ES2903230T3

ES2903230T3 - Plantas que tienen mayor tolerancia a los herbicidas

Info

Publication number: ES2903230T3
Application number: ES11848519T
Authority: ES
Inventors: Johannes Hutzler; Raphael Aponte; Thomas Mietzner; Matthias Witschel; Anja Simon; Jens Lerchl; Stefan Tresch; S Luke Mankin
Original assignee: BASF Agro BV
Current assignee: BASF Agro BV
Priority date: 2010-12-16
Filing date: 2011-12-15
Publication date: 2022-03-31
Anticipated expiration: 2031-12-15
Also published as: US20150252379A1; KR102085133B1; CA2818917A1; US20220315943A1; BR112013014778A2; MX2013005975A; CA2818917C; EP2652139B1; MY169304A; CN103261424A; JP6334169B2; ZA201305262B; UA121371C2; JP2014504855A; MX347362B; AU2011342759B2; EA201390842A1; AU2011342759A1; KR20140033330A; EA029356B1

Abstract

Un procedimiento para potenciar el crecimiento de una planta de cultivo mediante el control de la vegetación no deseada que rodea a dicha planta de cultivo en un sitio de cultivo, comprendiendo el procedimiento los pasos de: a) proporcionar, en dicho sitio, una planta que comprenda al menos un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una protoporfirinógeno oxidasa mutada (mut-PPO) que sea resistente o tolerante a un herbicida derivado de la benzoxazinona y b) aplicar a dicho sitio una cantidad eficaz de dicho herbicida, en el que la secuencia de nucleótidos de a) comprende una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 1, y en el que la mut-PPO codificada es una variante de la SEQ ID NO: 2 en el que el aminoácido en la posición 128 es Alanina, y el aminoácido en la posición 420 es Metionina, Isoleucina o Leucina , y en el que la cantidad efectiva de dicho herbicida no mata o inhibe el crecimiento de la planta resistente a los herbicidas de a).

Description

DESCRIPCIÓN

Plantas que tienen mayor tolerancia a los herbicidas

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere en general a procedimientos para conferir a las plantas tolerancia a nivel agrícola a un herbicida. En particular, la invención se refiere a plantas que tienen una mayor tolerancia a los herbicidas "derivados de la benzoxazinona". Más concretamente, la presente invención se refiere a los procedimientos y a las plantas obtenidas mediante mutagénesis y cruzamiento y transformaciones que tienen una mayor tolerancia a los herbicidas "derivados de la benzoxazinona".

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los herbicidas que inhiben la protoporfirinógeno oxidasa (en adelante Protox o PPO; EC:1.3.3.4), una enzima clave en la biosíntesis de la protoporfirina IX, se han utilizado para el control selectivo de las malezas desde la década de 1960. La PPO cataliza el último paso común en la biosíntesis de la clorofila y el hemo, que es la oxidación del protoporfirinógeno IX a protoporfirina IX. (Matringe et al. 1989. Biochem. 1. 260; 231) Los herbicidas inhibidores de la PPO incluyen muchas clases estructurales diferentes de moléculas (Duke et al. 1991. Weed Sci. 39; 465; Nandihalli et al. 1992. Pesticide Biochem. Physiol. 43; 193; Matringe et al. 1989. FEBS Lett. 245; 35 Yanase y Andoh. 1989. Pesticide Biochem. Physiol. 35; 70) Estos compuestos herbicidas incluyen los difeniléteres {por ejemplo lactofeno, (+-)-2-etoxi-1-metil-2-oxoetil 5-{2-cloro-4-(trifluorometil)fenoxi}-2-nitrobenzoato; acifluorfeno, ácido 5-{2-cloro-4-(trifluorometil)fenoxi}-2-nitrobenzoico; su éster metílico; u oxifuorfeno, 2-cloro-1-(3-etoxi-4-nitrofenoxi)-4-(trifluorobenceno)}, oxidiazoles, (por ejemplo, oxidiazon, 3-{2,4-dicloro-5-(1-metiletoxi)fenil}-5-(1,1-dimetiletil)-1,3,4-oxadi-azol-2-(3H)-ona), imidas cíclicas (por ejemplo S-23142, N-(4-cloro-2-fluoro-5-propargiloxifenilo)-3,4,5,6-tetrahidroftalimida; cloroftalima, N-(4-clorofenilo)-3,4,5,6-tetrahidroftalimida), fenilpirazoles (por ejemplo TNPP-etilo, 2-{1-(2,3,4-triclorofenilo)-4-nitropirazolil-5-oxi}propionato de etilo; M&B 39279), derivados de piridina (por ejemplo, LS 82-556), y fenopilato y sus análogos O-fenilpirrolidino- y piperidinocarbamato. Muchos de estos compuestos inhiben competitivamente la reacción normal catalizada por la enzima, actuando aparentemente como análogos del sustrato.

La aplicación de herbicidas inhibidores de la PPO da lugar a la acumulación de protoporfirinógeno IX en el cloroplasto y la mitocondria, que se cree que se filtra al citosol, donde es oxidado por una peroxidasa. Cuando se expone a la luz, la protoporfirina IX provoca la formación de oxígeno singlete en el citosol y la formación de otras especies reactivas de oxígeno, que pueden causar la peroxidación de lípidos y la alteración de la membrana, lo que conduce a la rápida muerte de la célula (Lee et al. 1993. Plant Physiol. 102; 881)

No todas las enzimas PPO son sensibles a los herbicidas que inhiben las enzimas PPO de las plantas. Tanto las enzimas PPO de Escherichia coli como las de Bacillus subtilis (Sasarmen et al. 1993. Puede. J. Microbiol. 39; 1155 Dailey et al. 1994. J. Biol. Chem. 269; 813) son resistentes a estos inhibidores herbicidas. Se han descrito mutantes del alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii resistentes al herbicida fenilimida S-23142 (Kataoka et al. 1990. J. Pesticide Sci. 15; 449 Shibata et al. 1992. En Research in Photosynthesis, Vol. III, N. Murata, ed. Kluwer:Netherlands. pp. 567-70). Al menos uno de estos mutantes parece tener una actividad de PPO alterada que es resistente no sólo al inhibidor herbicida con el que se seleccionó el mutante, sino también a otras clases de inhibidores de protox (Oshio et al. 1993. Z. Naturforsch. 48c 339 Sato et al. 1994. En ACS Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke, ed. ACS Press: Washington, D.C.). También se ha informado de una línea celular de tabaco mutante que es resistente al inhibidor S-21432 (Che et al. 1993. Z. Naturforsch. 48c 350) Se han utilizado mutantes de E. coli auxiliares para confirmar la resistencia a los herbicidas de las PPOs vegetales clonadas.

Existen tres estrategias principales para hacer que las plantas sean tolerantes a los herbicidas, es decir, (1) desintoxicar el herbicida con una enzima que transforme el herbicida, o su metabolito activo, en productos no tóxicos, como, por ejemplo, las enzimas para la tolerancia al bromoxinil o al basta (EP242236, EP337899); (2) mutar la enzima objetivo en una enzima funcional que sea menos sensible al herbicida, o a su metabolito activo, como, por ejemplo, las enzimas de tolerancia al glifosato (EP293356, Padgette S. R. et al., J.Biol. Chem., 266, 33, 1991); o (3) sobreexpresando la enzima sensible para producir cantidades de la enzima objetivo en la planta que sean suficientes en relación con el herbicida, en vista de las constantes cinéticas de esta enzima, para tener suficiente de la enzima funcional disponible a pesar de la presencia de su inhibidor. La tercera estrategia se describió para obtener con éxito plantas tolerantes a los inhibidores de la PPO (véase, por ejemplo US5,767,373 o US5,939,602 y los miembros de la familia de patentes de los mismos). Además, US 2010/0100988 y WO 2007/024739 divulgan secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos que tienen una actividad enzimática tal que las secuencias de aminoácidos son resistentes a los productos químicos herbicidas inhibidores de la PPO, en particular a los mutantes específicos de la PPO inhibidores del 3-feniluracilo.

Hasta la fecha, la técnica anterior no ha descrito plantas tolerantes a herbicidas derivados de la benzoxazinona que contengan al menos un ácido nucleico de PPO de tipo salvaje o mutado. El estado de la técnica tampoco ha descrito plantas de cultivo tolerantes a herbicidas derivados de la benzoxazinona que contengan mutaciones en genomas distintos al genoma del que deriva el gen PPO. Por lo tanto, lo que se necesita en la técnica es la identificación de los genes de tolerancia a los herbicidas derivados de la benzoxazinona de otros genomas y especies. Lo que también se necesita en la técnica son plantas de cultivo y plantas de cultivo que tengan una mayor tolerancia a los herbicidas, como el herbicida derivado de la benzoxazinona, y que contengan al menos un ácido nucleico de PPO de tipo salvaje y/o mutado. También se necesitan procedimientos para controlar el crecimiento de las malezas en las proximidades de dichas plantas de cultivo o de las plantas de cultivo. Estas composiciones y procedimientos permitirían el uso de técnicas de pulverización por encima cuando se apliquen herbicidas a zonas que contengan plantas de cultivo o plantas de cultivo.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

El problema se resuelve mediante la presente invención, que se refiere a un procedimiento para potenciar el crecimiento de las plantas de cultivo mediante el control de la vegetación no deseada en un sitio de cultivo de plantas, comprendiendo el procedimiento los pasos de:

a) proporcionar, en dicho sitio, una planta que comprenda al menos un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una protoporfirinógeno oxidasa mutada (mut-PPO) que sea resistente o tolerante a un herbicida derivado de la benzoxazinona, y

b) aplicar a dicho sitio una cantidad eficaz de dicho herbicida.

donde la secuencia de nucleótidos de a) comprende una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 1, y en el que la mut-PPO codificada es una variante de la SEQ ID NO: 2 en el que el aminoácido en la posición 128 es alanina, y el aminoácido en la posición 420 es metionina, isoleucina o leucina

y en el que la cantidad efectiva de dicho herbicida no mata o inhibe el crecimiento de la planta resistente a los herbicidas de a).

Otro objeto se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica una mut-PPO, en el que la mut-PPO codificada es una variante de la SEQ ID NO: 2 en el que el aminoácido en la posición 128 es Alanina, y el aminoácido en la posición 420 es Metionina, Isoleucina o Leucina..

En otra realización, la invención se refiere a una célula vegetal transformada por un ácido nucleico mut-PPO o a una planta que ha sido mutada para obtener una planta que expresa, preferentemente sobreexpresa un ácido nucleico mut-PPO, en la que la expresión del ácido nucleico en la célula vegetal da lugar a una mayor resistencia o tolerancia a un herbicida derivado de la benzoxazinona en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula vegetal.

donde el ácido nucleico mut-PPO comprende un polinucleótido que codifica una variante del polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 2;

y en el que la variante del polipéptido de la SEQ ID NO: 2 en b) incluye: el aminoácido en la posición 128 es Alanina, y el aminoácido en la posición 420 es Metionina, Isoleucina o Leucina.

En otra realización, la invención se refiere a una planta que comprende una célula vegetal según la presente invención, en la que la expresión del ácido nucleico en la planta da lugar a un aumento de la resistencia de la planta al herbicida derivado de la benzoxazinona en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

Las plantas de la presente invención pueden sertransgénicas o no transgénicas.

Preferentemente, la expresión del ácido nucleico en la planta da lugar a una mayor resistencia de la planta al herbicida derivado de la benzoxazinona en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

En otra realización, la invención se refiere a una semilla producida por una planta transgénica que comprende una célula vegetal de la presente invención, en la que la semilla es una genéticamente pura para una mayor resistencia a un herbicida derivado de la benzoxazinona en comparación con una variedad de tipo salvaje de la semilla.

En otra realización, la invención se refiere a un procedimiento para producir una célula vegetal transgénica con una mayor resistencia a un herbicida derivado de la benzoxazinona en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula vegetal que comprende, transformar la célula vegetal con un casete de expresión que comprende ácido nucleico mut-PPO según la presente invención.

En otra realización, la invención se refiere a un procedimiento de producción de una planta transgénica que comprende, (a) transformar una célula vegetal con un casete de expresión que comprende un ácido nucleico mut-PPO según la presente invención, y (b) generar una planta con una resistencia aumentada al herbicida derivado de la benzoxazinona a partir de la célula vegetal.

Preferentemente, el casete de expresión comprende además una región reguladora de la iniciación de la transcripción y una región reguladora de la iniciación de la traducción que son funcionales en la planta.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de Amaranthus tuberculatus (A.tuberculatus), Amaranthus tuberculatus resistente (A.tuberculatus_R), Arabidopsis thaliana larga (A.thaliana_2), Spinacia oleracea corta (S.oleracea_2), Nicotiana tabacum corta (N.tabacum_2), Glycine max (Glycine_max), Arabidopsis thaliana corta (A.thaliana_1), Nicotiana tabacum larga (N.tabacum_1), Chlamydomonas reinhardtii larga (C.reinhardtii_1), Zea mays (Z.mays), Oryza sativa (O.sativa_1), Solanum tuberosum (S.tuberosum), Cucumis sativus (C.sativus), Cichorium intybus (C.intybus_1), Spinacia oleracea larga (S.oleracea_1), Polytomella sp. Pringsheim 198.80 (Polytomella) secuencias PPO. Las regiones conservadas se indican en gris claro, gris y negro.

La figura 2 muestra la selección de cepas de Chlamydomonas reinhardtii resistentes al herbicida derivado de la benzoxazinona 1.a.35. (A) Células mutagénicas sembradas en medio sólido sin agente de selección. (B) Células mutagénicas sembradas en medio sólido con 1x10-7 M de benzoxazinona-derivado I.a.35. Las células resistentes al herbicida derivado de la benzoxazinona forman colonias (marcadas con un círculo y numeradas como 33, 34, 35 y 36), mientras que las células susceptibles no crecen. El mayor número de colonias en la placa A en comparación con la B, indica que las colonias de la placa B son resistentes al derivado de la benzoxazinona I.a.35.

La figura 3 muestra el recrecimiento de las cepas seleccionadas de Chlamydomonas reinhardtii, como se ve en la figura 2, resistentes al herbicida derivado de la benzoxazinona 1.a.35. (A) Células de tipo salvaje en medio líquido sin agente de selección. (B) Células de tipo salvaje en medio líquido que contiene el derivado de la benzoxazinona I.a.35 en aumento (entre 1x10-9 - 5x10-6 M). (C) Células mutagénicas en medio líquido sin agente de selección. (D1, D2, E1, E2) Cepas mutagénicas y seleccionadas en medio líquido, conteniendo un derivado creciente de la benzoxazinona I.a.35 (entre 1x10-9 - 5x10-6 M). Las cepas resistentes al herbicida derivado de la benzoxazinona 1.a.35, cultivan a un color más oscuro que indica el crecimiento. Las cepas susceptibles no se cultivan y permanecen de color claro. La mayor densidad de células en el medio líquido con células en crecimiento es responsable del color más oscuro. Los cultivos de menor densidad aparecen más claros o completamente claros

LISTADO DE SECUENCIAS

Tabla 1:

continuación

DESCRIPCION DETALLADA

Los artículos "un" y "uno, una" se utilizan en el presente documento para referirse a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa uno o más elementos. Como se usa en el presente documento, la palabra "que comprende" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" se entenderá que implica la inclusión de un elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos establecidos, pero no el exclusión de cualquier otro elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos.

La presente invención se refiere a un procedimiento para potenciar el crecimiento de las plantas de cultivo mediante el control de la vegetación no deseada en un sitio de cultivo de plantas, el procedimiento comprende los pasos de:

b) aplicar a dicho sitio una cantidad eficaz de dicho herbicida.

y en el que la cantidad efectiva de dicho herbicida no mata o inhibe el crecimiento de la planta resistente a los herbicidas de a)

El término "control de la vegetación no deseada" debe entenderse como la matanza de las malezas y/o el retraso o la inhibición del crecimiento normal de las mismas. Por malezas, en el sentido más amplio, se entienden todas aquellas plantas que crecen en lugares no deseados. Las malezas de la presente invención incluyen, por ejemplo, las dicotiledóneas y las monocotiledóneas. Las malezas dicotiledóneas incluyen, pero no se limitan a, malezas de los géneros Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus y Taraxacum. Las malezas monocotiledóneas incluyen, pero no se limitan a, las malezas de los géneros: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus y Apera. Además, las malezas de la presente invención pueden incluir, por ejemplo, plantas de cultivo que están creciendo en una ubicación no deseada. Por ejemplo, una planta de maíz voluntaria que se encuentra en un campo en el que predominan las plantas de soja puede considerarse una mala hierba, si la planta de maíz es indeseable en el campo de plantas de soja.

El término "planta" se utiliza en su sentido más amplio en lo que respecta a la técnica orgánica y pretende abarcar los organismos eucariotas que son miembros del Reino Plantae, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, las plantas vasculares, los vegetales, los granos, las flores, los árboles, las hierbas, los arbustos, las hierbas, las vides, los helechos, los musgos, los hongos y las algas, etc., así como los clones, los vástagos y las partes de las plantas utilizadas para la propagación asexual (por ejemplo, esquejes, pipas, brotes, rizomas, tallos subterráneos, grupos, coronas, bulbos, tallos bulbosos, tubérculos, rizomas, plantas/tejidos producidos en cultivo de tejidos, etc.). El término "planta" abarca además las plantas enteras, los ancestros y la progenie de las plantas y las partes de las plantas, incluidas las semillas, los brotes, los tallos, las hojas, las raíces (incluidos los tubérculos), las flores, los floretes, los frutos, los pedículos, los pedúnculos, los estambres, las anteras, el estigma, el estilo, el ovario, el pétalo, el sépalo, el carpelo, la punta de la raíz, el capuchón de la raíz, el pelo de la raíz pelo de la hoja, pelo de la semilla, grano de polen, microespora, cotiledón, hipocótilo, epicótilo, xilema, floema, parénquima, endosperma, una célula de acompañamiento, una célula de guarda y cualquier otro órgano, tejido y célula conocidos de una planta, y tejidos y órganos, en los que cada uno de los mencionados comprende el gen/ácido nucleico de interés. El término "planta" también abarca las células vegetales, los cultivos en suspensión, el tejido de callo, los embriones, las regiones meristemáticas, los gametofitos, los esporofitos, el polen y las microesporas, en los que cada uno de los mencionados comprende el gen/ácido nucleico de interés.

Las plantas que son particularmente útiles en los procedimientos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular las plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluidas las leguminosas forrajeras, las plantas ornamentales, los cultivos alimentarios, los árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acer spp, Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp, Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp., Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por ejemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp, Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por ejemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza, nabo]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp, Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp, Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp, Elaeis (por ejemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp, Ginkgo biloba, Glycine spp. (por ejemplo, Glycine max, Soja hispida o Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por ejemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por ejemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp, Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por ejemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp, Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp, Ornithopus spp., Oryza spp. (por ejemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp, Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp, Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp, Solanum spp. (por ejemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp, Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por ejemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum o Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp, Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp, amaranto, alcachofa, espárrago, brócoli, coles de Bruselas, col, canola, zanahoria, coliflor, apio, col rizada, lino, col rizada, lenteja, colza, quimbombó, cebolla, patata, arroz, soja, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, tomate, calabaza, té y algas, entre otros. Según una realización preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo. Algunos ejemplos de plantas de cultivo son, entre otros, la soja, el girasol, la canola, la alfalfa, la colza, el algodón, el tomate, la patata o el tabaco. Además, preferentemente, la planta es una monocotiledónea, como la caña de azúcar. Además, preferentemente, la planta es un cereal, como el arroz, el maíz, el trigo, la cebada, el mijo, el centeno, el sorgo o la avena.

En una realización preferida, la planta ha sido producida previamente por un proceso que comprende la preparación recombinante de una planta mediante la introducción y sobreexpresión de un transgén mut-PPO, como se describe en mayor detalle a continuación.

En otra realización preferida, la planta ha sido producida previamente por un proceso que comprende la mutagenización in situ de células vegetales, para obtener células vegetales que expresen un mut-PPO.

Como se divulga en el presente documento, los ácidos nucleicos de la invención se utilizan para potenciar la tolerancia a los herbicidas de las plantas que incluyen en sus genomas un gen que codifica una proteína mut-PPO o de tipo salvaje tolerante a los herbicidas. Dicho gen puede ser un gen endógeno o un transgén, como se describe más adelante. Además, en ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos de la presente invención pueden apilarse con cualquier combinación de secuencias polinucleotídicas de interés para crear plantas con un fenotipo deseado. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de la presente invención pueden apilarse con cualquier otro polinucleótido que codifique polipéptidos que tengan actividad pesticida y/o insecticida, como, por ejemplo, las proteínas de toxina de Bacillus thuringiensis (descritas en la Patente de EE.UU. No. 5.366.892 ,5.747.450, 5.737.514, 5-723-756, 5.593.881,y Geiser et al (1986) Gene 48: 109) Las combinaciones generadas también pueden incluir múltiples copias de cualquiera de los polinucleótidos de interés.

En una realización particularmente preferida, la planta comprende al menos un ácido nucleico heterólogo adicional que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima de tolerancia a los herbicidas seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste en 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), glifosato acetiltransferasa (GAT), citocromo P450, fosfinotricina acetiltransferasa (PAT), acetohidroxiácido sintasa (AHAS; EC 4.1.3.18, también conocida como acetolactato sintasa o ALS), hidroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD), fitoeno desaturasa (PD) y enzimas degradadoras de dicamba, como se describe en WO 02/068607o las enzimas degradadoras de ácido fenoxiacético y derivados del ácido fenoxipropiónico divulgadas en el documento WO 2008141154 o WO 2005107437.

En general, el término "herbicida" se utiliza en el presente documento para referirse a un ingrediente activo que mata, controla o de otro modo modifica negativamente el crecimiento de las plantas. La cantidad o concentración preferida del herbicida es una "cantidad efectiva" o "concentración efectiva" Por "cantidad efectiva" y "concentración efectiva" se entiende una cantidad y concentración, respectivamente, que sea suficiente para matar o inhibir el crecimiento de una planta, tejido vegetal, célula vegetal o célula huésped similares de tipo salvaje, pero que dicha cantidad no mate o inhiba tan gravemente el crecimiento de las plantas, tejidos vegetales, células vegetales y células huéspedes resistentes a los herbicidas de la presente invención. Típicamente, la cantidad efectiva de un herbicida es una cantidad que se utiliza rutinariamente en los sistemas de producción agrícola para matar las malezas de interés. Dicha cantidad es conocida por los expertos en la técnica. La actividad herbicida es exhibida por el herbicida derivado de la benzoxazinona de la presente invención cuando se aplican directamente a la planta o al locus de la planta en cualquier etapa de crecimiento o antes de la siembra o emergencia. El efecto observado depende de la especie vegetal a controlar, de la fase de crecimiento de la planta, de los parámetros de aplicación de la dilución y del tamaño de la gota de la pulverización, del tamaño de las partículas de los componentes sólidos, de las condiciones ambientales en el momento de la utilización, del compuesto específico empleado, de los adyuvantes y portadores específicos empleados, del tipo de suelo y de otros factores similares, así como de la cantidad de producto químico aplicado. Estos y otros factores pueden ajustarse como es sabido en la técnica para promover la acción herbicida no selectiva o selectiva. En general, se prefiere aplicar el herbicida derivado de la benzoxazinona en postemergencia a la vegetación indeseable relativamente inmadura para lograr el máximo control de las malezas.

Por planta "tolerante a los herbicidas" o "resistente a los herbicidas" se entiende una planta que es tolerante o resistente a al menos un herbicida a un nivel que normalmente mataría o inhibiría el crecimiento de una planta normal o de tipo salvaje. Por "proteína mut-PPO tolerante a los herbicidas" o "proteína mut-PPO resistente a los herbicidas", se entiende que dicha proteína mut-PPO muestra una mayor actividad de PPO, en relación con la actividad de PPO de una proteína mut-PPO de tipo salvaje, cuando está en presencia de al menos un herbicida que se sabe que interfiere con la actividad de PPO y a una concentración o nivel del herbicida que se sabe que inhibe la actividad de PPO de la proteína mut-PPO de tipo salvaje. Además, la actividad de PPO de dicha proteína mut-PPO tolerante o resistente a los herbicidas puede denominarse en el presente documento como actividad de PPO "tolerante a los herbicidas" o "resistente a los herbicidas".

El "herbicida derivado de la benzoxazinona" de la presente invención abarca las benzoxazinonas de fórmula I como se representa en lo siguiente:

en la que

R1 es hidrógeno o halógeno;

R2 es halógeno;

R3 es hidrógeno o halógeno;

R4 es hidrógeno, alquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C6, alquenilo C3-C6, haloalquilo C3-C C3-C6, haloalquinilo C3-C6, alcoxi C1-C6 o cicloalquilo-alquilo C3-C6-C1-C6;

R5 es hidrógeno, NH2, alquilo C1-C6 o alquinilo C3-C6;

R6 es hidrógeno o alquilo C1-C6; y

W es O o S;

Z es O o S.

En otra realización preferida, el "herbicida derivado de la benzoxazinona" de la presente invención abarca las benzoxazinonas de fórmula I como se representa en lo siguiente:

A) al menos una benzoxazinona de la fórmula I

en la que

R1 es hidrógeno o halógeno;

R2 es halógeno;

R3 es hidrógeno o halógeno;

R4 es hidrógeno, alquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C6, alquenilo C3-C6, haloalquilo C3-C6, alquinilo C3-C6, haloalquinilo C3-C6, alcoxi C1-C6 o cicloalquilo-alquilo C3-C6-C1-C6;

R5 es hidrógeno, NH2, alquilo C1-C6 o alquinilo C3-C6;

R6 es hidrógeno o alquilo C1-C6; y

X es O o S;

Y es O o S;

y al menos otro compuesto activo seleccionado entre

B) herbicidas de la clase b1) a b15):

b1) inhibidores de la biosíntesis de lípidos;

b2) inhibidores de la acetolactato sintasa (inhibidores de la ALS);

b3) inhibidores de la fotosíntesis;

b4) Inhibidores de la protoporfirinógeno-IX oxidasa,

b5) herbicidas de blanqueo;

b6) Inhibidores de la enolpiruvil shikimato 3-fosfato sintasa (inhibidores de la EPSP);

b7) inhibidores de la glutamina sintetasa;

b8) Inhibidores de la 7,8-dihidropropteroato sintasa (inhibidores de la DHP);

b9) inhibidores de la mItosa;

b10) Inhibidores de la síntesis de ácidos grasos de cadena muy larga (inhibidores VLCFA); b11) inhibidores de la biosíntesis de la celulosa;

b12) herbicidas desacopladores;

b13) herbicidas con auxinas;

b14) inhibidores del transporte de auxina; y

b15) otros herbicidas seleccionados del grupo que consiste en bromobutida, clorflurenol, clorflurenol-metilo, cinmetilina, cumilurón, dalapón, dazomet, difenzoquat difenzoquat-metilsulfato, dimethipin, DSMA, dymron, endotal y sus sales, etobenzanid, flamprop, flamprop-isopropilo, flamprop-metilo, flamprop-M-isopropilo, flamprop-M-metilo, flurenol, flurenol-butil, flurprimidol, fosamina, fosamina-amonio, indanofan, indaziflam, hidrazida maleica, mefluidida, metam, metil azida, metil bromuro, metil-dimron, metil yoduro, MSMA, ácido oleico, oxaziclomefona, ácido pelargónico, piributicarb, quinoclamina, triaziflam, tridifano y 6-cloro-3-(2-ciclopropil-6-metilfenoxi)-4-piridazinol (CAS 499223-49-3) y sus sales y ésteres;

y

C) los protectores.

Los herbicidas derivados de la benzoxazinona que son útiles para la presente invención también pueden ser composiciones en forma de composiciones de protección de cultivos herbicidas que comprenden una cantidad herbicida eficaz de una combinación de compuestos activos que comprenden al menos una benzoxazinona de fórmula I y al menos otro compuesto seleccionado entre los herbicidas B y los protectores C, como se ha definido anteriormente, y también al menos un portador líquido y/o sólido y/o uno o más tensioactivos y, si se desea, uno o más auxiliares habituales para las composiciones de protección de cultivos.

Además, los herbicidas derivados de la benzoxazinona que son útiles para la presente invención también pueden ser composiciones en forma de una composición de protección de cultivos formulada como una composición de 1 componente que comprende una combinación de compuestos activos que comprende al menos una benzoxazinona de fórmula I y al menos otro compuesto activo seleccionado entre los herbicidas B y los protectores C, y al menos un portador sólido o líquido y/o uno o más tensioactivos y, si se desea, uno o más auxiliares habituales para las composiciones de protección de cultivos.

Además, los herbicidas derivados de la benzoxazinona que son útiles para la presente invención también pueden ser composiciones en forma de una composición de protección de cultivos formulada como una composición de 2 componentes que comprende un primer componente que comprende al menos una benzoxazinona de fórmula I, un portador sólido o líquido y/o uno o más tensioactivos, y un segundo componente que comprende al menos otro compuesto activo seleccionado entre los herbicidas B y los protectores C, un portador sólido o líquido y/o uno o más tensioactivos, donde adicionalmente ambos componentes pueden comprender también otros auxiliares habituales en las composiciones fitosanitarias.

Si las benzoxazinonas de fórmula I descritas en el presente documento son capaces de formar isómeros geométricos, por ejemplo isómeros E/Z, es posible utilizar ambos, los isómeros puros y las mezclas de los mismos, en las composiciones según la invención.

Si las benzoxazinonas de fórmula I descritas en el presente documento tienen uno o más centros de quiralidad y, en consecuencia, están presentes como enantiómeros o diastereómeros, es posible utilizar ambos, los enantiómeros y diastereómeros puros y sus mezclas, en las composiciones según la invención.

Las fracciones orgánicas mencionadas en la definición de las variables R1 a R6 son, al igual que el término halógeno, términos colectivos para la enumeración individual de los miembros del grupo. El término halógeno denota en cada caso flúor, cloro, bromo o yodo. Todas las cadenas de hidrocarburos, es decir, todos los alquilos, pueden ser de cadena recta o ramificada, y el prefijo Cn-Cm denota en cada caso el número posible de átomos de carbono en el grupo.

Ejemplos de estos significados son:

alquilo C1-C4 y también las moléculas alquilo C1-C4 de cicloalquilo-alquilo C3-C6-C1-C4: por ejemplo CH3, C2H5, npropilo, y CH(CH3)2 n-butilo, CH(CH3)-C2H5, CH2-CH(CH3)2 y C(CH3)3;

alquilo C1-C6 y también las moléculas alquilo C1-C6 de alcoxi C1-C6-alquilo C1-C6: alquilo C1-C4 como se mencionó anteriormente, y también, por ejemplo, n-pentilo, 1-metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2,2-dimetilpropilo, 1-etilpropilo, n-hexilo, 1,1-dimetilpropilo , 1,2-dimetilpropilo, 1 -metilpentil, 2-metilpentilo, 3-metilpentil, 4-metilpentilo, 1,1 -dimetilbutilo, 1,2-dimetilbutilo, 1,3-dimetilbutilo, 2,2-dimetilbutilo, 2,3 -dimetilbutilo, 3,3-dimetilbutilo, 1-etilbutilo, 2-etilbutilo, 1,1,2-trimetilpropilo, 1,2,2-trimetilpropilo, 1 -etil-1-metilpropilo o 1 -etil-2-metilpropilo, preferiblemente metilo, etilo, n-propilo, 1 -metiletilo, n-butilo, 1,1 -dimetiletilo, n-pentilo o n-hexilo;

haloalquilo C1-C4: un radical alquilo C1-C4 como el mencionado anteriormente que está parcial o totalmente sustituido por flúor, cloro, bromo y/o yodo, por ejemplo, clorometilo, diclorometilo, triclorometilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, clorofluorometilo, diclorofluorometilo, clorodifluorometilo, bromometilo, yodometilo, 2-fluoroetilo, 2-cloroetilo, 2-bromoetilo, 2-yodoetilo, 2,2-difluoroetilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 2-cloro-2-fluoroetilo, 2-cloro-2,2-difluoroetilo, 2,2-dicloro-2-fluoroetilo, 2,2,2-tricloroetilo, pentafluoroetilo, 2-fluoropropilo, 3-fluoropropilo, 2.2- difluoropropilo, 2,3-difluoropropilo, 2-cloropropilo, 3-cloropropilo, 2,3-dicloropropilo, 2-bromopropilo, 3-bromopropilo, 3,3,3-trifluoropropilo, 3,3,3-tricloropropilo, 2,2,3,3-pentafluoropropilo, heptafluoropropilo, un radical haloalquilo C1-C3 como los mencionados anteriormente, y también, por ejemplo, 1-(fluorometil)-2-fluoroetilo, 1-(clorometil)-2-cloroetilo, 1-(bromometil)-2-bromoetilo, 4-fluorobutilo, 4-clorobutilo, 4-bromobutilo, no-fluorobutilo, 1,1,2,2,-tetrafluoroetilo y 1-trifluorometil-1,2,2,2-tetrafluoroetilo;

haloalquilo C1-C6: haloalquilo C1-C4 como se ha mencionado anteriormente, y también, por ejemplo, 5-fluoropentilo, 5-cloropentilo, 5-bromopentilo, 5-yodopentilo, undecafluoropentilo, 6-fluorohexilo, 6-clorohexilo, 6-bromohexilo, 6-yodohexilo y dodecafluorohexilo;

cicloalquilo C3-C6 y también las fracciones de cicloalquilo de cicloalquilo-alquilo C3-C6-C1-C4: hidrocarburos saturados monocíclicos que tienen de 3 a 6 miembros de anillo, como el ciclopropilo, el ciclobutilo, el ciclopentilo y el ciclohexilo;

alquenilo C3-C6: por ejemplo 1-propenilo, 2-propenilo, 1-metiletenilo, 1 -butenilo, 2-butenilo, 3-butenilo, 1 -metil-1-propenilo, 2-metil-1-propenilo, 1-metil-2-propenilo, 2-metil-2-propenilo, 1-pentenilo 2-pentenilo, 3-pentenilo, 4-pentenilo, 1 -metil-1-butenilo, 2-metil-1-butenilo, 3-metil-1-butenilo, 1-metil-2-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 3-metil-2-butenilo, 1-metil-3-butenilo, 2-metil-3-butenilo, 3-metil-3-butenilo, 1,1 -dimetil-2-propenilo, 1,2-dimetil-1-propenilo, 1.2- dimetil-2-propenilo, 1 -etil-1 -propenilo, 1 -etil-2-propenilo, 1-hexenilo, 2-hexenilo, 3-hexenilo, 4-hexenilo, 5-hexenilo, 1-metil-1-pentenilo, 2-metil-1-pentenilo, 3-metil-1-pentenilo, 4-metil-1-pentenilo, 1-metil-2-pentenilo, 2-metil-2-pentenilo, 3-metil-2-pentenilo, 4-metil-2-pentenilo, 1-metil-3-pentenilo, 2-metil-3-pentenilo, 3-metil-3-pentenilo, 4-metil-3-pentenilo, 1-metil-4-pentenilo, 2-metil-4-pentenilo, 3-metil-4-pentenilo, 4-metil-4-pentenilo, 1,1-metil-2-butenilo, 1,1 -dimetil-3-butenilo, 1,2-dimetil-1-butenilo, 1,2-dimetil-2-butenilo, 1,2-dimetil-3-butenilo, 1.3- dimetil-1 -butenilo, 1,3-dimetil-2-butenilo, 1,3-dimetil-3-butenilo, 2,2-dimetil-3-butenilo, 2,3-dimetil-1 -butenilo, 2.3- dimetil-2-butenilo, 2,3-dimetil-3-butenilo, 3,3-dimetil-1 -butenilo, 3,3-dimetil-2-butenilo, 1 -etil-1-butenilo, 1-etil-2-butenilo, 1 -etil-3-butenilo, 2-etil-1-butenilo, 2-etil-2-butenilo, 2-etil-3-butenilo, 1,1,2-trimetil-2-propenilo, 1 -etil-1 -metil-2-propenilo, 1-etil-2-metil-1-propenilo y 1-etil-2-metil-2-propenilo;

haloalquenilo C3-C6: un radical alquenilo C3-C6 como el mencionado anteriormente que está parcial o totalmente sustituido por flúor, cloro, bromo y/o yodo, por ejemplo 2-cloroprop-2-en-1-ilo, 3-cloroprop-2-en-1-ilo, 2,3-dicloroprop-2-en-1-ilo, 3,3-dicloroprop-2-en-1-ilo, 2,3,3-tricloro-2-en-1-ilo, 2,3-diclorobut-2-en-1-ilo, 2-bromoprop-2-en-1-ilo, 3-bromoprop-2-en-1-ilo, 2,3-dibromoprop-2-en-1-ilo, 3,3-dibromoprop-2-en-1-ilo, 2,3,3-tribromo-2-en-1- ilo o 2,3-dibromobut-2-en-1-ilo;

alquinilo C3-C6: por ejemplo, 1 -propinilo, 2-propinilo, 1 -butinilo, 2-butinilo, 3-butinilo, 1 -metil-2-propinilo, 1 -pentinilo, 2- pentinilo, 3-pentinilo, 4-pentinilo, 1-metil-2- butinilo, 1 -metil-3-butinilo, 2-metil-3-butinilo, 3-metil-1-butinilo, 1,1-dimetil-2-propinilo, 1 -etil-2-propinilo, 1 -hexinilo, 2 - hexinilo, 3-hexinilo, 4-hexinilo, 5-hexinilo, 1 -metil-2-pentinilo, 1-metil-3-pentinilo, 1-metil-4-pentinilo, 2-metil-3-pentinilo, 2-metil- 4-pentinilo, 3-metil-1-pentinilo, 3-metil-4-pentinilo, 4-metil-1-pentinilo, 4-metil-2-pentinilo, 1,1 -dimetil-2-butinilo, 1,1- dimetil-3-butinilo, 1,2-dimetil-3-butinilo, 2,2-dimetil-3-butinilo, 3,3-dimetil-1-butinilo, 1 -etil-2-butinilo, 1 -etil-3- butinilo, 2-etil-3-butinilo y 1-etil-1-metil-2-propinilo;

haloalquinilo C3-C6: un radical alquinilo C3-C6 como el mencionado anteriormente que está parcial o totalmente sustituido por flúor, cloro, bromo y/o yodo, por ejemplo 1,1 -difluoroprop-2-in-1-ilo, 3-cloroprop-2-in-1-ilo, 3-bromoprop-2-in-1-ilo, 3-yodoprop-2-in-1-ilo, 4-fluorobut-2-in-1-ilo, 4-clorobut-2-in-1-ilo, 1,1-difluorobut-2-in-1-ilo, 4-yodobut-3-in-1-ilo, 5-fluoropent-3-in-1-ilo, 5-yodopent-4-in-1-ilo, 6-fluorohex-4-in-1-ilo o 6-yodohex-5-in-1-ilo;

alcoxi C1-C4 y también las fracciones alcoxi C1-C4 de hidroxicarbonilo-alcoxi C1-C4, alcoxicarbonilo C1-C6 alcoxi C1-C4: por ejemplo, metoxi, etoxi, propoxi, 1-metiletoxi-butoxi, 1-metilpropoxi, 2-metilpropoxi y 1,1-dimetiletoxi; alcoxi Ci-C6 y también las fracciones alcoxi Ci-C6 de alcoxicarbonilo Ci-C6alcoxi Ci-C4: alcoxi Ci-C4 como se ha mencionado anteriormente, y también, por ejemplo, pentoxi, i-metilbutoxi, 2-metilbutoxi, 3-metilbutoxi, 1,1-dimetilpropoxi, 1,2-dimetilpropoxi, 2,2-dimetilpropoxi, 1-etilpropoxi, hexoxi, 1-metilpentoxi, 2-metilpentoxi, 3-metilpentoxi, 4-metilpentoxi, 1,1-dimetilbutoxi, 1,2-dimetilbutoxi, 1,3-dimetilbutoxi, 2,2-dimetilbutoxi, 2,3-dimetilbutoxi, 3,3-dimetilbutoxi, 1 -etilbutoxi, 2-etilbutoxi, 1,1,2-trimetilpropoxi, 1,2,2-trimetilpropoxi, 1 -etil-1 -metilpropoxi y 1 -etil-2 -metilpropoxi.

Según una realización preferida de la invención, también se da preferencia a aquellos derivados de benzoxazinona de fórmula I, en los que las variables, independientemente unas de otras o en combinación con otras, tienen los siguientes significados:

R1 es hidrógeno; también es preferentemente halógeno, particularmente preferido F o Cl, especialmente preferido F;

R2 F

R3 es hidrógeno o F, preferentemente hidrógeno; también es preferentemente F;

R4 es alquinilo C3-C6 o halolinilo C3-C6, preferentemente alquinilo C3 o halolinilo C3, particularmente preferido CH2C = CH, CH2C = CCl o CH2C = CBr; es también preferentemente alquinilo C3-C6 o cicloalquilo-alquilo C3-C6-C1-C6, particularmente preferido propargilo o ciclopropilmetilo; es también preferentemente alquinilo C3-C6, preferentemente alquinilo C3; particularmente preferido Ch2C = CH; es también preferentemente halolquinilo C³-C6, preferentemente halolquinilo C3, particularmente preferido CH2C = CCI o CH2C = CBr;

R5 es NH2, alquilo C1-C6 o alquilo C3-C6; preferentemente alquilo C1-C6; más preferentemente alquilo C1-C4; más preferentemente cH3;

R6 es alquilo C1-C6; preferentemente alquilo C1-C4; más preferentemente CH3;

W es O, también es preferentemente S;

Z es O, también es preferentemente S.

Se da especial preferencia a las benzoxazinonas de la fórmula I.a (corresponde a la fórmula I en la que R2 es F, R5 y R6 son CH3, W es O y Z es S),

en la que las variables R1, R3 y R4 tienen los significados, en particular los preferidos, definidos anteriormente.

Se prefieren los derivados de benzoxazinona de las fórmulas I.a.1 a I.a.48 de la Tabla A que se enumeran a continuación, en los que las variables R1, R3 y R4 tienen conjuntamente los significados indicados en una fila de la Tabla A (benzoxazinonas I.a.1 a I.a.54); y en los que las definiciones de las variables R1, R2 , R3 y R4 son de especial importancia para los compuestos según la invención no sólo en combinación con otros, sino en cada caso también por separado.

Tabla A

continuación

continuación

Una benzoxazinona especialmente preferida de la fórmula I que, como componente A, forma parte de la composición según la invención, es la benzoxazinona de fórmula I.a.35 tal como se ha definido anteriormente

Según una realización preferida particular de la invención, la composición útil para el procedimiento de la presente invención contiene como componente A la benzoxazinona de fórmula I.a.35

Los derivados de benzoxazinona descritos anteriormente y las composiciones se divulgan en detalle en la Solicitud de patente europea 09163242.2en particular, las divulgaciones en las páginas 1 a 7 que se refieren a los derivados de bezoxazinona y sus posibles sustitutos

Los derivados de la benzoxazinona de la presente invención suelen aplicarse mejor junto con uno o más herbicidas para obtener el control de una mayor variedad de vegetación indeseable. Cuando se utilizan junto con otros herbicidas de focalización, los compuestos actualmente reivindicados pueden formularse con el otro herbicida o herbicidas, mezclarse en tanque con el otro herbicida o herbicidas, o aplicarse secuencialmente con el otro herbicida o herbicidas.

Los compuestos herbicidas de la presente invención pueden utilizarse además junto con herbicidas adicionales a los que la planta de cultivo es naturalmente tolerante, o a los que es resistente a través de la expresión de uno o más transgenes adicionales como se ha mencionado anteriormente. Algunos de los herbicidas que pueden emplearse junto con los compuestos de la presente invención incluyen sulfonamidas como metosulam, flumetsulam, cloransulammetilo, diclosulam, penoxsulam y florasulam, sulfonilureas como clorimurón, tribenurón, sulfometurón, nicosulfurón, clorsulfurón, amidosulfurón, triasulfurón, prosulfurón, tritosulfurón, tifensulfurón, sulfosulfurón y metsulfurón, imidazolinonas como imazaquín, imazápico, ima-zetapir, imzapir, imazametabenz e imazamox, ácidos fenoxialcanoicos como 2,4-D, McPA, diclorprop y mecoprop, ácidos piridiniloxiacéticos como triclopir y fluroxipir, ácidos carboxílicos como clopiralid, picloram aminopiralid y dicamba, dinitroanilinas como trifluralina, benefin, benfluralina y pendimetalina, cloroacetanilidas como alacloro, acetocloro y metolacloro, semicarbazonas (inhibidores del transporte de auxinas) como clorofurenol y diflufenzopir, arilofenoxipropionatos como fluazifop, haloxifop, diclofop, clodinafop y fenoxaprop y otros herbicidas comunes como el glifosato, el glufosinato, el acifluorfen, el bentazon, la clomazona, el fumiclorac, el fluometuron, el fomesafen, el lactofen, el linuron, isoproturón, simazina, norflurazón, paraquat, diurón, diflufenicán, picolinafén, cinidón, setoxidim, tralkoxidim, quinmerac, isoxaben, bromoxinil, metribuzin y mesotriona.

Por ejemplo, los herbicidas derivados de la benzoxazinona que son útiles para llevar a cabo la presente invención pueden utilizarse junto con el glifosato y el glufosinato en cultivos tolerantes al glifosato o al glufosinato.

A menos que ya estén incluidos en la divulgación anterior, los herbicidas derivados de la benzoxazinona que son útiles para llevara cabo la presente invención pueden, además, utilizarse junto con compuestos:

b1) del grupo de los inhibidores de la biosíntesis lipídica:

Herbicidas ACC como aloxidim, aloxidim-sodio, butroxidim, cletodim, clodinafop, clodinafop-propargilo, cicloxidim, cihalofop, cihalofop-butilo, diclofop, diclofop-metilo, fenoxaprop, fenoxaprop-etilo fenoxaprop-P, fenoxaprop-P-etilo, fluazifop, fluazifop-butilo, fluazifop-P, fluazifop-P-butilo, haloxifop, haloxifop-metilo, haloxifop-P, haloxifop-P-metilo, metamifop, pinoxaden, profoxidim, propaquizafop, quizalofop, quizalofopetilo, quizalofop-tefurilo, quizalofop-P, quizalofop-P-etilo, quizalofop-P-tefurilo, setoxidim, tepraloxidim y tralkoxidim, y herbicidas no ACC como el benfuresato, butilato, cicloato, dalapón, dimepiperato, EPTC, esprocarb, etofumesato, flupropanato, molinato, orbencarb, pebulado, prosulfocarb, TCA, tiobencarb, tiocarbazil, trialato y vernolato;

b2) del grupo de los inhibidores de la ALS:

Sulfonilureas como amidosulfurón, azimsulfurón, bensulfurón, bensulfurón-metilo, clorimurón, clorimurónetilo, clorsulfurón, cinosulfurón, ciclosulfamurón, etametsulfurón, etametsulfurón-metilo, etoxisulfurón, flazasulfurón, flucetosulfurón, flupirsulfurón, flupirsulfurón-metilo-sodio, foramsulfurón, halosulfurón, halosulfurón-metilo, imazosulfurón, yodosulfurón, yodosulfurón-metilo-sodio, mesosulfurón, metazosulfurón, metsulfurón, metsulfurón-metilo, nicosulfurón, ortosulfamurón, oxasulfurón, primisulfurón, primisulfurónmetilo, propirisulfurón, prosulfurón, pirazosulfurón, pirazosulfurón-etilo, rimsulfurón, sulfometurón, sulfometurón-metilo, sulfosulfurón, tifensulfurón, tifensulfurón-metilo, triasulfurón, tribenurón, tribenurónmetilo, trifloxisulfurón, triflusulfurón, triflusulfurón-metilo y tritosulfurón, imidazolinonas como imazametabenz, imazamethabenzmetilo, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin e imazetapir, herbicidas de triazolopirimidina y sulfonanilidas como cloransulam, cloransulam-metil, diclosulam, flumetsulam, florasulam, metosulam, penoxsulam, pirimisulfán y piroxsulam, pirimidinilbenzoatos como bispiribac, bispiribac-sodio, piribenzoxim, piriftalid, piriminobac, piriminobac-metilo, piritiobac, piritiobac-sodio, éster de 4-[[2-[(4,6-dimetoxi-2-pirimidinil)oxi]fenil]amino]-benzoico (CAS 420138-41-6), éster de propilo del ácido 4-[[2-[(4,6-dimetoxi-2-pirimidinil)oxi]fenil]metil]amino]-benzoico (CAS 420138-40-5), N-(4-bromofenil)-2-[(4,6-dimetoxi-2-pirimidinil)oxi]bencenoetanamina (CAS 420138-01-8) y los herbicidas de sulfonilaminocarbonilo-triazolinona como flucarbazona, flucarbazona-sodio, propoxicarbazón, propoxicarbazón-sodio, tiencarbazona y tiencarbazona-metilo. Entre ellas, una realización preferida de la invención se refiere a aquellas composiciones que comprenden al menos un herbicida de imidazolinona;

b3) del grupo de los inhibidores de la fotosíntesis: amicarbazona, inhibidores del fotosistema II, por ejemplo herbicidas de triazina, incluidos los de clorotriazina, triazinonas, triazindionas, metiltiotriazinas y piridazinonas, como ametrina, atrazina, cloridazona, cianacina, desmetrina, dimetametrina, hexazinona, metribuzina, prometona, prometrina, propazina, simazina simetría, terbumetón, terbutilazina, terbutrina y trietazina, aril urea como clorobromurón, clorotolurón, cloroxurón, dimefurón, diurón, fluometurón, isoproturón, isourón, linurón, metamitrón, metabenztiazurón, metobenzurón, metoxurón, monolinurón, neburón, sidurón, tebutiurón y tiadiazurón, carbamatos de fenilo como desmedifam, karbutilat, fenmedifam, fenmedifam-etilo, herbicidas de nitrilo como bromofenoxim, bromoxinil y sus sales y ésteres, ioxinil y sus sales y ésteres uracilos como el bromacil, el lenacil y el terbacil, y el bentazon y el bentazon-sodio, el piridatre, el piridafol, el pentanochlor y el propanil y los inhibidores del fotosistema I como el dicuat, el dicuat-dibromuro, el paraquat, el paraquat-dicloruro y el paraquat-dimetilsulfato. Entre ellos, una realización preferida de la invención se refiere a aquellas composiciones que comprenden al menos un herbicida de aril urea. Entre estos, igualmente una realización preferida de la invención se relaciona con aquellas composiciones que comprenden al menos un herbicida de triazina. Entre estos, igualmente una realización preferida de la invención se relaciona con aquellas composiciones que comprenden al menos un herbicida de nitrilo;

b4) del grupo de los inhibidores de la protoporfirinógeno-IX oxidasa acifluorfen, acifluorfen-sodio, azafenidin, bencarbazona, benzfendizona, bifenox, butafenacil, carfentrazona, carfentrazone-ethilo, clometoxifen, cinidon-etil, fluazolato, flufenpir, flufenpir-etilo, flumiclorac, flumiclorac-pentilo, flumioxazin, fluoroglicofen, fluoroglicofen-etilo, fluthiacet, fluthiacet-metilo, fomesafen, halosafen, lactofen, oxadiargilo, oxadiazon, oxifluorfen, pentoxazona, profluazol, pyraclonil, pyraflufen, pyraflufen-ethilo, saflufenacil, sulfentrazona, tidiazimina, [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1-metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidina-3-il)fenoxi]-2-piridiloxi]acetato de etilo (CAS 353292-31-6; S-3100), N-etil-3-(2,6-dicloro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metil-1H-pirazol-1-carboxamida (CAS 452098-92-9), N-tetrahidrofurfurilo-3-(2,6-dicloro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metil-1H-pirazol-1-carboxamida (CAS 915396-43-9), N-etil-3-(2-cloro-6-fluoro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metil-1H-pirazol-1-carboxamida (CAS 452099-05-7), N-tetrahidrofurfurilo-3-(2-cloro-6-fluoro-4-trifluorometilfenoxi)-5-metil-1H-pirazol-1-carboxamida (CAS 45100-03-7) and 3-[7-fluoro-3-oxo-4-(prop-2-inil)-3,4-dihidro-2H-benzo[1,4]oxazin-6-il]-1,5-dimetil-6-tioxo-[1,3,5]triazinan-2,4-diona;

b5) del grupo de los herbicidas blanqueadores:

Inhibidores de la PDS: beflubutamida, diflufenicán, fluridona, flurocloridona, flurtamona, norflurazón, picolinafeno y 4-(3-trifluorometilfenoxi)-2-(4-trifluorometilfenil)pirimidina (CAS 180608-33-7), inhibidores de la HPPD: benzobiciclón, benzofenap, isoxaflutol, mesotriona, pirasulfotol, pirazolinato, pirazoxifeno, sulcotriona, tefuriltrona, tembotriona, topramezona y biciclopirona, blanqueador, objetivo desconocido: aclonifeno, amitrole, clomazona y flumeturón;

b6) del grupo de los inhibidores de la EPSP sintasa: glifosato, glifosato-isopropilamonio y glifosato-trimesio (sulfosato);

b7) del grupo de los inhibidores de la glutamina sintasa: bilanafos (bialafos), bilanafos-sodio, glufosinato, glufosinato-P y glufosinato-amonio;

b8) del grupo de los inhibidores de la DHP sintasa: asulam;

b9) del grupo de los inhibidores de la mitosa: compuestos del grupo K1 dinitroanilinas como la benfluralina, la butralina, la dinitramina, la etalfluralina, la flucloralina, la oricalina, la pendimetalina, la prodiamina y la trifluralina, fosforamidatos como el amiprofós amiprofós-metilo y butamifós, herbicidas de ácido benzoico como clortal, clortal-dimetilo, piridinas como ditiopir y tiazopir, benzamidas como propizamida y tebutam; compuestos del grupo K2 : clorprofam, profam y carbetamida; entre ellos, se prefieren los compuestos del grupo K1, en particular las dinitroanilinas;

b10) del grupo de los inhibidores de los VLCFA:

cloroacetamidas como el acetocloro, el alacloro, el butacloro, el dimetacloro, la dimetenamida, la dimetenamida-P, el metazacloro, el metolacloro, el metolacloro-S, la petoxamida, el pretilacloro, el propacloro, el propisocloro y el tenilcloro, las oxiacetanilidas como el flufenacet y el mefenacet, las acetanilidas como la difenamida, la naproanilida y la napropamida, las tetrazolinonas como la fentrazamida, y otros herbicidas como el anilofos, el cafenstrole, la fenoxasulfona, la ipfencarbazona, el piperofos, la piroxasulfona y

compuestos de isoxazolina de la fórmula II,

donde R7, R8, R9, R10, W, Z y n tienen los siguientes significados:

R7 es R8 o R9. independientemente uno del otro, hidrógeno, halógeno o alquilo C1-C4;

X oxígeno o NH;

Y fenilo o heterociclilo monocíclico de 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10 miembros que contiene, además de los miembros del anillo de carbono, uno, dos o tres heteroátomos iguales o diferentes seleccionados entre oxígeno, nitrógeno y azufre como miembros del anillo, en los que el fenilo y el heterociclilo no están sustituidos o llevan 1,2 o 3 sustituyentes Ryy seleccionados entre halógeno, alquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, haloalquilo C1-C4 y haloalcoxi C1-C4 preferentemente fenilo o heterociclilo aromático de 5 o 6 miembros (heterociclilo) que contiene, además de los miembros del anillo de carbono, uno, dos o tres átomos de nitrógeno como miembros del anillo, en los que el fenilo y el heterociclilo no están sustituidos o llevan 1, 2 o 3 sustituyentes Ryy; y

n cero o uno;

entre los compuestos de isoxazolina de la fórmula II, se da preferencia a los compuestos de isoxazolina de la fórmula II, en los que

R7 es R8 o R9 de forma independiente son H, F, Cl o metilo;

X es el oxígeno;

n n es 0 o 1, y

Y es fenilo, pirazolilo o 1,2,3-triazolilo, donde los tres últimos radicales mencionados no están sustituidos o llevan uno, dos o tres sustituyentes Ryy, especialmente uno de los siguientes radicales

en la que

R11 es halógeno, alquilo Ci-C4 o haloalquilo Ci-C4;

R12 es alquilo C1-C4;

R13 es halógeno, alcoxi Ci-C4 o haloalcoxi Ci-C4;

R14 es halógeno, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4 o haloalcoxi C1-C4;

m es 0, 1, 2 o 3; y

# denota el punto de unión al grupo CR13R14;

entre los compuestos de isoxazolina de la fórmula II, se da especial preferencia a los compuestos de isoxazolina de la fórmula II, en los que

R7 es el hidrógeno;

R8 es el flúor;

R9 es hidrógeno o flúor;

R10 es hidrógeno o flúor;

X es el oxígeno;

Y es uno de los radicales de las fórmulas Y1, Y2, Y3 o Y4

donde # denota el punto de unión al grupo CR9R10;

n es cero o 1, en particular 1; y

entre ellos, son especialmente preferidos los compuestos de isoxazolina de las fórmulas II.1, II.2, II.3, II.4, II.5, II.6, II.7, II.8 y II.9

los compuestos de isoxazolina de la fórmula II son conocidos en la técnica, por ejemplo, a partir de WO 2006/024820, WO 2006/037945, WO 2007/071900 y WO 2007/096576;

entre los inhibidores de los VLCFA, se da preferencia a las cloroacetamidas y a las oxiacetamidas, especialmente a la piroxasulfona;

b11) del grupo de los inhibidores de la biosíntesis de la celulosa: clortiamida, diclobenil, flupoxam, isoxaben,

1-Ciclohexil-5-pentafluorfeniloxi-14-[1,2,4,6]tiatriazin-3-ilamina y compuestos de piperazina de fórmula III,

en el que

A es fenilo o piridilo donde Ra está unido en la posición orto al punto de unión de A a un átomo de carbono;

Ra es CN, NO2, alquilo C1-C4, D-cicloalquilo C3-C6, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, haloalquilo C1-C4, O-D-cicloalquilo C3-C6, S(O)qRy, alquenilo C2-C6, D-cicloalquenilo C3-C6, alquilo C3-C6xi, alquinilo C2-C6, alquilo C3-C NRARB, tri-alquilsililo C1-C4, D-C(=O)-Ra1, D-P(=O)(Ra1)2, fenilo, naftilo, un monocíclico de 3 a 7 miembros o un bicíclico

de 9 o 10 miembros saturado insaturado o aromático unido mediante carbono o nitrógeno, que contiene 1, 2, 3 o 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, y que puede estar parcial o totalmente sustituido por los grupos Raa y/o Ra1, y, si Ra está unido a un átomo de carbono, adicionalmente halógeno; Ry es alquilo C1-C6, alquenilo C3-C4, alquinilo C3-C4, NRARB o haloalquilo C1-C4 y q es 0, 1 o 2; RA, RB independientemente uno del otro

son hidrógeno, alquilo C1-C6, alquenilo C3-C6 y alquinilo C3-C6; junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos,

RA, RB pueden formar también un anillo saturado, parcial o totalmente insaturado de cinco o seis miembros que, además de átomos de carbono, puede contener 1,2 o 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N

y S, cuyo anillo puede estar sustituido por 1 a 3 grupos Raa; D es un enlace covalente, C1-C4-alquileno, alquenilo C2-C6 o alquinilo C2-C6; Ra1 es hidrógeno, OH, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, alquenilo C2-C8, cicloalquenilo C5-C6, alquinilo C2-C8, alcoxi C1-C6, haloalcoxi C1-C4, alquiloxi C3-C8, alquinilo C3-C8, NRARB, alco C6-amino, alquilsulfonilamino C1-C6, alquilaminosulfonilamino C1-C6, [di-(C1-C6)alquilamino]sulfonilamino, alquenilamino C3-C6, alquilamino C3-C6, N-(alquenilo C2-C6)-N-(alquilo C1-C6)amino, N-(alquinilo C2-C6)-N-(alquilo C1-C6)amino, N-(alcoxi C1-C6)-N-(alquilo C1-C6)amino, N-(alquenilo C2-C6)-N-(alcoxi C1-C6)amino, N-(C2-C6-alquinil)-N-(C1-C6-alcoxi)-amino, C1-C6-alquilsulfonilo, tri-alquilsililo C1-C4, fenilo, fenoxi, fenilamino o un heterociclo monocíclico

de 5 o 6 miembros o bicíclico de 9 o 10 miembros que contenga 1, 2, 3 o 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, donde los grupos cíclicos están sin sustituir o sustituidos por 1, 2, 3 o 4 grupos Raa; Raa es halógeno, OH, CN, NO2, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, haloalcoxi C1-C4, S(O)qRy, D-C( alquilsililo C1-C4;

B independientemente uno del otro son hidrógeno, CN, NO2, halógeno, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alquenilo C2-C4, alquilo C3-C6, haloalquilo C1-C4, bencilo o S(O)qRy, Rb junto con el grupo Ra o Rb anillo adyacente también puede formar un anillo saturado o parcial o totalmente insaturado de cinco o seis miembros que, además de átomos de carbono, puede contener 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en

O, N y S, cuyo anillo puede estar parcial o totalmente sub-sustituido por Raa;

p m es 0, 1, 2, 3, 4 o 3,

R15 es hidrógeno, OH, CN, alquilo C1-C12, alquenilo C3-C12, alquinilo C3-C12, alcoxi C1-C4, cicloalquilo C3-C6, cicloalquenilo C⁵-C⁶, NRARB, S(O)nRy, S(O)nNRARB, C(=O)R15, CONR^aR^b, fenilo o un heterociclo aromático monocíclico

de 5 o 6 miembros o bicíclico de 9 o 10 miembros que contiene 1, 2, 3 o 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, donde los grupos cíclicos están unidos a través de D1 y están sin sustituir o sustituidos por 1,2,

3 o 4 grupos Raa, y también los siguientes grupos parcial o totalmente sustituidos porRaa: alquilo C1-C4, alquenilo C3-C4, alquinilo C3-C4, alcoxi C1-C4, cicloalquilo C3-C6, cicloalquenilo C5-C6, NRARB, S(O)nRy, S(O)nNRARB, CONRARB; preferentemente es hidrógeno, OH, CN, alquilo C1-C12, alquenilo C3-C12, alquinilo C3-C12, alcoxi C1-C4, cicloalquilo C3-C6, cicloalquenilo C5-C6, NRARB, S(O)nRy, S(O)nNRARB, C(=O)R25, CONRARB, fenilo o un heterociclo aromático monocíclico de 5 o 6 miembros o bicíclico de 9 o 10 miembros que contiene 1,2, 3 o 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, donde los grupos cíclicos están unidos a través de D1 y están sin sustituir o sustituidos por 1, 2, 3 o 4 grupos Raa, y también los siguientes grupos parcial o totalmente sustituidos por

Raa alquilo C1-C4, alquenilo C3-C4 y alquinilo C3-C4; R25 es hidrógeno, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C4 o haloalcoxi C1-C4; D1 es carbonilo o un grupo D; donde en los grupos R15, Ra y sus sub-sustituyentes las cadenas de carbono y/o los grupos cíclicos pueden llevar 1, 2, 3 o 4 sustituyentes Raa y/o Ra1;

R16 es alquilo C1-C4, alquenilo C3-C4 o alquinilo C3-C4;

R17 es OH, NH2, alquilo C1-C4, cicloalquilo C1-C43-C6 , alquenilo C3-C6, alquinilo C3-C6, hidroxialquilo C1-C4, cianoalquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C4-alquilo C1-C4 o C(=O)R25;

R18 es hidrógeno, halógeno, alquilo C1-C4 o haloalquilo C1-C4, o R18 y R19 juntos son un enlace covalente;

R19 es R20 o R21. independientemente uno del otro son hidrógeno, halógeno, OH, CN, NO2, alquilo C1-C4, haloalquilo

C1-C4, alquenilo C2-C6, alquilo C2-C6, alcoxi C1-C4, haloalquilo C1-C4, cicloalquilo C1-C43-C6 , cicloalquenilo C3-C6 y cicloalquilo C1-C43-C6;

R23, R24 independientemente uno del otro son hidrógeno, halógeno, OH, haloalquilo, NRARB, NRAC(O)R26, CN, NO2, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alquenilo C2-C4, alquinilo C3-C6, haloalquilo C1-C4, O-C(O)R26, fenoxi o benciloxi, donde en los grupos R23 y R24 las cadenas de carbono y/o los grupos cíclicos pueden llevar 1, 2, 3 o 4 sustituyentes

Raa;

R26 es alquilo C1-C4 o NRARB;

entre los compuestos de isoxazolina de los compuestos de piperazina de fórmula III, se da preferencia a los compuestos de piperazina de fórmula III, en los que

Ra es CN, NO2, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C4, haloalcoxi C1-C4 o D-C(=O)-Ra1; Ry es alquilo C1-C41-C6 , alquenilo C3-C4, NRARB o haloalquilo C1-C4 y q es 0, 1 o 2; RA, RB son, independientemente, hidrógeno, alquilo

C1-C6, alquenilo C3-C6 y alquinilo C3-C6; junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, RA, RB también pueden formar un anillo saturado, parcial o totalmente insaturado de cinco o seis miembros que, además de átomos de carbono, puede contener 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, cuyo anillo puede estar sustituido por 1 a 3 grupos Raa; D es un enlace covalente o C1-C4-alquileno; Ra1 es hidrógeno, OH, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6; Raa es halógeno, OH, CN, NO2, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alcoxi haloalquilo C1-C4, S(O)qRy, D-C(=O)-Ra1 y tri-alquilsililo C1-C4;

Rb independientemente uno del otro es CN, NO2, halógeno, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alquenilo C2-C4, alcoxi C3-C6, haloalcoxi C1-C4, bencilo o S(O)qRy, Rb junto con el grupo Ra o Rb unido al átomo del anillo adyacente también puede formar un anillo saturado o parcial o totalmente insaturado de cinco o seis miembros que, además de átomos de carbono, puede contener 1, 2 ó 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, cuyo anillo puede estar parcial o totalmente sustituido por Raa;

p m es 0 o 1.

R15 es hidrógeno, alquilo C1-C12, alquenilo C3-C12, alquinilo C3-C12, alcoxi C1-C4 o C(=O)R25, que puede estar parcial o totalmente sustituido p o rgmpos Raa; preferentemente es hidrógeno, alquilo C1-C12, alquenilo C3-C12, alquinilo

C3-C12, alcoxi C1-C4 o C(=O)R25;

R25 es hidrógeno, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, alcoxi C1-C4 o haloalcoxi C1-C4; donde en los grupos R15 , Ra y sus sub-sustituyentes las cadenas de carbono y/o los grupos cíclicos pueden llevar 1, 2, 3 o 4 sustituyentes Raa y/o

Ra1;

R16 es alquilo C1-C4;

R17 es OH, NH2, alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, haloalquilo C1-C4 o C(=O)R25;

R18 es hidrógeno, o R18 y R19 juntos son un enlace covalente;

R19 es R20 o R21. de forma independiente son el hidrógeno;

R23, R24 independientemente uno del otro son hidrógeno, halógeno u OH;

b12) del grupo de los herbicidas desacopladores: dinoseb, dinoterb y DNOC y sus sales;

b13) del grupo de los herbicidas con auxinas:

2,4-D y sus sales y ésteres, 2,4-DB y sus sales y ésteres, aminopiralida y sus sales, como aminopiralidatris(2-hidroxipropil)amonio y sus ésteres, benazolina, benazolina-etilo, cloramben y sus sales y ésteres, clomeprop, clopiralida y sus sales y ésteres, dicamba y sus sales y ésteres, diclorprop y sus sales y ésteres, diclorprop-P y sus sales y ésteres, fluroxipir, fluroxipir-butometilo, fluroxipir-metilo, MCPA y sus sales y ésteres, MCPA-tioetilo, MCPB y sus sales y ésteres, mecoprop y sus sales y ésteres, mecoprop-P y sus sales y ésteres, picloram y sus sales y ésteres, quinclorac, quinmerac, TBA (2,3,6) y sus sales y ésteres, triclopir y sus sales y ésteres, y aminociclopiracloro y sus sales y ésteres;

b14) del grupo de los inhibidores del transporte de auxinas: diflufenzopyr, diflufenzopyr-sodio, naptalam y naptalam-sodio;

b15) del grupo de los otros herbicidas bromobutida, clorflurenol, clorflurenol-metilo, cinmetilina, cumilurón, dalapón, dazomet, difenzoquat, difenzoquat-metilsulfato, dimethipina, DSMA, dymron, endotal y sus sales, etobenzanida, flamprop, flamprop-isopropilo, flamprop-metilo, flamprop-M-isopropilo, flamprop-M-metilo, flurenol, flurenol-butil, flurprimidol, fosamina, fosamina-amonio, indanofan, indaziflam, hidrazida maleica, mefluidida, metam, azida de metilo, bromuro de metilo, metil-dimron, yoduro de metilo, MSMA, ácido oleico, oxaziclomefona, ácido pelargónico, piributicarb, quinoclamina, triaziflam, tridifano y 6-cloro-3-(2-ciclopropil-6-metilfenoxi)-4-piridazinol (CAS 499223-49-3) y sus sales y ésteres.

Además, puede ser útil aplicar las benzoxazinonas de la fórmula I en combinación con los protectores. Los protectores son compuestos químicos que evitan o reducen los daños en las plantas útiles sin tener un impacto importante en la acción herbicida de las benzoxazinonas de la fórmula I hacia las plantas no deseadas. Pueden aplicarse antes de la siembra (por ejemplo, en tratamientos de semillas, brotes o plántulas) o en la aplicación de preemergencia o postemergencia de la planta útil.

Además, los protectores C, las benzoxazinonas I y/o los herbicidas B pueden aplicarse simultáneamente o en sucesión.

Los protectores adecuados son, por ejemplo ácidos (quinolin-8-oxi)acéticos, ácidos 1-fenil-5-haloalquil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxílicos, ácidos 1-fenil-4,5-dihidro-5-alquil-1H-pirazol-3,5-dicarboxílicos, ácidos 45-dihidro-5,5-diarilo-3-isoxazol carboxílico, dicloroacetamidas, alfa-oximinofenilacetonitrilos, acetofenonoximas, 4,6-dihalo-2-fenilpirimidinas, N-[[4-(aminocarbonil)fenil]sulfonil]-2-amidas benzoicas, anhídrido 1,8-naftálico, ácidos 2-halo-4-(haloalquil)-5-tiazol carboxílicos, fosfortiolatos y N-alquil-O-fenil-carbamatos y sus sales aceptables desde el punto de vista agrícola y sus derivados aceptables desde el punto de vista agrícola, como amidas, ésteres y tioésteres, siempre que tengan un grupo ácido.

Ejemplos de protectores C preferidos son benoxacor, cloquintocet, cimetrinil, ciprosulfamida, diclormid, diciclonon, dietolato, fenclorazol, fenclorim, flurazol, fluxofenim, furilazol, isoxadifen, mefenpyr, mefenato, anhídrido naftálico, oxabetrinil, 4-(dicloroacetil)-1-oxa-4-azaespiro[4.5]decano (MON4660, CAS 71526-07-3) y 2,2,5-trimetil-3-(dicloroacetil)-1,3-oxazolidina (R-29148, CAS 52836-31-4), y N-(2-metoxibenzoil)-4-[(metilaminocarbonil)amino] bencenosulfonamida (CAS 129531-12-0).

Los protectores C especialmente preferidos son el benoxacor, el cloquintocet, la ciprosulfamida, el diclormid, fenclorazol, el fenclorim, el flurazol, el fluxofenim, el furilazol, el isoxadifen, el mefenpyr, el anhídrido naftálico, el oxabetrinil, el 4-(dicloroacetil)-1-oxa-4-azaespiro[4.5]decano (MON4660, CAS 71526-07-3) y 2,2,5-trimetil-3-(dicloroacetil)-1,3-oxazolidina (R-29148, Ca s 52836-31-4), y N-(2-metoxibenzoil)-4-[(metilaminocarbonil)amino]bencenosulfonamida (CAS 129531-12-0).

Los protectores C particularmente preferidos son benoxacor, cloquintocet, ciprosulfamida, diclormid, fenclorazol, fenclorim, furilazol, isoxadifen, mefenpyr, 4-(dicloroacetil)-1-oxa-4-azaespiro[4.5]decano (MON4660, CAS 71526-07 3) y 2,2,5-trimetil-3-(dicloroacetil)-1,3-oxazolidina (R-29148, CAS 52836-31-4), y N-(2-metoxibenzoil)-4-[(metilaminocarbonil)amino]bencenosulfonamida (CAS 129531-12-0).

Los protectores C particularmente preferidos, que, como componente C, son constituyentes de la composición según la invención, son los protectores C definidos anteriormente; en particular, los protectores C.1 - C.13 enumerados a continuación en la tabla C:

Tabla C

continuación

Los compuestos activos B de los grupos b1) a b15) y los compuestos activos C son herbicidas y protectores conocidos, véase, por ejemplo El Compendio de Nombres Comunes de Plaguicidas (http://www.alanwood.net/pesticides/); Farm Chemicals Handbook 2000 volumen 86, Meister Publishing Company, 2000; B. Hock, C. Fedtke, R. R. Schmidt, Herbizide [Herbicidas], Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1995 W. H. Ahrens, Herbicide Handbook, 7a edición, Weed Science Society of America, 1994y K. K. Hatzios, Herbicide Handbook, Supplement forthe 7th edition, Weed Science Society of America, 1998. 2,2,5-Trimetil-3-(dicloroacetil)-1,3-oxazolidina [N° CAS 52836-31-4] también se denomina R-29l48. 4-(dicloroacetil)-1-oxa-4-azaespiro[4.5]decano [N° CAS 71526-07-3] también se denomina AD-67 y MON 4660. Otros compuestos herbicidas activos se conocen en WO 96/26202, WO 97/41116, WO 97/41117, WO 97/41118 y WO 01/83459 y también de W. Kramer et al. (ed.) "Modern Crop Protection Compounds", Vol. 1, Wiley VCH, 2007 y la bibliografía citada en el mismo.

Generalmente se prefiere utilizar los compuestos de la invención en combinación con herbicidas que son selectivos para el cultivo que se está tratando y que complementan el espectro de malezas controladas por estos compuestos a la tasa de aplicación empleada. Además, generalmente se prefiere aplicar los compuestos de la invención y otros herbicidas complementarios al mismo tiempo, ya sea como una formulación combinada o como una mezcla en tanque.

El término "ácido nucleico mut-PPO" se refiere a un ácido nucleico de PPO que tiene una secuencia mutada de un ácido nucleico de PPO de tipo salvaje y que confiere una mayor tolerancia al herbicida derivado de la benzoxazinona a una planta en la que se expresa. Además, el término "protoporfirinógeno oxidasa mutada (mut-PPO)" se refiere a la sustitución de un aminoácido de las secuencias primarias de tipo salvaje SEQ ID NO: 2, 4, , con otro aminoácido. La expresión "aminoácido mutado" se utilizará a continuación para designar el aminoácido que se sustituye por otro aminoácido, designando así el sitio de la mutación en la secuencia primaria de la proteína.

En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos PPO comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, o una variante de la misma.

Además, el experto en la técnica entenderá que las secuencias de nucleótidos de PPO abarcan homólogos, parálogos y ortólogos de la SEQ ID NO: 1, 25, 37 o 39, tal como se definen a continuación.

El término "variante" con respecto a una secuencia (por ejemplo, una secuencia polipeptídica o de ácido nucleico como -por ejemplo- una secuencia de nucleótidos reguladora de la transcripción de la invención) pretende significar secuencias sustancialmente similares. Para las secuencias de nucleótidos que comprenden un marco de lectura abierto, las variantes incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos idéntica de la proteína nativa. Las variantes alélicas de origen natural como éstas pueden identificarse con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente, como las generadas, por ejemplo, mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio y para marcos de lectura abiertos, que codifican la proteína nativa, así como las que codifican un polipéptido que tiene sustituciones de aminoácidos en relación con la proteína nativa. Generalmente, las variantes de la secuencia de nucleótidos de la invención tendrán al menos un 80%, por ejemplo, 81%-84%, al menos un 85%, por ejemplo, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, a 98 % y 99 % de "identidad de secuencia" de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1. Por polipéptido "variante" se entiende un polipéptido derivado de la proteína de la SEQ ID NO: 2, mediante la supresión (denominada truncamiento) o la adición de uno o más aminoácidos en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína nativa; la supresión o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios de la proteína nativa; o la sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios de la proteína nativa. Dichas variantes pueden ser el resultado, por ejemplo, de un polimorfismo genético o de una manipulación humana. Los procedimientos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica.

Se reconoce que las moléculas de polinucleótidos y los polipéptidos de la invención abarcan las moléculas de polinucleótidos y los polipéptidos que comprenden una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos que es suficientemente idéntica a las secuencias de nucleótidos expuestas en las SEQ ID Nos: 1, , o a las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID Nos: 2; El término "suficientemente idéntico" se utiliza en el presente documento para referirse a una primera secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que contiene un número suficiente o mínimo de residuos de aminoácidos o de nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar) a una segunda secuencia de aminoácidos o de nucleótidos, de manera que la primera y la segunda secuencia de aminoácidos o de nucleótidos tienen un dominio estructural común y/o una actividad funcional común.

La "identidad de secuencia" se refiere a la medida en que dos secuencias de ADN o aminoácidos óptimamente alineadas son invariables a lo largo de una ventana de alineación de componentes, por ejemplo, nucleótidos o aminoácidos. Una "fracción de identidad" para los segmentos alineados de una secuencia de prueba y una secuencia de referencia es el número de componentes idénticos que comparten las dos secuencias alineadas dividido por el número total de componentes en el segmento de la secuencia de referencia, es decir, toda la secuencia de referencia o una parte definida más pequeña de la secuencia de referencia. El "porcentaje de identidad" es la fracción de identidad multiplicada por 100. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación es bien conocida por los expertos en la técnica y puede llevarse a cabo mediante herramientas como el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, y preferentemente mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA disponibles como parte del GCG. Paquete Wisconsin. (Accelrys Inc. Burlington, Mass.)

Los términos "polinucleótido(s)", "secuencia(s) de ácido nucleico", "secuencia(s) de nucleótidos", "ácido(s) nucleico(s)", "molécula de ácido nucleico" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a nucleótidos, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una combinación de ambos, en una forma polimérica no ramificada de cualquier longitud.

Los "derivados" de una proteína abarcan los péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos en relación con la proteína no modificada en cuestión y que tienen una actividad biológica y funcional similar a la de la proteína no modificada de la que se derivan.

Los "homólogos" de una proteína abarcan los péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos en relación con la proteína no modificada en cuestión y que tienen una actividad biológica y funcional similar a la de la proteína no modificada de la que se derivan.

Una deleción se refiere a la eliminación de uno o más aminoácidos de una proteína.

Una inserción se refiere a la introducción de uno o más residuos de aminoácidos en un sitio predeterminado de una proteína. Las inserciones pueden incluir fusiones N-terminal y/o C-terminal, así como inserciones intra-secuenciales de uno o varios aminoácidos. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones N- o C-terminal, del orden de 1 a 10 residuos. Entre los ejemplos de proteínas o péptidos de fusión N- o C-terminal se incluyen el dominio de unión o el dominio de activación de un activador transcripcional tal como se utiliza en el sistema de dos híbridos de levadura, las proteínas de cubierta de fagos, la etiqueta (histidina)-6 etiqueta de la glutatión S-transferasa, proteína A, proteína de unión a la maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo Tag-100, epítopo c-myc, epítopo FLAG®, lacZ, CMP (péptido de unión a la calmodulina), epítopo HA, epítopo de la proteína C y epítopo VSV.

Una sustitución se refiere al reemplazo de aminoácidos de la proteína con otros aminoácidos que tienen propiedades similares (como hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras a-helicoidales o estructuras ¡5-hoja). Las sustituciones de aminoácidos suelen ser de un solo residuo, pero pueden agruparse dependiendo de las restricciones funcionales impuestas al polipéptido y pueden oscilar entre 1 y 10 aminoácidos; las inserciones suelen ser del orden de 1 a 10 residuos de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos son preferentemente sustituciones de aminoácidos conservadoras. Las tablas de sustitución conservadoras son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo Creighton (1984) Proteínas. W.H. Freeman and Company (Eds).

Tabla 2: Ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservados

continuación

Las sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos pueden realizarse fácilmente utilizando técnicas de síntesis de péptidos bien conocidas en la técnica, como la síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o mediante la manipulación de ADN recombinante. Los procedimientos de manipulación de secuencias de ADN para producir variantes de sustitución, inserción o deleción de una proteína son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados del ADN son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen la mutagénesis M13, la mutagénesis in vitro T7-Gen (USB, Cleveland, OH), la mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), la mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida al sitio.

Los "derivados" incluyen además péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que pueden, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la forma natural de la proteína, como la proteína de interés, comprender sustituciones de aminoácidos con residuos de aminoácidos no naturales, o adiciones de residuos de aminoácidos no naturales. Los "derivados" de una proteína también abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que comprenden residuos de aminoácidos naturalmente alterados (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados, miristoilados, sulfatados, etc.) o no naturalmente alterados en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma natural del polipéptido. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes o adiciones no aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de la que se deriva, por ejemplo una molécula informadora u otro ligando, unido covalentemente o no a la secuencia de aminoácidos, como una molécula informadora que se une para facilitar su detección, y residuos de aminoácidos no naturales en relación con la secuencia de aminoácidos de una proteína de origen natural. Además, los "derivados" también incluyen las fusiones de la forma natural de la proteína con péptidos de etiquetado como FLAG, HIS6 o tiorredoxina (para una revisión de los péptidos de etiquetado, véase Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523, 5151 a 2003).

"Ortólogos" y "parálogos" abarcan conceptos evolutivos utilizados para describir las relaciones ancestrales de los genes. Los parálogos son genes de la misma especie que se han originado por duplicación de un gen ancestral; los ortólogos son genes de organismos diferentes que se han originado por especiación y que también derivan de un gen ancestral común. En la Tabla 1 se muestra una lista no limitativa de ejemplos de dichos ortólogos.

Es bien conocido en la técnica que los parálogos y los ortólogos pueden compartir dominios distintos que albergan residuos de aminoácidos adecuados en sitios determinados, como bolsillos de unión para sustratos particulares o motivos de unión para la interacción con otras proteínas.

El término "dominio" se refiere a un conjunto de aminoácidos conservados en posiciones específicas a lo largo de un alineamiento de secuencias de proteínas relacionadas evolutivamente. Mientras que los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre los homólogos, los aminoácidos que están altamente conservados en posiciones específicas indican aminoácidos que son probablemente esenciales en la estructura, estabilidad o función de una proteína. Identificados por su alto grado de conservación en las secuencias alineadas de una familia de proteínas homólogas, pueden utilizarse como identificadores para determinar si un polipéptido en cuestión pertenece a una familia de polipéptidos previamente identificada.

El término "motivo" o "secuencia consenso" se refiere a una región corta conservada en la secuencia de proteínas relacionadas evolutivamente. Los motivos suelen ser partes altamente conservadas de los dominios, pero también pueden incluir sólo una parte del dominio, o estar situados fuera del dominio conservado (si todos los aminoácidos del motivo quedan fuera de un dominio definido).

Existen bases de datos especializadas en la identificación de dominios, por ejemplo, SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864 Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Ácidos. Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher y Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004)), o Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276/280 (2002). En el servidor de proteómica ExPASy (Instituto Suizo de Bioinformática (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31, 3784, 5151 a 2003). Los dominios o motivos también pueden identificarse mediante técnicas rutinarias, como la alineación de secuencias.

Los procedimientos para el alineamiento de secuencias para su comparación son bien conocidos en la técnica, tales procedimientos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. Ga p utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para encontrar la alineación global (es decir, que abarca las secuencias completas) de dos secuencias que maximiza el número de coincidencias y minimiza el número de brechas. El algoritmo BLAST (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula el porcentaje de identidad de la secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para realizar el análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Los homólogos pueden identificarse fácilmente utilizando, por ejemplo, el algoritmo de alineación de secuencias múltiples ClustalW (versión 1.83), con los parámetros de alineación por pares por defecto, y un procedimiento de puntuación en porcentaje. Los porcentajes globales de similitud e identidad también pueden determinarse utilizando uno de los procedimientos disponibles en el paquete de software MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10;4:29. MatGAT: aplicación que genera matrices de similitud/identidad a partir de secuencias de proteínas o ADN). Se puede realizar una pequeña edición manual para optimizar la alineación entre los motivos conservados, como sería evidente para un experto en la técnica. Además, en lugar de utilizar secuencias completas para la identificación de homólogos, también se pueden utilizar dominios específicos. Los valores de identidad de secuencia pueden determinarse sobre toda la secuencia de ácido nucleico o aminoácido o sobre dominios seleccionados o motivos conservados, utilizando los programas mencionados anteriormente con los parámetros por defecto. Para los alineamientos locales, el algoritmo Smith-Waterman es particularmente útil (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1);195-7).

Los inventores de la presente invención han encontrado sorprendentemente que sustituyendo uno o más de los residuos de aminoácidos clave, la tolerancia o resistencia a los herbicidas podría incrementarse notablemente en comparación con la actividad de las enzimas PPO de tipo salvaje con SEQ iD NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44 o 46. Las sustituciones preferidas de la mut-PPO son las que aumentan la tolerancia a los herbicidas de la planta, pero dejan la actividad biológica de la oxidasa sustancialmente inalterada.

Por consiguiente, los residuos de aminoácidos clave de una enzima PPO, una variante, un derivado, un otólogo, un parálogo o un homólogo de la misma, pueden ser sustituidos por cualquier otro aminoácido.

Los residuos de aminoácidos clave de una enzima PPO, una variante, un derivado, un otólogo, un parálogo o un homólogo de la misma, pueden ser sustituidos por un aminoácido conservado como se muestra en la Tabla 2.

El experto en la técnica entenderá que los aminoácidos situados en las proximidades de las posiciones de los aminoácidos mencionados a continuación también pueden ser sustituidos. Así, en otra realización la variante de la SEQ ID NO: 2, comprende un mut-PPO, en el que un aminoácido a ±3, ±2 o ± 1 posiciones de aminoácido de un aminoácido clave es sustituido por cualquier otro aminoácido.

Basándose en técnicas bien conocidas en la técnica, se puede desarrollar un patrón de secuencia altamente característico, mediante el cual se pueden buscar más candidatos a mut-PPO con la actividad deseada.

La búsqueda de otros candidatos a mut-PPO mediante la aplicación de un patrón de secuencia adecuado también estaría comprendida en la presente invención. Un lector experto entenderá que el presente patrón de secuencia no está limitado por las distancias exactas entre dos residuos de aminoácidos adyacentes de dicho patrón. Cada una de las distancias entre dos vecinos en los patrones anteriores puede, por ejemplo, variar independientemente una de otra hasta ±10, ±5, ±3, ± 2 o ± 1 posiciones de aminoácidos sin afectar sustancialmente a la actividad deseada.

En consonancia con dicho análisis funcional y espacial de los residuos de aminoácidos individuales basado en los datos cristalográficos obtenidos según la presente invención, pueden identificarse secuencias parciales de aminoácidos únicas características de los candidatos mut-PPO potencialmente útiles de la invención.

En una realización particularmente preferida, la variante o el derivado de la mut-PPO de la SEQ ID NO: 2 se selecciona de la siguiente Tabla 3a y las sustituciones combinadas de aminoácidos de la mut-PPO de la SEQ ID NO: 2 se selecciona de la Tabla 3b.

Tabla 3a: (Número de identificación de la secuencia 2, 26, 38, 40): sustituciones de un solo aminoácido

continuación

Tabla 3b: SEQ ID NO: 2 (sustituciones combinadas de aminoácidos)

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Debe entenderse que cualquier aminoácido, además de los mencionados en las tablas 3 anteriores, puede utilizarse como sustituto. Los ensayos para comprobar la funcionalidad de tales mutantes están fácilmente disponibles en la técnica, y respectivamente, se describen en la sección de ejemplos de la presente invención.

La secuencia de aminoácidos puede diferir de una secuencia de aminoácidos de una PPO de la SEQ ID NO: 2 en uno o más de las siguientes posiciones: 128, 175, 209, 210, 295, 296, 334, 353, 382, 384, 397, 398, 399, 400, 402, 403, 404, 405, 420, 439.

Los ejemplos de diferencias en estas posiciones de aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: el aminoácido en la posición 128 es distinto de la Arginina; el aminoácido en la posición 175 es distinto de la Glicina; el aminoácido en la posición 209 es distinto de la Glicina; el aminoácido en la posición 210 es distinto de la Glicina; el aminoácido en la posición 295 es distinto de la Leucina; el aminoácido de la posición 296 es distinto de la Serina; el aminoácido de la posición 334 es distinto de la Leucina; el aminoácido de la posición 353 es distinto de la Fenilalanina; el aminoácido de la posición 382 es distinto de la Glicina; el aminoácido de la posición 384 es distinto de la Leucina; el aminoácido de la posición 397 es distinto de la Leucina, el aminoácido de la posición 398 es distinto de la Glicina, el aminoácido de la posición 399 es distinto de la Treonina, el aminoácido de la posición 400 es distinto de la Leucina, el aminoácido de la posición 402 es distinto de la Serina el aminoácido de la posición 403 es distinto de la Serina, el aminoácido de la posición 404 es distinto de la Metionina, el aminoácido de la posición 405 es distinto de la Metionina, el aminoácido de la posición 420 es distinto de la Fenilalanina, el aminoácido de la posición 439 es distinto de la Fenilalanina.

En algunas realizaciones, la enzima PPO de la SEQ ID NO: 2 comprende lo siguiente: el aminoácido en la posición 128 es Ala, y el aminoácido en la posición 420 es Met, Ile o Leu.

El artesano experto podrá identificar las regiones conservadas y los motivos compartidos entre los homólogos, los ortólogos y los parálogos de la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, o 45, como los representados en la Tabla 1. Habiendo identificado dichas regiones conservadas que pueden representar motivos de unión adecuados, los aminoácidos correspondientes a los aminoácidos enumerados en las tablas 3a y 3b, pueden ser elegidos para ser sustituidos por cualquier otro aminoácido, preferentemente por aminoácidos conservados como los mostrados en la tabla 2, y más preferentemente por los aminoácidos de las tablas 3a y 3b.

Además, se divulga en el presente documento un procedimiento para identificar un herbicida derivado de la benzoxazinona utilizando una mut-PPO codificada por un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 o 45, o una variante o derivado de la misma.

Dicho procedimiento comprende los pasos de:

a) generar una célula o planta transgénica que comprenda un ácido nucleico que codifique una mut-PPO, en la que la mut-PPO se exprese;

b) aplicar un herbicida derivado de la benzoxazinona a la célula o planta transgénica de a) y a una célula o planta de control de la misma variedad;

c) determinar el crecimiento o la viabilidad de la célula o planta transgénica y de la célula o planta de control tras la aplicación de dicho herbicida derivado de la benzoxazinona, y

d) seleccionar "herbicidas derivados de la benzoxazinona" que confieren un crecimiento reducido a la célula o planta de control en comparación con el crecimiento de la célula o planta transgénica.

Por "célula de control" o "similar, de tipo salvaje, planta, tejido vegetal, célula vegetal o célula huésped" se entiende una planta, tejido vegetal, célula vegetal o célula huésped, respectivamente, que carece de las características de resistencia a los herbicidas y/o del polinucleótido particular de la invención que se divulga en el presente documento. Por lo tanto, el uso del término "de tipo salvaje" no pretende implicar que una planta, tejido vegetal, célula vegetal u otra célula huésped carezca de ADN recombinante en su genoma, y/o no posea características de resistencia a los herbicidas que sean diferentes de las divulgadas en el presente documento.

En el presente documento se divulga también un procedimiento para identificar una secuencia de nucleótidos que codifica una mut-PPO que es resistente o tolerante a un herbicida derivado de la benzoxazinona, el procedimiento comprende:

a) generar una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican la mut-PPO,

b) cribado de una población de los ácidos nucleicos resultantes que codifican la mut-PPO expresando cada uno de dichos ácidos nucleicos en una célula o planta y tratando dicha célula o planta con un herbicida derivado de la benzoxazinona,

c) comparar los niveles de tolerancia a los herbicidas derivados de la benzoxazinona proporcionados por dicha población de ácidos nucleicos que codifican la mut-PPO con el nivel de tolerancia a los herbicidas derivados de la benzoxazinona proporcionado por un ácido nucleico que codifica la PPO de control,

d) seleccionar al menos un ácido nucleico codificador de la PPO mutante que proporcione un nivel significativamente mayor de tolerancia a un herbicida derivado de la benzoxazinona en comparación con el proporcionado por el ácido nucleico codificador de la PPO de control.

El ácido nucleico que codifica la PPO mutante seleccionado en el paso d) proporciona al menos 2 veces más resistencia o tolerancia de una célula o planta a un herbicida derivado de la benzoxazinona en comparación con la proporcionada por el ácido nucleico que codifica la PPO de control.

Alternativamente, el ácido nucleico que codifica la PPO mutante seleccionado en el paso d) proporciona al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces, tanta resistencia o tolerancia de una célula o planta a un herbicida derivado de la benzoxazinona en comparación con la proporcionada por el ácido nucleico que codifica la PPO de control.

La resistencia o tolerancia puede determinarse generando una planta transgénica o célula huésped, preferentemente una célula vegetal, que comprenda una secuencia de ácido nucleico de la biblioteca del paso a) y comparando dicha planta transgénica con una planta o célula huésped de control, preferentemente una célula vegetal.

Se divulga en el presente documento un procedimiento para identificar una planta o alga que contiene un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una PPO de tipo salvaje o mut que es resistente o tolerante a un herbicida derivado de la benzoxazinona, el procedimiento comprende:

a) identificar una cantidad eficaz de un herbicida derivado de la benzoxazinona en un cultivo de células vegetales o algas verdes que provoque la muerte de dichas células.

b) tratar dichas células vegetales o algas verdes con un agente mutagénico,

c) Poner en contacto dicha población de células mutagénicas con una cantidad efectiva de herbicida derivado de la benzoxazinona, identificada en a),

d) seleccionar al menos una célula que sobreviva a estas condiciones de prueba,

e) Ampliación por PCR y secuenciación de los genes de la PPO de las células seleccionadas en d) y comparación de dichas secuencias con las del gen de la PPO de tipo salvaje, respectivamente.

Dicho agente mutagénico puede ser etilmetanosulfonato (EMS).

Existen muchos procedimientos bien conocidos por la técnicasano experto para obtener ácidos nucleicos candidatos adecuados para identificar una secuencia de nucleótidos que codifique una mut-PPO a partir de una variedad de organismos fuente potenciales diferentes, incluyendo microbios, plantas, hongos, algas, cultivos mixtos, etc., así como fuentes ambientales de ADN como el suelo. Estos procedimientos incluyen, entre otros, la preparación de bibliotecas de ADNc o de ADN genómico, el uso de cebadores oligonucleótidos adecuadamente degenerados, el uso de sondas basadas en secuencias conocidas o ensayos de complementación (por ejemplo, para el crecimiento sobre la tirosina), así como el uso de mutagénesis y combinación aleatoria para proporcionar secuencias que codifican mut-PPO recombinadas o de codificación aleatoria.

Los ácidos nucleicos que comprenden secuencias codificadoras de PPO candidatas y de control pueden expresarse en levadura, en una cepa huésped bacteriana, en un alga o en una planta superior como el tabaco o Arabidopsis y los niveles relativos de tolerancia inherente de las secuencias codificadoras de PPO se examinan según un fenotipo indicador visible de la cepa o planta transformada en presencia de diferentes concentraciones del herbicida derivado de la benzoxazinona seleccionado. Las respuestas a la dosis y los cambios relativos en las respuestas a la dosis asociados a estos fenotipos indicadores (formación de color marrón, inhibición del crecimiento, efecto herbicida, etc.) se expresan convenientemente en términos, por ejemplo, de GR50 (concentración para una reducción del 50 % del crecimiento) o de MIC (concentración inhibitoria mínima), donde los aumentos de los valores corresponden a aumentos de la tolerancia inherente de la PPO expresada. Por ejemplo, en un sistema de ensayo relativamente rápido basado en la transformación de una bacteria como E. coli, cada secuencia codificadora de mut-PPO puede expresarse, por ejemplo, como una secuencia de ADN bajo el control de expresión de un promotor controlable como el promotor lacZ y teniendo en cuenta adecuadamente, por ejemplo mediante el uso de ADN sintético, cuestiones como el uso de codones para obtener un nivel de expresión lo más comparable posible de diferentes secuencias de PPO. Dichas cepas que expresan ácidos nucleicos que comprenden secuencias alternativas de PPO candidatas pueden ser sembradas en diferentes concentraciones del herbicida derivado de la benzoxazinona seleccionado en, opcionalmente, un medio suplementado con tirosina y los niveles relativos de tolerancia inherente de las enzimas PPO expresadas se estiman sobre la base de la extensión y la MIC para la inhibición de la formación del pigmento marrón ocronótico.

En otra realización, los ácidos nucleicos candidatos se transforman en material vegetal para generar una planta transgénica, que se regenera en plantas fértiles morfológicamente normales que luego se miden para la tolerancia diferencial a herbicidas derivados de la benzoxazinona seleccionados. Muchos procedimientos adecuados para la transformación utilizando marcadores de selección adecuados como la kanamicina, vectores binarios como los de Agrobacterium y la regeneración de plantas como, por ejemplo, a partir de discos de hoja de tabaco son bien conocidos en la técnica. Opcionalmente, una población de plantas de control se transforma igualmente con un ácido nucleico que expresa la PPO de control. Alternativamente, se puede utilizar como control una planta dicotiledónea no transformada, como Arabidopsis o Tabaco, ya que ésta, en cualquier caso, expresa su propia PPO endógena. El promedio, y la distribución, de los niveles de tolerancia a los herbicidas de una serie de eventos de transformación de plantas primarias o de su progenie a los derivados de la benzoxazinona descritos anteriormente se evalúan de la manera normal, basándose en los daños a las plantas, los síntomas de blanqueo meristemático, etc., en una serie de concentraciones diferentes de herbicidas. Estos datos pueden expresarse en términos de, por ejemplo, valores GR50 derivados de curvas dosis/respuesta que tienen la "dosis" trazada en el eje x y el "porcentaje de muerte", el "efecto herbicida", el "número de plantas verdes emergentes", etc., trazados en el eje y, donde el aumento de los valores GR50 corresponde a un aumento de los niveles de tolerancia inherente de la PPO expresada. Los herbicidas pueden aplicarse adecuadamente en preemergencia o postemergencia.

Otro objeto se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica una mut-PPO, donde la mut-PPO codificada es una variante de la SEQ ID NO: 2 en el que el aminoácido en la posición 128 es Alanina, y el aminoácido en la posición 420 es Metionina, Isoleucina o Leucina.

En otra realización, la invención se refiere a una célula vegetal transformada por un ácido nucleico mut-PPO según la presente invención o a una célula vegetal que ha sido mutada para obtener una planta que expresa un ácido nucleico de tipo salvaje o un ácido nucleico mut-PPO, en la que la expresión del ácido nucleico en la célula vegetal da como resultado una mayor resistencia o tolerancia a un herbicida derivado de la benzoxazinona en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula vegetal.

El término "expresión/que expresa" o "expresión génica" significa la transcripción de un gen o genes específicos o un constructo genético específico. El término "expresión" o "expresión génica" significa, en particular, la transcripción de un gen o genes o constructo genético en ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARNm, con o sin traducción posterior de este último en una proteína. El proceso incluye la transcripción del ADN y el procesamiento del producto de ARNm resultante.

Para obtener el efecto deseado, es decir, plantas tolerantes o resistentes al herbicida derivado de la benzoxazinona de la presente invención, se entenderá que el al menos un ácido nucleico se "sobreexpresa" por procedimientos y medios conocidos por el experto en la técnica.

El término "expresión aumentada" o "sobreexpresión", tal y como se utiliza en el presente documento, significa cualquier forma de expresión que sea adicional al nivel de expresión original de tipo salvaje. Los procedimientos para aumentar la expresión de genes o productos génicos están bien documentados en la técnica e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión impulsada por promotores apropiados, el uso de potenciadores de la transcripción o de la traducción. Los ácidos nucleicos aislados que sirven como elementos promotores o potenciadores pueden introducirse en una posición apropiada (típicamente corriente arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido con el fin de aumentar la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Por ejemplo, los promotores endógenos pueden ser alterados in vivo por mutación, supresión y/o sustitución (véase, Kmiec, US 5,565,350 Zarling et al., WO9322443), o pueden introducirse promotores aislados en una célula vegetal en la orientación y distancia adecuadas de un gen de la presente invención para controlar la expresión del gen.

Si se desea la expresión de un polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región codificante de polinucleótidos. La región de poliadenilación puede derivarse del gen natural, de una variedad de otros genes vegetales o del ADN-T. La secuencia del extremo 3' que debe añadirse puede proceder, por ejemplo, de los genes de la nopalina sintasa o de la octopina sintasa, o alternativamente de otro gen vegetal, o menos preferentemente de cualquier otro gen eucariota.

También se puede añadir una secuencia de intrones a la región no traducida (UTR) 5' o a la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. Se ha demostrado que la inclusión de un intrón empalmable en la unidad de transcripción en consrtuctos de expresión tanto de plantas como de animales aumenta la expresión del gen tanto a nivel de ARNm como de proteínas hasta 1000 veces (Buchman y Berg (1988) Mol. Cell biol. 8) 4395-4405 Callis et al. (1987) Genes Dev 1:1183-1200). Esta potenciación de la expresión génica por parte de los intrones suele ser mayor cuando se sitúa cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. El uso de los intrones de maíz Adh1-S intrón 1, 2 y 6, el intrón Bronce-1 son conocidos en la técnica. Para información general, véase: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, N.Y. 1994)

El término "introducción" o "transformación", tal y como se menciona en el presente documento, abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno a una célula huésped, independientemente del procedimiento utilizado para la transferencia. El tejido vegetal capaz de propagación clonal posterior, ya sea por organogénesis o embriogénesis, puede transformarse con un constructo genético de la presente invención y regenerarse una planta entera a partir del mismo. El tejido particular seleccionado variará en función de los sistemas de propagación clonal disponibles y más adecuados para la especie concreta que se transforme. Entre los tejidos objetivo ejemplares se encuentran los discos foliares, el polen, los embriones, los cotiledones, los hipocótilos, los megagametofitos, el tejido de callo, el tejido meristemático existente (por ejemplo, el meristemo apical, las yemas axilares y los meristemos de la raíz) y el tejido meristemático inducido (por ejemplo, el meristemo del cotiledón y el meristemo del hipocótilo). El polinucleótido puede introducirse de forma transitoria o estable en una célula huésped y puede mantenerse no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Otra posibilidad es que se integre en el genoma del huésped. La célula vegetal transformada resultante puede utilizarse entonces para regenerar una planta transformada de la manera conocida por los expertos en la técnica.

La transferencia de genes extraños al genoma de una planta se denomina transformación. La transformación de especies vegetales es ahora una técnica bastante rutinaria. Ventajosamente, se puede utilizar cualquiera de los diversos procedimientos de transformación para introducir el gen de interés en una célula ancestral adecuada. Los procedimientos descritos para la transformación y regeneración de plantas a partir de tejidos vegetales o células vegetales pueden utilizarse para la transformación transitoria o estable. Los procedimientos de transformación incluyen el uso de liposomas, la electroporación, los productos químicos que aumentan la captación de ADN libre, la inyección del ADN directamente en la planta, el bombardeo con pistolas de partículas, la transformación mediante virus o polen y la microproyección. Los procedimientos pueden seleccionarse entre el procedimiento de calcio/polietilenglicol para protoplastidios (Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74 Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); electroporación de protoplastidios (Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); microinyección en material vegetal (Crossway A e t al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeo de partículas recubiertas de ADN o ARN (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70) la infección por virus (no integrativos) y similares. Las plantas transgénicas, incluidas las plantas de cultivo transgénicas, se producen preferentemente mediante transformación mediada por Agrobacterium . Un procedimiento de transformación ventajoso es la transformación in planta. Para ello, es posible, por ejemplo, permitir que las agrobacterias actúen sobre las semillas de la planta o inocular el meristemo de la planta con agrobacterias. Ha resultado particularmente conveniente, de acuerdo con la invención, permitir que una suspensión de agrobacterias transformadas actúe sobre la planta intacta o al menos sobre el primordio floral. Posteriormente, la planta se cultiva hasta obtener las semillas de la planta tratada (Clough y Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Los procedimientos para la transformación del arroz mediada por Agrobacterium incluyen procedimientos bien conocidos para la transformación del arroz, como los descritos en cualquiera de los siguientes: Solicitud de patente europea EP 1198985 A1, Aldemita and Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994. En el caso de la transformación del maíz, el procedimiento preferido es el descrito en Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o Frame et al. (Plant Physiol 129(1): 13 22, 2002. Dichos procedimientos se describen además a modo de ejemplo en B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42, 1991, 5151 a 225). Los ácidos nucleicos o el constructo que se va a expresar se clonan preferentemente en un vector adecuado para la transformación de Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Las agrobacterias transformadas por un vector de este tipo pueden utilizarse entonces de manera conocida para la transformación de plantas, como las plantas utilizadas como modelo, como Arabidopsis (Arabidopsis thaliana no se considera, en el ámbito de la presente invención, una planta de cultivo), o plantas de cultivo como, a modo de ejemplo, las plantas de tabaco, por ejemplo, sumergiendo hojas machacadas o picadas en una solución agrobacteriana y cultivándolas después en medios adecuados. La transformación de plantas mediante Agrobacterium tumefaciens está descrita, por ejemplo, por Hofgen y Willmitzer en Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 o se conoce, entre otras cosas, por F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.

Además de la transformación de células somáticas, que luego deben regenerarse en plantas intactas, también es posible transformar las células de los meristemos de las plantas y, en particular, las células que se desarrollan en gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, dando lugar a plantas transgénicas. Así, por ejemplo, se tratan semillas de Arabidopsis con agrobacterias y se obtienen semillas de las plantas en desarrollo de las que una determinada proporción es transformada y, por tanto, transgénica [Feldman, KA y Marks MD(1987). Mol Gen Genet 208:274-289 Feldmann K (1992). En: C Koncz, N-H Chuay J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, pp. 274-289]. Los procedimientos alternativos se basan en la eliminación repetida de las inflorescencias y la incubación del lugar de escisión en el centro de la roseta con agrobacterias transformadas, con lo que también se pueden obtener semillas transformadas en un momento posterior (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370. Sin embargo, un procedimiento especialmente eficaz es el procedimiento de infiltración al vacío con sus modificaciones, como el procedimiento de "inmersión floral". En el caso de la infiltración al vacío de Arabidopsis, las plantas intactas bajo presión reducida son tratadas con una suspensión agrobacteriana [Bechthold, N (1993). C R Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1194-1199], mientras que en el caso del procedimiento de "inmersión floral" el tejido floral en desarrollo se incuba brevemente con una suspensión agrobacteriana tratada con surfactantes [Clough, SJ y Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743]. En ambos casos se cosecha una cierta proporción de semillas transgénicas, que pueden distinguirse de las no transgénicas mediante su cultivo en las condiciones selectivas descritas. Además, la transformación estable de los plastidios es ventajosa porque los plastidios se heredan por vía materna en la mayoría de los cultivos, lo que reduce o elimina el riesgo de flujo de transgenes a través del polen. La transformación del genoma del cloroplasto se consigue generalmente mediante un proceso que se ha mostrado de forma esquemática en Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. En resumen, las secuencias que se van a transformar se clonan junto con un gen marcador seleccionable entre secuencias de flanqueo homólogas al genoma del cloroplasto. Estas secuencias homólogas de flanqueo dirigen la integración específica del sitio en el plastoma. La transformación plastidial se ha descrito para muchas especies de plantas diferentes y se ofrece una visión general en Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3):425-38 o Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21,20-28. Recientemente se ha informado de otros avances biotecnológicos en forma de transformantes de plástidos libres de marcadores, que pueden producirse mediante un gen creador transitorio cointegrado (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229). Las células vegetales modificadas genéticamente pueden regenerarse mediante todos los procedimientos con los que el trabajador especializado está familiarizado. Se pueden encontrar procedimientos adecuados en las publicaciones mencionadas de S.D. Kung y R. Wu, Potrykus o Hofgen y Willmitzer.

Generalmente, después de la transformación, las células vegetales o las agrupaciones de células se seleccionan por la presencia de uno o más marcadores codificados por genes expresables por la planta y co-transferidos con el gen de interés, tras lo cual el material transformado se regenera en una planta completa. Para seleccionar las plantas transformadas, el material vegetal obtenido en la transformación se somete, por regla general, a condiciones selectivas para poder distinguir las plantas transformadas de las no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas de la manera descrita anteriormente pueden plantarse y, tras un período inicial de crecimiento, someterse a una selección adecuada mediante pulverización. Otra posibilidad consiste en cultivar las semillas, en su caso después de la esterilización, en placas de agar utilizando un agente de selección adecuado para que sólo las semillas transformadas puedan convertirse en plantas. Alternativamente, las plantas transformadas se examinan para detectar la presencia de un marcador seleccionable como los descritos anteriormente.

Tras la transferencia de ADN y la regeneración, las plantas supuestamente transformadas también pueden evaluarse, por ejemplo, mediante el análisis de Southern, para detectar la presencia del gen de interés, el número de copias y/o la organización genómica. Alternativa o adicionalmente, los niveles de expresión del ADN recién introducido pueden ser monitorizados usando análisis Northern y/o Western, siendo ambas técnicas bien conocidas por las personas con habilidad normal en la técnica.

Las plantas transformadas generadas pueden propagarse por diversos medios, como la propagación clonal o las técnicas clásicas de reproducción. Por ejemplo, una planta transformada de primera generación (o T1) puede autofecundarse y seleccionarse transformantes homocigóticos de segunda generación (o T2), y las plantas T2 pueden propagarse posteriormente mediante técnicas clásicas de reproducción. Los organismos transformados generados pueden adoptar diversas formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes clonales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en las plantas, una raíz transformada injertada en una púa no transformada).

Preferentemente, el ácido nucleico mut-PPO o de tipo salvaje comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1, b) un polinucleótido que codifica una variante del polipéptido que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y en el que la variante del polipéptido de la SEQ ID NO: 2 en b) incluye: el aminoácido en la posición 128 es Alanina, y el aminoácido en la posición 420 es Metionina, Isoleucina o Leucina.

En otra realización, la invención se refiere a una planta, preferentemente una planta transgénica, que comprende una célula vegetal según la presente invención, en la que la expresión del ácido nucleico en la planta da lugar a un aumento de la resistencia de la planta al herbicida derivado de la benzoxazinona en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

Las plantas descritas en el presente documento pueden ser plantas de cultivo transgénicas o plantas no transgénicas.

Para los efectos de la invención, "transgénico", "transgén" o "recombinante" significa, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico, un casete de expresión, un constructo genético o un vector que comprenda la secuencia de ácido nucleico o un organismo transformado con las secuencias de ácido nucleico, los casetes de expresión o los vectores según la invención, todos aqquellos constructos provocados por procedimientos recombinantes en los que

(a) las secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas útiles en los procedimientos de la invención, o

b) secuencia(s) de control genético que está(n) vinculada(s) operativamente con la secuencia de ácido nucleico según la invención, por ejemplo un promotor, o

(c) a) y b)

no se encuentran en su entorno genético natural o han sido modificados por procedimientos recombinantes, siendo posible que la modificación adopte la forma de, por ejemplo, una sustitución, adición, deleción, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótidos. Por entorno genético natural se entiende el locus genómico o cromosómico natural en la planta original o la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, es preferible que se conserve, al menos en parte, el entorno genético natural de la secuencia de ácido nucleico. El entorno flanquea la secuencia de ácido nucleico al menos por un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 pb, preferentemente de al menos 500 pb, especialmente preferentemente de al menos 1000 pb, más preferentemente de al menos 5000 pb. Un casete de expresión natural -por ejemplo, la combinación natural del promotor natural de las secuencias de ácido nucleico con la correspondiente secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido útil en los procedimientos de la presente invención, tal y como se ha definido anteriormente- se convierte en un casete de expresión transgénico cuando este casete de expresión se modifica mediante procedimientos no naturales, sintéticos ("artificiales") como, por ejemplo, el tratamiento mutagénico. Los procedimientos adecuados se describen, por ejemplo, en US 5.565.350 o en WO 00/15815.

Por lo tanto, una planta transgénica para los propósitos de la invención se entiende que significa, como anteriormente, que los ácidos nucleicos usados en el procedimiento de la invención no se encuentran en su locus natural en el genoma de dicha planta,siendo posible que los ácidos nucleicos se expresen de forma homóloga o heteróloga. Sin embargo, como se ha mencionado, transgénico también significa que, mientras los ácidos nucleicos según la invención o utilizados en el procedimiento inventivo están en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia ha sido modificada con respecto a la secuencia natural, y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales han sido modificadas. Por transgénico se entiende preferentemente la expresión de los ácidos nucleicos según la invención en un locus no natural del genoma, es decir, se produce una expresión homóloga o, preferentemente, heteróloga de los ácidos nucleicos. Se mencionan en el presente documento las plantas transgénicas preferidas. Además, el término "transgénico" se refiere a cualquier planta, célula vegetal, callo, tejido vegetal o parte de la planta que contenga todo o parte de al menos un polinucleótido recombinante. En muchos casos, todo o parte del polinucleótido recombinante se integra de forma estable en un cromosoma o elemento extracromosómico estable, de modo que se transmite a las generaciones sucesivas. A efectos de la invención, el término "polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que ha sido alterado, reordenado o modificado por ingeniería genética. Los ejemplos incluyen cualquier polinucleótido clonado, o polinucleótidos, que están vinculados o unidos a secuencias heterólogas. El término "recombinante" no se refiere a las alteraciones de los polinucleótidos que resultan de eventos naturales, como las mutaciones espontáneas, o de la mutagénesis no espontánea seguida de la reproducción selectiva.

Las plantas que contienen mutaciones que surgen debido a la mutagénesis no espontánea y a la reproducción selectiva se denominan en el presente documento plantas no transgénicas y se incluyen en la presente invención. En las realizaciones en las que la planta es transgénica y comprende múltiples ácidos nucleicos mut-PPO, los ácidos nucleicos pueden derivarse de diferentes genomas o del mismo genoma. Alternativamente, en las realizaciones en las que la planta no es transgénica y comprende múltiples ácidos nucleicos mut-PPO, los ácidos nucleicos están localizados en diferentes genomas o en el mismo genoma.

En ciertas realizaciones, la presente invención incluye plantas resistentes a los herbicidas que se producen mediante la reproducción por mutación. Tales plantas comprenden un polinucleótido que codifica una mut-PPO y son tolerantes a uno o más "herbicidas derivados de la benzoxazinona". Dichos procedimientos pueden implicar, por ejemplo, la exposición de las plantas o semillas a un mutágeno, en particular a un mutágeno químico como, por ejemplo, el metanosulfonato de etilo (EMS) y la selección de plantas que tengan una mayor tolerancia a al menos uno o más herbicidas derivados de la benzoxazinona.

Sin embargo, la presente invención no se limita a las plantas tolerantes a los herbicidas que se producen mediante un procedimiento de mutagénesis que incluye el mutágeno químico EMS. Se puede utilizar cualquier procedimiento de mutagénesis conocido en la técnica para producir las plantas resistentes a los herbicidas de la presente invención. Tales procedimientos de mutagénesis pueden implicar, por ejemplo, el uso de uno o más de los siguientes mutágenos: radiación, como rayos X, rayos Gamma (por ejemplo, cobalto 60 o cesio 137), neutrones, (por ejemplo, producto de la fisión nuclear del uranio 235 en un reactor atómico), radiación Beta (por ejemplo, emitida por radioisótopos como el fósforo 32 o el carbono 14), y la radiación ultravioleta (preferentemente de 2500 a 2900 nm), y mutágenos químicos como los análogos de las bases (por ejemplo, el 5-bromo-uracilo), los compuestos relacionados (por ejemplo, 8-etoxi cafeína), antibióticos (por ejemplo, estreptonigrina), agentes alquilantes (por ejemplo, mostazas de azufre, mostazas de nitrógeno, epóxidos, etilenaminas, sulfatos, sulfonatos, sulfonas, lactonas), azida, hidroxilamina, ácido nitroso o acridinas. Las plantas resistentes a los herbicidas también pueden producirse utilizando procedimientos de cultivo de tejidos para seleccionar células vegetales que contengan mutaciones de resistencia a los herbicidas y luego regenerar plantas resistentes a los herbicidas a partir de ellas. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. Nos. 5,773,702, y 5.859.348. Se pueden encontrar más detalles sobre la reproducción por mutación en "Principals of Cultivar Development" Fehr, 1993 Macmillan Publishing Company.

Además de la definición anterior, el término "planta" pretende abarcar las plantas de cultivo en cualquier etapa de madurez o desarrollo, así como cualquier tejido u órgano (parte de la planta) tomado o derivado de cualquiera de dichas plantas, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Las partes de la planta incluyen, pero no se limitan a, los tallos, las raíces, las flores, los óvulos, los estambres, las hojas, los embriones, las regiones meristemáticas, el tejido de callo, los cultivos de anteras, los gametofitos, los esporofitos, el polen, las microsporas, los protoplastidios y similares.

La planta de la presente invención comprende al menos un ácido nucleico mut-PPO o un ácido nucleico de PPO de tipo salvaje sobreexpresado, y tiene una mayor tolerancia a un herbicida derivado de la benzoxazinona en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. Es posible que las plantas de la presente invención tengan múltiples ácidos nucleicos mut-PPO o de tipo salvaje de diferentes genomas, ya que estas plantas pueden contener más de un genoma. Por ejemplo, una planta contiene dos genomas, normalmente denominados genoma A y B. Dado que la PPO es una enzima metabólica necesaria, se supone que cada genoma tiene al menos un gen que codifica la enzima PPO (es decir, al menos un gen PPO). Tal como se utiliza en el presente documento, el término "locus del gen de la PPO" se refiere a la posición de un gen de la PPO en un genoma, y los términos "gen de la PPO" y "ácido nucleico de la PPO" se refieren a un ácido nucleico que codifica la enzima de la PPO. El ácido nucleico de PPO de cada genoma difiere en su secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico de PPO de otro genoma. Un experto en la técnica puede determinar el genoma de origen de cada ácido nucleico de la OPP mediante el cruce genético y/o procedimientos de secuenciación o de digestión de exonucleasas conocidos por los expertos en la técnica.

La presente divulgación incluye plantas que comprenden uno, dos, tres o más alelos mut-PPO, en las que la planta tiene una mayor tolerancia a un herbicida derivado de la benzoxazinona en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. Los alelos mut-PPO pueden comprender una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en un polinucleótido como el definido en la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43 o 45, o una variante o derivado del mismo, un polinucleótido que codifica un polipéptido como el definido en la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, o 46, o una variante o derivado, homólogo, ortólogo, parálogo de los mismos, un polinucleótido que comprenda al menos 60 nucleótidos consecutivos de cualquiera de los polinucleótidos mencionados; y un polinucleótido complementario a cualquiera de los polinucleótidos mencionados.

Los "alelos" o "variantes alélicas" son formas alternativas de un determinado gen, localizadas en la misma posición cromosómica. Las variantes alélicas abarcan los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), así como los pequeños polimorfismos de inserción/deleción (INDEL). El tamaño de los INDEL suele ser inferior a 100 pb. Los SNP y los INDEL forman el mayor conjunto de variantes de secuencia en las cepas polimórficas naturales de la mayoría de los organismos

El término "variedad" se refiere a un grupo de plantas dentro de una especie definida por el hecho de compartir un conjunto común de características o rasgos aceptados por los expertos en la técnica como suficientes para distinguir un cultivar o variedad de otro cultivar o variedad. Ninguno de los dos términos implica que todas las plantas de un determinado cultivar o variedad sean genéticamente idénticas a nivel genético o molecular, o que una determinada planta sea homocigótica en todos los loci. Se considera que un cultivar o una variedad es una "genéticamente pura" para un rasgo particular si, cuando el cultivar o la variedad de verdadero cultivo se autopoliniza, toda la progenie contiene el rasgo. Los términos "línea de reproducción" o "línea" se refieren a un grupo de plantas dentro de un cultivar definido por el hecho de compartir un conjunto común de características o rasgos aceptados por los expertos en la técnica como suficientes para distinguir una línea de reproducción o línea de otra línea de reproducción o línea. Ninguno de los dos términos implica que todas las plantas de una línea de reproducción o de una línea determinada sean genéticamente idénticas a nivel genético o molecular o que una planta determinada sea homocigótica en todos los loci. Se considera que una línea de reproducción o una línea es "reproducción verdadera" para un rasgo particular si, cuando la línea genéticamente pura o la línea de reproducción se autopoliniza, toda la progenie contiene el rasgo. En la presente invención, el rasgo surge de una mutación en un gen PPO de la planta o semilla.

Las plantas resistentes a los herbicidas de la invención que comprenden polinucleótidos que codifican polipéptidos mut-PPO también pueden utilizarse en procedimientos para aumentar la resistencia a los herbicidas de una planta mediante la reproducción convencional de plantas que implica la reproducción sexual. Los procedimientos comprenden el cruce de una primera planta que es una planta resistente a los herbicidas de la invención con una segunda planta que puede o no ser resistente al mismo herbicida o herbicidas que la primera planta o puede ser resistente a un herbicida o herbicidas diferentes que la primera planta. La segunda planta puede ser cualquier planta que sea capaz de producir plantas de progenie viables (es decir, semillas) cuando se cruza con la primera planta. Normalmente, pero no necesariamente, la primera y la segunda planta son de la misma especie. Los procedimientos pueden incluir opcionalmente la selección de plantas de progenie que comprendan los polipéptidos mut-PPO de la primera planta y las características de resistencia a los herbicidas de la segunda planta. Las plantas progenitoras producidas por este procedimiento de la presente invención tienen una mayor resistencia a un herbicida en comparación con la primera o la segunda planta o con ambas. Cuando la primera y la segunda planta son resistentes a diferentes herbicidas, las plantas progenitoras tendrán las características combinadas de tolerancia a los herbicidas de la primera y la segunda planta. Los procedimientos de la invención pueden incluir además una o más generaciones de retrocruzamiento de las plantas progenitoras del primer cruce con una planta de la misma línea o genotipo que la primera o la segunda planta. Alternativamente, la progenie del primer cruce o de cualquier cruce posterior puede cruzarse con una tercera planta que sea de una línea o genotipo diferente al de la primera o segunda planta. La presente invención también proporciona plantas, órganos vegetales, tejidos vegetales, células vegetales, semillas y células huésped no humanas que se transforman con la al menos una molécula polinucleotídica, casete de expresión o vector de transformación de la invención. Dichas plantas transformadas, órganos vegetales, tejidos vegetales, células vegetales, semillas y células huésped no humanas tienen una mayor tolerancia o resistencia a al menos un herbicida, a niveles del herbicida que matan o inhiben el crecimiento de una planta, tejido vegetal, célula vegetal o célula huésped no humana no transformada, respectivamente. Preferentemente, las plantas transformadas, los tejidos vegetales, las células vegetales y las semillas de la invención son plantas de Arabidopsis thaliana y plantas de cultivo.

Debe entenderse que la planta de la presente invención puede comprender un ácido nucleico de PPO de tipo salvaje además de un ácido nucleico mut-PPO. Se contempla que las líneas tolerantes al herbicida derivado de la benzoxazinona pueden contener una mutación en sólo una de las múltiples isoenzimas de la PPO. Por lo tanto, la presente invención incluye una planta que comprende uno o más ácidos nucleicos mut-PPO además de uno o más ácidos nucleicos PPO de tipo salvaje.

En otra realización, la invención se refiere a un procedimiento para producir una célula vegetal transgénica con una mayor resistencia a un herbicida derivado de la benzoxazinona en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula vegetal que comprende, transformar la célula vegetal con un casete de expresión que comprende un ácido nucleico mut-PPO.

En otra realización, la invención se refiere a un procedimiento de producción de una planta transgénica que comprende, (a) la transformación de una célula vegetal con un casete de expresión que comprende un ácido nucleico mut-PPO, y (b) la generación de una planta con una mayor resistencia al herbicida derivado de la benzoxazinona a partir de la célula vegetal.

En consecuencia, los ácidos nucleicos mut-PPO de la invención se proporcionan en casetes de expresión para su expresión en la planta de interés. El casete incluirá secuencias reguladoras unidas de forma operable a una secuencia de ácido nucleico mut-PPO de la invención. El término "elemento regulador", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polinucleótido capaz de regular la transcripción de un polinucleótido operable. Incluye, pero no se limitan a, promotores, potenciadores, intrones, 5' UTRs y 3' UTRs. Por "operativamente vinculado" se entiende una vinculación funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en la que la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, enlazado operativamente significa que las secuencias de ácido nucleico que se enlazan son contiguas y, cuando es necesario para unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura. El casete puede contener, además, al menos un gen adicional para ser cotransformado en el organismo. Alternativamente, el/los gen(es) adicional(es) puede(n) proporcionarse en múltiples casetes de expresión.

Dicho casete de expresión está provisto de una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia de ácido nucleico mut-PPO para estar bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. El casete de expresión puede contener además genes marcadores seleccionables.

El casete de expresión incluirá en la dirección 5'-3' de la transcripción, una región de iniciación transcripcional y traslacional (es decir, un promotor), una secuencia de ácido nucleico mut-PPO de la invención, y una región de terminación transcripcional y traslacional (es decir, región de terminación) funcional en las plantas. El promotor puede ser nativo o análogo, o extraño o heterólogo, al huésped vegetal y/o a la secuencia de ácido nucleico mut-PPO de la invención. Además, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. Cuando el promotor es "extraño" o "heterólogo" para la planta huésped, se pretende que el promotor no se encuentre en la planta nativa en la que se introduce el promotor. Cuando el promotor es "extraño" o "heterólogo" a la secuencia de ácido nucleico mut-PPO de la invención, se pretende que el promotor no sea el promotor nativo o natural de la secuencia de ácido nucleico mut-PPO operable de la invención. Tal y como se utiliza en el presente documento, un gen quimérico comprende una secuencia codificante unida operativamente a una región de iniciación de la transcripción que es heteróloga a la secuencia codificante.

Aunque puede ser preferible expresar los ácidos nucleicos mut-PPO de la invención utilizando promotores heterólogos, pueden utilizarse las secuencias promotoras nativas. Tales constructos cambiarían los niveles de expresión de la proteína mut-PPO en la planta o en la célula vegetal. Así, el fenotipo de la planta o de la célula vegetal se altera.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación transcripcional, puede ser nativa con la secuencia mut-PPO de interés operativamente vinculada, puede ser nativa con el huésped de la planta, o puede derivarse de otra fuente (es decir, ajena o heteróloga al promotor, la secuencia de ácido nucleico mut-PPO de interés, el huésped de la planta, o cualquier combinación de los mismos). Existen regiones de terminación convenientes en el plásmido Ti de A. tumefaciens , como las regiones de terminación de la octopina sintasa y la nopalina sintasa. Véase también Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262; 141-144 Proudfoot (1991) Cell 64:671-674 Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5; 141-149 Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroeetal. (1990) Gene 91: 151-158 Ballastal. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903y Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627:9639. Cuando proceda, el gen o genes pueden ser optimizados para aumentar su expresión en la planta transformada. Es decir, los genes pueden sintetizarse utilizando los codones preferidos por las plantas para mejorar su expresión. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92; 1-11 para una discusión sobre el uso de codones preferidos por el huésped. Existen procedimientos en la técnica para sintetizar los genes preferidos por las plantas. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. Nos. 5.380.831, 5.436.391 y 5.698.594. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477:498.

Se sabe que otras modificaciones de la secuencia mejoran la expresión de los genes en un huésped celular. Esto incluye la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitios de empalme exón-intrón, repeticiones tipo transposón y otras secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales para la expresión del gen. El contenido G-C de la secuencia puede ajustarse a los niveles medios de un huésped celular determinado, calculados por referencia a genes conocidos expresados en la célula huésped. En la medida de lo posible, la secuencia se modifica para evitar las estructuras secundarias de ARNm predichas en forma de horquilla. En los vectores de expresión de las plantas también pueden utilizarse secuencias de nucleótidos para potenciar la expresión de los genes. Entre ellos se encuentran los intrones del maíz Adhl, gen intronl (Callis et al. Genes y desarrollo 1: 1183-1200, 1987), y secuencias líder, (secuencia W) del virus del mosaico del tabaco (TMV), del virus del moteado clorótico del maíz y del virus del mosaico de la alfalfa (Gallie et al. Nucleic Acid Res. 15:8693-8711, 1987 y Skuzeski et al. Plant Mol. Biol. 15:65:1990. Se ha demostrado que el primer intrón del locus shrunken- 1 del maíz aumenta la expresión de los genes en los constructos de genes quiméricos. Las Pat. U.S. Nos. 5.424.412 y 5.593.874 divulgan el uso de intrones específicos en constructos de expresión genética, y Gallie et al. (Plant Physiol. 106:929-939, 1994) también han demostrado que los intrones son útiles para regular la expresión de los genes en función de los tejidos. Para mejorar u optimizar aún más la expresión del gen mut-PPO, los vectores de expresión vegetal de la invención pueden contener también secuencias de ADN que contengan regiones de unión a la matriz (MAR). Las células vegetales transformadas con dichos sistemas de expresión modificados, por tanto, pueden mostrar una sobreexpresión o una expresión constitutiva de una secuencia nucleotídica de la invención.

Los casetes de expresión pueden contener adicionalmente secuencias líder 5' en el constructo del casete de expresión. Estas secuencias líderes pueden actuar para mejorar la traducción. Los líderes de traducción son conocidos en la técnica e incluyen: líderes de picornavirus, por ejemplo, el líder del EMCV (región no codificante 5' de la encefalomiocarditis) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. ScL USA 86:6126-6130); líderes de potyvirus, por ejemplo, el líder t EV (Tobacco Etch Virus) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-238), líder del MDMV (virus del mosaico enano del maíz) (Virología 154:9-20), y la proteína de unión a la cadena pesada de la inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353:90-94); líder no traducido del ARNm de la proteína de la cubierta del virus del mosaico de la alfalfa (ARN 4 del AMV) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); líder del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) en Molecular Biology of RnA, ed. Cech (Liss, Nueva York), pp. 237-256); y líder del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Véase también, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965:968 También se pueden utilizar otros procedimientos conocidos para mejorar la traducción, por ejemplo, los intrones, y similares.

Al preparar el casete de expresión, los diversos fragmentos de ADN pueden ser manipulados, de manera que las secuencias de ADN estén en la orientación adecuada y, según sea apropiado, en el marco de lectura adecuado. Con este fin, se pueden emplear adaptadores o enlazadores para unir los fragmentos de ADN o se pueden realizar otras manipulaciones para proporcionar sitios de restricción convenientes, eliminar el ADN superfluo, eliminar los sitios de restricción o similares. Para ello, pueden intervenir la mutagénesis in vitro, la reparación de cebadores, la restricción, el recocido, las resustituciones, por ejemplo, las transiciones y versiones trans.

En la práctica de la invención pueden utilizarse varios promotores. Los promotores pueden seleccionarse en función del resultado deseado. Los ácidos nucleicos pueden combinarse con promotores constitutivos, preferidos por los tejidos u otros para la expresión en las plantas. Tales promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor central del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos divulgados en WO 99/43838 y Patente U.S. No. 6.072.050, el promotor central del CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); la actina del arroz (McEl-roy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); la ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581- 588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor de ALS (Patente de EE.u U. No. 5.659.026,), y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, La patente U.S. No. 5.608.149, 5,608,144, 5,604,121, 5,569,597, 5,466,785, 5,399,680, 5,268,463, 5,608,142, y 6,177,611.

Los promotores preferidos por el tejido pueden utilizarse para dirigir la expresión mejorada de mut-PPO dentro de un tejido vegetal particular. Dichos promotores de tejidos preferidos incluyen, pero no se limitan a, promotores de hojas preferidos, promotores de raíces preferidos, promotores de semillas preferidos y promotores de tallos preferidos. Los promotores preferidos por los tejidos son Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38, 7-792, 803 Zangenberg, N.H., etal., Eur. (1997) Mol. Gen Genet. 254, 3-337, 343 Zangenberg, N.H., et al., Eur. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168 Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331-1341 Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112, 2-525, 535 Zangenberg, N.H., et al., Eur. (1996) Plant Physiol. 112, 2-513, 524 Zangenberg, N.H., et al., Eur. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778 Lam (1994) Resultados Probl. Results Probl. Cell Differ. 20; 181- 196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23/6 1129-1138 Matsuoka e/ [alfa]/. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590y Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Estos promotores pueden modificarse, si es necesario, para una expresión débil. En una realización, los ácidos nucleicos de interés se dirigen al cloroplasto para su expresión. De este modo, cuando el ácido nucleico de interés no se inserta directamente en el cloroplasto, el casete de expresión contendrá además una secuencia de orientación al cloroplasto que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito del cloroplasto para dirigir el producto génico de interés a los cloroplastos. Estos péptidos de tránsito son conocidos en la técnica. Con respecto a las secuencias dirigidas al cloroplasto, "operativamente vinculadas" significa que la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito (es decir, la secuencia dirigida al cloroplasto) está vinculada al ácido nucleico mut-PPO de la invención de manera que las dos secuencias son contiguas y están en el mismo marco de lectura. Véase, por ejemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9; 104-126 Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550 Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968 Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; y Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Mientras que las proteínas mut-PPO de la invención incluyen un péptido de tránsito del cloroplasto nativo, cualquier péptido de tránsito del cloroplasto conocido en la técnica puede fusionarse a la secuencia de aminoácidos de una proteína mut-PPO madura de la invención mediante la unión operable de una secuencia de orientación al cloroplasto al extremo 5' de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína mut-PPO madura de la invención. Las secuencias dirigidas al cloroplasto son conocidas en la técnica e incluyen la subunidad pequeña del cloroplasto de la ribulosa-l,5-bisfosfato carboxilasa (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol.

30:769-780 Schnelletal. (1991) J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342); 5 -(enolpiruvil)shikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) (Archer et al. (1990) J. Bioen-erg. Biomemb. 22(6):789-810); triptófano sintasa (Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem.

270(11):6081-6087); plastocianina(Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363); corismato sintasa (Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457); y la proteína de unión a la clorofila a/b que recolecta la luz (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263; 14996-14999. Véase también Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9; 104- 126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550 Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol.

84:965-968 Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196; 1414-1421y Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Los procedimientos de transformación de cloroplastos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. ScL USA 87:8526-8530 Svab y Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917 Svab y Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El procedimiento se basa en la entrega de partículas de ADN que contienen un marcador seleccionable y la orientación del ADN al genoma de los plástidos a través de la recombinación homóloga. Además, la transformación plastidial puede llevarse a cabo mediante la transactivación de un transgén silencioso transportado por los plastidios mediante la expresión preferente en el tejido de una ARN polimerasa codificada en el núcleo y dirigida por los plastidios. Un sistema de este tipo ha sido reportado en McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305. Los ácidos nucleicos de interés para ser dirigidos al cloroplasto pueden ser optimizados para su expresión en el cloroplasto para tener en cuenta las diferencias en el uso de codones entre el núcleo de la planta y este orgánulo. De este modo, los ácidos nucleicos de interés pueden sintetizarse utilizando codones preferidos por los cloroplastos. Véase, por ejemplo, Patente U.S. No. 5.380.831.

En una realización preferida, el ácido nucleico mut-PPO comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1, b) un polinucleótido que codifica una variante del polipéptido que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y en el que la variante del polipéptido de la SEQ ID NO: 2 en b) incluye: el aminoácido en la posición 128 es Alanina, y el aminoácido en la posición 420 es Metionina, Isoleucina o Leucina.

Preferentemente, el casete de expresión comprende además una región reguladora de la iniciación de la transcripción y una región reguladora de la iniciación de la traducción que son funcionales en la planta. Mientras que los polinucleótidos de la invención se utilizan como genes marcadores seleccionables para la transformación de plantas, los casetes de expresión de la invención pueden incluir otro gen marcador seleccionable para la selección de células transformadas. Los genes marcadores seleccionables, incluidos los de la presente invención, se utilizan para la selección de células o tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen, pero no se limitan a, los que codifican la resistencia a los antibióticos, como los que codifican la neomicina fosfotransferasa II (NEO) y la higromicina fosfotransferasa (HPT), así como los genes que confieren resistencia a los compuestos herbicidas, como el glufosinato de amonio, el bromoxinil, las imidazolinonas y el 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Véase en general, Yarranton (1992) Curr. Opinen. Biotecnología. 3 :506-511 Christophers on et al (1992) Proc. Natl. Acad. ScL USA 89:6314-6318 Yao et al. (1992) Cell 71:63-72 Reznikoff (1992) Mol Microbiol 6:2419-2422; Barkley et al (1980) en The Operon, pp. 177 220 Hu et al (1987) Cell 48:555-566 Brown et al (1987) Cell 49:603-612; Figge et al (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al (1989) Proc. Acad. Nat. AcL USA 86:5400-5404 Fuerst et al (1989) Proc. Acad. Nat. ScL USA 86:2549-2553; Deuschle et al (1990) Science 248:480-483 Gossen (1993) Ph.D. Tesis, Universidad de Heidelberg Reines et al (1993) Proc. Acad. Nat. ScL USA 90: 1917-1921 Labow et al (1990) Mol Cell Biol 10:3343-3356 Zambretti et al (1992) Proc.

Acad. Nat. ScL USA 89:3952-3956 Bairn et al (1991) Proc. Acad. Nat. ScL USA 88:5072-5076 Wyborski et al (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653 Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol Struc. Biol 10: 143- 162 Degenkolb et al (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35; 1591-1595 Kleinschnidt et al (1988) Biochemistry 27: 1094-1104 Bonin (1993) Ph.D. Tesis, Universidad de Heidelberg Gossen et al (1992) Proc. Acad. Nat. ScL USA 89:5547-5551; Oliva et al (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919 Hlavka et al (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin) Gill et al (1988) Nature 334:721-724. La lista anterior de genes marcadores seleccionables no pretende ser limitativa. En la presente invención puede utilizarse cualquier gen marcador seleccionable.

La invención proporciona además un vector de expresión recombinante aislado que comprende el casete de expresión que contiene un ácido nucleico mut-PPO como se ha descrito anteriormente, en el que la expresión del vector en una célula huésped da como resultado una mayor tolerancia a un herbicida derivado de la benzoxazinona en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula huésped. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es el "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN de doble cadena en el que se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que se pueden ligar segmentos adicionales de ADN al genoma viral. Algunos vectores son capaces de replicarse de forma autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, los vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped al introducirse en ella, y por tanto se replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están vinculados operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión" En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante suelen tener la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse indistintamente, ya que el plásmido es la forma de vector más utilizada. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión, como los vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados), que cumplen funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en base a las células huésped que se van a utilizar para la expresión, que está operablemente unida a la secuencia del ácido nucleico que se va a expresar. Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y las que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en determinadas células huésped o en determinadas condiciones. Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión del polipéptido deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células huésped para producir así polipéptidos o péptidos, incluyendo polipéptidos o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe en el presente documento (por ejemplo, polipéptidos mut-PPO, polipéptidos de fusión, etc.).

En una realización preferida de la presente invención, los polipéptidos mut-PPO se expresan en plantas y células vegetales como células vegetales unicelulares (como las algas) (Véase Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1(3):239-251 y sus referencias) y células vegetales de plantas superiores (por ejemplo, las espermatófitas, como las plantas de cultivo). Un polinucleótido mut-PPO puede ser "introducido" en una célula vegetal por cualquier medio, incluyendo la transfección, la transformación o la transducción, la electroporación, el bombardeo de partículas, la agroinfección, la biolística y similares.

Se pueden encontrar procedimientos adecuados para transformar o transfectar células huésped, incluyendo células vegetales, en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, ed: Gartland y Davey, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Como la mayor tolerancia a los herbicidas derivados de la benzoxazinona es un rasgo general que se desea heredar en una amplia variedad de plantas como el maíz, el trigo, el centeno, la avena, el triticale, el arroz, la cebada, la soja, el cacahuete, el algodón, la colza y la canola, la manihot, el pimiento, el girasol y los tagetes, las solanáceas como la patata tabaco, berenjena y tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, plantas arbustivas (café, cacao, té), especies de Salix, árboles (palma aceitera, coco), hierbas perennes y cultivos forrajeros, estas plantas de cultivo son también plantas objetivo preferidas para una ingeniería genética como una realización más de la presente invención. En una realización preferida, la planta es una planta de cultivo. Los cultivos forrajeros incluyen, pero no se limitan a, el pasto de trigo, el pasto canario, el bromegrass, el pasto silvestre, el pasto azul, el pasto de huerta, la alfalfa, el salfoin, el trébol de patas de pájaro, el trébol alsike, el trébol rojo y el trébol dulce.

En una realización de la presente invención, la transfección de un polinucleótido mut-PPO en una planta se logra mediante la transferencia genética mediada por Agrobacterium . Un procedimiento de transformación conocido por los expertos en la técnica es la inmersión de una planta en flor en una solución de Agrobacteria , en la que la Agrobacteria contiene el ácido nucleico mut-PPO, seguida de la reproducción de los gametos transformados. La transformación de plantas mediada por Agrobacterium puede llevarse a cabo utilizando, por ejemplo, el GV3101(pMP90) (Koncz y Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396) o la cepa LBA4404 (Clontech) de Agrobacterium tumefaciens. La transformación puede realizarse mediante técnicas estándar de transformación y regeneración (Deblaere et al., 1994, Nucl. Acids.

Res. 13:4777-4788 Gelvin, Stanton B. y Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2nd Ed. - Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995.-en Sect., RingbucZentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4 Glick, Bernard R. y Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton : CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Por ejemplo, la colza puede transformarse mediante la transformación del cotiledón o del hipocótilo (Moloney et al., 1989, Plant Cell Report 8:238-242 De Block et al., 1989, Plant Physiol. 91:694-701). El uso de antibióticos para Agrobacterium y la selección de plantas depende del vector binario y de la cepa de Agrobacterium utilizada para la transformación. La selección de la colza se realiza normalmente utilizando kanamicina como marcador vegetal seleccionable. La transferencia de genes al lino mediada por Agrobacterium puede realizarse utilizando, por ejemplo, una técnica descrita por Mlynarova et al., 1994, Plant Cell Report 13:282-285. Además, la transformación de la soja puede realizarse utilizando, por ejemplo, una técnica descrita en Patente europea No. 0424 047, La patente U.S. No. 5.322.783, Patente europea No. 0397 687, Patente U.S. No. 5.376.543 o Patente U.S. No. 5.169.770. La transformación del maíz puede lograrse mediante el bombardeo de partículas, la captación de ADN mediada por polietilenglicol o mediante la técnica de la fibra de carburo de silicio. (Véase, por ejemplo, Freeling y Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: Nueva York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Un ejemplo específico de transformación del maíz se encuentra en la Patente U.S. No. 5.990.387 y un ejemplo específico de transformación de trigo se puede encontrar en Solicitud PCT No. WO 93/07256.

Según la presente invención, el polinucleótido mut-PPO introducido puede mantenerse en la célula vegetal de forma estable si se incorpora a un replicón autónomo no cromosómico o se integra en los cromosomas de la planta. Alternativamente, el polinucleótido mut-PPO introducido puede estar presente en un vector extracromosómico no replicante y expresarse transitoriamente o ser transitoriamente activo. En una realización, puede crearse un microorganismo recombinante homólogo en el que el polinucleótido mut-PPO se integra en un cromosoma, se prepara un vector que contiene al menos una porción de un gen PPO en el que se ha introducido una deleción, adición o sustitución para alterar, por ejemplo, funcionalmente, el gen PPO endógeno y crear un gen mut-PPO. Para crear una mutación puntual a través de la recombinación homóloga, pueden utilizarse híbridos de ADN-ARN en una técnica conocida como quimeraplastia (Cole-Strauss et al., 1999, Nucleic Acids Research 27(5):1323-1330 y Kmiec, 1999, Gene therapy American Scientist 87(3):240-247). Otros procedimientos de recombinación homóloga en especies de Triticum también son bien conocidos en la técnica y se contemplan para su uso en el presente documento.

En el vector de recombinación homóloga, el gen mut-PPO puede estar flanqueado en sus extremos 5' y 3' por una molécula adicional de ácido nucleico del gen PPO para permitir que se produzca la recombinación homóloga entre el gen mut-PPO exógeno portado por el vector y un gen PPO endógeno, en un microorganismo o planta. La molécula de ácido nucleico de PPO adicional que la flanquea tiene una longitud suficiente para que la recombinación homóloga con el gen endógeno tenga éxito. Normalmente, se incluyen en el vector varios cientos de pares de bases hasta kilobases de ADN flanqueante (tanto en el extremo 5' como en el 3') (véase, por ejemplo, Thomas, K. R., y Capecchi, M. R., 1987, Cell 51:503 para una descripción de los vectores de recombinación homóloga o Strepp et al., 1998, PNAS, 95(8):4368-4373 para la recombinación basada en el ADNc en Physcomitrella patens). Sin embargo, como el gen mut-PPO normalmente difiere del gen PPO en muy pocos aminoácidos, no siempre es necesaria una secuencia de flanqueo. El vector de recombinación homóloga se introduce en un microorganismo o en una célula vegetal (por ejemplo, a través de ADN mediado por polietilenglicol), y las células en las que el gen mut-PPO introducido se ha recombinado homológicamente con el gen PPO endógeno se seleccionan utilizando técnicas conocidas.

Se pueden producir microorganismos recombinantes que contengan sistemas seleccionados que permitan la expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo, la inclusión de un gen mut-PPO en un vector que lo pone bajo el control del operón lac permite la expresión del gen mut-PPO sólo en presencia de IPTG. Estos sistemas de regulación son bien conocidos en la técnica.

Otro aspecto se refiere a las células huésped en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se utilizan indistintamente en este documento. Se entiende que dichos términos se refieren no sólo a la célula en cuestión, sino que también se aplican a la progenie o a la progenie potencial de dicha célula. Dado que pueden producirse ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, dicha progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula madre, pero sigue estando incluida en el ámbito del término tal y como se utiliza en el presente documento. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, un polinucleótido mut-PPO puede expresarse en células bacterianas como C. glutamicum, células de insectos, células de hongos o células de mamíferos (como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS), algas, ciliados, células vegetales, hongos u otros microorganismos como C. glutamicum. Los expertos en la técnica conocen otras células huésped adecuadas.

Una célula huésped de la invención, como una célula huésped procariota o eucariota en cultivo, puede utilizarse para producir (es decir, expresar) un polinucleótido mut-PPO. En consecuencia, se divulgan procedimientos para producir polipéptidos mut-PPO utilizando las células huésped de la invención. El procedimiento comprende cultivar la célula huésped de la invención (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un polipéptido mut-PPO, o en la que se ha introducido un gen que codifica un polipéptido de tipo salvaje o mut-PPO) en un medio adecuado hasta que se produzca el polipéptido mut-PPO. El procedimiento puede comprender además el aislamiento de polipéptidos mut-PPO del medio o de la célula huésped. Se divulgan polipéptidos mut-PPO aislados y porciones biológicamente activas de los mismos. Un polipéptido "aislado" o "purificado" o una porción biológicamente activa del mismo está libre de parte del material celular cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante, o de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones del polipéptido mut-PPO en las que el polipéptido está separado de algunos de los componentes celulares de las células en las que se produce de forma natural o recombinante. En una realización, el lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de un polipéptido mut-PPO que tienen menos de aproximadamente el 30 % (por peso seco) de material no mut-PPO (también referido en el presente documento como un "polipéptido contaminante"), más preferentemente menos de aproximadamente el 20 % de material no mut-PPO, aún más preferentemente menos de aproximadamente el 10 % de material no mut-PPO, y más preferentemente menos de aproximadamente el 5 % de material no mut-PPO.

Cuando el polipéptido mut-PPO, o la porción biológicamente activa del mismo, se produce de forma recombinante, también es preferible que esté sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, que el medio de cultivo represente menos de aproximadamente el 20%, más preferentemente menos de aproximadamente el 10%, y más preferentemente menos de aproximadamente el 5 % del volumen de la preparación de polipéptidos. La expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas" incluye las preparaciones del polipéptido mut-PPO en las que el polipéptido está separado de los precursores químicos u otras sustancias químicas que intervienen en la síntesis del polipéptido. En una realización, el lenguaje "sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de un polipéptido mut-PPO que tienen menos de aproximadamente el 30 % (en peso seco) de precursores químicos o productos químicos no mut-PPO, más preferentemente menos de aproximadamente el 20 % de precursores químicos o productos químicos no mut-PPO, aún más preferentemente menos de aproximadamente el 10 % de precursores químicos o productos químicos no mut-PPO, y más preferentemente menos de aproximadamente el 5 % de precursores químicos o productos químicos no mut-PPO. En realizaciones preferidas, los polipéptidos aislados, o porciones biológicamente activas de los mismos, carecen de polipéptidos contaminantes del mismo organismo del que se deriva el polipéptido mut-PPO. Típicamente, tales polipéptidos se producen mediante la expresión recombinante de, por ejemplo, un polipéptido mut-PPO en plantas distintas de, o en microorganismos como C. glutamicum, ciliados, algas u hongos.

Como se ha descrito anteriormente, la presente invención enseña composiciones y procedimientos para aumentar la tolerancia a los derivados de la benzoxazinona de una planta o semilla de cultivo en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta o semilla. En una realización preferida, la tolerancia a los derivados de la benzoxazinona de una planta o semilla de cultivo se incrementa de tal manera que la planta o semilla puede resistir una aplicación de herbicida derivado de la benzoxazinona de aproximadamente 1-1000 g ai ha-1, más preferentemente 20-160 g ai ha-1, y más preferentemente 40-80 g ai ha-1. Tal y como se utiliza en este documento, "resistir" una aplicación de herbicida derivado de la benzoxazinona significa que la planta no muere o no resulta dañada por dicha aplicación.

Además, la presente invención proporciona procedimientos que implican el uso de al menos un herbicida derivado de la benzoxazinona como se describe en detalle más arriba.

En estos procedimientos, el herbicida derivado de la benzoxazinona puede aplicarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, el tratamiento de semillas, el tratamiento del suelo y el tratamiento foliar. Antes de su aplicación, el herbicida derivado de la benzoxazinona puede convertirse en las formulaciones habituales, por ejemplo, soluciones, emulsiones, suspensiones, polvos, pastas y gránulos. La forma de uso depende de la finalidad particular prevista; en cada caso, debe garantizar una distribución fina y uniforme del compuesto según la invención.

Al proporcionar a las plantas que tienen una mayor tolerancia al herbicida derivado de la benzoxazinona, se puede emplear una amplia variedad de formulaciones para proteger a las plantas de las malezas, con el fin de mejorar el crecimiento de las plantas y reducir la competencia por los nutrientes. Un herbicida derivado de la benzoxazinona puede utilizarse por sí mismo para el control de las malezas en preemergencia, postemergencia, antes de la plantación y en el momento de la plantación en las zonas que rodean a las plantas de cultivo descritas en el presente documento, o puede utilizarse una formulación de herbicida derivado de la benzoxazinona que contenga otros aditivos. El herbicida derivado de la benzoxazinona también puede utilizarse como tratamiento de semillas. Los aditivos que se encuentran en la formulación de un herbicida derivado de la benzoxazinona incluyen otros herbicidas, detergentes, adyuvantes, agentes esparcidores, agentes adherentes, agentes estabilizadores o similares. La formulación del herbicida derivado de la benzoxazinona puede ser una preparación húmeda o seca y puede incluir, pero no se limitan a, polvos fluidos, concentrados emulsionables y concentrados líquidos. El herbicida derivado de la benzoxazinona y las formulaciones herbicidas pueden aplicarse de acuerdo con los procedimientos convencionales, por ejemplo, mediante pulverización, riego, espolvoreo o similares.

Las formulaciones adecuadas se describen en detalle en PCT/EP2009/063387 y en PCT/EP2009/063386.

También debe entenderse que lo anterior se refiere a las realizaciones preferidas de la presente invención y que pueden realizarse numerosos cambios en la misma sin apartarse del alcance de la invención. La invención se ilustra además con los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse en modo alguno como una imposición de limitaciones al alcance de la misma. Por el contrario, ha de entenderse claramente que puede recurrirse a otras variadas realizaciones, modificaciones y equivalentes de las mismas, que, tras leer la descripción expuesta en el presente documento, pueden sugerirse a los expertos en la técnica sin apartarse del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Mutagénesis dirigida al sitio de la PPO de Amaranthus

Clonación de la PPO de Aramanthus

La secuencia de codificación de Amaranthus tuberculatus para las isotermas susceptibles y resistentes a la PPO, y las combinaciones mutantes, (SEQ ID No: 1, 3, 5, 7) fueron sintetizados y clonados por Geneart (Geneart AG, Regensburg, Alemania).

Los plásmidos se aislaron de E. coli TOP10 realizando una minipreparación de plásmidos y se confirmaron mediante secuenciación de ADN.

Expresión y purificación de PPO recombinante de tipo salvaje y mutante

(Tomado de: FranckE. Dayan, Pankaj R. Daga, Stephen O. Duke, Ryan M. Lee, PatrickJ. Tranel, Robert J. Doerksen. Biochemical and structural consequences of a glycine deletion in the a-8 helix of protoporphyrinogen oxidase. Biochimica et Biophysica Acta 1804 (2010), 1548-56)

Los clones en el vector pRSET se transformaron en la cepa BL21(DE3)-pLysS de E. coli. Las células se cultivaron en 250 ml de LB con 100 j g ml -1 de carbenicilina, agitando toda la noche a 37 °C. Los cultivos se diluyeron en 1 L de LB con antibiótico y se cultivaron a 37 °C agitando durante 2 h, se indujeron con 1 mM de IPTG y se cultivaron a 25 °C agitando durante 5 horas más. Las células se recolectaron por centrifugación a 1600 * g, se lavaron con 0,09 % de NaCl y se almacenaron a -80°C.

Las células se lisaron utilizando una prensa francesa a 140 MPa en 50 mM de fosfato de sodio, pH 7,5, 1 M de NaCl, 5 mM de imidazol, 5 % de glicerol y 1 j g ml-1 de leupeptina. Tras la lisis, se añadieron 0,5 U de benzonasa (Novagen, EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ) y PMSF (concentración final de 1 mM). Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 3000 * g. Las proteínas PPO marcadas con His se purificaron en una columna Hitrap Chelating HP activada con níquel (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ) equilibrada con 20 mM de fosfato sódico, pH 8,0, 50 mM de NaCl, 5 mM de imidazol, 5 mM de MgCl2, 0,1mM de EDTAy 17 % de glicerol.

La PPO se eluyó con 250 mM de imidazol. La proteína activa se desalinizó en una columna PD-10 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ) equilibrada con un tampón de fosfato sódico 20 mM, pH 7,5, 5 mM MgCI2, 1 mM EDTA y 17 % de glicerol. Cada litro de cultivo proporcionó aproximadamente 10 mg de PPO pura, que se almacenó a -20 °C hasta ser utilizada en los ensayos.

Ensayo de actividad PPO

Ensayo de la enzima PPO (no recombinante). La proteína de la PPO (EC 1.3.3.4) se extrajo de coleóptiles o brotes (150 g de peso fresco) de plántulas de maíz, hierba mora, gloria de la mañana y hoja de terciopelo cultivadas en la oscuridad, como se ha descrito anteriormente (Grossmann et al. 2010). Antes de la cosecha, las plántulas se dejaron reverdecer durante 2 horas en la luz para conseguir las mayores actividades enzimáticas específicas en las fracciones de tilacoides a bajas concentraciones de clorofila. A altas concentraciones de clorofila se produce un apagado significativo de la fluorescencia, lo que limita la cantidad de tilacoides verdes que pueden utilizarse en el ensayo. Los materiales vegetales se homogeneizaron en frío con una batidora Braun utilizando una relación de peso fresco a volumen de 1:4. El tampón de homogeneización estaba compuesto por tris(hidroximetil)aminometano (Tris)-HCI (50 mM; pH 7,3), sacarosa (0,5 M), cloruro de magnesio (1 mM), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (1 mM) y albúmina de suero bovino (2 g L'1). Tras la filtración a través de cuatro capas de Miracloth, se obtuvieron preparaciones de plástidos crudos después de centrifugarlos a 10 000 x g durante 5 minutos y resuspenderlos en tampón de homogeneización antes de centrifugarlos a 150 x g durante 2 minutos para eliminar los restos celulares crudos. El sobrenadante se centrifugó a 4000 x g durante 15 minutos y la fracción de pellas se resuspendió en 1 ml de un tampón que contenía Tris-HCI (50 mM; pH 7,3), EDTA (2 mM), leupeptina (2 pM), pepstatina (2 pM) y glicerol (200 ml L’1) y se almacenó a -80°C hasta su uso. La proteína se determinó en el extracto enzimático con albúmina de suero bovino como estándar. La actividad de la PPO se ensayó fluorométricamente monitorizando la tasa de formación de Proto a partir del protoporfirinógeno IX reducido químicamente en condiciones de velocidad inicial. La mezcla de ensayo consistió en Tris-HCI (100 mM; pH 7,3), e Dt A (1 mM), ditiotreitol (5 mM), Tween 80 (0,085%), protoporfirinógeno IX (2 pM) y 40 pg de proteína extraída en un volumen total de 200 pl. La reacción se inició mediante la adición del sustrato protoporfirinógeno IX a 22°C. El saflufenacil, la flumioxazina y el butafenacil se prepararon en una solución de dimetilsulfóxido (DMSO) (concentración de 0,1 mM de DMSO en el ensayo) y se añadieron a la mezcla del ensayo en concentraciones de 0,005 pM a 5 pM antes de la incubación. La fluorescencia se monitorizó directamente a partir de la mezcla del ensayo utilizando un POLARstar Optima / Galaxy (BMG) con excitación a 405 nm y emisión monitorizada a 630 nm. La actividad no enzimática en presencia del extracto inactivado por el calor fue insignificante. La inhibición de la actividad enzimática inducida por el herbicida se expresó como porcentaje de inhibición en relación con los controles no tratados. Las concentraciones molares del compuesto necesarias para una inhibición enzimática del 50 % (valores IC50) se calcularon ajustando los valores a la ecuación dosis-respuesta mediante un análisis de regresión no lineal.

Ensayo de la enzima PPO (recombinante). Proto se adquirió en Sigma-Aldrich (Milwaukee,WI). El protógeno se preparó según Jacobs y Jacobs (N.J. Jacobs, J.M. Jacobs, Assay for enzymatic protoporphyrinogen oxidation, a late step in heme synthesis, Enzyme 28 (1982) 206-219). Los ensayos se realizaron en 100 mM de fosfato de sodio, pH 7,4, con 0,1 mM de EDTA, 0,1 % de Tween 20, 5 j M deFAD y 500 mM de imidazol. Curvas dosis-respuesta con los inhibidores de la PPO acifluorfeno, lactofeno, benzoxazinona 1.a.35, o derivados de benzoxazinona preferidos (donde X es O o S, R4 es hidrógeno, alquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C6, alquenilo C3-C6, haloalquenilo C3-C6, alquinilo C3-C6, alquinilo C3-C6, alcoxi C1-C6 o cicloalquilo-alquilo C3-C6-C1-C6, R5 es hidrógeno, NH2, alquilo C1-C6 o alquinilo C3-C6, R6 es hidrógeno o alquilo C1-C6, o una combinación de ellos), se mide en presencia de 150 j M de Protógeno. Los anchos de banda de excitación y emisión se fijaron en 1,5 y 30 nm, respectivamente. Todos los ensayos se realizaron por duplicado o triplicado y se midieron utilizando un POLARstar Optima / Galaxy (BMG) con excitación a 405 nm y emisión monitorizada a 630 nm.

Los valores de respuesta a la dosis (IC50) para las enzimas PPO sustituidas son mayores que el valor IC50 para la enzima PPO de tipo salvaje (no sustituida) (Tabla 4a y 4ab). Esto indica que estas enzimas PPO sustituidas tienen una resistencia inherente a la benzoxazinona y a algunos de los derivados de la benzoxazinona probados. Las enzimas PPO sustituidas dG210 y R128L son enzimas PPO sustituidas conocidas que se encuentran en Amaranthus tuberculatus y han demostrado ser responsables de la resistencia de la PPO in planta a una variedad de herbicidas PPO (Dayan et al., 2010, Biochimica et Biophysica Acta, 1804:1548). Esto indica que las otras enzimas PPO sustituidas enumeradas, con un valor IC50 más alto que dG210 o R128L, son también enzimas PPO sustituidas que son responsables de la resistencia in planta contra una variedad de herbicidas PPO, incluyendo la benzoxazinona 1.a.35 (Tabla 4a) y los derivados de la benzoxazinona enumerados (Tabla 4b). Todas las enzimas PPO sustituidas muestran una actividad enzimática comparable, cambio de unidad de fluorescencia por minuto (FU/min) en comparación con la enzima PPO de tipo salvaje (Tabla 4a). Además, todos los valores de actividad de las enzimas PPO sustituidas son mayores que la enzima PPO sustituida dG210. La enzima PPO sustituida dG210 es suficientemente activa para su funcionamiento in planta . Esto indica que todas las demás enzimas PPO sustituidas indicadas son también suficientemente activas para la función in planta .

Tabla 4a: Valores IC50 (M) para la enzima PPO de tipo salvaje y sustituida por aminoácidos, para el inhibidor benzoxazinona 1.a.35.

Ejemplo 2: Cribado de células de algas mutagénicas para identificar clones tolerantes a herbicidas y mutaciones causantes en los genes de la PPO.

Para generar mutaciones que confieran resistencia a los herbicidas derivados de la benzoxazinona en los genes de la PPO, se puede utilizar la mutagénesis química o UV. Especialmente los organismos unicelulares como Chlamydomonas reinhardtii o Scenedesmus obliquus son útiles para identificar las mutaciones dominantes en la resistencia a los herbicidas.

Las células de algas Chlamydomonas reinhardtii de las cepas CC-503 y CC-1691 (Duke University, Durham, USA) se propagan en medio TAP (Gorman y Levine (1965) PNAS 54: 1665-1669) mediante agitación constante a 100 rpm, 22°C y una iluminación de luz de 30 jm ol Phot * m-2 * s-2 Scenedesmus obliquus (Universidad de Gottingen, Alemania) se propagan en medio de algas como se describe (Bogery Sandmann, (1993) En: Target assays for modern herbicides and 15 related phytotoxic compounds, Lewis Publishers) en las mismas condiciones de cultivo mencionadas para Chlamydomonas. El cribado de compuestos se realiza con una iluminación de 450 jm ol Phot * m-2 * s-2

Las cepas sensibles de Chlamydomonas reinhardtii o Scenedesmus obliquus se mutan con etilmetanosulfonato (EMS) 0,14 M durante 1 h, tal como se describe en Loppes (1969, 20 Mol Genet 104: 172-177) Las cepas tolerantes se identifican mediante el cribado de células mutagénicas en placas de solución nutritiva sólida que contienen el herbicida derivado de la benzoxazinona de interés en concentraciones de bajas a letales dependiendo de la actividad del compuesto en la cepa de algas específica.

La amplificación de los genes PPO de Chlamydomonas reinhardii de tipo salvaje y resistente a partir de ADN genómico o de ADN de copia como plantilla se realiza mediante técnicas estándar de PCR con oligonucleótidos de ADN. Las mutaciones se identifican comparando las secuencias de PPO de tipo salvaje y mutante mediante la herramienta de alineación de secuencias Align X (Vector NTI Advance Software Version 10.3, Invitrogene, Carlsbad, CA, USA).

La figura 2 muestra la selección de cepas de Chlamydomonas reinhardtii resistentes al herbicida derivado de la benzoxazinona 1.a.35. (A) Células mutagénicas sembradas en medio sólido sin agente de selección. (B) Células mutagénicas sembradas en medio sólido con 1x10-7 M de benzoxazinona-derivado I.a.35. Las células resistentes al herbicida derivado de la benzoxazinona forman colonias (marcadas con un círculo y numeradas como 33, 34, 35 y 36), mientras que las células susceptibles no crecen. El mayor número de colonias en la placa A en comparación con la B, indica que las colonias de la placa B son resistentes al derivado de la benzoxazinona I.a.35.

La figura 3 muestra el recrecimiento de cepas seleccionadas de Chlamydomonas reinhardtii, resistentes al herbicida derivado de la benzoxazinona 1.a.35. (A) Células de tipo salvaje en medio líquido sin agente de selección. (B) Células de tipo salvaje en medio líquido que contiene un derivado de benzoxazinona I.a.35 creciente (entre 1x10-9 - 5x10-6 M). (C) Células mutagénicas en medio líquido sin agente de selección. (D1, D2, E1, E2) Cepas mutagénicas y seleccionadas en medio líquido, conteniendo un derivado creciente de la benzoxazinona I.a.35 (entre 1x10'9 - 5x10'6 M). Las cepas resistentes al herbicida derivado de la benzoxazinona 1.a.35, cultivan a un color más oscuro que indica el crecimiento. Las cepas susceptibles no se cultivan y permanecen de color claro. La mayor densidad de células en el medio líquido con células en crecimiento es responsable del color más oscuro. Los cultivos de menor densidad aparecen más claros o completamente claros.

Ejemplo 3: Cribado de una población de A rabidopsis thaliana mutagenizada por EMS para identificar plantas tolerantes a herbicidas e identificación de mutaciones causantes en los genes PPO.

Una población M2 de plantas de Arabidopsis thaliana tratadas con EMS se obtiene de Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA). El cribado se realiza colocando las semillas de Arabidopsis en una solución nutritiva de Murashige Skoog de media potencia que contiene un 0,5 % de agente gelificante Gelrite® y un herbicida derivado de la benzoxazinona (de 0,1 a 500 ^|jM), dependiendo de la actividad del compuesto. Las placas se incuban en una cámara de crecimiento en ciclos de 16:8h de luz:oscuridad a 22 °C durante un máximo de tres semanas. Las plantas tolerantes que muestran fenotipos de blanqueo menos intensos se plantan en el suelo y se cultivan hasta la madurez en condiciones de invernadero. En la etapa de planta en roseta, se cosechan discos de hojas de plantas tolerantes al herbicida derivado de la benzoxazinona para aislar el ADN genómico con DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) o el ARNm total con RNeasy Plant Mini Kit (Quagen, Hilden, Alemania).

Las secuencias de PPO se amplifican mediante técnicas estándar de PCR a partir de ADN genómico con los respectivos oligonucleótidos. Para la amplificación de la PPO a partir del ARNm, se sintetizan copias de ADN in vitro utilizando la transcriptasa inversa Superscript III (Invitrogene, Carlsbad, CA, USA). Tras clonar los productos de la PCR en un plásmido de secuenciación estándar, la secuencia de ADN de los genes PPO mutados se identifica mediante técnicas de secuenciación estándar. Las mutaciones se identifican comparando las secuencias de PPO de tipo salvaje y mutante mediante la herramienta de alineación de secuencias Align X (Vector NTI Advance Software Version 10.3, Invitrogene, Carlsbad, CA, USA).

Ejemplo 4: Ingeniería de plantas tolerantes a herbicidas derivados de la benzoxazinona que tienen secuencias de PPO de tipo salvaje o mutadas.

se producen plantas de soja (Glycine max) tolerantes a herbicidas derivados de la benzoxazinona mediante un procedimiento descrito por Olhoft et al. (patente U.S. 2009/0049567). Las secuencias de PPO mutadas se clonan con técnicas de clonación estándar como se describe en Sambrook et al. (Clonación molecular (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press) en un vector binario que contiene el casete del gen marcador de resistencia (AHAS) y la secuencia de PPO mutada (marcada como GOI) entre el promotor de la ubiquitina (PcUbi) y la secuencia del terminador de la nopalina sintasa (NOS). Los plásmidos binarios se introducen en Agrobacterium tumefaciens para la transformación de plantas. Los constructos de plásmidos se introducen en las células del meristemo axilar de la soja en el nodo primario de los explantes de las plántulas mediante la transformación mediada por Agrobacterium . Tras la inoculación y el co-cultivo con Agrobacterias, los explantes se transfieren a medios de introducción de brotes sin selección durante una semana. Los explantes se transfieren posteriormente a un medio de inducción de brotes con 1-3 pM de imazapyr (Arsenal) durante 3 semanas para seleccionar las células transformadas. Los explantes con almohadillas de callo/brotes sanos en el nodo primario se transfieren entonces a un medio de elongación de brotes que contiene 1-3 pM de imazapir hasta que se elongue un brote o el explante muera. Las plántulas transgénicas se enraízan, se someten a un análisis TaqMan para detectar la presencia del transgén, se transfieren al suelo y se cultivan hasta su madurez en invernadero. La transformación de plantas de maíz se realiza mediante un procedimiento descrito por McElver y Singh (WO 2008/124495). Los constructos de vectores de transformación de plantas que contienen secuencias de PPO mutadas se introducen en embriones inmaduros de maíz a través de la transformación mediada por Agrobacterium .

Las células transformadas se seleccionan en medios de selección suplementados con 0,5-1,5 pM de imazetapir durante 3-4 semanas. Las plántulas transgénicas se regeneran en medios de regeneración de plantas y se enraízan después. Las plántulas transgénicas se someten a un análisis TaqMan para detectar la presencia del transgén antes de trasplantarlas a una mezcla de macetas y cultivarlas hasta su madurez en el invernadero. Arabidopsis thaliana se transforma con secuencias de PPO mutadas mediante el procedimiento de inmersión floral, tal y como describen McElver y Singh (WO 2008/124495). La transformación de Oryza sativa (arroz) se lleva a cabo mediante la transformación de protoplastidios, tal y como describen Peng et al. (US 6653529) Se prueba la tolerancia mejorada a los herbicidas derivados de la PPO en estudios de invernadero en plantas transgénicas T0 o T1 de soja, maíz, arroz y Arabidopsis thaliana que contienen secuencias de PPO mutadas.

Ejemplo 5: Ensayo de complementación y cribado funcional.

(véase también: William L. Patzoldt, Aaron G. Hager, Joel S. McCormick y Patrick J. Tranel. A codon deletion confers resistanceto herbicides inhibiting protoporphyrinogen oxidase. 103, 33, 5151 a 34).

Generación de bibliotecas PPO:

Las bibliotecas de genes de PPO se generan mediante mutagénesis aleatoria (PCR propensa a errores) o mutagénesis de saturación del gen de PPO (Geneart AG, Regensburg, Alemania), y se clonan en vectores de expresión (pBAD-TOPO) para el cribado in vivo. Además, se ha clonado una versión acortada de los genes PPO de tipo salvaje y mutante en un vector de expresión pBAD-TOPO (Invitrogen), de modo que la traducción comenzó en el segundo codón de inicio ATG. El ADNc de la PPO se amplifica por PCR utilizando el cebador directo 5-CAGGAATAAGTAATGGCAACTCTGAG- 3, que contiene un sitio de unión al ribosoma (AGGA) y un codón de inicio ATG, y el cebador inverso 5-GAAGAATTACGCGGTCTTCTCATC-3 que contiene un codón de parada. Se utilizan plásmidos susceptibles y putativamente resistentes a la PPO para transformar la cepa mutante hemG de E. coli, SASX38, amablemente proporcionada por Harry Dailey (Universidad de Georgia, Athens, GA). La cepa SASX38 de E. coli se mantiene en medio LB complementado con 20 pg*ml'1 de hematina. Las colonias transformadas de SASX38, y los controles no transformados, se someten a pruebas para comprobar su capacidad de crecimiento en medio LB solo o complementado con 20 pg*ml'1 de hematina o con el inhibidor de la PPO lactofeno y herbicidas derivados de la benzoxazinona que van de 0,01 a 500 pM, y se incuban a 37 °C durante 14 horas.

El ensayo de complementación y cribado utilizó una cepa mutante hemG (PPO) de Escherichia coli, SASX38, (Sasarman, A., Chartrand, P., Lavoie, M., Tardif, D., Proschek, R. & Lapointe, C. (1979) J. Gen. Microbiol. 113, 297 303.) para evaluar el efecto de las mutaciones de la PPO en las respuestas a los herbicidas de la PPO. La cepa SASX38 crece muy lentamente a menos que se le suministre hemo exógeno o se le rescate con una fuente alternativa de PPO. Además, dado que la E. coli de tipo salvaje es naturalmente tolerante a los inhibidores de la PPO, el uso de la cepa SASX38 permitió un ensayo relativamente directo de la sensibilidad a los herbicidas de las PPOs de tipo salvaje y mutantes de A. tuberculatus. La cepa SASX38 de E. coli se transforma con constructos de plásmidos que codifican la PPO de tipo salvaje y mutante. Los constructos son capaces de rescatar el crecimiento de la cepa SASX38 de E. co li, lo que indica que los genes PPO codifican proteínas funcionales. Sin embargo, la suplementación del medio de crecimiento con herbicidas derivados de la benzoxazinona inhibió drásticamente el crecimiento de E. coli transformada con la PPO de tipo salvaje, pero no el de E. coli transformada con algunas PPO mutantes.

Ejemplo 6: Condiciones de cultivo de tejidos.

Se ha desarrollado un ensayo de mutagénesis en cultivo de tejidos in vitro para aislar y caracterizar tejido vegetal (por ejemplo, maíz, tejido de arroz) que es tolerante a los herbicidas inhibidores de la protoporfirinógeno oxidasa, (por ejemplo, saflufenacil, bifenox, diuron, lactofen, butafenacil). El ensayo utiliza la variación somaclonal que se encuentra en el cultivo de tejidos in vitro . Las mutaciones espontáneas derivadas de la variación somaclonal pueden ser potenciadas por mutagénesis química y posterior selección de forma escalonada, en concentraciones crecientes de herbicida.

La presente invención proporciona condiciones de cultivo de tejidos para fomentar el crecimiento de callos de maíz o arroz friables y embriogénicos que son regenerables. Los callos se inician a partir de 4 cultivares diferentes de maíz o arroz que abarcan las variedades Zea mays y Japonica (Taipei 309, Nipponbare, Koshihikari) e Indica (Indica 1), respectivamente. Las semillas se esterilizan en la superficie con etanol al 70 % durante aproximadamente 1 minuto, seguido de lejía comercial Clorox al 20 % durante 20 minutos. Las semillas se enjuagan con agua estéril y se colocan en medios de inducción de callo. Se prueban varios medios de inducción de callo. Las listas de ingredientes de los medios probados se presentan en la Tabla 5.

Tabla 5:

Ejemplo 7: Selección de callos tolerantes a herbicidas.

Una vez que se determinan las condiciones de cultivo de los tejidos, se establecen las condiciones de selección mediante el análisis de la supervivencia de los tejidos en las curvas de muerte con saflufenacil, bifenox, diuron, lactofen, butafenacil, acifluorfen, herbicida derivado de la benzoxazinona. Se realiza un cuidadoso examen de la acumulación del herbicida en el tejido, así como de su persistencia y estabilidad en las células y en los medios de cultivo. Gracias a estos experimentos, se ha establecido una dosis subletal para la selección inicial del material mutado.

Tras el establecimiento de la dosis inicial de saflufenacil, bifenox, diurón, lactofeno, butafenacil, acifluorfeno y herbicida derivado de la benzoxazinona en los medios de selección, los tejidos se seleccionan de forma escalonada aumentando la concentración del inhibidor de la PPO con cada transferencia hasta que se recuperan células que crecieron vigorosamente en presencia de dosis tóxicas. Los callos resultantes se subcultivan de nuevo cada 3-4 semanas a R001M con agente selectivo. Más de 26.000 callos se someten a selección durante 4-5 subcultivos hasta que la presión selectiva supera los niveles tóxicos, según determinan las curvas de muerte y las observaciones del cultivo continuado.

Alternativamente, los cultivos líquidos iniciados a partir de callos en MS711R con agitación lenta y subcultivos semanales. Una vez establecidos los cultivos líquidos, el agente de selección se añade directamente al matraz en cada subcultivo. Tras 2-4 rondas de selección de líquidos, los cultivos se transfieren a filtros en medio sólido R001M para su posterior crecimiento.

Ejemplo 8: Regeneración de plantas.

El tejido tolerante se regenera y se caracteriza molecularmente para las mutaciones de la secuencia del gen de la PPO y/o bioquímicamente para la actividad alterada de la PPO en presencia del agente selectivo. Además, también se secuencian los genes implicados directa y/o indirectamente en las vías de biosíntesis y/o metabolismo del tetrapirrol para caracterizar las mutaciones. Por último, las enzimas que cambian el destino (por ejemplo, el metabolismo, la translocación o la transportación) también se secuencian para mutaciones caracterizadas.

Después de la selección con herbicida, los callos se regeneran utilizando un régimen de medios de R025M durante 10 - 14 días, R026M durante ca. 2 semanas, R327M hasta que se desarrollen brotes bien formados, y R008S hasta que los brotes estén bien enraizados para su traslado al invernadero. La regeneración se lleva a cabo en la luz. No se incluye ningún agente de selección durante la regeneración.

Una vez establecidas las raíces fuertes, los regenerantes M0 se trasplantan al invernadero en macetas cuadradas o redondas. Los trasplantes se mantienen bajo un vaso de plástico transparente hasta que se adaptan a las condiciones del invernadero. El invernadero se ajusta a un ciclo día/noche de 27°C/21°C (80°F/70°F) con luces de sodio de alta presión de 600W que complementan la luz para mantener una duración del día de 14 horas. Las plantas se riegan según las necesidades, dependiendo del tiempo y se fertilizan diariamente.

Ejemplo 9: Análisis de la secuencia.

El tejido foliar se recolecta de plantas clonales separadas para el trasplante y se analiza como individuos. El ADN genómico se extrae utilizando un kit Wizard® 96 Magnetic DNA Plant System (Promega, Patente U.S. No. 6.027.945 & 6,368,800) según las indicaciones del fabricante. El ADN aislado se amplifica por PCR utilizando el cebador directo e inverso apropiado.

La amplificación por PCR se lleva a cabo con la polimerasa de ADN Hotstar Taq (Qiagen) utilizando un programa de termociclado de caída como el siguiente 96°C durante 15 min, seguido de 35 ciclos (96°C, 30 seg; 58°C - 0,2 °C por ciclo, 30 seg; 72°C, 3 min y 30 seg), 10 min a 72°C.

Se verifica la concentración y el tamaño de los fragmentos de los productos de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Los productos PCR desfosforilados se analizan por secuencia directa utilizando los cebadores PCR (DNA Landmarks, o Entelechon). Los archivos de trazas de cromatogramas (.scf) se analizan en busca de mutaciones en relación con el gen de tipo salvaje utilizando Vector NTI Advance 10™ (Invitrogen). A partir de la información de la secuencia, se identifican las mutaciones en varios individuos. El análisis de la secuencia se realiza en los cromatogramas representativos y en la alineación AlignX correspondiente con la configuración por defecto y se edita para llamar a los picos secundarios.

Ejemplo 10: Demostración de la tolerancia a los herbicidas.

Los mutantes y escapes seleccionados se transfieren a pequeñas macetas. Los cultivares de tipo salvaje son germinados a partir de semillas para servir de control.

Después de aprox. 3 semanas después del trasplante, los regenerantes M0 se pulverizan con un pulverizador de oruga con saflufenacil (BAS 800H) o con un derivado de la benzoxazinona I.a.35 complementado con un 0,1 % de aceite de semilla metilado. Después de que las plantas se hayan adaptado a las condiciones del invernadero, un

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para potenciar el crecimiento de una planta de cultivo mediante el control de la vegetación no deseada que rodea a dicha planta de cultivo en un sitio de cultivo, comprendiendo el procedimiento los pasos de:

a) proporcionar, en dicho sitio, una planta que comprenda al menos un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una protoporfirinógeno oxidasa mutada (mut-PPO) que sea resistente o tolerante a un herbicida derivado de la benzoxazinona y

b) aplicar a dicho sitio una cantidad eficaz de dicho herbicida,

en el que la secuencia de nucleótidos de a) comprende una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 1, y en el que la mut-PPO codificada es una variante de la SEQ ID NO: 2 en el que el aminoácido en la posición 128 es Alanina, y el aminoácido en la posición 420 es Metionina, Isoleucina o Leucina ,

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la planta comprende al menos un ácido nucleico heterólogo adicional que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima de tolerancia a los herbicidas.

3. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el herbicida derivado de la benzoxazinona se aplica junto con uno o más herbicidas dirigidos a la PPO.

4. Un ácido nucleico aislado que codifica una mut-PPO, en el que la mut-PPO codificada es una variante de la SEQ ID NO: 2 en la que el aminoácido en la posición 128 es Alanina, y el aminoácido en la posición 420 es Metionina, Isoleucina o Leucina, y en la que la mut-PPO codificada es resistente o tolerante a un herbicida derivado de la benzoxazinona.

5. Una célula vegetal transgénica transformada por el ácido nucleico mut-PPO como se define en la reivindicación 4, en la que la expresión del ácido nucleico en la célula vegetal da lugar a un aumento de la resistencia o la tolerancia a un herbicida derivado de la benzoxazinona en comparación con un tipo salvaje correspondiente de la célula vegetal

6. Una planta transgénica que comprende una célula vegetal como se define en la reivindicación 5, en la que la expresión del ácido nucleico en la planta da lugar a un aumento de la resistencia de la planta al herbicida derivado de la benzoxazinona en comparación con un tipo salvaje correspondiente vegetal.

7. Una planta que expresa un mut-PPO mutagenizado o mut-PPOrecombinante que comprende la SEQ ID NO: 2, en la que la secuencia de aminoácidos difiere de una secuencia de aminoácidos de una PPO de tipo salvaje de una planta correspondiente de tipo salvaje, en la que el aminoácido en la posición 128 es Alanina, y el aminoácido en la posición 420 es metionina, isoleucina o leucina, y en la que la mut-PPO es resistente o tolerante a un herbicida derivado de la benzoxazinona.

8. Una semilla producida por una planta transgénica que comprende una célula vegetal como la definida en la reivindicación 5 o por una planta como la definida en la reivindicación 6 o 7, en la que la semilla es genéticamente pura para una mayor resistencia a un herbicida derivado de la benzoxazinona en comparación con un tipo salvaje correspondiente de la semilla.

9. Un procedimiento para producir una célula vegetal transgénica con una mayor resistencia a un herbicida derivado de la benzoxazinona en comparación con un tipo salvaje correspondiente de la célula vegetal que comprende, transformar la célula vegetal con un casete de expresión que comprende un ácido nucleico mut-PPO como se define en la reivindicación 4.

10. Un procedimiento para producir una planta transgénica que comprende, (a) transformar una célula vegetal con un casete de expresión que comprende un ácido nucleico mut-PPO como se define en la reivindicación 4, y (b) generar una planta con una mayor resistencia al herbicida derivado de la benzoxazinona a partir de la célula vegetal.

11. El procedimiento de la reivindicación 9 o 10, en el que el ácido nucleico mut-PPO comprende un polinucleótido que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1;

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el casete de expresión comprende además una región reguladora de la iniciación de la transcripción y una región reguladora de la iniciación de la traducción que son funcionales en la planta.