UA121371C2 - Стійка до гербіцидів трансгенна рослина, яка містить мутантну протопорфіриногеноксидазу - Google Patents

Стійка до гербіцидів трансгенна рослина, яка містить мутантну протопорфіриногеноксидазу Download PDF

Info

Publication number
UA121371C2
UA121371C2 UAA201308956A UAA201308956A UA121371C2 UA 121371 C2 UA121371 C2 UA 121371C2 UA A201308956 A UAA201308956 A UA A201308956A UA A201308956 A UAA201308956 A UA A201308956A UA 121371 C2 UA121371 C2 UA 121371C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
ppo
bek
plant
rgo
avr
Prior art date
Application number
UAA201308956A
Other languages
English (en)
Inventor
Йоханнес Хутцлер
Йоханнэс Хутцлер
Рафаель Апонте
Томас Мітцнер
Томас Митцнер
Маттіас Вічель
Маттиас Вичель
Аня Сімон
Аня Симон
Єнс Лерхль
Енс Лерхль
Штефан Треш
Штэфан Трэш
С. Люк Манкін
С. Люк Манкин
Original Assignee
Басф Агро Б. В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Басф Агро Б. В. filed Critical Басф Агро Б. В.
Publication of UA121371C2 publication Critical patent/UA121371C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/32—Ingredients for reducing the noxious effect of the active substances to organisms other than pests, e.g. toxicity reducing compositions, self-destructing compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12N9/0059—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5097—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving plant cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Abstract

Винахід стосується клітини трансгенної рослини, трансформованої нуклеїновою кислотою, що кодує mut-PPO, де експресія нуклеїнової кислоти в клітині рослини приводить до підвищеної стійкості або толерантності до гербіциду, що походить з бензоксазинону, в порівнянні з рослинною клітиною дикого типу. Винахід також стосується трансгенної рослини, яка експресує мутантну або рекомбінантну mut-PPO, та способу продукування трансгенної рослини.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД
Даний винахід стосується в цілому способів надання рослинам сільськогосподарського рівня толерантності до гербіциду. Зокрема, винахід відноситься до рослин, що мають підвищену толерантність до гербіцидів, що є "похідним бензоксазинону". Більш конкретно даний винахід відноситься до способів і рослин, отриманих в результаті мутагенезу, схрещування та трансформації що мають підвищену толерантність до гербіцидів, що є "похідними бензоксазинону".
ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ
Гербіциди, які інгібують оксидазу протопорфіриногену (надалі іменований як Ргоїох або
РРО; ЕС:1.3.3.4), що є ключовим ферментом в біосинтезі протопорфірина ІХ, використовуються для селективної боротьби з бур'янами з 1960 року. РРО каталізує останній загальний етап в біосинтезі хлорофілу і гему, який окислює протопорфіриноген ІХ в протопорфірин ІХ. Майніпде еї а. 1989. Віоспет. 1. 260: 2311). РРО-інгібуючі гербіциди включають багато різних структурних класів молекул (ОиКе еї аІ. 1991. МУеєй 5сі. 39: 465; Мапаїнаїї еї аІ. 1992. Ревіїсіде Віоспет.
РНузіої. 43: 193; Маїйпде єї аІ. 1989. РЕВ5 Гей. 245: 35; Мапазе апа Ападон. 1989. Резіісіде
Віоспет. РПпузіої. 35: 701. Ці гербіцидні сполуки включають дифенілові естери «наприклад, лактофен, (-)-2-етокси-1-метил-2-оксоетил 5-(2-хлор-4-«(«трифторметил)фенокси)-2- нітробензоат; ацифлуорфен, 5-(2-хлор-4-(трифторметил)фенокси)-2-нітробензойну кислоту; Її метиловий естер; або оксифлуорфен, 2-хлор-1-(3-етокси-4-нітрофенокси)-4-(трифторбензол)), оксидіазоли (наприклад, оксидіазон, 3-12,4-дихлор-5-(1-метилетоксі)феніл)-5-(1,1-диметилетил)- 1,3,4-оксадіазол-2-(3Н)-он), циклічні іміди (наприклад, 5-23142, М-(4-хлор-2-фтор-5- пропаргілоксіфеніл)-3,4,5,6-тетрагідрофталімід; хлорфталім, М-(4-хлорфеніл)-3,4,5,6- тетрагідрофталімід), фенілпіразоли (наприклад, ТНРР-етил, етил 2-(1-(2,3,4-трихлорфеніл)-4- нітропіразоліл-5-окси)пропіонат; МВ 39279), похідні піридину (наприклад, 5 82-556) і фенопілат та його О-фенілпіролідино- та піперидинкарбаматні аналоги. Багато з цих сполук конкуренто інгібують звичайні реакції, що каталізуються ферментом, які, можливо, виступають в якості аналогів субстрату.
Застосування РРО-інгібуючих гербіцидів призводить до накопичення протопорфіриногену ІХ в хлоропластах і мітохондріях, які, як вважають, потрапляють в цитозоль, де він окислюється
Зо пероксидазою. Під впливом світла протопорфірин ІХ викликає утворення синглетного кисню в цитозолі та утворює інші реактивні види кисню, які можуть викликати перекисне окислення ліпідів та руйнування мембран, що призводить до швидкої загибелі клітини (ее та ін. 1993.
Ріапі РНузіої. 102: 8811.
Не всі РРО ферменти чутливі до гербіцидів, які інгібують рослинні ферменти РРО. Обидва
РРО ферменти ЕзсепПегіспіа соїї та Васіїив5 зибБій5 (Зазаптеп та ін. 1993. Сап 9. Місгобіої. 39: 1155; Райеу та ін. 1994. 9. Віої. Спет. 269:813| стійкі до цих гербіцидних інгібіторів. Були зареєстровані мутанти одноклітинної водорості СпІіатудотопаз геїіпНагаййї, стійкі до фенілімід гербіцидів 5-23142 ІКаїаока єї аї. 1990. 9. Ревіїсіде сі. 15: 449; Зніраїйа єї аї. 1992. Іп Везвєагснй іп
Рпоїозупіпевіб5, Мої. ПІ, М. Мигаїа, ей. Кіцугег; Ме йепапавб. рр. 567-70|Ї. Принаймні один з цих мутантів, як виявилося, має змінену активність РРО, і який стійкий не тільки до гербіцидного інгібітору, на якому мутант був обраний, але також і до інших класів інгібіторів протокса (О5пПіо еї а! 1993. 7. Маїшпогесп. 48с:339; за еї аІ. 1994. В АС5 Зутрозішт оп РогрПугіс Резіісідев5, 5. рике, ей. АС5 Ргев55: УмМазпіпоїоп, О.С). Лінії клітин мутантного табаку також стали відомі як резистентні до інгібітора 5-21432 |СНе єї аІ. 1993. 7. Маїшпогеси. 480: 350). Ауксотрофічні мутанти Е.соїї були використані для підтвердження стійкості до гербіцидів клонованих рослинних РРО.
Три основні стратегії доступні для створення рослин, толерантних до гербіцидів, тобто (1) детоксикація гербіцидів з ферментом, який перетворює гербіцид або його активний метаболіт у нетоксичні продукти, такі як, наприклад, ферменти для толерантності до бромоксинілу або до басти (ЕР242236, ЕР3378991; (2) мутації ферменту-мішені в функціональному ферменті, який менш чутливий до гербіциду, або його активного метаболіту, такого як, наприклад, ферментів для толерантності до гліфосату (ЕР293356, Раддеце 5.К. та ін., У.ВіоІ!. Спет., 266, 33, 1991; або (3) гіперекспресія чутливого ферменту таким чином, щоб кількість цільового ферменту в рослині була достатньою по відношенню до гербіциду, зважаючи на кінетичну константу цього ферменту, так, щоб мати достатньо доступного функціонального ферменту, незважаючи на чутливість його інгібітору. Третя стратегія була описана для успішного отримання рослин, які були стійкі до РРО інгібітора (див., наприклад, Ш5З5,767,373 або О55,939,602, і патенти аналоги).
Крім того у ОБ 2010/0100988 ї УМО 2007/024739 розкривають нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотні послідовності, які мають ферментативну активність таким чином, що амінокислотні послідовності стають стійкими до гербіцидних хімічних речовин РРО інгібіторів, зокрема до 3-фенілурацілу, інгібітора конкретних мутантів РРО.
На сьогоднішній день в попередньому рівні техніки не описані рослини, які толерантні до гербіцидних похідних бензоксазинону рослин, що містять принаймні одну дикого типу нуклеїнову кислоту або РРО-мутовану. Також не описано у попередньому рівні техніки культурні рослини, що толерантні до гербіцидних похідних бензоксазинону, що містять мутації в геномах, крім геному, з якого РРО ген походить. Таким чином, існує потреба в даній області в ідентифікації генів, толерантних до гербіцидних похідних бензоксазинону з додаткових геномів та видів. Також необхідним в даній галузі є культурні рослини та культурні рослини, що володіють підвищеною стійкістю до гербіцидів, таких як похідних бензоксазинону гербіцидів і містять принаймні одну нуклеїнову кислоту дикого типу та/або мутованого РРО. Також необхідні методи контролю бур'янів в безпосередній близькості від таких культурних рослин або сільськогосподарських культур. Ці композиції і методи дозволені для використання розпиленням методами при застосуванні гербіцидів для областей, що містять культурні та сільськогосподарські рослини.
СУТЬ ВИНАХОДУ
Завдання вирішується представленим винаходом, який відноситься до способу контролю небажаної рослинності на ділянці для вирощування рослин, що включає наступні стадії: а) забезпечення у вказаній ділянці рослини, яка містить щонайменше одну нуклеїнову кислоту, яка містить нуклеотидну послідовність, яка кодує протопорфіриногеноксидазу (РРО) дикого типу або мутовану протопорфіриногеноксидазу (ти-РРО), яка є стійкою або толерантною до гербіцидних похідних бензоксазинону, р) нанесення на вказані ділянки ефективної кількості зазначеного гербіциду.
Крім того, даний винахід стосується способу ідентифікації гербіцидних похідних бензоксазинону при використанні дикого типу або тш-РРО, що кодується нуклеїновою кислотою, яка включає нуклеотидні послідовності 5ЕО ІО МО: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23,25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, або 45, або їх варіанти.
Зазначений спосіб включає такі стадії: а) генерації трансгенних клітин або рослин, що містять нуклеїнову кислоту, що кодує тиї-
РРО, що відрізняється тим, тиЇ-РРО є експресованим; р) використання гербіцидних похідних бензоксазинону до трансгенних клітин або рослин, а також контроль клітин або рослин того ж виду; с) визначення росту або життєздатності трансгенних клітин або рослин і контрольних клітин або рослин після застосування зазначеної тест-сполуки; і а) відбір тестованих сполук, які призводять до зниження росту в контрольних клітинах або рослинах в порівнянні з ростом трансгенних клітин або рослин.
Інший об'єкт стосується способу ідентифікації нуклеотидної послідовності, яка кодує тиї-
РРО, що є стійким або толерантним до гербіцидних похідних бензоксазинону, що містить етапи: а) генерування бібліотеки нуклеїнових кислот, що кодують тиї-РРО, р) скринінг популяції отриманих нуклеїнових кислот, що кодують тиш-РРО, шляхом експресії кожної із зазначених нуклеїнових кислот у клітині або рослині та обробку вказаних клітин або рослин гербіцидним похідними бензоксазинону, с) порівняння рівнів толерантності гербіцидного похідного бензоксазинону, поширених у частині популяції нуклеїнових кислот, що кодують тШш-РРО з рівнем толерантності до гербіцидного похідного бензоксазинону, поширеним у контролі нуклеїнових кислот, що кодують
РРО, а) вибір щонайменше однієї нуклеїнової кислоти, що кодує тиї-РРО, яка забезпечує значно підвищений рівень стійкості до гербіцидного похідного бензоксазинону в порівнянні з впровадженим контролем нуклеїнової кислоти, що кодує РРО.
У переважному варіанті здійснення, нуклеїнова кислота, що кодує ти-РРО, вибрана на стадії 4), забезпечує щонайменше в 2 рази більше толерантності до гербіцидного похідного бензоксазинону в порівнянні з впровадженим контролем нуклеїнової кислоти, що кодує РРО.
Стійкість або толерантність може бути визначена шляхом генерації трансгенних рослин, що містять бібліотеки послідовності нуклеїнової кислоти на стадії а) і порівняння зазначеної трансгенної рослини з контрольною рослиною.
Інший об'єкт стосується способу ідентифікації рослини або водорості, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує тШш-РРО, що є стійкою або толерантною до гербіцидного похідного бензоксазинону та включає етапи: а) визначення ефективної кількості гербіцидного похідного бензоксазинону в культурі клітин 60 рослин або зелених водоростей.
р) обробку зазначеної клітини рослини або зеленої водорості з мутагенізуючим агентом, с) контактування зазначеної популяції мутантних клітин з ефективною кількістю гербіцидного похідного бензоксазинону, зазначених у а) а) вибір щонайменше однієї клітини, що залишилася живою в цих умовах випробувань, е) ПЛР-ампліфікацію і секвенування генів РРО з клітин обраних в 0) і порівняння цих послідовностей з послідовністю дикого типу генів РРО відповідно.
У переважному варіанті мутагенізуючим агентом є етилметансульфонат.
Інший об'єкт стосується виділеної нуклеїнової кислоти, що кодує тш-РРО, нуклеїнова кислота ідентифікована за способом, як визначено вище.
В іншому варіанті винахід стосується рослинної клітини, що трансформована дикого типу або тиЇ-РРО нуклеїновою кислотою або рослини, яка була мутована для отримання експресії рослини, переважно з надекспресією дикого типу або тш-РРО нуклеїнової кислоти, в якій експресія нуклеїнової кислоти в клітині рослини призводить до збільшення стійкості або толерантності до гербіциду, що є похідним бензоксазинону, порівняно з варіантом дикого типу рослинної клітини.
В іншому варіанті здійснення даний винахід відноситься до рослин, що включають рослинні клітини відповідно до даного винаходу, в яких експресія нуклеїнових кислот в рослині призводить до підвищеної стійкості рослин до гербіциду, що є похідним бензоксазинону, в порівнянні з варіантами рослин дикого типу.
Рослини представленого винаходу можуть бути як трансгенними, так і нетрансгенними.
Переважно експресія нуклеїнової кислоти у рослин призводить до підвищення стійкості рослин до гербіциду, що є похідним бензоксазинону, в порівнянні з варіантами рослин дикого типу.
В іншому варіанті винахід стосується отримання насіння трансгенної рослини, що містить рослинну клітину за даним винаходом, у якому насіння розмножується гомозиготно для підвищенної резистентності до гербіциду, що є похідним бензоксазинону, в порівнянні з варіантами рослин дикого типу.
В іншому варіанті здійснення винахід стосується способу одержання клітини трансгенної рослинної з підвищеною стійкістю до гербіциду, що є похідним бензоксазинону, в порівнянні з
Зо варіантами клітин рослин дикого типу, що включає трансформацію рослинної клітини експресійною касетою, що містить нуклеїнові кислоти дикого типу або ти-РРО.
В іншому варіанті здійснення даний винахід стосується способу одержання трансгенної рослини, що включає в себе: (а) трансформацію рослинної клітини касетою експресії, яка містить нуклеїнові кислоти дикого типу або тш-РРО, і (Б) отримання рослин з підвищеною стійкістю до гербіциду, що є похідним бензоксазинону, з рослинної клітини. Переважно експресійна касета додатково містить регуляторні області ініціації транскрипції та регуляторні області ініціації трансляції, які Є функціональними в рослині.
В іншому варіанті винахід стосується використання тш-РРО винаходу в якості селективного маркера. Винахід відноситься до методу виявлення або вибору трансформованої рослинної клітини, рослинної тканини, рослини або її частини, що складається з а) отримання трансформованої рослинної клітини, рослинної тканини, рослини або частини Її, в якій вказана трансформована рослинна клітина, рослинна тканина, рослина або частина її містить ізольовану нуклеїнову кислоту, яка кодує поліпептид тиш-РРО за винаходом, як описано нижче, де поліпептид використовується у якості селективного маркеру і де зазначена трансформована рослинна клітина, рослинна тканина, рослина або частина її може додатково вміщувати ізольовану нуклеїнову кислоту за інтересом; Б) контактування трансформованої рослинної клітини, рослинної тканини, рослини або частини її з принаймні однією сполукою, що інгібує похідні бензоксазинону; с) визначення, чи є рослинна клітина, рослинна тканина, рослина або частина рослини залежною від інгібітора або сполуки, здатної інгібувати; та 4) визначення або вибір трансформованої рослинної клітини, рослинної тканини, рослини або частини її.
Винахід також реалізується в очищених тиї-РРО білках, які містять мутації, що описані тут, які можна використовувати в дослідженнях молекулярних моделей для проектування подальшого поліпшення стійкості до гербіцидів. Методи очищення білків є дуже відомими і можуть бути легко виконані з використанням комерційно-доступних продуктів або спеціально розроблених методів, як викладено, наприклад, у Ргоївіп Віоїесппоіоду, УМаієй апа Неадоп (УМіеу, 1994).
КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ
Фігура 1 показує вирівнювання послідовності амінокислот Атагапійиз шбегсшав5 (Алибегсціаси5), Атагапіпих їшбрегсціай5 стійке (Алибегсціайи5 К), Агарідорзі5 (Пайапа довге бо (А.(Паїїапа 2), Зріпасіа оіегасеа коротке (5.0Іегасеа 2), Місойапа їабасит коротке
(Млабасит 2), гліцин максимальне (Сіусіпе тах), Агарідорзів5 (Паїйапа коротке (АПВаїїапа 1),
Місойапа їарасит довге (МЛарасит 1), Спіатудотопах геїппагайкі довге (С.геіпНагайії 1), 7ва тауз (7.таув5), Огуга взаїїма (0.5айма 1), 5оїапит їшбегозит (5ЛИирегозит), Сиситів взаїмив (С.займив), Сіспогіит іпїуриз (С.іпіурив 1), Зріпасіа оіІегасеа довге (5.0Іегасеа 1), Роїутеїйа 5р.
Ргіпдзпеїт 198.80 (РоуотеїІа) РРО послідовності. Збережені ділянки виділено світло-сірим, сірим та чорним кольорами.
На Фігурі 2 показано штам Спіатудотопазв геїіпНагаїїйї, стійкий до гербіциду, що є похідним бензоксазинону, 1.а.35 гербіциду. (А) Мутагенізовані клітини висівають на тверде середовище без селективного агента. (В) Мутагенізовані клітини висівають на тверде середовище, що містить 1х10-7 М похідної бензоксазинону І. а.35. Клітини, які стійкі до гербіциду, що є похідним бензоксазинону, формують колонії (в колі і пронумеровані 33, 34, 35 і 36), тоді як чутливі клітини не ростуть. Найбільше число колоній на планшеті А, в порівнянні з планшетом В, показує наскільки колонія В стійка до гербіциду, що є похідним бензоксазинону, І. а.35.
Фігура З показує повторний ріст вибраних штамів Спіатудотопаз геіпВагайії, як показано на
Фігурі 2, стійких до гербіциду, що є похідним бензоксазинону, І. а.35. (А) Клітини дикого типу у рідкому середовищі без селективного агента. (В) Клітини дикого типу у рідкому середовищі, що вміщує більше похідної бензоксазинону І. а.35 (від 1х109 до 5х106 М). (С) Мутагенізовані клітини у рідкому середовищі без селективного агенту. (01, 02, Е1, Е2) Мутагенізовані та вибрані штами у рідкому середовищі, що містять збільшену кількість похідної бензоксазинону І. а.35 (від 1х109-5х105 М). Штами, що стійкі до похідної бензоксазинону І. а.35. Культури темного кольору показують ріст. Чутливих штамів не має в культурі та вони відмічені світлим кольором.
Більш високу щільність клітин у рідкому середовищі з клітинами, які ростуть, відмічено темним кольором. Низька щільність культури відмічена світлим або забарвлення відсутнє.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Таблиця 1 2 ф|АмінокислотаРРО / |Атагапійив/// 77777771 ІАВОБ2326 9 14 ф|АмінокислотаРРО / |Атагтапйив/// 77777771 ІАВОБ2329ш9Ч 6 ф|АмінокислотаРРО / |Атагтапійив/// 77777711 ІАВОБ2330 8 ф|АмінокислотаРРО / |Атагтапіив// 77777777 ІАВОБ2328ГЗ 9 |НуклеїновакислотаРРО |Агарійорвів РРХ (АВОО7650 З 10 ф|АмінокислотаРРО |Агарідйорвів/// | ІВАВОВЗОТ 12 ф|АмінокислотаРРО | Місойапа.ї//// 17777777 ІААСОг290ШЮШ 14 ф|АмінокислотаРРО // |Сіпойит 17777717 ФАРІБбОЗ61 10 16 ф|АмінокислотаРРО /|Зріпаса//////// 17777111 ІВААОБВОВ 18 |АмінокислотаРРО /|Зріпаса | ІВАВбОЛО З 20 ф|АмінокислотаРРО /|Зоїапит 17771771 ІСААТЯОЮЮ0 22 |АмінокислотаРРО /-/- |/еа.////////777/ 17717171 1АСМ283560О 24 ф|АмінокислотаРРО /-/-|/еа./////7777777777 17171717 МР, 01105004 26 |АмінокислотаРРО |Спіатуйотопазї | - ІААСТОБВЮ 27 |НуклеїновакислотаРРО |Роуютейй (РРО // (АРЗ32964 З 28 |АмінокислотаРРО |Роуютейй | 777777 ІАРЗ329641 |АмінокислотаРРО //|Зодпит 17717171 ХР 002446710 (81 |НуклеїновакислотаРРО |Спотеіа.//-/-/:/
32 |АмінокислотаРРО /|Спотйй////// | 77777777 15159871 34 |АмінокислотаРРО -/ |Огула//// 17777777 ІВАВЗО760 36 |АмінокислотаРРО |Атагапіив/// | ІАВОБ23259 38 |АмінокислотаРРО |Агарійорвів.//-/- | 777777 ІМРОВ49283ШЩГ 40 |АмінокислотаРРО /|Місойапа.ї//// 17777717 ААСОг291Ю0 42 |АмінокислотаРРО /|Суспе 17771711 ІВАА7вЗ3А8Ю0О 44 |АмінокислотаРРО /|Сиситв/////// 17777777 ІВАНВЯВВЯЛ ОО (46 |АмінокислотаРРО -- |Огула//// | 77777777 |САЕОТббІ
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС
Використання граматичних форм однини може бути використано і для позначення множини (наприклад, щонайменше один). Між іншим, наприклад, слово "елемент" може означати один або більше елементів.
Як використано тут, слова "містить" або його варіанти, такі як "вміщує" або "складається" слід розуміти включення зазначеного елемента, цілого або стадії, групи елементів цілих або стадій, але не виключає будь-якого іншого елемента цілого або стадії, групи елементів цілих або стадій. Представлений винахід відноситься до методу контролю небажаної рослинності на ділянці для вирощування рослин, що включає етапи: а) отримання у вказаній ділянці рослини, що містить принаймні одну нуклеїнову кислоту, яка включає нуклеотидну послідовність, що кодує протопорфіриногенну оксидазу або мутовану протопорфіриногенну оксидазу (тш-РРО), що є стійкою або толерантною до гербіциду, що є похідним бензоксазинону; р) нанесення на вказану ділянку ефективну кількість зазначеного гербіциду.
Термін "контроль небажаної рослинності" слід розуміти як знищення бур'янів та/або інше, що гальмує або інгібує нормальний ріст бур'янів. Під "бур'янами" слід розуміти всі рослини, які ростуть там, де їх поява є небажаною.
Бур'яни в представленому винаході включають, наприклад, дводольні та однодольні бур'яни. Дводольні бур'яни включають, але не обмежують, бур'яни родин: Зіпарів, І еріаіїшт,
Саїйшт, 5іеїЇага, Майісагіа, Апіпетів, Саїїпзода, Спепородіит, Ойіса, бепесіо, Атагапійив,
Ропшаса, Хапіпішт, Сопмоїмшив5, Іротоєа, Роїудопит, безбапіа, Атбргозіа, Сігвішт, Сагацйив,
Зопспив5, БоЇїапит, Вогірра, Роїаїа, І іпаетіа, Іатішт, Мегопіса, Абшіоп, Етех, Раїйшга, Міоїа,
СаіІеорзіх5, Рарамег, Сепіацгеа, Той т, Капипсиїш5, та Тагахасит. Однодольні бур'яни включають, але не обмежують, бур'яни родин:Еспіпоспіса, 5еїагіа, Рапісит, Оідкагіа, РпІеит,
Роа, Ревіийса, ЕІеивіпе, Вгаспніагіа, І от, Вготив, Амепа, Сурегив, Зогупит, Адгоругоп, Суподоп,
Мопоспогіа, Рітргівіузіїх, Задінага, ЕІеоснагі5, Зсігрих, Разраїшт, Ізспаєтит, 5рпепосієа,
Басіуіосіепішт, Адговії5, Аіюоресигих, та Арега. Додатково бур'яни представленого винаходу можуть включати, наприклад, культурні рослини, які ростуть в небажаному місці. Наприклад,
Зо вільні рослини кукурудзи, які ростуть на полі, де вирощують сою, та рослини кукурудзи там будуть небажаними.
Термін "рослина" застосовується у найширшому розумінні стосовно органічного матеріалу і призначений для охоплення еукаріотичних організмів, які входять до Царства рослин, приклади яких включають, але не обмежують судинні рослини, овочі, круп'яні, квіти, дерева, трави, чагарники, злакові, виноград, папороті, мохи, гриби і водорості, і т. д., а також клони, пагони і частини рослин, які використовують для безстатевого розмноження (наприклад, живці, стебла, пагони, кореневища, підземні стебла, бульби, верхівки, цибулини, кореневища, бульбоцибулини, рослини/тканин, що вирощені з культури тканин і т. д.). Термін "Рослини" додатково охоплює цілі рослини, предків і нащадків рослин і частин рослин, включаючи насіння, пагони, стебла, листя, коріння (у тому числі бульб), квіти, квіточки, фрукти, ніжки, плодоніжки, тичинки, пиляк, стигма, маленькі стебла, зав'язь, пелюстки, чашолистки, маточки, кінчик кореня, корінний цоколь, волосяне коріння, волосяне листя, волосяне насіння, пилок, мікроспори, сім'ядолі, гіпокотиль, епікотіль, ксилеми, флоеми, паренхіми, ендосперм, клітину-супутник, клітину охоронець і будь-які інші відомі органи, тканини і клітини рослин і тканин, і органів, де кожен з вищезазначених включають ген/нуклеїнову кислоту заявленого. Термін "рослина"
охоплює також клітини рослин, суспензійних культур, калюс, ембріони, меристематичні області, гаметофіти, спорофіти, пилок і мікроспори, знову ж таки, де кожна з вищезазначених включає ген/нуклеїнову кислоту за винаходом.
Рослини, які особливо корисні в способах за винаходом, включають всі рослини, які належать до царства Мігідіріапіає, зокрема однодольні і дводольні рослини, включаючи кормові або кормові бобові культури, декоративні рослини, продовольчі культури, дерева і чагарники, вибрані зі списку, що містить: Асег 5рр., Асіїпідіа 5рр., АбеІто5спи5 5рр., Адаме 5ізаіапа,
Адгоругоп 5рр., Адговіїв 5іобІопітега, АПит 5рр., Атагапіпйи5 5рр., Атторпійа агепагіа, Апапав5 сото5ив5, Аппопа 5рр., Аріит дгамеоіепв, Агаспі5 5рр, Апосагриз 5рр., Азрагадив опісіпаїі5, Амепа 5рр. (6.9. Амепа заїїма, Амепа їТаша, Амепа Бругапііпа, Амепа їТаша маг. займа, Амепа Нурііда),
Аметпоа сагатроїа, Ватриза 5р., Вепіпсаза Пізріда, ВепоїІейа ехсеї5єа, Веїа миїдагів, Вгазвіса 5рр. (6.9. Вгаззіса парих, Вгаззіса гара 55р. (канола, олійна ріпа, масельна ріпа)), Садавба
Тайіпоза, Сатеїйа 5іпепвзіз, Саппа іпаіса, Саппарів займа, Сарзісит в5рр., Сагех еїаїа, Сагіса рарауа, Сагізза тасгосагра, Сагуа 5рр., Сапнатив іпсіопив5, Савіапєа 5рр., Сеїра репіапага, Сіспойцт епаїміа, Сіппатотит в5рр., Спи Іапайб5, Сйгив врр., Сосо5 врр., Сойеа 5рр.,
СоіІосазіа езсціепіа, Соїа 5рр., Согспогив 5р., Сопапагит заїмит, Согуїшв 5рр., Стагаєдив з5рр.,
Стосиз заїі-мив, биситойа зрр., Сиситів 5рр., Супага 5рр., Оаийсив сагоїа, Оєзтодійт 5рр., Оіто- сагриз5 Іопдап, Оіозсогеа 5рр., Оіозруго5 5рр., ЕспіпоспІоса 5рр., ЕЇІаеї5 (наприклад, ЕЇІаеєїі5 диїпеепвів, ЕЇІаєї5 оїІвїега), ЕІєибіпе согасапа, Егадгобвіїв їеї, Епапіпи5 5р., Епоброїгуа |аропіса,
Еисаїуріи5 5р., Єпдепіа опійога, Гадоругит 5рр., Гадив 5рр., Гезійса агипаіпасеєа, Ріси5 сагіса,
Еопипепйа 5рр., Егадагіа 5рр., Сіпкдо Біоба, Сіусіпе 5рр. (наприклад, Сіусіпе тах, Зо)а Ппізріда або Зоі|а тах), Соз55урішт Вігзишт, Неїїапіпих 5рр. (наприклад, Неїїапіпих5 аппиц5), НетегосаїЇїб
Тима, Нірізсив 5рр., Ногаеит з5рр. (наприклад, Ногдешт миїдаге), Іротоєа бБаїаїаз, дидіап5 5рр.,
І асішса заїїма, І аїпугив 5рр., І еп5 сціпагів, Гіпит и5Наїіввітит, І йспі спіпепвів, І оїи5 зрр. а асшаподміа, Гиріпиз 5рр., Ги2ціа зуїмаїйса, І усорегзісоп 5рр. (наприклад, І усорегвзісоп езсшепішт,
Гусорегвісоп Іусорегзісцт, Гусорегзісоп грушоподібний), Масгоїуіота 5рр., Маїц5 5рр., Маїріойпіа етагдіпаїа, Маттєа атегісапа, Мапоїїега іпаїіса, Мапіпої 5рр., МапіїКага 2ароїа, Медісадо заїма,
Меї йоги 5рр., Мепіна з5рр., Мізсапіпиз» 5іпепві5, Мотогаїса 5рр., Могив підга, Миза 5рр., Місоїапа 5рр., ОЇІєа 5рр., Орипійа 5рр., Огпіпориз 5рр., Огуа 5рр. (наприклад, Огула з5аїїма, Огуга Іаїшоїіа),
Зо Рапісит тіїйасеит, Рапісит мігдаїшт, Раззійога єдиїйв5, Равзіїіпаса з5аїїма, Реппізешт 5р., Регзєа 5рр., Реїгозеїїпит сгізрит, РНаїагіз агипаіпасеа, Рпазеоіи5 5рр., РпІєит ргаїепзе, Рпоеєпіх 5рр.,
Ріигадтіїез ашизігаїї5, Рпузаїїв 5рр., Ріпив в5рр., Рівіасіа мега, Різит з5рр., Роа 5рр., Роршив 5рр.,
Ргозоріз врр., Ргипиб5 5рр., Рвідішт врр., Рипіса агапашт, Руги соттипіб5, Оцегсив врр.,
Варпапиз заїїми5, Впєит гНабрагтбагит, Вірез 5рр., Вісіпиє соттипів, Вибив 5рр., Засспагит
З5 5рр., Заїїх в5р., Затрисив5 зрр., бесаІє сегеаіє, Зезатит взрр., біпаріє в5р., боіапит 5рр. (наприклад, Боіапит їшрегозит, Зоїапит іпіедгітоїйнт або Зоіапит Іусорегвзісшт), Зогупит
Брісоїог, Зріпасіа 5рр., зугудіит 5рр., Тадеїез 5рр., Татагіпдив іпаіса, Пеобгота сасао, ТійоЇїйт 5рр., Тгірзасит адасіуїоіїде5, Т/йісозесаІе гітраці, Т/йісит 5рр. (наприклад, Тгйісит аевзімит,
Тийсит дикот, Тийсит Шедідит, Тиїїсит пубегтит, Тийїсит тасна, Гиййсицт ваймит, Тийсит топососсціт або Тгйісит миЇдаге), Тгораеоїшт тіпи5, ТгораеоЇїшт та/|)ц5, Массіпічт 5рр., Місіа 5рр., Мідпа 5рр., Міоїа одогаїа, Міїї5 5рр., 7ва таув, 7і2апіа раїшвігів, 27ігірпи5 5рр., амарант, артишок, спаржу, броколі, брюссельську капусту, капуста, ріпак, моркву, цвітну капусту, селеру, листова капуста, льон, капуста, сочевиця, ріпак, бамія, цибуля, картопля, рис, соя, полуницю, цукрові буряки, цукровий очерет, соняшник, помідори, кабачки, чай і водорості, серед інших.
Відповідно до кращого варіанту здійснення даного винаходу, рослиною є культурна рослина.
Приклади культурних рослин включають, серед іншого сою, соняшник, ріпак, люцерну, ріпак, бавовну, томати, картоплю і тютюн. Більш переважно, рослиною є однодольні рослини, такі, як цукровий очерет. Крім того, переважно, рослиною є зернові, такі як рис, кукурудза, пшениця, ячмінь, просо, жито, сорго або овес. У переважному варіанті здійснення винаходу рослину спочатку було вироблено за способом, що включає рекомбінантне підготування рослин шляхом введення і надекспресією РРО трансгену дикого типу або ти-РРО трансген, як описано більш докладно нижче.
В іншому переважному варіанті здійснення винаходу рослину раніше було отримано за способом, що включає іп 5йи мутагенізацію рослинних клітин та отримання рослинних клітин, які експресують ти-РРО.
Як описано тут, нуклеїнові кислоти за винаходом знайдуть застосування у підвищенні стійкості рослин до гербіцидів, які містять у своєму геномі ген, що кодує білок, толерантний до гербіцидів дикого типу або тш-РРО. Такий ген може бути ендогенним або трансгенним, як описано нижче. Крім того, в деяких варіантах здійснення нуклеїнові кислоти за даним 60 винаходом можуть бути складені з будь-якої комбінації полінуклеотидних послідовностей за винаходом для створення рослин бажаного фенотипу. Наприклад, нуклеїнові кислоти за даним винаходом можуть бути складені з будь-яким іншим полінуклеотидним, що кодує поліпептиди, що мають пестицидну та/або інсектицидну активність, такі як, наприклад, білок токсину Васіїйи5
Тпигіпдіепзі5 (описано в патентах Ш.5. Раїепі Мо5. 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5,723,756; 5,593,881; апа Сеїзег еї аіІ (1986) Сепе 48: 109). Створені комбінації можуть також включати кілька копій будь-яких з полінуклеотидів, що заявлені.
В особливо кращому варіанті здійснення винаходу, рослина містить щонайменше одну додаткову гетерологичну нуклеїнову кислоту, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує фермент стійкості до гербіцидів, обраний, наприклад, з групи, що складається з 5- енолпірувілшикімат-з-фосфатсинтази (ЕРБР5Б), гліфосатацетилтрансферази (САТ), цитохром
РА.Б5О, фосфинотрицинацетилтрансферази (РАТ), ацетогідроксикислотсинтази (АНА5, ЕС 4.1.3.18, також відомий як ацетолактатсинтази або АЇ 5), гідроксифенілдіоксигенази пірувату (НРРОБ), фітоіїнов десатурази (РО) і фермент руйнування дикамби, як розкрито в МО 02/068607 або фермент руйнування похідних феноксиоцтової- та феноксипропіонової кислот, як розкрито в УМО 2008141154 і УМО 2005107437. Як правило, термін "гербіцид" використовується тут для позначення активного інгредієнта, який знищує, контролює або іншим чином негативно модифікує ріст рослин. Переважна кількість або концентрація гербіциду є "ефективною кількістю" або "ефективною концентрацією". Під терміном "ефективна кількість" і "ефективна концентрація" слід розуміти кількості і концентрації відповідно, які Є достатніми для знищення або інгібування росту подібного, дикого типу, рослин, рослинної тканини, рослинних клітин або клітини-хазяїна, але ця вказана кількість не вбиває або інгібує суворо ріст стійких до гербіцидів рослин, рослинної тканини, рослинні клітини і клітини-хазяїна за даним винаходом. Як правило, ефективна кількість гербіциду Є кількістю, яка зазвичай використовується в сільськогосподарських виробничих системах, щоб убити бур'яни, як заявлено. Така кількість є відомою фахівцям в даній області. Гербіцидну активність проявляє гербіцид, що є похідним бензоксазинону за даним винаходом, коли його наносять безпосередньо на рослину або на локус рослини на будь-якій стадії росту або перед посадкою, або поростанням. Отриманий ефект залежить від виду рослин, що підлягають знищенню, стадії росту рослини, застосування параметрів розбавлення і розміру краплі розпилення, розміру часток твердих компонентів, умов навколишнього середовища під час застосування, конкретно застосовуваної сполуки, певних ад'ювантів і носіїв, типу грунту, тощо, а також кількості хімічного застосування. Ці та інші фактори можуть бути скориговані, як відомо в даній області, для сприяння неселективної або селективної гербіцидної дії. Як правило, переважно, для досягнення максимальної боротьби з бур'янами застосовують гербіцидні похідні бензоксазинону для після сходової обробки у відношенні незрілої небажаної рослинності.
Під "стійкими до гербіцидів" або "стійкою до гербіцидів" рослиною, розуміють те, що рослина толерантна або стійка до, принаймні одного гербіциду, рівень якого, як правило, знищує або пригнічує ріст нормального або дикого типу рослини. Під "толерантний до гербіцидів ти-РРО білок" або "стійкий до гербіцидів тш-РРО білок" слід розуміти, що такий тш-РРО білок демонструє більшу РРО активність, порівняно з активністю білку РРО дикого типу, тоді як у присутності принаймні одного гербіциду, як відомо, перешкоджається активність РРО і при концентрації або рівні гербіциду, який, як відомо, інгібує РРО активність дикого типу ти-РРО білка. Крім того, активність РРО таких стійких до гербіцидів або стійких до гербіцидів тш-РРО білків може згадуватися тут як активність РРО "толерантних до гербіциду" або "стійких до гербіциду". "Гербіцид, що є похідним бензоксазинону" відповідно до даного винаходу включає бензоксазинон формули І, як показано в наступному прикладі: 2 1 о Кк о Аз ев - г
М М М М
ОА т 2 І є, де
БО В' означає водень або галоген;
Вг означає галоген;
ВЗ означає водень або галоген;
В" означає водень, Сі-Св-алкіл, Сі-Св-галогеналкіл, Сз-Све-циклоалкіл, Сз-Св-алкеніл, Сз-Св- галогеналкеніл, Сз-Св-алкініл, Сз-Св-галогеналкініл, Сі-Св-алкокси або Сз-Св-циклоалкіл- С1-Св- алкіл;
В? означає водень, МН», Сі-Св-алкіл або Сз-Св-алкініл;
В? означає водень або Сі-Св-алкіл; і
УМ означає О або 5; 7 означає О або 5.
В іншому переважному варіанті здійснення "гербіцидна похідна бензоксазинону", відповідно до даного винаходу, включає в себе бензоксазинон формули І, як показано в наступному прикладі:
А) принаймні одного бензоксазинону загальної формули 1 2 о" й й б «МАК. ри ве
ХМ о во де
В' означає водень або галоген;
Вг означає галоген;
ВЗ означає водень або галоген;
В" означає водень, Сі-Св-алкіл, Сі-Св-галогеналкіл, Сз-Све-циклоалкіл, Сз-Св-алкеніл, Сз-Св- галогеналкеніл, Сз-Св-алкініл, Сз-Св-галогеналкініл, Сі-Св-алкокси або Сз-Св-циклоалкіл- С1-Св- алкіл;
В? означає водень, МН», Сі-Св-алкіл або Сз-Св-алкініл;
В? означає водень або Сі-Св-алкіл; і
УМ означає О або 5; 7 означає О або 5.
В іншому переважному варіанті здійснення "гербіцидна похідна бензоксазинону" відповідно до даного винаходу включає бензоксазинон формули І, як показано в наступному прикладі:
А) принаймні одного бензоксазинону загальної формули 2 в! (о, Кк З о Кк т ЖД
М М М У
А А в х М о у де ВЕ! означає водень або галоген;
Ко) Іг означає галоген;
ВЗ означає водень або галоген;
В" означає водень, Сі-Св-алкіл, Сі-Св-галогеналкіл, Сз-Све-циклоалкіл, Сз-Св-алкеніл, Сз-Св- галогеналкеніл, Сз-Св-алкініл, Сз-Св-галогеналкініл, Сі-Св-алкокси або Сз-Св-циклоалкіл-С1-Св- алкіл;
В? означає водень, МН», Сі-Св-алкіл або Сз-Св-алкініл;
В? означає водень або Сі-Св-алкіл; і
Х означає О або 5;
У означає О або 5; і щонайменше з одною додатковою активною сполукою, вибраною з р) гербіциду класу В1)-В15):
БІ) інгібіторів біосинтезу ліпідів; рг) інгібіторів ацетолактатсинтази (АГ 5 інгібітори);
БЗ) інгібіторів фотосинтезу; рі) інгібіторів протопорфіриноген-їЇХ оксидази,
р5) гербіцидів відбілювачів;
Бб) інгібіторів енолпірувілишикимат-3-фосфат-синтази (інгібіторів ЕРЗР);
Б7) інгібіторів глутамінсинтетази;
БВ) інгібіторів 7,8-дігідроптероатсинтази (ОНР інгібітори);
ВО) інгібіторів мітозу; 010) інгібіторів синтезу дуже довголанцюгових жирних кислот (МІ СЕА інгібітори); 011) інгібіторів біосинтезу целюлози; р12) гербіцидів розщеплювачів;
В13) ауксинових гербіцидів; 014) інгібіторів переносу ауксину, і 015) інших інгібіторів, вибраних з групи, що складається з бромобутіду, хлорфлуренолу, хлорфлуренол-метилу, цинметиліну, кумілурону, далапону, дазомету, діфензоквату, діфензокват-метилсульфату, диметипіну, ОБМА, дімрону, ендоталу та їх солей, етобензаніду, флампропу, флампроп-ізопропілу, флампроп-метилу, флампроп-М-ізопропілу, флампроп-М- метилу, флуренолу, флуренол-бутилу, флурпрімідолу, фосаміну, фосамін-амонію, інданофану, індацифламу, малеїнового гідразиду, мефлуідіду, метаму, метил азиду, метилу бромистого, метил-дімрону, метилиодиду, ММА, олеїнової кислоти, оксацикломефону, пеларгонової кислоти, пірібутикарбу, квінокламіну, тріазіфламу, трідіфану і б-хлор-3-(2-циклопропіл-б- метилфенокси)-4-піридазінолу (СА5 499223-49-3) та їх солей і естерів; та
С) антидотів.
Гербіцидом, що є похідним бензоксазинону, який використовують для даного винаходу, можуть бути також композиції у вигляді гербіцидно активних композицій засобів захисту рослин, що включають гербіцидно ефективну кількість комбінації активної сполуки, що містить принаймні один бензоксазинон загальної формули І і принаймні одну додаткову сполуку, вибрану з гербіцидів В і антидотів С, як визначено вище, а також, принаймні один рідкий і/або твердий носій, і/або одну чи більше поверхнево-активних речовин і, за необхідності, одну або більше додаткових допоміжних речовин для звичайних композицій захисту рослин.
Крім того, гербіцидом, що є похідним бензоксазинону, які є корисними для даного винаходу,
Зо можуть бути також композиції у вигляді композиції для захисту рослин, приготовлені у вигляді 1- компонентної композиції, що містить комбінацію активних сполук, яка містить, щонайменше один бензоксазинон формули І і, принаймні одну додаткову активну сполуку, вибрану з гербіцидів В і антидотів С, і, принаймні один твердий або рідкий носій, і/або одну або більше поверхнево-активних речовин і, за необхідності, одну або більше додаткових допоміжних речовин для звичайних композицій захисту рослин.
Крім того, гербіцидом, що є похідним бензоксазинону, який є корисними для даного винаходу, можуть бути також композиції у вигляді композиції для захисту рослин, приготовлені у вигляді 2-компонентної композиції, що містить перший компонент, який містить принаймні один з бензоксазинонів формули І, твердий або рідкий носій і/або одну або більше поверхнево- активних речовин, і другий компонент, що містить, щонайменше одну додаткову активну сполуку, вибрану з гербіцидів В і антидотів С, твердий або рідкий носій, і/або одну або більше поверхнево-активну речовину, де додатково обидва компоненти можуть також містити інші допоміжні речовини, звичайні для композицій захисту рослин.
Якщо бензоксазинони формули І, як описано тут, здатні утворювати геометричні ізомери, наприклад, Е/27-ізомери, можна використовувати обидва, чисті ізомери та їх суміші в композиціях згідно з цим винаходом. Якщо бензоксазинони формули ЇЇ, як описано тут, мають один або кілька хіральних центрів і, як наслідок, присутні у вигляді енантіомерів або діастереомерів, можна використовувати обидва, чисті енантіомери і діастереомери та їх суміші, в композиціях згідно винаходу. Органічні залишки, зазначені у визначених змінних від Е' до ЕК», є - як термін галоген - загальні терміни для окремих перерахованих членів групи. Термін галоген означає в кожному випадку, фтор, хлор, бром або йод. Всі вуглеводневі ланцюги, тобто всі алкіли, можуть бути лінійними або розгалуженими, префікс Сп-Ст позначають в кожному випадку можливе число атомів вуглецю в групі.
Прикладами таких значень є:
С1-С4-алкіл, а також Сі-С4-алкільні частини Сз-Свє-циклоалкіл-С1-С4-алкілу, наприклад СН,
СН», н-пропіл і СН(СНз)г-н-бутил, СН(СНз)-СаН5, СН»--СН(СНвз)» і С(СНз)з; С1-Св-алкіл, а також
Сі-Св-алкільні радикали С:і-Св-алкокси- Сі-Св-алкіл: Сі-С4-алкіл, як зазначено вище, а також, наприклад, н-пентил, 1-метилбутил, 2-метилбутил, З-метилбутил, 2,2-діметилпропіл, 1- етілпропіл, н-гексил, 1,1-діметилпропіл, 1,2-діметилпропіл, 1-метилпентен, 2-метилпентен, 3- 60 метилпентен, 4-метилпентен, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2,2-
диметилбутил, 2,3-диметилбутил, 3,3З-диметилбутил, 1-етілбутіл, 2-етілбутіл, 1,1,2- тріметилпропіл, 1,2,2-тріметилпропіл, 1-етил-1-метилпропіл або 1-етил-2-метилпропіл, переважно метил, етил, н-пропіл, 1-метилетил, н-бутил, 1,1-диметилетил, н-пентил або н- гексил; Сі-С.--галогеналкіл: Сі-С4-алкільний радикал, як зазначено вище, який частково або повністю заміщений фтором, хлором, бромом/або йодом, наприклад, хлорметил, дихлорметил, трихлорметил, фторметил, дифторметил, трифторметил, хлор-фторметил, дихлорфторметил, хлордифторметил, бромметил, іодметил, 2-фторетил, 2-хлоретил, 2-брометил, 2-йодетил, 2,2- дифторетил, 2,2,2-трифторетил, 2-хлор-2-фторетил, 2-хлор-2,2-дифторетил, 2,2-дихлор-2- фторетил, 2,2,2-тріхлоретил, пентафторетил, 2-фторпропіл, З-фторпропіл, 2,2-дифторпропіл, 2,3-дифторпропіл, 2-хлорпропіл, З-хлорпропіл, 2,3-дихлорпропіл, 2-бромпропіл, З-бромпропіл, 3,3,3-трифторпропіл, 3,3,3-трихлорпропіл, 2,2,3,3,3-пентафторпропіл, гептафторпропіл, С1-Сз- галогеналкіл, як зазначено вище, а також, наприклад, 1-(фторметил)-2-фторетил, 1- (хлорметил)-2-хлоретил, 1-(бромметил)-2-брометил, 4-фторбутил, 4-хлорбутил, 4-бромбутил, нонафторбутил, 1,1,2,2,-тетрафторетил і 1-трифторметил-1,2,2,2-т-етрафторетил; Сі-Св- галогеналкіл: Сі-С.--галогеналкіл, як згадувалося вище, а також, наприклад, 5-фторпентил, 5- хлорпентил, 5-бромпентил, 5-йодпентил, андекафторпентил, 6б-фторгексил, б-хлоргексил, 6- бромгексил, 6-йодгексил і додекафторгексил; Сз-Св-циклоалкіл, а також циклоалкільні групи Сз-
Св-циклоалкіл-С1-Са-алкіл: моноциклічні насичені вуглеводні, що мають від З до б членів в кільці, такі як циклопропіл, циклобутил, циклопентил і циклогексил; Сз-Св-алкеніл, наприклад 1- пропеніл, 2-пропеніл, 1-метилетеніл, 1-бутеніл, 2-бутеніл, З-бутеніл, 1-метил-1-пропеніл, 2- метил-1-пропеніл, 1-метил-2-пропеніл, 2-метил-2-пропеніл, 1-пентеніл, 2-пентеніл, З-пентеніл, 4-пентеніл, 1-метил-1-бутеніл, 2- метил-1-бутеніл, З-метил-1-бутеніл, 1-метил-2-бутеніл, 2- метил-2-бутеніл, 3-метил-2-бутеніл, 1-метил-З-бутеніл, 2-метил-З-бутеніл, З-метил-З-бутеніл, 1,1-диметил-2-пропеніл, 1,2-диметил-1-пропеніл, 1,2-диметил-2-пропеніл, 1-етил-1-пропеніл, 1- етил-2-пропеніл, 1-гексеніл, 2-гексеніл, З-гексеніл, 4-гексеніл, 5-гексеніл, 1-метил-1-пентеніл, 2- метил-1-пентеніл, З-метил- 1-пентеніл, 4-метил-1-пентеніл, 1-метил-2-пентеніл, 2-метил-2- пентеніл, З-метил-2-пентеніл, 4-метил-2-пентеніл, 1-метил-3- пентеніл, 2-метил-З-пентеніл, 3- метил-З-пентеніл, 4-метил-З-пентеніл, 1-метил-4-пентеніл, 2-метил-4-пентеніл, З-метил-4- пентеніл 4-метил-4-пентеніл, 1,1-диметил-2-бутеніл, 1,1-диметил-З-бутеніл, 1,2-диметил-1-
Ко) бутеніл, 1,2-диметил-2-бутеніл, 1,2-диметил-З-бутеніл, 1,3-диметил-1-бутеніл, 1,3-диметил-2- бутеніл, 1,3-диметил-З3-бутеніл, 2,2-диметил-З-бутеніл, 2,3-диметил-1-бутеніл, 2,3-диметил-2- бутеніл, 2,3-диметил-З-бутеніл, 3,3-диметил-1-бутеніл, 3,3-диметил-2-бутеніл, 1-етил-1-бутеніл, 1-етил-2-бутеніл, 1-етил-З-бутеніл, 2-етил-1-бутеніл, 2-етил-2-бутеніл, 2-етил-З-бутеніл, 1,1,2- триметил-2-пропеніл, 1-етил-1-метил-2-пропеніл, 1-етил-2-метил-1-пропеніл і 1-етил-2-метил-2- пропеніл;
Сз-Св-галогеналкеніл: Сз-Св-алкенільний радикал, як зазначено вище, який частково або повністю заміщений фтором, хлором, бромом і/або йодом, наприклад, 2-хлор-проп-2-ен-1-іл, 3- хлорпропіл-2-ен-1-іл, 2,3-дихлорпроп-2-ен-1-іл, З,3-дихлорпроп-2-ен-1-іл, 2,3,3-трихлор-2-ен-1- іл, 2,3-дихлорбут-2-ен-1-іл, 2-бромпроп-2-ен-1-іл, З-бромпроп-2-ен-1-іл, 2,3-дибромопроп-2-ен-1- іл, 3,.3-дибромопроп-2-ен-1-іл, 2,3,3-трибром-2-ен-1-іл або 2,3-дипромобут-2-ен-1-іл;
Сз-Св-алкініл: наприклад, 1-пропініл, 2-пропініл, 1-бутиніл, 2-бутиніл, З-бутиніл, 1-метил-2- пропініл, 1-пентиніл, 2-пентиніл, З-пентиніл, 4-пентиніл, 1-метил-2-бутиніл, 1-метил-З-бутиніл, 2- метил-З-бутиніл, З-метил-1-бутиніл, 1,1-диметил-2-пропініл, 1-етил-2-пропініл, 1-гексиніл, 2- гексиніл, З-гексиніл, 4-гексиніл, 5-гексиніл, 1-метил-2-пентиніл, 1-метил-З-пентиніл, 1-метил-4- пентиніл, 2-метил-3-пентиніл, 2-метил-4-пентиніл, З-метил-1-пентиніл, З-метил-4-пентиніл, 4- метил-1-пентиніл, 4-метил-2-пентиніл, 1,1-диметил-2-бутиніл, 1,1-диметил-З-бутиніл, 1,2- диметил-З-бутиніл, 2,2-диметил-З-бутиніл, 3,3-диметил-1-бутиніл, 1-етил-2-бутиніл, 1-етил-3- бутиніл, 2-етил-З-бутиніл і 1-етил-1-метил-2-пропініл, Сз-Св-галогеналкініл: Сз-Св-алкінільний радикал, як зазначено вище, який частково або повністю заміщений фтором, хлором, бромом
БО і або йодом, наприклад, 1,1-дифторпроп-2-ін-1-іл, З-хлорпроп-2-ін-1-іл, З3-бромпроп-2-ін-1-іл, 3- іодопроп-2-ін-1-іл, 4-фторбут-2-ин-1-іл, 4-хлорбут-2-ин-1-іл, 1,1-дифторбут-2-ин-1-іл, 4-іодобут-
З-ин-1-іл, 5-фторпент-3-ин-1-іл, 5-іодопент-4-ин-1-іл, б-фторгекс-4-ин-1-іл або б-іодогеко-5-ин-1- іл;
Сі-С-алкокси, а також Сі-С.--алкокси-замісники гідроксикарбоніл-Сі-С4-алкокси, С1-Св- алкоксикарбоніл-Сі-С«-алкокси, наприклад метокси, етокси, пропокси, 1 - метилетоксі бутокси, 1-метилпропокси, 2-метилпропокси і 1,1-диметилетокси; -Сі-Св-алкокси, а також Сі-Св-алкокси фрагментів Сі-Св-алкоксикарбоніл-Сі-С--алкокси: Сі-С--алкокси, як згадувалося вище, а також, наприклад, пентоксил, 1-метилбутокси, 2-метилбутокси, З-метоксилбутокси, 1,1- диметилпропокси, 1,2-диметилпропокси, 2,2-диметилпропокси, 1-етилпропокси, гексокси 1- 60 метилпентокси, 2-метилпентокси, З-метилпентокси, 4-метилпентокси, 1,1-диметилбутокси, 1,2-
диметилбутокси, 1,3-диметилбутокси, 2,2-диметилбутокси, 2,3-диметилбутокси, 3,3- диметилбутокси, 1-етилбутокси, 2-етилбутокси, 1,1,2-триметилпропокси, 1,2,2-три-метил- пропокси, 1-етил-1-метилпропокси і 1-етил-2-метилпропокси.
Відповідно кращим варіантом здійснення даного винаходу є переважно також гербіцид, що є похідним бензоксазинону формули І, де змінні, або незалежно одна від одної або в комбінації одна з одною, мають такі значення:
В' є воднем; є також переважно галогеном, особливо переважно Е або СІ, особливо переважно Е;
В є Е;
ВЗ є воднем або Е, переважно воднем;
Також переважно Е;
В? являє собою Сз-Св-алкініл або Сз-Свє-галогеналкіл, переважно Сз-алкініл або Сз- галогеналкіл,
Особливо переважно СНСНЕСН, СНСЕССІ або СНгСЕС ВГ;
Також переважно Сз-Св-алкініл або Сз-Св-циклоалкіл- Сі-Св-алкіл, особливо переважно пропаргіл або ціклопропілметил;
Також переважно Сз-Св-алкініл, переважно Сз-алкініл; особливо переважними
СНеСЕСН;
Також переважно Сз-Св-галоалкініл, переважно Сз-галоалкініл, особливо переважно
СНеСЕССІ або СНеСЕСВГ;
В? являє МН», С1-Св-алкіл або Сз-Св-алкініл; переважно С:1-Св-алкіл, більш переважно С1-С4- алкіл, найбільш переважно СНЗз;
Ве є Сі-Св-алкіл, переважно С1-С4-алкіл, найбільш переважно СНЗз;
М являє собою 0,
Також переважно 5; 7 являє собою 0,
Також переважно 5.
Особливу перевагу надають бензоксазинону формули І.а (відповідає формулі І, де Б: є Е, Бо і 25 являють собою СН»з, УМ являє собою 0О і 7 представляє 5), ! Е ніс хх мо І.в, 4 вчу й зо св, де змінні КЕ", ВЗ ї Е7 мають значення, зокрема, переважні значення, як визначено вище.
Найбільш переважні похідні бензоксазинону формули І.а.1 до І.а.48 Таблиці А, перераховані нижче, в якій змінні Б' ВЗ ії БК" разом мають значення, вказані в одному рядку Таблиці (бензоксазинонів І.а.1-1.а.54), і де визначення змінних ЕК", В, ВЗ ії ВЕ" мають особливу важливість для сполук за винаходом не тільки в поєднанні одна з одною, але в кожному випадку також самі по собі.
Таблиця А ши т и п : т ОХ: СОНЯ ПОН з СО баб 77777777 1н/777 ні |СнеСняЯСНнІїЇСС/////////://:/ 0: ба8. 77777777 1н/7 ні ІЇсвшсвСНС/7/:/: ГГ Г( та. 272717 1871877 |сСвсЕєВ 307074
Особливо переважним бензоксазиноном загальної формули І, де як компонент А є частина композиції відповідно до даного винаходу, є бензоксазинон формули І.а.35, як визначено вище.
У відповідності з конкретним варіантом здійснення даного винаходу композиція, придатна для способу за даним винаходом, містить як компонент А бензоксазинон формули І.а.35.
Е вовча
Їа.з35
Що р. мо 5 Мо -
СН, Н
Описані вище похідні бензоксазинону та композиції розкриті більш детально у Європейській патентній заявці 09163242.2, зокрема розкриття на сторінках 1-7 з посиланням на похідні бензоксазинону та їх можливі замісники повністю включені шляхом посилання.
Похідні бензоксазинону, за даним винаходом, більш краще застосовувати в поєднанні з одним або декількома іншими гербіцидами, щоб отримати контроль над більш широким спектром небажаної рослинності. При використанні в поєднанні з іншими гербіцидами, заявлені сполуки можуть бути приготовані з іншим гербіцидом або гербіцидами, змішані в резервуарі з іншим гербіцидом або гербіцидами або нанесені послідовно з іншим гербіцидом або гербіцидами.
Гербіцидні сполуки даного винаходу можуть також бути використані в поєднанні з додатковими гербіцидами, до яких культурні рослини є природно толерантними, або до яких вони стійкі через експресію одного або більше додаткових трансгенів, як згадувалося вище.
Деякі з цих гербіцидів, які можна використовувати в поєднанні зі сполуками за даним винаходом, включають сульфонаміди, такі як метосулам, флуметсулам, клорансулам-метил, діклосулам, пеноксулам і флорасулам, сульфонілсечовини, такі як хлорімурон, трибенурон, сульфометурон, нікосульфурону, хлорсульфурон, амідосульфурон, триасульфурон, просульфурон, трітосульфурон, тіфенсульфурон, сульфосульфурон і метсульфурон, імідазолінони, такі як імазахін, імазапік, ІМА-зетапір, імзапір, імазаметабенз і імазамокс, феноксиалканова кислота, такі як 2,4-О0, МОСРА, дихлорпроп і мекопроп, піридинілоксиоцтова кислота, такі як тріклопір і флуроксіпір, карбонові кислоти, такі як клопіралід, піклорама, амінопіралід і дикамби, дінітроаніліни, такі як тріфлуралін, бенефін, бенфлуралін і пендиметалін, хлорацетаніліди, такі як алахлор, ацетохлор і метолахлор, семікарбазони (інгібітори транспортування ауксину), такі як хлорфлуренол і діфлуфензопіром, ариоксифеноксипропіонати такі як флуазифоп, галоксіфоп, діклофоп, клодінафоп і феноксапроп та інших поширених гербіцидів включаючи гліфосат, глюфосинат, аціфлуорфен, бентазон, кломазон, фуміклорак, флуометурон, фомезафен, лактофіт, лінурон, ізопротурон симазин, норфлуразон, паракват, діурон, діфлуфенікан, піколінафен, цінідон, сетоксідімом, тралкоксідім, квінмерак, ізоксабен, бромоксініл, метрибузин і мезотріон.
Наприклад, гербіцид, що є похідним бензоксазинону, який може бути корисним для здійснення даного винаходу, може бути використаний в поєднанні з гліфосатом і глуфосінатом для культур, стійких до гліфосату або глюфосинату. Якщо це не було включено в розкритті вище, гербіцид, що є похідним бензоксазинону, який є корисним для здійснення даного
Зо винаходу може, крім того, використовуватися в поєднанні із сполуками:
БІ) з групи інгібіторів біосинтезу ліпідів:
АСС-гербіциди, такі як аллоксідім, аллоксідім-натрій, бутроксідім, клетодим, клодинафоп, клодинафоп-пропаргіл, циклоксидим, цигалофоп, цигалофоп-бутил, діклофоп, діклофоп-метил, феноксапроп, феноксапроп-етил, феноксапроп-Р, феноксапроп-Р-етил, флуазифоп, флуазифоп-бутил, флуазифоп-Р, флуазифоп-Р-бутил, галоксіфоп, галоксіфоп-метил, галоксіфоп-Р, галоксіфоп-Р-метил, теїатіїор, піноксаден, профоксідім, ргорадиі?агор, квізалофоп, квізалофоп-етил, квізалофоп -тефурил, хизалофоп-Р, хизалофоп-Р-етил, хизалофоп-Р-тефурил, сетоксидімом, тепралоксидим і тралкоксидім і не АКК гербіциди, такі як бенфуресат, бутилат, циклоат, далапон, дімепіперат, ЕРТС, еспрокарб, етофумесат, флупропанат, молінат, орбенкарб, пебулат, просульфокарб, ТСА, тіобенкарб, тіокарбазіл, тріаллат і вернолат; рг) з групи інгібіторів АЛС: 03) з групи, що включає інгібітори фотосинтезу: амікарбазон, інгібітори фотосистеми ЇЇ, наприклад, триазинові гербіциди, в тому числі хлортріазинони, тріазинони, тріазиндіони, метилтіотріазини і пірідазінони такі як аметрін, атразин хлорідазон, цианазін, десметрин, діметаметрін, гексазінон, метрибузин, прометон Пром-Трин, пропазин, симазин, сіметрин, тербуметон, тербутілазин, тербутрін і трієтазин, арилсечовини, такі як хлоробромурон, хлоротолурон, хлороксурон, дімефурон, діурон, флуометурон, ізопротурон, ізоурон, лінурон, метамітрон, метабензтіазурон, метобензурон, метоксурон, монолінурон, небуроном, сідурон, тебутіурон і тіадіазурон, фенілкарбаматами, такі як десмідіпамам, карбутілат, фенмедифам, фенмедифаметил, нітрилгербіциди, такі як бромофеноксим, бромоксініл і його солі та естери, іоксініл та його солі та естери, такі як урацилес, бромаціл, ленацил і тербацил і бентазон, бентазон-натрій, піридатр, пірідафол, пенатохлор і пропаном та інгібітори фотосистеми І, такі як дикват, дикват-дибромід паракват, паракват дихлорида і паракватдіметилсульфат. Серед них кращим варіантом здійснення даного винаходу щодо композицій є ті, що містять щонайменше один гербіцид арилсечовини. Серед них також переважним варіантом здійснення винаходу відносно таких композицій є ті, що містять принаймні один триазин гербіциду. Серед них також переважним варіантом здійснення винаходу щодо таких композицій є ті, що містять принаймні один нітрильний гербіцид;
р4) з групи інгібіторів оксидази протопорфіриногена-ЇХ: ацірлуорфен, аціфлуорфен-натрій, азафенідін, бенкарбазон, бензфендізон, біфенокс, бутафенацил, карфентразон, карфентразонетіл, хлометоксифен, цінідонетил, флуазолат, флуфенпір, флуфенпіртетил, флуміклорак, флуміклорак-пентил, флуміоксазін, фторглікофен, фторглікофен-етил, сафлуфенаціл, флутіацет-метил, фомезафен, галозафен, лактофіт, оксадіаргіл, оксадіазон, оксифлуорфен, пентоксазон, профлуазол, пірахлоніл, пірафлуфен, пірафлуфен-етил, сафлуфенацил, сульфентразон, тідіазімін, етил ІЗ-(2-хлор-4-фтор-5-(1-метил-б--рифторметил- 2,4-діоксо-1,2,3,4-тетрагідропіримідин-3-ілуфенокси|-2-піридилокси|оцтової кислоти (СА5 353292-31-6; 5-3100), /М-етил-3-(2,6-дихлор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-1Н-піразол-1- карбонової кислоти (СА5 452098-92-9), М-тетрагідрофурфурил-3-(2,6-дихлор-4- трифторметилфенокси)-5-метил-1Н-піразол-1-карбоксамід (СА5 915396-43-9), М-етил-3-(2-хлор- б-фтор-4-трифторметилфенокси) -5-метил-1Н-піразол-1-карбонової кислоти (САЗ 452099-05-7),
М-тетрагідрофурфурил-3-(2-хлор-6-фтор-4-трифторметилфенокси)-5-метил-1Н-піразол-1- карбонової кислоти (САБ 45100-03-7) і 3-Г7/-фтор-3-оксо-4-(проп-2-ініл)-3,4-дигідро-2Н- бензо|1,4|оксазін-б-іл|-1,5-диметил-б-тіоксо-(1, З,5)гриазинан-2,4-діон; р5) з групи відбілюючих гербіцидів:
РОБ інгібітори бефлубутамід, діфлуфенікан, флуридон, флурохлоридон, флуртамон, норфлуразон, піколинафен, і 4-(З--рифторметилфенокси)-2-(4-трифторметилфеніл) піримідин (САБ5 180608-33-7), НРРО інгібітори: бензобіциклон, бензофенап, ізоксафлутол, мезотріону пірасулфотол, піразолінат, піразоксіфен, сулкотріон, тефурілтрінон, темботріон, топрамезон і біциклопірон, відбілювач, невідомого призначення: аклоніфен, амітрол, кломазон і флуметурон; рб) з групи інгібіторів ЕРБР синтази: гліфосат, гліфосат ізопропіламонія і гліфосат-тримесиум (сульфосат); 07) з групи інгібіторів глутамінсинтази: біланафос (біалафос), біланафос-натрій, глюфосинат, глюфосинат-Р і глюфосинату амонію; рВ8) з групи інгібіторів ОНР синтази: асулам; ре) з групи інгібіторів мітозу: сполуки групи КІ: дінітроаніліни, такі як бенфлуралін, бутралін, дінітрамін, еталфлуралін, флухлоралін, оризалін, пендиметалін, продиамін і тріфлуралін, фосфорамідати, такі як амінопрофос, аміпрофосметил, бутаміфос, гербіциди бензойної кислоти, такі як хлортал, хлортал -диметил, піридини, такі як дитіопір і тіазопір, бензаміди, такі як пропізамід і тебутам, сполуки групи К2: хлорпрофам, профам і карбетамід, серед цих сполук групи КІ, зокрема дінітроанілінам переважно; 010) з групи інгібіторів МЕСЕА: Хлорацетаміди, такі як ацетохлор, алахлор, бутахлор, діметахлор, діметенамідом, діметенамід-Р, метазахлор, метолахлор метолахлор-5, петоксамід, претілахлор, пропахлор, пропісохлор і тенілхлор, таких як оксіацетаниліди, флуфенацет і мефенацет, таких як ацетанілід діфенамід, напроанілід і напропамід, тетразолінони, такі як фентразамід та інші гербіциди, такі як анілофос, кафенстрол, феноксасулфон, іпфенкарбазон, піперофос, руроксасулфон та ізоксазолін сполук формули ІЇ, и во, Й х св, (1) по | в чо несемо Кк
Й де В, ВВ, ВУ, ВО, МУ, 7 і п мають такі значення:
В", ВВ, У, ВО незалежно один від одного водень, галоген або Сі-С--алкіл;
Х кисень або МН;
У феніл або моноциклічний 5-, 6-, 7-, 8-, 9- або 10-членний гетероцикліл, що містить в доповнення одночленне вуглецеве кільце, два або три однакових чи різних гетероатома, вибраних з кисню, азоту та сірки як члени кільця, де феніл і гетероцикліл є незаміщеними або несуть 1, 2 або З замісники, БУ, вибраними з галогену, Сі-Са-алкілу, Сі-Са-алкокси, С1-Са4- галоалкілу і Сі-С4-галоалкокси; переважно феніл або 5 - або б--ленний ароматичний гетероцикл (гетероарил), який містить, на додаток до члени карбонового кільця, один, два або три атоми азоту в якості членів кільця, де феніл і гетероарил є незаміщеними або несуть 1, 2 або З замісники КУУ; та п є нуль або одиниця; серед ізоксазолінових сполук формули ІІ, перевага віддається сполукам ізоксазоліну формули ІЇ, в якій
ВУ, АВ, ВУ, В"о незалежно один від одного являють собою Н, Е, СІ або метил;
Х означає кисень;
п дорівнює 0 або 1; та
У являє собою феніл, піразоліл або 1,2,3-триазоліл, причому три останні згаданих радикали є незаміщеними або мають один, два або три замісники КУУ, особливо один з наступних радикалів 1
КУ " ет М-в" М 49 Я й З я «Бу ! кі: ПИШИ Кк
У ст з я ще 7
Не х Е 3 ж Е й Р
В г ї де
А" являє собою галоген, Сі-Са-алкіл або Сі-С4-галогеналкіл;
В": позначає С:і-Са-алкіл;
В'зЗ являє собою галоген, Сі-С4-алкокси або С-і-С--галогеналкоксі;
В"? являє собою галоген, Сі-Са-алкіл, Сі-С4-галогеналкіл або Сі-С4-галогеналкоксі; т, 1, 2 або 3, а також
Ж позначає місце приєднання до групи СК'"ЗВ/я; серед сполук ізоксазоліну формули ІІ, особлива перевага віддається тим сполукам ізоксазоліну формули ІІ, де
В" являє собою водень;
В? являє собою фтор;
В" означає водень або фтор;
В"? означає водень або фтор; Х означає кисень;
У є одним з радикалів формул У", У2, УЗ і ми пе М. Ра -М га - й «и ОВ, По-сн,, С С зоавояя т х Мав ни От
ОЮНЕ, і ОСН.се, Е чт ча ча ча де 2 позначає точку приєднання до групи СЕУВ'Є; п дорівнює нулю або 1, зокрема 1, і серед них особлива перевага сполукам ізоксазоліну формул 1.1, 11.2, 1.3, 1.4, 1.5, 11.6, 11.7,
ІІ.8 та 1.9 зо М Го М оце, ша не н.с
З | З і не ОСНЕ, ох во ОСНЕ, 3" о з" о
НК
2
С мМ С мк ЕС м рай
Е оо С М-сн, Зо с -св, оо С М-сн,
М нс й си Моне Из
НС о-Мм ке Е не
НЗ Н.А Н.О -е -х не не М з | ; З нео кОРООСНЕ, нео РЕ
І.б І.Я ех КОМ дх Де)
Е 9 Г м-сн, Код ИсН, шк: З М о ОСНЕ ко ША: насам Є 2 НС о-м
І.8 Не
Сполуки ізоксазоліна формули ІІ відомі в даній галузі, наприклад, з М/О 2006/024820, УМО 2006/037945, УМО 2007/071900 та МО 2007/096576, 5 серед інгібіторів МІ СЕА перевага віддається хлорацетамідам та оксиацетамідам, особливо піроксасульфону; 011) з групи інгібіторів біосинтезу целюлози: хлортіамід, дихлобеніл, флупоксам, ізоксабен, 1-циклогексил-5-пентафлуорфенілоксі-12-11,2,4 бІгіатризин-З-іламін та сполукам піперазину формули ПП, вв о М ві ре в" р Кк
АТ )/д ВО Но, в Мі52 те
Ж І д'єт - о в" ве де
А є феніл або піридил, де Ке приєднаний в орто-положенні до точки приєднання А до атома вуглецю;
На є СМ, МО», Сі-Са-алкіл, ЮО-Сз-Све-циклоалкіл, Сі-С«-галогеналкіл, Сі-С--алкокси, С1-Са4- галогеналкоксі, О-О0-Сз-Св-циклоалкіл, З(О)48У, С2-Св-алкеніл, О-Сз-Св-ціклоалкеніл, Сз-Св- алкенілоксі, С2-Св-алкініл, Сз-Св-алкінілоксі, МЕВВ8, три-Сі-Са-алкілсіліл, О-С(-О)-На!, О-Р(-О)-
Ве", феніл, нафтил, 3-7--ленне моноциклічне або 9- або 10-ч-ленний біциклічний насичений, ненасичений або ароматичний гетероцикл, який приєднаний через вуглець або азот, який містить 1, 2, З або 4 гетероатома, вибраних з групи, що складається з 0, М та 5, і яке може бути частково або повністю заміщені групами, На та/або КУ, а якщо Ба приєднаний до атома вуглецю, то додатково галоген;
ВУ С:і-Св-алкіл, Сз-С--алкеніл, Сз-Са-алкініл, МЕЛЕ? або С.-Са4-галогеналкіл і 40,1 або 2;
ВА, ВВ незалежно один від одного являють собою водень, С1-Св-алкіл, Сз-Св-алкеніл або Сз-
Св-алкініл; разом з атомом азоту, до якого вони приєднані, БМ, В? можуть також утворювати п'яти-або шестичленне насичене, частково або повністю ненасичене кільце, яке додатково до атомів вуглецю, може містити 1, 2 або З гетероатома, вибраних з групи, що складаєтьсяз О, М і 5, причому кільце може бути заміщено від 1 до З груп Кеа; р являє собою ковалентний зв'язок, Сі-С4-алкілен, Со-Св-алкеніл або Со-Св-алкініл;
Ве! означає водень, ОН, Сі-Св-алкіл, Сі-С4-галогеналкіл, Сз-Св-циклоалкіл, Со-Св-алкеніл, С5-
Се-ціклоалкеніл, Со-Св-алкініл, Сі-Св-алкокси, С1-С.--галогеналкоксі, Сз-Св-алкенілоксі-, Сз-Св- алкінілоксі, МеВ, С1-Св алкоксіаміно, С-Св-алкілсульфоніламіно, С-Св- алкіламіносульфоніламіно, Іди-(Сі-Св)алкіламіно| сульфоніламіно, Сз-Св-алкеніламіно, Сз-Св- алкініламіно, М-(С2-Св-алкеніл)-М-(С1-Св-алкіл)аміно, М-(С2-Св-алкініл)-М-(С1-Св-алкіл) аміно, М- (Сі-Св-алкокси)-М-(С1-Св-алкіл)аміно, М-(С2-Св-алкеніл)-М-(С1-Св-алкокси)-аміно, М-(С2-Св- алкініл)-М-(С1-Св-алкокси)-аміно, Сі-Св-алкілсульфоніл-, три-С1-С--алкілсіліл, феніл, фенокси, феніламіно або 5 - або б-ч-ленний моноциклічний або 9- або 10-членний біциклічний гетероцикл, який містить 1, 2, З або 4 гетероатома, вибраних з групи, що складається з 0, М і 5, де циклічні групи незаміщені або заміщені 1, 2, З або 4 групами Кага;
Вага являє собою галоген, ОН, СМ, МО», Сі-Са-алкіл, Сі-С4-галогеналкіл, Сі-С4-алкокси, С1-С4- галогеналкоксі, 5(О)4ВУ, О-С(5О0)-В2 і три-С1-С4-алкілсіліл;
В? незалежно один від одного означають водень, СМ, МО», галоген, Сі-Са-алкіл, С1-С4-
Ко) галогеналкіл, С2-Са-алкеніл, Сз-Св-алкініл, Сі-Са-алкокси, С1-С--галогеналкоксі, бензил або 5(О)аВУ;
В? разом з групою КЕ: або Ре, приєднані до сусіднього атому кільця можуть також утворювати п'яти-або шести-членний насичений або частково або повністю ненасичене кільце, яке, додатково до атомів вуглецю може містити 1, 2 або 3 гетероатоми, вибрані з групи, що складається з О, М і 5, причому кільце може бути частково або повністю заміщене Каа; р дорівнює 0, 1, 2 або 3;
В"? означає водень, ОН, СМ, С1і-Сі2-алкіл, Сз-С1і2-алкеніл, Сз-С:і2-алкініл, Сі--С«-алкокси, Сз-
Се-ціклоалкілом, С5-Се-циклоалкеніл, МЕ"В8, Б(О)пВУ, (ОМА АВ, С(О)в25, -«СОМВАВВ, феніл або 5- або б-членний моноциклічний або 9- або 10-членний біциклічний ароматичний гетероцикл, який містить 1, 2, З або 4 гетероатомів, вибраних з групи, що складається зО, Мі 5, де циклічні групи приєднані через 0! і незаміщеними або заміщені 1, 2, З або 4 групами Р, а також наступні частково або повністю Ка -заміщених груп: Сі-Са-алкіл, Сз-Са-алкеніл, Сз-Са- алкініл, Сі-С-алкокси, Сз-Св-ціклоалкілом, С5-Св-ціклоалкеніл, МРЕВ, Б(О)овУ, (ОМА,
С(О)в25, СОМВАВВ; переважно означає водень, ОН, СМ, С1-Сі2-алкіл, Сз-Сі2-алкеніл, Сз-С12- алкініл, Сі-С.--алкокси, Сз-Сеє-ціклоалкіл, С»5-Св-ціклоалкеніл, МЕМАВ, (ОВУ, 5(ОМАВВ,
С(-О)в25, СОМАМЯАВ, феніл або 5- або б-членний моноциклічний або 9- або 10-членний біциклічний ароматичний гетероцикл, який містить 1, 2, З або 4 гетероатома, вибрані з групи, що складається з О, М і 5, де циклічні групи приєднані через 0! і незаміщені або заміщені 1, 2, З або 4 групами Ка», а також наступні частково або повністю Кг -заміщених груп: Сі-Са-алкіл, Сз-Са-
БО алкеніл і Сз-С--алкініл;
В2» означає водень, Сі-Са-алкіл, Сі-С4-галогеналкіл, Сі-С4--алкокси або Сі-С--галогеналкоксі; р' являє собою карбоніл або групу 0; де в групах КЕ", Ве та їх суб-замісників вуглецевого ланцюга і/або циклічні групи можуть нести 1, 2, З або 4 замісники, 22 і/або Ва;
В'б означає С1-Са-алкіл, Сз-Са-алкеніл або Сз-Са4-алкініл;
В'Ї означає ОН, МН», Сі-Са-алкіл, Сз-Св-циклоалкіл, Сз-Св-алкеніл, Сз-Св-алкініл, С1-С4- гідроксіалкіл, Сі-С4-ціаноалкіл, Сі-С4--галогеналкіл, Сі-С4--алкокси-С1-Са-алкіл або С(-О)Н2»;
ВЗ означає водень, галоген, С:і-С--алкіл або Сі-С--галогеналкіл або ВБ'8 ії ВК!» разом утворюють ковалентний зв'язок;
В», 20, Д2!, Дг2 незалежно один від одного означають водень, галоген, ОН, СМ, МО», С1-Са- алкіл, Сі-С--галогеналкіл, Сг-Св-алкеніл, С2-Св-алкініл, Сі--С«-алкокси, Сі-С4-галогеналкоксі, Сз-
Сев-циклоалкіл, Сз-Се-ціклоалкеніл-і Сз-Св-ціклоалкініл;
В23, д2 незалежно один від одного означають водень, галоген, ОН, галогеналкіл, МеВ,
МАМС(О)826, СМ, МО», Сі-Са-алкіл, Сі-Са-галогеналкіл, С2-С--алкеніл, Сз-Св-алкініл, С1-С4- алкокси, Сі-С4-галогеналкоксі, О-С(О)К25, фенокси або бензилокси, причому в групах КЗ і вуглецеві ланцюги і/або циклічні групи можуть нести 1, 2, З або 4 замісники Меа;
Вб є Сі-Са-алкіл або МЕ"ВВ; серед сполук ізоксазоліну сполук піперазин формули І, перевага віддається сполукам піперазину формули І, де
А є феніл або піридил, де Кг приєднаний в орто-положенні до точки приєднання до атому вуглецю;
ВА є СМ, МО», Сі-Са-алкіл, Сі-С--галогеналкіл, Сі-С«-алкокси, Сі-С--галогеналкоксі або О-С (50)-Ва;
ВУ Сі-Св-алкіл, Сз-Са-алкеніл, Сз-С4-алкініл, МЕ"В8 або С.-С4--галогеналкіліде д є 0, 1 або 2;
ВУ, ВВ незалежно один від одного являють собою водень, С1-Св-алкіл, Сз-Св-алкеніл або Сз-
Св-алкініл; разом з атомом азоту, до якого вони приєднані, 2", ВУ можуть також утворювати п'яти-або шестичленне насичене, частково або повністю ненасичене кільце, яке, на додаток до атомів вуглецю, може містити 1, 2 або З гетероатома, вибраних з групи, що складаєтьсяз О, Мі 5, причому кільце може бути заміщено від 1 до З груп Кеа;
О являє собою ковалентний зв'язок або Сі-С--алкілен;
Ва! означає водень, ОН, С:-Св-алкіл, Сі-С4--галогеналкіл, Сз-Св-циклоалкіл;
Вага являє собою галоген, ОН, СМ, МО», Сі-Са-алкіл, Сі-С4-галогеналкіл, Сі-С4-алкокси, С1-С4- галогеналкоксі, 5(О)4аВУ, О-С(-О)-Вя і триС:-Слалкілеіліл;
Ве незалежно один від одного являє СМ, МО», галоген, С1-Са-алкіл, Сі-С4--галогеналкіл, Со-
С.-алкеніл, Сз-Св-алкініл, Сі--С«-алкокси, Сі-С4-галогеналкоксі, або бензил 5(О)аВуУ;
В? разом з групою Рг або Р», приєднану до сусіднього атому можуть також утворювати п'яти- або шестичленне насичене або частково або повністю ненасичене кільце, яке, на додаток до атомів вуглецю, може містити 1, 2 або З гетероатома, вибраних з групи, що складаєтьсяз О, Мі
Зо 5, причому кільце може бути частково або повністю заміщені Ка, р являє собою 0 або 1;
В'5 означає водень, С1-Сі2-алкіл, Сз-С12-алкеніл, Сз-Сі2-алкініл, Сі-С--алкокси або С(О)В2, які можуть бути частково або повністю заміщені Каае-групами; переважно являє собою водень,
С1-Сі2-алкіл, Сз-С12-алкеніл, Сз-С:12-алкініл, С--С4--алюкокси або С(ХО)К25;
В25 означає водень, Сі-Са-алкіл, Сі-С--галогеналкіл, Сі-С4-алкокси або Сі-С--галогеналкоксі, де в групах К"», Ваг та їх суб-замісників вуглецевого ланцюга і/або циклічні групи можуть нести 1, 2, З або 4 замісники, 22 і/або Ва;
В'Є означає С:і-Са-алкіл;
В'" означає ОН, МН», Сі-Са-алкіл, Сз-Св-циклоалкіл, Сі-С-галогеналкіл або С(ІХО)К2»;
В'З означає водень, або В" ії В»? разом утворюють ковалентний зв'язок;
В"Я, В2о. Дт, Д?! незалежно один від одного являють собою водень;
В23, Д2" незалежно один від одного означають водень, галоген або ОН; р12) з групи розв'язуючих гербіцидів: диносеб, дінотерб і ОМОС та його солі;
Б13) з групи ауксинових гербіцидів: 2,А-О і його солі та естери, 2,4-ОВ, його солі та естери, амінопіралід та його солі, такі як амінопіралід-трис (2-гідроксипропіл) амонію та його естери, беназолін, беназолін-етилу, хлорамбен і його солі та естери, кломепроп, клопіралід і його солі та естери, дикамба і її солі та естери, дихлорпроп і його солі та естери, дихлорпроп-Р і його солі та естери, флуроксипір, флуроксіпір-бутометил, флуроксіпір-метил, МСРА і його солі та естери, МСРА-тіоетил, МСРВ і його солі та естери, мекопроп і його солі та естери, мекопроп-Р і його солі та естери, піклорам і його солі та естери, квінклорак, квінклорак ТВА (2,3, б) і його солі та естери, триклопір та його солі та естери та аміноциклорирахлор і його солі та естери; 014) з групи, що включає інгібітори транспортування ауксину: діфлуфензопіром, діфлуфензопіром-натрій, напталам і напталам-натрій; р15) з групи інших гербіцидів: бромобутід, хлорфлуренол, хлорфлуренол-метил, цінметилін, кумілурон, далапон, дазомет, діфензокват, діфензокват-метилсульфат, діметипін, ОМА, дімрон, ендотал та її солі, етобензанід, флампроп, флампроп-ізопропіл, флампроп-метилу, флампроп-М-ізопропіл, флампроп-М-метил, флуренол, флуренол-бутил, Ффлурпрімідол, 60 фозамін, фозамін-амоній, інданофан, індазірлам, малеїновий гідразид, мефлуідід, метам,
метилазид, метилбромід метил-дімрон, метилиодид, М5МА, олеїнова кислота, оксазікломефон, пеларгонова кислота, пірібутікарб, хінокламін, тріазифлам, трідіфан і б-хлор-3-(2-циклопропіл-б- метилфенокси)-4-піридазинол (СА5 499223-49-3) і його солі та естери.
Крім того, може бути корисно використовувати бензоксазинони формули | в поєднанні з антидотами. Антидотами є хімічні сполуки, які запобігають або зменшують пошкодження корисних рослин, не маючи великого вплив на гербіцидну дію бензоксазинону формулу І до небажаних рослин. Їх можна застосовувати як до посіву (наприклад, для обробки насіння, пагонів або саджанців), або до появи сходів, або після появи сходів корисної рослини.
Крім того, антидоти С, бензоксазинони | та/або гербіциди В можуть застосовуватися одночасно або послідовно.
Відповідні антидоти є, наприклад, (хінолін-8-окси)оцтові кислоти, 1-феніл-5-галогеналкіл-1 Н- 1,2,4-триазол-3-карбонові кислоти, 1-феніл-4,5-дигідро-5-алкіл-1 Н-піразол-3,5-дикарбонові кислоти, 4,5-дигідро-5,5-діарил-3З-ізоксазолкарбонові кислоти, дихлорацетаміди, альфа- оксимінофенілацетонітрил, ацетофеноноксими, 4,б-дигалоген-2-фенілпіримідини, М-((4- (амінокарбоніл)феніл|сульфоніл|-2-бензоїламіди, 1,8-нафталеві ангідриди, 2-галоген-4- (галоідалкіл)-5-тіазолкарбонові кислоти, фосфортіолати і М-алкіл-О-фенілкарбамати та їх сільськогосподарсько прийнятні солі і їх сільськогосподарсько прийнятні похідні, такі аміди, естери і тіоестери, за умови, що вони мають кислотну групу.
Прикладами кращих антидотів С є беноксакор, клоквінтоцет, циометриніл, ципросульфамід, дихлормід, дициклонон, діетолат, фенхлоразол, фенклорін, флуразол, флуксофеніл, фурілазол, ізоксадифен, мефенпір, мефенат, нафталевого ангідриду оксабетрініл, 4-(дихлорацетил)-1- окса-4-азаспіро|(4.5|декан (МОМ4660, САБ 71526-07-3) і 2,2,5-триметил-3-(дихлорацетил)-1,3- оксазолідин (К-29148, СА5 52836-31-4) і М-(2-метоксибензоїл)-4-
Іметиламінокарбоніл)аміно|бензолсульфонамід (СА5 129531-12-0).
Особливо переважними антидотами С є беноксакор, клоквінтоцет, ципросульфамід, діхлормід, фенхлоразол, фенклорін, флуразол, флуксофеніл, фурілазол, ізоксадифен, мефенпір, нафталевий ангидрид, оксабетриніл, 4-(дихлорацетил)-1-окса-4-азаспіро|4.5|декан (МОМ4660, СА 71526-07-3) і 2,2,5-триметил-3-(дихлорацетил)-1,3-оксазолідин (К-29148, СА5 52836-31-4), і М-(2-метоксибензоїл)-4-((метиламінокарбоніл)аміно|Їбензолсульфонамід (САЗ
Коо) 129531-12-0).
Особливо переважними антидотами С є беноксакор, клоквінтоцет, ципросульфамід, дихлормід, фенхлоразол, фенклорім, фурілазол, ізоксадифен, мефенпір, 4-(дихлорацетил)-1- окса-4-азаспіро|(4.5|декан (МОМ4660, САБ 71526-07-3) і 2,2,5-триметил-3-(дихлорацетил)-1,3- оксазолідин (к-29148, СА5 52836-31-4), і М-(2-метоксибензоїл)-4-
Іметиламінокарбоніл)аміно|бензолсульфонамід (СА5 129531-12-0).
Особливо переважними антидотами С, в якості компонента С, є компонент композиції згідно з винаходом є антидоти С, як визначено вище, зокрема, антидоти С.1-С.13 перераховані нижче у таблиці С:
Таблиця С 111111111111Сафенерс/://::- ГГ: о ЇСЯбеноккакр.////77777777111111111111111111111111111111 0 Їбаклоквінтоцет////7771111111111111111111111111111111111 0 ЇСЗципросульфамід.ї//:/:/О777777711111111111111111111111сСсС о ЇСадихлормід/////777777777111111111111111111111сСсС 0 |Сб5фенхлоразол../:/ 21111111 о |Сбфенклорим./////77111111111111111111111111111111111 о ЇСфурилазол..7//////77777777711111111111111111111111111111111111 0 ЇС8іоксадифен.////////777777777777711111111111111111111111111сС о ЇСемефенпр.7///////7111111111111111111111111111 о І|СлОангідриднафталевоєкислоти.д//://7771111111с1С 000 1С11 4-(дихлорацетил)-1-окса-4-азаспіро|4.5|декан (МОМ4660, СА5 71526-07-3 о |благ,2,5-триметил-З-(дихлорацетил)-1,3-оксазолідин (В-29148, СА5 52836-31-4).:С/( Х /:/У/Д
Щі б.13 М-(2-метоксибензоїл)-4-((метиламінокарбоніл)ламіно|Їбензолсульфонамід (САЗ 129531- 12-0
Активні сполуки В груп Б1) - Б15) і активні сполуки С, відомі як гербіциди та антидоти, див., наприклад, Те Сотрепаїішт ої Ребзіїсіде Соттоп Матез (пер:/Ллимли.аапмиоса.пеїрезіісідев/);
Еагт Спетісаіє Напароок 2000 моїште 86, Меївіег Риріїєпіпд Сотрапу, 2000; В. Носк, С. Евєдіке,
А.А. 5сптіаії, Нетбігіде ІНетбісідев|, Ссеогд Тпіете Мепад, зішндап 1995; МУ. Н. Ангепв, Небісіде
НапарооК, 71 еайіоп, Ууеей Зсієпсе Босіеїу ої Атегіса, 1994; та К. К. Наїіов5, Негбрісіде
Напабоок, Зиррієтепі гг Ше 7 єайіоп, УУеєд 5сієпсе босівїу ої Атеїіса, 1998. 2,2,5-триметил-
З-(дихлороацетил)-1,3-оксазолідин |ІСАБ Мо. 52836-31-4 також відомий як К-29148. 4- (дихлорацетил)-1-окса-4-азаспіро(4.5|декан |(САБ Мо. 71526-07-3| також відомий як АЮ-67 та
МОМ 4660. Далі відомі активні гербіцидні сполуки з УУМО96/26202, УМО 97/41 116, МО 97/41 1 17,
УМО 97/411 18 та М/О 01/83459 а також з МУ. Кгатег еї аїЇ. (ева.) "Модегп Стор Ргоїесійоп
Сотроипав", Мої. 1, УМіеу МСН, 2007 і цитована там література. Як правило, переважно використовувати сполуки за винаходом в комбінації з гербіцидами, які є селективними щодо врожаю, який виправляють, і які доповнюють спектр сполук для контролю бур'янів при нормальних робочих витратах. Крім того, зазвичай переважно застосовувати сполуки за винаходом та інші додаткові гербіциди одночасно або як комбінований препарат або у вигляді бакової суміші.
Термін "нуклеїнова кислота тш-РРО" відноситься до РРО нуклеїнової кислоти, що має послідовність, яка є мутованою від дикого типу РРО нуклеїнової кислоти і який надає посиленної стійкості до гербіцидного похідного бензоксазинону рослинам в експресії. Крім того, термін "мутована оксидаза протопорфіриногену (тш-РРО)" відноситься до заміни амінокислоти дикого типу первинних послідовностей ЗЕО ІЮ МО: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, або 46, або її варіант, похідне, гомолог, ортолог або Паролог цього, іншими амінокислотами. Вираз "мутована амінокислота" буде використаний нижче для позначення амінокислоти, яка замінена іншою амінокислотою, тим самим позначає сайт мутації в первинній послідовності білка. У переважному варіанті здійснення РРО нуклеотидна послідовність містить послідовність з«ЕО ІЮ МО: 1, 25, 37 або 39 або її варіант або похідне. Крім того, повинно бути зрозуміло фахівцю в даній галузі техніки, що РРО нуклеотидні послідовності включають гомологи, парологи і ортологи ЗЕО ІЮ МО: 1, 25, 37 або 39, як визначено нижче.
Термін "варіант" стосовно послідовності (наприклад, поліпептид або послідовність нуклеїнової кислоти, такий як, наприклад, - регуляції транскрипції нуклеотидної послідовності за винаходом), означає по суті аналогічну послідовність. Для нуклеотидної послідовності, що містить відкриту рамку зчитування, варіанти включають ті послідовності, які через виродженості
Зо генетичного коду кодують ідентичну амінокислотну послідовність нативного білка. Природні алельні варіанти є такими, які можуть бути ідентифіковані з використанням відомих методів молекулярної біології, як, наприклад, полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і методами гібридизації. Варіант нуклеотидних послідовностей включають також синтетично отримані нуклеотидні послідовності, такі що генеруються, наприклад, за допомогою сайт-спрямованого мутагенезу і відкритими рамками зчитування, що кодують нативний білок, а також ті, які кодують поліпептиди, що мають амінокислотні заміни відносного з нативним білком. Як правило, варіанти нуклеотидних послідовностей за винаходом можуть мати принаймні 30, 40, 50, 60, до 70 956, наприклад, переважно 71 95, 72 95, 7З 9Уо, 74 о, 7590, 76 о, 77 У, 78 90, до 79 9о, зазвичай щонайменше 80 95, наприклад, 81-84 95, принаймні 85 95, наприклад, 86 95, 87 95, 88 о, 89 95, 9095, 91 95, 92905, 93 в, 94 90, 9595, 96 95, 97 95, 9895 та 99 95 нуклеотидної "ідентичності послідовності" до нуклеотидної послідовності 5ЕО ІЮ МО: ЗЕО ІО МО: 1, 3, 5, 7,9, 11, 13, 15, 17, 19,21, 23,25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 ї 45. Термін "варіант" поліпептиду означає поліпептид, отриманий з білка 5ЕО ІЮО МО: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, або 46, шляхом делеції (так звані усічення) або додавання однієї або декількох амінокислот на М-кінці або С-кінець нативного білка, видалення або додавання одного або декількох амінокислот в одному або декількох сайтах в нативного білка, або заміщення однієї або декількох амінокислот в одному або декількох сайтах в нативного білка.
Такі варіанти можуть бути результатом, наприклад, генетичного поліморфізму або з людських маніпуляцій. Методи таких маніпуляцій, як правило, відомі в даній галузі. Слід визнати, що полінуклеотидні молекули і поліпептиди за винаходом включають молекули полінуклеотидів і поліпептидів, що містить нуклеотидну або амінокислотну послідовність, яка є досить ідентичною нуклеотидній послідовності, викладений у 5ЕО ІЮО МО: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27,29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, або 45, або амінокислотній послідовності, представлених у ЗЕО
ІП МО: 2,4,6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 або 46. Термін "досить ідентичні" використовується тут для позначення першої амінокислотної або нуклеотидної послідовності, яка містить достатню або мінімальну кількість ідентичних або еквівалентних (наприклад, з подібним бічним ланцюгом) амінокислотних залишків або нуклеотидів на другій амінокислотній або нуклеотидній послідовності, так, що перша і друга амінокислотна або нуклеотидна послідовності мають загальний структурний домен і/або бо загальну функціональну активність.
"Ідентичність послідовностей" відноситься до ступеня, в якому дві оптимально вирівняні ДНК або амінокислотні послідовності, інваріантні по всьому вікну вирівнювання компонентів, наприклад нуклеотидів або амінокислот. "Ідентичність фракції" для вирівняних сегментів з тестової послідовності і опорної послідовності числа ідентичних компонентів, які є спільними для двох вирівняних послідовностей, поділені на загальне число компонентів відносно сегмента послідовності, тобто вся послідовність відноситься або менше до певної частини еталонної послідовності. "Відсоток ідентичності" є ідентичність фракції 100. Оптимальне вирівнювання послідовностей для вирівнювання у вікні порівняння добре відомі фахівцям в даній галузі техніки і можуть проводитися засобами, такими як алгоритм локальної гомології тій і
Умаїептап, алгоритм гомології вирівнювання МееаІетап і УуУип5с!, пошук подібності методом
Реагзоп і Гіртап, переважно за допомогою комп'ютерної реалізації цих алгоритмів, таких як
САР, ВЕЗТРЇТ, ЕА5ТА, та ТЕА5ТА, доступними як частина СО. УмМізсопзіп РасКаде. (Ассеїгу5
Іпс. Випіпаюп, Мав5.).
Терміни "полінуклеотид (и)", "послідовність (ості) нуклеїнових кислот", "нуклеотидна послідовність (ості)ю, "нуклеїнова кислота (и) "молекула нуклеїнової кислоти" використовуються тут взаємозаміно і відносяться до нуклеотидів, таких як рибонуклеотиди, або дезоксірибонуклеотиди або поєднання того й іншого в полімерні нерозгалужені форми будь-якої довжини. "Похідні" пептидів, що вміщують білки, олігопептидів, поліпептидів, білків та ферментів мають амінокислотні заміни, делеції та/або інсерції, в порівнянні з немодифікованим білком, про який йде мова, та мають схожу біологічну та функціональну активності немодифікованого білка, з якого вони отримані. "Гомологи" пептидів, що містять білки, олігопептидів, поліпептидів, білків і ферментів, що мають амінокислотні заміни, делеції та/або інсерції в порівнянні з немодифікованим білком, про який йде мова, та мають схожу біологічну та функціональну активності немодифікованого білка, з якого вони отримані.
Делеції стосуються видалення однієї або більше амінокислот з білка.
Інсерції стосуються одного або більше амінокислотних залишків, що вводять в заданому місці в білку. Інсерції можуть включати М-кінцеві та/або С-кінцеві вбудови, а також вставки всередині послідовності однієї або декількох амінокислот. Як правило, вставок в межах амінокислотної послідовності буде менше, ніж М-або С-кінцевих вбудов, порядку приблизно від 1 до 10 залишків. Приклади білків або пептидів з М-або С-кінцевими вбудовами білку включають зв'язуючий домен або домен активації активатора транскрипції, що використовують в дріжджовій двогібридній системі, білки фага (гістидин)-6-тег, глутатіон З-трансферази-тег, білок
А, мальтоза-зв'язуючий білок, дигідрофолатредуктази, епітоп Тег 100, с-тус епітоп, РІГ АСе- епітоп, Іас7, СМР (калмодулін зв'язуючий пептид), НА епітоп, епітоп білка С апа У5М епітоп.
Заміщення відноситься до заміни амінокислоти білка іншими амінокислотами, які мають аналогічні властивості (наприклад, подібну гідрофобність, гідрофільність, антигенність, схильність до утворення перерв альфа-спіральної структури або ДВ-складчастих структур).
Амінокислотні заміни є, як правило, з одного залишків, але можуть бути згруповані залежно від функціональних обмежень місця накладанням на поліпептид і може знаходитися в діапазоні від 1 до 10 амінокислот; вставками, як правило, порядку приблизно від 1 до 10 амінокислотних залишків. Амінокислотні заміни переважно є консервативними амінокислотними замінами.
Таблиці консервативних замін добре відомі в даній галузі (див., наприклад Стгеідпіоп (1984)
Ргоїєїпв. М.Н. Ггеетап апа Сотрапу (ред.).
Таблиця 2
Приклади консервативних амінокислотних замін
Ше 7 йейМа,ї///1111111111СС1
Амінокислотні заміни, делеції та/або інсерції, можуть бути легко виконані з використанням методів синтезу пептидів, добре відомими в даній галузі, наприклад, твердофазного синтезу пептидів тощо, або за допомогою маніпуляції рекомбінантної ДНК. Методи маніпуляції послідовності ДНК проведення варіантів заміни, вставки або делеції білків добре відомі в даній галузі. Наприклад, способи отримання заміщення мутацій в заздалегідь визначених місцях в
ДНК добре відомі фахівцям в даній галузі і включають М13 мутагенез, мутагенез Т7-гену іп міго у (ОВ, СіемеїЇапа, ОН), мутагенез швидкої заміни направляючого сайту (5ігаїадепе, Зап Оіедо,
СА), мутагенез ПЛР-опосередкованй направляючого сайту або інші протоколи мутагенезу направляючих. "Похідні" додатково включають в себе пептиди, олігопептиди, поліпептиди, які можуть, у порівнянні з амінокислотною послідовністю природної форми білка, такими як білок інтересу, включати заміни амінокислот з амінокислотними залишками неприродної форми або додатковими неприродніми амінокислотними залишками. "Похідні" білка також включають пептиди, олігопептиди, поліпептиди, які включають природні випадкові заміни (глікозильовані, ациліровані, прениліровані, фосфорильовані, міристоілировані, сульфатовані і т. д.) або не природньо замінені амінокислотні залишки, в порівнянні з амінокислотною послідовністю природнього поліпептиду. Похідне може також містити один чи більше неамінокислотних замісників або додатків в порівнянні з амінокислотною послідовністю, з якої вони були отримані, наприклад, молекула-репортер або інший ліганд, ковалентно або нековалентно зв'язаний з амінокислотною послідовністю, наприклад, репортерною молекулою, яка пов'язана для полегшення його виявлення, і не зустрічаються в природних амінокислотних залишках, по відношенню до природньої амінокислотної послідовності білка. Крім того, "похідні" включають також злиття, що зустрічаються в природі, білків з міченими пептидами, такими як РІ Ас, НІЗб або тіоредоксин (для опису мічених пептидів див. Тегре, Аррі. Місгобіої!. Віотесппої. 60, 523-533, 2003). "Ортологи" та "парологи" включають еволюційні поняття, що використовуються для опису родових відносин генів. Парологами є гени в межах одного виду, які виникли через дублювання
Зо гена-попередника; ортологами є гени з різних організмів, які виникли через видоутворення, а також отримані із загальних генів-нащадків. Необмежений перелік прикладів таких ортологів, які показані в таблиці 1. Добре відомо з рівня техніки, що парологи та ортологи можуть ділити різні домени, приховуючи прийнятні амінокислотні залишки в даних сайтах, таких як зв'язувальні пакети для конкретних субстратів або зв'язувальні мотиви для взаємодії з іншими білками.
Термін "домен" відноситься до набору амінокислот, що зберігають специфічні положення вздовж вирівнювання послідовностей еволюційно споріднених білків. У той же час амінокислоти в інших положеннях можуть мінятися між гомологами, амінокислоти, які є високо консервативними у конкретному положенні вказують амінокислоти, які є істотно необхідними у структурі, стабільності або функціонуванні білку. Ідентифіковані їх високим ступенем консервативності в вирівняних послідовностях родини гомологів білків, вони можуть бути використані в якості ідентифікаторів для визначення, чи будь-який поліпептид за інтересом відноситься до раніше ідентифікованої родини поліпептидів.
Термін "мотив" або "консенсусна послідовність" стосується короткої консервативної області в послідовність еволюційно споріднених білків. Мотиви часто є високо консервативними частинами доменів, але може також включати в себе тільки частину домену або бути розташовані поза консервативним доменом (якщо всі амінокислоти мотиву знаходяться за межами певного домену).
Існують спеціальні бази даних для ідентифікації областей, наприклад, ЗМАКТ (Зспийя еї а). (1998) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 95, 5857-5864; І ейпіс єї аї. (2002) Мисівїс Асідх Рез 30, 242- 244), ІпіегРіо (Миїдег єї аї., (2003) Мисі. Асіаб5. Нев5. 31, 315-318), Ргозіе (Виспег апа Ваїгосп (1994), Узагальнений синтаксисний профіль для мотивів бімолекулярних послідовностей та його функції в автоматичній інтерпретації послідовності. (Іп) ІЗМВ-94; Ргосеєдіпоз5 2па Іпіегтаїйопаї
Соп'іегепсе оп Іпівїїїдепі Зубзівтв ог Моїесшіаг Віоіоду. Айтап В., Вишад 0., Кагр Р., Гаїпгор Н., зЗеагів О., Едв., рр53-61, АДАЇ Ргев5, Мепіо Рак; Нио еї аї., Мисі. Асіабє. Вевз. 32:0134-0137, (2004)), ог Ріат (Ваіетанп еї а!., Мисівїс Асіаз Незеагсі З30(1): 276-280 (2002)). Набір інструментів для кремнієвого аналізу білкових послідовностей доступний на ЕХРА5БУу ргоїеотісв зегмег. (Зм/і55
Іпвійше ої Віоіпіоптаїййсе (Савієїдег єї аі, Ех-РАБу: сервер протеоміки для поглибленного вивчення та аналізу білків, Мисієвїс Асід5 Ке5. 31:3784-3788(2003)). Домени або мотиви можуть бути також визначені за допомогою звичайних методів, наприклад, шляхом вирівнювання послідовностей.
Методи вирівнювання послідовностей для порівняння добре відомі в даній галузі техніки та включають САР, ВЕЗТРЇТ, ВІ А5Т, ЕАЗТА апа ТЕА5ТА. САР використовує алгоритм Мееадіетап та Мусп5сп ((1970) 9 Мої Віо! 48: 443-453 для пошуку глобальних (тобто, охоплює повні послідовності) вирівнювань двох послідовностей, який максимізує кількість зпівпадінь та мінімізує кількість пропусків. Алгоритм ВГАБТ (Аїй5зспи! еї а). (1990) У Мої Віо! 215: 403-10) підраховує відсоток ідентичності послідовності та виконує статистичний аналіз подібності між двома послідовностями. виконує статистичний аналіз подібності між двома послідовностями.
Програмне забезпечення для виконання аналізу ВІ А5Т публічно доступне через Національний центр біоїнформатики (МСВІ). Гомологи можуть бути легко визначені з використанням, наприклад, алгоритму Сіибїаму вирівнювання декількох послідовностей (версія 1,83), при цьому типовим є параметри попарного вирівнювання та методи обчислювання у відсотках. Загальний відсоток подібності та ідентичності може бути також визначено з використанням одного з методів, доступних в пакеті програмного забезпечення МаїзАТ (Сатрапеййа еї аї,, ВМС
Віоіптогтаїйісь. 2003 ди! 10;4:29. МаїіСАТ: додаток, який генерує матриці подібності//дентичності з
Зо використанням послідовності білків або ДНК.) Мінімальне ручне корегування може виконуватися для оптимізації вирівнювання між консервативними мотивами, що очевидно для фахівця в даній галузі. (Зпійп ТЕ, Умаїегтап М5 (1981) 9. Мої. Віо! 147(1); 195-7).
Автори даного винаходу несподівано виявили, що шляхом заміни одного або більше з ключових амінокислотних залишків толерантність або стійкість до гербіцидів може бути повторно чисельно збільшена в порівнянні з активністю дикого типу РРО ферментів з ЗЕО ІЮ
МО: 2, 4,6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 або 46. Переважні заміни ти-РРО є ті, які підвищують стійкість до гербіцидів рослин, але залишена біологічна активність активності оксидази істотно не впливає.
Відповідно, в іншому об'єкті даного винаходу ключові амінокислотні залишки ферменту РРО, варіанту, похідного отолога, Паролога або його гомолога заміщено будь-якою іншою амінокислотою.
У переважному варіанті здійснення ключові амінокислотні залишки ферменту РРО, варіанту, похідного отолога, паролога або його гомолога заміщено консервативною амінокислотою, як показано у таблиці 2.
Фахівцеві в даній галузі повинно бути зрозуміло, що амінокислоти розташовані в безпосередній близькості від позицій амінокислот, зазначених нижче, також можуть бути заміщені. Таким чином, в іншому варіанті здійсненні варіант БЗЕО ІО МО: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, або 46, варіант, похідне, паролог або гомолог містить тиш-РРО, в яких амінокислота ж3, 52 або ї-1 в амінокислотних позиціях від ключової амінокислоти замінена будь-якою іншою амінокислотою. На основі методів, добре відомих в даній області, найвищі характерні зображення послідовності можуть бути розроблені, за допомогою яких в подальшому можуть бути знайдені тш-РРО кандидати з потрібною активністю.
Пошук подальших тши-РРО кандидатів шляхом застосування підходящої конфігурації послідовності буде також входити в обсяг даного винаходу. Слід розуміти кваліфікованому читачеві, що даний шаблон послідовність не обмежено точною відстанню між двома сусідніми амінокислотними залишками зазначеного шаблону. Кожна з відстаней між двома вище сусідніми моделями може, наприклад, змінюватися незалежно одна від одної більш ніж на ж10, 5, 53, 52 або 41 амінокислотних позицій без істотного впливу на бажану активність.
Відповідно до згаданих вище функціонального і просторового аналізів окремих амінокислотних залишків на основі кристалографічних даних, отриманих відповідно до даного винаходу, унікальні часткові амінокислотні послідовності характеризують потенційно корисних ти-РРО кандидатів згідно винаходу та можуть бути ідентифіковані.
В особливо кращому варіанті здійснення винаходу варіант або похідне тш-РРО з 5ЕО ІЮ
МО: 2, вибрані з наступної таблиці За та комбіновані амінокислотні заміни тш-РРО з 5ЕО ІЮ
МО: 2 вибраний з таблиці 360.
Таблиця За (Послідовність ІЮ Мо: 2, 26, 38, 40): одиничні амінокислотні заміни , Ключова . .
Аго128 І еи, Аа, Маї І еи, Аа, Маї, Пе, Рпеє, Тр, Авр, Авп й делеція, Аа, Маї, Рго, Г ем, Пе, Меї, 2 Спіу175 делеція, Аа, Маї, Рго Фег, ТНг й делеція, Аа, Маї, Рго, Г ем, Пе, Меї, 2 СпіугОо9 делеція, Аа, Маї, Рго Фег, ТНг сугто делеція, Аа, Маї, Рго долеці, лів, Ма), Рго, І ем, Ме, Меї,
Ї еи295 Зег, Меї, Аа Зег, Меї, Аа, Маї, Авр, Ап ТПг
Зег296 Ї ем, Меї, СІ Ї еи, Меї, Спу, Маї, Авр, Азп ТНг
Ї еи334 маї, Пе, Рне маї, Пе, Рне, Туг, Азп, Авр, ТНг
РпеЗ53 Туг, Ге, Маї, Пе, Авп сіузв2 Аа, бег, ТАг Аа, бег, Тиг, Сувз, Маї, Авр
Ї еи384 Аа, маї, Пе Аа, маї, Пе, Авп, Авр, ТАг
Ї еи397 Аа, маї, Пе Аа, маї, Пе, Авп, Авр, ТАг сіуЗзО8 Аа, бег, ТПг Аа, Зег, ТП, Сув, Маї, Авр
Ти399 Зег, Сув, Меї, Аа, Авп
І еи400 Аа, Маї, Пе, Рне Аа, Маї, Пе, Ре, Азп, Азр, Тиг
Зег402 Сиу, Аа, Сув Сиу, АІа, Сув, Авр, Ні бег403 СТУ, Аа, Суб Су, Аа, Сув, Авр, Нів
Меї404 Зег, Суб, ТП Зег, Суз, ТП, СІу, Аа
Меї405 Ї ем, АІа, Маї Ї ем, АІа, Маї, СІу, Сув, 5еї
Рпе420 Меї, Суз, Пе, Туг, Тр Меї, Суз, Пе, Туг, Ттр, Геи, ТНг
Рпе439 Туг, Тр, Аа, Ма), Іе
Уаї389 Меї, Аа, Суз Меї, Аа, Сув, Нів
Аіаг220 делеція, Маї, Тпг, Ге, Су, Пе| делеція, Маї, Тпг, Гец, Сув, Пе, Меї 5305 І еи, Аа, Ма! І еи, Ага, Ма!
Туг426 Меї, Сув, Іе Меї, Сув, Іе, Геи, Тиг й делеція, Аа, Маї, Рго, Г ем, Пе, Меї, 40 Спіу178 делеція, Аа, Маї, Рго Фег, ТНг су179 делеція, Аа, Ма, Рго делеція, Ла, Уві, Гто, Чем, Те, Ме,
Ріпе372 Меї, Суз, Пе, Туг, Тгр, Ре Меї, Суз, Пе, Тут, Ттр, Ріє, Геи, ТНг
Ріпез392 Меї, Сузв, Пе, Тут, Тр Меї, Суз, Пе, Тут, Ттр, Гей ТНг
Таблиця ЗБ
ЗЕО ІЮО МО: 2 (комбіновані амінокислотні заміни) : Ключове
Комбі- й положення 1 оег, ТИг з |енноют|нникльчитє еврлачиетнен зег, ТИг
Слід розуміти, що будь-яка амінокислота, крім тих, які згадані в наведених вище таблицях 3, може бути використана як заступник. Дослідження для перевірки функціональності таких 5 мутантів і легко доступні в даній галузі техніки і, відповідно, описані в розділі прикладів здійснення даного винаходу.
У переважному варіанті амінокислотна послідовність відрізняється від амінокислотної послідовності РРО 5ЕО ІО МО: 2 в одному або декількох з наступних положень: 128, 175, 209, 210, 295, 296, 334, 353, 382, 384, 397, 398, 399, 400, 402, 403, 404, 405, 420, 439.
Приклади відмінностей у цих положеннях амінокислот включають, але не обмежуються ними, один або більше з таких дій: амінокислота в положенні 128 є іншою, ніж аргінін; амінокислота в положенні 175 є іншою, ніж гліцин; амінокислота в положенні 209 є іншою, ніж гліцин; амінокислота в положенні 210 є іншою, ніж гліцин; амінокислота в положенні 295 є іншою, ніж лейцин; амінокислота в положенні 296 є іншою, ніж серин; амінокислота в положенні 334 є іншою, ніж лейцин; амінокислота в положенні 353 є іншою, ніж фенілаланін; амінокислота в положенні 382 є іншою, ніж гліцин; амінокислота в положенні 384 є іншою, ніж лейцин; амінокислота в положенні 397 є іншою, ніж лейцин, амінокислота в положенні 398 є іншою, ніж гліцин, амінокислота в положенні 399 є іншою, ніж треонін, амінокислота в положенні 400 є іншою, ніж лейцин, амінокислота в положенні 402 є іншою, ніж серин, амінокислота в положенні 403 є іншою, ніж серину, амінокислота в положенні 404, крім метіоніну амінокислота в положенні 405, крім метіоніну амінокислота в положенні 420, крім фенілаланіну, амінокислота в положенні 439 є іншою, ніж фенілаланін.
У деяких варіантах здійснення фермент РРО 5ЕО ІЮ МО: 2 містить одне або більше з наступного: амінокислота в положенні 128 є Геи, Аа, Маї, Ме, Ре, Тгр, Авр, або Авп; амінокислота в положенні 175 видаляється, Аа, МаїЇ, Рго, Геи, Пе, Меї, бег, або ТнНг; амінокислота в положенні 209 видаляється, Аїа, Маї, Рго, І еи, Пе, Меї, Зег або Тиг; амінокислота в положенні 210 видаляється, Аа, Маї, Рго, І ей, Пе, Меї, бЗег, або ТПг; амінокислота в положенні 295 є бег, Меї, Аа, Маї, Ар, Азп або Тнпг; амінокислота в положенні 296 є І е!и, Меї, Су, Маї, Ар,
Абп або Тпг; амінокислота в положенні 334 є вал, брехня, Рпе, Туг, Азп, Ар або ТнНг; амінокислоти в положенні 353 є Туг, І еи, Маї, Пе, або Азвп; амінокислота в положенні 382 є Аа, зЗег, ТНг, Суз, Ма! або Ар; амінокислоти в положенні 384 є Аїа, Маї, Ме, Азп, А5р або ТнНг; амінокислота в положенні 397 є Аа, Маї, Пе, Азп, Ар або ТНг, амінокислота в положенні 398 є
Аа, Зег, Тиг, Су, Маї, або Азр, амінокислоти в положенні 399 в бег, Суб, Меї, Аіа або Авп, амінокислота в положенні 400 є Аа, Маї, Пе, Ре, Авп, Ар або Тпг, амінокислота в положенні 402 є Су, Аа, Су, Азр або Ні, амінокислота в положенні 403 є Су, Аа, Су, Ар або Ні, амінокислоти в положенні 404 є Зег, Суб, ТНПг, СіІу або Аа, амінокислота в положенні 405 є І еи,
Аа, Маї, Су, Су, або 5ег, амінокислота в положенні 420 є Меї, Суз, Пе, Туг, Тгр, ем або Тнг, амінокислота в положенні 439 є Туг, Тгр, Аа, Маї, або Іе.
У ще одному переважному варіанті амінокислотна послідовність відрізняється від амінокислотної послідовності РРО 5ЕО ІО МО: 26 в положенні 389. Переважно, амінокислоти в положенні 389 є іншим, ніж валін. Більш переважно, коли амінокислота в положенні 389 є Меї,
Аа, Су або Нів.
У ще одному переважному варіанті амінокислотна послідовність відрізняється від амінокислотної послідовності РРО 5ЕО ІЮ МО: 38 в одному або декількох з наступних положень: 220, 305, 426. Переважно амінокислоти в положенні 220 є іншим, ніж аланін, амінокислоти в положенні 305 є іншим, ніж серин, амінокислоти в положенні 426 є іншим, ніж тирозин.
Більш переважно, коли амінокислота в положенні 220 видаляється, Маї, ТПг, Гей, Суб, Пе, або Меї; амінокислоти в положенні 305 є ГІ еи, Аа, Маї, амінокислоти в положенні 426 є Меї, Су,
Ме, Геи або ТНг.
У ще одному переважному варіанті амінокислотна послідовность відрізняється від амінокислотної послідовності з РРО з 5ЕБО ІЮ МО: 40 в одному або декількох з наступних положень: 178, 179, 372, 392. Переважно амінокислоти в положенні 178 є іншим, ніж гліцин, амінокислота в положенні 179 є іншим, ніж гліцин, амінокислота в положенні 372 є іншим, ніж фенілаланін амінокислоти в положенні 392 є іншим, ніж фенілаланін.
Більш переважно, коли амінокислота в положенні 178 видаляється, Аїа, Маї, Рго, Г ем, Пе,
Меї, Зег або Тиг; амінокислоти в положенні 179 видаляється, Ла, Маї, Рго, Геи, Пе, Меї, Зег або
Тиг; амінокислоти в положенні 372 є Меї, Суб, Іе, Туг, Тгр, Рпе, Гени, або Тпг; амінокислоти в положенні 392 є Меї, Суб, Пе, Туг, Тгр, або І еи.
В межах знань фахівця в цій галузі, що виявлення консервативних областей і мотивів розділено між гомологами, ортологами і Парологами 5ЕО ІО МО: 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23,25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 або 45, як зображено в таблиці 1. Маючи ідентифікованими такі консервативні області, які можуть представляти прийнятні зв'язуючі мотиви, амінокислоти, що відповідають амінокислотам, перерахованим в таблиці За та ЗБ, можуть бути вибраними для заміни будь-якою іншою амінокислотою, переважно консервативною амінокислотою, як показано у таблиці 2, а також більш переважно амінокислотою з таблиць За і 30.
Крім того, даний винахід відноситься до способу ідентифікації гербіцидне похідне бензоксазинону за допомогою тш-РРО, що кодується нуклеїнової кислотою, яка включає нуклеотидну послідовність ХЕО ІЮО МО: 1, 3, 5, 7, 9, 1471, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33,
Ко) 35, 37, 39, 41, 43, або 45, або його варіант або похідне.
Зазначений спосіб включає такі стадії: а) генерація трансгенних клітин або рослин, що містить нуклеїнову кислоту, що кодує тиї-
РРО, що відрізняється тим, ти-РРО є експресійним; р) використання гербіцидного похідного бензоксазинону до трансгенних клітин або рослин а) і контрольних клітин або рослин того ж сорту; с) визначення зростання або життєздатність трансгенних клітин або рослин і контрольних клітин або рослин після застосування зазначеного гербіцидного похідного бензоксазинону і а) вибір "гербіцидного похідного бензоксазинону", яке призведе до зниження росту контрольних клітин або рослин в порівнянні з ростом трансгенних клітин або рослин.
Під "контрольними клітинами" або "подібний, дикого типу, рослин, тканина рослин, рослинної клітини або клітина-хазяїн" розуміють рослин, рослинну тканину, рослинні клітини або клітину-хазяїна, відповідно, в яких відсутня характеристика гербіцидної стійкості та/або певний полінуклеотид за винаходом, як вказано в даному описі. Не використання терміну "дикий тип" мається на увазі, що рослині, тканині рослин, рослинній клітині або іншій клітині-хазяїну не вистачає рекомбінантної ДНК в своєму геномі, тал"або не має характеристик стійкості до гербіцидів, які відрізняються від описаних тут.
Інший об'єкт стосується способу ідентифікації нуклеотидної послідовності, що кодує тиї-
РРО який стійкий або толерантний до гербіцидне похідне бензоксазинону, метод включає: а) генерування бібліотеки нуклеїнових кислот, що кодує тиш-РРО,
Б) скринінг популяції в отриманих нуклеїнових кислот, що кодують тшиш-РРО, шляхом експресії кожної із зазначених нуклеїнових кислот у клітині або рослині та обробку вказаних клітин або рослин гербіцидним похідним бензоксазинону с) порівняння рівнів гербіцидної толерантності похідних бензоксазинону, впроваджених у вказаній популяції нуклеснових кислот тШш-РРО, що кодують нуклеїнові кислоти з рівнем гербіцидної толерантності похідних бензоксазинону, що спостерігається у контрольній нуклеїновій кислоті, що кодує ти-РРО, а) вибір щонайменше однієї нуклеїнової кислоти, що кодує ти-РРО, яка забезпечує значно вищий рівень стійкості до гербіцидне похідне бензоксазинону в порівнянні з забезпеченим контролем нуклеїнової кислоти, що кодує тиЇ-РРО.
У переважному варіанті здійснення нуклеїнова кислота, що кодує тиш-РРО, вибрана на стадії 4), забезпечує щонайменше в 2 рази більше стійкості або толерантності клітин або рослин до гербіцидного похідного бензоксазинону в порівнянні з забезпеченням контрольної нуклеїнової кислоти, що кодує тиш-РРО.
У ще одному переважному варіанті здійснення нуклеїнова кислота, що кодує тши-РРО, вибрана на стадії а), забезпечує щонайменше в 2 рази, принаймні в 5 разів, принаймні в 10 разів, принаймні в 20 разів, принаймні в 50 разів, принаймні 100-кратно, принаймні в 500 разів, наскільки багато стійкості або толерантності клітини або рослин до гербіциду, що є похідним бензоксазинону, в порівнянні до такої, що забезпечується контролем нуклеїновою кислотою, що кодує РРО.
Стійкість або толерантність можуть бути визначені шляхом генерації трансгенних рослин або клітини хазяїна, переважно рослинній клітині, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, бібліотеки на стадії а) і порівняння зазначеної трансгенної рослини з контрольною рослиною або клітиною-хазяїна, переважно рослинною клітиною.
Інше завдання стосується способу ідентифікації рослини або водорості, що містить нуклеїнову кислоту, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує дикий тип або тш-РРО, який стійкий або толерантний до гербіцидного похідного бензоксазинону, що містить етапи: а) визначення ефективної кількості гербіцидного похідного бензоксазинону в культурі клітин рослин або зеленої водорості, що призводить до загибелі цих клітин, б) обробку зазначеної клітини рослини або зеленої водорості з мутагенізуючим агентом, с) контактування зазначеної популяції мутантних клітин з ефективною кількістю гербіцидного похідного бензоксазинону, зазначених у а) г) вибір щонайменше однієї клітини, що вижила у цих умовах, д) ПЛР-ампліфікація і секвенування генів РРО з клітин обраних в 0) і порівняння таких послідовностей з послідовністю гену РРО дикого типу, відповідно.
У переважному варіанті здійснення згаданий мутагенізуючий агент Є етилметанесульфонатом (ЕМ5).
Багато способів добре відомі фахівцям в даній області, доступні для отримання відповідних кандидатних нуклеїнових кислот для ідентифікації нуклеотидної послідовності, що кодує тиї-
Зо РРО з різноманіття потенційних джерел організмів, включаючи мікробів, рослини, гриби, водорості, змішані культури також, як екологічні джерела ДНК, такі як грунт. Ці методи включають, між іншим, підготовку КДНК або геномних бібліотек ДНК, використання відповідних вироджених олігонуклеотидних праймерів, використання зондів на основі відомих послідовностей або аналізів комплементарності (наприклад, для зростання під впливом
З5 тирозину), а також використання мутагенезу, перестановки і для того, щоб забезпечити рекомбінації або перемішування послідовностей, що кодують тиЇ-РРО.
Нуклеїнові кислоти, що містять кандидатні і регуляторні послідовності, що кодують РРО, можуть бути експресовані в дріжджах, в бактеріальному штамі хазяїна, у водорості або вищих рослинах таких як тютюн або Агарідорхіє і відносні рівні, притаманної толерантності, послідовностей, що кодують РРО, піддані скринінгу згідно з видимим індикаторним фенотипом трансформованого штаму або рослин у присутності різних концентрацій обраного гербіциду, що є похідним бензоксазинону. Дозові відповіді і відносні зрушення в дозі реакції, пов'язані з цими індикаторними фенотипами (утворення коричневого кольору, інгібування росту, гербіцидний ефект і т. і) зручно виразити в термінах, наприклад, 5К50О (концентрація для 50 95-вого зниження росту) або МІС (мінімальна інгібуюча концентрація) значення, де збільшення значення відповідають збільшенню притаманної толерантності експресованого РРО. Наприклад, у відносно швидкій аналізуючій системі, заснованій на перетворенні такої бактерії, як Е.соїї, кожна послідовність, що кодує тш-РРО, може бути експресована, наприклад, у вигляді послідовності
ДНК під контролем експресії здатного контролювати промотора, такого як промотор Гас7 і з прийнятним підрахунком, наприклад, шляхом використання синтетичних ДНК, таких як використання кодонів для того, щоб отримати так порівняно як можливо рівень експресії різних послідовностей РРО. Такі штами, що експресують нуклеїнові кислоти, що містять альтернативні кандидатні РРО послідовності, можуть бути поміщені при різних концентраціях обраного гербіциду, що є похідним бензоксазинону, в, необовязково на середовищі, доповненому тирозином, і відносних рівнях притаманної толерантності експресованих ферментах РРО, оцінених на основі ступеню і МіС для інгібування утворення коричневого кольору, охронотичного пігменту.
В іншому варіанті кандидатні нуклеїнові кислоти трансформують в рослинному матеріалі для отримання трансгенної рослини, регенерують в морфологічно нормальних фертильних бо рослинах, які потім вимірювали для диференціальної толерантності до вибраних гербіцидних похідних бензоксазинону. Багато підходящих для перетворення з використанням відповідних селективних маркерів, таких як канаміцин, виконавчі вектори, такі як від Адгобасієгічт і регенерації рослин, як, наприклад, з дисків листя тютюну добре відомі в даній галузі.
Необов'язково, контроль популяції рослин аналогічним чином трансформовані нуклеїнової кислоти, що виражають управління РРО. Крім того, не-трансформованих дводольних рослин, таких як Агарідорзіх або тютюн може бути використаний в якості контролю, так як це, в будь- якому випадку, висловлює своє власне ендогенний РРО. Середнє значення та розподілення рівнів стійкості до гербіцидів ряду подій первинної трансформацій рослин або їх потомства до описаних вище похідних бензоксазинону оцінюються у звичайному порядку на основі ураження рослин, симптомів меристематичного відбілювання тощо в діапазоні різних концентрацій гербіцидів. Ці дані можуть бути виражені у вигляді, наприклад, значень ОК50, отриманих з кривих доза/відповідь, які мають "дозу", нанесену на вісь х, та "відсоток знищених", "гербіцидний ефект", "кількість нових зелених рослин" тощо, нанесені на вісь У, де збільшені значення 5К50 відповідають підвищеним рівням властивої стійкості експресованого РРО. Гербіциди можуть, відповідно, застосовуватися до появи або після появи паростків.
Інший об'єкт стосується виділеної нуклеїнової кислоти, яка кодує ти-РРО, де нуклеїнову кислоту можуть ідентифікувати за способом, визначеним вище.
В іншому варіанті здійснення даний винахід відноситься до рослинної клітини, трансформованої від дикого типу або ти-РРО нуклеїнової кислоти або рослинної клітини, яка була мутована для отримання рослини, що експресують нуклеїнову кислоту дикого типу або тиї-РРО, де експресія нуклеїнової кислоти в клітині рослини призводить до збільшення стійкості або толерантності до гербіцидного похідного бензоксазинону в порівнянні з варіантом дикого типу рослинної клітини.
Термін "експресія/експресує" або "генна експресія" означає транскрипцію конкретного гена або специфічних генів або конкретного генетичного конструкту. Термін "експресія" або "генна експресія" означає, зокрема транскрипцію гена або генів, або генетичного конструкту в структурну РНК (рРНК, тРНК) або мРНК з або без наступної трансляції останнього в білку.
Спосіб включає транскрипцію ДНК і обробку отриманого продукту мРНК.
Щоб отримати бажаний ефект, тобто рослини, які є толерантними або стійкими до
Зо гербіцидного похідного бензоксазинону даного винаходу, має бути зрозуміло, що щонайменше одна нуклеїнова кислота є "надекспресована" методами і засобами, відомими фахівцеві в даній галузі.
Термін "підвищена експресія" або "надекспресія", що використовуваний тут, означає будь- яку форму експресії, яка є додатковою до рівня експресії вихідного дикого типу. Методи підвищення експресії генів або генних продуктів добре відомі в даній галузі і включають, наприклад, надлишкову експресію, що управляється відповідними промоторами, використання енхансерів транскрипції або енхансерів трансляції. Виділені нуклеїнові кислоти, які служать в якості промотору або енхансера можуть бути введені у відповідне положення (як правило, вище за напрямом) не гетерологічних форм полінуклеотида, з тим, щоб регулювати експресією нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид інтересу. Наприклад, ендогенні промотори можуть бути змінені в природних умовах шляхом мутації, делеції та/або заміни (зеє, Кітіес, О5 5,565,350; 7апіпод еї аіІ., М/09322443), або виділені промотори можуть бути введені в рослинну клітину в правильній орієнтації та відстані від гену за винаходом так, щоб регулювати експресією гену.
Якщо експресія поліпептиду є бажаною, то загалом бажано включати область поліаденілювання на 3'-кінці полінуклеотиду, що кодує ділянки. Поліаденілювання можуть бути отримані з природного гена, з безлічі інших генів рослин, або з Т-ДНК. Кінці послідовності 3", які будуть додані, можуть бути отримані з, наприклад, генів нопалінсинтази або октопінсинтази, або, альтернативно, від іншого рослинного гена, або, менш переважно, від будь-яких інших еукаріотичних генів.
Послідовність інтрону також може бути додана до 5'-сетранслюючої області (ТК) або послідовність, що кодує послідовність, що кодує частково, щоб збільшити кількість зрілих меседжів, що накопичуються в цитозолі. Включення спеціального інтрону в одиницю транскрипції в рослинних і тваринних експресійних конструкціях було показано збільшення експресії генів як на рівні мРНК та білка до 1000 разів (Висптап апа Вего (1988) Мої. СеїЇ ріої. 8: 4395-4405; Саїїв єї а). (1987) Сепев Юем 1:1 183-1200). Таке інтронне посилення експресії генів як правило максимальне коли розміщене поблизу 5'-кінця транскрипційної одиниці.
Використання інтронів кукурудзи Аап1-5 інтрона 1, 2 і 6, інтрон Вгоп7е-1 відомо в даній галузі.
Для отримання загальної інформації див: Те Маїге Напароок, Спаріег 116, Егееїїпд апа Умаїрої, (510) Еав., Зрігіпдег, М.У. (1994).
Ттермін "введення" або "трансформація", про який йдеться тут, охоплює передачу екзогенного полінуклеотида в клітину-хазяїна. незалежно від методу, що використовується для передачі. Здатність рослинних тканин до подальшого клонального розповсюдження, будь то органогенез або ембріогенез, можуть бути трансформовані з генетичної конструкції за даним винаходом і вся рослина регенерувати від нього. Обрана конкретна тканина буде змінюватися в залежності від клональної систем, доступної для поширення, і найкраще підходить для конкретних трансформованих видів. Приклади тканинних мішеней включають тканини дисків листя, пилок, ембріони, сім'ядолі, гіпокотілі, мегагаметофітів, калюсної тканини, існуючі мерістематичні тканини (наприклад, апікальної меристеми, пазушні бруньки, і коренева меристема) і індукована меристемна тканина (наприклад, сім'ядолю меристеми і Гіпокотиль меристеми). Полінуклеотид може бути тимчасово або стабільно введено в клітину-хазяїна і може підтримуватися неінтегровано, наприклад, як плазміда.
Альтернативно, він може бути інтегрований в геном хазяїна. Отримана в результаті трансформована рослинна клітина може бути потім використана для регенерації трансформованої рослини способом, відомим фахівцям в даній області.
Передача чужорідних генів у геном рослини називається трансформацією. Трансформація рослини в даний час є досить звичайною методикою. Переважно, будь-які з декількох методів трансформації можуть бути використані для введення гена в підходящу клітину-предка.
Способи, описані для трансформації та регенерації рослин з рослинних тканин або рослинних клітин можуть бути використані для тимчасової або стабільної трансформації. Методи трансформації включають застосування ліпосом, електропорації, хімічних речовин, які збільшують поглинання вільної ДНК, ін'єкції ДНК безпосередньо на рослину, бомбардування частинками, трансформації з використанням вірусів або пилку і мікропроекціювання. Методи можуть бути обрані з кальцій/поліетиленгліколь методів для протопластів (Кгеп5, Б.А. еї аї., (1982) Маїште 296, 72-74; Медгшйи І! еї аї. (1987) Ріапі Мої! Віо! 8: 363-373); електропорацією протопластів (ЗПЙНО К.О. еї аїЇ. (1985) Віо/Гесппо! З, 1099-1 102); мікроіїн'єкцією в рослинний матеріал (Стго55улау А еї аї., (1986) Мої. Сеп Сепеї 202: 179-185); бомбордуванням частинками, що вкриті ДНК або РНК (Кієїп ТМ еї аї., (1987) Майшге 327: 70) інфікування з (не інтегративними) вірусами, тощо. Трансгенні рослини, в тому числі трансгенні культурні рослини, отримують
Зо переважно за допомогою Адгобасіегіпт-опосередкованої трансформації. Вигідний спосіб перетворення є перетворення в підложці. З цією метою, наприклад, допускається дія агробактерій на насіння рослин або для інокуляції рослини меристеми з агробактеріями. Це виявилося особливо доцільним відповідно до винаходу, щоб дозволити суспензії трансформованих агробактерій діяти на інтактні рослини або принаймні на примордіальну квітку. Рослини, які виросли пізніше, ніж насіння оброблених рослин не будуть отримані (Сіоцдни апа Вепі, Ріапі У). (1998) 16, 735-743). Методи Адгорасіегіпт-опосередкованої трансформації рису включають достатньо відомі методи для трансформацій рису, такі, як описані в будь-якому з наступних: ЕР 1 198985 А1, АІдетійа та Ноддез (Ріапіа 199: 612-617, 1996); Спап та ін. (Ріапі
МОЇ! Віої 22 (3): 491-506, 1993), Нівї та ін. (Ріапі У 6 (2): 271-282, 1994), описи яких включені сюди за допомогою посилання, що повністю викладені. У разі трансформації кукурудзи, переважний спосіб, як описано в будь-якому з Ізпіда еї аї. (Маї. Віоїесппої! 14(6): 745-50, 1996) або Егате та ін. (Ріапі Рпузіо! 129(1): 13-22, 2002), описи яких включені сюди за допомогою посилання, що повністю викладені. Зазначені способи описані далі як приклади у В. Уепез еї аї., Тесппіднев ог
Сепе Тгтапвгіег, іп: Тгапздепіс Ріапів, Мої. 1, Епдіпеегіпу апа Шії2айоп, єдв. 5.0. Кипд апа В. Ми,
Асадетіс Рге55 (1993) 128-143 апа іп Роїшукив Аппи. Нем. Ріапі Рпузіо!. Ріапі Моїес. Віої. 42 (1991) 205-225). Нуклеїнові кислоти або конструкти експресують переважно клонуванням у вектор, який підходить для експресії Адгобасіегіит їштегасієп5, наприклад рвіМм19 (Вемап еї аї.,
Мисі. Асід5 Кев. 12 (1984) 871 1). Агробактеріальні трансформації таким вектором можуть бути використані відомим способом для трансформації рослин, таких як рослини, що використовували як моделі, такі, як арабидопсис (Агабідорзхіз ТНАГІАМА знаходиться в межах об'єму даного винаходу та не розглядається в якості культурних рослин) чи культурна рослин, наприклад, рослина тютюну, наприклад, шляхом занурення зім'ятого листя або подрібненого листя в агробактеріальний розчин, а потім культивуванням їх у підходящому середовищі.
Трансформації рослин за допомогою Адгобасіегіит їшпегасієп5 описані, наприклад, у Ноїдеп та
УМІтійгег іп Мисі. Асіа Кев5. (1988) 16, 9877 або відомі з Р.Р. М/пйе, Месіог5 Тог Сепе Тгапегег іп
Ніднег Ріапів; іп Тгтапздепіс Ріапів, Мої. 1, Епдіпеегіпд апа Шігайоп, ед5. 5.0. Кипд апа ВА. Ми,
Асадетіс Ргев5, 1993, рр. 15-38. В доповнення до трансформації соматичних клітин, які потім повинні бути регенеровані в цілі рослини, також можна перетворити клітини рослинної меристеми і, зокрема, ті клітини, які розвиваються з гамет. У цьому випадку трансформовані 60 гамети будуть слідувати природному розвиток рослин, що призведе до отримання трансгенних рослин. Так, наприклад, насіння Агарідорзіз обробляли агробактеріями і насіння, отримане з розвинутих рослин, з яких певна частина трансформується і, таким чином є трансгенною (ГЕеідтап, КА апа Маїк5 МО (1987). Мої Сеп Сепеї 208:274-289; Евідтапп К (1992). Іп: С Копсл,
М-Н Спца апа .) ЗНеїІ, єд5, Меїйоаз іп Агарідорзіз Везєагсі. М/ога бсіепійіс, 5іпдароге, рр. 274- 289). Альтернативні методи засновані на повторному видаленні суцвіть і інкубації місця видалення в центрі розетки з трансформованими агробактеріями, в результаті чого трансформоване насіння також може бути отримане в більш пізній момент часу (Спапд (1994).
Ріапі У. 5: 551-558; Каїаміс (1994). Мої Сеп Сепеї, 245: 363-370). Проте, особливо ефективним методом є метод вакуумної інфільтрації з його модифікацією, такою як "Пога! аїр" методом. У разі вакуумної інфільтрації Агабідорві5, інтактні рослини при зниженому тиску обробляли агробактеріальною суспензією (Веспїпоїа, М (1993). С К Асай 5сі Раїіз І їе сі, 316: 1194-1199), водночас з методом "Погаї аїр" розвивають квіткові тканини, витримуючи не довго у поверхнево- активних речовинах агробактеріальної суспензії |(СІоцой, 59 апа Вепі АЕ (1998) Те Ріапі .). 16, 735-743). Певну частку трансгенного насіння збирають у обох випадках та це насіння можна відрізнити за ростом у вищеописаних селективних умовах. Крім того, стабільна трансформація пластид є переважною, тому що пластиди, успадковані по материнській лінії, є найбільшим культурним зниженням або усуненням трансгену передачею через пилок. Трансформація генома хлоропластів, як правило, досягається способом, який був схематично зображений в
ІКІаиб5 та ін., 2004 Маїшге Віосїесппоїоду 22 (2), 225-229). Стисло щодо послідовностей, їх клонують разом з селективним маркерним геном між фланкуючими послідовностями гомологів у хлоропластах геному. Ці бічні послідовності гомологів головних ділянок специфічно інтегрують у пластоми. Пластидна трансформація була описана для багатьох різних видів рослин та наведено у |Воск (2001) Тгапздепіс ріавзіазв іп Бравіс гезеагсі апа ріапі ріотесппоіоду. У) Мої! Віо|. 2001 бер 21; 312 (3):425-38 ог Маїїда, Р (2003) Ргоагез5 Юулагаз соттегсіа|їгайоп ої ріавзіїй іапеіоптайоп есппоіоду. Ттепавз ВіоїеснпоЇї. 21, 20-28). Далі біотехнологічні досягнення повідомили нещодавно про форми трансформацій вільних пластид, які можуть бути отримані за допомогою перехідного маркерного гену |КіІаиз еї а!., 2004, Маиге ВіоїесппоЇоду 22(2), 225-223).
Генетично модифіковані рослинні клітини можна регенерувати за допомогою всіх методів, з якими спеціалісти знайомі. Відповідні способи можна знайти у вищезгаданій публікації 5.0. Кипа
Зо апа ЕК. Уми, РоїгукКи5 або Ноїдеп та Уміптй»ег.
Зазвичай після трансформації, рослинні клітини або клітинні групи вибирають по присутності одного або більше маркерів, які кодують ген рослинної експресії співтрансферно з геном інтересу, після чого перетворений матеріал регенерують в цілу рослину. Щоб вибрати трансформовані рослини, рослинний матеріал, отриманий в процесі трансформації, як правило, піддають селективним умовам так, що трансформовані рослини можна відрізнити від нетрансформованих рослин. Наприклад, насіння, отримане у вищеописаному способі, може бути висаджене і після початкового періоду зростання піддається відповідній селекції шляхом розпилення. Інша можливість полягає у вирощуванні насіння, при необхідності, після стерилізації, на чашках з агаром з використанням відповідного селективного агента, так що тільки трансформоване насіння може рости в рослинах. З іншого боку, трансформовані рослини піддають скринінгу на присутність селективного маркера, такого як ті, які описані вище.
Після перенесення ДНК і регенерації, імовірно, трансформовані рослини також можуть бути оцінено, наприклад, за допомогою Могіпегп або Уезіет аналізу, на присутність гена інтересу, число копій і/або геномну організацію. Альтернативно або додатково рівні експресії знову введеної ДНК можна контролювати за допомогою Могіпегп та/або У/езіегп аналізу, як методи добре відомі особам із звичайною кваліфікацією в даній області.
Згенеровані трансформовані рослини можна розмножувати за допомогою різних засобів, таких як клональне розмноження або класичними методами селекції. Наприклад, перше покоління (або Т1) трансформованої рослини може бути самозапиленим і гомозиготним, друге покоління (або Т2) трансформантів відібраних і Т2 рослини можуть потім бути додатково розмножені за допомогою класичних методів селекції. Згенерований трансформований організм може приймати різні форми. Наприклад, вони можуть бути химерами трансформованих клітин і нетрансформованих клітин; клональними трансформантами (наприклад, всі трансформовані клітини містили касету експресії), щепленням трансформованих і нетрансформованих тканин (наприклад, в рослинах, трансформованих щепленням кореневища до нетрансформованих пагонів).
Переважно, нуклеїнова кислота дикого типу або тш-РРО містить полінуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з: а) полінуклеотиду, як показано в ЗЕО ІЮ МО: 1,3,5,7,9,1 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, або 45, або його 60 варіант або похідне, б) полінуклеотиду, що кодує поліпептид, як показано в ЗЕО ІЮО МО: 2, 4, 6,
Зо
8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, або 46, або його варіант або похідне; в) полінуклеотиду, який містить щонайменше 60 послідовних нуклеотидів будь-якого з а) або б), г) полінуклеотиду, комплементарного полінуклеотиду за будь-яким з а)-в).
Переважно, експресія нуклеїнової кислоти в рослині призводить до підвищеної стійкості рослин до гербіцидного похідного бензоксазинону в порівнянні з диким типом різних рослин.
В іншому варіанті здійснення даний винахід відноситься до рослини, переважно від трансгенної рослини, що містить рослинні клітини, відповідно до даного винаходу, в яких експресія нуклеїнової кислоти в рослину призводить до підвищеної стійкості рослин до гербіцидного похідного бензоксазинону порівняно з диким типом різних рослин.
Рослини, описані тут, можуть бути або трансгенними культурними рослинами або нетрансгенними рослинами.
В данному винаході термін "трансгенний", "тгрансгени" або "рекомбінантний" означає, наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, експресуюча касета, генну конструкцію або вектор, що містить послідовність нуклеїнової кислоти або організм, що трансформований з послідовністю нуклеїнової кислоти, експресуючі касети або вектори відповідно до винаходу, всі ці побудови отримані рекомбінантними способами, в яких або (А) нуклеїнові кислоти кодують білки, що використані в способах за винаходом, або (Б) послідовність(ості) генетичного контролю функціонально пов'язані з послідовністю нуклеїнової кислоти згідно винаходу, наприклад, промотор, або (С)а) і 6) не перебувають у їх природному генетичному оточенні або були модифіковані за допомогою рекомбінантних способів, причому для модифікації приймали форму, наприклад, заміну, додавання, видалення, вставку або інверсію однієї або декількох нуклеотидних залишків.
Природне генетичне оточення розуміють як природні геномні або хромосомні локуси в оригінальній рослині або наявність в геномній бібліотеці. У разі геномної бібліотеки природне генетичне середовищ послідовності нуклеїнової кислоти переважно зберігається, принаймні, частково. Середовище фланків послідовності нуклеїнової кислоти, принаймні, на одній стороні і
Зо має довжину послідовності, рівну принаймні 50 пар основ, переважно щонайменше 500 пар основ, особливо переважно щонайменше 1000 пар основ, більш переважно принаймні 5000 пар основ. Природні експресійні касети, наприклад з природним поєднанням природного промотора з послідовності нуклеїнової кислоти з відповідною послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, використані в способах за даним винаходом, як визначено вище, стає трансгенною експресійною касетою, коли ця касета експресії модифікована неприродними, синтетичними ("штучними") методами, такими як, наприклад, обробка мутагеном. Відповідні способи описані, наприклад, в патенті 5 5565350 або УМО 00/15815.
Трансгенну рослину для цілей даного винаходу, треба розуміти в значенні так само, як вище, що нуклеїнові кислоти, які використовуються в способі за винаходом, є не в їх природному локусі в геномі зазначеної рослини, причому для нуклеїнових кислот експресія буде гомологічною або гетерологічною. Однак, як згадувалося, трансгенний також означає, що, в той час як нуклеїнові кислоти згідно винаходу використовувалися в способі винаходу або знаходяться в їх природному положенні в геномі рослини, послідовність була модифікована стосовно природної послідовності та/або регуляторної послідовності, природна послідовність була змінена. Під трансгенними переважно мають на увазі експресію нуклеїнових кислот, згідно винаходу, в неприродному локусі в геномі, тобто експресії нуклеїнових кислот відбувається гомологічно або, переважно, гетерологічно. Переважно трансгенні рослини згадуються в даному документі. Крім того, термін "трансгенний" відноситься до будь-яких рослин, рослинних клітин, калюсу, рослинної тканини або частини рослини, яка містить всі або частину щонайменше одного рекомбінантного полінуклеотиду. У багатьох випадках весь або частина рекомбінантного полінуклеотиду стабільно інтегровані в хромосому або стабільний позахромосомний елемент, так що вона передається у наступних поколіннях. Для цілей даного винаходу термін "рекомбінантний полінуклеотид" відноситься до полінуклеотиду, який був змінений, змінений або модифікований генною інженерією. Приклади включають будь-який клонований полінуклеотид або полінуклеотиди, які пов'язані або поєднані з гетерологичними послідовностями. Термін "рекомбінантний" не відноситься до змін полінуклеотидів, які є результатом природних подій, таких як спонтанні мутації або внаслідок неспонтанного мутагенезу подальшої селекції.
Рослини, що містять мутації, що виникають через неспонтанний мутагенез та селекцію 60 згадуються тут як нетрансгенні рослини і включені в даний винахід. У варіантах здійснення, де рослина є трансгенною і містить безліч тиш-РРО нуклеїнових кислот, нуклеїнові кислоти можуть бути отримані з різних геномів або з того ж генома. Крім того, у варіантах здійснення, де рослина є нетрансгенною і містить безліч тш-РРО нуклеїнових кислот, нуклеїнові кислоти, розташовані на різних геномах або на тому ж геномі.
Деякі варіанти здійснення даного винаходу включають стійкі до гербіциду рослини, які отримують мутаційною селекцією. Такі рослини включають полінуклеотид, що кодує тш-РРО і стійкі до одного або кількох "похідних бензоксазинону гербіцидів". Такі методи можуть включати в себе, наприклад, обробку рослин або насіння в мутагені, зокрема, хімічним мутагеном, таким як, наприклад, етилметансульфонат (ЕМ5) і селекція для рослин, які мають підвищену стійкість до принаймні одного або більше гербіцидного похідного бензоксазинону.
Однак даний винахід не обмежується рослинами, толерантними до гербіцидів, які отримують мутагенетичними способами, пов'язаними з хімічним мутагеном ЕМ5. Будь-який мутагенний спосіб, відомий в даній галузі технікию, може бути використаний для отримання стійких до гербіцидів рослин за даним винаходом. Такі методи мутагенезу може включати в себе, наприклад, використання будь-якого одного або більше з таких мутагенів: випромінювання, такого як рентгенівське випромінювання, гамма промені (наприклад, кобальт- 60 або цезій-137), нейтронів (наприклад, продукт ядерного розкладу на уран-235 в атомному реакторі), бета випромінювання (наприклад, випромінювання радіоізотопів, таких як фосфор 32 або вуглець 14) і ультрафіолетове випромінювання (переважно від 2500 до 2900 нм) і хімічних мутагенів, таких як основні аналоги (наприклад, 5-ром-урацил), споріднених сполук (наприклад, 8-етокси кофеїн), антибіотики (наприклад, стрептонігрин), алкілуючі агенти (наприклад, сірчастий іприт, азотистий іприт, епоксиди, етиленаміни, сульфати, сульфонати, сульфони, лактони), азид, гідроксиламін, азотиста кислота або акридин. Резистентні до гербіцидів рослини можуть бути також отримані за допомогою методів культури тканини, щоб вибрати рослинні клітини, що включають гербіцид-резистентні мутації, а потім регенерацію стійких до гербіцидів рослин також. Див., наприклад, патенти США Мо Мо 5773702 і 5859348, обидва з яких включені в даний опис у всій своїй повноті за допомогою посилання. Подальші подробиці мутаційної селекції можна знайти в "Ргіпсіраї5 ої Сийімаг Оемеюртепі" Рейг, 1993 Мастійап Рибіїєпіпод
Сотрапу, розкриття якого включено тут шляхом посилання.
В доповнення до визначеного вище, термін "рослина" призначений для позначення культурних рослин в будь стадії зрілості або розвитку, а також будь-яких тканин або органів (частин рослин), взяті або отримані з таких рослин, якщо інше не зазначено ясно в контексті.
Частини рослин включають, але не обмежуються ними, стебла, коріння, квіти, насіневий зародок, тичинки, листя, ембріони, меристематичні ділянки, калюсну тканину, пиляк культур, гаметофіти, спорофіти, пилок, мікроспори, протопласти, тощо.
Рослина з даним винаходом містить щонайменше одну тш-РРО нуклеїнову кислоту або нуклеїнову кислоту з підвищеною експресією дикого типу РРО, і підвищеною толерантністю до гербіцидного похідного бензоксазинону в порівнянні з сортом дикого типу рослин. Не виключені рослини згідно з даним винаходом, що мають декілька нуклеїнових кислот дикого типу або тиї-
РРО з різних геномів, так як ці рослини можуть містити більше одного геному. Наприклад, рослина містить два генома, зазвичай називають А і В геноми. Оскільки РРО є обов'язковим метаболічним ферментом, передбачається, що кожен геном має принаймні один ген, що кодує фермент РРО (тобто принаймні один ген РРО). Використаний тут термін "локу РРО гена" відноситься до положення гена РРО у геномі, а терміни "РРО ген" і "РРО нуклеїнова кислота" відноситься до нуклеїнової кислоти, що кодують фермент РРО. РРО нуклеїнові кислоти в кожному геномі відрізняються за нуклеотидною послідовністю нуклеїнових кислот РРО на іншому геномі. Фахівець у даній галузі може визначити геном походження кожної РРО нуклеїнової кислоти за допомогою генетичного кросингу і/або іншого способу секвенування або способом екзонуклеазного розщеплення, відомого фахівцям в даній галузі техніки.
БО Представлений винахід включає рослини, що містять один, два, три або більше тиш-РРО алелів, в якому рослина підвищеної толерантності до гербіцидного похідного бензоксазинону в порівнянні з сортом дикого типу рослин. тШш-РРО алелі можуть містити нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з полінуклеотиду, як це визначено в 5ЕО ІЮ МО: 1,3, 5, 7, 9, 1 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 або 45 ", або його варіант або похідне, полінуклеотид, що кодує поліпептид, як визначено в 5ЕО ІЮО МО: 2, 4,6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 або 46 ", або його варіант або похідне, гомолог, ортолог, Паролог, їх полінуклеотид містить щонайменше 60 послідовних нуклеотидів будь-якого з вищевказаних полінуклеотидів, і полінуклеотиду, комплементарного будь-якому з вищевказаних полінуклеотидів.
"Алелі" або "алельні варіанти" є альтернативні форми даного гена, розташованого в тому ж хромосомному положенні. Алельні варіанти охоплюють одиничні нуклеотидні поліморфізми (ЗМР), а також невеликі вставки/видалення поліморфізмів (вставок). Розмір вставок, як правило, менше 100 пар основ. 5МР та ІМОЕГ утворюють найбільший набір варіантів послідовностей в природних поліморфних штамах більшості організмів.
Термін "сорт" відноситься до групи рослин у межах одного виду, визначається загальним набором характеристик або ознак, прийнятих фахівцями в даній галузі як достатні, щоб відрізнити один сорт або різновид від іншого сорту або культурного сорту. Тут немає ані якого натяку на поняття, що всі рослини з будь-якого сорту або сорт буде генетично ідентичними або на весь ген або на молекулярному рівні або, що будь-яка дана рослина буде гомозиготною у всіх локусах. Культурним сортом або сортом вважається "дійсно розведеним" по конкретним ознакам, якщо при простому розведенні сорту або різновиді присутнє самозапилювання, все потомство містять ознаки. Терміни "лінії розведення" або "лінії" відносяться до групи рослин у межах сорту, що визначається обміном загальним набором характеристик або ознак, прийнятих фахівцями в даній галузі як достатні, щоб відрізнити одне лінійне розведення або лінії від іншого лінійного розведення або лінії. Там немає натяку в будь-якому висловлюванні, що всі рослини будь-якої даної розведеної лінії або лінії будуть генетично ідентичними або в повному гені або на молекулярному рівні, або що будь-яка дана рослина буде гомозиготною у всіх локусах. Лінійним розведенням або лінією вважається "істине розведення" за конкретною ознакою, якщо справжні лінії розведення або лінії розведення самозапилюються і все потомство містить ознаку. У цьому винаході ознака виникає в результаті мутації в гені РРО рослини або насіння.
Стійкі до гербіцидів рослини за винаходом, які містять полінуклеотиди, що кодують ти-РРО поліпептиди, також знайдуть застосування у способах підвищення опору рослин до гербіцидів шляхом традиційної селекції рослин за участю статевого розмноження. Способи включають схрещування першої рослини, яка є стійкою до гербіцидів рослиною даного винаходу з другою рослиною, яка може або не може бути стійкою до того ж гербіциду або гербіцидів, як перша рослина, або може бути стійкою до іншого гербіциду або гербіцидів, ніж перша рослина. Друга рослина може бути будь-якою рослиною, яка здатна продукувати життєздатні рослини
Зо (наприклад, насіння) при схрещуванні з першою рослиною. Зазвичай, але не обов'язково, перша і друга рослини є того ж виду. Методи можуть додатково включати в себе вибір потомства рослин, які містять тШш-РРО поліпептиди першої рослини і гербіцидно-стійкі характеристики другої рослини. Потомство рослин, отримане таким способом за даним винаходом мають підвищену стійкість до гербіциду порівняно з першою або другою рослиною або обох. Коли перша і друга рослини стійкі до різних гербіцидів, то потомство рослин матиме комбіновані гербіцидні характеристики першої та другої рослин. Способи за винаходом можуть додатково включати одне або декілька поколінь зворотного схрещування потомств рослин першого поперечного з рослинами тієї ж лінії або генотипу, як перша або друга рослини. З іншого боку, потомство першого зхрещування або будь-якого наступного зхрещувань можуть бути зхрещені з третьою рослиною, яка має іншу лінії або генотип, ніж перша або друга рослини. Даний винахід також відноситься до рослин, рослинних органів, рослинних тканин, рослинних клітин, насіння і нелюдських клітин-хазяїна, які перетворюються щонайменше одним полінуклеотидом молекули експресійної касети або вектором трансформації за винаходом. Такі трансформовані рослини, рослинні органи, рослинні тканини, рослинні клітини, насіння і нелюдські клітини-хазяїна підвищили толерантність або стійкість до принаймні одного гербіциду на рівні гербіциду, який вбиває або інгібує ріст нетрансформованих рослин, рослинної тканини, рослинної клітини або нелюдської клітини-хазяїна, відповідно. Переважно, трансформованими рослинами, рослинними тканинами, рослинними клітинами і насінням, згідно винаходу, є
Агарідорбзів ІПаїїапа і культурні рослини.
Слід мати на увазі, що рослина за даним винаходом може містити нуклеїнову кислоти РРО дикого типу додатково до тш-РРО нуклеїнової кислоти. Передбачається, що лінії, толерантні до гербіцидних похідних бензоксазинону можуть містити мутацію тільки в одному з декількох ізоферментів РРО. Таким чином, даний винахід включає в себе рослину, що містить одну або більше ти-РРО нуклеїнових кислот, додатково до однієї або більше нуклеїнових кислот дикого типу РРО.
В іншому варіанті здійснення даний винахід відноситься до рослинного насіння трансгенних рослин, що містить рослинні клітини за даним винаходом, у якому насіння підходить для розмноження з підвищеною стійкістю до похідної бензоксазинону гербіциду в порівнянні з диким типом іншого насіння.
В іншому варіанті здійснення даний винахід стосується способу одержання трансгенної рослинної клітини з підвищеною стійкістю до гербіцидного похідного бензоксазинону в порівнянні з диким типом іншої рослинної клітини, що включає трансформації рослинної клітини з касетою експресії, яка містить тиЇ-РРО нуклеїнової кислоти.
В іншому варіанті здійснення даний винахід стосується способу одержання трансгенної рослини, що включає в себе: (а) трансформацію рослинної клітини з касетою експресії, яка містить тиш-РРО нуклеїнову кислоту, і (б) отримання рослин з підвищеною стійкістю до гербіцидного похідного бензоксазинону з рослинної клітини.
Отже, тиш-РРО нуклеїнові кислоти за винаходом впроваджені в експресійні касети для експресії в рослині за інтересом. Касета буде включати регуляторні послідовності оперативно пов'язані з тШш-РРО послідовністю нуклеїнової кислоти згідно з винаходом. Термін "регуляторний елемент", що використано тут, відноситься до полінуклеотиду, який здатний регулювати транскрипцію функціонально пов'язаного полінуклеотиду. Він включає, але не обмежується цим, промотори, енхансери, інтрони, 5 ТЕ, та 3 ШОТЕ. Під "функціонально пов'язаним" розуміють функціональний зв'язок між промотором і другою послідовністю, де послідовність промотору ініціює та опосередковує транскрипцію ДНК-послідовності відповідно другій послідовності. Як правило, функціонально пов'язаний означає, що послідовності нуклеїнових кислот пов'язані з суміжними, де необхідно з'єднати дві білка кодуючі області суміжних і в тих же межах зчитування. Касета може додатково містити щонайменше один додатковий ген бути котрансформований в організм. Крім того, додатковий ген(и) може бути впровадженим на кілька експресійних касет. Така експресійна касета забезпечена множиною сайтів рестрикції для вставки тиш-РРО послідовності нуклеїнової кислоти, що знаходиться під транскрипційним контролем регуляторних областей. Касета експресії може додатково містити селективні маркерні гени.
Касета експресії буде включати в 5-3 направляючі транскрипції, транскрипції і трансляції ініціювання регіонів (тобто промотор), ти-РРО послідовність нуклеїнової кислоти за винаходом, а також транскрипції і трансляції областей термінації (тобто область термінації), що функціонує в рослинах. Промотор може бути природнім або аналогом, або чужерідним або гетерологічним до рослини-хазяїна і/або тш-РРО послідовністю нуклеїнової кислоти за винаходом. Крім того,
Зо промотор може бути природної послідовності або, альтернативним, синтезованої послідовності.
Де промотор є "чужорідним" або "гетерологічним" до рослини-хазяїна, передбачається, що промотор не знайдений в рідній рослині, в яку вводять промотор. Якщо промотор є "чужорідним" або "гетерологічним" до тиш-РРО послідовності нуклеїнової кислоти за винаходом, передбачається, що промотор не є нативним або природним промотором для функціонально зв'язаної тш-РРО послідовності нуклеїнової кислоти за винаходом. Як використовується тут, химерний ген містить послідовність, що кодує, функціонально пов'язану з областю ініціації транскрипції, що є гетерологичною до кодуючої послідовності.
Хоча для експресії тш-РРО нуклеїнових кислот за винаходом може бути кращим використати гетерологічний промотор, нативниийй промотор послідовності можна бути також використовувати. Такі конструкції призводять до зміни рівнів експресії тш-РРО білка в рослинній клітині рослини або рослині. Таким чином, фенотип рослинної клітини або рослини змінюється.
Термінальна область може бути нативної з регіон ініціації транскрипції, може бути нативної з функціонально пов'язаної тш-РРО послідовності інтересу, може бути нативної з рослини- хазяїна, або може бути отримана з іншого джерела (наприклад, зовнішньо або гетерологічним промотором, тшиЇ-РРО послідовності нуклеїнової кислоти інтересу, рослини-хазяїна, або будь- якої їх комбінації). Близький термінальний регіон доступні з Ті-плазміди їшптегасієп5 А., такі як термінальні регіони октопінсинтази і нопалінсинтази. Див. також Спцегіпеаи та ін. (1991) Мої.
Сеп. Сепеї. 262: 141-144; Ргоцагоої (1991) СеїІ 64:671-674; Запіасоп та ін. (1991) Сепез5 Оем. 5: 141-149; Модеп та ін. (1990) Ріапі Сеї| 2: 1261-1272; Мипгое та ін. (1990) Сепе 91: 151-158; ВаПав та ін. (1989) Мисіевїс Асід5 Ке5. 17:7891-7903; апа дозі та ін. (1987) Мисієвїс Асій Ке5. 15:9627- 9639. У разі необхідності, ген(и) можуть бути оптимізовані для підвищеної експресії у трансформованій рослині. Це означає, що гени можуть бути синтезовані з використанням переважно рослинних кодонів для поліпшення експресії. Див. як приклади Сатррбеї!Ї апа Сомлті (1990) Ріапі Рпузвіої. 92: 1-1 1 тог а дізсиввіоп ої позі-ргетегтей содоп изаде. Методи є доступними в цій галузі для синтезу переважно рослинних генів. Див. для прикладу Ш.5. Раїепі Мо5. 5,380,831, і 5,436,391, та Митау та ін. (1989) Мисіеіс Асід5 Ке5. 17:477-498, що включені як посилання.
Додаткові модифікації послідовності є відомими для підсилення експресії гена в клітини- 60 хазяїна. Вони включають елімінацію послідовності, що кодує побічні сигнали поліаденілювання,
екзон-інтронів сигнали сплайсингу, транспозон-подібні повтори, та інші подібні добре відомі послідовності, які можуть бути шкідливими для експресії генів. -С зміст послідовності може бути відрегульованим до рівня середнього для даної клітини-хазяїна, шляхом розрахунку посилення на відомий ген, що експресуються в клітині-хазяїна. Коли це можливо, послідовність модифікують, щоб уникнути пророкувань петлі вторинної структури мРНК. Нуклеотидні послідовності для посилення експресії гена можуть бути також використані у векторах експресії в рослині. До них відносяться інтрони кукурудзи лані, іпігопі гена |Сай5 еї а). Сепе5 апа
ОемеІортепі 1: 1 183-1200, 1987), та лідерна послідовність, (М/- послідовність) у вірусі мозаїки табаку (ТММ), у вірусі хлоротичних зерен кукурудзи та вірус альфа-мозаїки ІСаїйе еї аїІ. Мисієїс
Асій Нев. 15:8693-8711, 1987 і 5Кигезкі еї а. Ріапі Мої. Віої. 15:65-79, 1990). Перший інтрон зі зморщеного-1 локусу кукурудзи було показано для збільшення експресії генів у химерних генних конструктах. 0.5. Раї. Мо5. 5,424,412 та 5,593,874 розкриває використання конкретних інтронів в конструкції експресії генів, та Саїе еї аї. (Ріапі Рпузіоі!. 106:929-939, 1994) Також було показано, що інтрони можуть бути використані для регуляції експресії генів у тканинних специфічних основах. Для подальшого підвищення або оптимізації тш-РРО експресії генів, рослинний вектор експресії згідно винаходу може також містити послідовності ДНК, що містить матрицю кріплення областей (Марс). Рослинні клітини, трансформовані такими змінами системи експресії, таким чином, можуть володіти надлишковою експресією або констутивною експресією нуклеотидної послідовності за винаходом.
Касети експресії можуть додатково містити 5' лідерні послідовності в конструкції експресійної касети. Такі лідерні послідовності можуть діяти, посилюючи трансляцію.
Трансляція лідерів відома в даній галузі і включають в себе: лідери пикорнавирусів, наприклад,
ЕМСМ лідер (енцефаломіокардит 5' некодуючий регіон) (ЕІгоу-51вїп еї аї. (1989) Ргос. Маї)!. Асад.
ЗсІ БА 86:6126-6130); противірусний лідер, як приклад, ТЕМ лідер (Тобассо Еїсп Міги5) (саїйе еї аІ. (1995) Сепе 165(2):233-238), МОММУ лідер (Маїге Омагї Мозаїс Міги5) (Мігоїюду 154:9-20), та білок, зв'язуючий важкі ланцюги людського імуноглобуліну (ВіР) (Масе)іак еї аї. (1991) Маїшиге 353:90-94); нетрансльований лідер з мРНК білка оболонки вірусу мозаїки люцерни (АММ ЕКМА 4) (Чобріїпоу еї аї. (1987) Майшиге 325:622-625); лідер вірусу мозаїки табаку (ТММ) (Саїіе еї аї. (1989) іп
Моїіесшіаг Віоіоду ої ВМА, єйд. Сесй (г ів5, Мем Могк), рр. 237-256); та лідер вірусу хлоротичної
Зо плямистості кукурудзи (МСМУМ) (Готтеї еї а. (1991) Мігоюду 81:382-385). Див. також ЮеПа-
Сіорра еї аї. (1987) Ріапі Ріузіої. 84:965-968. Інші способи, відомі для посилення трансляції, також можуть бути використані, наприклад, інтрони, тощо.
При підготовці касети експресії різними фрагментами ДНК можна маніпулювати таким чином, щоб забезпечити послідовності ДНК в правильній орієнтації і, при необхідності, в правильній рамці зчитування. З цією метою адаптери або лінкери можуть бути використані, щоб приєднатися до фрагменту ДНК або інші маніпуляції можуть бути залучені для забезпечення зручної рестрикції сайтів, видалення надлишкової ДНК, видалення сайтів рестрикції, або тому подібне. З цією метою можуть бути залучені мутагенез іп мійго, праймерна репарація, рестрикція, повторна підстановка, наприклад, транссайтинг і трансверсія.
Множина використаних промоторів може бути в практиці даного винаходу. Промотори можуть бути обрані на основі бажаного результату. Нуклеїнові кислоти можуть бути об'єднані з конститутивними, переважно тканинними або іншими промоторами для експресії в рослинах.
Такі конститутивні промотори включають, наприклад, основний промотор К5зуп7, промотор та інші конститутивні промотори, описані в УМО 99/43838 та Ш.5. Раїепі Мо. 6,072,050; основний
Самм 355 промотор (Оавеї та ін. (1985) Маїйге 313:810-812); актин рису (МеЕїгоу еї аї. (1990)
Ріапі Сеї! 2: 163-171); убіквітин (Спгістепзеп еї а. (1989) Ріапі Мої. Віо!. 12:619-632 та Спгібїіепзеп та ін. (1992) РіІапі Мої. ВіоїЇ. 18:675-689); РЕМИ (І аві вї аї. (1991) Тнеєог. Аррі. Сепеї. 81:581-588);
МА5 (Мейеп еї аї. (1984) ЕМВО 3. 3:2723-2730); АІЇ 5 промотор (0.5. Раїепі Мо. 5,659,026), та подібні. Інші конститутивні промотори включають, наприклад, Ш.5. Раїепі Мо5. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; і 6,177,61 1.
Переважно тканинні промотори можуть бути використані для цільової розширеної ти-РРО експресії в конкретній рослинній тканині. Такі переважно тканинні промотори включають, але не обмежуються ними, промотори переважно листя, промотори переважно кореню, промотори переважно насіння і промотори переважно стовбуру. Промотори переважно листя включають УМататойю еї а). (1997) Ріапі 9. 12(2):255-265; Кажатага еї а!. (1997) Ріапі СеїІ Рпузіо!. 38(7):792- 803; Напзеп та ін. (1997) Мої. Сеп Сепеї. 254(3):337-343; ВНив5еї! єї аї. (1997) Ттапздепіс Нев. б(2): 157-168; Віпепан еї аї. (1996) Ріапі РНувзіої. 1 12(3): 1331-1341; Мап Сатр еї аї. (1996) Ріапі
РНузіої!. 1 12(2):525-535; Сапемавсіпі єї а). (1996) Ріапі Рнузіо!. 1 12(2):513-524; Мататоїйо вї аї. (1994) Ріапі Сеї! Рнпузіої. 35(5):773-778; І ат (1994) Везиїйїв Ргобі. Сеї! Оїйнег. 20: 181-196; Ого7со 60 еї а). (1993) Ріапі Мої! Віої. 23(6): 1129-1 138; Маїзвцока є! Г(аІрнау/. (1993) Ргос Ма). Асад. 5сі. ОБА
90(20):9586-9590; апа Сцемага-Сагсіа єї аї. (1993) Ріапі 9. 4(3):495-505. Такі промотори можуть бути модифіковані, якщо це необхідно, слабкою експресією. В одному варіанті здійснення нуклеїнові кислоти інтересу орієнтовані в хлоропласти для експресії. Таким чином, нуклеїнової кислоти інтересу безпосередньо не вставлені в хлоропласт, експресійна касета додатково містить послідовність хлоропласт-мішені, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує транзитний пептид хлоропласта, щоб направити продукт гену інтересу в хлоропласти. Такі транзитні пептиди відомі в даній галузі Що стосується послідовність хлоропласт-мішені "функціонально пов'язаний" означає, що послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує транзитний пептид (тобто послідовність хлоропласт-мішені), пов'язаний з ти-РРО нуклеїнової кислоти за винаходом, так що дві послідовності є суміжними і в тій же рамці зчитування. Див., наприклад, Моп Неї)пе еї аїЇ. (1991) Ріапі Мої. ВіоІ. Кер. 9: 104-126; Сіаїк еї аї. (1989) 9. Віо!.
Спет. 264:17544-17550; РеПа-Сіорра еї аї. (1987) Ріапі Рнузіо!. 84:965-968; ВКотег єї аї!. (1993)
Віоспет. Віорпуб. Ве5. Соттип. 196:1414-1421; апа бНнапй еї аї. (1986) Зсієпсе 233:478-481.
Незважаючи на це, тш-РРО білки за винаходом включають нативний транзитний пептид хлоропласту, будь-якого транзитного пептиду хлоропласта, відомого в даній області, можуть бути злиті з амінокислотною послідовністю зрілого тш-РРО протеїну за винаходом шляхом функціонального зв'язування послідовності хлоропласт-мішені з 5-кінцем нуклеотидної послідовності, що кодує зрілий тш-РРО протеїн за винаходом. Хлоропласт послідовності відомі в даній галузі і включають хлоропласт малої субодиниці рибулозо-л, 5-бісфосфаткарбоксілазу (Вибізсо) (де Сазіго 5іма РІЇнНоО еї а!. (1996) Ріапі Мо!. Віо!. 30:769-780; 5сНпеї! еї аї. (1991) 9. Віої.
Спет. 266(5):3335-3342); 5-(енолпірувіл) шікімат-З-фосфат-синтаз (ЕРБР5) (Агопег еї аї. (1990)
У. Віоепего. Віотетрь. 22(6):789-810); триптофансинтетазу (2пао еї а!. (1995) 9. Вісі. Спет. 270(1 1):6081-6087); пластоцианін (І амтепсе еї аїЇ. (1997) 9. Віої Спет. 272(33):20357-20363); хорисматсинтетазу (Зсптійї ей а». (1993) У. Віої Спет. 268(36):27447-27457); та світлозбираючий хлорофіл а/р зв'язуючий білок (І НВР) (І атрра еї аї. (1988) 9. ВіоЇ. Спет. 263: 14996-14999). Також див. Моп Неїпе еї аї. (1991) Ріапі Мої. Віої. Кер. 9: 104-126; СіаїК еї аї. (1989) 9. Віої. Спет. 264:17544-17550; ЮеїМПа-Сіорра еї а!. (1987) Ріапі РНузіо!ї. 84:965-968; Воте"г еї аі. (1993) Віоспет. Віорпуб5. НКез. боттип. 196: 1414-1421; апа 5Нан еї аї. (1986) бсієпсе 233:478-481.
Зо Методи трансформації хлоропластів є відомими в даній галузі. Див., наприклад, 5маб еї аї. (1990) Ргос. Маї!. Асад. 5сІ ОБА 87:8526-8530; 5маб апа Маїїда (1993) Ргос. Маї). Асад. бсі. ОБА 90:913-917; 5маб апа Маїїда (1993) ЕМВО 3. 12:601-606. Метод заснований на пушці доставки частинок ДНК, що містить селективний маркер і орієнтує ДНК в геном пластиди шляхом гомологічної рекомбінації. Крім того, трансформація пластид може бути досягнута шляхом трансактивації трансгену легких пластид переважно тканинної експресії ядерно кодованих і пластид спрямованих РНК-полімеразою. Така система розкривалася в МеВгіде еї а!. (1994) Ргос.
Май. Асад. сі. ОБА 91:7301-7305. Нуклеїнові кислоти інтересу злиті з хлоропласти можуть бути оптимізовані для експресії в хлоропластах для обліку відмінностей у використанні кодонів між ядром рослини і цієї органели. Таким чином, нуклеїнові кислоти інтересу можуть бути синтезовані з використанням хлоропласт-переважних кодонів. Див., наприклад, патент США Мо 5380831, який включений сюди шляхом посилання.
У переважному варіанті здійснення тши-РРО нуклеїнові кислоти складають полінуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з: а) полінуклеотиду, як показано в ЗЕО ІЮ МО: 1,3, 5,7, 9,1 1, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, або 45, або його варіант або похідне, б) полінуклеотиду, що кодує поліпептид, як показано в 5ЕО ІО МО: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, або 46, або варіант або похідне; в) полінуклеотид, містить щонайменше 60 послідовних нуклеотидів будь-якого з а), в) і с) полінуклеотиду, комплементарного полінуклеотиду будь-якого з а)-с).
Переважно касета експресії додатково містить ініціації транскрипції регуляторної області та ініціації трансляції регуляторної області, які є функціональними в рослині. У той час як полінуклеотиди за винаходом знаходять застосування в якості селективних маркерних генів для трансформації рослин, експресуючі касети згідно винаходу можуть включати в себе інший ген селективного маркера для відбору трансформованих клітин. Селективні маркерні гени, в тому числі за даним винаходом, використовують для відбору трансформованих клітин або тканин.
Гени-маркери включають, але не обмежуються ними, гени, що кодують стійкість до антибіотика, такі як гени, що кодують неоміцинфосфотрансферази І! (МЕС) і гігроміцинфосфотрансферазу (НРТ), а також гени, що надають стійкість до гербіцидних сполук, таких як гліфоцинат амоній, бромоксініл, імідазолінони і 2,4-дихлорофеноксиацетат (2,4-О0). Див. в цілому, Маггтапоп (1992)
Ситт. Оріп. Віотесн. 3:506-51 1; Спгівїорнегв оп еї а! (1992) Ргос. Маї!. Асад. 5сі О5БА 89:6314- 60 6318; Мао еї аї. (1992) Сеї! 71:63-72; Вегпікоїї (1992) Мої Містобвіо! 6:2419-2422; Вагкієу єї аї
(1980) іп Тне Орегоп, рр. 177-220; Ни єї а! (1987) СеїІ 48:555-566; Вгом/п єї а! (1987) Сеї! 49:603- 612; Рідде єї а! (1988) Сеї! 52:713-722; ЮОеизспіе еї а! (1989) Ргос. Маї! Асад. Асі ОА 86:5400- 5404; Рцетві єї а! (1989) Ргос. Маї! Асад. 5сі ОБА 86:2549-2553; ЮОеизспіе еї а! (1990) 5сівепсе 248:480-483; Сбовззеп (1993) РИ.О. Тневів, Опімегейу ої НеїдеІрега; Веїпез еї а! (1993) Ргос. Маї!
Асай. 5сІ ОА 90: 1917-1921; І ароуу єї а! (1990) Мо! Сеї! Віо! 10:3343-3356; 7атогейі еї а! (1992)
Ргос. Маї! Асад. 5сІ ОСОБА 89:3952-3956; Ваїпт єї а! (1991) Ргос. Маї! Асад. 5сі ОА 88:5072-5076; муурог»кі еї а! (1991) Мисівїс Асіад5 Нев. 19:4647-4653; НіПепапа-м/ізвтап (1989) Торісв Мої 5ігис.
Віо! 10: 143-162; Оедепкоїь еї а! (1991) Апіїтістор. Адепів СпетоїНег. 35: 1591-1595; КІвіп5сНпіаї еї а! (1988) Віоспетівму 27: 1094-1 104; Вопіп (1993) РИ.О. Тевібв, Опімегейу ої Неїдеїрего;
Со55еп еї а! (1992) Ргос. Маї! Асад. 5сі ОА 89:5547-5551; Оіїїма єї а! (1992) Апіїтістор. Адепів
СпетоїНег. 36:913-919; НіахжкКа єї а! (1985) Напароок ої Ехрегітепіа! Рпаптасоіоду, Мої. 78 (5ргіпдег-Мепад, Вепіп); СіЇЇ еї а! (1988) Майте 334:721-724. Таке розкриття включено в даний опис за допомогою посилання. Наведений вище список обраних маркерних генів не призначений для обмеження. Будь які селективні маркерні гени можуть бути використані в даному винаході.
Крім того, винахід відноситься до виділеного рекомбінантного вектора експресії, що містить експресійну касету з тишШ-РРО нуклеїновою кислотою, як описано вище, в якому експресія вектора в клітину-хазяїна призводить до підвищеної толерантності до гербіцидного похідного бензоксазинону в порівнянні з диким типом інших з клітини-хазяїна. Використаний тут термін "вектор" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, здатної транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона пов'язана. Одним типом вектора є "плазміда", яка відноситься до кільцевої дволанцюгової ДНК петлі, в якій додаткові сегменти ДНК можуть бути лігіровані. ІншИМ типом вектора є вірусний вектор, в якому додаткові сегменти ДНК можуть бути лігіровані в вірусний геном. Деякі вектори здатні до автономної реплікації в клітині-хазяїна, в яку вони введені (наприклад, бактеріальні вектори, що мають бактеріальний сайт ініціації реплікації і епісомні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неепісомні вектори ссавців) інтегрують в геном клітини-хазяїна при введенні в клітину-хазяїна, і тим самим реплікуються разом з геномом хазяїна. Крім того, деякі вектори здатні направляти експресію генів, з якими вони функціонально пов'язані. Такі вектори називають тут "експресуючі вектори". У цілому, експресуючі вектори,
Зо використовувані в технології рекомбінантної ДНК, є часто у формі плазмід. У даному описі терміни "плазміда" і "вектор" можуть бути використані взаємозамінно, оскільки плазміда є формою вектора, що найбільш широко застосовується. Тим не менш, винахід включає інші форми експресуючих векторів, такі як вірусні вектори (наприклад, дефектні по реплікації ретровіруси, аденовіруси та аденоасоційовані віруси), які виконують еквівалентні функції.
Рекомбінантні вектори експресії за винаходом містять нуклеїнову кислоту згідно винаходу у формі, придатній для експресії нуклеїнової кислоти в клітині-хазяїна, яка означає, що рекомбінантні експресуючі вектори включають один або більше регуляторних послідовностей, обраних на основі клітини-хазяїна, які будуть використовуватися для експресії, яка функціонально пов'язана з послідовністю нуклеїнової кислоти, що експресується. Регуляторні послідовності включають ті, які керують констутивною експресією нуклеотидної послідовності в багатьох типах клітин-хазяїна і ті, які керують експресією нуклеотидної послідовності тільки в певних клітинах-хазяїна або за певних умов. Буде очевидно фахівцям в даній галузі техніки, що конструкція експресуючого вектора може залежати від таких факторів, як вибір клітини-хазяїна для трансформації, рівень експресії бажаного поліпептиду і т. д. Вектори експресії винаходу можуть бути введені в клітину-хазяїна для отримання таким чином поліпептида або пептиду, в тому числі злитого поліпептида або пептиду, який кодується нуклеїновими кислотами, як описано вище (наприклад, тш-РРО поліпептиди, злиті поліпептиди і т. д.).
У переважному варіанті здійснення даного винаходу тш-РРО поліпептиди експресуються у рослин і рослинних клітинах, таких як клітини одноклітинних рослин (наприклад, водорості) (Див. Раїсіасге еї а!., 1999, Магіпе Віоїесппоіоду 1 (3):239-251 і посилання в ньому) і рослинні клітини вищих рослин (наприклад, насіннєвих, таких як хлібні злаки). тиш-РРО полінуклеотид може бути "введений" в рослинну клітину за допомогою будь-яких засобів, у тому числі трансфекції, трансформації або трансдукції, електропорації, бомбардуванням частинками, агроінфікуванням, біолістики, тощо.
Придатні методи трансформації або трансфекції клітин-хазяїна, у тому числі клітини рослин можна знайти в затьгоокК та ін. (МоІесшаг Сіопіпд: А Гарогаїгу Мапиаї. 2па, еа., Соїа Бргіпд
Нарог І абогаюгу, Соїд ріпа Натог І абогаюгу Ргев5, Соїд 5ргіпа Наїбог, МУ, 1989) апа оїнег
Іарогаїюгу тапиа!5 зисп аз Меїйос5 іп МоїІесшіаг Віоіоду, 1995, Мої. 44, Адго-басієгішт ргоїосо!в, еа: Сапшапа апа Рамеу, Нитапа Ргев5, Тоїоула, Мем Уегзеу. Оскільки підвищена толерантність 60 до гербіциду, що є похідним бензоксазинону, є спільною рисою, яку було б бажано успадкувати в найрізноманітніших рослинах, таких як кукурудза, пшениця, жито, овес, тритікале, рис, ячмінь, соєві боби, арахіс, бавовна, ріпак і канола, маніока, перець, соняшник та чорнобривці, пасльонові рослини, такі як картопля, тютюн, баклажани та помідори, Місіа 5ресіе5, горох, люцерна, чагарникові рослини (кава, какао, чай), заїїх 5ресіе5, дерева (пальма олійна, кокосова), багаторічні трави, і кормові культури, сільськогосподарські рослини. Ці сільськогосподарські рослини також є рослинами-мішенями для генної інженерії в якості ще одного варіанту здійснення даного винаходу. У переважному варіанті здійснення винаходу рослина є культурною рослиною. Кормові культури включають, але не обмежують, УУпеащдгав5,
Сапагудгав5, Вготедгав5, М/Ідгує Ставзв, Вінедгаз5, Огспагадгавзвз, АГаїга, Заоїп, Вігав5-тоої ТгеєпоїЇ,
АїБіКке Сіомег, Вей Сіомег, апа Змевї Сіомег.
В одному з варіантів здійснення даного винаходу трансфекції тш-РРО полінуклеотиду в рослину досягаються за рахунок Адгорасіегіпт-опосередкованого перенесення гена. Один метод трансформації відомий фахівцям в даній галузі техніки є занурення рослини в розчин агробактерій, в якому агробактерій містить тш-РРО нуклеїнові кислоти, з подальшим розведенням перетворених гамет. Опосередковані Адгорасіегішт трансформації рослин можна виконати за допомогою, наприклад, ЗМУ3101 (рМРОО) (Копс апа зеспеїІ, 1986, Мої. Сеп. сепеї. 204:383-396) ог | ВА4404 (СІопіесп) штаму Адгобасіегішт Іштеїасіеп5. Трансформації можуть бути виконані стандартними трансформаціями та регенераційними способами (Оебіаєге еї аї., 1994, Мисі. Асіав. Нев. 13:4777-4788; Семіп, тапюп В. апа 5спіїрегоогї, НКобет А, Ріапі МоіІесціаг
Віоїоду Мапиаї, 2па Еа. - Оогагеспї: Кіпмег Асадетіс Рибрі., 1995. - іп Зесі., Віпдарис 7епіга|є зЗідпайш: ВТ 1-Р ІБВМ 0-7923-2731-4; СіїсК, Вегтага В. апа Тпотрзоп, Чдонп Е., Меїнодвз іп Ріапі
Моїіесшіаг Віоіоду апа Віоїесппоіоду, Воса Найоп: САС Ргезв, 1993 360 5., ІЗВМ 0-8493-5164-2).
Наприклад, рапсове насіння може бути перетворене за допомогою перетворення сім'ядолі або гіпокотилю (Моіопеу еї аї!., 1989, Ріапі Сеї! Керог 8:238-242; Ое Віоск еї аї., 1989, Ріапі Рпузвіо1. 91:694-701). Використання антибіотиків для Адгобасіегішт та селекції рослин залежить від бінарного вектора і штаму Адгобасіегішт, що використовували для трансформації. Ріпакова селекція, як правило, здійснюється з використанням канаміцину як селективного маркера рослини. Опосередковане Адгобасіегішт перенесення гену льону може бути здійснено з використанням, наприклад, методики, описаної Міупагома еї аї., 1994, Ріапі Сеї! Керогі 13:282-
Зо 285. Крім того, перетворення сої можна проводити з використанням, наприклад, способу, описаного в Європейському патенті Мо. 0424 047, 0.5. Раїепі Мо. 5,322,783, Епореап Раїепі Мо. 0397 687, О.5. Рагепі Мо. 5,376,543, ог 0.5. Раїепі Мо. 5,169,770. Трансформація кукурудзи може бути досягнута шляхом бомбардування частинками, поліетиленгліколь опосередкованим поглинанням ДНК, або методом з використанням волокна карбіду кремнію. (Див., наприклад,
Егееїїпд апа Уаїрої "Тне таїг2е напароок" Зргіпдег Мепад: Мем Моїк (1993) ІБВМ 3-540-97826-7).
Конкретний приклад трансформації кукурудзи міститься в Ш.5. Раїепі Мо. 5,990,387, і конкретний приклад трансформації пшениці можна знайти в заявці РСТ Мо УМО 93/07256.
Відповідно до даного винаходу введені тш-РРО полінуклеотиди можуть бути збережені в рослинної клітини стабільно, якщо вони включені в нехромосомальний автономний реплікон або інтегровані в хромосоми рослин. Крім того, введені тш-РРО полінуклеотид можуть бути присутніми на позахромосомних нереплікованих векторах і бути тимчасово експресованими або тимчасово активними. В одному варіанті здійснення може бути створений гомологічний рекомбінантний мікроорганізм, в якому тШш-РРО полінуклеотид інтегрований в хромосому, отримують вектор, який містить щонайменше частину гена РРО, в якому видалення, додавання або заміна була введена, щоб тим самим змінювати, наприклад, функціонального порушити, ендогенний ген РРО та створити тш-РРО гена. Щоб створити точку мутації за допомогою гомологічної рекомбінації ДНК-РНК, гібриди можуть бути використані в технології, відомої як спітегаріавіу (Соїе-5ігацивв евї аї., 1999, Мисівїс Асіаз Везеагсй 27(5):1323-1330 апа Ктієс, 1999,
Сепе Шегару Атеїгісап Зсієпіївї 87(3) 240-247). Інші процедури гомологічної рекомбінації виду
Тійісут також добре відомі в даній галузі техніки і розглядаються для використання в даному винаході.
У векторі гомологічної рекомбінації тш-РРО ген може бути замкнутий на своїх 5' і 3' кінцях додаткової молекули нуклеїнової кислоти гена РРО для забезпечення гомологічної рекомбінації між екзогенним тш-РРО геном, що несе вектор і ендогенним геном РРО в мікроорганізмі або рослині. Додаткова фланкуюча РРО молекула нуклеїнової кислоти має достатню довжину для успішної гомологічної рекомбінації з ендогенним геном. Як правило, кілька сотень пар основ до тисяч пар нуклеотидів фланкуючої ДНК (як на 5'-і 3'-кінців) включені у вектор (див., наприклад.,
Тпотах, К.А., апа Сарес-сні, М.В., 1987, Се 51:503 для опису векторів для гомологічної рекомбінації або 5ігерр еї аї., 1998, РМА5, 95(8):4368-4373 для кКДНК на основі рекомбінації в 60 патенті РпузсоптійїгеїМа). Однак, так як тиш-РРО ген зазвичай відрізняється від гена РРО всього декілька амінокислот, фланкуючі послідовності не завжди необхідні. Вектор гомологічної рекомбінації вводять в мікроорганізм або рослинну клітину (наприклад, через поліетилен гліколь опосередкованих ДНК) і клітини, в яких введено тш-РРО геном гомологічної рекомбінації з ендогенним геном РРО вибираються за допомогою відомих в даній галузі техніки.
В іншому варіанті рекомбінантні мікроорганізми, можуть бути отримані системою селективного вмісту, що забезпечує регульовану експресію введеного гена. Наприклад, включення Ітші-РРО гена у вектор, який підпадає під контроль Іак оперона, дозволяє експресію тільки тш-РРО в присутності ІРТО. Така регуляторна система добре відома з рівня техніки.
Інший аспект даного винаходу відноситься до клітин-хазяїна, в які був введений рекомбінантний вектор експресії за винаходом. Термін "клітина хазяїна" і "рекомбінантна клітина хазяїна" використовуються тут взаємозамінно. Зрозуміло, що такі терміни відносяться не тільки до конкретної клітини, а і вони також застосовуються і до потомства або потенційного потомства такої клітини. Оскільки деякі модифікації можуть мати місце в наступних поколіннях внаслідок мутації або впливів навколишнього середовища, таке потомство може не бути фактично ідентичним батьківській клітині, але все ще буде включене в обсяг терміна в даному описі. Клітина хазяїна може бути будь-яка прокаріотична або еукаріотична клітина. Наприклад, тШ-РРО полінуклеотид може бути експресований в бактеріальних клітинах, таких як
С.дішатісцт, комах, клітинах грибів або клітинах ссавців (наприклад, клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО) або клітини СО5), водоростей, інфузорії, клітинах рослин, грибків або інших мікроорганізмів, як С.дішатісит. Інші відповідні клітини хазяїна відомі фахівцям в даній області.
Клітина-хазяїн за винаходом, така як прокаріотична або еукаріотична клітина-хазяїн в культурі, може бути використана для продукування (тобто експресії) тш-РРО полінуклеотиду.
Відповідно, винахід також відноситься до способів отримання тшиш-РРО поліпептидів з використанням клітин-хазяїна за винаходом. В одному варіанті здійснення спосіб включає культивування клітини-хазяїна за винаходом (у якому було введено рекомбінантний вектор експресії, що кодує тиш-РРО поліпептид, або в геном якої був введений ген, що кодує поліпептид дикого типу або тиЇ-РРО) в відповідному середовищі перед тим як продукувати тиї-
РРО поліпептид. В іншому варіанті здійснення спосіб додатково включає виділення тиш-РРО поліпептидів з середовища або з клітини-хазяїна. Інший аспект даного винаходу відноситься до виділених тш-РРО поліпептидів і їх біологічно активних частин. "Виділений" або "очищений" поліпептид або його біологічно активна частина є вільною від деякого клітинного матеріалу за допомогою технології рекомбінантної ДНК або хімічних попередників або інших хімічних речовин хімічним синтезом. Вираз "по суті вільний від клітинного матеріалу" включає препарати ти-РРО поліпептид, в яких поліпептид відділений від деяких клітинних компонентів клітин природним шляхом або рекомбінантним способом. Вираз "по суті вільний від клітинного матеріалу" включає препарати тш-РРО поліпептиду, що мають менш ніж близько 30 95 (на суху вагу) не ти РРО матеріалу (також зветься тут як "забруднений поліпептид"), більш переважно менше ніж приблизно 20 95 не тиШ-РРО матеріалу, ще більш переважно менше ніж приблизно 10 95 не ти РРО матеріалу, а найбільш переважно менше ніж близько 5 95 не ти-РРО матеріалу.
Коли тш-РРО поліпептид або його біологічно активна частина є рекомбінантно про- індукованої, він також є переважно по суті вільний від культурального середовища, тобто культуральне середовище представляє менш ніж приблизно 20 95, більш переважно менше ніж приблизно 10 95, і найбільш переважно менше ніж близько 595 від обсягу поліпептидного препарату. Вираз "по суті вільний від хімічних попередників або інших хімічних речовин" включає препарати ти-РРО поліпептид, в яких поліпептид відділений від хімічних попередників або інших хімічних речовин, які беруть участь у синтезі поліпептида. В одному варіанті здійснення вираз "по суті вільний від хімічних попередників або інших хімічних речовин" включає препарати тиш-РРО поліпептиду, що має менш ніж близько 30 95 (по сухій вазі) хімічних попередників або ти-РРО хімічних речовин, більш переважно менше ніж близько 20 95 хімічних попередників або тш-РРО хімічних речовин, ще більш переважно менше ніж приблизно 10 95 хімічних попередників або тиш-РРО хімічних речовин, і найбільш переважно менше ніж приблизно 5 95 хімічних попередників або тиш-РРО хімічних речовин. У переважних варіантах виділені поліпептиди або їх біологічно активні частини вільні від забруднення поліпептидів з того ж організму, з якого тиШ-РРО поліпептид походить. Зазвичай такі поліпептиди отримують шляхом рекомбінантної експресії, наприклад, тш-РРО поліпептид в рослинах, крім або в мікроорганізмах, таких як С.дішатісит, війчасті, водорості та гриби.
Як описано вище, даний винахід навчає композиціям і способам для збільшення толерантності до похідної бензоксазинону у культурних рослин або насіння в порівнянні з бо сортом рослин або насіння дикого типу. У переважному варіанті толерантність культурних рослин або насіння до похідної бензоксазинону збільшується таким чином, що рослина або насіння витримують гербіцидне похідне бензоксазинонів переважно приблизно 1-1000 г на га-1, більш переважно 20-160 г на га-ї, а найбільш переважно 40-80 г на га-1. Як тут використовується, "витримує" похідні бензоксазинону гербіцидів означає, що рослина або не знищується або не страждає від такого застосування.
Крім того, даний винахід пропонує способи, які включають застосування щонайменше одного гербіцидного похідного бензоксазинону, як детально описано вище.
У цих способах гербіцидне похідне бензоксазинону може бути нанесено будь-яким способом, відомим в даній області, включаючи, але не обмежуючись цим, обробку насіння, обробку грунту та листя. Перед нанесенням гербіцидного похідного бензоксазинону можуть бути перетворені в звичайні композиції, наприклад розчини, емульсії, суспензії, порошки, тонкі порошки, пасти і гранули. Використання форми залежить від мети застосування, в кожному разі вона має забезпечувати тонке і рівномірне розподілення сполуки згідно з винаходом.
Надаючи рослинам збільшену толерантність до гербіцидного похідного бензоксазинону, можуть бути використані різноманітні препарати для захисту рослин від бур'янів, з тим щоб підвищити ріст рослин і знизити конкуренцію за поживні речовини. Гербіцидне похідне бензоксазинону може бути використане само по собі передсходово, післясходово, перед посадкою і при посадці на ділянках боротьби з бур'янами, що оточують культурні рослини, описані тут, або препарат Гербіцидне похідне бензоксазинону може бути використане разом з іншими добавками. Гербіцидне похідне бензоксазинону також може бути використане для обробки насіння. Добавки, що знаходяться в складі гербіцидного похідного бензоксазинону включають інші гербіциди, детергенти, допоміжні речовини, розпилюючі агенти, клеючі агенти, стабілізуючі агенти або тому подібне. Гербіцидний препарат похідного бензоксазинону може бути вологим або сухим препаратом і може включати, але не обмежуються ними, текучі порошки, емульгуючі концентрати та рідкі концентрати. Гербіцидне похідне бензоксазинону і композиції гербіцидів можуть бути застосовані у відповідності зі звичайними методами, наприклад, шляхом розпилення, поливу, опилювання або тому подібне.
Подібні композиції докладно описані в РСТ/ЕР2009/063387 і РСТ/ЕР2009/063386, які включені сюди шляхом посилання.
Зо Слід також розуміти, що вищевикладене відноситься до кращого варіанту здійснення даного винаходу, і що численні зміни можуть бути зроблені в ньому без відступу від обсягу даного винаходу. Винахід далі ілюструється такими прикладами, які не повинні бути тлумачені жодним чином, що накладе обмеження на обсяг винаходу. Навпаки, вони для ясного розуміння того, що можуть бути різні інші варіанти, модифікації і еквіваленти, які після прочитання даного опису, можуть бути запропоновані фахівцям в даній галузі техніки без відступу від даного винаходу та/або об'єму прикладеної формули винаходу.
ПРИКЛАДИ
ПРИКЛАД 1: Сайт-спрямований мутагенез Атагапіпи5 РРО
Клонування Агатапійив5 РРО
Було синтезовано кодувальну послідовність Атагапійиє фшбрегсоціай5 для РРО- сприйнятливих і стійких ізоформ, а мутантні комбінації (ЗЕО ІЮО МО: 1, 3, 5, 7) і клоновано
Сепеап (Сепеап АС, Недепзвриго, Септапу).
Плазміди ізолювали з Е.соїї ТОР1О шляхом плазмідного мінпрепарування і підтверджували шляхом секвенування ДНК.
Експресія та очищення рекомбінантної дикого типу і мутантної РРО (Взято з: Егапск Е. Оауап, РапкКа) К. ОСада, 5іерпеп 0. ОикКе, Куап М. Геє, Раїніск У. Тгапеї,
Вобреп у. РоеїгКзеп. Віоспетісаї! апа в5ігисіига! сопзедиепсез ої а діусіпе деїейоп іп їте а-8 Неїїх ої ргоїорогрпугіподеп охідазе. Віоспітіса єї Віорпузіса Асіа 1804 (2010), 1548-56).
Клони в рЕ5ЕТ векторі були трансформовані в штам Е.соїї ВІ/21 (ОЕЗ)-рі уз5. Клітини вирощували в 250 мл І В з 100 мкг мл-1 карбеніциліну, при струшуванні протягом ночі при 37 "С.
Культури розводили в 1 л І В з антибіотиком і вирощували при 37 "С при струшуванні протягом 2 год., індукували з 1 мМ ІРТО і вирощували при 25 "С, струшуючи ще протягом 5 годин. Клітини збирали центрифугуванням при 1600х49, промивали 0,09 95 Масі, і зберігали при -80 "С.
Клітини лізирували з використанням преса Френча при 140 МПа в 50 мМ фосфату натрію рН 7,5, 1 М Масі, 5 мм імідазолу, 5 95 гліцерину і 1 мкг мл-1 лейпептіну. Після лізису, було додано 0,5 Од бензонази (Момадеп, ЕМО Спетісаї!5, Іпс, сірбеїомлп, МУ) ї РМБЕ (кінцева концентрація 1
ММ). Клітинний дебрис видаляли центрифугуванням при 3000х4д. Мічені гістидином білки РРО очищали на активованій ніселем Нігар хелатуючий НР колонці (СЕ Неайсаге Віо-5сієпсе5
Согр., Різсаїажау, МУ), врівноваженій 20 мМ фосфату натрію, рН 8.0, 50 мМ масі, 5 мм 60 імідазолу, 5мММ Мас», 0,1 мМ ЕДТО |і 17 95 гліцерину.
РРО елюювали 250 мМ імідазолу. Активний білок знесолювали на колонці РО-10 (СЕ
Неайнсаге Віо-5сієпсез5 корпорації, Різсаїажау, МУ), врівноваженій 20 мМ натрій-фосфатним буфером, рН 7.5, 5 мМ Масі»г, 1 мМ ЕДТО і 17 95 гліцерину. Кожен літр культури забезпечував приблизно 10 мг чистого РРО, який зберігали при -20 "С до використання в аналізах.
Аналіз активності РРО
Ферментний аналіз РРО (нерекомбінантного). Білок РРО (ЕС 1.3.3.4) був екстрагований з колеоптелів або пагонів (150 г сирої ваги) вирощеної в темряві кукурудзи, пасльону чорного, ранкової слави і саджанців теофраста, як описано раніше (Сго55тапп еї аїЇ. 2010). До збору урожаю саджанці протягом 2 годин зростали при світлі для досягнення найвищої специфічної активності ферментів у фракцій тилакоїдів при низькій концентрації хлорофілу. При високій концентрації хлорофілу відбувається значне гасіння флуоресценції, що обмежує кількість зелених тилакоїдів, що може бути використано в тесті. Рослинні матеріали були гомогенізовані на холоді за допомогою блендера Вгашп при співвідношенні свіжої маси до об'єму 1: 4. Буфер для гомогенізації складався з трис(гідроксиметил) амінометана (Тріс)-НСІ (50 мМ; рн 7.3), сахарози (0,5 М), хлориду магнію (1 мм), етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТО) (1 мМ) і бичачого сироваткового альбуміну (2 г л"). Після фільтрації через чотири шари Мігасіоїй було отримано препарати сирих пластид після центрифугування при 10000х9д протягом 5 хв. і ресуспендування в буфері для гомогенізації перед центрифугуванням при 150х9 протягом 2 хв., з тим, щоб видалити дебрис сирих клітин. Супернатант центрифугували при 4000хд протягом 15 хв. і осадові фракції ресуспендували в 1 мл буфера, що містить трис-НСІ (50 мМ, рн 7.3),
ЕДТО (2 мМ), лейпептину (2 мкМ), пепстатину (2 мкМ) і гліцерину (200 мл І 7), і зберігали при - 80 "С перед використанням. Білок визначали у ферментному екстракті з бичачим сироватковим альбуміном в якості стандарту. Активність РРО визначали фторметрично шляхом моніторингу рівня утворення Ргоїо з хімічно відновленого протопорфіриногена ЇХ при початкових умовах швидкості. Суміш для аналізу складалася з трис-НСІ (100 мМ, рН 7,3), ЕДТО (1 мМ), дитіотреїтолу (5 мМ), Тмжееп 80 (0,085 95), протопорфіриногену ІХ (2 мкМ) і 40 мкг екстрагованого білка в загальному об'ємі 200 мкл. Реакцію ініціювали додаванням субстрату протопорфіриноген ЇХ при 22"Сб. Сафлюфенацил, флуміоксазин і бутафенацил були підготовлені в розчині диметилсоульфоксиду (ДМСО) (0,1 мМ концентрація ДМСО в аналізі) і
Зо додані в суміш для аналізу в концентраціях від 0,005 рМ до 5 мкМ до інкубації. Флуоресценцію контролювали безпосередньо за аналізом суміші з використанням Роїагеїаг Оріїпа/саїаху (ВМО) з активізацією при 405 нм і емісією при 630 нм. Неферментна активність в присутності інактивованого нагріванням екстракту була незначною. Інгібування ферментної активності індуковане гербіцидом виражено як відсоток інгібування в порівнянні з необробленим контролем. Молярна концентрація сполуки, необхідна для 50 95 інгібування ферменту (значення
ІСво) розраховували шляхом встановлення значень рівняння доза-відповідь з використанням нелінійного регресійного аналізу.
РРО ферментний аналіз (рекомбінантний). Ргоїо був придбаний у бідта-Аїйагісн (Мімашйкевє,
ММ). Протоген готували відповідно до ЧУчасоре і Чдасоре (М.9У. дасоре5, 9У.М. УЧасоре5, Авзау ог епгутаїйс ргоїорогрпугіподеп охідаїйоп, а Іаге віер іп пете 5упіпезвів,
Епгуте 28 (1982) 206-219). Аналізи проводили в 100 мМ фосфату натрію, рН 7,4 за допомогою 0,1 мМ ЕДТО, 0,1 95 Туееп 20, 5 мкМ ЕАб і 500 мМ імідазолу. Криві доза-відповідь з інгібіторами РРО ацифлуорфеном, лактофітом, бензоксазиноном 1.а.35 або бажано з похідними бензоксазинону (де Х є О або 5, ВК" є воднем, Сі-Св-алкілом, Сі-Св-галогеналкілом, Сз-Св- циклоалкілом, Сз-Св-алкенілом, Сз-Св-галогеналкенілом, Сз-Св-алкінілом, Сз-Св- галогеналкінілом, Сі-Св-алкокси, або Сз-Свє-циклоалкіл-Сі-Св-алкілом, Е? є воднем, МН», С1-Св- алкілом або Сз-Св-алкінілом, РУ є воднем або С:-Св-алкілом, або їх комбінацією), вимірюють у присутності 150 мкМ протогену. Смуги збудження та емісії були встановлені на рівні 1,5 і 30 нм відповідно. Всі аналізи були зроблені двічі або тричі і виміряні за допомогою Роїагеїаг
Орійпа/Са|Іаху (ВМО) із збудженням при 405 нм та емісії при 630 нм.
Значення дози відповіді (ІСзо) для заміщених ферментів РРО є більшими, ніж значення ІСзо для дикого типу (незаміщений) ферменту РРО (таблиця 4а та 4аб). Це вказує на те, що ці заміщені ферменти РРО мати власну стійкість до бензоксазинону і деяких тестованих похідних бензоксазинону. Заміщені ферменти РРО аса210 ії К1281 відомі як такі, що замінюють РРО ферменти, знайдені в Атагапіпйих шБрегсціайи5, і показано, що вони відповідають за резистентність РРО іп ріапіа до різних гербіцидів РРО (Оауап еї аї.,, 2010, Віоспітіса еї
Віорпузіса Асіа, 1804:1548). Це вказує на те, що інші зазначені заміщені РРО ферменти з більш високим значенням ІСво, ніж 405210 або К128Ї, є також заміщеними РРО ферментами, які відповідають за іп ріапіа резистентність проти різних гербіцидів РРО, у тому числі 60 бензоксазинону 1.а.35 (табл. 4а) і перерахованих похідних бензоксазинону (таблиця 46). Всі заміщені ферменти РРО показують порівняну активність ферменту, зміну одиниці флуоресценції за хвилину (РШ/хв) порівняно з диким типом ферменту РРО (таблиця 4а). Крім того, всі значення активності ферментів для заміщених РРО є більшими, ніж для заміщеного
РРО ферменту д0210. Заміщений РРО фермент 40210 є досить активним для функції іп ріапіа.
Це означає, що всі інші зазначені заміщені ферменти РРО також досить активні для функції іп ріапа.
Таблиця 4а
ІСво (М) значення для ферменту РРО дикого типу і ферменту РРО із заміщенням амінокислот, для інгібітору бензоксазинону 1.а.35
ЕЕ ТЕРАГ Я НО ЯР Те: ПНЯ ОТ ПО
Таблиця 46:
ІСво (М) значення для ферменту РРО дикого типу і ферменту РРО із заміщенням амінокислот, для перерахованих похідних бензоксазинону
Заміщенн Актив: водень | єЄводень | водень водень | є водень | є водень | ЕШ/мтіп вт2ВІ |3,82Е-08 |202Е-07 3,57 06. |777777171717171717171171171111111750 асето |3,33Е-08 (10-07 164307 | | 77771717 в80 1-970. | -ЮЙБМ МК Ї7.7.ЮД;1Е7777711 44107 (44107 243Е-06|243Б06| 250 а2гої Її 77777177 16л7е07|6л17е-07 1,00є-05|1,00є05| 179
АВ128А, шк 71117 вововфіовоє ово оювов| зо
ПРИКЛАД 2: Скринінг мутантних клітин водоростей для виявлення стійких до гербіцидів клонів і причинно обумовлених мутацій в генах РРО.
Для створення мутації, що надають стійкість до гербіциду, що походить з бензоксазинону, в генах РРО, можуть бути використані хімічний або УФ-мутагенез. Особливо корисними для ідентифікації домінуючих мутацій у стійкості до гербіцидів є одноклітинні організми, такі, як
СпПіатудотопазх геіппагаці або Зсепедезтиз обіїднив5.
Клітини водорості Спіатудотопавз геіппагані штамів СС-503 і СС-1691 (ОиКе Опімегвіу, бигпат, США) розмножують в середовищі ТАР (Горман і Левін (1965) РМА5 54: 1665-1669) при постійному струшуванні при 100 обертах за хвилину, 22 "С і світовому освітленні 30 мкмоль фот "мех с,
Зсепедезтивз обіїдци5 (Геттінгенського університету, Німеччина) розмножують в середовищі водоростей, як описано (Водег і Запатапп, (1993) в:. Мета аналізу для сучасних гербіцидів і 15 пов'язаних фітотоксичність сполук, Льюїс видавців) при тих же умовах культивування, як зазначено для Спі(атудотопав5. Скринінг сполук виконується при освітлення 450 мкмоль фот" ме" сг,
Чутливі штами Спіатудотопаєх геїіппагайії або 5сепеде5ти»вх обріїдци5 мутують за допомогою 0,14 М етилметансульфонату (ЕМ5) протягом 1 год., як описано І оррез (1969, 20 Мої Сеп Сепеї 104: 172-177). Толерантні штами ідентифікують шляхом скринінгу мутагенізованних клітин на планшетах з твердим живильним розчином, що містять похідні гербіциду бензоксазинону за інтересом при низьких і летальних концентраціях сполуки в залежності від активності сполуки в специфічному штамі водорості.
Ампліфікація генів РРО від дикого типу і резистентної Спі(атудотопазв геіпйагаїї з геномної
ДНК або копії ДНК як матриці виконують за допомогою стандартних методів ПЛР з використанням ДНК-олігонуклеотидів. Мутації були виявлені шляхом порівняння дикого типу і мутантних послідовностей РРО за допомогою програми вирівнювання послідовностей АїЇїдп Х ((Месіог МТІ Адумапсе бЗоймаге Мегвіоп 10.3, Іпийгодепе, Сагізрай, СА, ОБА)).
На Фігурі 2 показаний вибір штаму Спі(атудотопазФ геіппагайї, стійкого до похідної гербіциду бензоксазинону 1.а.35. (А) Мутагенізовані клітини висівали на тверде середовище без вибраного агента. (В) Мутагенізовані клітини висівали на тверде середовище, що містить 1х10-7
М похідної гербіциду бензоксазинону 1.а.35. Клітини, які є резистентними до похідної гербіциду бензоксазинону утворюють колонії (обведені колом і пронумеровані 33, 34, 35 і 36), тоді як чутливі клітини не ростуть. Вище число колоній на планшеті А в порівнянні з В, показує, що колонії на планшеті В стійкі до похідної гербіциду бензоксазинону 1.а.35.
На Фігурі З показано повторне зростання вибраних штамів Спіатудотопаз геїіппагайї, стійких до похідної гербіциду бензоксазинону 1.а.35. (А) Клітини дикого типу в рідкому середовищі без вибраного агента. (В) Клітини дикого типу в рідкому середовищі, що містить зростаючу похідну гербіциду бензоксазинону 1.а.35 (від 1х109 до 5х05 М). (С) Мутагенізовані клітини в рідкому середовищі без вибраного агента. (01, 02, Е1, Е2) Мутагенізовані і відібрані штами в рідкому середовищі, що містить зростаючу похідну гербіциду бензоксазинону 1.а.35 (від 1х109 до 5х106
М). Штами, резистентні до гербіциду 1.а.35, похідної бензоксазинону, культивуються до більш темного кольору, що вказує ріст. Чутливі штами не культивуються і залишаються світлого кольору. Вища щільність клітин в рідкому середовищі з зростаючими клітинами демонструє темний колір. Низька щільність культури дає світліший колір або є цілком прозорою.
ПРИКЛАД 3. Скринінг ЕМ5 мутагенізіваних популяцій Агарідорзі5 Іпайапа для виявлення
Зо стійких до гербіцидів рослин та ідентифікації причин мутацій в генах РРО.
М2 популяція рослин Агабідорвхі5 (пайапа, оброблених ЕМ5 отримують з насіння І ейіе (Кошпа Коск, ТХ, ОБА). Скринінг проведено на посіві насіння Агабрідорзіз на половинній концентрації живильного розчину Мурашиге-Скуга, що містить 0,590 желатинного агента
Сеїгйеф і похідну бензоксазинону гербіцидів (від 0,1 до 500 мкМ), залежно від активності сполук.
Планшети інкубували в ростовій камері в 16:08 год. циклів світло-темрява при 22 "С на термін до трьох тижнів. Толерантні рослини з менш інтенсивним відбілюванням фенотипу висаджують у грунт і вирощують до зрілості в тепличних умовах. На стадії розетки рослини листові диски збирають з рослин з похідною бензоксазинону гербіцидів для виділення геномної ДНК з ОМеазу
Ріапі Міпі Кі (Оіадеп, Ніїдеп, Сегтапу) або загальної мРНК з ЕМеазу Ріапі Міпі КИ (Очадеп,
Ніїдеп, Септапу).
РРО послідовності ампліфікують за допомогою стандартних методів ПЛР для геномної ДНК з відповідними олігонуклеотидами. Для ампліфікації РРО з мРНК, ДНК копії синтезують іп міго використанням Зирегзосгірі І зворотню транскриптазу (Іпмігодепе, Сагізрад, СА, ОА). Після клонування продукти ПЛР в плазміді стандартної послідовності ДНК послідовність мутованих генів РРО визначали за допомогою стандартних методів секвенування. Мутації були виявлені шляхом порівняння дикого типу і мутантних послідовностей РРО за допомогою засобів вирівнювання послідовностей АїЇїдп Х (Месіог МТІ Адмапсе боїймаге Мегзіоп 10.3, Іпийгодепе,
Сагпіврад, СА, ОА).
ПРИКЛАД 4. Конструювання толерантних до похідної гербіциду бензоксазинону рослин з дикого типу або мутованих послідовностей РРО.
Толерантна до похідної гербіциду бензоксазинона рослини сої (Сіусіпе тах) отримували за способом, як описано Оїйой та співавт. (Патент США 2009/0049567). Послідовності мутантних
РРО клонували за стандартними методами клонування, як описано в ЗатрбгооК і співавт. (Моїесшіаг сіопіпд (2001) Соїд бргіпуд Нагбог І арогаюгу Ргев5) у бінарний вектор, що містить касету маркера гена стійкості (АНА5) і мутовані послідовності РРО (позначені як СОЇ) між промотором убіквітину (РсСОбБі) і послідовністю термінатора нопалін-синтази (МОБ). Бінарні плазміди вводять в Адгобасіегічт їштегтасіеп5 для трансформації рослин. Плазмідні конструкції вводяться в пахвову клітину меристеми сої на первинному вузлі розсади експлантата опосередковано через Адгобасіегічт. Після інокуляції та спільного культивування з Адгобасіегіа, 60 експлантати переміщують, щоб злити первинне середовище без відбору протягом одного тижня. Експлантати згодом переміщують, щоб злити індукційне середовище, що містить 1-3 мкМ імазапіру (Агзепаї) протягом З тижнів, щоб відібрати трансформовані клітини. Експланти зі здоровими калюсом/зародки пагонів на первинному вузлі потім передаються в середовища для подовження пагонів, що містить 1-3 мкМ імазапіру, доки пагін не подовжиться або експлант не загине. Трансгенні проростки укорінюють, піддають аналізу ТадМап на наявність трансгенів, переносять в грунт і вирощують до зрілості в теплиці. Трансформацію рослини кукурудзи здійснюються за допомогою способу, описаного МеЕїЇмег і бБіпой (М/о 2008/124495). Векторні конструкти трансформації рослин, що містять мутовані послідовності РРО, вводять в незрілі зародки кукурудзи шляхом трансфомації, опосередкованої Адгобасіегічт.
Трансформовані клітини відбирають в селективному середовищі з додаванням 0,5-1,5 мкМ імазетапіру протягом 3-4 тижнів. Трансгенні проростки регенерували на середовищі для регенерації рослини та укорінювали згодом. Трансгенні проростки піддавали аналізу ТадМап на наявність трансгенів перед пересаджуванням у заливну суміш та вирощували до зрілості в теплиці. Агарідорзі5 їйпайапа трансформували мутованою послідовністю РРО методом занурення квіток, як описано МеЕїЇмег і Сінгх (ММО 2008/124495). Трансформація Огуга заїїма (рис) здійснювали шляхом трансформації протопласта як описано Пен та ін. (05 6653529)
Трансгенні рослин ТО або Т1 сої, кукурудзи, рису і Агабрідорвзі5 (паійапа, що містять мутовану послідовність РРО, тестували на поліпшену толерантність до РРО-похідних гербіцидів у тепличних дослідженнях.
ПРИКЛАД 5. Функціональна комплементація та скринінгове дослідження. (див. також: УміПат ГІ. Раїгоїді, Аагоп с. Надег, чУоеі 5. МоСоптіск, апа Раїйпск 9. Тгтапеї. А содоп аеєїеїйоп сопієг5 гезівїапсе юю Пегбісідез іппірбйіпуд ргоїорогрпугіподеп охідазе. РМАБ 103 (33), 12329-34)
РРО бібліотеки генерування:
Бібліотеки РРО гену генерували випадковим мутагенезом (помилки, що допускала ПЛР) або сатураційним мутагенезом РРО-гена (Сепеаг АС, Кедеп5ригдо, Септапу) і клонували в експресуючому векторі (РВАО-ТОРО) для іп мімо скринінгу. Крім того, скорочений варіант генів дикого типу і мутантних РРО клонують в рРВРАЮ-ТОРО векторі експресії (Іпмітодеп), так що трансляція починається з другого стартового кодону АТО. РРО кКДНК ПЛР ампліфікують з
Зо використанням прямого праймера 5-САСОСААТААИТААТаСасСААСАТТТСТОада-3, що містить сайт зв'язування рибосоми (АССА) і стартовий кодон АТО, та зворотний праймер 5-
СААСААТТАСаСаатТстТТсСтТСАТО-3, що містить стоп-кодон. Чутливі і, як передбачається, стійкі плазміди РРО використовують для трансформації пето мутантного штаму Б. соїїЇ, 5А5БХЗ8, люб'язно наданого Нагту Оайеу (Опімегейу ої Сеогдіа, АШепв, БА). БА5ХЗ38 штам Е.соїї витримують на І В-середовищі, що містить 20 мг'"мл! гематину. Трансформовані колонії
ЗАБ5ХЗ8 і нетрансформований контроль тестують на їх здатність росту на одному ІВ середовищі або з додаванням 20 мг"мл" гематину або з інгібітором РРО лактофеном і гербіцидним похідним бензоксазинону в діапазоні від 0,01 до 500 мкМ, та інкубували при 37 "С протягом 14 год.
Комплементацію та скринінгове дослідження використовували з пето (РРО) мутантним штамом БЕ. соїї, БА5ХЗ8 (Зазагтап, А., Спагігапа, Р., Гамоїє, М., Тагаїй, О., Ргозспек, В. 4
Іароїпіє, С. (1979) У. Сеп. Місгобріої. 1 13, 297-303.) для оцінки ефекту мутацій РРО до відповідей РРО гербіциду. 5БАБХЗ38 штам росте дуже повільно, якщо не доставляється з екзогенним гемом або не відновлений з альтернативним джерелом РРО. Крім того, оскільки
Е.соїї дикого типу природно стійкі до РРО інгібіторів, використання штаму БАЗХЗ38 включене до прямого аналізу чутливості до гербіциду дикого типу і мутантних РРО для А. Шрегсціайшв5.
ЗАБ5ХЗ8 штам Е.соїї трансформували плазмідним конструктом, що кодує дикий тип і мутантні
РРО. Конструкти можуть відновити зростання штаму Е.соїї БА5ХЗ8, тим самим вказуючи, що
РРО гени кодують функціональні білки. Проте, додавання до живильного середовища похідної гербіциду бензоксазинону значно інгібує ріст Е.соїї, трансформованої диким типом РРО, але не
Е.соїї, трансформованої деякими мутантними РРО.
ПРИКЛАД 6. Умови культивування тканини.
Дослідження іп міїго мутагенізації культуральної тканини були проведені, щоб виділити і охарактеризувати рослинні тканини (наприклад, тканини кукурудзи, рису), які стійкі до гербіцидів, інгібуюючих протопорфіриногеноксидазу (наприклад, сафлуфенацил, біфенокс, діурон, лактофен, бутафенацил). При дослідженні використовували сомаклональний варіант, який знаходиться іп міго в культурі тканини. Спонтанні мутації отримані сомаклональними змінами можуть бути підвищені шляхом хімічного мутагенезу і подальшої підбору сходовим чином при збільшенні концентрації гербіциду.
Даний винахід відноситься до умов культури тканини для стимуляції росту живленням ембріогенної кукурудзи або калюсу рису, здатним до регенерації. Калюси ініціюють від 4 різних сортів кукурудзи або рису, що включає 7еа Маух та даропіса (Таіреї 309, Мірропбаге, Козпіпікагі) та Іпаїса (Іпаїса 1) сортів відповідно. Насіння поверхнево стерилізують в 70 95 етанолі протягом приблизно 1 хв., а потім в 20 95 комерційному відбілювачі Сіогох протягом 20 хвилин. Насіння промивають стерильною водою і висівають на середовище для індукції калюсу. Різні середовища інтродукції калюсу було протестовано. Перелік інгредієнтів для тестового середовища представлені в Таблиці 5.
Таблиця 5
Вовітамни!їзідта | / ! !/ | лох!
МЗсолі |Здта | | | тох | лох | тох | лох
МЗвітамниїзідта | | | ох | їох | ЇЇ
Мбсолі |Рпуюівсн| 40г/л | 40г/л. | :/ ЇЇ ОО 17777777 1777771
Мбвітаміни|Рпуюєсн| 10Х | ї0Х | ! ЇЇ її -спролін |Зідта | 2.9г/л. | б5г/л. | : | (| | 12г/л вер» | невинні кислота
Гідролізат . шен ета 1111 рот
І-Азр зонда (о 11110 воміт
Никотинова| г. шт (та 11111 ровмт
Не кан СНИ ННЯ ПОН КОНЯ КОНЯ ПОЛНАЯ ВСЕ
ТамінносІЗдта | (ЇЇ (щЩ(! |! Щщ| | ТОмгл/
Міоїнозитолізідта | (ОЇ 77777711 | лобмгл (Мальтоза |ММУА | ЗОг/л | ЗОг/л. | ЗОг/л | З0гл
Сорбітол |Оиспеба | -:( | (ЗЛ | ЗоОл. | ОЇ 7777/1777
Цукроза (УМА ЇЇ 77/77 1777171717171717171717171717171717171 1 логло | Збгл
ОМАА о |Одспеа/ | ЇЇ 7777777717Ї177171717171717171711717171717171717171 | 5омол |: 240 |Здта | 2бм/ил | ОЇ 7777/1771 | 1омгл мосіовноЇУМАЇ ОЇ 17111111 рН 17777171 11158. | 58 | 58 | 58 | 58 | 57
Сбеййе |Ойиспе2 | 40г/л. | : (ОСС | 25гл | 7 тане (вт | 00001 типу 1
Автоклав | | ї5хвл. | ї5хвл. | ї5хвл. | ї15хвл. | ї5хвл. | 20хвл.
Кінетин |Здта | | 2Омг/л | 2О0мул |:
ОМАА 0 |Ойцспеаї | | ТОмол | їОмул |: | ЇЇ
АВА 0 |Здта | -( | 5бм/л!| ОЇ 7777777 17777111! (Сеїотахіте (Оиспета | | Олг/л | Ол/г/л | Олг/л. |:
Ванкоміцин|Оиспета | | Олг/л | Ол/г/л | Олг/л. |: дить |та | | гом | ит | соми
КОО01М середовище індукції калюсу було відібрано після тестування множини варіантів.
Культури зберігають в темряві при 30 "С. Ембріогенний калюс повторно пересівають у свіже середовище через 10-14 днів.
ПРИКЛАД 7. Вибір толерантного до гербіциду калюсу.
Як тільки умови культивування тканини визначено, подальше створення умов вибору встановлюють на основі аналізу тканин, що залишилися життєздатними в кривій знищення з сафлуфенацилом, біфеноксом, діуроном, лактофеном, бутафенацилом, аціфлуорфеном, похідним гербіциду бензоксазинона. Особливу увагу приділяли дослідженням накопичення гербіциду в тканинах, а також його стійкості і стабільності в клітині і культуральному середовищіу. Через ці експерименти сублетальна доза була створена протягом початкового відбору мутованого матеріалу.
Після встановлення початкової дози сафлуфенацилу, біфеноксу, діурону, лактофену, бутафенацилу, аціфлуорфену і гербіцидного похідного бензоксазинонуу у виборі середовища, тканини підібрали поетапно, шляхом збільшення концентрації інгібітора РРО з кожною передачею повертали клітини, які росли енергійно у присутності токсичних доз. Отриманий калюс далі пересівають кожні 3-4 тижні до КОО1 М з селективним агентом. Більше 26000 калюсів піддані селекції протягом 4-5 субкультивувань до досягнення селективного тиску вище токсичних рівнів, як це визначено за кривими вбивання та спостереженнями подальшого культивування. Альтернативно, рідкі культури ініціювали з калюсу в М5711К з повільним струшуванням і щотижневим субкультуруванням. Як тільки рідку культуру встановлено, селективний агент додають безпосередньо в колбу для кожної субкультури. Після 2-4 раундів вибору рідини, культури переносять до фільтрів на твердих середовищах КО0ОЇ М для подальшого зростання.
ПРИКЛАД 8. Регенерація рослин.
Толерантну тканину регенерують і молекулярно характеризують для мутацій послідовностями РРО гена і/або біохімічно для зміненої активності РРО у присутності селективного агента. Крім того, гени, що беруть участь безпосередньо та/або опосередковано у біосинтезі тетрапіролу та/або шляхів метаболізму, також просеквеновані для характеристики мутацій. Нарешті, ферменти, які змінюють хід (наприклад, обмін речовин, транслокації, транспортації) також просеквеновані для характеристики мутацій.
Після вибору гербіциду калюс регенерували використанням режиму середовища КО25М протягом 10-14 днів, К026М - протягом приблизно 2 тижнів, КЗ27М поки добре сформовані пагони не будуть розділені і К0085 поки пагони будуть мати коріння для перенесення в теплиці.
Регенерація здійснюється на світлі. Неселективний агент виключають під час регенерації.
Після отримання міцних коренів МО регенеранти пересаджують в теплицю в квадратних або круглих горщиках. Трансплантати утримують в прозорих пластикових чашках, поки вони не пристосуються до тепличних умов. Тепличний режим встановлюють на цикл день/ніч 27 "С/21 С (80 "Р/70 Р) з 600УУ високим тиском натрієвого світла, доповненого світлом для підтримки 14-годинного світлового дня. Рослини поливають відповідно до потреби в залежності від погоди і добрив щодня.
ПРИКЛАД 9. Аналіз послідовності.
Листову тканину збирали з клонованих рослин, розділених для пересадки і аналізували індивідуально. Геномну ДНК отримували за допомогою УмігагаФ 96 Мадпейс ОМА Ріапі зулет
КІ (Рготеда, 05 Раїепі Мо5. 6,027,945 8. 6,368,800), відповідно до вказівок виробника. Виділену
ДНК ПЛР-ампліфікували з використанням відповідного прямого і зворотного праймерів. ПЛР- ампліфікацію проводили з використанням Ноївіаг Тад ОМА полімерази (Оіадеп) за допомогою термоциклічної програми наступним чином: 96 "С протягом 15 хв., потім 35 циклів (96 С, 30 сек., 58 70-0,2 702 за цикл, 30 сек., 72 "С, З хв. і 30 сек.), 10 хв. при 72 76.
ПЛР-продукти перевіряли на концентрацію і розмір фрагмента через агарозний гель електрофорезу. Дефосфорильовані продукти ПЛР аналізували через прямі послідовності з використанням ПЛР-праймерів (ОМА Іапатагк5, або Епієіеспоп). Файли хроматографічніх слідів (5СЇ) аналізували для порівняння мутацій з диким типом гена з використанням Месіог МТІ
Адуапсе 10м (Іпмігодеп). На основі інформації про послідовність, мутації визначали в множині представників. Аналіз послідовності виконується на типових хроматограмах і відповідні вирівнювання АїЇдпХ з настройками за замовчуванням і відредагованими, щоб фіксувати вторинні піки.
ПРИКЛАД 10. Демонстрація толерантності до гербіцидів.
Обраних мутантів переносять в невеликі горщики. Сорти дикого типу пророщують з насіння, що служить як контроль.
Після З тижнів після трансплантації МО регенеранти обприскують, використовуючи обприскувач з сафлуфеніцилом (ВАЗ 800Н) або похідним бензоксазинону І.а.35 з додаванням 0,1 96 метильованої насінневої олії. Після того, як рослини пристосувалися до умов теплиці, підмножину обприскують додатково сафлуфеніцилом (ВА5 800Н) або похідним бензоксазинону
Іа.35. Після розпилення рослини витримують в умовах посухи протягом 24 годин, після чого поливають і запліднюють знову. Обприскані рослини фотографують і оцінюють до гербіцидної обробки та після 1 та 2 тижнів відновлення.
ПРИКЛАД 11. Виділення гербіцидів за допомогою тканинної культури.
Обирають середовище для використання і розробляють криві вбивання, як зазначено вище. 60 Для відбору, були використані різні методи. Будь-який крок вірного відбору або рівень швидкої летальності від гербіциду відмічається. У будь-якому випадку всі калюси трансформують для кожного нового раунду відбору. Вибір 4-5 циклів культури з 3-5 тижнів для кожного циклу.
Калюси поміщають на нейлонові мембрани для полегшення трансформації (листи з 200 мікронними порами, Віодевідп, Засо, Маіпе). Мембрани вирізали під розмір чашки Петрі 100х20 мм і автоклавували перед використанням 25-35 калюсів (середня вага/калюс 22 мг) для кожного планшету. Крім того, один набір калюсів піддають селекції в рідкому культуральному середовищі з тижневими субкультурами з подальшим перенесенням на напівтверде середовище.
Мутантні лінії вибирали за допомогою сафлуфенацилу (ВАЗ 800Н) або похідного бензоксазинону І.а.35. Ефективність отримання мутантів висока, враховуючи відсоток калюсів, які регенеровані, мутантні лінії або кількість ліній, як визначено грамом використаної тканини. У цілому частота мутацій, в порівнянні з зеазпоге разраїшт, становить 5 разів більша, а в порівнянні з Маї7ее в 2 рази більша.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 БАСФ СЕ «1205 РОСЛИНИ, ЯКІ МАЮТЬ ПІДВИЩЕНУ ТОЛЕРАНТНІСТЬ ДО ГЕРБІЦИДІВ «1305 РЕ71580 «1505. 15 61/423604 «1515 2010-12-16 «1505 ЕР 10195296.8 «1515 2010-12-16 «1605 46
Зо «1705 РавепсІп уеквзіоп 3.4 «2105 1 «2115» 1605 «2125 ДНК
З5 «213» Атагапесйив Єцпрегксит1асив «4005 1 аєддеєааєсєс ааєссаєвтас ссасссссса ссааассссд сассдссаєс дссаєссдесса бо дЕсЄсаасса адаассассс адсадссдса асдддсааса ССсссдадсд ддаадаассс 120 асЕєссдста ааадддаєсоос СЯєСсЯєсоЧЕ дсЕдДдадесса дсодасссоос, сСдсєдсаєсає 180 аадсєаааає сссаєдУєєє дадедсдаса ССдсссдаад седасєсссад адссддаддас 240 ааасеєсаааа сЕдЕеЕсааааа ачаєдаєссс асссоддваєда адддддсааа Сбассасдаса Зоо чааачдеєдадд сададдеєсеєс дадеЕсєсдаєс даєдассссд ддссссдасда даадсаасад З6о
Еєдссааєеєє сасаааасаа аадаєасаєа дссададасуд дсЕсссссодес дссастассяо 420
Есаааєсссдуд седсассасе сасдадсаає асссссесад саааассааа дссдсаааєсе 480 аєдеЕєддаас саєєєсестьдд дадаааасас аасдссассд аассссссда Сдадсаєсдєс 540 саддааадсу ЕсоодЕЧЧааєє ЕсЕеЕєдадсда саєєеєєдоада аачадеЕстЕдЕ Едаєтаєдцьс 60 аєсдасссЕє ЄЕєЧдЕеЕєдсоодуа басаєдсддс ддадассссс аассдЯяссссс саєсдсассає 6бо асаєєєссад аадесаєддаа баєєдааааа адздсссддсеєс ссдсЯяєсссодас; сддасесаасс 720 сааєссаасає сдЕсаєсєстаа даадддаааад додсодадааа агдсеЕєсстає Саадаадссяе 78о садаєдсасоаєда деЕссасссссассссаадді ддааєсдсада сасеєсдеєєда сасааєдедс 840 ааасадсеєєд деЕЧдаадаєда асесааассс садсдсєдадда СдсеЕдЕсссЕс дессагсаєаас 900 садаадддда Сссссессасс адддааєсдуда ссадесеєсес стаєдеесааа саасассаде 960 чаачдаєсаає сеЕсСаєдаєдс ЕдЕдЯдєЕдЕеЕсС аседсессаа сЕСУдсааєсує сааадаааєд 1020 аадаєсаєда аасеєсодааа Єссаєстєсса сеЕсЧдасесєса єсссададдеі дасдеасдаєа 1080 ссссЕвсссу Есаєдаєсас єдсаєєсааа ааддаєааад Едаададасс сєсеЕсдаддаас 1140
ЕЕСсСдддадеєс єваєссссєс бааададсаа сасааєддас Єдаадасесь Еддсасеєта 1200
СЕС ЕсСсЕССа ЄдавєдеЕсеєсс Едаєсудєдсе ссаєсеєдаса ЕДЕДдДЕСЕСсСЕЕ гассасаєье 1260
ЧдЕсддаддаа дсадааасад аааасесєдса аасусеЕссаа судаєдааєсе даадсаааєа 1320 (516) ЧФЕЄЕСЕЄСвУЧд ассеЕссадса дсЕДдЕсСоОддадс ассдаддасу аассеєсасєє єдеЕСааєсає 1380 сЕСЕЄЕеЕсоОдда дсаасдсаєе сссаєеєднає ддасасааєе асчарссьдеЕ ЕсЕЧЧададсе 1440 асадасаада Єддаааадда ЕСЕЄсСстдда СЄЕСЕсСЕеЕсаєд саддєаасса гаадоддеЕддва 1500 сЕсЕСадеду даааадсдає ддссЕсСсуда Едсааддсвєд сддаасеЕсдєс аасаєсстає 1560 сЕддасеєссс асасасасує даадаєддає дадаадассу сдеаа 1605 «2105 2 «2115 534 «212» РЕТ «2135 Аштшагапеєйпив ЄпрексміаєЄит «4005 2
Меє Уаї Іїе сіп бек І1їе ТПг Нів Гей бек Рго АвБп Тец Аїа Гей Рго 1 5 10 15 зек Рго Гец бек Уаії бек ТПг Гпув Авп о Тук Рго Уаі Аїа Уа1і Меє Щ1У
Ап о І1е бек біц Агд бій бій Рко ТПг бек Аїа Гпув Агуд Уаі1 Аїа Уаї
Ууаї с1у Аза сіу Уа1 бек сіу геш Аїа Аза Аїа Тук їпув ІТецй Гув бБекг бо 20 Нів с1іу Гей бек Уаї ТПг Гей Рбе сій Аза Авр б5ег Агд Аїа с1іу с1Уу 65 70 75 80
Тпув ТГешп Гпув ТПг Уаї Ппув пув Авр с1іу Рпе Іїе Тер Ар сбіц сС1у Аїа 85 90 95
АвпоТПг Месє ТПг біц бек бій Аїа біц Уаї бек бек Гей Іїе Авр Авр 25 100 105 110
Тец б1у Гей Агуд бій Ппув біп біп Гей Рго Іїе Бек біп Авп Гув Агд 115 120 125
Туг Іїе Аїа Агуд Авр біу ІТецп Рго Уаії Гец Іец Рго бек АБп Рго Аїа 130 135 140
Зо А1їа Гечп Гей ТіПг бек АвБп о І1їе Гей бек Аїа Гуз бек Ппув ІТей сбіп Те 145 150 155 160
Меє гей бій Рго Рбе Гей Тгр Агуд пуб Нів АвБп Аза ТПг бій Гец 5ег 165 170 175
Авр сій Нів Уаі! біп біц бек Уаі сб1у бій Рпе Рпе сіц Агд Нів РБПе
З5 180 185 190 сб1у гув бій Рпе Уаі Авр Тук Уаі Іїе Авр Рго Рпе Уаії Аїа с1у ТЕПг 195 200 205
Сув б1у б1у Авр Рго біп бек Гей бек Меє Нів Нів ТПг Рпе Рго с1ци 210 215 220 40 Уаї ТЕр АБп чІ1їе бій Гпув Агуд Рпбе сіу бек Уаі Ррбе Аїа с1у Гей І1е 225 230 235 240 біп бек ТПг Гей Гей бек Ппув пув бій пув біу б1у б1п АБп Азїа 5ег 245 250 255
ІТІе пув пув Рго Агд Уаі Агуд біу бек Рпе бек Рпе сбіп сіу с1у Меє 45 260 265 270 біп Тпг Гей Уаі Авр ТПг Меє Сув пув біп Гїец б1у б1п АвБр сі Гей 275 280 285
Тпув Ге біп Сув бі Уа1 Гей бек Гей бек Туг Авп біп Пув С1у І1е 290 295 300 50 Рго Бек Гей б1іу АБп Тгр бек Уаі1 бек бек Меє бек Авп АвБп ТПг 5ег 305 310 315 320 бі Авр біп бБег Туг Авр Аїа Уаі Уаі Уаі ТПг Аза Рго І1е Агд Авп 325 330 335
Уаї пув бі Меє пув Іїе Месє пуб Роре б1у Авп Рго РПе бек Гей Авр 55 340 345 350
Рпе Іїе Рго біц Уаї ТПг Тук Уа1ї Ркго Іїецй бек Уаі Меє Іїе ТПг Аї1а 355 3З6о 365
Рпе пув пув Авр о Гуз Маії Гув Агуд Рго Гей біц сіу Рбе сіу Уаї Іей 370 375 380 (516) І1їе Рго бек Ппув біц сбіп Нів Авп сіу Тем Гпув ТПг Гей с1у ТБбг Ієцй 385 390 395 400
Рпе бек бек Месє Меє Ррпе Рго Авр Агуд Аза Рго бек Авр Меєсє Сув Іей 405 410 415
Рпе ТПг ТіПг Рре Уаї б1у сі1у Бек Агд АБп Агд Гув Гей Аїа Ап Аїа 420 425 430 зек ТПг Авр бій Ге Ппув сіп І1е Уаї бек бек Авр Гей сіп сіп Іецй 435 440 445
Тец б1у ТпПг бій Авр бій Рго Бек Рпе Уаі Авп Нів Гей Рібе Тгр 5ег 450 455 460
Ап Аза РіПе Рго Іецй Тук б1у Нів Авп Туг Авр бек Уаі Гей Агуд Аїа 465 470 475 480
І1е Авр пув Меє біцп Гув Авр Тец Рго б1у Рпе Рпе Туг Аїа с01у Авп 485 490 495
Нів пув сіу сіу Пец бек Уаі сіу Ппув Аїа Месє Аза бек с1Уу Сув Гув 500 505 510
А1а Аї1а сій Іей Уаї І1їе бек Тук Гей Авр бек Нів І1е Тук Уаї Тув 515 520 525
Меє АвБр бій пув ТПг Аї1а 530 «2105 З «2115» 1605 «2125 ДНК «213» Ашакапеєйпив Єпрексиіаєсив «4005 З аєддеєааєсєс ааєссаєвтас ссасссссса ссааассссд сассдссаєс дссаєссдесса бо дЕсЄсаасса адаастассс адгадссдса асдддсааса ССсСссдадсо ддаадаассс 120 асЕєсєдсвта ааадчддеЕєдс ЄЕЧЯЧЕЄЧЇЕСсоодЕ дссддадесса дсддасессдс сдседсатгає 180 аадсєаааає сссаєдУєєє дадедсдаса ССдсссдаад седасєсссад адссддаддас 240
Зо ааасєсаааа сЕдссааааа ачасоддесеє аєєсодоаає адддоддсааа бассаєдаса Зоо чааачдеєдадуд сададдеєсес дадеЕсєеєдаєс даєчаєсьєвда ддсеЕсєсдрда даадсаасад 3З6о
Еєдссааєеє сасаааасаа аадаєасаса дссададссу дсЕсссссодес дссастассяо 420
Есаааєсссуд сеЕдсастрасе сасдадсаає асссссссад саааассааа дссдсааасс 480 аєдеЕєддаас саєєєсеєстьд дадаааасас аасдссассд аасЕссссда Єдадсаєсаєс 540 саддааадся ЕсСодЕЧЯЧааєє єсЕеЕсдадсда саєєєєдоада аададесеЕсоє єдаєсаєдес 6боо аєєдасссЕє єєЧдЕеЕєЧдсоодуа басаєдсддс ддадассссс аассдЯяссссс саєсдсассає 6бо асаєєєссад аадесаєддаа баєєдааааа адздсссддсеєс ссдсдсссдс соаоадасесаасєсс 720 сааєссаасає сдссасссаа дааддаааад ддсддадааа асдсссстає сСаадаадссс 78о0 садаєдсасоаєда деЕссассссс ассссаадде ддааєсдсада сасеєсдеєєда сасааєдедс 840 ааасадсеєд дЕдаачаєда асесааасес садсдеЕЧчада СЄдсЕдсссЕс деЕСагаєаас 900 садаадддда Сссссссасс адддааєсдда ссадеЕсеєсьс сртаєдеесааа гбаасассадес 960 чаачдаєсаає сеЕсаєдаєдс ЕдЕЧ9ЧєЕдЕеЕС асесдсессаа ЕЄСсСдсааєдЕ сааадаааєд 1020 аадчаєстаєда аасеЕсоддааа Ессаврсвесса сеЕсЧдасесса ЕєсСсададде дасдбєасдаєа 1080 ссссЕвсссу Есаєдаєсас єдсаєєсааа ааддаєааад Едаададасс сєсеЕсдаддаас 1140 сЕСОДДадеЕєс Єваєссссєс ааададсаа саєааєсдодас Сдаадасеєсеє Єддрасееса 1200
СЕС ЕсСсЕССа ЄдавєдеЕсеєсс Едаєсдедсесс ссаєстєдаса ЕДЕДдДЕСЕСсСЕЕ гассасаєете 1260
ЧдЕсддаддаа дсадааасад аааасесєдса аасусеЕссаа судаєдааєсе даадсаааєа 1320 чдЕСЕСЕЕеСсСвдд ассеЕссадса дсеЕдЕсддадс ассдаддасу аассеЕєсасе гЕдЕСвяаєсає 1380 сЕСЕЄЕсоОдда дсаасдсаєе сссаєеєднає ддасасааєе асчарсссудсє сеЕсдададесс 1440 асадасаада Сддаааадда ЕСЕЄССЕдда СЕСЕСсСЕеЕсасд саддсаасса гаадодеЕдвда 1500 сЕсЕСадеду даааадсдає ддссЕсСсуда Едсааддсвєд сддаасеЕсдєс аасаєсстає 1560 сЕддасеєссс асасасасує даадаєддає дадаадассу сддєаа 1605 «2105 4 «2115 534 «2125 РЕТ «2135 Аштшагапеєйпив ЄпрексміаєЄит 60 «4005 4
Меє Уаї Іїе сіп бек І1їе ТПг Нів Гей бек Рго АвБп Тец Аїа Гей Рго 1 5 10 15 зек Рго Гец бек Уаії бек ТПг Гпув Авп о Тук Рго Уаі Аїа Уа1і Меє Щ1У 20 25 30
АвБп отІ1е бек бій Акуд бій бій Рго ТПг бек Аїа пув Агуд Уаі А1їа Уаї 35 40 45
Ууаї с1у Аза сіу Уа1 бек сіу тей Аїа Аза Аїа Тук пуб ІТецй пув бБег 50 55 бо
Нів сіу Гей бек Уаї ТПг Іец Рбе біц Аза Авр б5ег Агуд Аїа б01у Щ1У 65 70 75 80
Тпув ТГецшп Гпув ТПг о Уаії пув пув Авр с1у Рпе Іїе Тер Авр сбіц сС1у А1а 85 90 95
АвпоТПг Месє ТПг біц бек бій Аїа біц Уаї бек бек Гей Іїе Авр Авр 100 105 110
Тем бі1у Ггеш Агд сій Пув біп біп Гей Рго Іїе бек біп АвБп Гпув Агд 115 120 125
Ту Іїе Аїа Агуд Аїа сіу Іецп Ркго Уаії Гец Іец Рго бек АБп Рго Аїа 130 135 140
А1їа гей Ггец ТіПг бек АвБп о І1е Гец бек Аїа Гпув Бек Кпув Гей сбіп І1е 145 150 155 160
Меє гей бій Рго Рбе Гей Тгр Агуд пуб Нів АвБп Аза ТПг бій Гец 5ег 165 170 175
Авр сій Нів Уаі! біп б1іц бек Уаі сб1у бій Рпе Рпе бій Агуд Нів Ріе 180 185 190 сі1у пув біц Рпе Уаії Авр Туг Уа1і І1їе АБр Рго Рпе Уаі! Аїа с1у Тіг 195 200 205
Сув б1у б1у Авр Рго біп бек Гей бек Меє Нів Нів ТПг Рібе Рго бій 210 215 220
Уаї ТЕр АБп Іїе сій пув Агуд Рпе сіу бек Уаі Роре Аїа с1у Те Ше
Зо 225 230 235 240 біп бек ТПг Гей Гей бек Ппув Ппув бій пув с1іу с1у бій АвБп Аїа 5ег 245 250 255
ІТІе пув пув Рго Агд Уаі Агуд біу бек Рпе бек Рпе сбіп сіу с1у Меє 260 265 270 сбіп Тк Гец Маії Авр ТПг Меєсє Сув Ппув біп Гецп с1і1у бій Авр сій Гей 275 280 285
Тпув Ге біп Сув бі Уа1 Гей бек Гей бек Туг Авп біп Пув С1у І1е 290 295 300
Ркго Бек Гец біу Авп Тгр бек Уаі! бек бек Меє бек Авп Авп ТПг 5бег 305 310 315 320 бі Авр біп бБег Туг Авр Аїа Уаі Уаі Уаі ТПг Аза Рго І1е Агд Авп 325 330 335
Ууаї пув біш Меє пув Іїе Месє пув Рбе с1іу Авп Рго РоПе бек Гей Авр 340 345 350
Рпе Іїе Ркго біц УМаії ТПг Тук Маї Ркго Іей бек Уа! Меє І1е Тібг А1а 355 36о0 365
Рпе пув пув Авр Гуз УМаї Гув Агд Рго Іїецп бій с1іу Рпе сіу Уаі1ї Іец 370 375 380
ІТ1е Рго Бек пув біц біп Нів Авп о біу Гей Гпув ТПг Ге с1у ТПг ГІец 385 390 395 400
Рпе бек бек Мес Меє Рпе Рго Авр Агуд Азїа Рго бек Авр Меє Сув Іец 405 410 415
Рпе ТПг ТіПг Рре Уаї б1у сі1у Бек Агд АБп Агд Гув Гей Аїа Ап Аїа 420 425 430 зек ТПг Авр бій Ге Ппув сіп чІ1е Уаії бек бек Авр Гей сіп сіп Іецй 435 440 445
Тец б1у ТпПг бій Авр бій Рго Бек Рпе Уаі Авп Нів Гей Рібе Тгр 5ег 450 455 460
Ап Аза РіПе Рго Іецй Тук б1у Нів Авп Туг Авр бек Уаі Гей Агуд Аїа (516) 465 470 475 480
І1е Авр пув Меє біцп Гув Авр Тец Рго б1у Рпе Рпе Туг Аїа с01у Авп 485 490 495
Нів пув сіу сіу Пец бек Уаі сіу Ппув Аїа Месє Аза бек с1Уу Сув Гув 500 505 510
А1а Аї1а сій Іей Уаї І1їе бек Тук Гей Авр бек Нів І1е Тук Уаї Тув 515 520 525
Меє АвБр бій пув ТПг Аї1а 530 «2105 15 «2115» 1602 «2125 ДНК «213» Ашакапеєйпив Єпрексиіаєсив «4005 15 аєддеєааєсєс ааєссаєвтас ссасссссса ссааассссд сассдссаєс дссаєссдесса бо дЕсЄсСсасса адаассассс адсадссдса асдддсааса ССсСссдадсд адаадаассс 120 асЕєсєдсвта ааадчддеЕєдс ЄЕЧЯЧЕЄЧЇЕСсоодЕ дссддадесса дсддасессдс сдседсатгає 180 аадсєаааає сссагдзусєеєє дадсдеЕдаса СЕЧЯСсСсСеєЧдаадд ссдаєсєсстад адсєддадоас 240 ааасеєсаааа сЕДдЕеЕсааааа ачаєдчдсссс ассеєдодаєд аддаддоадсааа Сассаєдаса Зоо чааачдеєдадд сададдеєсеєс дадеЕсєсдаєс даєдассссд ддссссдасда даадсаасад З6о
Еєдссааєеє сасаааасаа аадаєасаса дссададасуд дсЕсссссодес дссастассяо 420
Есаааєсссуд сеЕдсастрасе сасдадсаає асссссссад саааассааа дссдсааасс 480 асдЕєддаас сассєсссту дадаааасас аагдсстассдд аасЕсєсстда єдадсасдаєве 540 саддааадсу ЕсоодЕЧЧааєє ЕсЕеЕєсЧдадсда саєєеєєдоада аачадчзеЕеЕсЧє єдаєсваєдцьсе 6боо аєєдасссЕє єєЧдЕеЕєЧдсоодуа басаєдсдда дасссссааєс сддссссссає дсассасбаса 6бо бЕєсСсадаад баєддаасає єЄдаааааадд СССддсСЕеЕсСсЯ сЯсссоссдда ассааєсссаа 720
ЕсаасаєєдеЕ баєсєаадаа ддааааддді ддадаааасд ссЕссстаєссаа даадссосді 78о
Зо чдсасуаєдууєс сасстєеєсаєе сСсааддсєдчда абдсадасас ЄсдЕсЄдасас аасдедсааа 840 садсссддаєд аадаєдаасс сааассссад єдЕЧдаддеєдс єдЕССЕрдЕСсС агагсаассад 900 аадддадаєсс ссеєсаєсадуа дааєєддесса дсссссссста сдссаааєсаа сСассадесдаа 960 чаєсааєсьс аєдаєсдседЕ ддЕсєдЕСасі дссссааєсс дсааєдеЕсаа адаааєдаад 1020 аєсаєдааає ЄЕддаааєсс асєсесасьс дасеЕстаєсс сададдедас дсасудбсассс 1080 сСЕЄЕСсСсСдєса єдастассдс аєєссааааауд дчаєаагдеєда ададассеєсе єдадоадсесес 1140 ччадеЕєсева ЄссссеЕСсСтаа ададсаасає аасодаседа адасеєсесвдуа гасеесаєвте 1200
ЕссеЕсССсСаєда ЄЧЯсЕсССсСсСЕДда ЕсудєдсЕеЕсСса ЄседасаєдеЕ дЕСЕСЕЄвас гасаєседес 1260 чдаддаадса дааасадааа асеЕєдсааас дссєсаасдуд аєдааєєсдаа дсаааєсадее 1320
ЄсЕесседасс сЕСадсадсеЕ дЕсєдддсасі даддасдаас сеЕсСсСавєєвдеЕ сааєссаєсьс 1380
ЄЕсЕдддадса асдсаєсссс асєдсаєдда сасааєсасу асєсдеЕдеЕеЕсеЕ дададссаєа 1440 часаачдаєдд ааааддаєсеЕ Ессеєддасєьс сеЕсСваєдсад деЕаассаєаа доадесддасьє 1500
Есадєедддаа аадсдаєддс сЕССддаєдс ааддсеєдсдд аасеЕеЕдеєаає аєсстаєсьд 1560 часеЕСсЕсава басасуєдаа даєддаєдад аадассдсдЕ аа 1602 «2105 6 «2115 533 «2125 РЕТ «2135 Аштшагапеєйпив ЄпрексміаєЄит «4005 6
Меє Уаї Іїе сіп бек І1їе ТПг Нів Гей бек Рго АвБп Тец Аїа Гей Рго 1 в) 10 15 зек Рго Гец бек Уаії бек ТПг Гпув Авп о Тук Рго Уаі Аїа Уа1і Меє Щ1У 20 25 30
Ап о І1е бек біц Агд бій бій Рко ТПг бек Аїа Гпув Агуд Уаі1 Аїа Уаї 35 40 45
Ууаї с1у Аза сіу Уа1 бек сіу геш Аїа Аза Аїа Тук пуб ІТецй пув бБег 50 з9 (210) (516) Нів с1іу Гей бек Уаї ТПг Гей Рбе сій Аза Авр б5ег Агд Аїа с1іу с1Уу 65 70 75 80
Тпув ТГецшп Гпув ТПг о Уаії пув пув Авр с1у Рпе Іїе Тер Авр сбіц сС1у А1а 85 90 95
АвпоТПг Месє ТПг біц бек бій Аїа біц Уаї бек бек Гей Іїе Авр Авр 100 105 110
Тем бі1у Ггеш Агд сій Пув біп біп Гей Рго Іїе бек біп АвБп Гпув Агд 115 120 125
Туг Іїе Аїа Агуд Авр біу Тец Ркго Уаії Ггец Гец Рго бек АБп Рго Аї1а 130 135 140
А1їа гей Ггец ТіПг бек АвБп о І1е Гец бек Аїа Гпув Бек Кпув Гей сбіп І1е 145 150 155 160
Меє гей бій Рго Рпе Гей Тгр Агуд пуб Нів АвБп Аза ТПг бій Гей б5ег 165 170 175
Авр сій Нів Уаі! біп б1іц бек Уаі сб1у бій Рпе Рпе бій Агуд Нів Ріе 180 185 190 сі1у пув біц Рпе Уаії Авр Туг Уаі1і Іїе АвБр Рго Рпе Уаі Аза с1у Тібг 195 200 205
Сув б1у Авр Рго біп Бек Гей бек Меє Нів Нів ТПг Рібе Рго сій Уаї 210 215 220
ТЕр Авп І1е сіц пув Агуд Рпе сіу бек Уаі Рпе Аза сС1іу Гец І1е сіп 225 230 235 240 зек ТПг Гец Тец бек Гув Гпув біц Гуз б1у б1у бій Авп Аїа бек І1е 245 250 255
Тув Гув Рго Агуд Уаі Агу сіу Бек Рпе Бек Рпе біп б1у сб1у Меє сіп 260 265 270
ТПЕ Гецп Уаії Авр ТПг Мес Сув Ппув біп Гей с1і1у бій Авр сій Геч Тув 275 280 285
Тец біп Сув бій Уаії Гей бек Гей бек Туг АвБп о біп Гув б1у Ше Рго 290 295 300 зек Гей біу Авп Тгр бек Уаі! бек бек Меє бек Авп Авп ТПг бек сіц
Зо 305 310 315 320
Авр сбіп бек Тут Авр А1їа Уаї Уаії Уаії ТПг Аїа Рго І1е Агд Авп Уаї 325 330 335 їпув бі Меє Ппув Іїе Меє пув Рпе с1іу Авп Рго Рпе бек Гей Авр РіПе 340 345 350
І1їе Рго біц Маї ТПг Тук Уаї Рго Гей бек Уа! Меє І1е ТПг Аза Ріе 355 3З6о 365
Туз Гув Авр о пув Уа1і Ппув Агуд Рго Гей біц сіу Рпе сіу Уаї Іецй І1е 370 375 380
Ркго Бек пув біц біп Нів Авп сіу Гей Ппув ТПг Гей с1іу ТПг Іецй РБе 385 390 395 400 зек Бек Меєсє Месє Рпе Рго Авр Агд Аза Рго бек Авр Меє Сув Гей Ріє 405 410 415
ТПг ТпПкЕ Рбе Уаї сіу сбіу Бек Агуд АвБп Агуд гув Гей Аза Ап Аїа б5ег 420 425 430
ТПЕ Авр бій Гей пув сбіп Іїе Уаї Бек бек Авр Гей сбіп сіп Ге Іец 435 440 445 бі1у ТПпгЕ бій Авр бій Рго бек Рпе Уаії Авп Нів Іец Рпе Тгр бек Авп 450 455 460
Аза Рпе Рго Гец Тук б1у Нів Авп Туг Авр Сув Уаі Гей Агуд Аїа Те 465 470 475 480
Авр пув Меє біц Гпув Авр Тецй Рго сіу Рпе Рпе Туг Аза с1у Авп Нів 485 490 495 пув б1і1у с1у Гей Бек Уаі1і сіу пув Аїа Меє Аїа бек сіу Сув ТУув А1а 500 505 510
А1ї1а сій Гецп УМа1! І1е бек Тук Гей Авр бек Нів І1е Тук Уаї туз Мес 515 520 525
Авр сій пуб ТПг А1а 530 60 «2105 7
«2115» 1602 «2125 ДНК «213» Ашакапеєйпив Єпрексиіаєсив «4005 7 аєддеєааєсєс ааєссаєсас ссассеєссса ссааассеєсд саєєсдссаєс дссаєєдвесса (216) дЕсЄсСсасса адаассассс адсадссдса асдддсааса ССсссдадсд ддаадаассс 120 асЕєсєдсвта ааадчддеЕєдс ЄЕЧЯЧЕЄЧЇЕСсоодЕ дссддадесса дсддасессдс сдседсатгає 180 аадссаааає сссагєдЧєєеє дадедсдаса ССЯосссдаад ссааєссссад адсгеддаддс 240 ааасєсаааа сЕдссааааа ачасоддесеє аєєсодоаає адддоддсааа бассаєдаса Зоо чааачдеєдадд сададдеєсеєс дадеЕсєсдаєс даєдассссд ддссссдасда даадсаасад З6о
Еєдссааєеє сасаааасаа аадаєасаса дссададасуд дсЕсссссодес дссастассяо 420
Есаааєсссуд сеЕдсасрасе сасдадсаає асссеЕсссад сааааєсааа дссдсааассе 480 аєдеЕєддаас саєєєсестьдд дадаааасас аасдссассд аассссссда Сдадсаєсдєс 540 саддааадся ЕсСодЕЧЯЧааєє єсЕеЕсдадсда саєєєєдоада аададесеЕсоє єдаєсаєдес 6боо асєєдасссЕє єєЧдЕеЕєЧдсоодоа басаєдсдда дасссссаає сдссссссає дсассасаса 6бо бЕєСсСсадаад баєддаасає єдаааааадд СССоОдсссСсд СсоЯсссооссдда ассааєсссаа 720
ЕсаасаєєдеЕ баєсєаадаа ддааааддді ддадаааасд ссЕссстаєссаа даадссосді 78о чЧЕасчдєдаєеє саєєеєеєсаєе єсааддсдда асдсадасас ссдссдасас аасдсдсааа 840 садссгдуаєсд аачаєдаасоі сааасєссад СдчЕДдадаєдс СЄдЕСССЄЧЯЕС абасаассад 900 аадддадаєсс ссеєсаєсадуа дааєєддесса дсссссссста сдссаааєсаа сСассадесдаа 960 чаєсааєсьс аєдаєсдседЕ ддЕсєдЕСасі дссссааєсс дсааєдеЕсаа адаааєдаад 1020 аєсаєдааає сСЕддаааєсс авсеЕссасьс дасеЕєваєес сададдєдас деасдбрассс 1080 сЕЕЕССсСЯдєса Едаєтассдс асеєсааааад даєааадеєда ададассєсс сдадддсесеес 1140 чдчадеЕєссва ЄссссеЕСсСтаа ададсаасає аасодасеєда адасссстда бассесасеє 1200
ЕссеЕсССсСаєда ЄЧЯсЕсССсСсСЕДда ЕсудєдсЕеЕсСса ЄседасаєдеЕ дЕСЕСЕЄвас гасаєседес 1260 чдаддаадса дааасадааа асеЕєсдсааас дсЕссаасуд аєдааєєдаа дсааатрадсе 1320
ЄсЕесседасс сЕСадсадсеЕ дЕсгдоддсасі даддасдаас сеЕсСсСавєєвдеЕ сааєссаєсьс 1380 гЕседдадса асдсаєсссс асєдсаєдда сасааєсасу аєєсЕдеЕсЕ дададссаєа 1440
Зо чдасаачаєдуд ааааддаєсеЕ Ессєддасєс сеЕсСваєдсад десаассаєаа ддаєсодассе 1500
Есадєедддаа аадсдаєддс сессддаєдс ааддседсд аасеЕєдеєаає ассстаєсьд 1560 часеЕСсЕсава басасуєдаа даєддаєдад аадассдсдЕ аа 1602 «2105 8 «2115 533 «2125 РЕТ «2135 Аштшагапеєйпив ЄпрексміаєЄит «4005 8
Меє Уаї Іїе сіп бек Іїе ТПг Нів Гей бек Рго АБп Гецп Аїа Іецй Рго 1 в) 10 15 зек Рго Гец бек Уаії бек ТПг Гпув Авп о Тук Рго Уаі Аїа Уа1і Меє Щ1У 20 25 30
Ап оІ1е бек біц Агд б1іц бій Рго ТПг Бек Аза пув Агуд Уаії А1їа Уаї 35 40 45
Ууаї с1у Аза сіу Уа1 бек сіу геш Аїа Аза Аїа Тук пуб ІТецй пув бБег з9 (210) 50 Нів с1іу Гей бек Уаї ТПг Гей Рпе бій Аза Авп б5Бег Агуд Аїа с1іу с1Уу 65 70 75 80
Тпув ТГецшп Гпув ТПг о Уаії пув пув Авр с1у Рпе Іїе Тер Авр сбіц сС1у А1а 85 90 95
Ап оТПг Месє ТПг о біц бек бій Аза біц Уаї бек бек Гей Іїе Авр Авр 100 105 110
Тец б1у Гей Агуд бій Ппув біп біп Гей Рго Іїе Бек біп Авп Гув Агд 115 120 125
Туг Іїе Аїа Агуд Авр біу ІТецп Рго Уаії Гец Іец Рго бек АБп Рго Аїа 130 135 140 (516) А1їа Гечп Гей ТіПг бек АвБп І1їе Гей бек Аїа Гуз бек Ппув Гечп біп І1е 145 150 155 160
Меє гей бій Рго Рбе Гей Тгр Агуд пуб Нів АвБп Аза ТПг бій Гец 5ег 165 170 175
Авр сій Нів Уаі! біп б1іц бек Уаі сб1у бій Рпе Рпе бій Агуд Нів Ріе 180 185 190 сі1у пув біц Рпе Уаії Авр Туг Уа1і І1їе АБр Рго Рпе Уаі! Аїа с1у Тіг 195 200 205
Сув б1у Авр Рго біп Бек Гей бек Меє Тук Нів ТПг Рібе Рго сій Уаї 210 215 220
ТЕр АвБп чІ1е сій пуб Агуд Робе сіу бек Уаі Рре Аїа с1у їеїп Ше сіп 225 230 235 240 зек ТПг Гец Тец бек Гув Гпув біц Гуз б1у б1у бій Авп Аїа бек І1е 245 250 255
Тпув Гув Рго Агуд Уаі Агуд сіу Бек Рпе бек Рпе сіп сіу сбіу Меє сіп 260 265 270
ТПЕ Гецп Уаії Авр ТПг Мес Сув Ппув біп Гей с1і1у бій Авр сій Геч Тув 275 280 285
Те біп Сув бій Уаії Гей бек Гей бек Туг Авп біп Гув С1у І1е Рго 290 295 300 зек Гей біу Авп Тгр бек Уаі! бек бек Меє бек Авп Авп ТПг бек сіц 305 310 315 320
Авр сбіп бек Туг Авр А1ї1а Уаї Уаі Уаі ТПпг Аза Рго Іїе Агд Авп Уаї 325 330 335 їпув бі Меє Ппув Іїе Меє пув Рпе с1іу Авп Рго Рпе бек Гей Авр РіПе 340 345 350
І1їе Рго біц Маї ТПг Тук Уаії Рго Гей бек Уаії Меє чІ1е ТбПг Аза Ріре 355 360 365
Туз Гув Авр о пув Уа1і Ппув Агуд Рго Гей біц сіу Рпе сіу Уаї Іецй І1е 370 375 380
Ркго Бек пув біц біп Нів Авп б1іу Тецшп Гув ТПг Гей с1у ТпПкг Гецй Ре
Зо 385 390 395 400 зек Бек Меєсє Месє Рпе Рго Авр Агд Аза Рго бек Авр Меє Сув Гей Ріє 405 410 415
ТПг ТпПкЕ Рбе Уа1! сіу сбіу Бек Агуд Авп Агд Гув Тец А1а АБп Азїа 5ег 420 425 430
ТПЕ Авр бій Гей пув сбіп Іїе Уаї Бек бек Авр Гей сбіп сіп Ге Іец 435 440 445 бі1у ТпгЕ бій Авр бій Рго бек Рпе Уаі Авп Нів Гей Рібе Тгр 5ег Авп 450 455 460
Аза Рпе Рго Гец Тук б1у Нів Авп Туг Авр бек Уаі Гей Агуд Аїа Те 465 470 475 480
Авр пув Меє біц Гпув Авр Тецй Рго сіу Рое Рпе Туг Аза с1у Авп Нів 485 490 495 пув б1і1у с1у Гей Бек Уаі1і сіу пув Аїа Меє Аїа бек сіу Сув ТУув А1а 500 505 510
А1ї1а сій Гецп УМа1ї І1е бек Тук Гецп Авр бек Нів І1е Тук Уаї Гуз Мес 515 520 525
Авр сій пуб ТПг А1а 530 «2105 19 «211» 1644 «212» ДНК «213» Агарідорвів Епаі1їіїапа «4005 9 аєдддссеєда Єсааааасдд басссссстає сдссчєссссд ддаєсаадссдд даассссдесс бо
ЧСЕЧФЕЯЧЕВЕЄ ЄЕсССсСасеса ЕсЕССсСЯдЕСас СдсСЕсЕСсСдас ЄддЕСадада ЕсСЕЄсЧЯЧасесе 120 чааєєдеЕєдс адаєсадсаає додсодєссдда дсадсадсад ассаєссааає Сдаадсоддсс 180 (516) Есаддааава чадссодсадеЕ сдгаддедса доаоєдсаадсуд дасеЕсдсоддс ддсеЕгасаад 240
Еєдаааєсда додає сєдаа ЄЧдЕеЕЧЧассдесд ЄсСсдаадссдд асддаададі аддсдддаад Зоо
Еєдадаадед Єсаєдсаааа ЄдЧдЕсєсдаєсс соддаєсдаад дадсааасас саєдассдад З6о
ЧдсЕЧДЧадссад аадеЕєдоадад ЄЄсасссдає дассесдддсе єссЯаєЄдадаа асаасаасес 420 ссаассссас адааааадсуд дсасаєєсддвд содааєдудаєд гасседеєдає дстасстасс 480 ааєсссаєад адсєддеЕсас аадесадсдєд ссссссассс аасссаадес Ссааваєсєсєд 540
Есддаассає єесСсаєддаа дааааадссс Ссаааадссе садаєдсаєс гдссдаадаа 6боо адеЕдесаадсу адзеєссеЕсесса асоассаєєсс ддасаададд ССдДдссдасста ссесаєсдас 6бо сСсСЕсссооєссд дсддаасаад Сдссдсодддас сседарєсссс ЕЕЕсСааєдаа дсаєсессьес 720 ссадасєсєсс ддаасадеЕсс содссстаєс асадесесоддбнд сааєссадаас ааадеЕссдсяе 78о чдсЕаааддеєд деаааадсад адасасааад адсссссссд дсасааааааа чадесссасає 840 чадЕСАЄЕСС сЕСсСтаадод додааєдсад арсєссеєсссту асасуєєдчед саааадссяс 900
Есасаєдаєд адаєсааєєє адасеєссаад дсассссссс сооссссасаа СсСсСсддаєса 960 ачасаддада ассддеЕСсаєсе ассЕсдеЕдес ссдсаєааєд ааасдсадад асаааасссс 1020 саєвтаєдаєд седсЕсСсЕсСЕ деЕдсааєдед ааддадаєда аддесгаєдаа аддаддасаа 1080 сссЕсЕСадс гааасеЕесся ссссдадасе ааєссасаєдс сссесссдудеЕ сЕсааєсасс 1140 асаєєсасаа аддадааадеї ааададассє сеЕсдааддсеЕ Еєдддабасе саєсссаєсяе 1200 ааддадсааа адсасудеЕсе саааасесвта дудасасасеЕсеє єеєссаєсаає даєдеЕвссса 1260 чаєсдеЕєссс сеадесдасає Есаєсстасає асаасеЕсеєса ЕєодЧдЕдоддад гаддаассад 1320 чаасвєадсса аадссессас Едасдааєста ааасаадеєєд Єдасеєеєсьда ссеЕссадсда 1380 сЕдЕєЯддаду Есдаадудєда асссуєдЕеЕсь дссаассаєе асвраєсдддад дааадсаєес 1440 ссдЕсдсаєсдд асадсадста єдасесадес асддаадсаа ЄсСдасаадає дчдадааєдає 1500 сеассЕдддЕ ЕСЕЄСсаєдс аддєааєсає сдаддддддсес ЕСЕСЕДЕсду даааєсааєва 1560 чдсаєсаддЕесє дсааадсадс Едассеєєдед аєсеЕсасасс ЕддадеЕСьск сессаааєдасєс 1620 аадааассаа аєдасадссє асаа 1644 «2105 10 «2115 547 «2125 РЕТ «213» Агарідорвів Епаі1їіїапа
Зо «4005 10
Меє с1у Гей Іїе пув Авп сіу ТпПг Гей Туг Сув Агкд Рпе б1у І1е 5ег 1 в) 10 15
ТЕр Авп Рпе Аза Аїа Уаї РПе РібПе бек ТПг Туг Рпе Агуд Нів Сув Ре
З5 20 25 30
Акуд Гей Уаії Агуд Авр Рпе Авр бек біцш Іецй Іїейп сіп Іїе Аїа Меє Аї1а зек с1іу Аїа Уаі Аза АвБр Нів сіп І1е бій Аїа Уа1! бек с1у пуб Агд з9 (210) 40 Уа1ї1 Аїа Уаї Уаї с1у Аїа сі1у Ма1! бек сбіу Гей Аїа Аїа А1їа Тук Гув 65 70 75 80
Тецшц Гпув Бек Агуд с1іу Гей Авп Уа1! ТБПг Уаії Рре б1іц Аза АвБр с1у Аг4д 85 90 95
Ууаї сі1у с1у Ппув Гей Агуд бек Уа1і Меє сіп Авп б1і1у Іец І1е Тгр Авр 45 100 105 110 бі б1у Аза АвБп ТПг Меє ТПг сій Аза бій Рго сій Уаї сіу бек Іей 115 120 125
Тец Авр Авр Гей с1іу Гей Агуд бій Ппув біп біп Рбе Рго І1е бек біп 130 135 140 50 пув Ппув Агуд Тук Іїе Уаі Агуд АвБп сіу УМаі Рго Уа1і Меє Тецй Рго Тіг 145 150 155 160
Авп оРго І1їе біц Гец Уа1і! ТПг бек бек Уаі Іец бек ТПг сіп Бек Гув 165 170 175
Рпе сіп І1е Іецшц Іїецй бій Рго Рпе ІТецй Тер Ппув Пув Ппув бек бек Гув 180 185 190
Уаї Бек Авр Аїа бек Аїа біц бій бек Уаї бек біц Рпе Рпе сіп Аг4д 195 200 205
Нів Рпе сіу сбіп біц Уаї Маі1і Авр Тук Іец І1е Авр Рго Рпе Уа1і1 0Щ1У 210 215 220 (516) сіу ТПг Бек Аза Аїа Авр Рго Авр бек Гей бек Меє Гуз Нів бек РІе 225 230 235 240
Рго Авр Гец Тгр АвБп бек Рпе сіу бек І1е І1е Уаі сС1у Аїа І1е Агд 245 250 255
ТПг пув Рпе Аза Аїа пув сіу сіу Ппув бБекг Агд Авр ТПг Гув бек бег 260 265 270
Рго с1у ТБг Ппув Ппув сіу Бек Агуд сіу бек Рібе бек Рпе пув с1і1у 01Уу 275 280 285
Меє сіп І1їе Гей Рго Авр ТПг Гей Сув Ппув бек Гей бек Нів АБр сі1ци 290 295 300
І1е Авп Гец Авр бек КГув Уаії Іец бек ТІГецй бек Туг Авп Бек сіу б5ег 305 310 315 320
Акуд біп біц Авп о Тгр о бек Гей бек Сув Уаії бек Нів АвБп бій ТПг сіп 325 330 335
Акуд біп Авп о Рго Ні Туг Авр Аїа Аза Рго їецп Сув Авп Уа1і Ппув сіц 340 345 350
Меє гув Маї Меє пув сіу сб1у біп Рго Рпе сіп Тецй Авп Роре Гей Рго 355 360 365 бі І1е АвБп Тук Меє Рго Гей бек Уаі Гей І1їе ТПг ТіПг Рое ТПг Гу 370 375 380 бі гув Маї пув Агуд Рго Гей сі с1іу Рпе сіу Уа1! Гей І1е Рго 5ег 385 390 395 400 пув бі біп Ппув Нів сб1у Рпе Ппув ТПг Гей сіу ТПг Гей Рібе бег 5ег 405 410 415
Ме Меє Рпе Рго Авр Агуд бек Рго бек Авр Уаї Нів Іецй Тугє ТПг ТПг 420 425 430
Рпе Іїе сіу біу Бек Агд АвБп о біп сій Теш Аїа Ппув Аїа бек ТПг Авр 435 440 445 біш Гей пув сбіп Уаі Уа1 ТПг бек Авр Гей біп Агд Гец Гец сСіу Уаї 450 455 460 бі б1у бій Рго Уаі Бек Уа1 Авп Нів Тугк Туг Тер Агд Пув Аїа РіПе
Зо 465 470 475 480
Ркго Гец Туг Авр бек бек Туг Авр бек Уаі Меє сі Аїа І1їе Авр ув 485 490 495
Меє бій Авп Авр Гей Рго сіу Рпе Рпе Туг Аїа б1у АБп Ні5 Агд Щ1У 500 505 510 с1у Гей бек УМаї с1іу Пув бек І1їе Аїа бек сіу Сув їув Аїа Аза Авр 515 520 525
Тецп Маї І1їе бек Тук Гей бій Бек Сув Бек Авп Авр ГПув Пув Рго Авп 530 535 540
Авр бек Ієц 545 «2105 11 «2115 1647 «2125 ДНК «2135 Місобіапа барасит «4005 11 аєдасаасаа сеЕсссаєсдс сааєсаєссєї аасасєсссса сссассадесс десЕсдссаєсд бо ссассддсає ссеЕгааассду гасчадееєсс ассссссесс сеЕсСсааєстс саадсдсаає 120 адеЕдеєСсааєє дсааєдодастьд дадаасасда Сдссссдаєссд ссааадаєса сасадесссєо 180
Ессесадсудд Єсдасддсдд асссодссоаасо дадсєддасе дедеЕсасадес содадсадва 240 аєсадеЕддсс ЕсЕєдсаєєдс дсадаєдаєсд Сссдссаасс ассссаассс даєсддаєаасс Зоо чадоасдадад аєсдеєдссодд Єддсаасаса асчассдсдда ааададасдд стасєсдас9дда З6о чаачааддеЕс ссаасадесеє ссадссдсєсс даєсстаєсдеЕ Єдассаєддс адсачаседе 420 ччваєєдаадча аєчаєєєдає деЕєдЧодадає сссаасдсдсес сссЯясеЕссЯяє єссдсддваад 480 чдабаааєсаа додсссдЕссс сеЕСсаааассс ассдассєссс ссссессесесда Єссдаєсдадсе 540 агєєссеЕддса адеЕєдЧчададс єЄодсЧчЧЕЕссдддс дссассддес Сссдсссесс асссссадде 6боо саєдаддааєс садссдадса дЕссдЯдрдсаєЄ сдасааєссссд дсддсдаадс сЕссдаасдс 6бо (516) Есдаєадаас сассеЕвуєєс сСодесдЕСсСсСає дседдЕЧчаєс ссесаааасо дадсаєдааа 720 чдсадсаєєвєд ддааадеЕсєсд даадеЕсдддаа дааассддаєд дсадсаєсає сддаддаасс 78о бЕєсааадсаа баааддадад аєссадсаса сссааадсдс сссдсдаєссс дсдаєсссассяо 840 ааассаааад дасадасаде Єддаєсаєссс аддаадддіс сСсадаасдсс дссддаєдса 900 аєсадедсаа даєєдодадаад саааєсаааа ссассаєсдда адссЕссссад саєссассаад 960
Єсадааааад даддаєаєса сеЕєЄдасасас дадасассад ааддадстаде ЕссеЕсесесаа 1020 адесдаадса ЄЕдЕСсСаєдас єдЕдссаєсс гаєдесадсаа дсаасавсаєєс асудесссссе 1080
ЕсоддЕбдссуд садсадаєдс асеЕєссааає сЕСвассаєс ссссадесвду адсадессаса 1140 авеєеєсаваєс сЕСяадаадс гаєєсдяєдає дадсдеЕСсСтду Еєддаєддеда асгаааддада 1200
ЕЕсдддсаде Єдсаєссасу басасаддда деЕддааасас баддаасчає асасадеєсса 1260
Есасеєсессс сеаассдеЕдс сссааааддеі соуддудєдстас ЕсЕєдаасста саєсодадва 1320 дсааааааєс седааасєсе дсссаадасу дададссаас ЕєдЕддаадеі адеЕсдчаєсде 1380 чассєеЕсадаа аааєдссває аааасссааа дсссаадаєс сЕСЕєЧєвеЯдЕ доадсдсдсода 1440 чдЕаєддссас аадссаєссс асадеЕсеЕсьдд деЕЕддесаєс сдддаєсасдсе аадгасесдса 1500 ааадсєдсва Єдааєдаєаа ЕдоддсеЕєдаа додсЕдЕЕЕєсС ЕєдоддоадеЕаа Есаєсдесдеса 1560 чаєдЕадсає Єддодадучаєд ЕдДдЕєдаадЧчє дсесгаєдаад Еєдсаєссда ддеЕаасадва 1620
СЕЕСвЯєсСЕсС доасаєдсаєа саааєда 1647 «2105 12 «211» 548 «212» РЕТ «213» Місовіапа барасит «4005 12
Меє ТПг ТП ТпПс Рго Іїе Азїа АБп о Нів Рго Ап І1е Ропе ТПг Нів сіп 1 в) 10 15 зек бек бек бек Рго ІТецйп Аза Робе Тец АБп Агуд ТПг бек Робе І1е Рго 20 25 30
Рпе бек бек І1е бек Гув Агуд АвБп бек Уаі Авп Сув Авп б1у Тер Аг4д
Зо ТПЕ Агуд Сув бек Уа1і! Аїа пуб Авр Тук ТпПг Уа1! Рго бек бек Аїа Уаї з9 (210)
Авр с1і1у с1у Рго Аї1а Аїа бій Гец Авр Сув Уаі І1ї1е Уа1і С1Уу Аїа щ1У 65 70 75 80
І1е бек б1і1у Іїец Сув І1е А1ї1а сбіп Уаі! Меє бек Аїа Авп Туг Рго Авп
З5 85 90 95
Тецп Меє Уаї ТП бі Аза Агуд Авр Агуд Аїа сіу с1у АвБп І1е ТПг Тс 100 105 110
Ууаї бій Агуд Авр сбіу Тук Гец Тер бій сіц б1у Рго Авп Бек Рпе сіп 115 120 125 40 Рго Бек Авр Рго Мес Гей ТПг Меє Аїа Уа1ї Авр Сув с1у Гечп Тув Авр 130 135 140
Авр Гей Уаї Ггец б1у Авр Рго АБп Аза Рго Акуд Ропе Уаї Іецй Тгр Гу 145 150 155 160 сб1у Гпув Гей Агуд Рго Уа1 Рго Бек Пув Гей ТПг Авр Гец Рго Рое РіГе 45 165 170 175
Авр Гей Меєс бег І1е Рго б1у пув Гей Агуд Аїа сіу Робе сС1у Аза І1е 180 185 190 сб1у Гей Агуд Рго Бек Рго Рго сіу Нів бі бій бек Уаї біц біп РБе 195 200 205 50 Уа1 Агуд Агд Авп Гей сіу сбі1у бі Уаі Рбе бій Агд Гей І1е бій Рго 210 215 220
Рпе Сув бек біу Маії Тук Аза б1у Авр Рго Бек Пув Гей бек Меє Гув 225 230 235 240
Аза Аза Ріпе сіу Гуз УМа1ії ТеЕр ув Гей бі біц ТбПг сіу сбі1у бек І1е 245 250 255
ІїІе с1у біу ТЕ Рпе ув Аза І1е Гув бій Агуд Бек Бек ТПкг Рго Гув 260 265 270
Аза Рго Агуд Авр Рго Агд Гей Рго Пув Рго Ппув сіу біп ТПг Уаї с1У 275 280 285 (516) зек Рпе Акуд Ппув сб1і1у Гей Акуд Меє Гей Рго Авр Аза І1їе бег Аза Агд 290 295 300
Тец б1у Бек Ппув Гей Ппув Гей бек Тер Гпув Гей бек бек І1е ТПг Гув 305 310 315 320 зек біц пув біу бі1у Тук Нів Іец ТПг Тук бій ТПг Рго біц с1іу Уаї 325 330 335
Уаї бек Ггецп біп бек Акуд бек І1їе Уаї Меє ТПкК Уа1ї Ркго бек Тук Уаї 340 345 350
Аза Бек Авп І1е Іец Агуд Рго Гец бек Уаі Аза Аза Аза Авр Аза Гей 355 360 365 зек Авп Рпе Туг Тук Рго Рго Уаі бі1у А1ї1а Уаї ТПг І1їе Бек Тук Рго 370 375 380 біп 611 Аза І1е Агуд Авр бій Агд Гей Уаі Авр с1і1у сій Гец пув 01У 385 390 395 400
Рпе с1і1у біп їец Ні Рго Агд ТПг біп б1у Уаії сій ТПг гейш с1у ТПг 405 410 415
І1їе Тук бек бек бек Гей Рпе Рго Авп Агуд Аїа Рго Ппув с1у Аг Уаї 420 425 430
Тецшц Гей Гей Авп Туг Іїе сіу сі1у Аза Ппув Авп Рго біц І1е Іец 5ег 435 440 445
Тпув ТпПг бій бек біп Геш Уаі1 сі Уаі Уаі1 Авр Агд Авр Іецй Агд Гу 450 455 460
Меє гей Іїе Ппув Рго Ппув Аїа біп Авр Рго Гец Уаі! Уа1ї с1у Уа1і Аг4д 465 470 475 480
Ууаї Тер Рго біп Аза Іїе Рго біп Рбе Гец Уаї сСіу Нів Іецй Авр ТПг 485 490 495
Пес бек ТПг Аїа пув Аза Аза Меє Авп АБр Авп с1іу Гей бій с1у Гей 500 505 510
Рпе Гец сіу б1у Авп Тук Уаі бек бі1у УМаії Аза Ге с1у Агуд Сув Уаї 515 520 525 бі б1у Аї1а Ту бі Уаі Аза бек бі Уаі ТПг сіу Рібе Гец б5ег Агд
Зо 530 535 540
Тук Аїа Тук Гув 545 «2105 13 «2115» 1668 «2125 ДНК «213» Сіспогіцт іпрурив «4005 13 аєчдасаєсеєс Єсасадасуає єсдЕеЕссссеЕСсС аассдессдсес дсадссддеЕс сссссессс бо ссассЯдЕсс ссоддсдддЕс деЕсдасдсєса аадааєсста ддрасстаає сасдтрагсаде 120 ссддсдсаєсєс дсааасдсаа Саддсддадд ЕсссдсрдсЕ стагсадссаа ддаєссссса 180 аєсасеЕссес ссаєєєсааа єдадеЕссаас сСсссадссає соЯоєеододасьд єдеЕСсаєєЧчед 240 чдасодссддса ЕгбадсоддссеЕ СЕдсаєсдсу саддсессссад сдассаааса судссессдес Зоо
ЕсЕСсССсСододаєд Єдаєсдеєсас сдаддсасда дасададссд ддддсаасає ассаасоддсс З6о чааачоадаєд дстгаєсеєсть ддаадчаадді сссаасадсс Сссадссаєс сЄдаєдссаєд 420 сесассаєдда Єдоасддасад Сдоддссдаад даєчаєєссда єдеЕсаддеда сссаасадса 480 ссссодсеЕссд бассасоддад аддсдаєєссд ааассудЕєс сеЕсссааасс ддоастьдассьс 540 сСсСЕССсСЕсСс9Уд ассесаєдчад сЕсСсеЕССтудда ааасесадад ссодЕЕсСсоод СдсеЕсеЕєддва 6боо
БбЕСсСсСудєсСсЕЄ сассеєссада Єсдсдаадаа Ссоаодессдада аазсеЕсоаєсад асаєсаассес 6бо чдчдачаєдаад ЄЄеЕссдаасо сЕєЄЧдасадаа ссссеЕссоосс саддсдесєсса соассддвесдває 720 ссаєсєсаааас Ссадсаєсдаа адсадсаєєсе додааддеЕсс ддааєссдда дсааааєо9дде 78о чдабадсаєєд ЄєЯдЧдЕддадс сеЕєсааддсесс асссаддаса дааадаасад Ссаааадссс 840 ссасдддасс сдаддссбасс дааассааад ддссааасьд Еєддаєссее сСаддааадвда 900 саадсдчаєсдс Сдсссаасдс аассссаасу аддеєсаддра дсададесдаа ассєсдчеЕдЧчеЕв9о 960 аадсєсасда деаєсеЕсааа асєєддадаає ададдеЕсаєса аєсєдасаєса Едааасасса 1020 сааддаєєсуд ааадеЕседса дассаааасе ассдєдаєда сеЕдеЕсссаєс ссасуаєддасд 1080 адедасеЕєдєеє ЄдсуєссусЕ ЕЄСсСЯєсоодУЧєЄ дсадсадаєд саєєдеЕСааа асеЕстаєсає 1140 (516) ссЕссоддЕеЕсЯд садседбтаєс ааєсеєсаврає ссаааадасуд сааєсєсоаєдс сдассоддсед 1200 аєєдаєддеЕс аасеЕсааадуд ЕЄЕєддодсаа сСЕдсаєссас даадесаадд ддЕддааасе 1260
Єгаддбасда Єссасадесс ассЕсЕсееєс сссаассддад сдссассвдуч аадддеєєсьд 1320 сЕСЕєЄдаасе асаєсєсоддадд ддссасааає ссеЕдаааєєс гаєсааадас ддадддсдаа 1380 аєєдеЕддаєд сододЕддассу ддассстасуд асдаєдседа Єааддсдеда Едсддаадає 1440 ссаєєдасЯяє ЕдддоддЕдсо ддЕдЕддссЕ сдадсааєсс сдсадеЕсєЕсь даєсоодесає 1500 баєдасаєєс садасєсьєдс аааадседсс сеЕдадеЕадсу деЕддаєссса адасасдаєеє 1560 сЕєдЯдЕдоадса астаєдеЕдеЕс єддаЕЧЕД9чЯсЕ Есаддєааає чеЕдессдаддсес ЄдсЕєаєдає 1620 дЕєдссодсвд аддеЕааєсдаа СЕЕЕссуссоа сааддуддЕеЕдЕ асаадеда 1668 «2105 14 «2115 Б555 «212» РЕТ «213» Сіспогіцт «4005 14
Меє ТПг бек Гей ТПг Авр о Уаї Сув бек Гей Авп Сув Сув Агуд бек Тгр 1 5 10 15 зек Бек Гец Рго Рго Рго Уа! бек біу біу бек Гей ТПг Бек Гпув Авп 20 Рго Акад Тук Гей І1е ТПг Тук бек Рго Аїа Нів Агд Ппув Сув Авп Агд
ТЕр Агуд Рпе Агуд Сув бБег І1е Аза пуб Авр бБег Рго І1е ТПг Рго Рго бо
ІТІе Бек Авп о біц Рбе АвБп бек біп Рго Гей Гей Авр Сув Уа1 І1їе Уаї 25 65 70 75 80 сб1у Аї1а с1у Іїе Бек с1іу Гей Сув Іїе Аїа сіп Аїа Гец Аза ТПг Гув 85 90 95
Нів Аїа бек Уа1 бек Рго Авр Уаі1і Іїе Уаії ТБг біц Аза Агуд АБр Агд 100 105 110
Зо Уаї б1у б1у Авп І1їе бек ТПг Уаії бій Агд Авр сіу Тукг Гей Тер с1чи 115 120 125 бі б1у Ркго Авп бек Рпе біп Рго Бек Авр Аїа Меє Гец ТПг Меє Уаї 130 135 140
Уаї Авр Бек с1іу Гей пув Авр Авр Гей Уаї Ггец с1у Авр Рго ТПг Аї1а 35 145 150 155 160
Рго Агкд РпПе Уаії Іецй Тер сі1у б1у Авр Гей Ппув Рго Уа1 Рго бек Гув 165 170 175
Рго Аїа Авр ТІецй Рго Рпе Рпе Авр Іецй Меє бек Рпе Рго с1у пуб Іей 180 185 190 40 Агуд Аїа с1у Рбе сб1у Аза Гей с1іу Рпе Акуд Рго бек Рго Рго Авр Аг4д 195 200 205 бі бій бек Уаі бій біш Рбе Уаі Агуд Агд Авп Гей с1у Авр сі Уаї 210 215 220
Рпе сій Агкд Тїец І1е бій Рго Робе Сув бек біу Уаі Туг Аїа с1у Авр 45 225 230 235 240
Ркго Бек Ппув ІТец бек Меє Гув Аїа Аза Рпе с1у Ппув Уаї Тгр Авп Іей 245 250 255 бі біп АБп о сіу сіу Бек Іїе Уаі сіу с1у Аїа Рбе пуб Аїа І1е сіп 260 265 270 50 Авр Агуд пув Авп обек біп Пув Рго Рго Акуд Авр Рго Акд Гей Рго Гу 275 280 285
Ркго Ппув біу біп ТПг Уаї сіу бек Рре Агуд Гув сіу біп Аїа Меє ГІец 290 295 300
Рго Авп Аза І1е бек ТПг Агуд Тец біу бек Агуд Уа1! пуб Гец Сув Тгр 55 305 310 315 320
Тпув Гей ТПг бек Іїе Бек Гпув Гей бій Авп Агуд с1у Тукг Авп Гей ТЕГ 325 330 335
Тук біш ТПкЕ Рго сбіп біу Роре сій бек Гей Сіп ТПг Гпув ТПг І1е Уаї 340 345 350 (516) Меє Тпг УМа1ї Рго бек Туг Уаі Аза бек Авр Гей Іецй Агуд Рго Гей 5ег 355 3З6о 365
Тец б1у Аї1а Аза Авр Аїа Гей бек Пув РібПе Туг Туг Рго Рго Уаії Аїа 370 375 380
А1ї1а Уа1 бек І1ї1е бек Тук Рго Пув Авр Аї1а І1е Агуд Аза АвБр Аг9д Іецй 385 390 395 400
І1їе Авр с1у біп еп Ппув с1іу Рбе сіу сбіп Гей Нів Рго Агуд бек сіп 405 410 415 сі1у Маї бій ТПпг Ге сб1у ТПг Іїе Туг Бек бек бек Гей Робе Рго Авп 420 425 430
Акуд Аза Рго Рго біу Акд Уаї Гей Гей Гей Ав5п Туг Іїе сСіу С1у А1а 435 440 445
ТПЕ Ап Ркго сіц І1їе Гец бек Пув ТПг біц с1у б1п І1е Уаї АБр Аїа 450 455 460
Уаї Авр Агуд Авр Гей Агуд ТБг Месє їец І1е Агд Агд АБр Аїа бій Авр 465 470 475 480
Рго Гей ТБПг Тец сі1у УМаії Акуд Уаї Тер Рго Агуд Аза І1е Рго біп Ріе 485 490 495
Тец І1ї1е с1у Нів Туг Авр Іїе Гей Авр бег Аїа їуб5 Азї1а Аза Іецй 5ег 500 505 510 зек сіу біу Роре біп б1у Меє Роре Іец б1у б1у Авп Туг Уаі Бех щУ 515 520 525
Ууаї Аза ге с1у пув Сув Уаі біц Аза Аїа Туг Авр Уаі Аї1а Аїа сі1и 530 535 540
Уаї Меє Авп Рпе Гей бек біп сіу Уа1 Тук Гув 545 550 555 «2105 15 «2115» 1689 «2125 ДНК
Зо «213» Зріпасіа о1егасеа «4005 15 аєдчадсдста Єддсдеєсаєс дадеасаасдд дсссссссЯає сдссдасааєс ссстасдаєсса бо
Ебаєсссаєє деаддсасаа ссдабаєсасс ассссдаєссс сассєссдаєс дссссдаада 120 счаддаддаа дсЕСсСаєссду сеЕдсЕСтаса аєсєсаасся стаасеЕссдс ддсеЕдсадесс 180 ааєсассада асааааасає аддсасааас ддвадссдасда дсддсддадда соаодаддадаі 240
ЧЕЧДЕсадасе деЕЧдДЕЧЧаєєдЕ адддаддсдда ассадсддас Сссдсаєссдс асаддсессста Зоо
Есгбасврааає асессаассяє сеЕссасдаає сссаєссдсса ссдаддссаа ддаєссчадесс З6о часдддааса Єсасрассає ддаадссєдає доаодсасссає додаададдд Есстаагадсес 420
ЕсЕСсСадссає седаєдсадеЕ дсЕСассаєу дсЕДдсеЕЧчаса дсодЧєсєсЕдЧаа ададчдаастд 480 чЧЕЧдДсЕдоддад аєсссааєеєс дссЕСсСЯсСЕСсс дсдссдсддда асддсааасс ааддсстодга 540 ссссссаадс Ссассдассс сссссеЕсеЕєе даєсєсаєда дсеЕсссстгда ааадаєсадд 6боо чдсСЕдЧєСсСЕсЧ дЕдсСЕСЕвдуд сЕсасдасса ЄсЕсСссссодд сссасдадда асссддссдаа 6бо сааєєведеЕсс деЕСЯдЕааєсє єддеЕЧчаєдад дЕСЕЕєдаас дсеЕсЧаєсуа ассЕєсевде 720
ЕсадчоаєдеЕЧс агдседдаєда Сссссссаад СЕЧчадетаєда аадсесдсеЕєс єддсадоадее 78о
ЕдводдЕсСеЕсєду адсааааддд Єддсадсаєс ассддбеддса сссосаааас аасссаддаа 840 ачаааддаєа аєсстаадсс ассеЕсдадас ссдсдссосс ссааассааа дддссадаса 900
ЧЕєЧддаєсся єсаддааадд асєдадсаєд Ссдссаассу ссасєсєсстсда ааддсеЕсддас 960 аасааадеєда аадгаєсаєд дасссеєвессс дуоасасєдсса адесдеЕСсдаа сдодададеає 1020 ааєсєдасес аєдааасасс адаєддассд дсЕсссуЯєта ддассаааад СоЯОсЕЧєЧаєд 1080 асєдЕсСссує сасаєсуєєдс аадсадссьс сЕсСсдЕсСсас ЕЕссадаєде сдссдсадаа 1140
ЄсЕСЕсЕеєСсСаа аасеЕссаєса Еєссассадес дсадсеЕдеЕдЕеЕ сасеЕсєеєссста Есссааадаа 1200 чдсааєсадає сададеЕдссе даєєдасодує даасеєсааад дасеєсодддса аєсасаєєссс 1260 сдсадеЕсаад чдЕдсдддааас сЕгдддааса асеЕсавадее сарсЕсьсес ссседддсда 1320 дсассассвуд деаддасссє даєєсєсдаас сСасасєддад дедасастаа ссссддсаєа 1380
Єбадасаада сдааадаєда асгадсеєдаа дсадсєдаса доадаєєсєдад аадаасесьс 1440 асааасссва агдсаааадс ЕссссдуддаЕє ЕєсЯодЧЧєЧдсєда дадеаєддсс асаадсаась 1500 ссссаасесе гаасеєддсса сЕЕсєдаєссд сєсдаєдсад саааадссдс ЄЕєдасьедає 1560 чдаєддасаса аадчаєсуєе єсСЕєдддЕдда аастаєдкає саддеЕдеЕвдс ЕсЕддоддссода 1620 (516) Єдсаєсададуд деЕдсстаєда аєсєдсадсес даддаєєдсад асрсеЕсссууєс асадсасесду 1680 чаєаааєад 1689
«2105 16 «2115 562 «212» РЕТ «213» вріпасіа «4005 16
Меє бек Аза Меє Аїа Гей бек бек ТПг Меє Аїа Іей бек Гей Рго сіп 1 5 10 15
Ззек бек Меє бек Гей бек Нів Сув Агкуд Нів АБп Агуд І1е ТПг І1їе Іецй 20 25 30
І1е Рго бек бек бек Гей Агуд Агуд Акуд біу сіу Бек Бек Іїе Агд Сув 35 40 45 зек ТПг І1е бек ТПг бек Авп б5ег Аї1а Аї1а Аза Аза АвБп Тук біп Авп 50 55 бо
Тув АБп о І1е с1у ТПг Авп сіу Уаі Авр с1у сіу сіу сіу сі1у с1у 1У 65 70 75 80
Уаї гей Авр Сув Уа1 Іїе Уаї сіу сіу сіу І1е бек б1у Іеп Сув Ше 85 90 95
А1ї1а сбіп Аїа ІТецй бек ТПг Ппув Тук бек Авп Гей бек ТПг Ап Ріе І1е 100 105 110
Ууаї ТП бі Аїа пув Авр Агуд Уаі сіу с1у АвБп І1е ТПг ТПпг Меє сі 115 120 125
Аза Авр сіу Туг Іец Ткгр бій біц б1у Рго Авп бек Рпе сбіп Рго б5ег 130 135 140
Авр Аза Уаї Гецш ТПг Меє Аза Уаї Авр бек б1у Гей Ппув бі сій ГІец 145 150 155 160
Уаї Гей с1у Авр Рго Ап о бек Рго Агуд Рпе Уаі Гец Тгр АвБп б1Уу Гув 165 170 175
Зо Тем Агуд Рго Маії Рго бек Пув Гей ТПг Авр Гей Рго Ріе Ріе Авр Гей 180 185 190
Ме бек Рпе Рго сіу Ппув І1е Агуд Аїа сіу Гец сіу Аїа Іецп Сс1Уу Гей 195 200 205
Акуд Рго бек Рго Рго Аї1а Нів біц біц бек Уаі бій сбіп Рпе Уа1 Аг4д 210 215 220
Акуд Авп о Гей с1і1у Авр біц Уаії Робе біц Агд їец І1е бій Рго РПе Сув 225 230 235 240 зек сіу Уаї Туг Аїа б1у Авр Ркго бек Гув Гей бек Меє гув Аза Аї1а 245 250 255
Рпе с1у Акуд УМаії Тгр Уаії Гей бій сіп Пув сіу сі1у бек Іїе І1е 01Уу 260 265 270 сбі1у ТПпЕгЕ Гей Ппув ТПг Іїе сбіп сій Агуд пув Авр о Авп Рго пуб Рго Рго 275 280 285
Акуд Авр о Рго Агд Тецй Рго Пув Рго пув бі1у біп ТПпг Уа1і с1у Бек Ріе 290 295 300
Акуд пув с1у Пец бек Меє ІТецй Рго ТПг Аза І1е бек сій Агд Гїеш 0Щ1У 305 310 315 320
Авпопув Уаї Ппув Уаі1ї бек Тер ТПг Іец бек б1у Іїе Аїа Ппув Бек б5ег 325 330 335
Авп осбіу сій Тук Авп Гей ТпПг Тук бій ТБг Рго Авр с1у Гей Уа1! 5ег 340 345 350
Уаї Акуд ТПг пув бек Уа1 Уаї Меє ТПг Уа1ї Рго бек Туг Уаі Аза 5ег 355 3З6о 365 зек Гец Гец Агд Рго Гей бБег Авр Уаі Аї1а Аїа сій Бек Гей бек Гув 370 375 380
Рпе Нів Туг Рго Рго Уаі Азїа Аїа Уаї бек Гецп бек Тук Рго Ппув б1іц 385 390 395 400
А1їа І1ї1е Агд бек біц Сув ІТейп І1е Авр сб1у б1іп Іїейп пув с1у РпПе 0Щ1У 405 410 415 (516) сіп Гей Нів Бек Агуд бек біп сіу Маї сбіш ТПг Гей с1у ТПкг І1е Туг 420 425 430 зек бек бек ІТец Ропе Рго сб1у Агд Аїа Рго Рго с1у Агуд ТПг Іец І1е 435 440 445
Тец АБп Туг Іїе сі1у с1у Авр ТПг АвБп Рго сіу Іїе Гей Авр Гув ТПг 450 455 460 цув Авр біц Геп Аїа сбіц Азїа Уаі1і Авр Агуд Авр Гей Агкуд Агуд І1е Гей 465 470 475 480
І1е Авп Рго АБп Азїа Гув Аза Рго Агд Уаії Іеп сіу Уаї Агкд Уа1! Тгр 485 490 495
Рго сбіп Аїа І1е Рго біп Рпе Іїец І1е сб1у Нів Рпе Авр Гей Гей Авр 500 505 510
Аза Аїа пув Аїа Аза Іїецйп ТПг Авр сбіу б1у Нів Ппув сіу Гец Рібе Іей 515 520 525 сбі1у б1у Авп Туг Уаі Бек сіу Уаі Аїа Гей с1у Акд Сув І1е сбіц с01У 530 535 540
А1їа Тук сій бек Аї1а Аза сій Уаії Уаі Авр Рре Гей бек біп Туг 5ег 545 550 555 560
Авр Гув «2105 17 «2115» 1596 «2125 ДНК «213» вріпасіа о1егасеа «4005 17 аєддеєаасас бассудеЕсеєс ссадссаєса ассааєсєссддда дЕссаєссдсєс ддЕсссассс бо ассаадааса асссадеЕсає доддсаасдсєс сссдадсдаа ассаадссаа Ссаасссаєсєс 120
ЕсЕдсваааа дадЕСЧСсСЕЧЕ ЄЧЯЧЕЄЧОдсдсС доасдссадесдд дасеЕсдссдс ддсдабаєсаад 180
Зо сгааааєсда асодсстєдаа єдсдасаєсд єссддаадсьд аєадсададс Содсддддааа 240 сесаааассд Ссдсааадда СоддДдЕсеЕЧаєє єодоодчаєсдаад дддсааасас саєсдасадад Зоо адсчаєдадда аддеєсасдчад єЄЄєЧЕСсСсдає дассссдоддда сСссоасдадаа дссасадста З6о ссаассссас аааасаааад асасаєсдсес адачдчасрддеЕс ЕссСстЕдеЕдсеЕ деЕсасстєсса 420 ааєссадеЕєд содсЕсСсЕєдаа дадсаасаєс сЕсссадсаа аасссаадсесс асаааєсаєд 480
ЕсддаассеЕс єЕЕСЕЕгдддаа аааасасаає ддєдстаадда ЄСЕСЄдасда дааєсдсссаа 540 чааадеЕдеЕдда сЕДдадЕеЕсСЕеЕсЕЕ Еєдадсдадсає сЕсодддааад азєЕеЕсоєтєда ЕсСаєсеЕсааєс 6боо чаєссЕвєевд єСсСдсодддєас аадеддсдда дасссссаає сссеЕссссає дсдєссаєсдаса 6бо вЕєЄСсСсадаає сасоодаасає Єдадаасадд ЄЕсдддЕеЕєСсСад єдасєєсссддд аєссаєєсад 720
ЕсбааасеєдеЕ саєссаадаа ддааааддді ддадаааадс аассссссаа Саадаадсса 78о счєдсасуєд д9сЕСсСУсСЕЕеСсС ЕєСсСеСсадоодс ододааєдсада сассадеЕсда састасаєдс 840 ааачадеЕєвсєд деЕдаадаєда асесааассс садсссдадда ЄсСсСЕсссасє дессагсасадсес 900 сасаасддаа дссссасаєсс ададааєсдда єсадедеЕсьс стаєдесааа садсассаєс 960 саадаєсаас сагаєдаєдс єдЕСЧЯєсудсд ассдссссаа Есааєааєудс сааадаасьд 1020 аачаєсаєда аадеддаааа сссавфсєвессе сеЕсдасессса ЕєСсСсададдеі дадсеЕдеЕста 1080 ссссссесссд єсастаєсас басаєєсаауд аадассааєд Єдаададасс єСЕЄсЧЯаддаде 1140 гЕсоОдДЕДЕЕсС єЕДЯДвасссеєс бааєдадсаа сасааєдуддс ЕдаадасеЕсь ЕддсасеЕєствд 1200
ЕЕЄЕСсСсСЕСяа ЄдавєдеЕсесс Едаєсдедсес сссеЕСЕДдаєд Едсаєссаєа сассассеЕве 1260 чЧЕєддаддна дсадааасад адаасесєдса ааадсеЕссаа судаєдаасе даадсаааєга 1320 дЕСЕСЕЕеСсСвд ассеЕссадса дсЕдЕсддодс ассдаддудсуд аасстасьсеЕ ЕдЕДЧДааєсає 1380
СЕсвсасеєдда дсааадсасе сссеєсесеєсає доасдсааєє асдасесаде ЕєСсСЕсСададса 1440 асададаада бЄддаааддудда ссЕєсстдда сЕсЕеЕсеЕсасу саддбаасса гаадоддеЕддва 1500 сСЕдЕСЕдЕду дааадессаає адссеЕссддда басааадсєд ссдадсеєвдс дагаєсстає 1560 сЕСЧдадеЕсса асаадаєдас сдаддадасе асасаа 1596 «2105 18 «2115 531 «2125 РЕТ «213» вріпасіа 60 «4005 18
Меє Уаї Іїе гей Ркго Уаі1і бек біп Гей бек ТПг АвБп Тец б1у Іец 5ег 1 5 10 15
Тецп Маї Бек Рго ТПг Ппув Авп Авп Рго Уа1і Меє сіу Авп Уаї бек бій 20 25 30
Агуд Авп обіп УМаі! АвБп обіп Рго Іїе бек Аїа Гуз Агуд Уаі Аїа Уа1ї! Уаї 35 40 45 сб1у А1ї1а сі1іу Уаі Бек сб1і1у геш Аїа Аза Аїа Тук Ппув Гей пув бек Авп 50 55 бо б1у Гей Авп Уаі ТПг гейш Рбе сі Аза Авр бБег Агуд Аїа сіу с1Уу Гув 65 70 75 80
Тецшц Гпув ТПг Уаії Уаії Гпув Авр сі1у Гей Іїе Тер Ар сіц С1у Аї1а Авп 85 90 95
ТПЕ Меє ТПг сій бек Авр біц бій Уа1ї ТБПг бек Іец Рпе Авр Авр Гей 100 105 110 с1у Ії1е Акд бій Ппув Гей біп Гей Рго І1е Бек біп Авп Гув Агд Туг 115 120 125
І1е Аїа Агд Авр біу Гей Рго Уаії Іец Гей Рго Бек Авп Рго Уаі1 Аї1а 130 135 140
Тецшп Гецп Ппув Бек Авп Іїе Гей бек Аїа Ппув бек Ппув Гей біп І1е Меє 145 150 155 160
Тец бій Ркго Рпе Гей Тер пув Ппув Нів Авп сіу Аїа пуб Уаї 5ег Авр 165 170 175 бі АБп Аза сбіп бі бек Уаі1 Аїа сій Рпе Рпе сій Агд Нів Рое 01Уу 180 185 190 пув бій Рпбе Маії Авр Туг Тей І1їе Авр Рго Рпе Уаі Аїа сі1у ТПг 5ег 195 200 205 сбі1у б1у Авр Рго біп Бек Гей бек Меє Агуд Нів Аза Рібе Рго сій Іей 210 215 220
ТЕр Авп І1е біц Авп Агуд Рбе сіу бек Уаі І1е бек с1у Рпе І1їе сіп
Зо 225 230 235 240 зек Мпув Пец бек бек Гув Ппув біц Гуз б1у б1у бій Ппув біп бек б5ег 245 250 255
Авпопув пув Рго Агд Уаі Агуд біу бек Рпе бек Рпе сіп сбіу сіу Меє 260 265 270 сбіп Тк Гец Маії Авр ТПг Іїе Сув Пув біцш Рпе сіу бій Авр сій Гей 275 280 285
Тпув Гей біп бек бі Уа1і Гей бек Гей бБег Тук бек Нів Авп с1у бег 290 295 300
Тецп ТПг бек бій Авп Тер бек Уа1і Бек Бек Меє бек Авп бег ТПг І1е 305 310 315 320 біп Авр біп Рго Туг Авр Аїа Уаі Уаі Уаі ТПг Аза Рго І1е АвБп Авп 325 330 335
Уаї пув бій гейш пув Іїе Месє пув Уа1 сіц Авп Рго РобПе бек Гей Авр 340 345 350
Рпе Іїе Ркго бій УМаї бек Сув Гей Рго Гей бек Уаі І1ї1е І1е ТПг Тіг 355 3З6о 365
Рпе пув Ппув ТПг Авп оУаї Гув Агд Рго Іїецп бій с1іу Рпе сіу Уаі1ї Іец 370 375 380
Уаї Ркго Бек Авп бій сіп Нів Авп сіу Гей пув ТПг Ге с1у ТПг Ієц 385 390 395 400
Рпе бек бек Мес Меє Рпе Рго Авр Агуд Аза Рго бБег Авр Уа1! Тукг Іец 405 410 415
Тук ТпПг ТПг Рбе Уаї сіу сіу Бек Агд АвБп Агд бі Гей Аїа Гув Аї1а 420 425 430 зек ТПг Авр бій Ге Ппув сіп чІ1е Уаії бек бек Авр Гей сіп сіп Іецй 435 440 445
Тец б1у ТП сі с1у бій Рго ТПг Рпе Уаї Авп Нів Рпе Туг Тгр 5ег 450 455 460
Тпув Аза Рпе Рго Гей Тук с1у Агуд Авп Туг Авр бек Уаї Гей Агд А1а (516) 465 470 475 480
І1Іе сіц пув Меєсє біцш Агуд Авр Гей Рго сіу Гей Рбе Туг Аза С1у Авп 485 490 495
Нів пув сіу сіу Пец бек Уаі сіу Ппув бек І1е А1їа бек с1у Тук Гув 500 505 510
А1ї1а Аї1а сій ІТеш А1їа Іїе бек Туг Гей біц Бек Авп Пув Меє ТПгЕ сіц 515 520 525 сій Тк І1е 530 «2105 19 «2115 1674 «2125 ДНК «2135 5Бо1іапит Єирековит «4005 19 аєдасаасаа сддссдЕсдс саассасссо адсассссса сссассддесс дссдсрдссд (216)
Есдссуєсує сессссессес ассдссуєса СЕСЕСсСаєсев сааассдрас дааєсеєссаєс 120 ссесасессс ссасссссаа дсдсаасгаде десааєєсдса асддссддад аасасчзаєде 180
ЕссЧдєсдсса аддаєстасас адеЕссссссс сСсодаадссоо асддсааєса дЕсСсСссдоадад 240 седдассдєсд соддсадссдд адсаддаасс адсддасссс дсассдссаа ддадеєдасєсссду Зоо
ЧдсЕааєстаєс ссааєєєдає доадєдасодад дсдаддадаєс деседссддедда ааасаєсаасд З6о асоддеєддааа дчачаєддаєа сеЕсаєдддаа дааддесссста асадессссса дссессдадає 420 ссбтасдессда саасддссдс адассддвода єсдаадчаєдд асЕєєвдавєаеєє доаоададасссяс 480 чаєдсдссеЕс дсссгЧЧссЕє дЕоодааддає ааассааддс седЕссссод саадсесасе 540 чаєсеЕссссеЕ ЄСЕЄЕеєЧаєєє даєдадсаєс сссддсаадс Ссададссдд ЄЕЕсоддесдсс 6боо аєєддссеЕєс дсссеЕЄсасс єссаддессає даддааєссад Ссдадсадес садсдсдаєссдае 6бо ааєсєЕєддед садаадесссе єдаасуєєсу асеЕдаассає єсЕЕдЕсССЄдд сдЕЕсасодсс 720 чдаєдассссє сааааєєдає баєдааадса дсасссддда аадсдсддаа дссадаасаа 78о
Зо асеЕдодаєдаєа дсастассодуч ддодаассссЕ ааадсаасса аддададаєс садсаасссяе 840 ааассдссеЕс деЕдаєссдсд ЄЄвассааса ссааааддас ааассдссдд аєсаєєтад 900 аадддеєсєда дааєдседсс ддаєдсааєсс сдсдааадас сСдддаадсаа адсаааастса 960
Єсаєддаадс ЄЕсссадсає басааадсса даааааддад часаєсеЕсесе дасагасдад 1020 асассадаад дадгадеесс єСсСЕдсдааді судаадсаєєсд ЕсаєдаседеЕ Ессаєсстває 1080 дЕадсаадса асагаєсасу сссЕСЕсеЕсЯа дссдссдсад садаєдсасе сеЕСВаадееес 1140 басвраєсссс садгадсадс адеЕдасааєс ссагаєссєс аададдстає Есудєсдаєдад 1200 сдєСЕЯдЕеЕсЧд асддеЕдаасе ааадддаєсеЕ доддсадеєдс аєсссасуєес асадоададед 1260 чааасассад даасаасаса бадеЕссаєса сЕсСЕЕеЕссва ассуєбдсесс аааєддассдад 1320
ЧдЕдсвасеЕсеє Єдаасврасає Єддаддадса асааасгассд аааєєдедес гаадасодад 1380 адссаассє9д Єддаадсаде Єдассдєдас сеЕсадааааа ЄдсеЕсасааа асссааадса 1440 саадаєсссе ЕсУдсвасоддд єдЕдсдадса Еддссасаад ссаєссссаса ЯФЕЄЕЄвЧдЕС 1500 ччдасаєсєдд агасассаду басеєдсаааа асеЕдсєссаа деЕдаєагааєдда дсеєдасоад 1560 сраєєссьсу додддадєааєта єдЕДдДЕСЄЯдЯЧЕ дсадсаєвєдуа даадчаєдеєдЕ Єдааддедсяе 1620 баєдаааєад саєссдаддЕ аасеєддасес сеЕдеЕСсСЕСсаде аєдсаврасаа аєсда 1674 «2105 20 «2115 557 «2125 РЕТ «2135 5Бо1іапит Єирековит «4005 20
Меє ТПпг ТпПг Тпг Аза Уа1і Аза А5п Нів Рго бек І1е Рпе ТПг Нів Аг4д 1 в) 10 15 зек Рго Ген Рго бек Рго бек бек бек бек бек бек Рго бек РіПе Іецй 20 25 30
Рпе гей Авп Агуд ТПг АвБп о Рпе І1е Рго Тук Рпе бек ТПг Бек Гпув Агд 35 40 45
АвпобБек Уаії Авп Сув Авп обіу Тгр Агд ТБг Агуд Сув бек Уаі Аїа Гув 50 з9 (210) (516) Авр Тук ТПг УМа1! Рго Рго бек біц Уаі Авр б1у АБп біп Рпе Рго с1іц 65 70 75 80
Тец Авр Сув Уаі Уаі Уаі1 сіу Аїа с1у Іїе Бек сіу Гец Сув І1е А1а 85 90 95 пув Маї І1їе Бек Аза Авп Туг Рго Авп Гей Меє Уа1! ТБбг біц Аї1а Агд 100 105 110
Авр Агуд Аза сбіу б1у АБп чІ1їе ТПг ТпПг о Уаі! бій Агуд Авр с1у Тук Іецй 115 120 125
ТЕр бі бій с1у Рго Авп бек Рпе біп Рго бБег Авр Рго Меє Іец ТПг 130 135 140
Мен Аїа Уаї Авр Сув сіу Гец Ппув Авр Авр Гец Уаії Іец б1у Авр Рго 145 150 155 160
Авр Аза Рго Акд РоПе Уаії Гей Тгр Гув Авр Гув Гей Агуд Рго Уа1і Рго 165 170 175 сб1у Гпув Гей ТПг Авр Гей Рго Рпе Рпе Авр Гей Меє бег І1е Рго 01Уу 180 185 190 ув Гей Агуд Аїа с1іу Рбе сіу Аїа І1е с1у Гей Агуд Рго бек Рго Рго 195 200 205 сбі1у Тук бій сі Бек Уаі1 бій сбіп Рпе Уаі Агуд Агд Авп Гец С1у А1а 210 215 220 бі Маії Рпе сій Агуд Гей Іїе сій Рго Рпе Сув бек сіу Уаї Туг А1а 225 230 235 240 б1у Авр Рго Бек Ппув Гей Іїе Меє пув Аїа Аза Рпе сіу Ппув Уа1ї Тгр 245 250 255
Тпув ІТеп бій сіп ТП сіу сіу Бек Іїе Іїе сіу сіу ТПкг Рібе ГТу5 А1а 260 265 270
Іїе пув бій Агуд бек Бек Авп Рго Пув Рго Рго Агуд Авр Рго Ак9 Іецй 275 280 285
Ркго ТПг Рго пуб біу біп ТПпг о Уаї б1у бек Рпе Агд Ппув с1у Гей Агд 290 295 300
Меє Гей Рго Авр Аза Іїе Сув бій Акд Гец сіу бек пув Маї Гпув Іецй
Зо 305 310 315 320 зек Тер Мпув ІТец бек бек І1е ТПг Гув бек б1іп Ппув с1у с1у Тук ГІец 325 330 335
Тецп ТПпгЕ Тук бій ТпПг Рго біц сіу Уаі Уа1і Бек Гей Агуд бБег Агд 5ег 340 345 350
Іїе Уаії Меє ТПг Уаї Рго бек Тук Уаі Аза бек АБп І1е Гей Агд Рго 355 3З6о 365
Тец бек Уаі Аза Аза Аїа Ар Аїа Гей бек бек Рпе Тукг Туг Рго Рго 370 375 380
Ууаї Аза Аїа Уа1ї ТПг І1їе бек Тук Рго сбіп біц Аза І1е Агд АБр с1ци 385 390 395 400
Акд Гей Уаії Авр сбі1у б1іцш Іїешп Ппув біу Рпе б1у біп Гей Нів Рго Аг4д 405 410 415 зек біп біу Уаії біцш ТПпг Гей сіу ТПг І1е Тук Бек Бек Бек Гей Ріе 420 425 430
Рго Авп Акуд Аза Рго Авп о с1іу Агуд Уаі Гей Гей Гей Авп Туг Ії1е 01Уу 435 440 445 б1у А1їа ТПг Авп о ТПг бій І1е Уаї Бек Ппув ТПг бій бек біп Іец Уаї 450 455 460 бі Азї1а Уаї Авр Агуд Авр Гей Агуд пув Меє Гей Іїе пуб Рго пув Аїа 465 470 475 480 біп Авр Рго Рпе Уаі ТПг сіу Уаі Агуд Уаі Тер Рго сбіп Аза І1е Рго 485 490 495 біп Рпе Гей Уаії сіу Нів Гей Авр ТПг Гей сіу ТПг Аза пуб ТПг Аїа 500 505 510
Пен бек Авр Авп сіу Гей Авр біу Гей Рпе Гей сіу б1іу Авп Тук Уаї 515 520 525 зек сіу Уаі Аїа Іец б1у Агкуд Сув Уаі біп с1у Аза Туг біц І1е А1а 530 535 540 зек біц Уаї ТПг б1у Рпе Гей бек біп Туг Аїа Тук Гув (516) 545 550 555
«2105 21 «2115» 1608 «2125 ДНК «213» йеа шаув «4005 21 аєддеЕсдссд ссасадссас содссаєддсс ассдссдсає сдссдссасс саасдддасс бо сдаасассод сдсддссссд ссассодадда сссадсдєдс дседсдседс гДдеЕддсоадос 120 чдасдсддссу аддсассддс аєссассддс дсдсддссде ссдсоддассд сддссдсдаєд 180 часодаддса ЕсадеддссЕ седсассдсу саддсуссду ссасодсоддса соодсдесд9адо 240 часдєдсесєд єсасоодаддс ссдсоадсссдс сссддсддса асаєссассас сдссдадсдас Зоо сссдаддаад ддсасссссд ддаддадддс сссаасадсе гссадсссес сдассссдре З6о сссассаєсдд ссдсддасад соддасєдаад даєдасес9д ЄЕЕессодддоода сссааасдосд 420 ссдясЯссссоа сдссдсддда ддддаадссд аддсссдрдс саєссаадсс сдссдассьс 480 ссЧосссеЕссу ассесаєдад сасєсссаддад аадсесаддд ссодесстадда сдсоссгодс 540 аєссдсссдс сеЕссеЕсСсадд ссодсдаадад Ссадсддадча адсссдсдсд ссдсаассес 6боо
ЧаєдсЕЧадд ЄСЕЄєдадсо ссесаєсдад ссссесссдсс саддеєдеєсса Єоассдавесває 6бо ссЕсссаадс сСсадсаєдаа ддссдсаєсеЕ додааддеЕсс додсододеЕсддда адааастсддва 720 чабадеаєса єєдЧдєддаас саєсаадаса асссаддада ддадсаадаа Сссаааасса 78о ссчдаддочаєсд сссоуссеесс даадссаааа дддсадасад ЕєЄДдсаєссвеє саддаадчоаде 840 сЕсдссаєсдсе ссссаааєсдс сассасаєсс адсеЕсдддра дсааадессаа астаєсає9дд 900 ааасеєсасда дсаєсасааа аєсадаєдас аадддасаєд ССсСсоодадса Сдааасдсса 960 чаачдоддЕєд ЄЕссдудєдса ддасєаааацчі дЕсСаєсаєда свеаєєсєссаєс асасаєєтдсяе 1020 адсаасавєесє єдсуєсссасе Ессаадсдає дссдсадаєд сЕСваєсаад аєсссаєває 1080 ссассоддЕеЕсд седсеЕдеЕаас єДдЕсЕСсСдває ссаааддаад саассадааа адааєдсетва 1140 аєєдаєдддд аасессаддуд сЕЕєддссад сЕдсаєссас деадесаадд адеЕсдадаса 1200
Єгаддаасаа сасасадесс сесасесесес ссаааєсуєд сЕССЕдасду Еаддуаєдета 1260 сЕєСсСсааасеі асасаддадд Єдссасааас асаддааєсд ЕсЕССаадас Єдааадедад 1320 сЕддЕсдаад садсєдассуд ЄдассеЕссда ааааєдсеса гаааєсссас адсадеддас 1380
Зо ссЕЕсадесс ЕсСоОдДЕДДЕсСсСУ адеЕсводдсса саадссавбас сссадесеєссеє ддадаєсаддасає 1440 сЕєДдаєсьсс гЕддаадссдс аааадссдсес ссддассдад деЕддссасда ЕдаадсеЕдеес 1500 сЕаддадоада астаєдеЕсєдс аддадеЕсдсс сєдддсадає дсоасЕдадад содсдєаєдаа 1560 адеЕдссЕСдс ааагаєстєда сЕссеЕсдасс аадтаєдсся асаадеда 1608 «2105 122 «2115 535 «2125 РЕТ «213» йеа шаув «4005 Д 22
Меє Уаі Аза Аза ТПг Аза ТПг Аза Меє Аза ТПг Аза Аза бек Рго Іецй 1 в) 10 15
Тец АБп о сбі1у ТПг Агуд І1е Рго Аїа Агуд Гей Агуд Нів Агуд біу Гей 5ег 20 25 30
Ууаї Акуд Сув Аїа Аза Уа1і1 Аїа сіу сб1у Азї1а Аза сій Аза Рго Аїа 5ег 35 40 45
ТП б1у Аїа Агд Гец бег Аза Авр Сув Уаії Уаі Уаі с1у сС1у сС1у Ше з9 (210) 50 зек б1у їем Сув ТПг Аза сіп Аїа Тей А1ї1а ТПг Агуд Нів сіу Уаі Щ1У 65 70 75 80
Авр Уаі1і Ггец Уаі! ТПг бі1ц Аза Агуд Азїа Агуд Рго с1у с1у АБп І1е ТЕГ 85 90 95
ТПг Уаі1 бій Агуд Рго бі біц б1у Тук Гец Тгр біц б1ц б1у Рго Авп 100 105 110 зек Рпе біп Рго Бек Авр Рго Уаі Іец ТПг Меє Аза Уаі Авр Бех щУу 115 120 125
Тецшц ув Авр Авр Гей Уаі Рпе сіу Авр Рго Авп Аза Рго Агд РПе Уаї 130 135 140 (516) Тем Тер біц б1у Ппув Гей Агуд Рко УМаї Рго Бек Ппув Рго Аїа Авр Гей 145 150 155 160
Ркго РіпПе Рібе АвБр Іецй Меє бек І1е Рго б1у Гув Гей Агуд Аїа с1Уу Іец 165 170 175 сб1у А1ї1а теп с1у Іїе Агуд Рго Рго Рго Рго сіу Акгд біц біц бек Уаї 180 185 190 бій бій Рбе Уаії Агуд Акуд АвБп о Теп сбіу Аї1а бій Уаі Рібе сій Агд Гей 195 200 205
І1е бій Рко Рбе Сув бек біу Уаії Туг Аїа с1у Авр Рго Бек Пув Іец 210 215 220 зек Меє пув Аїа Аза Рпе сі1у пув Уаі Тгр Акд ей бій бій ТПгЕ щ1У 225 230 235 240 сбі1у бек Іїе І1е сіу с1іу ТПкг Іїе Гпув ТПг Іїе сіп біц Агд бек Гув 245 250 255
АвпоРкго пуб Рго Рго Агуд Авр Аїа Агд Тецй Рго Пув Рго Ппув с1у сіп 260 265 270
ТПг Маії Аїа бек Ррбе Агуд Ппув сб1у Гецп Аїа Меє Тей Рго АБп Аїа І1е 275 280 285
ТПг Бек Бек Гей сіу бек пув Уа1! пуб Гец бек Тгр Гув Те ТПг 5ег 290 295 300
ІТІе ТБг пув бек Авр Авр Гув біу Тук Маї Іеп сій Ту бій ТПг Рго 305 310 315 320 бі б1у УМаї Уаії Бек Уаі сіп Аза Ппув Бек Уаі1і І1їе Мес ТіПг І1е Рго 325 330 335 зек Тук Уаії А1їа Бек АвБп І1е Тец Агд Рго Гей бБег бБег Авр Аза Аї1а 340 345 350
Авр Аїа Гей бек Агуд Рпе Тук Тук Рго Ркго Уаі Аза Аїа Уа1і ТіПг Уаї 355 360 365 зек Тук Рго пуб біц Аза І1е Агд їув5 б1іцп Сув Гей Іїе Ар с1у сіц 370 375 380
Тец біп с1у Рпе сіу біп Гей Нів Рго Агуд Бек біп сіу Уаії сбіц ТЕПг
Зо 385 390 395 400
Тец б1у ТПг Іїе Тугк Бек бек Бек Гей Рпе Рго Авп Агуд Аза Рго АБр 405 410 415 б1у Акд Уаї Гей Гей Гей Ап Туг Іїе с1у с1у Аїа ТБбг Ап Тс 01Уу 420 425 430
І1їе Уаї бек Ппув ТПг бій бек бій Гей Уаі бі Аза Уаії Авр Аг Авр 435 440 445
Тец Агд Гпув Меє Гей Іїе Ап бБег ТПг Аїа Уа1і Авр Рго Гец Уаї Іей 450 455 460 бі1у Маії Акуд Уаі Тер Рго сіп Аза Іїе Рго сіп Рібе Гец Уаї С1у Нів 465 470 475 480
Тец Авр Іїейп Гей біш Аїа Аза пув Аза Аїа Гей Ар Агд сіу с1іу Туг 485 490 495
Авр с1у Гей Рібе Іец бі1у б1у Авп Туг Уаі Аї1а с1у Уаі Аїа їеш 0Щ1У 500 505 510
Агуд Сув Уаі біц б1у Аза Тук бій бек Аза бек біп І1їе бек Авр РіПе 515 520 525
Тецп ТПпкг Ггув Ту Аїа Тук Гув 530 535 «2105 23 «211» 1635 «212» ДНК «213» йеа шаув «4005 23 агєдсеЕсдсЕє єдасеєдссес адссеЕсассс дссссасссс асссесаєсуд ссасдесеосс бо дсдсасасес дЕСсСдсссссд сстрасдсдсу деЕссссдсда сддсдддссс сддасддасссс 120 сдсдсадсдс ссдссадаєсс ддссдссдсс деЕсддсдсессу доддесадсдд дсесдсддасд 180 (516) чдсдгасаддс Есадасадад сдодсдЕдаас деаасоддсдЕ Ссдаадсоддс сдасадддасд 240 чддаддааада басоддассаа ЄЄСсСсддадддс доадЕссдссс ддоадаєдаадд адссаасасс Зоо аєдасадаадч деЕдчааєддада додссадсада ссдаєссдаєд ассссддессс асаадасааа З6о садсадсаєсєс ссаассссса асасаадсудє гасаєєдееса аадасддадс ассадсассд 420 агєєссеЕєсодд аєсссаєеєєс дсеаасдааа адсадсдссс ссссдасааа ассааадасєсс 480
ЧдсЧдЕсаєєвєє єєдЧдаассаєє єсеЕСвасаад ааадссааса саадааассс сддааааадед 540
ЕСЕЧчаддадс асссддадсда дачесдеЕсддду адссссвдсд аасодссасеЕс гддаададаа 6боо чЕЄЧЕєЧась аєєєвдеЕєда єссаєєсдса дссддаасаа дсдсаддада Сссададесса 6бо сбтаєсєссаєссс дессаєсдсасс сссадсаєєсд єддааєссда ааадааадста гддеЕссадее 720 аєгєєдеЕсдудед ссаєсеЕєдеЕсС єаадссадса дссаааддсд асссадсааа дасаадасає 78о чаєєсаєсад ддаааадаад даасадасда дсдссУсссс саєєєсаєда єддааєдсад 840
Есасєаасаа аєдсасссса сааєсєдаадеє досадаєчаса асдеєдаадсс гддасасадаа 900 чЕЧЕєЄЧЕСаєЄ Єддсаєдесас аєєєдаєсдда дЕссссдсас саддсаддед десаассссс 960 чЧЕєдаєєеєсда аддасадсду Едасааддас сеЕсдстадса ассааассеєв Едасдседее 1020 асааєдасад сеЕссаєєсдесєс аааєдЕсСсод аддаєдааде Есассааадд Еддадсессд 1080 чЕЄЯЧЕЄСЕвд асеЕессесесс єаадаєддає сасссассас баєсеєсссає ддеЕДдаседсе 1140 сЕсаадаадуд аєдаєдссаа дааассеєстьу дааддасеЕсдд доддЕСЕсаає ассесгасаад 1200 даасадсааа аасаєсудеЕсеЕ даааасссьс дооадасеЕсьсе сЕсссЕСаає даєдевссса 1260 чаєсдадсес сЕдаєдасса асаєєсасає асаасаєєсд Еєдоддоадеад ссасаагада 1320 чаєсєЕєдсьд дадсессаас дЕСвасєсьд ааасаасесд Едассесвда ссеЕсаааааа 1380 сЕСЕєддасу гададдуддса ассаассеЕсе дссаадсаєд гагассддудад аааєдсеЕсее 1440 ссЕєсЧдсасо дссаєдаєта садеєсьдса Есодаадсса гадаааадає ддадааааас 1500 сЕєсСсададЕ ЕСсСЕЄсЄСсСсасудс аддааасадс ааддаєдддс ЕсСЯсСЕДЕсЯд аадеЕдеЕваєва 1560 дсЕєсаддаа дсааддседс Едассеєгдса аєсеЕсасаєс єєдааєсьса сассаадсає 1620 ааєааєєсас аєєда 1635 «2105 24 «2115 544 «2125 РЕТ «213» йеа шаув
Зо «4005 24
Меє гей Аза гейш ТПг Аїа бек Аза бек бек Аза бек бек Нів Рго Туг 1 в) 10 15
Акуд Нів Аза бБег Аза Ні ТПг Агуд Агуд Рго Агуд Гей Агуд Аза Уаї Іей
З5 20 25 30
А1їа Меє Аза сіу Бек Авр Авр Рго Агд Аї1а Аїа Рго Аїа Агуд бек Уаї
А1їа Уаі1 Уаї с1і1у Аїа с1у Маї бек сі1у Гей Аїа Аза Аїа Туг Агд Іей з9 (210) 40 Агуд біп бек біу Маі Авп Уаі ТПг Уаі Рбе сій Аза Аза Авр Агуд А1а 65 70 75 80 сі1у б1у пув Іїе Агуд ТПг Ап бек сбіц біу бі1у Рпре Уаі Тгр АБр с1и 85 90 95 б1у А1а АвБп ТПпг Меє ТПг сіц с1у бій Тер бій Аза бек Агд Іецй І1е 45 100 105 110
Авр Авр Гец сіу Іец біп Авр Ппув біп біп Тук Рго Авп бек біп Нів 115 120 125
Тпув Агуд Тук Іїе Уаі Гпув Авр сіу Аза Рго Аїа Гей І1е Рго 5ег Авр 130 135 140 50 Рго І1їе бек Гей Мес Гпув бек бек Уаї Гей бек ТПг Гуз бек Ппув Те 145 150 155 160
А1їа гей Рібе Робе біц Ркго Рпе Гец Тук ув Гув Аза АвБп ТПг Агд Авп 165 170 175 зек с1іу Ппув Уаі бек бі бій Нів Гей бек бій бек Уаї сіу бек РБПе 180 185 190
Сув бій Акуд Нів Рпе сіу Акуд сій Уаі Уа1 Авр Тук Ріе Уаї АвБр Рго 195 200 205
Рпе Уаії Аїа сіу ТПг бек Аза с1іу Авр Рго бій бек Гей бБег Іїе Агд 210 215 220 (516) Нів Аза Рпе Рго Аїа Гецй Тер АБп Гецп сій Акуд Гуз Тук с1іу бек Уаї1ї 225 230 235 240
ІІе Уаї сі1у Аїа І1е Іїецй бек Ппув ІТецп Аї1а Аза Ппув с1у Авр Рго Уаї 245 250 255
Тпув ТПКг Агуд Нів Авр бек бек с1у Ппув Агуд Агуд Авп Агуд Агуд Уа1ї! 5ег 260 265 270
Рпе бек Рібпе Нів сіу сіу Меє біп бек Іїей І1е АБп Аїа Гей Нів Авп 275 280 285 бі Маї сб1у Авр Авр Ап Уа1і пув Ге с1іу ТПг сій Уаї Гец бек Іей 290 295 300
А1їа Сув ТПг РрБе Авр бі1у Маї Рго Аїа Іец б1у Агд Тгр Бек Ії1їе 5ег 305 310 315 320
Уаї Авр бек Ппув Авр бек с1і1у Авр Гув Авр Гец Аза бесг АБп біп ТПг 325 330 335
Рпе Авр Аїа Уаії І1е Меє ТПг Аза Ркго Іїецй бек Авп Уаі Агд Агкд Меє 340 345 350 пув Рпе ТПг Ппув с1іу сб1іу Аїа Рко Уаї Уаї Гей Авр Рібе Гей Рго Гув 355 360 365
Ме Авр Тук Гей Рго Гей бек Геш Меє Уа! ТПг Аза Рпе Гув Гув Авр 370 375 380
Авр Уа1 Ппув Ппув Ркго Іец бі1іц сіу Ррбе сіу Маії Іейп І1їе Рго Тук Гув 385 390 395 400 бі біп біп Ппув Нів сб1іу Гей Ппув ТПг Гей с1іу Тбг Гей Рібе бег 5ег 405 410 415
Меє Меє Рпе Рго Авр Агуд Аза Рго Ар Авр біп Туг Іец Тугє ТПг ТПг 420 425 430
Рпе Уаі сіу біу Бек Нів Авп Агуд Авр Тей Аїа с1у Аза Рго ТіПг 5ег 435 440 445
І1е Гец пув біп ІТец Уаї ТПг бек Авр Тецп Гпув Ппув Гей Гей сіу Уаї 450 455 460 бі б1у біп Рго ТПг Рпе Уа1 Ппув Нів Уа1 Туг Тер с1у АБп Аїа РБПе
Зо 465 470 475 480
Ркго Гец Тук біу Нів Авр Туг бек бек Уаі Гей біш Аїа І1е сій Гув 485 490 495
Меє сій пув Авп Гей Рго сіу Рпе Рбе Туг Аза б1у Авп бек Гув Авр 500 505 510 с1у Гей А1їа Уаї сіу бек Маї Іїе Аїа бек сіу бек їУув Аїа Аза Авр 515 520 525
Тец Аїа І1їе бек Тук Гей сій Бек Нів ТПг Ппув Нів Авп Авп бег Нів 530 535 540 «2105 25 «2115 1692 «2125 ДНК «213» Спіашудоштопав геіпНагкаєсії «4005 225 аєчаєдеЕєда сссадасесс гєдддассдсс асуддсеєста дссоддсудеЕс дсадаєссдс (216)
Есддсеєдсодс асдеєсеєссодс сааддссдсд ссссддссса сддссасєсссс ддесдсдадс 120 сссдсдассд седсдадссс сдсдассодсу дсддсссудсс дсасасесса ссдсаседсе 180 чдсддсддсса сеЕддЕдсссс сасодддсдеєсс ддадссоддсу Єсдссаадас дсеЕсдасаає 240 чЧчЕЧДЕаєдаса єдаєсЧдєдає содеЕдддадді сссссдддсесс сддєдассдуда ссаддесстгд Зоо дсддсеЕСсСадс асааааєєса даасеЕссссс дссасододадда сссдсдадсд сдссддсдадас З6о аасаєсасудє ссаєдеЕсоддд счаєддссас дсдсдддадда адддсссдаа садсесссад 420 сссаасдаса дсасдссдса дассдсоаодесд дассссддсс дсдадаадда ссЕсдЕдеєс 480 чдадЕдасссса соуддсЕссссу сЕєсСЯдєдесодЯ Сооддадоадса адседсдссс суєдсссесд 540 чдассеЕддасуд ссеЕєЄсассеє сдассссасд сссаєсссссу дсаадаєссд сдссодддассгд 6боо чдасдссаєсд дссесаєсаа соодадссасд сссссссссоа аддададсдс ддадсадеєс 6бо аєссдссдса ассеєдддсда ЄдчадасдеЕсс ссссдасстда Ссддадсессєс ссдсессддас 720 чЧЕдЕасдсдд дсдассссеєс саадссдссс асдааддсдд сссссаасад даєсссддвдасс 78о (516) сЕддадчаада асдодсддсад сссдодсдода додсдссаєса адссдеЕєсса ддаасдссад 840
Єссаасссдуд ссссдссудсу ддасссдсудс седссудссса адсссааддд ссадасоаддеЕд 900 чЧдасЕСЯдЕЄсСсС дсааддодсся даачасдссд ссддасдсса Ссдадсдсаа саєсссссдас 960 аачзаєссдсда Єдаасєддаа дсеЕдоасдЕсЕсс ссдддссдсд аддсоддасдодд дсоддсас4д4дад 1020 сЕддЕдсасу асасудсссда доддссуєдеєс ааддЕдеЕсєсд сссдсдессує ддсеЕссдасс 1080 дсдсссадсеЕ асдєддеєдоадс ддасссддсс ааддадсадд сдсссдссдс сдссдаддасс 1140 сЕдддсЕсСсЕ Есдассассс дссоддеЕдоадс дссудєдасдс єдЕСЯдсассс дсеєдадсдесс 1200 чЧчЕдсодддадд адсдсааддс сеЕсддасддда Сссдсдссодд дсЕссддеса дседсасссд 1260 сдсасдсадд дсассассас ссосдддсасс асссасадсс ссадсссдес ссссддессдс 1320 дсдсссдадд дссасаєдсе дседсссаас сбасассддсд дсассассаа ссдсддсаєс 1380
ЧдЕСсСаассада ссассдадса дседодсддад саддсддаса аддасссдсд саасаєсддЕс 1440 ассаадсссуд асдсдсссаа дссссусоавоа дЕдддсоасдс дсоаєдсдоадсс дсдсоассаєсс 1500 ссдсадссса асссдддсса сссддадсад седдасаадд сдсдсааддс дсгддасдасд 1560 чдсаддадсеЕдс адддсдєдса сседдддддс аассасдєсса дсоддЕдсддс ссгдддсаад 1620 чЧчЕЧдЧдЕддадс асоддсрасда деЕсСсдсадсс аассгсддсса ададсдсдсс сааддссдса 1680
ЧдЕсааддссєЕ аа 1692 «2105 26 «2115 563 «2125 РЕТ «213» Спіаштшудоштопавз «4005 26
Меє Меє гей ТПг сіп Тбг Рго сб1іу ТБг Аза ТБПг Аза бек бек Агд Агд 1 в) 10 15 зек біп І1е Агд бек Аї1а Аза Нів Уа! бек Аї1а Гпув Уаі Аїа Рго Аг4д 20 25 30
Рго ТПг Ркго Рібе бек Уаі Аїа бек Рго Аїа ТПг Аза Аза бек Рго А1а
Зо ТПгЕ Аза Аза Аза Агуд Агуд ТП Ге Ні5 Агуд ТБг Аза Аї1а Аза Аїа ТЕіг з9 (210) б1у Аза Рго ТПг Аза бек сіу Аїа сіу Уаі Аїа Ппув ТБг Гец АвБр Авп 65 70 75 80
Уаї Тук Авр Уаі Іїе Уа1! Уаї сіу сіу сіу Пец бек бі1у Іецп Уаї ТПг
З5 85 90 95 сбі1у бі1іп Аїа Геш Аза Аїа сіп Нів Ппув Іїе біп Авп Рібе Гец Уаї! ТЕПг 100 105 110 бі Аза Агуд сій Агуд Уа1 с1і1у с1у Авп І1е ТПг бек Меєс бек б1у Авр 115 120 125 40 сіу Тук Маії Тер бій бій б1іу Рко Авп бек Рре сбіп Рго АвБп Авр 5ег 130 135 140
Меє гей сбіп Іїе Аза Уаї Авр бек сіу Сув біц Гув Авр ІТецп Уаї РПе 145 150 155 160 б1у Авр Рго ТПг Аза Рго Агуд Рпе Уаі Тер Тер сій с1і1у Пув Іец Агд 45 165 170 175
Ркго Маії Ркго бек біу Іїецй Авр Аїа Ропе ТПг Рпе Авр Гей Меє бек Те 180 185 190
Рго сіу Ппув І1е Агд Аї1а сС1у їец сС1у Аза І1е сС1у Гей Іїе А5Бп щу 195 200 205 50 А1їа Ме Рго бек Рпе біц сій бек Уаі біц біп Рбе І1е Аг9д Аг9д Авп 210 215 220
Тец б1у Авр сій Уаі Рпе Рпе Агд Гей Іїе бій Рго Рібе Суб бБег 01Уу 225 230 235 240
Уаї Ту Аїа с1у Авр Рго бек Пув Гей бек Месє губ Азї1а Аз1а Рпе Авп 245 250 255
Акуд І1е Тер І1е Іецшп б1іцп Гув Авп обіу бі1у бек Геи Уаі с1у сС1у Аї1а 260 265 270
І1е пув Гец Роре біп б1п Агуд біп бек АБп Рго Аза Рго Рго Агд Авр 275 280 285 (516) Рго Акд Гемй Рго Рго Ппув Рго Ппув с1іу біп ТПг Уаї с1іу бек Рібе Агд 290 295 300 їпув б1у Гей Ппув Меє Гей Рго Авр Аза Іїе бій Агуд АвБп І1е Рго АБр 305 310 315 320
Тпув І1е Акуд Уаі Авп Тер пув Гей Уаі Бек Гей сС1у Агд біц А1а Авр 325 330 335 с1у Акуд Тук б1у пеп Уа1ї Туг Авр ТПг Рго сій с1у Акуд Уаї Ппув Уаї 340 345 350
Рпе Аїа Агуд Аїа Уаі А1ї1а Гей ТБПг Аза Рго бек Туг Уаі Уаі Аїа Авр 355 360 365
Тец Маї гув сбіш біп Аїа Рго Аїа Аза Аїа сій Аїа Гец сіу бек РБПе 370 375 380
Авр Тут Рго Рго Уаі б1у А1ї1а Уа1! Тс Іецй бек Тук Рго Гей бек Аїа 385 390 395 400
Ууаї Акд бі бій Акуд пув Аза Бек Авр сіу бек Уаі Рго б1у Рпе ШУ 405 410 415 сіп Гей Нів Рго Акуд ТПг сбіп с1іу І1е ТПг ТПг Гей с1іу ТПг І1е Туг 420 425 430 зек бек бек ІТец Рпе Рго сб1у Агд Аїа Рго бій сіу Нів Меє Гецй Гей 435 440 445
Тец АБп Туг Іїе сі1у с1у ТПкг ТПг Авп Агуд сб1іу І1е Уаї АвБп сбіп Тс 450 455 460
ТП біц біп Гец Уаії біц біп Уа1і Авр пуб Авр Тец Агуд Авп Меє Уаї 465 470 475 480
ІТІе пув Рго Авр Аза Рго ГПув Рго Агуд Уаі Уаі сіу Уаі Агуд Уа1і1 Тгр 485 490 495
Рго Акгд Аза І1е Рго сбіп Рпе Ап Гей сіу Нів Гецп сій сіп Тецй Авр 500 505 510 пу Аз1а Агуд гув Аза гейш Авр Аза Аза с1іу Гей сіп сіу Уаї Нів Іей 515 520 525 сбі1у б1у Авп Туг Уа1і Бек сіу Уаі Аїа Гей сіу Ппув Уаї Уаї сб1іц Нів
Зо 530 535 540 сбі1у Тук бій Бек Аза Аїа Ап Гей Аїа Ппув бек Уа1 бек пув Аза А1а 545 550 555 560
Уаї ув Аїа «2105 27 «2115 1734 «2125 ДНК «213» Ро1убощте11а 5р «4005 27 аєдеЕСсдчадеЕє ссдсастаад дстаєсаєсдс дддсдаасаа ЯДЕСССсСССсСсаа сссасдссаа бо ааасаєссеєс сЕсссЕсеЕсСЕ деСсасааєсу Єсдассеєсаа ассссесаас ссасєссоассяе 120
Ессооасадса сеЕсСаєчасдє счдєсодєсЯєЕ доаєдссоодаа СЄСЕССДЯЯЯЧЄЕСЄ дЕСТасодсс 180 саадсассса дсасссааса Саадаєсдає аасдеЕсстда єсасеєдаадс єдаєсаєсдие 240 чЧЕаддсддеєа аааєсасдас дааааддааєсє ааачассссс содсоддадда дддсссааає Зоо адеЕєдсстаа Єдаасдасдс ЕЄвавсаєссдяс дссдсссдад асдссддсдас ддаасссааа З6о авєєсвтаєсдд содаєссааа аєсассасдусє ЄСддасєсссЯаєс доадддЕсдаєссЯа Єссдасоаєс9агд 420 дсессссаєєд даадстасудс СЕгааааєсс дасссееєсає ссасссаадда сссасеєссЧе 480 чдссаєссдад дадесасадд ЄЕЕгодЯдсдсд єсассуддсес сасстааддад єсаддаддвад 540 адсдєддадд дсЕсЕдеЕсєсо асодасссса ддадасдада СЄЕСссдадсу асссдеЕсдад 6боо сссЕсссдсе ссододдессса сосододдддає ссгадсааас єдессауурусд ссдседсеееес 6бо чддаааасеєєд єддааєєсдча ададчасдддадс дасддсадсес бассссдсддд сдссЕссс9ае 720 басдєааєда асааасдасу сдааадаадуд асддоадсддаду сдааадасдда ддасасодеЕс 780 сссссдаасуд адасддссаа ддсасссааа ссарссесьд дсссаасадо арсдеоесеес 840 чачдаддодддаа Єсдадаєссє дсссааддсс ассдсдсааа адссдддаєда Ссддадесссде 900 сЕсддсссас дасссдсдсд сассдаєссс асдсадсссу сддаєсддабас дасадсддгас 960 сдЕсСЕдЕсСдЕ ассдеЕсудає дадесаєсаа ддсдаєдасу асеЕсдадесд басддсадве 1020 (516) ЧдсЕдсассодс деЕасодсдда додчоаодаєсєдеЕс дсододсододадоуа асчдаддасодс соасоддвеЕдвдвад 1080 чЧчЕдЧдЕддсда адааддєсдЕ дсеЕдасдасд ссддсаєєсу асдссдсуда саєсеЕсдессд 1140 садбЕЕССсСдЯдсЕ Едудсддсоддс ддсдаасссу Есдааддадд Еддаєсасссо дссадеадсд 1200 гЕгЕдЧдЕСЯЯЄЕС ЕЕссдрасда сдЕсдасссуд аєсессдсса басассдсдЕ дадессасаєд 1260 чдсЕСсаєддсс Єсадсудессе Єдудссаасьс сасссесусс сададддеЕсь ссубасаєта 1320 чддаассаєесє асддсадтас астарсссс аассуєесссо ссдбадсесуд басддасдсесе 1380
ЄЕаааєєссу Єєдоасодаєс сассдассЯяє дсадсоддадЕ ссдсддаєсс аасдасЕст 1440 чсдаєддадда Єддаєссдда ЕсЕдааааад адсуддудєєда Ессдададд адссдсддаад 1500 ссадаадесс ЕсуддуддЕдаа адгагаєсса ааддсваєєсс сессадееєсда саєєддеЕсає 1560
Єгддаєсдад Єддааааддс сааааєдаєд Сгааадаасу аааддддоада Едсадаєс9д 1620 адєЕддддєса аасеЕддсудду аааєстаєдед сдсоддсдеєсу садедддсад асдсасадаа 1680 гЕсддаєєссу аааєсосода даасесддсд саддааєєдуд сдадаааааа асад 1734 «2105 28 «2115 577 «212» РЕТ «213» Ро1уєоштеї1їа «4005 28
Месє бек бек бек Аїа Тей Агуд Гей Гей Сув с1у Акуд ТПг Бек Рпе Ріе 1 5 10 15
Ап оГец Сув біп Гуз Тук Рго Рго бек РПе Гей бек біп Гей бек ТЕПг 20 25 30
Тец АвБп о Рпе бБег ТПг Нів бек Рго Рпе Авр бек ТПг Туг Авр Уа1ї! Уаї
Уаї Уаї б1у Аїа сіу Іїе бек сіу Гей бек ТПг Аза біп Аза Іецй 5ег бо
ІІе сбіп Нів губ І1е Авр АвБп Уа! Іец Уаі ТПпг сій Аза Авр Нів Аг4д 65 70 75 80
Зо Уаї б1у 61у Ппув І1їе ТБПг ТПг Гув Агуд Авп о Гув Авр Робе Гей Тер с1и 85 90 95 бі б1у Рго Авп Бек Сув Гей Меє Авп Ар Аїа Гей Туг Агд Аїа А1а 100 105 110
Акуд Авр Аза сіу Уаі біцп бек пув І1е Іецй бек Аза Авр Рго Пув Іец
З5 115 120 125
Рго Агд Тгр І1е Іецй Тгр сб1у Агд Агд Іецй Агд Уаі Аза Рго Іе .Щ1У 130 135 140 зек Тут Аїа Іїец пуб бек Авр ІТец Іец бек ТПг сіп с1у Гей Гей Агд 145 150 155 160 40 А1а чІ1е Акуд сіу УМаї ТПпкг сіу Рпе сіу Уаї бек Рго Аза Рго Рго Тув 165 170 175 сбі1у б1іп бій бій Бек Уаі1 сіц сі1у Рпе Уаі Агуд Акд ТБПг Гец с1у Авр 180 185 190 бі І1е Рпе сій Агуд Гей Уаі1і сій Рго Рпе Сув бек сіу Уаї Туг А1а 45 195 200 205 б1у Авр Рго Бек Кпув Гей бек Ме Агуд Аїа Аза Рпе сіу Пув Іец Уаї 210 215 220 бі Рпе бій сій ТпПг б1у Авр сіу Бек Гей Гей Агуд сіу Уаії Робе Агд 225 230 235 240 50 Тук Маії Меє Авп Гув Агуд Агд бій Агуд Агуд ТБг сбіу б1у Аїа Гпув Авр 245 250 255 б1у Авр ТПг о Уаі Рго Гей Авп бій ТпПг Аїа пув АТа Рго пуб бек вег 260 265 270 зек сіу Рго ТПг Уаії бек бек Рпе біц с1у с1у І1е сій Іїе Гей Рго 55 275 280 285 пу Аї1а І1е Аза сіп пув Гей с1у Авр Агуд Уаі Агкд Гец с1у Гей Агд 290 295 300
Тец Маії Агкуд І1їе Авр Рго ТПг сбіп Геш Аза Авр с1іу ТПг ТПг Аїа Туг 305 310 315 320 (516) Агд Гей бек Туг Агуд Агуд Меє бек Нів біп б1у Авр Авр Авр бек 5ег 325 330 335
Акуд ТЕ Аза сбі1у Аїа Уаії Рго Акд ТПг Аза бій с1у Авр Уаі Аїа А1а 340 345 350 б1у Авр бій Авр Аза Уаі1 Уаі1і сій Уаі Уаі1і Аїа Ппув Ппув Уаї Уаї Іей 355 360 365
ТПЕ ТрПг Рго Аїа Рбе АвБр Аїа Аза Авр І1їе ІТей бБег Агд бек с1Уу Гей 370 375 380
Ууаї Аза Аза Аїа Ав5п Рго Гец пув сій Маії Авр Туг Рго Рго Уаї Аїа 385 390 395 400
Тец Маї Уаї Гей бек Туг Авр Уаі Авр бБег ІїІе бБег Аї1а І1е Нів Аг4д 405 410 415
Уаї Бек Нів Уаі Аїа Нів сіу Гей бек сіу Роре сбіу біп Іецй Нів Рго 420 425 430
Акуд Рго біц біу Тец Агд ТПг Гец сіу ТПг І1е Тук сіу бек ТПг Іей 435 440 445
Рпе Рго Авп Агуд бек Рго Уаі Аїа Акуд ТПг ТПг Гей Гей Авп Ріе Уаї 450 455 460 бі1у б1у Бек ТПг Авр Агуд Аїа Уаі сіу Бек Аза Авр Рго Меє Аза Гей 465 470 475 480
А1їа Меє сіц Уаї Авр ІТец Авр Гец Туз КГув бек с1у Гей Іїе Агд сіц 485 490 495 сб1у Аї1а Аї1а Ппув Рго біш Уаі1і Гей сіу Уаї пув Маї Тук Рго пув Аїа 500 505 510
ІТ1е Рго біп Рбе Авр І1е сіу Ні Іецй Авр Агуд Уаі бій пув Аїа Гув 515 520 525
Меє Мес еп Ппув Авп бій Агуд біу сб1у Аза Авр Тгр бек с1іу Уаї Тув 530 535 540
Тец А1а с1у Авп Тук Уа1 Сув сіу Уаі Аїа Уаі1 с1у Агд Сув І1е б1ц 545 550 555 560
Рпе с1у Рпбе біц І1ї1е Аза сій Ап Гей Аїа сбіп сіц Гец Аза Агд Гу
Зо 565 570 575
Тув «2105 29 «2115» 1635 «2125 ДНК «213» вогодпит рісої1ог «4005 29 аєдсеЕсдсеЕсС ддасеєдссас додєсЕСсСсСссс ассссддєссс асссссаєсс ссаєссдсссос бо ассЕСссдсеЕсС дсадеЕсєсся ссрасадєссд дЕссссдсда сддсдддссс сдасдасесс 120 сдсдсадссс ссдссаддесс ддссдссдсс деЕсСддсдсессу доддесадсодд дсеЕсдсдоасд 180 чдсдбасаддс Єсаддаадчад соддсоасЄдаає дсдасоддсдс Ссдаддсддс сдасадддасд 240 чддаддааада гбасддассаа СЕССДаддудс доОдДЕСсЕСЕСС ододддаєдаадуа адсдаасасс Зоо аєдасадаадч дедчааєєдда додссадсада ссдасадаєд ассссддссс асаадасааа З6о садсадсаєсєс ссаассссса асасаадсудс гасаєєсдсеса аадаєддадс ассадсастд 420 авгєєссеЕєсодд аєсссаєеєєс дсеєдаєдааа адсадесдссс сссссасааа ассааадасєсс 480
ЧдсЧдЕсаєЕєєвєє єєдЧаассаєе єсЕеЕССсСасаад ааадссааса саадааассс Сддаааадса 540
ЕСЕЧаєсдадс аєссдчадсда дачесдеЕсСдду адссссеЕссуд аасодссасес содаададаа 6боо чЕЄЧЕєЧасе аєсеєваєєда єссаєссдса дссддаасаа дсдсаддада Сссададесса 6бо сбтаєсєсстассс дссасдсасс сссадсасьтд єддааєссодда ааадааааса СддеЕссадссес 720 чЕЄЕЧЕєЯдЧдеєд ссаєсеЕвєдеЕсС єаадссааса дссаааддсд асссадсааа дасаадасдао 78о чаєєсаєсад сдаааадаад дааєсадасдс дЕдссЯсЕсс сасєсссаєдда сддааєсдсад 840
Есасєаасаа аєдсасссса сааєсєдаадеє досадаєчаса асдеєдаадсс гддасасадаа 900 чЕЧЕєЧЕСаєЄ Єддсодєдсас аєсадаєсдда дссссодсас саддсдддаєд десаассссс 960 чаєдаєєеєсда аддаєдсвад Еддсааддас сЕсдстаааа ассааассеєв Едасдседее 1020 асааєдасад сеЕссаєсдесєс аааєдеЕссад аддаєдаадеі Єсасаааадд Еддадсессяе 1080
ЕЕсЯЕеСсад асеЕеЕссесеєсс єааддєддає сасссассас бассєсєсає даєдаседсь 1140 (516) сЕсаадаадуд аадаєдссаа дааассеєстьу дааддасеЕсдд дсдєсЕсаає ассстасаад 1200 даасадсааа аасаєсудеЕсеЕ ааааасссьс дооадасеЕсься ЕсеЕсСсЕСяаає даєдеЕсссса 1260 чаєсдадсес сЕдасудасса асаєєсасає асаасаєєсд Еєдоддоадеад ссасаагада 1320 чаєсєЕєдсьд дадсессаас дЕСвасєсьд ааасаасесд Едассесвда ссеЕсаааааа 1380 сЕСЕсадудсу басаддуддса ассаасесеЕсеЕ дссаадсаєа гагассддудад аааєдсеЕсее 1440 ссЕЕсЧдсаєсу дссаєдаєста сааєєссддса Есоодаадсста гадаааадає ддадааааає 1500 сЕЄСсСсадоадЕ ЕСЕСсССсасдс аддааасаас ааддаєдддс ЕЄдсЕдЯЧЕвда дадесоаєтаєа 1560 дсЕєсаддаа дсааддседс Едассеєгдса аєсеЕсубаєс єєдааєсьса сассаадсає 1620 ааєааєєвас аєєда 1635 «2105 30 «2115 544 «212» РЕТ «213» вог9дПит «4005 30
Меє гей Аза Агуд ТпПг Аза ТПг Уаї бек бек ТПг бек бек Нів бек Нів 1 5 10 15
Ркго Туг Агд Рго ТПг бек Аза Агд бек ІТецй Агд Гей Агуд Рго Уаі1ї Іец 20 А1їа Меє Аїа сіу бек Авр Авр бек Агуд Аї1а Аїа Рго Аїа Акуд бек Уаї
А1їа Уаі1 Уаї сі1у Аїа с1у УМаї бек б1і1у Іїецпй Уаі Аза Аїа Туг Аг9д Іецй бо
Акуд пув бек біу Уаі АвБп Уаії ТПпг Уаі Рпе бій Аза Аїа Авр Агуд Аїа 25 65 70 75 80 сі1у б1у пув Іїе Агуд ТПг Ап бек бі с1іу с1іу Рбе Гей Тгр АвБр бій 85 90 95 б1у А1а АвБп ТПпг Меє ТПг сіц с1у бій Гей бій Аза бек Агд Іецй І1е 100 105 110
Зо Авр Авр Геч с1і1у Гей сбіп Авр Ппув сбіп сіп Туг Рго АвБп бек сіп Нів 115 120 125
Тпув Агуд Тук Іїе Уаі Гпув Авр сі1у Аза Рго Аїа Гей І1е Рго 5ег Авр 130 135 140
Ркго І1їе бек Іец Меє Гув бек бек Уаі! ТІецй бек ТПг Ппув Бек Ппув Те 35 145 150 155 160
А1їа гей Рібе Робе біц Ркго Рпе Гец Тук ув Гув Аза АвБп ТПг Агд Авп 165 170 175
Ркго сіу Ппув Уаі Бек Авр бій Нів Іец бек бій Бек Уа1і с1у Бек Ре 180 185 190 40 Рпе сії Акуд Нів Рпе сб1іу Ак9д бій Уаії Уа1і Авр Тук Гей І1е АБр Рго 195 200 205
Рпе Уаі Аза сі1у ТПг бек Аза б1у Авр Рго сій Бек Гей бек І1е Сув 210 215 220
Нів Аїа Рпе Рго Аїа Гец Тгр Авп Гец біц Агд Гу Тук с1у Бек Уаї 45 225 230 235 240
Уаї Уаї с1у Аїа Іїе Гей бек Ппув Гей ТПг АТїа пуб б1у Авр Рго Уаї 245 250 255
Тпув Тпг Агуд Агуд Авр обБег бек Аза Гпув Агуд Агуд Авп Агуд Агуд Уа1ї! 5ег 260 265 270 50 Рпе бек Рібпе Нів сіу сіу Меє біп бек Іїей І1е АБп Аїа Гей Нів Авп 275 280 285 бі Маї сб1у Авр Авр Ап Уа1і пув Ге с1іу ТПг сій Уаї Гец бек Іей 290 295 300
А1їа Сув ТПг Ггец Авр б1у Аз1а Рго Аїа Рго сбі1у с1у Тгр Бек І1їе 5ег 55 305 310 315 320
Авр Авр бек пув Авр Аза бек біу їув Авр Те Аза Ппув Ап біп ТЕГ 325 330 335
Рпе Авр Аїа Уаії І1е Меє ТПг Аза Ркго Іїецй бек Авп Уаі біп Агкд Меє 340 345 350 (516) пув Рпе ТПг Ппув с1іу сб1іу Аїа Рко Робе Уаії Гей Авр Рібе Гей Рго Гув 355 3З6о 365
Уаї Авр Тук Гей Рго Гей бек Гей Меє Уа! ТБПг Аза Рпе Гув Гув с1и 370 375 380
Авр Уа1 Ппув Ппув Ркго Іец бі1іц сіу Ррбе сіу Маії Іейп І1їе Рго Тук Гув 385 390 395 400 бій біп біп пув Нів с1у Гей Пув ТПг Ге с1у ТПг Гей Ріре бек 5ег 405 410 415
Меє Меє Рпе Рго Авр Агуд Аза Рго Ар Авр біп Туг Іец Тугє ТПг ТПг 420 425 430
Рпе Уаї сіу сіу бек Нів АвБп Агд Авр тей Аза с1у Аза Рго ТПг 5ег 435 440 445
І1е Гец пув біп ІТец Уаї ТПг бек Авр Тецп Гпув Ппув Гей Гей сіу Уаї 450 455 460 біп б1у біп Рго ТПг Рпе Уа1 Ппув Нів Іїе Туг Тер с1у АБп Аїа РБПе 465 470 475 480
Рго Гпеп Тук біу Нів Авр Туг Авп бек Уа! Іеп біц Аїа І1е сій Гув 485 490 495
Меє сій пув Авп Гей Рго сіу Рпе Рбе Туг Аза б1у Авп Авп Гув Авр 500 505 510 сб1у теп Аї1а Уаії сіу Бек Уаі1і І1ї1е Аза Бек сіу бек Гув Аїа А1а Авр 515 520 525
Тец Аїа І1їе бек Тук Гей сій Бек Нів ТПг Ппув Нів Авп АвБп Іецй Нів 530 535 540 «2105 31 «2115 1017 «2125 ДНК «213» Спіогеї1а 5р
Зо «4005 31 аєддссеЕсса садсаасасе дсасоддсдсд сссгдссдсс сддсдсддес сдсдддссдас бо сддсасассд садсассдад сасссадсас аардддссдс дссгддсддс садддедсад 120 садсддаадд дддсадддда дсддсдсссуд дсасрдсудбда гбдсаддсессдс ссаддесессе 180 сссдадаадд сдддддсдад сасадддадс дсадсадасд асадсддсдє Егсасдасаре 240 чЧЕдЧЕСсСЯгоЯд дсодссодсає сеЕссддсессес ассассуссс аддсудсеєдас сасдсадсас Зоо адсддсЧдєда содсоддсодддє дседодсєдасс дадддссодсд ассдсдбддад соддсаасаєс 3З6о ассЕСсСсЯдєдЕ ссаасаадда ддвадоаддссд ссдсдддадда аддддесссаа сссеЕсссад 420 ссааасдасс ссасссодса ддссдсддсд дасдссддсд гддсоддасса дседдтастд 480 чдасдасссса соддсдссодсЯ ЄЄЕсєЯдсдсас сдддасаада адссдсдссс сасдсссєсс 540 дадассссдасуд сосссасдєє сддассєдаєудд адсасєсуєдуа дсаадаєссд двдсдоаддоадсед 6боо чдасдсодсеєдоа дсЕЄсааддс дсссасдсса дассасдада ададсдсдда дсадсаєсдед 6бо сддсдсаасс Сдддддссда ддсдсЕссдад содссрдаєсу адсссеєсстьд садсоддсаєд 720
Басдссддсуд ассссаадаа дседеЕсСсасд ааддсуддсесеЕ ЕгддсааддЕ драсдасстд 78о0 чадчаачаадд дсддсадсає саєдоадсддс десдаєссаадс сЄдаєсссадда дсддсдсдсс 840 аасссдссдс содссдсдсад сссадсдсвуд ссдсссаадс ссдсдддсса дасдоаєсодоас 900
ЕссЕЄссодсеЕ ссоддссеєдсу сасоассдссу даєсдссаєсдда соддсдсоддсс дддадасдас4д 960 чЧдЕдсдсасса дсеЕддсадсе сааддадссс адсааддаад дддаддссста саадсда 1017 «2105 32 «2115 338 «2125 РЕТ «2135 Спіогеї1а «4005 32
Мен АзТа бек ТПг Аїа ТПг Ггец Нів сіу Аза Рго Сув Сув бек Аї1а Аг4д 1 в) 10 15
Рго Уаі сб1у Агд Агуд Нів І1їе Аї1а Аза Рго бек Іїе сіп Нів Ап 0щ1У 20 25 30 (516) Рго Акд їеп Аїа А1ї1а Агуд Уаі сбіп сіп Акуд Гув б1у Аїа с1у біч Агд 35 40 45
Акуд бБег Аїа Гец Агд Уаі біп Аїа Уаі біп Аза Рго Рго бій Гпув Аїа 50 з9 (210) б1у А1їа бек ТПг сіу Бек Аза Аза Авр Авр бек сіу Уаї Туг Авр Уаї 65 70 75 80
Уаї Уаї Маї с1у Аїа сіу І1е бек сі1у Гей ТПг ТБг Аза сбіп Аїа Гей 85 90 95
ТПгЕ Тпкг біп Нів бек біу Уаі Аїа Агуд Агд Уаі І Уаі ТПгЕ бі щу 100 105 110
Акуд Авр Агуд Уаї! біу б1у АвБп І1е ТПг бек Уаії бек АвБп пув бій сіц 115 120 125 с1у Гей Гей Тр бі біц с1у Рго Авп Бек Рпе біп Рго Авп Авр бег 130 135 140
І1е гец біп Аї1а Аза Уаї Авр Аї1а сі1у Маі Азїа Авр сіп Гей Уаі1ї Іец 145 150 155 160 с1у Авр Рго ТПг Аїа Рго Агу Рпбе Уаї Тук Тер Авр Гуз Гув Гей Агд 165 170 175
Ркго ТПг Рго бек біу Рго Авр Аїа Іїецй ТПг Рпе Авр Гей Меє бек Те 180 185 190
Ууаї с1у пув Іїе Акуд Аїа сіу гейш сіу Аїа Гец сі1у Рпе Гув Азїа Рго 195 200 205
Меє Рго Авр Ту бій сій бек Уаі сій сбіп Тук Уаі Агд Агуд Авп Гей 210 215 220 сб1у Аї1а сій Уаі Рпе бій Акд Гей І1їе бій Рго РібПе Суб бек біу Уаї 225 230 235 240
Тук Аїа с1у Авр Рго Ппув пуб Гей бек Меє Пув Аїа Аза Рпе с1Уу Гув 245 250 255
Уаї Тук Авр гейш бій пув пув сіу сіу Бек І1е Уаі с1у с1у Уа1і Ше 260 265 270
Тпув Теп І1е сіп бій Агуд Агуд Аза АвБп о Рго Рго Рго Рго Агд бег Рго
Зо 275 280 285
А1їа Гей Рго Рго їув Рго А1ї1а сіу біп ТПг Уаї сіу Бек Ррпе Агд 5ег 290 295 300 сб1у Гей Акуд ТПг Гей Рго Авр Аза Меє Аза Аза Агд Гец сС1у АБр А1а 305 310 315 320
Уа1 Акуд ТрПг бек Ткгр біп Гецш Гуз біц Гей бек їув біц о1у сбіц А1а 325 330 335
Тук Гув «2105 33 «2115» 1611 «2125 ДНК «213» Огула вагіха «4005 33 аєддссдсесуд ссдссодсадс саєддссасс дссассєсссу ссасддсадс дссдесусес бо сдсаєсссдсд асдссдсдад даддасссдс сдасдсддес асдасєссдссд сдссдессдесс 120 адсддсдсдд ссдаддсдсс сасоадсдссс ддддсоасоада ЄдеЕсддсодда ссдсдаєссдаєд 180 чЧЕддадсдодсд дсассадсудд дсеЕссСдсасс дсодсаддсдс Єддудссасааа дсасоддсдеЕс 240 чдасчдасдєдс ЄсдеЕсасоода ддсссдсдсес содссссудудасу дсаасаєсас сассдссдад 300 сдсдссддсд адддссассо ссдддаддад дддсссааса дсеЕсссадсс ЕЕссдасссс З6о
ЧдЕСсСсСЕСасса ЕЄддссодєдда садсодддссс ааддасчасєс ссдЯясдЕссдда ддассссаас 420 дсдссоадсоадЕ ЄсдєдседеЯд ододадоаддаад ссааддссдд бдссдсссаа дсссддсдас 480 сЕдссЯвЕсСЕ ссодассеєсає дадсассссс додсаадсеса додссддссс гддсодсдсес 540 часЧдсєєсдад сдссассеєсс аддоадсдсєдад дадссддсда аддасесссдс дсддсдсаас 6боо сеЕсддсдсдд аддессссда дсдссеєсарс дадссеЕсссЕ дсеєсаддеєдеЕ дгаєсдстгодде 6бо чаєссеЕєсаа адсеєсадеає даадодссдса сСссооддаадда Сдсддаддадсс ддаддасасс 720 чдчдаддєадса єсаєєдадеєдуа аассаєсааа асаасссадда ададддддаа ааассссааа 78о (516) ссдссдадду асссссудссс Ессаасудсса ааддддсадча садссдсаєс ссеЕСаддаад 840
ЧдаЕєСЕДЯдаста єЄдсЕСсСссоода Єдсваєссаса сСссаддссда дсадсааадс сааасеєссса 900
Еддаадеєєда саадсаєсас ааадесадас аасаааддає асдсаєсаде дсаєсдаааса 960 ссадааддду ЕддЕсЕсдудЕ дсаадссааа асеЕдеЕєдеЕСа Едассаєссс ассаваєдцье 1020 чдсбЕадеЕдава ЄсесЕдсдудес асеЕсєссааці даєсдсадсад аєдсеЕссуєс ааграєсстває 1080 баєссассад ЕЕДдДСсСЕдсСЕдЕ аасеЕдеЕесса сасссаааад аадсааєтад аааадааєсдс 1140
ЄЕааєєдасу дададсссса дддєЕссуддс садссдсаєс содсудаєбадеса двдададседад 1200 асЕсєсаддаа саагаєаєад сссаєсасьс сЕсссаааєс деЕдсЕСсСсадс Еддаадоадід 1260
ЕгасеЕсєседа ассасасаду аддЕсєстаса аасасадудда ЕЕДдДЕсЕеЕСсСсСаа дасєдаааде 1320 чадсєддсад аадсадсєда ссдеЕдассес аддаадаєдс Єдаєаааєсс сааадсадед 1380 часссЕєсдуд єссЕсдддсЯдЄє ссудудбаєдда ссасаадсса бассасадее ссеЕсаєєддс 1440 саєсєєдаєс асссеєдаддс єдсааааєсяі дсссеЕдддса ааддеЕддеєвта сдаєдчаєсвд 1500 вЕССсСЕСЧддад ддаастаєдеЕ Едсаддадеьс дсссєддудсес даєдсоаєєда аддєдсаєає 1560 чададеЕдссеЕ сасааасаєс Єдасвтасесуд ассаадсасуд ссграсаадед а 1611 «2105 34 «2115 536 «212» РЕТ «213» Огула вагіха «4005 34
Месє Аї1а Аза Аза Аза Аїа А1а Мес Аза ТПг Аза ТіПг бег Аза ТПг Аї1а 1 в) 10 15
Аза Рго Рго Гец Агд І1е Агуд АБр Аї1а Аз1а Агуд Агуд ТПг Агуд Агуд Агд 20 25 30 бі1у Нів Уаії Акуд Сув Аїа Уаі Аза бек с1у Аїа Аза сіц Аїа Рго А1а
Аза Ркго с1іу Аїа Агкд Уаі бек Аїа Авр Суб Уаі Уаі Уа1 О1у 0ш1у ЩУ з9 (210)
Зо І1їе бек с1у Гей Сув ТПг Аза сіп Аїа Іїейш Аїа ТП Ппув Нів сіу Уаї 65 70 75 80 б1у Авр Уаії Гей Уаі ТПг сбіц Аза Агуд Аза Агуд Рго сіу б1у АБп І1е 85 90 95
ТПг ТПг Аза сій Агуд Аїа с1і1у сій сіу Тугк Іец ТЕр б1п бій с1у Рго
З5 100 105 110
АвпобБек РПе біп Рго бек Авр Рго Уаі Іецй ТПг Меє Аїа Уаі1і Авр 5ег 115 120 125 сб1у Гешп Гпув Авр Авр Геш Уаі1 Рпе с1у Авр Рго Авп Аза Рго Агд РіПе 130 135 140 40 Уаї теп Тер сій с1у Ппув Гей Агуд Рго УМаї Рго бек Ппув Рго с1Уу Авр 145 150 155 160
Тецп Рко Рпе Рпе Авр Гей Меє бек Іїе Рго сіу пув Гей Агд Аїа с1Уу 165 170 175
Тец б1у Аї1а еп сіу Уаі Агуд Аза Рго Рго Рго с1іу Акд біц сбіц 5ег 45 180 185 190
Ууаї бій Авр Рпе Уаі1 Агуд Агд Авп Гей сіу Аїа біц Уаі Рпе сій Аг4д 195 200 205
Тец І1ї1е бій Рго Рпе Сув бек сіу Уа1і Туг Аза с1у Авр Рго бек Гув 210 215 220 50 Пес бек Месє пув Аїа Аза Рібе сіу Ппув Уаі Тгр Агд Гей бій АвБр Тіг 225 230 235 240 сі1у б1у бек Іїе І1їе сіу сіу ТПг Іїе Гпув ТПг Іїе сіп сбіц Акд с1Уу 245 250 255
Тув Авп оРго Ппув Рго Рго Агуд Авр Рго Агуд Гей Рго ТПг Рго пув 01У 260 265 270 біп Тпг Уаї Аза бек Рпе Агкуд Ппув с1іу Гей ТПг Меє Гей Рго АБр А1а 275 280 285
І1е ТБПг бек Агд Іїец бі1у Бек пуб Уаії Гув Гей бек Тгр Гпув Гей ТЕПг 290 295 300 (516) зек Іїе ТБг Ппув бек Авр Авп Ппув сіу Туг Аїа Ге Уаї Тук бій ТПг 305 310 315 320
Рго сіц сіу Уаії Уаї бек Уаі біп Аїа Гув ТПг Уаі Уа1і Меє ТПкг Пе 325 330 335
Ркго Бек Тук Уаі Аза бек Авр І1е Іїец Агуд Рго Гей бек бБег Авр Аїа 340 345 350
А1а Авр Аїа Іецй бек Іїе Рпе Тук Тук Ркго Рго Уаі Аїа Аїа Уа1ї! ТПг 355 360 365
Уаї Бек Тук Рго пув сій Аїа Іїе Агд Пув біц Сув Те І1е АБр Щ1У 370 375 380 бі Гей біп с1іу Рпе сіу біп Гей Нів Рго Агуд бек біп сіу Уаї сій 385 390 395 400
ТПг Ге с1іу ТБг І1їе Туг бек бек бек Гец Робе Рго АБп Агуд Аза Рго 405 410 415
Аза с1у Акуд Уаї Іец Іец Гей Авп Туг І1е с1у с1у Бек ТПг Авп о ТПг 420 425 430 с1у І1ї1е Маї Бек Ппув ТБг бій бек бій Геп Уаі сій Аїа Уаї Авр Агд 435 440 445
Авр Гей Агуд пуб Меє Іїецй І1їе АвБп Рго ув Аза Уаі Авр Рго Іец Уаї 450 455 460
Тец б1у Уаії Акуд Уаі Тер Рго сбіп Аза Іїе Рго сіп Робе Гец І1е 01Уу 465 470 475 480
Нів гей Авр Нів Гец біц Аза Аїа пуб бек Аї1а Те сС1у пув б01у ЩУ 485 490 495
Тук Авр сіу Гей Рібе Гец сіу сіу Авп Туг Уаі Аїа с1у Уаї Аза Гей 500 505 510 с1у Акуд Сув Маії сій с1у Аїа Туг бій бек Аза бек біп І1е бек Авр 515 520 525
Тук Гей ТПг пув Туг Аїа Тук Гув 530 535
Зо «2105 35 «2115 1518 «2125 ДНК «213» Ашакапеєйпив Єпрексиіаєсив «4005 35 аєдддсааса ЄЄЄсСЕеЕЧадсо ддаєдаассс асссссдсса ааадддеєдс Сассоаєсоде (216)
ЧдсЕддадеЕса деЕддасеЕєдс єдседсасає аадссааааєс сссасддДдЕсс даасдесдаса 120 гЕЕЧЕсеєЧдаад сеЕдаєєстад адсеєддаддс ааасссаааа ссдссааааа адасодесссес 180 агєєєдводаєд адддддсааа бассаєсдаса дааадсдадда садаадессесс дадеЕссдаєс 240 чаєчасєсьвєд доассЕсудєЄда даадсаасад ЄсСдссаассє сасааааєсаа аадагбасата Зоо
ЧдсЕадачдчаєд дЕСЕЄСсСсСтЕдЕ дсвгассассо сСсаааєсссду ссдсассдсс сасдадсаає З6о аєссЕвсеєсад сааааєсааа дсеєдсааасс асдссддаас сасєссссссд дадаааасас 420 ааєдстасед адсеЕсєеєсеєда єдадсасдсс саддааадсу Єсддесдаасс нсессесдадсва 480 саєЕєєєсведоада аачадчеЕеЕсєдЕ єдаєтаєсуєе асеєдассстє ЕсЯдсЕдсодда басаєдедЧе 540 чддачасссеєс аассусссеЕс саєдсассає асассєссад аадрасддаа бассдааааа 6боо адчеЕсеЕдуасс сЕдЕЧЕЄЄдс єддассааєс сааєссаасає сдеЕсаєсссаа дааддаааад 6бо чаєддаддад даааєдсеєс баєсаадаад ссеЕСсдсдсас дсддеЕссаєсєс сссаєсссає 720 чЧаєддааєдс адасасеєдеЕ Єдасасааса Сдсааасадс сСсддсдаада Сдаасссааа 78о сеЕсСсадесдєд аддсдссдсс сссдссасрас аассадаадда ддассссеєсс аєгсаддоадаає 840
ЕддЕСсСадеЕсс сЕсССТасдеЕс ааасаасасс адедаачаєс аассеєсаєда Соссдеодесе 900
ЧдЕСсасеєдсес сааєєсддсаа єдЕСааадаа асдаадаєса Сдаааєссод аааєссаєсєсс 960
Єсасеєєдасе єваєсссада даєдадеЕсас дгассссесь сеЕдЕсаєдає гассдсаєсес 1020 аадааддаєа аадедаадад ассасєсдад доасЕсЕддад ЕЄсСЕсаєссс сессааадад 1080 саасаєааєд дассдаадас ЕсСЕсдддтасе сравєсеЕсссе ссаєдаєсдєє єсссддаєсде 1140 дсеЕссаєсвуд асаєрдеЕдеЕсеЕ сеЕесасвраса СЕсооссодад даадсадааа гадааавасеє 1200 дсааасдсес саасддаєда асеєдаадсаа аградеЕеЕссье сеєдассеєвєса дсадссоєвд 1260 часасеєдадд асдаассеєсс аєседессаає саєсЕсСЕсес ддадсаасдс агссссаєвд 1320 баєддасаса аєсасдаєсс єдДдеЕсєесдада дссасадаса адаєддаааа ддасссссся 1380 чдчавЕєвЕвеЕс аєдсаддеаа ссаєааддЧає ддасесессад Едддаааадс даєддесессс 1440 (516) чдчаєдсаадд седсддаасеЕ ЕдеЕаасаєсс сасссодасе сеєсасасаса єдеЕЧдаадчаєд 1500 чаєдадаада ссдсдеаа 1518
«2105 36 «2115 505 «212» РЕТ «2135 АштагапЕрив «4005 36
Меє с1у Авп Іїе Бек бій Агуд Авр бій Рго ТПг бек Аїа Гув Агд Уаї 1 5 10 15
А1їа Уаї Уаї сі1у А1ї1а сіу Уаі бек с1і1у еп Аїа Аза Аїа Тукг їТуУув Іецй 20 25 30
Тпув бек Нів сіу Гей Авп Уа1 ТПг гейш Рпе бій Аза Авр бег Агд А1а 35 40 45 сі1у б1у Ппув Гей Ппув ТПг Уа1! пув Ппув Авр сіу Робе І1ї1е Тгр АБр бій 50 55 бо б1у А1а АвБп ТПг Меє ТПг бій бек бі Аїа бій Уа1 бек бек Іец І1е 65 70 75 80
Авр Авр Гец сіу Іец Агкд бій пув біп біп Гей Рго Іїе Бек біп Авп 85 90 95 цув Агуд Туг Іїе Аїа Акуд Авр с1іу Гей Рго Уаї Гей Гей Рго бек Авп 100 105 110
Рго Аїа Аїа Іец Іецй ТПг бек АвБп І1е Іїецй бек Аїа Ппув Бек Пув Іец 115 120 125 біп І1е Меє Гей бій Рго Рпе Рпе Тгр Агуд пув Нів АвБп Аза ТПг бій 130 135 140
Тец бек Авр сій Нів Уаі1і сіп сій Бек Уаі сіу сій Рбе Рбе сій Агд 145 150 155 160
Нів Рпе сіу Ппув сіц Рбе Уаії Авр Туг Уаії І1е Авр Рго Рпе Уаії Аїа 165 170 175
Зо сіу Тк Сув б1у с01у Авр Рго біп бек Гей бек Меє Нів Нів ТПкг Ріе 180 185 190
Рго біц Уаї Тгр АБп І1е сій Гпув Агуд Рпе б1у бек Уаі РпПе Аїа 0Щ1У 195 200 205
Тец І1ї1е сбіп бек ТПг Гей Гей бек Ппув пув біц пув сіу сСі1у с1у 1У 210 215 220
Ап Аїа бек І1ї1е пуб Гу Рго Агуд Уаі Агд біу бек Рпе бек РПе Нів 225 230 235 240 сбі1у б1у Меє сіп ТПпг Ггеш Уаі1і Авр ТПг Іїе Сув пув біп Гец с1іу бій 245 250 255
Авр бій Гей їув Гецп біп Сув біц Уаії Гей бек Гей бек Туг Авп сіп 260 265 270
Тпув б1у І1їе Рго Бек Гей сіу Авп Тгр Бек Уа1 бек бек Мес 5ег Авп 275 280 285
АвпоТПг бек біц Авр біп бек Туг Авр Аї1а Уаії Уаі Уаі ТПг Аза Рго 290 295 300
І1е Агуд Авп о Уаії пув біп Меє Гуз І1е Меє ув Рпе с1у Авп Рго Ре 305 310 315 320 зек Гец Авр Робе І1е Рго бій Уаі! бек Тук Уаії Рго Гей Бек Уа1 Меє 325 330 335
І1їе ТПг АТїа Рбе Ппуз пуб Авр о Ппув Уаії їув Агуд Рго Гей сі с1і1у РіПе 340 345 350 сі1у Маї Гей Іїе Рго Бек Ппув бій сбіп Нів Авп сіу Гей пуб ТПгЕ Іей 355 36о0 365 бі1у ТПпг Гей Рпе бБег бек Меє Меє Рпе Рго Авр Агуд Аза Рго 5ег Авр 370 375 380
Меє Сув Гей Рпе ТПг ТПг Рібе Уаі1і сіу сіу Бек Агд АвБп Агд Гув Іецй 385 390 395 400
Аза Авп Аза бек ТПг Авр бій Гец Гуз біп І1е Уаї Бек Бек Авр Іецй 405 410 415 (516) сіп біп Гецп Гецп с1у ТБг бій Авр бій Рго бек Рпе Уа1ї Авоп Нів Гей 420 425 430
Рпе Тер бБег АвБп Аза Рпе Рго Іец Тук б1у Нів Авп Туг Авр бек Уаї 435 440 445
Тец Акуд Аї1а І1їе Авр Ппув Меє сій пув Авр Гей Рго сіу Рібе Рое Туг 450 455 460
А1їа сб1у Авп Нів Ппув сіу с1іу Гей бек Уаі1і! сі1у пув Аїа Меє Аїа 5ег 465 470 475 480 с1у Сув Гув Аза Аїа бій Гей Уаі Іїе Бек Тукг Гей Авр бег Ні І1е 485 490 495
Тук Уа1 пув Меє Авр біц Гув ТПг Аї1а 500 505 «2105 37 «2115 1521 «2125 ДНК «213» Агарідорвів Епаі1їіїапа «4005 37 аєдчадеЕває сеЕСЕєсСЕсСс Ессдасдасос саассудсссс ссссассаєс сссддаадссс (216) ааєсєссдаєс гаааєддссста Саадсесссеє адассссусеЕ дсеєсадеддс соодсдддасса 120 ассдеЕсддає сеЕЄсааааає сддааддсдда ддаддсасса ссассасдас ддассдаєдед 180 аєгєєдеЕСсоддсоа дадаваєстад ЄдЧдєсЕссдс ассдсссадда сдсссдссас сСаадсаєссяо 240 чаєдсеЕдсеЕсС сдааєєвсаає єдеЕЧассддад дсгааддаєс деЕдЕеЕсддада саасаєтаєс Зоо асЕСЧдЕЧдчаад адааєдчаєвє єсеЕСЕєдддаа дааддесссса асбсадеЕсссса ассдєсстсдває З6о ссрасдссса сстаєддеЕдчуає адагадедає Єсооааддаєд аєссодесдеє додадаєссяе 420 асеЕдсдссаа ЧФЯЄЕСЕЕЧЕЧЕЄ дедддаасдда ааассдаддс сддЕсссаєс даадссааса 480 часеЕсассує ссеЕЕеЕсЧЧавєсе даєдаднаєс доосодддаада Есададседа ЕсЕсООдЕдса 540 сЕсддсаєссс дассдссасс сссаддеЕсдє даадааєстд гєдддаддадеЕс єдсасодсае 6боо аассЕСсддеЕд аєдадєєсеЕ єдадсдсесьд аєсдаассЯє ЕЕЕдеЕЕеСаду ЕДЕСтаєдсе 6бо
Зо чдаєчаєссеЕс саааассдад саєдааадса дсЯгЕсдоода аддесєєсддаа астададсаа 720 ааєддеєддаа дсаєаасадд Єддсассссс ааддсааєссс аддададдаа ааасдссссс 78о ааддсадаас дадасссдсд сседссаааа ссасадддсес ааасадессда СЄссЕСсссадда 840 аадддасеєєс дааєдеЕєдсс адаадсааса сСссдсаадає Саддсадсаа адссаадвевд 900
ЕсЕєддаадс єСЕСядддбає сасеєаадссд дададсддад дасасаассс аасагсаєсдад 960 асєссадаєд дЕсСвадесеЕсс судєдсададс аааадеЕдеЕсд ЄааєдасоадеЕ дссаєсесає 1020
ЧЕєдсаадед ДдЧЕСЕСЕСудсСу сеоссЕСЕвЕссСс дааєстьдсвд саааєдсась сессааааста 1080 баєвасссас садеЕсдсадс адраєстаєс Еєсубасссуда аадаадсаає ссдаасадаа 1140 гЧдЕеЕєдаєад аєдудєдаасе ааадодЕеЕсЕес доодсааєсєдс аєссасдсас дсааддадеє 1200 чдааасаєсад даассаєсса садсесссса сЕсЕсЕсСсаа аєсдсдсасс дсссодаада 1260 аЕгєсеЕсдсесдсЕ Єдаасвтасає єддсодддєсс асааасассу дааєєсссдесс саадеЕссдаа 1320 чаєдадеЕсад Єддаадсаєсе єсгадевдує сасеЕседава ЕссЕєЄдасас ддссаааєса 1380
ЕсеЕСсСвєаасує сЕсСсдуддсса сдааддаста ЄЕСсСЕсоОдЧЯєЄд дсааєтасдЯяє сдсєддадеднка 1440 дссЕєаддсес даєЯдсдсада аддсдсасає дааассдсда Еєдаддесаа саасеЕєссаєд 1500
Есасддбасуд сЕсасаадса а 1521 «2105 38 «2115» 506 «2125 РЕТ «213» Агарідорвів «4005 38
Меє сій Гей бек Гей Гей Агуд Рго ТПг ТПг біп бек ІТец ІТецйп Рго 5ег 1 в) 10 15
Рпе бек Ппув Рго АвБп о Тецй Агуд Гей Авп оУаї! Тук Ппув Рго Гей Агд Іецй 20 25 30
Акуд Сув бек Уаі Аза б1у б1у Рго ТПг Уаї сі1у Бек Бек Ппув Іїе сіц 35 40 45 (516) сіу біу сб1у б1у ТПг ТБг Іїе ТПг ТБг Авр о Сув Уаі І1е Уа1і с1у Щ1У 50 з9 (210)
сб1у І1е бек сі1у Гей Сув Іїе Аїа сіп Аїа гей Аза ТПг Ппув Нів Рго 65 70 75 80
Авр Аза Аза Рго АвБп о Тец І1е Уаі! ТБПг б1іцш Аза Гуз Авр Агд Уаі1і Щ1У 85 90 95 с1у АБп І1е І1їе ТПг Акуд бій бі Авп б1у Рбе Гей Тер б1й сб1ц 1У 100 105 110
Ркго Авп о бек РПе біп Рго бек Авр Рго Меє Іїей ТПг Меє Уа1 Уа1і1 Авр 115 120 125 зек с1і1у Пец Гпув Авр Авр Тецп Уаії Іец б1у Авр Рго ТПг Аїа Рго Аг4д 130 135 140
Рпе Уаї Гец Тгр Авп о б1у Гпув Тец Агд Ркго Уаії Рго Бек Ппув Гей ТЕПг 145 150 155 160
Авр Гей Рго Рібе Рбе Авр ІТецп Мес бек І1е с1у с1у пув Іїе Агд Аїа 165 170 175 сі1у Рпе б1у Аза Гей с1у І1е Акуд Рго бек Рго Рго сб1іу Агуд сбіц сі1ц 180 185 190 зек Уаі біц біц Рре Уаії Агуд Агд АБп о Тец б1у Авр бі Уаі1і Рпе сіц 195 200 205
Акд Гей І1їе біц Ркго Рпе Сув бек біу Маі Ту Аза с1у Авр Рго 5ег 210 215 220
Туз Гей бек Меє пув Аїа Аза Рпе сіу Ппув Уа1і1 Тер пуб Гец біц сіп 225 230 235 240
Ап осіу сіу бек І1е І1е с1у сбі1у Тс Рпе ув Аза І1е сбіп бій Агд 245 250 255
Пув Авп о АТїа Рго пув Аза бій Акуд Авр о Рго Агуд Гей Рго Гув Рго сіп 260 265 270 бі1у біп ТпПг о Уаії сіу Бек Рпе Агуд Ппув с1іу Гей Акуд Меє Гей Рго бій 275 280 285
А1ї1а І1їе бек Аза Агд Іїец бі1іу бек пув Маї Ппув Гей бек Тгр Пув Іец
Зо 290 295 300 зек с1іу І1е ТПг Гув Те бій бек біу б1у Тук Авп Гей ТПг Тук сіц 305 310 315 320
ТПЕ Рго Авр сіу Гец Уаї бек Уа1 сіп бек пуб бек Уаі Уаї Меє ТПг 325 330 335
Уа1ї1 Ркго Бек Нів Уаі Аїа бек сб1у Гей Гей Акуд Рго Гей бек бій 5ег 340 345 350
Аза Аза Авп Аза Іецй бек Гпув Гец Тук Тук Рго Рго Уаі Аїа Аїа Уаї 355 3З6о 365 зек Іїе бек Тук Рго Гув бій Аїа І1е Агуд ТПпг сій Сув Гей І1е Авр 370 375 380 сі1у бій Гей Ппув с1у Рпе сіу сіп Гей Нів Рго Агд ТПг біп с1у Уаї 385 390 395 400 біц Тс Гей сіу ТПг Іїе Тук Бек Бек Бек Гей Робе Рго АвБп Агд А1а 405 410 415
Рго Рго с1іу Агуд І1е Гей Гей Гей Ав5п Туг І1е сі1іу с1іу бек ТБПг Авп 420 425 430
ТпПг с1у Іїе Гей бек Ппув бек біц сіу біц Гец Уаі бі1іц Аза РПпе Гей 435 440 445
Ууаї с1у Нів Рпе Авр Іїе Гец Авр ТПг Аїа пуб бек бек ТІГецй ТПг 5ег 450 455 460 зек сіу Тук біц б1у Гей Рпе Іец бі1у б1у Авп Ту Уаі Аїа сі1у Уаї 465 470 475 480
А1їа гей с1у Акд Сув5 Уаії бій сб1у Аїа Тук бій ТПг Аза Ії1е сіц Уаї 485 490 495
Авп о Авп Рпе Меє бБег Агуд Тугк Аїа Тук ТГув 500 505 «2105 39 60 «211» 1515 «212» ДНК
«2135 Місобіапа барасит «4005 39 аєддсеЕссЕє сеЕдссододада адаєааасас адссссдсда адададссдс адссаєсоде (216) чдсаддадсдЕса ЧдЕддодсссСдс Сдсадсасас аадссдаааа ЄссаєддсеЕс дааєсдеєдаса 120 чеЕаєєсєдаад садаадоадаа адсєддаддд аадссасдба дсдсдадсса адаєсддсссгд 180 аєаєддоадаєд ааддддсааа басвсаєдасс дааадсдаад деЕдасдєссас асссесдвасєс 240 чаєєсеЕсевд дасессдада ааадсаасаа Єссссасесс сасаааасаа дсассасаєсс Зоо дссадаааєд дсасеЕсстьЯдеЕ аседеєсассо сСсаааєссаа сСсдаєстсдає саааадсаає З6о
ЕСсЕСЕСсеСсСса седдаєсааа дсеЕсСсадаєд сЕЄСсСсдддаас саасаєсстаєд даадаасааа 420 аадсеєсеєссс аддеЕдеєсєда сесасаєдаа адсдссадед дасєссеєссса дсассасессе 480 чддаааддчадд ЄЄЧЕЄЧаста єсЕаассдас ссссессоєссд ссддаасоаєда сддвсддвесдває 540 сседасссдс Ссссаасдса ссасссаєєє ссададеЕсдеЕ ддааєссада даааазодеес 6боо чдасЕСадеєса басеєЕєддадс баєєсдаєссі аадссаєсссс ссаааааєсда ааадаадсаа 6бо чдддссассса ааасесєсадс ааасаачдчаад сдссадсоудда чЧчассЕсссес сЕЕсестеодвос 720 чддааєдсааа сасеєсасеєда єЄдсаасаєсдс ааадасєссса дадаадаєда асссадастса 78о аасеєЕСстадад ЄЄСЕЧдддааєє аєсеЕєдсадсес сдсассдада ассссдсдає адасадсс9дд 840
Есааєтаєеєє седссеЕсСЕсс асасаааадд саассадаад аадааєсаєсєс сдаєсоассдса 900 аєсаєдасодд ссссасеєстд єдаєдссаад адсасдаада Ссдссаадад аддаааєссса 960
СЕЄСсасесса асесєсасеєсс єдадудаєєдає сСасосассудс басседесвдЕ баєаассаса 1020 гЕсаададдд аааасуєааа дсаєссссьєс дадоадЕсЕсд чодЕссСЕвдЕ ассеессаад 1080 чадсаасаас аєдудєсссаа дасасваддс асссеЕсьссо сеЕЄСваєдає дяєсЕсСсадає 1140 сдддсассаа асааєдеЕєЄта ЕєсСЕСвасасе асЕєеєдеЕсд дсддаадссд ааагсададаа 1200 сЕєдсаааауд ссеЕСсааддас Єдадсеєдааа дадаєсадеаа сЕЕСЕДдасся саадсадсед 1260 єЕЧдоддЕдсвд адддададсс аасасаєдеуд аассаєстає асєдчдадеаа адсаєсессса 1320 гЄЕдеасдддс агаастаєда Ессадесста даєдсааєсд асааааєдда даааааєсьє 1380 ссЕддаєвтає єсвраєдсадд Єаассасаду чоадддаєєдЕ садесЕддсаа адсаєвтаєсе 1440
Есеєддаєдса аєдсадседа ЕСЕЄдЕвара ссаграєсьсу аасссуєсеіс аассдасессс 1500 аааавдасаєє дседа 1515
Зо «2105 40 «2115 504 «2125 РЕТ
З5 «213» Місобсіапа «4005 40
Меє Аза Рго Бек Аїа сіу сій Авр Гпув Нів бек бек Аїа Гув Агд Уаї 1 в) 10 15 40 А1ї1а Уаї Іїе с1у А1ї1а сіу Уаі бек сбіу еп Аїа Аза Аїа Тукг їТуУув Іецй 20 25 30
Тпув І1е Нів сіу Гей Авп Уа1і! ТПг Уаі Рпе сій Аза сіц сі1у Гтув А1а сі1у б1у Ппув Гей Агуд Бек Уа1і бек біп Авр сіу Гей Ії1е Тгр АБр бій 45 50 з9 (210) б1у А1а АвБп ТПг Меє ТПг сій бек бі сб1у Авр Уа! ТПг Ріе Іец І1е 65 70 75 80
Авр Бек Ггец сіу Іец Акд бій Ппув біп біп Рпе Рго Гей Бек біп Авп 85 90 95 цув Агуд Туг Іїе Аїа Акуд АвБп обіу ТБг Рго Уаї Гей Гей Рго бек Авп 100 105 110
Рго Іїе Авр Іїец І1е Гув Бек Авп Рре ІТецй бек ТПг сіу Бек Ппув ГІец 115 120 125 біп Меє Гей Гей бій Рго Іїе Гей Тер пув Авп о пув пуб Гец бек біп 130 135 140
Уаї Бек Авр Бек Нів сіц бек Уа1і бек сіу Робе Рое біп Агуд Нів РПе 145 150 155 160 с1у гув бій Уаї Уаії Авр Тук Гей Іїе Авр Рго Рпе Уаії Аїа с1у ТЕПг 165 170 175 (516) Сув бі1у б1у Авр Рго Авр бек Гей бек Мес Нів Нів бек Ропе Рго сіц 180 185 190
Тецп Тер АвБп Гей бій пув Агуд Рпе сіу Бек Уаі1і Іїе Ггец сС1у Аза І1е 195 200 205
Акуд Бек пуб Гец бек Рго Гув Авп о біц Гуз пуб біп б1у Рго Рго Гув 210 215 220
ТПг Бек Аза Авп Гув пуб Агуд біп Агуд с1іу бек Рре бек Рпе Іеч С1Уу 225 230 235 240 біу Меє біп ТПпг Гей ТПг Авр Аза І1їе Сув Гпув Авр Гей Агд бій АБр 245 250 255 біц Гей Акуд Гей Авп о бБег Агуд Уаі Гей бій Гей бек Сув бек Сув ТПг 260 265 270 бі Авр бек Аїа Іїе Авр бБег Тгр бБег Іїе Іїе бБег Аза бек Рго Нів 275 280 285 пуб Агкд біп бек бі біш бій Бек Рпе Авр Аїа Уа1і! І1е Меєс ТПг А1а 290 295 300
Рго Гей Сув Авр Уаії Ппув бек Меє пув Іїе Аїа Ппув Агд с1у АБп Рго 305 310 315 320
Рпе Гец Ггец АвБп Рпе І1е Рго біц Маії Авр Тук Уа1і Рго Гей бек Уаї 325 330 335
Ууаї Іїе ТпПг ТПг Рпе пуб Агд бій Авп о Уа1! пув Туг Рго Тецй б1п щу 340 345 350
Рпе сіу Уаї Іїец Маії Ркго бек пув біц біп біп Нів с1у Гей Ппув ТПг 355 360 365
Тец б1у ТПг Гей Рпе бек бек Меє Меє Рпе Рго Ар Агуд Аїа Рго АвБп 370 375 380
Авп оУаї Тук Темп Тукг ТПг ТПК Рпе Уаі сіу сбіу Бек Агд АвБп Агкд с1ц 385 390 395 400
Тец А1ї1а ув Аза Бек Агуд ТПг сій Гей пув бій І1е Уаї ТіПг 5ег Авр 405 410 415
Тецп Ггув біп Гей Геш с1у Аїа сі с1іу бій Ркго ТПг Тук Уаї Авп Нів
Зо 420 425 430
Тецп Тук Тер бек Ппув Аїа Рпе Рго Гей Тук сіу Нів Авп Туг Авр 5ег 435 440 445
Уаї гей Авр Аїа Іїе Авр Пув Меє сій пуб Авп о Тец Рго б1і1у Гечп РПе 450 455 460
Тукг Аза с1у Авп Нів Агуд біу б1у Гей бек Уа1і сіу Ггув Аїа Гей 5ег 465 470 475 480 зек сіу Сув АвБп Аї1а Азїа Авр Іїецш Уаії І1е бек Тук Гей бій бек Уаї 485 490 495 век ТПг Авр бек Тув Агд Нів Сув 500 «2105 41 «2115 1509 «2125 ДНК «213» біусіпе шах «4005 41 аєддсЕсєссЕ седсаасада сдаєаассса адасссдсаа ааададсадс СЯассассоаде бо
ЧдсЕдчоаддадраа ЧчЕ9ддЯдЧдсСссСЯдсС Сдсоудсссас ааассдааає сасаєдддеєсс ододаєдеЕсасе 120 чеЕаєєєдаад седадодаад адсєддаддадд аддссдадаа ДдЕдДдЕссссса ддаєсддеста 180 агєєєдодаєд адоададстаа басаасєдасс дааадсдааа Ссдаддесєсаа аддессдвасс 240 чаєдсеЕсеЕвд дасеєєсаада ааадсадсад ССсСссаасає сасадсаєаа дсассасаєсс Зоо
ЧдЕЧчаааааєд доддсассасе ЕєсеЕддсассс асааассссод ссдсассасо даададсааа З6о сгдсСсвЕЕсСсуд сасаассааа дчасссаєссс ассєеєсдаассаєстаєдеуд даааадааде 420 чассссеЕСста аєдеЕдеЕдеєда єдааааєсссят дсддааадесд Саддсаддаєс сеЕссдаасдас 480 сассссдддаа аададдессдс ддассаєстд арсдасссЕє єсодєсоддоадоа састадедса 540 чдсадаєсстд ааєсеЕсеЕсеєс гаєдсдссає ссссссссад адссасддаа СсСсодадааа 6боо аадздЕсєеЕддсеЕ ссаєвсаєадс содддсаєссд саасссаадс сбасссдссаа аадддааааа 6бо (516) асгддадааа аєаддассдс асгаадааааг аасааасаса аадсчгдддєеєс дЕсссстсесс 720 садддсддда Сдсадасасс дасадасаса Єсдесдсааад адсеЕсддсаа адасдасстє 78о аааєсаааєд аааадздеЕєеє дасаєсадсес сасодссаєд асддаадесс ссоссссасаа 840 аасеєддеЕСсСта Єсасвадедс ЄЄсСеЕаассаа адсасасаад асдеєсдаєсдс адсааєссаєд 900 асддсеЕссеЕс баєаєааєдеЕ сааддасаєс аадаєссасаа аааддддаас Ссессесссса 960 сЕсаавеєвсс еєЕссссдаддє аадсвасуєд ссааєсєсад Есаєдаєсас бассеєссааа 1020 аадчачааєд Сааададасс ЕсЕддаддда СЕсСоОдадеЕЄс ЕсдДЕсСсСсЕсСсС гааададсаа 1080 ааавгаєддесє бааааасссє Еддсасасьс сЕСЕССсСЄСсСса сдаєдеЕсєссс адаєсоєдса 1140 ссрадедаєе гагаєсеєста бассассесс асєгсддсддаа сссаааасад ддаасеЕвєдсе 1200 саадсеєсєсаа ссдасдадсе Єаддаааасе деЕгасеЕсєсвуд асссдадааа ЯдЕєДдЕєдддва 1260 чдсададдддд аассаасаєсе єдЕеЕєаассає сЕСТаєсоода деЕааадздсесе ЕссеЕеЕєсЧВає 1320 дчдасдєаассї аєдоадеЕсаде ЕСЕЄСаадса аєсдаєаада бадааааада єсЕСссссдда 1380
ЕСЕ ЕєСсСЕсвд садудєаасса саааддедда сеЕСЕСадесд дсааадсаає адссеЕсаддс 1440 бдсааадсад сеЕдаєсєвде даваєсссас сеЕсаасессвд сЕссадасаа сасадесдссяе 1500 чаєсаааєда 1509 «2105 42 «2115 :502 «212» РЕТ «213» сбіусіпе «4005 42
Меє АзТа бек Бек Аїа ТПг Авр Авр Авп Рго Агуд бек Уаї пуб Агд Уаї 1 в) 10 15
А1їа Уаі1 Уаї сі1у Аїа сС1у УМаї бек сбіу Іїеш Аїа Аза Аїа Тук Ппув Іей 20 25 30
Тпув бек Нів сіу Гей Авр Уа1 ТПг Уаі Рпе сій Аза сіц с1у Агд А1а сбі1у б1у Акд Гей Агуд Бек Уа1і бек сбіп Авр сіу Іецшп І1е Тгр АБр с1и з9 (210)
Зо с1у Аїа АБп ТПг Меє ТБбг бій бек бій І1е сій Уаї пув с1у еп Пе 65 70 75 80
Авр Аза Гец сіу Іец біп бій пув біп біп Рпе Рго І1е бек біп Нів 85 90 95
Туз Агуд Тук Іїе Уаі Гпув Авп сіу Аза Рго Гей Гей Уаї Рго ТПг Авп
З5 100 105 110
Рго Аїа Аїа Іец Іецйп Гув бек Пув Гей Гей бек Аза біп бек Тув І1е 115 120 125
Нів гейш Іїе Рбе сіц Рго Робе Меє Тер Гпув Агд бБег Авр Рго бек Авп 130 135 140 40 Уа1ї Сув Авр бій Авзп бек Уа! бій бек Уа1і! сб1у Агкд Рпе Рпе сій Агд 145 150 155 160
Нів Рпе сіу Ппув біц Уаії Маії Авр Тук Іец І1е Авр Рго Рпе Уа1і1 0Щ1У 165 170 175 бі1у ТПпг бек Аза Аза Авр Рго бій бек Гец бек Меє Агуд Нів бек РІе 45 180 185 190
Рго біц Гец Тгр АвБп Тец бій Гпув Агд Рпе с1у бБег І1е І1е Аїа 0щ1У 195 200 205
А1їа гей сіп бек їув Те Рпе Аза Ппув Агд бій Гпув ТП о1у бій Авп 210 215 220 50 Агуд ТПг АТа Тей Агуд пуб Авп о Гпув Нів ГПув Агуд біу бек Рпе бек РіПе 225 230 235 240 біп б1у сбі1у Меє сбіп ТПг Гей ТПг Авр ТпПг Гей Сув пув бій Гец с1У 245 250 255
Тув Авр Авр Гей пув Гей Авп бій пув Уаі Гей ТПг Гей Аїа Туг с1У 260 265 270
Нів Авр сіу бек бек бек бек біп Авп Тгр бег І1е ТПг бек Аїа 5ег 275 280 285
Ап обіп бек ТПг біп Авр Уаії Авр Аїа Уаії І1ї1е Меє ТПг Аїа Рго Іец 290 295 300 (516) ТУук Авп оУаії Ппув Авр І1е Ппув5 І1е ТПг пув Акуд б1іу ТЕ Рго Ропе Рго 305 310 315 320
Тец Авп Рпе Гей Рго бі Уа1 бек Тук Уа1 Рго Іїе бек Уаї Меє І1е 325 330 335
ТПЕ ТпПкЕ Рбе пуб пув біц Авп оУаї пув Агд Рго Іїейп сі с1у Рпе С1У 340 345 350
Уаї Гецп Маії Рго бек пув біц біп Ппув Авп с1іу Тїемш Гув ТПг Гей 1У 355 360 365
ТПЕ Гей Рібе бек бек Мес Месє Рбе Рго Авр Агуд Аза Рго бек Авр Іецй 370 375 380
Тук Гей Тук ТПг ТПг Рре І1е сіу сіу ТБг біп АБп Агкд бій Тецй Аїа 385 390 395 400 біп Аз1а бек ТПг Авр бі гей Агуд пув Іїе Уа1 ТПг бек Авр Гей Агд 405 410 415 ув ІТеп Іїеп сС1у Аїа біш с1іу бій Рго ТПг Рпе Уаі1і Авп Нів РПе Туг 420 425 430
Тер бек Ппув с1у Рібе Рго Гей Тукг б1у Агд Авп Туг сіу Бек Уаії ГІечц 435 440 445 біп Аза І1е Авр ув Іїе бій Ппув Авр Гей Рго сіу Робе Робе Рое А1а 450 455 460 б1у Авп Тук Ппув с1іу с1іу Гей бек Уаі с1у пув Аїа І1е Аїа бег 01Уу 465 470 475 480
Сув гув Аї1а Аза Авр Гей Уа1і Іїе бек Тук Гей Авп бег Аза б5ег Авр 485 490 495
АвпоТПг Уаї Рго Авр Гу 500 «2105 43 «2115 1205 «2125 ДНК
Зо «2135 Сиситів вабіуцйв «4005 43 адсЕєссаас сЕєЄСсСсдаєсс баєєсссасс асодсодсда асадсддессс аааадаєдває бо
Ебадееєседу дадасссада Єдсассссда ЄсСсдсассдеЕ дддаасоддааа дсссадасса 120
ЧдЕдсссдсда аасстаасда Ссрассссеєс сеЕєдасссда Єдадсаєєдда єддааааасс 180 ачадсаддсеє ЄЄЯдЧдЕдсссЕ доддсасссдс сссссссссс саддссдада ддаассадесес 240 чаачааєєєд єссдєСоЯддаа ссеЕєЄДддсаає дааазсссссд аасаєсссдає ададссаєссс Зоо гЧдЕЄСЕЧдЧдєд баєсасодстдад Єдасссосса аадссаадса Сдааадсадс ЄЕссддсаад З6о чЧЕєєоддаддс бададсаааа ЄдадеЕддасаде ассаєссодсд ддасссссаа адсассссаа 420 чаааддааса ааассрассаа ассассаада даєссдсудсс бассааадсс гаадддссаа 480 асЕдЕєддає сЕсеЕссоддаа аддасевасс агдеЕєдссаа асдсравсес сасеЕсЧчєєевд 540 чададеааад бЄаааадсаєс єєддаадсса сСссадсаєса дсааадсдда Сдасдоддадді 6боо
БаєадеЕсєеєда саєасдааас ассадаадда ссадссссса бассаадсад аадесдессаєс 6бо аєчасуддеЕєс сЕєЄСЕвсаває єдседдсасоі ссдессдсаєс сааєссссоаддд дааадсесдса 720 чаєдсасеЕєс сааааєсста сСрасссасса дЕєдсаєсад Єдассагбаєс абаєсссаааа 78о чддадсааєса ддааадааєд сеЕєЧчаєсдає ддсдаассаа аддодадЕссдда ссааєсєсдсас 840 ссесдсадсс адддддєдас Сбассссддддда астасасаса дсесаєсасє єЕеЕссстаає 900 сдадсдссад асддааддде ассдсеєсеєсд аастсасаєсдд даддддсессас Саасассдда 960 авєсЕвеєсес адасададад сдадсєсава даадсадеЕсєд аєсдддавєсЕ аадаааааєс 1020 сеЕсасааасс сааасдсада ддаєссссса ссаєєдадсуд єдадоадедед дссасаадсс 1080 авєссасаде ЄссЕдаєсьду ссаєсєсдає дЕсссадаса ссдссааддс сддасєдада 1140 чададасеЕддаа ЄддадоддодсеЕ асЕсесадчє ддааассаєд гаєдсододеЕдЕ ддссЕєсд99д 1200 ачаєд 1205 «2105 144 «2115 401 «2125 РЕТ «2135 Сиситів бо «4005 44 зек Рпе біп Ркго Бек Авр Рго І1е Іецш ТПг Меє Уаї Уаі Авр бБег 01У 1 5 10 15
Тецшц ув Авр Авр Гей Уаі Гей с1у Авр Рго Авр Аза Рго Агд РПе Уаї 20 25 30
Тец Тер АвБп сіу Ппув Гей Агуд Рго Уаі Рго Аїа Ппув Рго Ап Авр ГІецй 35 40 45
Ркго РіпПе Рібе АвБр Іецй Меє бек І1е с1у б1у Гув Іїе Агуд Аїа с1у Ріе 50 55 бо сі1у Аїа теп с1у Іїе Акуд Рго Рго Рго Рго сіу Акуд біц бій бек Уаї1! 65 70 75 80 бі бій Рпе Уаі Агуд Агуд Авп о Гей с1у Авп біц Уаі1! Рбе сбіц Агд Іей 85 90 95
І1е бій Рко Рбе Сув бек біу Уаії Туг Аїа б1у Авр Рго бек КПув Іей 100 105 110 зек Меє пув Аїа Аза Рпе с1у пув Уаі Тгр Акд Гей бій біп АБп 1У 115 120 125 сСі1у бек Іїе І1е сіу с1і1у ТПкг Рпе пув Аїа Гей біп б1й Агд Авп Гув 130 135 140
ТПЕ ТП Ппув Рго Рго Агуд Авр Рго Агд Гей Рго Пув Рго Ппув с1у сіп 145 150 155 160
ТПг Уа1 сіу Бек Рібе Агкд Гуз сіу Гей ТПг Меє Гей Рго А5п Аза І1е 165 170 175 зек ТПкг Сув Тец біу бек Ппув Уаії пуб Маї бек Тгр Ппув Гей бек 5ег 180 185 190
ІТІе бек пув Уаі Авр Авр сі1у біу Тук Бек Гей ТПг Тук біц ТіПг Рго 195 200 205 бі б1у Гей Уаії Бек Іїе Гей бек Агуд Бек Уа1і1 Іїе Меєс ТіПг Уаі1ї! Рго 210 215 220
Зо Ззек Ту Іїе Аїа с1у ТПг Гей Геш Агуд Рго Іїе бек сіу Гув Аї1а А1їа 225 230 235 240
Авр Аїа Гей бек пуб РпПе Тугк Туг Рго Рго Уаі Аза бек Уаі ТПг Пе 245 250 255
Зек Тук Рго пув біу Аї1а І1е Агд пув бій Сув Гей І1е АвБр с1у бій
З5 260 265 270
Тец гув б1у Рпе сіу біп Гей Нів Рго Агуд Бек біп сіу Уаї ТіПг ТЕПг 275 280 285
Тец б1у ТПг І1їе Туг Бек бек бек Гей Робе Рго АБп Агуд Аї1а Рго Авр 290 295 300 с1у Акуд Уаї Гешп Гей Гей АвБп Туг І1їе с1у сб1у Аїа ТБг АБоп ТЕ 1У 305 310 315 320
І1е Гец бек біп ТПг бій бек сій Гей Іїе сій Уа1! Уаї АвБр Агд Авр 325 330 335
Тец Агд Гув Іїе Гей Іїе Авп Рго АБп Аїа бій Авр Рго Гей Рго Іей 340 345 350 зек Уаі Агкд Уаі Тер Рго сбіп Аза Іїе Рго сіп Рпе Гей Ії1е сС1у Нів 355 3З6о 365
Тец Авр Уаї Гей Авр ТПг Аїа пув Аза с1іу Гей Агуд сбіц Аза с1і1у Меє 370 375 380 сі б1у Гешп Рпе Гей сіу біу АвБп Тук Уаії Сув сіу Уа1і Аїа теп 0Щ1У 385 390 395 400
Агд «2105 45 «2115» 1521 «212» ДНК «213» Огула вагіха 60 «4005 45 аєддссдссЕ ссдасдассс ссодсоддсодда аддсссдсєсд ссдссаєсєсоаяд сассоддесдес (216) адеЕдддсеЕсд соддсоддсодба садоадссдадд аадсдсддсд Єдсаддєдас дадєдЕссдад 120 чдсддссдаса доаддсоддадєдоа даачасасдд ассаассссуд адддсдддЕс саєссддадас 180 чааддддсса асассаєдас адачадсдаа сСсдодаддсаа дсаддсссає ЄСдасдасссс 240 ддассбасаад дсааасадса деассстаас ссасаасаса адсдеЕсасає сЄдЕСааадає Зоо чддадсассаа сасеєдаєєсс сесадаєссс ассдсдссса Сдаааадсас СсаДсссссссес З6о асааааєсаа адсеєсаадсе аєсєссдддаа ссассссссо асдадаааєс садсадаадд 420 ассЕСсдддаа аадеєдеєСсєда Єдаасаєсса адсдададед Єдасєссесссє дедсасаєсае 480 ачачаєааєс аддеЕєЧдеЕєдча Єсаєсссаєс даєссаєсссд соддссддаас аадсдододаддва 540 чаєсссдадс сассаєсаає Ссуоссаєсдса СЕЄсСсадсає саєддааьєс одадаасаад 6боо
БаєддсеЕсьд єсаєєдседуа Єдссассєсдд сссааасстає ссассааддда Єдаєсєссадед 6бо аачасаддад деЕдсЕєсЄсодсс аддадаааддчда аддаасааас чеЕдедесаєєс нвсксессаєєессає 720 чЧаєддааєдс адесасеєаає адаєдсассс сасааєсдаад Ссддадаєдда Саасдсдаад 78о сЕєддЕасад аадсудєєдеЕсС аседдсаєдеЕ ЕдсєдЕЧаєу дадеЕсессесеєс єеЕСтЯдЕДдЕ 840
ЕддеЕСсСааєєс седесеєЧчасес аааадасдсе ааадддааад ассесадааа даассааєссе 900 гЕЕєСЧсаєдсед єсаєааєдас єдсеЕссаєсду сссааєсдссс ададдаєдаа дсЕссасаааа 960 чаєддадеЕес ссЕЕсуєдсеЕ адасеЕсесьс сссааддесу аєсаєссасс астаєрсесьс 1020 аєддєаасад сЕсСЕсСаадаа ддаадаєдес аааааассає Еддааддасе гєддєдссевд 1080 асасссврава аддаасадса ааадсаєдде сссаааассс Еєдддасссє сеЕссеєссесд 1140 аєчаєдеЕсеєс садаєсдадс Есссааєдає саасаєстає асасаєсєсеЕ саєсододад 1200 адссаєааса дадассєсдс ЕддддсЕеЕсСса асддстаєсс Єдааасаасе ЕдЕДассесяе 1260 чассєаадаа адсЕСсСЕсдду ЕдЕєдаддда саасстасьсє сеЕдЕДЧДаадса Едеасаєє9и 1320 ачаааєдсеЕсє єЕССЕЕсаса Еддссадаає сасдаєсьду басеєддаадс гагадсаааа 1380 аєддадааса арсеЕсссадуа дЕЕсСЕсеЕсас дсаддаааєа асааддаєда дчЕЕдасЕдвЕе 1440 дчдаааєдеЕва Садссссадуа аадсааддеє дссдассесд Єдаєсєсеєса єСЕсЧСЯаВаєсся 1500 бдсасадаєс аддасааєса 9д 1521 «2105 46
Зо «2115» 506 «2125 РЕТ «213» Огула вагіха «4005 46
З5
Меє Аза Аза Бек Авр Авр Рго Агуд сіу сіу Акуд бек Уаії Аїа Уа1ї Уаї 1 в) 10 15 сб1у А1ї1а сі1іу Уаі Бек сб1і1у гейш Аїа Аїа Аїа Туг Агд Гей Агд Гув Агд 20 25 30 40 сіу Маії біп Уаї ТпПг Уаї Рбе бішц Аза Аза Авр Агуд Аїа с1у с1Уу Гув
І1е Агуд ТБг АвБп о бек бі сб1у с1у Рпбе І1е Тгр АБр біш о1у Аї1а Авп з9 (210)
ТПг Меє ТПг сій бек біц Те сій Аза бБег Агд ІТец І1е Авр АБр Іецй 45 65 70 75 80 сб1у Гей біп с1у Ппув біп біп Тук Рго Авп бек біп Нів пуб Агд Туг 85 90 95
І1е Уаї пув Авр б1у Азї1а Рго ТПг Іец І1е Рго бБег Авр Рго Ії1е Аї1а 100 105 110 50 Пе Меє Ппув бек ТПг Уаї Гей бек ТПг Ппув бек Ппув Тем Гув Гей Ріе 115 120 125
Тец бій Ркго Рпе Гей Тук бій Ппув Бек Бек Агуд Агуд ТПг бек б1у Гув 130 135 140
Уаї Бек Авр бі Нів Гей бек бі Бек Уа1 Іїе Рбе Гец Сув І1е Сув 145 150 155 160
Ак Авр о Авп обіп Уаії Уаії Авр Туг Іїец І1е Авр Рго Рпе Уаі Аїа 0Щ1У 165 170 175
ТПг Бек сіу с1у Авр Рго біц бек Гец бег І1е Агуд Ні5 Азїа Рпе Рго 180 185 190 (516) А1їа Геї Тер АвБп Гец біц Ап Гпув Тук сіу бек Уаі Іїе Аза СсС1іу А1а 195 200 205
І1е Гец бек пуб ІТец бек ТПг пув б1у Авр бек Уаі Ппув ТПгЕ с1у ШУ 210 215 220
А1їа бек Рго біу Ппув б1у Агд Авп Пув Агд Уаі! бек Рпе бек РПе Нів 225 230 235 240 сіу біу Месє біп бек Гей Іїе Авр Аїа Гей Ні Авп бій Уаї с1у Авр 245 250 255 б1у Авп Уаї Ппув Гей с1іу ТПг сі Уаі Гей бек Ггец Аїа Сув Сув Сув 260 265 270
Авр сіу Уаї бек бек бек біу біу Тер бек І1е бек Уа1і Авр бек Гув 275 280 285
Авр Аїа пуб сіу їув Авр Гей Агд Гув АБп обіп бек Рпе Авр Аїа Уаї 290 295 Зоо
ІТІе Мес ТПг Аза Ркго Гей бек Авп Уа! біп Акуд Меє пув Рпе ТПг Гув 305 310 315 320 сіу біу Маї Рго Рпе Уаї Гей Авр Рібе Гей Рго Ппув Уа1! Авр Тук ГІеи 325 330 335
Ркго Гец бек Іец Меє Уаї ТПг Аза Рпе Гпув Ппув бій Авр Уа1! Ппув Гув 340 345 350
Рго Гец біц сі1у Рпе с1у Аза Іїецшц І1е Рго Туг Ппув бі біп сбіп Гув 355 3З6о0 365
Нів с1і1у Гей Ппув ТПг Гец біу ТПг Гец Рібе бег бек Меє Меє Рпе Рго 370 375 38о0
Авр Агуд Аза Рго АвБп о Авр обіп Туг ІТец Туг ТПг бек Рпе І1е с1у ШУ 385 390 395 400 зек Нів Авп Агуд Авр Гецп Аза сіу Аза Рго ТПг Аза І1е Гей ІТув сіп 405 410 415
Тецп Маї ТПг бек Авр Гей Агуд Ппув Гей Ге сіу Уаі1 сіц с1у біп Рго 420 425 430
ТПЕ Рпе Уа1! Ппув Нів Уаії Нів Тгр Агд АвБп Азї1а Рпе Рго Гей Туг щЩ1У 435 440 445 біп Авп о Туг Авр Ге Уаі гей сійш Аза Іїе Аїа Ппув Меє біц АБп АвБп 450 455 460
Тецп Рко сб1у Рпе Рпе Туг Аїа с1іу Авп Авп Гув Авр біу Гец А1їа Уаї 465 470 475 480 с1у АвБп Уаії Іїе Аїа бек сіу бек Гув А1ї1а Аза Авр Гей Уаї І1е 5ег 485 490 495
Тук Гей бій бек Сув ТПг Авр біп АвБр Авп

Claims (5)

500 505 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Клітина трансгенної рослини, трансформована нуклеїновою кислотою, що кодує тиЇ-РРО, де експресія нуклеїнової кислоти в клітині рослини приводить до підвищеної стійкості або толерантності до гербіциду, що походить з бензоксазинону, в порівнянні з рослинною клітиною дикого типу, причому нуклеїнова кислота тшиш-РРО містить полінуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається 3: а) полінуклеотиду, який містить послідовність, що має принаймні 8095 ідентичності послідовності до послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1, Юр) полінуклеотиду, що кодує варіант поліпептиду, який показано в 5ЕО ІЮО МО: 2, причому варіант поліпептиду 5ЕО ІО МО: 2 в Б) включає: амінокислота в положенні 128 є аланіном та амінокислота в положенні 420 є метіоніном, ізолейцином або лейцином.
2. Трансгенна рослина, що містить клітину рослини, як визначено у п. 1, де експресія зазначеної нуклеїнової кислоти в рослині приводить до підвищеної стійкості рослин до гербіциду, що походить з бензоксазинону, в порівнянні з рослиною дикого типу.
3. Рослина, яка експресує мутантну або рекомбінантну тш-РРО, що містить 5ХЕО ІЮ МО: 2, в якій амінокислотна послідовність відрізняється від амінокислотної послідовності РРО дикого типу відповідної рослини дикого типу, де амінокислота в положенні 128 є аланіном та амінокислота в положенні 420 є метіоніном, ізолейцином або лейцином. бо 4. Спосіб продукування трансгенної рослини, що включає:
(а) трансформацію клітини рослини касетою експресії, яка містить нуклеїнову кислоту тиї-РРО, і (б) продукування рослини з підвищеною стійкістю до гербіциду, що походить з бензоксазинону, з рослинної клітини, причому нуклеїнова кислота тиЇ-РРО містить полінуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з: а) полінуклеотиду, який містить послідовність, що має принаймні 8095 ідентичності послідовності до послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1, Юр) полінуклеотиду, що кодує варіант поліпептиду, який показано в ЗЕО ІЮ МО: 2, причому варіант поліпептиду 5ЗЕО ІЮ МО: 2 в Б) включає: амінокислота в положенні 128 є аланіном та амінокислота в положенні 420 є метіоніном, ізолейцином або лейцином.
5. Спосіб за п.4, в якому касета експресії додатково містить регуляторну область ініціації транскрипції та регуляторну область ініціації трансляції, які функціонують в рослині. х ра х ча ж Ге я 50 я ла А сминкниіїх г пиття НІВІТНИЯРНИАМ КВОТ КУРИ КМОНІ ВЕНИ сет КРЕВАКВМ, Я: о дошорюксіюцдЯ йог семан кА АЮ КЮВЕТ АЬКЗРЬЯУКЯТИНУ РАННІ ЕЕ нання нанк кою кою ЕК ИККУЮ : ВИ
А.хивіїюна Х оленя НООІКНОТЬТСВЕ СТУ ВКА АЗК КК ИНОК КІВ КОВО НАДО ЛИДОВ тт ин ВАН ЕУ КО вя
З.зАякжстя Є Н пенею тт ять ютютенн ТРЕКІВ СК КЕН БУВАЄ В ЕН т ен РЕ ВАККАН : ЗЕ В-жараєим І: на в в в в в ся тео лк жжкки ЕВ я лак ВИ БАКУУ. ХУ І ІЙ сіуліпе вах фонияи нюють юю тютюн юю ються книжка ж кю жосжтькі кож ожть кожет о Ар Дн РНК: я доблвіїзаюв : межттюжт их ВОВК ВЕНИ к их тамихтанх х РИБНУ ТКТО КСВ кан хланиха и вЙ ВОВКІВ ОСТІ ТС 1 З
Б.жнмахомо й з МТТЕРІАННРМІУТНОУ---- ВВР БАРБИВОВКІКРЕЖІВКИНІУУНСМНОХ ВВС ВУ АЮ КК РНВАУВ ВО РАХЕВВИЙ шх тов б.кофумаєйнії КО" МНБТИРСТАТАКК НОВ АВААНУХАМКАРВКТ РУКА ТРАТ ВАХВАТАМАРВТКНВТАЛАКТО Я тт РТВ ЯКТ НО : ВЕ ж. вжиж фони няння ВИАКЖТКТАТАМАТААЗИЦЬМСТКЕКАКЬЖНИВЬ МИСАК ХО птн ДАЖАВЕВХУ--АТЬЗАВСТОХ З
О.шахіча 1 : ежавоюжесежжаюежа соки НК АААЗМЬТАТЗАКААРРИКІ КОААКИІАКАСО НИЙ Твен ежасоюхо АКАНАМЕСеАКИВАЮСЯ ХО : ве
З.кивехавмх : ВТТТАПАННТУКЕТНАРЕр РЕНО ЕЛІНА ТМУ КВИТОК УТ ВСЕ псттляттт Му ЦУЮ В КР: В поліз Доля м пЕАНА ЗАЧАТТЯ АЛЕ АСВ А ЗАЛІ А ТАТІ ВОЛА ЧА НА ТОАЛАМ ВОВЧАК В ДАЛІ ВСАА ВЕЖА ЗЕ КОЛА ЧЕКАВ АТ МЕЖА ЗЕ АКТА ЧА ЗІ ВРАЗ МЕРА А ЗА УАЛЕ ВІ А Ач ВІ Анні х с звстуюик Х : я НІЕМТОУСНВКССАВе с ШИК ОРИКОВССВЬ ВИНО ТТ БАНКУ ВАИВСЕХАКО тт ВІТРУ ВЕНЕОРЬКОСТВОЕ її З-азіккалкх 1 роли ВАННА ЕБІНАВКЬРОБИНОЬКНИСКНМВІТТЬКЕМКВиКВВНЄВКІ СВТ Ми ААУ ВИМ ТЕМАМИ ДОК ї яв Бобукомаїїн фолтяянттяннтянннтя нн НЕЗЕАВВОМССВККЕВЬКОКТУЕ ВИТ ИНЕВІНя РУ тттттттт І КВ :О8І 5 х 125 Й 8 14 ма дра Й х 150 х яка. А смлювкмиісзх ої КОЗООУАЛЬХ ККЗ ден ТКАНІ ЗКУ КОЖ АННИ ВКА ВККС ЕВИЗЬК КВК Р КН ВАМИ ВСЯ Ба: ча дочок В: о тт ще мокко ст вия С ОУВКОИКР КОМІ ве с, ДЯ : 444
А. жкизіївих Х : кА о лено ТИ яму Кох їх ДО 5-- НЕ о ВАН вух ші Сх ОКР ЗаКевИК ВК КЗ КР ХУ БУ: 15 .зкіакксва Є : МО Ак кон ДК оо КО еВ ко Ж еф кове хеот я сетув ні : 333 В-квюасмм шщ, а. ж ха шк ях я ек а о пе на я Я стукіпе вах : КОХА КУ КОМУНИ ККУ по пове ВІЗКУ из екврк ра КООЕКООКК ХО НІ рАНВА : 314
Ш.снмасжю 5 з БОООХ СК пев опи ва КОКО тими Ре ЕЕ ею ех ІНаенК ВАРЮДЕТЬТ : 173 покмофумаєйніїй ЮК с ОЦЕТ оВАКАЛНКІНН КВ ши ке дені з ВЕНА КУН ЕК ноОКтАВКУКАВ кс: : 188 т.вяжх : СБУ ДНули- ВК ОА она зер я ЗЕ РОБУУСІКИ поун УК ИА : 159
О.жатіча ї Ше ВАК вс о - п ФКЕтСВ ВАННИ і о: 52
В.кивеха вм : МОЖ ТОИД АНТ нів А отри ВОК КВ с ке З КЕН : 15Ф шочакіюх ЕЕ в В ЕН ККАЛ КИ о Км З НК в. івсуюик, : БОБ Ада ткнавтаД я ТЕМНІ яв ОКА КЕКВ. г. в іс пе ДА: 37
В.юзккалих 1 : ВЕК ЗДКТеНЬЕтНЕх не ша Яд Я з кот» коки ДОМИВЕЬсЯКеме іде УКР І : ї185 Бокутомеїїк : ВЕК х БІоянІек--ДЕИО ке СТА Вн-- КІ з ВКЕНЕМ АМУТАЛ ЛАВА ОА КАКН АВК : 135 У а аз чу а «уп Ж є ж к5е ч г.
й х хо м БО У 265 х Я х за з шарексмінечих : ах: УНН ХНиЕВУ КК НКХ ТЕО В З ее ее УА Зоо кВ В си ши ді Жов - 243 докивоктазаних ДО: кітео ака. тНІдРЕМі КЕНАТКЕ РК Севя пдтивКЕт ше Со НН НЕТ КК Пр АХ : ПА А тввіїсюя ШЕ : ве В ОВЕН ПЬКИР МИ КЕКВ, ре дви пе ж КО и т ЩИТИ о: гля
Ш.сісквисся 8 : Ко ОНА тоже квиски ВАСКО щі ВІЗ СТИХ ек «ВЕЕБК Деек ; вах В-нявасюю З : ве бе МСЬКО ВМ НК ко Ех ів мтс фев «ВУВЕКЕОАКННК з 2 йпіусййа вах : хи в іт вооснт овнуі тт и Ти лет мя екон ін Дяк о: 215 « : КУМ СОВКИ НАВ ян в рИ КУКИ МНН НИ КВ ОМ КНТ ОХ менш 0 ВО; ши ЕЕ НЕ
К.холдюзичеїї х о: БАТТЕО ВЕН Ас 1Мо----АРЗк МКК еко омо п КС ро иьЕ с: 2 - - Ж ПО а Ма У т Ка и ІЩЕ Се ОД З ще: В кб жу ет Ж, Вих ; я РЕКС Ка х ИН я о ВОК та в Ай шк СИХ: КЗ й. дасідка 3 : 5 я я ; нн о ЕІ ЩЕ об я ов ВАН о КІ: 28Е
З. кахлю : у Во Ку рин НК КВ МУ ОЬ СОМ и ОКХ т За ЕКая : 7 ; з Коркові дея. вро М М, М ЗЯНЕИ о. В В ви. у ЕЙ позавіУзя Н ЕХ КУ жа: уз онаннннй ВОК ще НЕ КОН КОКО Ком ВА КИ ВК : 1 я ісствчх 1 : ВИРРКК НЯ м СТЕ ХР КР УК а з ко як Се Охи- МОМ АККАТ : 875 Й -е Ж оне Й М. пра НИ ЗИ В о о ВИ т. хв
Б.оізкапих А : ВИР ОН в она они М Ам кв й ші ТОЖ ше БЕК: 28 Фзіуксвеіїх : ТАБ УВК) ХІВИТВВОТ Ер ке РКО ее М и ДІККЕНС : вх і ях Ж ж и г я М пр т и з М З ЕЕ т зга х З я во ва т яоо дотавазжсвівемя Не НИ й шен ж с шк ще ж а інн и я МНН фотон КО БЕБКА ее НЕ КОСЖН АВК ЗВО ОТ ТЕС РАВ сво Кн Ж пазюююьвиюкх ї ВЕЖ досназічко 2 ї ЖАДД стен МВТ Е В РОТОВУ МЕ не Знані КН і--ВиВВу ше ллаєжтеаєстя : ВІВ
В.оївтосям ХК : нок. НИМИ нн що ВУ КЕКОКРВИ НО иа я уд я ї ВІВ
К.вврясою я : ЗВФДВН- ння ЕНКОСРРКТВАНК-КЕВОЗ У КОТ МОНО ери нм ДСС оо ЗАМ ння с ВА сітсіре має шо нини нн НН В тема вес БА дентин ої ЕВ К-свзіїоюх, Н пт нин У с ско шир ЗА и нс а НН я ла жжжтеажетте ї ЗХ
М.швряєс 1 : КЕКан тини ЖІ МК екю ково в й ие еЖКо---- НЯ пеня кленяюном о ЗЗХ м и нн п ше ПОВІК ВВС И КАК ет ВИК ттнннюнню ї ЗЕ Ж У 1 ДЕК сля УК НУО кс НЕ с нен тт Й КЕ няння у ВВЕ
Х.ваух : Ме НРКУ - ох шо Кт ОВЕН ЗВКОК Ко. й ВЕ з.хекіткї : се ння ПО А Я я Вир скора В ЖЕКи ої ЗВ
З. кмвагоюих : ЖЕДЕ---ненн ВТ ККРН ТВ КОКОН ОК А ЗК КИ НК ти: ВАХ о засіччх : ряст оосвиютов ся о Квт ток Ки хоо--- ця Їсжтавежжетяех ї ФОЖ б.імтуюмх і : ФК нн ВОК 5. око дес тКОО- КН Здьакве----- ВО Шуде тин ВВ
Ж.озккосою З. : ДК нн РОКИ КНОВОМВ-КИНИ Коен вів Інн о нер щи ок Пн Жеірусоюніїв : ВИБЕАЕВрТОвАИВсЬ ТТ РЕМЕТАНАКИВЕ ВИ ве ЕК Ао т МСА РТорАеаттА- ДО АтнеНосВрваантвє : 34 зи РМ и ЕЕ г и 42 х 349 я Я ява й хво Енн Си в З Б КУ ЦЕееокккт---нкесю» кв Ну ним ко я: 34 Всяка ЙО: теле ТВ ОВТВ А СНУ КНОК о МЕРОН-КНЬО КВЕД М нттико Кук КА ер УКВ: З д.свазйана 2 ромен тікоютжнть життя чн ВВС РІЗАВ ВНС КВ я ВК ООР ЕОЬКЗЬНеНА Дати РІВяа а у Фе г 0?
Я.оівкасвв Х ролети нтяннн и ТІ ОТ М КЕКВ т НК ВН не СМУМЕТХ ТУ КОКТМ- ОК ИОВВН ВИ ія що : 384
Н.карасим 2 ропитянннктянння ВДВ ВВКВХР КО АВЬСРУКОВКХ - АКВСВЕ-Я ВК ер тт зве Не, о : 856 сіусьах вах рояятттлятюутлнстт т ВДВ. х АВ ННІ ---ТКРСТР-ЕВЬКУ Нет Зоя. не ВЕК : ЗА
4. вв ромен пет тт ов КК ЕЕ ТЬЕК ІОАНА НО ТЕИВТинн : ЗД оон ни ши б; жа фе шк жи як на КВ й
М.карасав 1 пн и миши в й в м р ши
С.КеіМНаМЕЯЕЯі ого ОВТ ККУ АКАНА АНЯ УА НОР вх сек В Бе ман првк--аоо -- ВК: 925
Х.взуя ронетняннеятннне ВИМ ККО КИ НИКИ ААКН ТЬВНО КЕ Ан и х Ж Коен МК вд же: ЗО д.ливіта ин о ев ше М и оо сн я -Ж5: 895 нн о шо це у ее вас МОУ
С. вакітих : нен о Ов кофе ко ков -Е : 886
С. ізвурох 4 Неон де всньс в ; Же КР А пон Ж-- В: 39
5.оівтвства 3. г ожяннеюкнннеєхя РОКІВ УМА РБЗПУК КВОТ их КВК сини : Я роїуссва 315 : АИРЕТАКСВТААСРЕЮ НТКУ МАКОЗЛІВНУ ВСУ ВЕК АН КОЛІНА НАС 3? СУ ВЕ БЕ ств ьрР : Є ян нення ко тане ж М ик ля ж ноя жо ж ЩІ що
Х.сфетсмівсах : КВ ис В р нн Фото ювь щі ев аю д.кивехсавих Й: Ен од пДеКІХя ек овен ство ву й. АНСНТЕ С ВАХОКИВКК» : ЧО
А.тваіізав Е : ТЕстьк рн: в Вс и я ТАЗА ЬОКИЮ ВОЗИ ВККС МЮВИТо ЕАТОКНЕВЦоня : 500
Щ.аівкзовв 2 : мя ТІВ АВКАКАЄТЮКВ вх, ПТКЕ--- ТВ сне як, РАЮ! пен ВИЙ : 87
Ш.сарасчя З Нерест ект од Се и и я ОНСАВСНен В Й Кк АНКЕТ ФАХОВІ : ЯКО біусійе зах : Шо кн шо ОМНЬСАКО ВН ЕТ. НКсР ДоВКтоВ АТОКТЕКНи : 467 а. хваіїан ї син яд о ре Ото Мфонтнттнетттнннттнннтттиненяний ре вБЩТаенн : 464
Б.сарясчв З фест ве, саун Ідекве ни й КО кжжа й шк; і сю ПЕЗТВААНЮЙЯия : БОЄ
С.кеіннахісії ї : "НЕ с ЯКЕ р оо шо шим іш ша же ж ом Хоче : астЕт і Вега е т С вв ори МК о-ВЕНетАу ув зно о КеНьОи: ЖОВ : 435 д.явічн і Шепеон в ос ш ше З сш ши о є оман
З.счрекозцих : и оте Брати и і ше их фетр ай : Бах жк : ЕТ ЕВ нк ох ТЕМНЕ КЕ ВО ЖЖ рпако сени го. Я КН МОТАКАСВККнняя ї: ЗВХ б.іюкуюах 1 : ен Сх КН ДРЕВО АХВ ие Іов т. ТК СІМ НТ щи ни : 513 км майже тки се ПВ Х ж ване ї джек. м д.озсхзива 1 : а; шен До деедко ВАСКО Р В КИ ВОВНА я. пе ХКенни с БЕо Воїусоюиії 5 : фак ет В ТП ААДСВАр ОНА МЕНЕ МК В СІК ККСЯХ о сук СОНЯ ККЕас : 837 чЬПТЕ5еВ БЕР дах їі 5 1 я ту й в ре Е х го к чо - обліків с --ВИЕНЕМОТЕХ ОА несна нет Дрантлиновнтхн- : Ка
А.тикакеіасия Я: --В Х де хна вот УБІХУККОВНІй» : 5
З.квазмівна Х : «ВЕК УВКНКО МН А осКА ЩІ8. КеСяКОККНовня ї 547
З. сівтасха 2 : Сто таб реа я : 3
Н.тарасяю З : ВИК ТАВВ ВК тНосви ої ВЕ---уБТОВКиНо- : 504 сітсіне вах гот ВЕК док сажі КАНССНАСЮВ НОВА с: 50 Асоваііана КС: зони од но СтоМЕт ІВ. МОЯКТАТИ ти с БОБ
М.хавасв У : кош ї я да ТОЕКТАЖК нт:
С.коіннаєйтіі 1 : АСВОМУВІ см ос я яй АКЕОВКААМКА нти т БЕЗ т.ваух ше ск я их :8ю
О.вакіха Шо Мойсея дове ожв шу слов А ВКА
С. вавілдлах : каву сш. ДЕ: ВУ с. івеуках ї : БІК щі іа нн ян ДДСУЖК нин: БЕК
З.сівквсяк Я : Но й бо ПІКОВІ тннння о ЖЕЕ Роїунве їв : КИЗДВО СВ вот ЕЕої. ШЕденннннянння її В БЕ и бе м 8 ФІГ 1-"продовження ОИКНКННН КВ ХОМ Я Б до Кох с У о. о. о. о о . с
ФІГ. КА й пен я ж с 7 ОКО а а аж і М с У М М М М Я ПК ху . Ч вх се С ОК ХО С ОО я х х. сх.
ЯНГ. о
UAA201308956A 2010-12-16 2011-12-15 Стійка до гербіцидів трансгенна рослина, яка містить мутантну протопорфіриногеноксидазу UA121371C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US42360410P 2010-12-16 2010-12-16
PCT/IB2011/055701 WO2012080975A1 (en) 2010-12-16 2011-12-15 Plants having increased tolerance to herbicides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA121371C2 true UA121371C2 (uk) 2020-05-25

Family

ID=46244173

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201308956A UA121371C2 (uk) 2010-12-16 2011-12-15 Стійка до гербіцидів трансгенна рослина, яка містить мутантну протопорфіриногеноксидазу

Country Status (17)

Country Link
US (2) US11274313B2 (uk)
EP (1) EP2652139B1 (uk)
JP (1) JP6334169B2 (uk)
KR (1) KR102085133B1 (uk)
CN (1) CN103261424B (uk)
AU (1) AU2011342759B2 (uk)
BR (1) BR112013014778A2 (uk)
CA (1) CA2818917C (uk)
CR (1) CR20130296A (uk)
DE (1) DE112011104396T5 (uk)
EA (1) EA029356B1 (uk)
ES (1) ES2903230T3 (uk)
MX (1) MX347362B (uk)
MY (1) MY169304A (uk)
UA (1) UA121371C2 (uk)
WO (1) WO2012080975A1 (uk)
ZA (1) ZA201305262B (uk)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA121371C2 (uk) 2010-12-16 2020-05-25 Басф Агро Б. В. Стійка до гербіцидів трансгенна рослина, яка містить мутантну протопорфіриногеноксидазу
AR091489A1 (es) * 2012-06-19 2015-02-11 Basf Se Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno oxidasa (ppo)
US10041087B2 (en) 2012-06-19 2018-08-07 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
WO2014177992A2 (en) * 2013-04-30 2014-11-06 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
CN104107437B (zh) * 2013-06-09 2015-08-26 厦门成坤生物技术有限公司 一种用于治疗乙型病毒性肝炎的rna干扰组合物及其制备方法
UA123757C2 (uk) 2013-08-12 2021-06-02 Басф Агро Б. В. Мутована протопорфіриногеноксидаза, що надає рослинам стійкості до ппо-інгібуючого гербіциду
BR112016002851B1 (pt) 2013-08-12 2022-02-22 BASF Agro B.V. Molécula de ácido nucleico, constructo de ácido nucleico, vetor, polipeptídeo ppo, método para controlar vegetação indesejada e uso do ácido nucleico
BR112016014174B1 (pt) * 2013-12-18 2022-03-15 BASF Agro B.V. Método de controle de vegetação indesejada e método de produção de uma célula vegetal transgênica
KR101827545B1 (ko) * 2014-12-16 2018-02-08 주식회사 팜한농 프로토포르피리노겐 옥시다아제를 이용한 식물 및/또는 조류의 제초제 저항성 부여 또는 증진 방법
PE20181026A1 (es) * 2015-08-03 2018-06-27 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para tolerancia a los herbicidas en plantas
US10378023B2 (en) 2015-09-01 2019-08-13 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for herbicide tolerance in plants
MA45030A (fr) 2016-05-20 2019-03-27 Basf Agro Bv Peptides à double transit pour le ciblage de polypeptides
JP6875426B2 (ja) * 2016-06-16 2021-05-26 ファームハンノン・カンパニー・リミテッドＦａｒｍｈａｎｎｏｎｇ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ変異体およびこれを用いる除草剤耐性付与および／または増進のための組成物および方法
CA3024985A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Farmhannong Co., Ltd. Methods and compositions for conferring and/or enhancing herbicide tolerance using protoporphyrinogen oxidase or variant thereof
CN109790153A (zh) * 2016-07-27 2019-05-21 巴斯夫农业公司 具有增加的除草剂耐受性的植物
PE20190838A1 (es) * 2016-07-29 2019-06-17 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para la expresion genica en plantas
EP3559243A1 (en) 2016-12-20 2019-10-30 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
WO2019106568A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Basf Se Plants having increased tolerance to herbicides
CA3085594C (en) * 2017-12-15 2023-10-10 Farmhannong Co., Ltd. Composition and method for conferring and/or enhancing tolerance against herbicides by using variants of ppo
AU2018385130B2 (en) 2017-12-15 2022-07-14 Farmhannong Co., Ltd. Composition and method for conferring and/or enhancing herbicide tolerance using variants of protoporphyrinogen ix oxidase from cyanobacteria
KR102048841B1 (ko) * 2017-12-26 2019-11-27 대한민국 제초제 내성을 갖는 남일 돌연변이 후대 계통, Namil(SA)-gla1, 및 이의 용도
KR102048838B1 (ko) * 2017-12-26 2019-11-27 대한민국 제초제 내성을 갖는 남일 돌연변이 후대 계통, Namil(EMS)-gla1, 및 이의 용도
AU2020292093A1 (en) * 2019-06-14 2021-12-16 Farmhannong Co., Ltd. Methods and compositions for conferring and/or enhancing herbicide tolerance using protoporphyrinogen IX oxidase of various cyanobacteria or variant thereof
BR112021024656A2 (pt) * 2019-09-17 2022-04-12 Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd Polipeptídeo de hidroxife-nilpiruvato-dioxigenase mutante, gene codificador e uso do mesmo
US20240124432A1 (en) 2020-11-24 2024-04-18 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
CA3214498A1 (en) 2021-04-07 2022-10-13 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
AU2022340861A1 (en) 2021-09-03 2024-03-14 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Plants having increased tolerance to herbicides
WO2023044364A1 (en) 2021-09-15 2023-03-23 Enko Chem, Inc. Protoporphyrinogen oxidase inhibitors
AR127152A1 (es) 2021-09-27 2023-12-20 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Plantas de girasol no transgénicas que tienen tolerancia aumentada a herbicidas
WO2023137309A2 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Enko Chem, Inc. Protoporphyrinogen oxidase inhibitors
CN114504869B (zh) * 2022-01-27 2023-05-23 浙江工业大学 一种便携手摇式海水淡化器
WO2023169984A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
KR20230141283A (ko) * 2022-03-31 2023-10-10 주식회사 팜한농 프로토포르피리노겐 옥시다아제의 변이체를 이용하는 트리플루디목사진 내성 부여 및/또는 증진을 위한 조성물 및 방법
WO2023222589A1 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal compounds
WO2024012968A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Syngenta Crop Protection Ag Herbicidal pyrimidinone derivatives

Family Cites Families (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
EP0242236B2 (en) 1986-03-11 1996-08-21 Plant Genetic Systems N.V. Plant cells resistant to glutamine synthetase inhibitors, made by genetic engineering
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
BE1000563A6 (fr) 1987-05-18 1989-02-07 Cedres Castro Herminio S Dispositif accessoire, retractable dans un wc du type traditionnel destine a l'hygiene du corps.
JPS6475486A (en) * 1987-09-17 1989-03-22 Nihon Tokushu Noyaku Seizo Kk Benzoxazinones and herbicide
ATE105585T1 (de) 1987-12-21 1994-05-15 Univ Toledo Transformation von keimenden pflanzensamen mit hilfe von agrobacterium.
US5198013A (en) * 1988-02-05 1993-03-30 Sagami Chemical Research Center Benzoxazinone compounds and herbicidal composition containing the same
FR2629098B1 (fr) 1988-03-23 1990-08-10 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimerique de resistance herbicide
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
JPH02235873A (ja) * 1989-03-10 1990-09-18 Sagami Chem Res Center オキサゾリジンジオン誘導体及びその製法
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
DE69133128T2 (de) 1990-04-12 2003-06-18 Syngenta Participations Ag Gewebe-spezifische Promotoren
PL295547A1 (uk) 1990-04-26 1992-10-05 Plant Genetic Systems Nv
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
US5277905A (en) 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
CA2112676C (en) 1991-08-02 2007-07-03 Michio Ohba Novel microorganism and insecticide
CA2116449C (en) 1991-08-27 2005-04-05 Vaughan Alan Hilder Proteins with insecticidal properties against homopteran insects and their use in plant protection
WO1993007256A1 (en) 1991-10-07 1993-04-15 Ciba-Geigy Ag Particle gun for introducing dna into intact cells
TW261517B (uk) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
AU4115693A (en) 1992-04-24 1993-11-29 Sri International In vivo homologous sequence targeting in eukaryotic cells
NZ278490A (en) 1993-12-09 1998-03-25 Univ Jefferson Chimeric polynucleotide with both ribo- and deoxyribonucleotides in one strand and deoxyribonucleotides in a second strand
JP2909796B2 (ja) 1993-12-28 1999-06-23 ローム株式会社 サーマルプリントヘッドおよびその製造方法
US5593881A (en) 1994-05-06 1997-01-14 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis delta-endotoxin
US5939602A (en) 1995-06-06 1999-08-17 Novartis Finance Corporation DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof
US5767373A (en) 1994-06-16 1998-06-16 Novartis Finance Corporation Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
DE19505995A1 (de) 1995-02-21 1996-08-22 Degussa Verfahren zur Herstellung von Thietanonen
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
US6084155A (en) 1995-06-06 2000-07-04 Novartis Ag Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
WO1997004088A1 (en) * 1995-07-20 1997-02-06 Sumitomo Chemical Company, Ltd. Porphyrin-accumulating type herbicide resistance gene
US5737514A (en) 1995-11-29 1998-04-07 Texas Micro, Inc. Remote checkpoint memory system and protocol for fault-tolerant computer system
BR9707783A (pt) * 1996-02-28 1999-07-27 Novartis Ag Promotores provenientes de genes para protoporfirnogênio oxidase em vegetais
US5948917A (en) 1996-03-26 1999-09-07 Nippon Soda Co., Ltd. 3-(isoxazol-5-yl)-substituted benzoic acid derivative and method for production thereof
HUP9902423A3 (en) 1996-04-26 2001-02-28 Nippon Soda Co Benzene derivatives substituted by heterocycles and herbicides
WO1997041117A1 (fr) 1996-04-26 1997-11-06 Nippon Soda Co., Ltd. Nouveaux derives du benzene substitues par des heterocycles, et herbicides
AU1670797A (en) 1996-04-26 1997-11-19 Nippon Soda Co., Ltd. Benzene derivatives substituted by heterocycles and herbicides
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
US5773702A (en) 1996-07-17 1998-06-30 Board Of Trustees Operating Michigan State University Imidazolinone herbicide resistant sugar beet plants
US5859348A (en) 1996-07-17 1999-01-12 Board Of Trustees Operating Michigan State University Imidazolinone and sulfonyl urea herbicide resistant sugar beet plants
WO1998029554A1 (en) 1996-12-27 1998-07-09 Sumitomo Chemical Co., Ltd. Methods of conferring ppo-inhibiting herbicide resistance to plants by gene manipulation
JP4451933B2 (ja) * 1996-12-27 2010-04-14 住友化学株式会社 遺伝子操作による植物へのｐｐｏ阻害性除草剤耐性付与法
US6027945A (en) 1997-01-21 2000-02-22 Promega Corporation Methods of isolating biological target materials using silica magnetic particles
ZA98371B (en) * 1997-01-31 1999-07-16 Du Pont Genetically transformed plants demonstrating resistance to porphyrinogen biosynthesis-inhibiting herbicides.
US7105724B2 (en) 1997-04-04 2006-09-12 Board Of Regents Of University Of Nebraska Methods and materials for making and using transgenic dicamba-degrading organisms
US5939360A (en) 1997-07-08 1999-08-17 Nippon Soda Co., Ltd. Compound and herbicidal composition for weed control
CA2303403A1 (en) 1997-09-11 1999-03-18 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Novel protoporphyrinogen oxidase tolerant to photobleaching herbicide
AR014072A1 (es) 1998-02-26 2001-01-31 Pioneer Hi Bred Int Molecula de acido nucleico aislada que tiene una secuencia nucleotidica para un promotor que es capaz de iniciar una transcripcion constitutiva en unacelula de planta, construccion adn, vector, celula huesped, metodo para expresar en forma constitutiva una secuencia nucleotidica heteroloca en una
US6555732B1 (en) 1998-09-14 2003-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Rac-like genes and methods of use
AU775233B2 (en) 1999-07-22 2004-07-22 National Institute Of Agrobiological Sciences Method for superrapid transformation of monocotyledon
DE19939095A1 (de) 1999-08-18 2001-02-22 Univ Eberhard Karls Von Coxsackieviren abgeleitetes Vektorsystem für Gentransfer
AU2001260114A1 (en) * 2000-03-14 2001-09-24 Syngenta Participations Ag Protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
US6936467B2 (en) * 2000-03-27 2005-08-30 University Of Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides
AU5920601A (en) 2000-04-28 2001-11-12 American Cyanamid Co Use of the maize x112 mutant ahas 2 gene and imidazolinone herbicides for selection of transgenic monocots, maize, rice and wheat plants resistant to the imidazolinone herbicides
EP1226127B1 (en) 2000-05-04 2009-07-01 Basf Se Substituted phenyl sulfamoyl carboxamides
US7462481B2 (en) 2000-10-30 2008-12-09 Verdia, Inc. Glyphosate N-acetyltransferase (GAT) genes
CN100537764C (zh) 2001-10-19 2009-09-09 住友化学工业株式会社 除草剂代谢蛋白质,其基因及其应用
AU2002336288C1 (en) 2001-10-19 2009-04-30 Sumitomo Chemical Company, Limited Weed controller metabolism proteins, genes thereof and use of the same
CA2897475C (en) 2004-04-30 2018-07-10 Dow Agrosciences Llc Novel herbicide resistance genes
MXPA06013357A (es) 2004-06-07 2007-03-01 Basf Plant Science Gmbh Transformacion mejorada de porotos de soja.
US8680290B2 (en) 2004-09-03 2014-03-25 Syngenta Limited Isoxazoline derivatives and their use as herbicides
EP1799657B1 (en) 2004-10-05 2009-12-02 Syngenta Limited Isoxazoline derivatives and their use as herbicides
US20070021515A1 (en) 2005-07-19 2007-01-25 United States (as represented by the Secretary of Agriculture) Expandable starch-based beads and method of manufacturing molded articles therefrom
US7842856B2 (en) 2005-08-25 2010-11-30 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Herbicide resistance gene, compositions and methods
US7671254B2 (en) * 2005-08-25 2010-03-02 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Herbicide resistance gene, compositions and methods
KR20080050618A (ko) 2005-09-26 2008-06-09 닛뽕소다 가부시키가이샤 아시플루오르펜에 대한 내성을 부여하는 활성을 갖는프로토포르피리노겐옥시다아제 및 그 유전자
GB0526044D0 (en) 2005-12-21 2006-02-01 Syngenta Ltd Novel herbicides
GB0603891D0 (en) 2006-02-27 2006-04-05 Syngenta Ltd Novel herbicides
US20070214515A1 (en) 2006-03-09 2007-09-13 E.I.Du Pont De Nemours And Company Polynucleotide encoding a maize herbicide resistance gene and methods for use
VN21892A1 (en) 2007-04-04 2010-01-25 Basf Plant Science Gmbh Ahas mutants
MX2009012120A (es) 2007-05-09 2010-02-12 Dow Agrosciences Llc Genes novedosos con resistencia a herbicidas.
AR066787A1 (es) 2007-05-30 2009-09-09 Syngenta Participations Ag Genes del citocromo p450 que confieren resistencia a los herbicidas
CN101215289A (zh) 2008-01-11 2008-07-09 南开大学 具有PPO抑制活性及除草活性的3-取代苯基-吡唑并[3,4-d][1,2,3]三嗪-4-酮类化合物
CA2741138A1 (en) 2008-10-29 2010-05-06 Basf Se Substituted pyridines having herbicidal action
EA023754B1 (ru) 2009-06-19 2016-07-29 Басф Се Гербицидные бензоксазиноны
WO2011018486A2 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Basf Se Herbicidally active composition comprising benzoxazinones
UA112969C2 (uk) 2010-08-03 2016-11-25 Сібас Юс Ллс Рослина, стійка до одного або більше ррх-інгібуючих гербіцидів, яка містить мутантний ген протопорфіриноген ix оксидази (ррх)
US20120122223A1 (en) 2010-08-03 2012-05-17 Cibus Us Llc Mutated protoporphyrinogen ix oxidase (ppx) genes
EP2621924B1 (en) 2010-10-01 2015-03-04 Basf Se Herbicidal benzoxazinones
UA121371C2 (uk) 2010-12-16 2020-05-25 Басф Агро Б. В. Стійка до гербіцидів трансгенна рослина, яка містить мутантну протопорфіриногеноксидазу
AR091489A1 (es) 2012-06-19 2015-02-11 Basf Se Plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas inhibidores de la protoporfirinogeno oxidasa (ppo)
US10041087B2 (en) 2012-06-19 2018-08-07 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
BR112016002851B1 (pt) 2013-08-12 2022-02-22 BASF Agro B.V. Molécula de ácido nucleico, constructo de ácido nucleico, vetor, polipeptídeo ppo, método para controlar vegetação indesejada e uso do ácido nucleico
UA123757C2 (uk) 2013-08-12 2021-06-02 Басф Агро Б. В. Мутована протопорфіриногеноксидаза, що надає рослинам стійкості до ппо-інгібуючого гербіциду
BR112016014174B1 (pt) 2013-12-18 2022-03-15 BASF Agro B.V. Método de controle de vegetação indesejada e método de produção de uma célula vegetal transgênica

Also Published As

Publication number Publication date
EP2652139B1 (en) 2021-10-20
US20150252379A1 (en) 2015-09-10
EA201390842A1 (ru) 2013-12-30
KR20140033330A (ko) 2014-03-18
AU2011342759B2 (en) 2017-04-27
EP2652139A4 (en) 2014-05-21
CR20130296A (es) 2013-08-09
CA2818917C (en) 2023-02-28
MY169304A (en) 2019-03-21
EP2652139A1 (en) 2013-10-23
CA2818917A1 (en) 2012-06-21
JP6334169B2 (ja) 2018-05-30
KR102085133B1 (ko) 2020-03-05
BR112013014778A2 (pt) 2017-06-06
CN103261424B (zh) 2017-12-12
MX2013005975A (es) 2013-07-15
DE112011104396T5 (de) 2013-10-10
JP2014504855A (ja) 2014-02-27
WO2012080975A1 (en) 2012-06-21
US11274313B2 (en) 2022-03-15
US20220315943A1 (en) 2022-10-06
EA029356B1 (ru) 2018-03-30
ZA201305262B (en) 2014-12-23
ES2903230T3 (es) 2022-03-31
CN103261424A (zh) 2013-08-21
MX347362B (es) 2017-04-10
AU2011342759A1 (en) 2013-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA121371C2 (uk) Стійка до гербіцидів трансгенна рослина, яка містить мутантну протопорфіриногеноксидазу
US20240026371A1 (en) Plants having increased tolerance to herbicides
ES2909315T3 (es) Plantas con mayor tolerancia a herbicidas
UA123757C2 (uk) Мутована протопорфіриногеноксидаза, що надає рослинам стійкості до ппо-інгібуючого гербіциду
DE112011101566T5 (de) Pflanzen mit erhöhter herbizidtoleranz
BR112016014174B1 (pt) Método de controle de vegetação indesejada e método de produção de uma célula vegetal transgênica
CN107645908A (zh) 对除草剂具有提高的耐受性的植物
CN106460007A (zh) 具有增加的除草剂耐受性的植物
CN105247058A (zh) 具有增加的除草剂耐受性的植物
CA3032014A1 (en) Plants having increased tolerance to herbicides
CN107603960A (zh) 乙酰辅酶a羧化酶除草剂抗性植物
CN111801012A (zh) 具有增加的除草剂耐受性的植物
CN110382702A (zh) 具有增加的除草剂耐性的植物
CN107426979A (zh) 具有增加的除草剂耐受性的植物
CN105358697A (zh) 具有增加的除草剂耐受性的植物
CN117897378A (zh) 对除草剂具有增加的耐受性的植物
CN109688807A (zh) 具有增加的除草剂耐受性的植物
TW201231656A (en) Plants having increased tolerance to herbicides