093A1 (en) * 2019-06-14 2021-12-16 Farmhannong Co., Ltd. Methods and compositions for conferring and/or enhancing herbicide tolerance using protoporphyrinogen IX oxidase of various cyanobacteria or variant thereof
BR112021024656A2 (pt) * 2019-09-17 2022-04-12 Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd Polipeptídeo de hidroxife-nilpiruvato-dioxigenase mutante, gene codificador e uso do mesmo
US20240124432A1 (en) 2020-11-24 2024-04-18 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
CA3214498A1 (en) 2021-04-07 2022-10-13 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
AU2022340861A1 (en) 2021-09-03 2024-03-14 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Plants having increased tolerance to herbicides
WO2023044364A1 (en) 2021-09-15 2023-03-23 Enko Chem, Inc. Protoporphyrinogen oxidase inhibitors
AR127152A1 (es) 2021-09-27 2023-12-20 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Plantas de girasol no transgénicas que tienen tolerancia aumentada a herbicidas
WO2023137309A2 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Enko Chem, Inc. Protoporphyrinogen oxidase inhibitors
CN114504869B (zh) * 2022-01-27 2023-05-23 浙江工业大学 一种便携手摇式海水淡化器
WO2023169984A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
KR20230141283A (ko) * 2022-03-31 2023-10-10 주식회사 팜한농 프로토포르피리노겐 옥시다아제의 변이체를 이용하는 트리플루디목사진 내성 부여 및/또는 증진을 위한 조성물 및 방법
WO2023222589A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
WO2024012968A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal pyrimidinone derivatives

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1036571A (zh) * 1988-02-05 1989-10-25 财团法人相模中央化学研究所 苯并恶嗪酮化合物和含有这种化合物的除草组合物
WO1997032011A1 (en) * 1996-02-28 1997-09-04 Novartis Ag Dna molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof
WO2001012815A1 (de) * 1999-08-18 2001-02-22 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Von coxsackieviren abgeleitetes vektorsystem für gentransfer

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
EP0242236B2 (en) 1986-03-11 1996-08-21 Plant Genetic Systems N.V. Plant cells resistant to glutamine synthetase inhibitors, made by genetic engineering
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
BE1000563A6 (fr) 1987-05-18 1989-02-07 Cedres Castro Herminio S Dispositif accessoire, retractable dans un wc du type traditionnel destine a l'hygiene du corps.
JPS6475486A (en) * 1987-09-17 1989-03-22 Nihon Tokushu Noyaku Seizo Kk Benzoxazinones and herbicide
ATE105585T1 (de) 1987-12-21 1994-05-15 Univ Toledo Transformation von keimenden pflanzensamen mit hilfe von agrobacterium.
FR2629098B1 (fr) 1988-03-23 1990-08-10 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimerique de resistance herbicide
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
JPH02235873A (ja) * 1989-03-10 1990-09-18 Sagami Chem Res Center オキサゾリジンジオン誘導体及びその製法
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
DE69133128T2 (de) 1990-04-12 2003-06-18 Syngenta Participations Ag Gewebe-spezifische Promotoren
PL295547A1 (ru) 1990-04-26 1992-10-05 Plant Genetic Systems Nv
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
US5277905A (en) 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
CA2112676C (en) 1991-08-02 2007-07-03 Michio Ohba Novel microorganism and insecticide
CA2116449C (en) 1991-08-27 2005-04-05 Vaughan Alan Hilder Proteins with insecticidal properties against homopteran insects and their use in plant protection
WO1993007256A1 (en) 1991-10-07 1993-04-15 Ciba-Geigy Ag Particle gun for introducing dna into intact cells
TW261517B (ru) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
AU4115693A (en) 1992-04-24 1993-11-29 Sri International In vivo homologous sequence targeting in eukaryotic cells
NZ278490A (en) 1993-12-09 1998-03-25 Univ Jefferson Chimeric polynucleotide with both ribo- and deoxyribonucleotides in one strand and deoxyribonucleotides in a second strand
JP2909796B2 (ja) 1993-12-28 1999-06-23 ローム株式会社 サーマルプリントヘッドおよびその製造方法
US5593881A (en) 1994-05-06 1997-01-14 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis delta-endotoxin
US5939602A (en) 1995-06-06 1999-08-17 Novartis Finance Corporation DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof
US5767373A (en) 1994-06-16 1998-06-16 Novartis Finance Corporation Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
DE19505995A1 (de) 1995-02-21 1996-08-22 Degussa Verfahren zur Herstellung von Thietanonen
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
US6084155A (en) 1995-06-06 2000-07-04 Novartis Ag Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
WO1997004088A1 (en) * 1995-07-20 1997-02-06 Sumitomo Chemical Company, Ltd. Porphyrin-accumulating type herbicide resistance gene
US5737514A (en) 1995-11-29 1998-04-07 Texas Micro, Inc. Remote checkpoint memory system and protocol for fault-tolerant computer system
US5948917A (en) 1996-03-26 1999-09-07 Nippon Soda Co., Ltd. 3-(isoxazol-5-yl)-substituted benzoic acid derivative and method for production thereof
HUP9902423A3 (en) 1996-04-26 2001-02-28 Nippon Soda Co Benzene derivatives substituted by heterocycles and herbicides
WO1997041117A1 (fr) 1996-04-26 1997-11-06 Nippon Soda Co., Ltd. Nouveaux derives du benzene substitues par des heterocycles, et herbicides
AU1670797A (en) 1996-04-26 1997-11-19 Nippon Soda Co., Ltd. Benzene derivatives substituted by heterocycles and herbicides
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
US5773702A (en) 1996-07-17 1998-06-30 Board Of Trustees Operating Michigan State University Imidazolinone herbicide resistant sugar beet plants
US5859348A (en) 1996-07-17 1999-01-12 Board Of Trustees Operating Michigan State University Imidazolinone and sulfonyl urea herbicide resistant sugar beet plants
WO1998029554A1 (en) 1996-12-27 1998-07-09 Sumitomo Chemical Co., Ltd. Methods of conferring ppo-inhibiting herbicide resistance to plants by gene manipulation
JP4451933B2 (ja) * 1996-12-27 2010-04-14 住友化学株式会社 遺伝子操作による植物へのｐｐｏ阻害性除草剤耐性付与法
US6027945A (en) 1997-01-21 2000-02-22 Promega Corporation Methods of isolating biological target materials using silica magnetic particles
ZA98371B (en) * 1997-01-31 1999-07-16 Du Pont Genetically transformed plants demonstrating resistance to porphyrinogen biosynthesis-inhibiting herbicides.
US7105724B2 (en) 1997-04-04 2006-09-12 Board Of Regents Of University Of Nebraska Methods and materials for making and using transgenic dicamba-degrading organisms
US5939360A (en) 1997-07-08 1999-08-17 Nippon Soda Co., Ltd. Compound and herbicidal composition for weed control
CA2303403A1 (en) 1997-09-11 1999-03-18 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Novel protoporphyrinogen oxidase tolerant to photobleaching herbicide
AR014072A1 (es) 1998-02-26 2001-01-31 Pioneer Hi Bred Int Molecula de acido nucleico aislada que tiene una secuencia nucleotidica para un promotor que es capaz de iniciar una transcripcion constitutiva en unacelula de planta, construccion adn, vector, celula huesped, metodo para expresar en forma constitutiva una secuencia nucleotidica heteroloca en una
US6555732B1 (en) 1998-09-14 2003-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Rac-like genes and methods of use
AU775233B2 (en) 1999-07-22 2004-07-22 National Institute Of Agrobiological Sciences Method for superrapid transformation of monocotyledon
AU2001260114A1 (en) * 2000-03-14 2001-09-24 Syngenta Participations Ag Protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
US6936467B2 (en) * 2000-03-27 2005-08-30 University Of Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides
AU5920601A (en) 2000-04-28 2001-11-12 American Cyanamid Co Use of the maize x112 mutant ahas 2 gene and imidazolinone herbicides for selection of transgenic monocots, maize, rice and wheat plants resistant to the imidazolinone herbicides
EP1226127B1 (en) 2000-05-04 2009-07-01 Basf Se Substituted phenyl sulfamoyl carboxamides
US7462481B2 (en) 2000-10-30 2008-12-09 Verdia, Inc. Glyphosate N-acetyltransferase (GAT) genes
CN100537764C (zh) 2001-10-19 2009-09-09 住友化学工业株式会社 除草剂代谢蛋白质,其基因及其应用
AU2002336288C1 (en) 2001-10-19 2009-04-30 Sumitomo Chemical Company, Limited Weed controller metabolism proteins, genes thereof and use of the same
CA2897475C (en) 2004-04-30 2018-07-10 Dow Agrosciences Llc Novel herbicide resistance genes
MXPA06013357A (es) 2004-06-07 2007-03-01 Basf Plant Science Gmbh Transformacion mejorada de porotos de soja.
US8680290B2 (en) 2004-09-03 2014-03-25 Syngenta Limited Isoxazoline derivatives and their use as herbicides
EP1799657B1 (en) 2004-10-05 2009-12-02 Syngenta Limited Isoxazoline derivatives and their use as herbicides
US20070021515A1 (en) 2005-07-19 2007-01-25 United States (as represented by the Secretary of Agriculture) Expandable starch-based beads and method of manufacturing molded articles therefrom
US7842856B2 (en) 2005-08-25 2010-11-30 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Herbicide resistance gene, compositions and methods
US7671254B2 (en) * 2005-08-25 2010-03-02 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Herbicide resistance gene, compositions and methods
KR20080050618A (ko) 2005-09-26 2008-06-09 닛뽕소다 가부시키가이샤 아시플루오르펜에 대한 내성을 부여하는 활성을 갖는프로토포르피리노겐옥시다아제 및 그 유전자
GB0526044D0 (en) 2005-12-21 2006-02-01 Syngenta Ltd Novel herbicides
GB0603891D0 (en) 2006-02-27 2006-04-05 Syngenta Ltd Novel herbicides
US20070214515A1 (en) 2006-03-09 2007-09-13 E.I.Du Pont De Nemours And Company Polynucleotide encoding a maize herbicide resistance gene and methods for use
VN21892A1 (en) 2007-04-04 2010-01-25 Basf Plant Science Gmbh Ahas mutants
MX2009012120A (es) 2007-05-09 2010-02-12 Dow Agrosciences Llc Genes novedosos con resistencia a herbicidas.
AR066787A1 (es) 2007-05-30 2009-09-09 Syngenta Participations Ag Genes del citocromo p450 que confieren resistencia a los herbicidas
CN101215289A (zh) 2008-01-11 2008-07-09 南开大学 具有PPO抑制活性及除草活性的3-取代苯基-吡唑并[3,4-d][1,2,3]三嗪-4-酮类化合物
CA2741138A1 (en) 2008-10-29 2010-05-06 Basf Se Substituted pyridines having herbicidal action
EA023754B1 (ru) 2009-06-19 2016-07-29 Басф Се Гербицидные бензоксазиноны
WO2011018486A2 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Basf Se Herbicidally active composition comprising benzoxazinones
UA112969C2 (uk) 2010-08-03 2016-11-25 Сібас Юс Ллс Рослина, стійка до одного або більше ррх-інгібуючих гербіцидів, яка містить мутантний ген протопорфіриноген ix оксидази (ррх)
US20120122223A1 (en) 2010-08-03 2012-05-17 Cibus Us Llc Mutated protoporphyrinogen ix oxidase (ppx) genes
EP2621924B1 (en) 2010-10-01 2015-03-04 Basf Se Herbicidal benzoxazinones
UA121371C2 (uk) 2010-12-16 2020-05-25 Басф Агро Б. В. Стійка до гербіцидів трансгенна рослина, яка містить мутантну протопорфіриногеноксидазу
AR091489A1 (es) 2012-06-19 2015-02-11 Basf Se Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno oxidasa (ppo)
US10041087B2 (en) 2012-06-19 2018-08-07 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
BR112016002851B1 (pt) 2013-08-12 2022-02-22 BASF Agro B.V. Molécula de ácido nucleico, constructo de ácido nucleico, vetor, polipeptídeo ppo, método para controlar vegetação indesejada e uso do ácido nucleico
UA123757C2 (uk) 2013-08-12 2021-06-02 Басф Агро Б. В. Мутована протопорфіриногеноксидаза, що надає рослинам стійкості до ппо-інгібуючого гербіциду
BR112016014174B1 (pt) 2013-12-18 2022-03-15 BASF Agro B.V. Método de controle de vegetação indesejada e método de produção de uma célula vegetal transgênica

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1036571A (zh) * 1988-02-05 1989-10-25 财团法人相模中央化学研究所 苯并恶嗪酮化合物和含有这种化合物的除草组合物
WO1997032011A1 (en) * 1996-02-28 1997-09-04 Novartis Ag Dna molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof
WO2001012815A1 (de) * 1999-08-18 2001-02-22 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Von coxsackieviren abgeleitetes vektorsystem für gentransfer

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUANG M.Z. et al. Synthesis and herbicidal activity of isoindoline-1,3-dione substituted benzoxazinone derivatives containing a carboxylic ester group. J. Agric. Food Chem. 2009, vol. 57, № 20, p. 9585-9592 *
JUNG H.I. et al. Resistance mechanisms in protoporphyrinogen oxidase (PROTOX) inhibitor-resistant transgenic rice. Journal of Plant Biology. Oct. 2007, vol. 50, № 5, p. 586-594 *
LI X.G. et al. Development of protoporphyrinogen oxidase as an efficient selection marker for Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maize. Plant Physiology. Oct. 2003, vol. 133, p. 736-747 *
PATZOLDT W.L. et al. A codon deletion confers resistance to herbicides inhibiting protoporphyrinogen oxidase. PNAS. 15 Aug.2006, vol. 103, № 5, p. 12329-12334 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2652139B1 (en) 2021-10-20
US20150252379A1 (en) 2015-09-10
EA201390842A1 (ru) 2013-12-30
KR20140033330A (ko) 2014-03-18
AU2011342759B2 (en) 2017-04-27
EP2652139A4 (en) 2014-05-21
CR20130296A (es) 2013-08-09
CA2818917C (en) 2023-02-28
MY169304A (en) 2019-03-21
EP2652139A1 (en) 2013-10-23
CA2818917A1 (en) 2012-06-21
JP6334169B2 (ja) 2018-05-30
KR102085133B1 (ko) 2020-03-05
BR112013014778A2 (pt) 2017-06-06
CN103261424B (zh) 2017-12-12
MX2013005975A (es) 2013-07-15
DE112011104396T5 (de) 2013-10-10
JP2014504855A (ja) 2014-02-27
WO2012080975A1 (en) 2012-06-21
US11274313B2 (en) 2022-03-15
UA121371C2 (uk) 2020-05-25
US20220315943A1 (en) 2022-10-06
ZA201305262B (en) 2014-12-23
ES2903230T3 (es) 2022-03-31
CN103261424A (zh) 2013-08-21
MX347362B (es) 2017-04-10
AU2011342759A1 (en) 2013-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA029356B1 (ru) Растения с повышенной устойчивостью к гербицидам
CN105637091B (zh) 对除草剂具有增强的耐受性的植物
CN106029890B (zh) 对除草剂具有增强的耐受性的植物
US20240026371A1 (en) Plants having increased tolerance to herbicides
CN104662155B (zh) 对除草剂具有增强的耐受性的植物
CN107645908A (zh) 对除草剂具有提高的耐受性的植物
DE112011101566T5 (de) Pflanzen mit erhöhter herbizidtoleranz
CN109790153A (zh) 具有增加的除草剂耐受性的植物
CN106460007A (zh) 具有增加的除草剂耐受性的植物
CN105247058A (zh) 具有增加的除草剂耐受性的植物
DE112012004586T5 (de) Pflanzen mit erhöhter Toleranz gegenüber Herbiziden
CN111801012A (zh) 具有增加的除草剂耐受性的植物
CN107426979A (zh) 具有增加的除草剂耐受性的植物
CN105358697A (zh) 具有增加的除草剂耐受性的植物
CN117897378A (zh) 对除草剂具有增加的耐受性的植物
CN109688807A (zh) 具有增加的除草剂耐受性的植物

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG TJ TM