BR112015025068B1 - Método para controlar vegetação indesejada - Google Patents

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Abstract

MÉTODO PARA CONTROLAR VEGETAÇÃO, MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE HERBICIDA, MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS, ÁCIDOS NUCLEICOS, CÉLULA VEGETAL, PLANTAS, SEMENTE, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE CÉ- LULAS VEGETAIS TRANSGÊNICAS, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS E MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO OU SELEÇÃO D E CÉLULAS VEGETAIS TRANSFORMADAS. A presente invenção refere-se a um método de controle de vegetação indesejada em um local de cultivo de planta, em que o método compreende as etapas de fornecimento, no mencionado local, de uma planta que compreende pelo menos um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma hidroxifenil piruvato dioxigenase do tipo selvagem ou uma hidroxifenil piruvato dioxigenase que sofreu mutação (mut-HPPD) que é resistente ou tolerante a um herbicida inibidor de HPPD e/ou uma sequência de nucleotídeos que codifica uma homogenotisato solanesil transferase do tipo selvagem ou uma homogenotisato solanesil transferase que sofreu mutação (mut-HST) que é resistente ou tolerante a um herbicida inibidor de HPPD, aplicando ao mencionado local uma quantidade eficaz do mencionado herbicida. A presente invenção refere-se ainda a plantas que compreendem mut-HPPD e métodos de obtenção dessas plantas.

Description

[001] O presente pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório Norte-Americano n° US 61/817370, depositado em 30 de abril de 2013, que é integralmente incorporado ao presente como referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se, de forma geral, a métodos para fornecer às plantas níveis agrícolas de tolerância contra herbicidas. Particularmente, a presente invenção refere-se a plantas que possuem tolerância aprimorada à inibicão de HPPD, preferencialmente herbicidas derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a métodos e plantas obtidas por meio de mutagênese, retrocruzamento e transformação que possuem tolerância aprimorada a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] Herbicidas que inibem 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase (4- HPPD; EC 1.13.11.27), enzima principal na biossíntese das prenilquinonas plastoquinona e tocoferóis, foram utilizados para controle seletivo de ervas desde o início da década de 1990. Eles bloqueiam a conversão de 4- hidroxifenilpiruvato em homogenotisato no processo biossintético (Matringe et al, 2005, Pest Manag. Sci., vol. 61: 269-276; Mitchell et al, 2001, Pest Manag. Sci., vol. 57: 120-128). Acredita-se que plastoquinona é um cofator necessário da enzima fitoeno dessaturase na biossíntese de carotenoide (Boeger e Sandmann, 1998, Pestic. Outlook, vol. 9:29-35). A sua inibição resulta no esgotamento dos conjuntos de vitamina E e plastoquinona vegetal, gerando sintomas de branqueamento. A perda de carotenoides, particularmente em sua função de protetores dos fotossistemas contra a foto-oxidação, gera degradação oxidativa de clorofila e membranas fotossintéticas no crescimento de tecidos de brotos. Consequentemente, a síntese e a função de cloroplastas são prejudicadas (Boeger e Sandmann, 1998). A enzima homogenotisato solanesil transferase (HST) catalisa a etapa seguinte a HPPD no processo biossintético de plastoquinona. HST é uma prenil transferase que descarboxila homogenotisato e também transfere para ele o grupo solanesila de difosfato de solanesila, de maneira a formar 2-metil-6-solanesil-1,4-benzoquinol (MSBQ), um intermediário ao longo do processo biossintético de plastoquinona. As enzimas HST são ligadas por membranas e os genes que as codificam incluem uma sequência de direcionamento de plastídeos.
[004] As classes químicas mais imortantes de herbicidas inibidores de 4-HPPD comerciais incluem pirazolonas, tricetonas e isoxazóis. Os inibidores imitam a ligação do substrato 4-hidroxifenilpiruvato a um íon ferroso ligado por enzimas no local ativo por meio da formação de um complexo de transferência de carga de dipolo de íons estável. Dentre os herbicidas inibidores de 4-HPPD, tricetona sulcotriona foi o primeiro exemplo desse grupo de herbicidas a ser utilizado na agricultura e ter seu mecanismo de ação identificado (Schulz et al, 1993, FEBS Lett. Vol. 318: 162-166). Relatou-se que as tricetonas são derivadas de leptospermona, um componente herbicida da planta escova de garrafa, Callistemon spp (Lee et al, 1997, Weed Sci., Vol. 45, 162-166).
[005] Algumas dessas moléculas vêm sendo utilizadas como herbicidas, pois a inibição da reação em plantas gera embranquecimento das folhas das plantas tratadas e a morte das mencionadas plantas (Pallett, K. E. et al, 1997, Pestic. Sci. 50: 83-84). Os herbicidas para os quais HPPD é o alvo e que são descritos no estado da técnica são particularmente isoxazóis (EP 418175, EP 470856, EP 487352, EP 527036, EP 560482, EP 682659 e Patente Norte-Americana n° 5.424.276), particularmente isoxaflutol, que é um herbicida seletivo para milho, dicetonitrilas (EP 496630, EP 496631), particularmente 2- ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-CF3 fenil)propano-1,3-diona e 2-ciano-3- ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2fenil)propano-1,3-diona, tricetonas tais como as descritas em EP 625505, EP 625508, Patente Norte-Americana n° 5.506.195, particularmente sulcotriona ou pirazolinatos. Além disso, o conhecido herbicida topramezona permite o mesmo tipo de sintomas fitotóxicos, com perda de clorofila e necrose nos tecidos de broto em crescimento, como os herbicidas branqueadores inibidores de 4-HPPD descritos acima em espécies vegetais susceptíveis. Topramezona pertence à classe química de pirazolonas ou benzoil pirazóis e foi introduzida comercialmente em 2006. Quando aplicado após a emergência, o composto controla seletivamente um amplo espectro de grama anual e ervas de folhas largas em milho.
[006] Três estratégias principais são disponíveis para tornar as plantas tolerantes a herbicidas, ou seja, (1) desintoxicação do herbicida com uma enzima que transforma o herbicida ou seu metabólito ativo em produtos não tóxicos, tais como as enzimas para tolerância a bromoxinil ou Basta (EP 242236, EP 337899); (2) mutação da enzima alvo em uma enzima funcional que é menos sensível ao herbicida ou ao seu metabólito ativo, como as enzimas para tolerância a glifosato (EP 293356, Padgette, S. R. et al, J. Biol. Chem., 266, 33, 1991); ou (3) sobre-expressão da enzima sensível de forma a produzir quantidades da enzima alvo na planta que sejam suficientes com relação ao herbicida, em vista das constantes cinéticas dessa enzima, de forma a ter enzima funcional suficiente disponível apesar da presença do seu inibidor. A terceira estratégia foi descrita para a obtenção bem sucedida de plantas que fossem tolerantes a inibidores de HPPD (WO 96/38567). US 2009/0172831 descreve sequências de nucleotídeos que codificam sequências de aminoácidos que possuem atividade enzimática, de forma que as sequências de aminoácidos sejam resistentes a substâncias herbicidas inibidoras de HPPD, particularmente mutantes de HPPD específicos de inibidores de tricetona.
[007] Até hoje, o estado da técnica não descreveu plantas tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, que contenham pelo menos um ácido nucleico de HPPD que sofreu mutação de acordo com a presente invenção. O estado da técnica também não descreveu plantas produtoras tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, que contenham mutações sobre genomas diferentes do genoma do qual é derivado o gene HPPD. Portanto, o que é necessário na técnica é a identificação de genes de tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, de genomas e espécies adicionais. O que também é necessário na técnica são plantas produtoras e plantas de safra que possuam maior tolerância a herbicidas tais como herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, e que contenham pelo menos um ácido nucleico HPPD que sofreu mutação de acordo com a presente invenção. Também são necessários métodos de controle do crescimento de ervas nas proximidades dessas plantas produtoras ou plantas de safra. Essas composições e métodos permitiriam o uso de métodos de pulverização durante a aplicação de herbicidas a áreas que contenham plantas produtoras ou plantas de safra.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[008] O problema é solucionado pela presnte invenção, que se refere a um método de controle de vegetação indesejada em um local de cultivo de plantas, em que o método compreende as etapas de: (a) fornecimento, no mencionado local, de uma planta que compreende pelo menos um ácido nucleico que compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma hidroxifenil piruvato dioxigenase do tipo selvagem ou uma hidroxifenil piruvato dioxigenase que sofreu mutação (mut-HPPD) que é resistente ou tolerante a um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona; e/ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma homogenotisato solanesil transferase do tipo selvagem ou uma homogenotisato solanesil transferase que sofreu mutação (mut-HST) que é resistente ou tolerante a um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona; e (b) aplicação ao mencionado local de uma quantidade eficaz do mencionado herbicida.
[009] Além disso, a presente invenção refere-se a um método de identificação de um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, utilizando mut-HPPD codificado por um ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 52, 54, 56, 68, 69 ou uma de suas variantes e/ou utilizando um mut- HST codificado por um ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 47, 49 ou uma de suas variantes.
[0010] O mencionado método compreende as etapas de: (a) geração de planta ou célula transgênica que compreende um ácido nucleico que codifica um HPPD do tipo selvagem ou que sofreu mutação, em que o HPPD do tipo selvagem ou que sofreu mutação é expresso; (b) aplicação de um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, à planta ou célula transgênica de (a) e a uma planta ou célula controle da mesma variedade; (c) determinação do crescimento ou da viabilidade da planta ou célula transgênica e da planta ou célula controle após a aplicação do mencionado composto de teste; e (d) seleção de compostos de teste que conferem crescimento reduzido à planta ou célula controle em comparação com o crescimento da planta ou célula transgênica.
[0011] Outro objeto refere-se a um método de identificação de uma sequência de nucleotídeos que codifica um mut-HPPD que é resistente ou tolerante a um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em que o método compreende: (a) geração de uma biblioteca de ácidos nucleicos codificadores de mut-HPPD; (b) seleção de uma população dos ácidos nucleicos que codificam mut-HPPD por meio da expressão de cada um dos mencionados ácidos nucleicos em uma célula ou planta e tratamento da mencionada planta ou célula com um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona; (c) comparação dos níveis de tolerância a herbicidas inibidores a HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, fornecidos pela mencionada população de ácidos nucleicos codificadores de mut-HPPD com o nível de tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, fornecido por um ácido nucleico codificador de HPPD controle; e (d) seleção de pelo menos um ácido nucleico codificador de mut-HPPD que fornece nível significativamente aprimorado de tolerância a um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em comparação com o fornecido pelo ácido nucleico codificador de HPPD controle.
[0012] Em uma realização preferida, o ácido nucleico codificador de mut-HPPD selecionado na etapa (d) fornece pelo menos duas vezes mais tolerância a um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em comparação com o fornecido pelo ácido nucleico codificador de HPPD controle.
[0013] A resistência ou tolerância pode ser determinada por meio da geração de uma planta transgênica que compreende uma sequência de ácidos nucleicos da biblioteca da etapa (a) e comparação da mencionada planta transgênica com uma planta controle.
[0014] Outro objeto refere-se a um método de identificação de uma planta ou alga que contém um ácido nucleico que codifica um mut-HPPD ou mut-HST que é resistente ou tolerante a um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em que o método compreende: (a) identificação de quantidade eficaz de um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em um cultivo de células vegetais ou algas verdes; (b) tratamento das mencionadas células vegetais ou algas verdes com um agente de mutagênese; (c) contacto da mencionada população de células que sofreram mutagênese com quantidade eficaz de herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, identificado em (a); (d) seleção de pelo menos uma célula que sobrevive a essas condições de teste; e e. amplificação por PCR e sequenciamento de genes HPPD e/ou HST a partir de células selecionadas em (d) e comparação dessas sequências com sequências genéticas de HPPD ou HST do tipo selvagem, respectivamente.
[0015] Em uma realização preferida, o agente de mutagênese é metanossulfonato de etila.
[0016] Outro objeto designa um ácido nucleico isolado que codifica mut-HPPD, em que o ácido nucleico é identificável por meio de um método conforme definido acima.
[0017] Em outra realização, a presente invenção refere-se a uma célula vegetal transformada por um ácido nucleico HPPD do tipo selvagem ou que sofreu mutação ou uma planta que tenha sofrido mutação para obter uma planta que expressa, preferencialmente que sobre-expressa ácido nucleico HPPD do tipo selvagem ou que sofreu mutação, em que a expressão do ácido nucleico na célula vegetal resulta em aumento da resistência ou tolerância a um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em comparação com uma variedade do tipo selvagem da célula vegetal.
[0018] Em uma realização preferida, a célula vegetal de acordo com o presente é transformada por um ácido nucleico HPPD do tipo selvagem ou que sofreu mutação que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 52, 54, 56, 68, 69 ou uma de suas variantes ou derivados.
[0019] Em outra realização, a presente invenção refere-se a uma planta transgênica que compreende uma célula vegetal de acordo com a presente invenção, em que a expressão do ácido nucleico na planta resulta em aumento da resistência da planta a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em comparação com uma variedade da planta do tipo selvagem.
[0020] As plantas de acordo com a presente invenção podem ser transgênicas ou não transgênicas.
[0021] Preferencialmente, a expressão do ácido nucleico na planta resulta em aumento da resistência da planta a herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em comparação com variedade da planta do tipo selvagem.
[0022] Em outra realização, a presente invenção refere-se a uma semente produzida por uma planta transgênica que compreende uma célula vegetal de acordo com a presente invenção, em que a semente é reprodução verdadeira de aumento da resistência a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em comparação com uma variedade da semente do tipo selvagem.
[0023] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um método de produção de células vegetais transgênicas com resistência aprimorada a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em comparação com uma variedade do tipo selvagem da célula vegetal que compreende a transformação da célula vegetal com um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico HPPD do tipo selvagem ou que sofreu mutação.
[0024] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um método de produção de plantas transgênicas que compreende (a) transformação de células vegetais com um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico HPPD do tipo selvagem ou que sofreu mutação e (b) geração de plantas com resistência aprimorada a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou ticetona, da célula vegetal.
[0025] Preferencialmente, o cassete de expressão compreende adicionalmente uma região reguladora do início de transcrição e uma região reguladora do início de tradução que são funcionais na planta.
[0026] Em outra realização, a presente invenção refere-se ao uso do mut-HPPD de acordo com a presente invenção como marcador selecionável. A presente invenção fornece um método de identificação ou seleção de células vegetais transformadas, tecidos vegetais, plantas ou suas partes que compreende (a) fornecimento de uma célula vegetal transformada, tecido vegetal, planta ou sua parte, em que a mencionada célula vegetal transformada, tecido de planta, planta ou sua parte compreende um ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo mut-HPPD de acordo com a presente invenção conforme descrito a seguir, em que o polipeptídeo é utilizado como marcador de seleção e a célula vegetal transformada, tecido vegetal, planta ou sua parte pode compreender opcionalmente um ácido nucleico isolado de interesse adicional; (b) contato da célula vegetal transformada, tecido vegetal, planta ou sua parte com pelo menos um composto inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona; (c) determinação se a célula vegetal, tecido vegetal, planta ou sua parte é afetada pelo inibidor ou composto de inibição; e (d) identificação ou seleção da célula vegetal transformada, tecido vegetal, planta ou sua parte.
[0027] A presente invenção também é realizada em proteínas mut- HPPD purificadas que contêm as mutações descritas no presente, que são úteis em estudos de modelagem molecular para projetar melhorias adicionais da tolerância a herbicidas. Os métodos de purificação de proteínas são bem conhecidos e podem ser facilmente realizados utilizando produtos disponíveis comercialmente ou métodos especialmente projetados, conforme descrito, por exemplo, em Protein Biotechnology, Walsh e Headon (Wiley, 1994).
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0028] Figura 1: regiões conservadas e ainhamento de sequências de aminoácidos de enzimas HPPD de Chlamydomonas reinhardtii (Cr_HPPD1a, Cr_HPPD1b), Physcomitrella patens (Pp_HPPD1), Oryza sativa (Osj_HPPD1), Triticum aestivum (Ta_HPPD1), Zea mays (Zm_HPPD1), Arabidopsis thaliana (At_HPPD), Glycine max (Gm_HPPD), Vitis vinifera (Vv_HPPD) e Hordeum vulgare (Hv_HPPD). * Sequência derivada de projeto de sequenciamento de genoma. ID do local: GRMZM2G088396. ** Sequência de aminoácidos com base em acesso GenPept NCBI CAG25475.
[0029] A Figura 2 exibe um mapa de vetor de um vetor de transformação vegetal que é utilizado para transformação de soja com sequências de HPPD/HST.
[0030] A Figura 3 exibe um teste de germinação com mudas de Arabidopsis transgênicas que expressam HPPD mutante de Hordeum L320H P321A. As plantas foram germinadas sobre [3-(4,5-di-hidroisoxazol-3-il)-2- metil-4-metilsulfonilfenil]-(5-hidróxi-1-metilpirazol-4-il)metanona.
[0031] A Figura 4 exibe um teste de pulverização de herbicida com plantas Arabidopsis transgênicas que expressam variantes de HPPD de Arabidopsis ou HPPD de Picruphilus que sofreram mutação. Plantas controle não transgênicas são tratadas paralelamente e são tomadas fotografias quatorze dias após o tratamento. As plantas foram pulverizadas com diferentes concentrações de inibidor 1 ([3-(4,5-di-hidroisoxazol-3-il)-2-metil-4- metilsulfonilfenil]-(5-hidróxi-1-metilpirazol-4-il)metanona) e inibidor 2 (2-(4- metilsulfonil-2-nitrobenzoil)ciclo-hexano-1,3-diona).
[0032] A Figura 5 exibe um teste de pulverização de herbicida com plantas Arabidopsis transgênicas que expressam variantes de HPPD de Hordeum que sofreram mutação. Plantas controle não transgênicas são tratadas paralelamente e são tomadas fotografias quatorze dias após o tratamento. As plantas foram pulverizadas com diferentes concentrações de inibidor 1 ([3-(4,5-di-hidroisoxazol-3-il)-2-metil-4-metilsulfonilfenil]-(5-hidróxi-1- metilpirazol-4-il)metanona) e inibidor 2 (2-(4-metilsulfonil-2-nitrobenzoil)ciclo- hexano-1,3-diona).
[0033] A Figura 6 exibe um teste de pulverização de herbicidas com plantas de soja transgênicas que sobre-expressam a variante de HPPD de Arabidopsis que sofreu mutação na qual metionina 335 foi substituída por histidina em comparação com plantas desoja do tipo selvagem não transgênicas (Jake). Plantas de soja foram tratadas paralelamente com diferentes taxas de aplicação e fotografias são tomadas 14 dias após o tratamento. As plantas foram pulverizadas com 0, 6,25 g/ha, 25 g/ha e 100 g/ha de [3-(4,5-di-hidroisoxazol-3-il)-2-metil-4-metilsulfonilfenil]-(5-hidróxi-1- metilpirazol-4-il)metanona (Inibidor 1).
[0034] A Figura 7 exibe teste de campo de herbicida com plantas de soja transgênicas que sobre-expressam mutantes de HPPD de Arabidopsis conforme indicado. As fotografias exibem a determinação preliminar sete dias após o tratamento com 50 g/ha de [3-(4,5-di-hidroisoxazol-3-il)-2-metil-4- metilsulfonilfenil]-(5-hidróxi-1-metilpirazol-4-il)metanona (Inibidor 1). Plantas controle não transformadas são marcadas como tipo selvagem. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS TABELA 1
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DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0035] Os artigos “um” e “uma” são utilizados no presente para designar um ou mais de um (ou seja, pelo menos um) objeto gramatical do artigo. Como exemplo, “um elemento” indica um ou mais elementos.
[0036] Da forma utilizada no presente, a expressão “que compreende” ou variações tais como “compreende” ou “compreendendo” será compreendida como indicando a inclusão de um elemento, número inteiro ou etapa indicada ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de nenhum outro elemento, número inteiro ou etapa, grupo de elementos, números inteiros ou etapas.
[0037] Os inventores da presente invenção descobriram que a tolerância ou resistência de uma planta a um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, poderá ser notadamente aumentada por meio da sobre-expressão de enzimas HPPD do tipo selvagem ou que sofreram mutação que compreendem SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67.
[0038] Consequentemente, a presente invenção refere-se a um método de controle de vegetação indesejada em um local de cultivo de plantas, em que o método compreende as etapas de: (a) fornecimento, no mencionado local, de uma planta que compreende pelo menos um ácido nucleico que compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma hidroxifenil piruvato dioxigenase (HPPD) do tipo selvagem ou uma hidroxifenil piruvato dioxigenase que sofreu mutação (mut-HPPD) que é resistente ou tolerante a um “herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona”; e/ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma homogenotisato solanesil transferase do tipo selvagem ou uma homogenotisato solanesil transferase que sofreu mutação (mut-HST) que é resistente ou tolerante a um “herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona”; e (b) aplicação ao mencionado local de uma quantidade eficaz do mencionado herbicida.
[0039] A expressão “controle da vegetação indesejada” deve ser compreendida como indicando a morte de ervas e/ou o retardamento ou inibição do crescimento normal das sementes. Ervas, no sentido mais amplo, são compreendidas como indicando todas as plantas que crescem em locais onde são indesejadas. As ervas de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, ervas dicotiledôneas e monocotiledôneas. Ervas dicotiledôneas incluem, mas sem limitações, ervas dos gêneros: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus e Taraxacum. Ervas monocotiledôneas incluem, mas sem limitações, ervas dos gêneros: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus e Apera. Além disso, as ervas de acordo com a presente invenção podem incluir, por exemplo, plantas de safras que estão crescendo em local indesejado. Uma planta de milho voluntária que se encontra em um campo que compreende predominantemente plantas de soja, por exemplo, pode ser considerada erva caso a planta de milho seja indesejada no campo de plantas de soja.
[0040] O termo “planta” é utilizado no seu sentido mais amplo, referindo-se a material orgânico e destina-se a englobar organismos eucarióticos que são membros do reino vegetal, cujos exemplos incluem, mas sem limitações, plantas vasculares, legumes, grãos, flores, árvores, ervas, arbustos, gramas, uvas, samambaias, musgos, fungos, algas etc., bem como clones, mudas e partes de plantas utilizadas para propagação assexuada (por exemplo, cortes, conduções, brotos, rizomas, caules subterrâneos, tufos, coroas, bulbos, cormos, tubérculos, rizomas, plantas/tecidos produzidos em cultivo de tecidos etc.). O termo “planta” engloba adicionalmente plantas inteiras, ancestrais e prole das plantas e partes de plantas, incluindo sementes, brotos, hastes, folhas, raízes (incluindo tubérculos), flores, floretes, frutos, pedículos, pedúnculos, estames, anteras, estigmas, estiletes, ovários, pétalas, sépalas, carpelos, pontas de raízes, coifas, pelos de raízes, pelos de folhas, pelos de sementes, grãos de pólens, microesporos, cotilédones, hipocotilédones, epicotilédones, xilemas, floemas, parênquimas, endospermas, células de companhia, células de guarda e quaisquer outros órgãos, tecidos e células vegetais conhecidas, bem como tecidos e órgãos, em que cada um dos mencionados acima compreende o gene/ácido nucleico de interesse. O termo “planta” também engloba células vegetais, cultivos em suspensão, tecido de calos, embriões, regiões meristemáticas, gametófitos, esporófitos, pólen e microesporos, novamente em que cada um dos mencionados acima compreende o gene/ácido nucleico de interesse.
[0041] Plantas que são particularmente úteis nos métodos de acordo com a presente invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, particularmente plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas que incluem legumes de forragem ou feno, plantas ornamentais, plantas produtoras, árvores ou arbustos selecionados a partir da relação que compreende Acer spp, Actinidia spp, Abelmoschus spp, Agave sisalana, Agropyron spp, Agrostis stolonifera, Allium spp, Amaranthus spp, Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp, Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp, Asparagus officinalis, Avena spp (por exemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp, Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp (por exemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp (canola, colza oleaginosa, nabo silvestre)), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp, Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp, Carthamus tinctorius, Castanea spp, Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp, Citrullus lanatus, Citrus spp, Cocos spp, Coffea spp, Colocasia esculenta, Cola spp, Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp, Crataegus spp, Crocus sativus, Cucurbita spp, Cucumis spp, Cynara spp, Daucus carota, Desmodium spp, Dimocarpus longan, Dioscorea spp, Diospyros spp, Echinochloa spp, Elaeis (por exemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp, Fagus spp, Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp, Fragaria spp, Ginkgo biloba, Glycine spp (por exemplo, Glycine max, Soja hispida ou Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp (por exemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp, Hordeum spp (por exemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp, Lactuca sativa, Lathyrus spp, Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp, Luffa acutangula, Lupinus spp, Luzula sylvatica, Lycopersicon spp, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp, Malus spp, Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp, Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp, Mentha spp, Miscanthus sinensis, Momordica spp, Morus nigra, Musa spp, Nicotiana spp, Olea spp, Opuntia spp, Ornithopus spp, Oryza spp (por exemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp, Persea spp, Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp, Phleum pratense, Phoenix spp, Phragmites australis, Physalis spp, Pinus spp, Pistacia vera, Pisum spp, Poa spp, Populus spp, Prosopis spp, Prunus spp, Psidium spp, Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp, Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp, Ricinus communis, Rubus spp, Saccharum spp, Salix sp, Sambucus spp, Secale cereale, Sesamum spp, Sinapis sp, Solanum spp (por exemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium ou Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp, Syzygium spp, Tagetes spp, Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp, Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp (por exemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum ou Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp, Vicia spp, Vigna spp, Viola odorata, Vitis spp, Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp, amaranto, alcachofra, aspargo, brócoli, couve de Bruxelas, repolho, canola, cenoura, couve-flor, aipo, couve galega, linho, couve, lentilha, canola, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, morango, beterraba, cana de açúcar, girassol, tomate, abóbora, chá e algas, entre outros. Segundo uma realização preferida da presente invenção, a planta é uma planta produtora. Exemplos de plantas produtoras incluem, entre outras, soja, girassol, canola, alfafa, colza, algodão, tomate, batata ou fumo. De preferência adicional, a planta é uma planta monocotiledônea, tal como cana de açúcar. De preferência adicional, a planta é cereal, tal como arroz, milho, trigo, cevada, milheto, centeio, sorgo ou aveia.
[0042] Em uma realização preferida, a planta foi previamente produzida por meio de um processo que compreende a preparação recombinante de uma planta por meio da introdução e sobre-expressão de um transgene de HPPD do tipo selvagem ou que sofreu mutação e/ou HST do tipo selvagem ou que sofreu mutação, conforme descrito com mais detalhes a seguir.
[0043] Em outra realização preferida, a planta foi previamente produzida por meio de um processo que compreende a mutagênese in situ de células vegetais, para obter células vegetais que expressam mut-HPPD e/ou mut-HST.
[0044] Conforme descrito no presente, os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção encontram uso no aumento da tolerância a herbicidas de plantas que compreendem nos seus genomas um gene que codifica uma proteína HPPD do tipo selvagem ou que sofreu mutação e/ou HST do tipo selvagem ou que sofreu mutação tolerante a herbicidas. Esse gene pode ser gene endógeno ou transgene, conforme descrito a seguir.
[0045] Em outra realização, portanto, a presente invenção refere- se a um método de aumento ou amplificação da resistência ou tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona de plantas, em que o método compreende a sobre- expressão de um ácido nucleico que codifica enzimas HPPD do tipo selvagem ou que sofreram mutação que compreende SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67.
[0046] Em uma realização, a enzima HPPD do tipo selvagem compreende SEQ ID NO: 40, 44 ou 46.
[0047] Além disso, em certas realizações, os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem ser reunidos com qualquer combinação de sequências de polinucleotídeos de interesse, a fim de criar plantas com fenótipo desejado. Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem ser reunidos, por exemplo, com quaisquer outros polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que possuem atividade como pesticida e/ou inseticida, tais como as proteínas da toxina Bacillus thuringiensis (descritas nas Patentes Norte-Americanas n° 5.366.892, 5.747.450, 5.737.514, 5.723.756, 5.593.881 e Geiser et al (1986), Gene 48: 109). As combinações geradas podem também incluir diversas cópias de qualquer um dos polinucleotídeos de interesse.
[0048] Como forma de exemplo, os polinucleotídeos que podem ser reunidos com os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção incluem ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos que conferem resistência a pragas/patógenos tais como vírus, nematoides, insetos ou fungos e similares. Exemplos de polinucleotídeos que podem ser reunidos com ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção incluem polinucleotídeos que codificam: polipeptídeos que possuem atividade pesticida e/ou inseticida, tais como outras proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (descritas nas Patentes Norte- Americanas n° 5.366.892, 5.747.450, 5.737.514, 5.723.756, 5.593.881; e Geiser et al (1986), Gene 48: 109); lectinas (van Damme et al (1994), Plant Mol. Biol. 24: 825, pentina (descrita na Patente Norte-Americana n° 5.981.722) e similares; características desejáveis para resistência a doenças ou herbicidas (por exemplo, genes de desintoxicação de fumonisina (Patente Norte- Americana n° 5.792.931); genes de resistência a doenças e avirulência (Jones et al (1994), Science 266: 789; Martin et al (1993), Science 262: 1432; Mindrinos et al (1994), Cell 78: 1089); mutantes de acetolactato sintase (ALS) que geram resistência a herbicidas tais como as mutações S4 e/ou Hra; resistência a glifosato (por exemplo, gene 5-enolpirovilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPS), descrito nas Patentes Norte-Americanas n° 4.940.935 e 5.188.642; ou o gene glifosato N-acetiltransferase (GAT), descrito em Castle et al (2004), Science, 304: 1151-1154; e nos Pedidos de Patente Norte- Americanos publicados n° 20070004912, 20050246798 e 20050060767)); resistência a glufosinato (por exemplo, os genes de fosfinotricino acetil transferase PAT e BAR, descritos nas Patentes Norte-Americanas n° 5.561.236 e 5.276.268); resistência a herbicidas, incluindo herbicidas sulfonil ureia, DHT (2,4-D) e PPO (por exemplo, glifosato acetil transferase, arilóxi alcanoato dioxigenase, acetolactato sintase e protoporfirinogene oxidase); um citocromo P450 ou sua variante que confere resistência ou tolerância a herbicidas, entre outros, a herbicidas HPPD (Pedido de Patente Norte-Americano com número de série 12/156.247; Patentes Norte-Americanas n° 6.380.465, 6.121.512, 5.349.127, 6.649.814 e 6.300.544; e o Pedido de Patente PCT publicado n° WO 2007000077); e características desejáveis para processamento ou produtos de processo tais como alto teor de óleo (por exemplo, Patente Norte- Americana n° 6.232.529); óleos moddificados (tais como genes dessaturase de ácido graxo (Patente Norte-Americana n° 5.952.544; WO 94/11516)); amidos modificados (tais como pirofosforilases ADPG (AGPase), sintases de amido (SS), enzimas de ramificação de amido (SBE) e enzimas de desramificação de amido (SDBE)); e polímeros ou bioplásticos (tais como Patente Norte- Americana n° 5.602.321; betacetotiolase, póli-hidroxibutirato sintase e acetoacetil-CoA reductase (Schubert et al (1988), J. Bacteriol. 170: 5837-5847) possibilitam a expressão de póli-hidroxialcanoatos (PHAs)), cujas revelações são incorporadas ao presente como referência.
[0049] Em uma realização particularmente preferida, a planta compreende pelo menos um ácido nucleico heterólogo adicional que compreende (iii) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima de tolerância a herbicidas selecionada, por exemplo, a partir do grupo que consiste de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPS), glifosato acetil transferase (GAT), citocromo P450, fosfinotricino acetiltransferase (PAT), aceto-hidroxiácido sintase (AHAS; EC 4.1.3.18, também conhecida como acetolactato sintase ou ALS), protoporfirinogene oxidase (PPGO), fitoeno dessaturase (PD) e enzimas de degradação de dicamba, conforme descrito em WO 02/068607.
[0050] Geralmente, o termo “herbicida” é utilizado no presente para indicar um ingrediente ativo que mata, controla ou prejudica de outra forma o crescimento de plantas. A concentração ou quantidade preferida do herbicida é “quantidade eficaz” ou “concentração eficaz”. Por “quantidade eficaz” e “concentração eficaz”, indica-se uma quantidade e concentração, respectivamente, que seja suficiente para matar ou inibir o crescimento de uma planta, tecido vegetal, célula vegetal ou célula hospedeira do tipo selvagem similar, mas a mencionada quantidade não mata nem inibe tão severamente o crescimento das plantas resistentes a herbicidas, tecidos vegetais, células vegetais e células hospedeiras de acordo com a presente invenção. Tipicamente, a quantidade eficaz de herbicida é uma quantidade que é utilizada rotineiramente em sistemas de produção agrícola para matar ervas de interesse. Essa quantidade é conhecida dos técnicos comuns no assunto. Atividade herbicida é exibida por herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, útil para a presente invenção quando aplicado diretamente à planta ou ao local da planta em qualquer estágio de crescimento ou antes do plantio ou emergência. O efeito observado depende da espécie vegetal a ser controlada, do estágio de crescimento da planta, dos parâmetros de aplicação de diluição e do tamanho de gotículas de pulverização, do tamanho de partícula de componentes sólidos, das condições ambientais no momento do uso, do composto específico empregado, dos adjuvantes específicos e do veículos empregados, do tipo de solo e similares, bem como da quantidade de substância aplicada. Estes e outros fatores podem ser ajustados conforme conhecido na técnica para promover ação herbicida seletiva ou não seletiva. Geralmente, prefere-se a aplicação do herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, pós-emergência a vegetação indesejável relativamente imatura para atingir o controle máximo de ervas.
[0051] Por planta “tolerante a herbicidas” ou “resistente a herbicidas”, designa-se a planta que é tolerante ou resistente a pelo menos um herbicida em nível que normalmente mataria ou inibiria o crescimento de uma planta normal ou do tipo selvagem. Por “proteína mut-HPPD tolerante a herbicidas” ou “proteína mut-HPPD resistente a herbicidas”, pretende-se que essa proteína mut-HPPD exibe atividade de HPPD superior, com relação à atividade de HPPD de uma proteína mut-HPPD do tipo selvagem, na presença de pelo menos um herbicida que conhecidamente interfere com a atividade de HPPD em nível ou concentração do herbicida que conhecidamente inibe a atividade de HPPD da proteína mut-HPPD do tipo selvagem. Além disso, a atividade de HPPD dessa proteína mut-HPPD tolerante a herbicidas ou resistente a herbicidas pode ser denominada no presente atividade de HPPD “tolerante a herbicidas” ou “resistente a herbicidas”.
[0052] Em uma realização preferida, o herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, é selecionado a partir do grupo que consiste de benzobiciclon, benzofenap, isoxaflutol, mesotriona, pirassulfotol, pirazolinato, pirazoxifen, sulcotriona, tefuriltriona, tembotriona, topramezona e biciclopirona (4-hidróxi-3-[[2-(2-metoxietóxi)metil]- 6-(trifluorometil)-3-piridinil]carbonil]-biciclo[3.2.1]-oct-3-en-2-ona).
[0053] Os herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, úteis para a presente invenção frequentemente são mais bem aplicados em conjunto com um ou mais herbicidas dirigidos a HPPD e/ou HST diferentes para obter controle de uma variedade mais ampla de vegetação indesejável. Quando utilizado em conjunto com outros herbicidas dirigidos a HPPD e/ou HST, os compostos de acordo com a presente invenção podem ser formulados com o(s) outro(s) herbicida(s), misturados em tanque com o(s) outro(s) herbicida(s) ou aplicados em sequência com o(s) outro(s) herbicida(s).
[0054] Os compostos herbicidas úteis para a presente invenção podem ser utilizados em conjunto com herbicidas adicionais aos quais a planta produtora é naturalmente tolerante ou aos quais é resistente por meio da expressão de um ou mais transgenes adicionais mencionados acima ou aos quais é resistente por meio de mutagênese e métodos de cultivo conforme descrito a seguir.
[0055] A menos que já incluído na descrição acima, os herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona de acordo com a presente invenção podem ser adicionalmente utilizados em conjunto com compostos: (a) do grupo dos inibidores da biossíntese de lipídios: Aloxidim, Aloxidim nátrio, Butroxidim, Cletodim, Clodinafop, Clodinafop-propargil, Cicloxidim, Ci-halofop, Ci-halofop-butil, Diclofop, Diclofop-metil, Fenoxaprop, Fenoxaprop-etil, Fenoxaprop-P, Fenoxaprop-P-etil, Fluazifop, Fluazifop-butil, Fluazifop-P, Fluazifop-P-butil, Haloxifop, Haloxifop-metil, Haloxifop-P, Haloxifop-P-metil, Metamifop, Pinoxaden, Profoxidim, Propaquizafop, Quizalofop, Quizalofop-etil, Quizalofop-tefuril, Quizalofop-P, Quizalofop-P-etil, Quizalofop-P-tefuril, Setoxidim, Tepraloxidim, Tralcoxidim, Benfuresat, Butilat, Cicloat, Dalapon, Dimepiperat, EPTC, Esprocarb, Etofumesat, Flupropanat, Molinat, Orbencarb, Pebulat, Prossulfocarb, TCA, Tiobencarb, Tiocarbazil, Trialat e Vernolat; (b) do grupo dos inibidores de ALS: amidossulfuron, azimsulfuron, bensulfuron, bensulfuron-metil, bispiribac, bispiribac-sódio, clorimuron, clorimuron-etil, clorsulfuron, cinossulfuron, cloransulam, cloransulam-metil, ciclossulfamuron, diclossulam, etametsulfuron, etametsulfuron-metil, etoxissulfuron, flazassulfuron, florassulam, flucarbazona, flucarbazona-nátrio, flucetossulfuron, flumetsulam, flupirsulfuron, flurpirsulfuron- metil-nátrio, foransulfuron, halossulfuron, halossulfuron-metil, imazametabenzo, imazametabenzo-metil, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquin, imazetapir, imazossulfuron, iodossulfuron, iodossulfuron-metil-nátrio, mesossulfuron, metossulam, metsulfuron, metsulfuron-metil, nicossulfuron, ortossulfamuron, oxassulfuron, penoxsulam, primissulfuron, primissulfuron-metil, propoxicarbazona, propoxicarbazona-nátrio, prossulfuron, pirazossulfuron, pirazossulfuron-etil, piribenzoxim, pirimissulfan, piriftalid, piriminobac, piriminobac-metil, piritiobac, piritiobac-nátrio, piroxsulam, rimsulfuron, sulfometuron, sulfometuron-metil, sulfossulfuron, tiencarbazona, tiencarbazona- metil, tifensulfuron, tifensulfuron-metil, triassulfuron, tribenuron, tribenuron-metil, trifloxissulfuron, triflussulfuron, triflussulfuron-metil e tritossulfuron; (c) do grupo de inibidores da fotossíntese: ametrina, amicarbazona, atrazina, bentazona, bentazona-nátrio, bromacil, bromofenoxim, bromoxinil, seus sais e ésteres, clorobromuron, cloridazona, clorotoluron, cloroxuron, cianazina, desmedifam, desmetrin, dimefuron, dimetametrin, diquat, dibrometo de diquat, diuron, fluometuron, hexazinona, ioxinil, seus sais e ésteres, isoproturon, isouron, carbutilato, lenacil, linuron, metamitron, metabenzotiazuron, metobenzuron, metoxuron, metribuzin, monolinuron, neburon, paraquat, dicloreto de paraquat, dimetilsulfato de paraquat, pentanoclor, fenmedifam, fenmedifam-etil, prometon, prometrin, propanil, propazina, piridafol, piridato, siduron, simazina, simetrin, tebutiuron, terbacil, terbumeton, terbutilazina, terbutrina, tidiazuron e trietazina; (d) do grupo dos inibidores de oxidase de protoporfirinogênio IX oxidase: Acifluorfen, Acifluorfen-nátrio, Azafenidin, Bencarbazon, Benzofendizon, Benzoxazinona (conforme descrito em WO 2010/145992), Bifenox, Butafenacil, Carfentrazon, Carfentrazon-etil, Clometoxifen, Cinidon-etil, Fluazolat, Flufenpir, Flufenpir etil, Flumiclorac, Flumiclorac pentil, Flumioxazin, Fluoroglicofen, Fluoroglicofen etil, Flutiacet, Flutiacet metil, Fomesafen, Halosafen, Lactofen, Oxadiargil, Oxadiazon, Oxifluorfen, Pentoxazon, Profluazol, Piraclonil, Piraflufen, Piraflufen etil, Saflufenacil, Sulfentrazon, Tidiazimin, 2-Clor-5-[3,6-di-hidro-3-metil-2,6-dioxo-4-(trifluorometil)-1(2H)- pirimidinil]-4-fluoro-N-[(isopropil)metilsulfamoil]benzamid (H-1; CAS 372137-354), etil éster de ácido [3-[2-cloro-4-fluoro-5-(1-metil-6-trifluorometil-2,4-dioxo- 1,2,3,4,-tetra-hidropirimidin-3-il)fenóxi]-2-piridylóxi]acético (H-2; CAS 35329231-6), N-etil-3-(2,6-dicloro-4-trifluorometilfenóxi)-5-metil-1H-pirazolo-1- carboxamid (H-3; CAS 452098-92-9), N-tetra-hidrofurfuril-3-(2,6-dicloro-4- trifluorometilfenóxi)-5-metil-1H-pirazol-1-carboxamid (H-4; CAS 915396-43-9), N-etil-3-(2-cloro-6-fluoro-4-trifluorometilfenóxi)-5-metil-1H-pirazol-1-carboxamid (H-5; CAS 452099-05-7) e N-tetra-hidrofurfuril-3-(2-cloro-6-fluoro-4- trifluorometilfenóxi)-5-metil-1H-pirazolo-1-carboxamid (H-6; CAS 45100-03-7); (e) do grupo dos herbicidas lixiviadores: Aclonifen, Amitrol, Beflubutamid, Benzobiciclon, Benzofenap, Clomazon, Diflufenican, Fluridon, Flurocloridon, Flurtamon, Isoxaflutol, Mesotrion, Norflurazon, Picolinafen, Pirassulfutol, Pirazolinat, Pirazoxifen, Sulcotrion, Tefuriltrion, Tembotrion, Top- ramezon, 4-Hidróxi-3-[[2-[(2-metoxietóxi)metil]-6-(trifluorometil)-3-piridil]car- bonil]biciclo[3.2.1]oct-3-en-2-ona (H-7; CAS 352010-68-5) e 4-(3- Trifluorometilfenóxi)-2-(4-trifluorometilfenil)pirimidina (H-8; CAS 180608-33-7); (f) do grupo de inibidores de EPSP sintase: Glifosato, Glifosato-isopropilamônio e Glifosato-trimésio (Sulfosat); (g) do grupo de inibidores de sintase de glutamina: Bilanafós (Bialafós), Bilanafós-nátrio, Glufosinat e Glufosinat-amônio; (h) do grupo de inibidores de DHP sintase: Asulam; (i) do grupo de inibidores de mitose: Amiprofós, Amiprofós- metil, Benfluralin, Butamifós, Butralin, Carbetamid, Clorprofam, Clortal, Clortal- dimetil, Dinitramina, Ditiopir, Etalfluralin, Flucloralin, Orizalin, Pendimetalin, Prodiamina, Profam, Propizamid, Tebutam, Tiazopir e Trifluralin; j. do grupo de inibidores de VLCFA: Acetoclor, Alaclor, Anilofós, Butaclor, Cafenstrol, Dimetaclor, Dimetanamid, Dimetanamid-P, Difenamid, Fentrazamid, Flufenacet, Mefenacet, Metazaclor, Metolaclor, Metolaclor-S, Naproanilid, Napropamid, Petoxamid, Piperofós, Pretilaclor, Propaclor, Propisoclor, Piroxassulfona (KIH-485) e Tenilclor; compostos da Fórmula 2:
Figure img0005
[0056] Os compostos particularmente preferidos da Fórmula 2 são: 3-[5-(2,2-Difluoroetóxi)-1-metil-3-trifluorometil-1H-pirazol-4- ilmetanossulfonil]-4-fluoro-5,5-dimetil-4,5-di-hidroisoxazol (2-1); 3-{[5-(2,2- Difluoroetóxi)-1-metil-3-trifluorometil-1H-pirazol-4-il]-fluorometanossulfonil}-5,5- dimetil-4,5-di-hidroisoxazol (2-2); 4-(4-Fluoro-5,5-dimetil-4,5-di-hidroisoxazolo- 3-sulfonilmetil)-2-metil-5-trifluorometil-2H-[1,2,3]triazol (2-3); 4-[(5,5-Dimetil-4,5- di-hidroisoxazolo-3-sulfonil)-fluorometil]-2-metil-5-trifluorometil-2H-[1,2,3]triazol (2-4); 4-(5,5-Dimetil-4,5-di-hidroisoxazolo-3-sulfonilmetil)-2-metil-5-trifluorometil- 2H-[1,2,3]triazol (2-5); 3-{[5-(2,2-Difluoroetóxi)-1-metil-3-trifluorometil-1H- pirazol-4-il]-difluorometanossulfonil}-5,5-dimetil-4,5-di-hidroisoxazol (2-6); 4- [(5,5-Dimetil-4,5-di-hidroisoxazolo-3-sulfonil)-difluorometil]-2-metil-5- trifluorometil-2H-[1,2,3]triazol (2-7); 3-{[5-(2,2-Difluoroetóxi)-1-metil-3- trifluorometil-1H-pirazol-4-il]-difluorometanossulfonil}-4-fluoro-5,5-dimetil-4,5-di- hidroisoxazol (2-8); 4-[Difluoro-(4-fluoro-5,5-dimetil-4,5-di-hidroisoxazolo-3- sulfonil)-metil]-2-metil-5-trifluorometil-2H-[1,2,3]triazol (2-9); k. do grupo de inibidores da biossíntese de celulose: Clortiamid, Diclobenil, Flupoxam e Isoxaben; l. do grupo de herbicidas desacopladores: dinoseb, dinoterb e DNOC e seus sais; m. do grupo dos herbicidas de auxina: 2,4-D e seus sais e ésteres, 2,4-DB e seus sais e ésteres, Aminopiralid e seus sais tais como Aminopiralid-tris(2-hidroxipropil)amônio e seus ésteres, Benazolin, Benazolin- etil, Cloramben e seus sais e ésteres, Clomeprop, Clopiralid e seus sais e ésteres, Dicamba e seus sais e ésteres, Diclorprop e seus sais e ésteres, Diclorprop-P e seus sais e ésteres, Fluroxipir, Fluroxipir-butometil, Fluroxipir- metil, MCPA e seus sais e ésteres, MCPA-tioetil, MCPB e seus sais e ésteres, Mecoprop e seus sais e ésteres, Mecoprop-P e seus sais e ésteres, Picloram e seus sais e ésteres, Quinclorac, Quinmerac, TBA (2,3,6) e seus sais e ésteres, Triclopir e seus sais e ésteres e ácido 5,6-dicloro-2-ciclopropil-4- pirimidinocarboxílico (H-9; CAS 858956-08-8), seus sais e ésteres; n. do grupo dos inibidores de transporte de auxina: Difluofenzopir, Diflufenzopir-nátrio, Naptalam e Naptalam-nátrio; o. do grupo dos outros herbicidas: Bromobutid, Clorflurenol, Clorflurenol metil, Cinmetilina, Cumiluron, Dalapon, Dazomet, Difenzoquat, Metilsulfato de Difenzoquat, Dimetipin, DSMA, Dimron, Endotal e seus sais, Etobenzanid, Flamprop, Flamprop-isopropil, Flamprop-metil, Flamprop-M- isopropil, Flamprop-M-metil, Flurenol, Flurenol-butil, Flurprimidol, Fosamin, Fosamina-amônio, Indanofan, Ácido malêinico-hidrazida, Mefluidid, Metam, Metilazida, Brometo de metila, Metildimron, Iodeto de metila. MSMA, Ácido oleico, Oxaziclomefon, Ácido pelargônico, Piributicarb, Quinoclamin, Triaziflam, Tridifan e 6-Cloro-3-(2-ciclopropil-6-metilfenóxi)-4-piridazinol (H-10; CAS 499223-49-3), seus sais e ésteres.
[0057] Exemplos de agentes de segurança C preferidos são Benoxacor, Cloquintocet, Ciometrinil, Ciprossulfamid, Diclormid, Diciclonon, Dietolato, Fenclorazol, Fenclorim, Flurazol, Fluxofenim, Furilazol, Isoxadifen, Mefenpir, Mefenat, Anidrido de ácido naftálico, Oxabetrinil, 4-(Dicloroacetil)-1- oxa-4-azaspiro[4.5]decan (H-11; MON4660, CAS 71526-07-3) e 2,2,5-Trimetil- 3-(dicloroacetil)-1,3-oxazolidin (H-12; R-29148, CAS 52836-31-4).
[0058] Os compostos de grupos (a) até (o) e os agentes de segurança C são herbicidas e agentes de segurança conhecidos; vide, por exemplo, The Compendium of Pesticide Common Names (http://www.alanwood.net/pesticides/); B. Hock, C. Fedtke, R. R. Schmidt, Herbicides, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1995. Outros efetores herbicidas são conhecidos por meio de WO 96/26202, WO 97/41116, WO 97/41117, WO 97/41118, WO 01/83459 e WO 2008/074991, bem como por meio de W. Kramer et al (ed.), Modern Crop Protection Compounds, Vol. 1, Wiley VCH, 2007 e a literatura ali mencionada.
[0059] Alguns dos herbicidas que são úteis em conjunto com os herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona de acordo com a presente invenção incluem benzobiciclon, mesotriona, sulcotriona, tefuriltriona, tembotriona, 4-hidróxi-3-[[2- (2-metoxietóxi)metil]-6-(trifluorometil)-3-piridinil]carbonil]-biciclo[3.2.1]-oct-3-en- 2-ona (biciclopirona), cetospiradox ou seu ácido livre, benzofenap, pirassulfotol, pirazolinato, pirazoxifen, topramezona, [2-cloro-3-(2-metoxietóxi)-4- (metilsulfonil)fenil](l-etil-5-hidróxi-1H-pirazol-4-il)-metanona, (2,3-di-hidro-3,3,4- trimetil-1,1-dioxidobenzo[b]tien-5-il)(5-hidróxi-1-metil-1H-pirazol-4-il)-metanona, isoxaclortol, isoxaflutol, α-(ciclopropilcarbonil)-2-(metilsulfonil)-β-oxo-4- clorobenzenopropanonitrila e α-(ciclopropilcarbonil)-2-(metilsulfonil)-β-oxo-4- (trifluorometil)-benzenopropanonitrila.
[0060] Em uma realização preferida, o herbicida adicional é topramezona.
[0061] Em uma realização particularmente preferida, o herbicida adicional é: - (1-etil-5-prop-2-inilóxi-1H-pirazol-4-il)-[4-metanossulfonil-2- metil-3-(3-metil-4,5-di-hidroisoxazol-5-il)-fenil]-metanona:
Figure img0006
ou - (1-etil-5-hidróxi-1H-pirazol-4-il)-[4-metanossulfonil-2-metil-3- (3-metil-4,5-di-hidroisoxazol-5-il)-fenil]-metanona:
Figure img0007
[0062] Os compostos descritos acima são detalhados em EP 09177628.6, que é integralmente incorporada ao presente como referência.
[0063] Herbicidas particularmente preferidos que podem ser empregados em conjunto com os compostos de acordo com a presente invenção incluem sulfonamidas, tais como metossulam, flumetsulam, cloransulam metil, diclossulam, penoxsulam e florassulam, sulfonilureias tais como clorimuron, tribenuron, sulfometuron, nicossulfuron, clorsulfuron, amidossulfuron, triassulfuron, prossulfuron, tritossulfuron, tifensulfuron, sulfossulfuron e metsulfuron, imidazolinonas tais como imazaquin, imazapic, imazetapir, imzapir, imazametabenzo e imazamox, ácidos fenoxialcanoicos tais como 2,4-D, MCPA, diclorprop e mecoprop, ácidos piridiniloxiacéticos tais como triclopir e fluroxipir; ácidos carboxílicos tais como clopiralid, picloram, aminopiralid e dicamba, dinitroanilinas tais como trifluralin, benefin, benfluralin e pendimetalin, cloroacetanilidas tais como alaclor, acetoclor e metolaclor, semicarbazonas (inibidores de transporte de auxina) tais como clorflurenol e diflufenzopir, ariloxifenoxipropionatos tais como fluazifop, haloxifop, diclofop, clodinafop e fenoxaprop e outros herbicidas comuns, incluindo glifosato, glufosinato, acifluorfen, bentazon, clomazona, fumiclorac, fluometuron, fomesafen, lactofen, linuron, isoproturon, simazina, norflurazon, paraquat, diuron, diflufenican, picolinafen, cinidon, setoxidim, tralcoxidim, quinmerac, isoxaben, bromoxinil, metribuzin e mesotriona.
[0064] Os herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, de acordo com a presente invenção podem ser adicionalmente utilizados em conjunto com glifosato e glufosinato sobre safras tolerantes a glifosato ou tolerantes a glufosinato.
[0065] Prefere-se geralmente utilizar os compostos de acordo com a presente invenção em combinação com herbicidas que sejam seletivos para a safra sendo tratada e que complementem o espectro de ervas controladas por esses compostos na taxa de aplicação empregada. Prefere-se ainda, de forma geral, aplicar os compostos de acordo com a presente invenção e outros herbicidas complementares ao mesmo tempo, seja como formulação de combinação ou como mistura de tanque.
[0066] A expressão “ácido nucleico mut-HPPD” designa um ácido nucleico HPPD que contém uma sequência que sofre mutação de um ácido nucleico HPPD do tipo selvagem e confere maior tolerância a “herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona” a plantas nas quais é expressa. Além disso, a expressão “hidroxifenil piruvato dioxigenase que sofreu mutação (mut-HPPD)” designa a substituição de um aminoácido das sequências primárias do tipo selvagem de SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, sua variante, derivado, homólogo, ortólogo ou parálogo com outro aminoácido. A expressão “aminoácido que sofreu mutação” será utilizada abaixo para designar o aminoácido que é substituído por outro aminoácido, de forma a designar o local da mutação na sequência primária da proteína.
[0067] A expressão “ácido nucleico mut-HST” designa um ácido nucleico HST que contém uma sequência que sofre mutação de um ácido nucleico HST do tipo selvagem e confere maior tolerância a “herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona” a plantas nas quais é expressa. Além disso, a expressão “homogenotisato solanesil transferase que sofreu mutação (mut-HST)” designa a substituição de um aminoácido das sequências primárias do tipo selvagem de SEQ ID NO: 48 ou 50 por outro aminoácido. A expressão “aminoácido que sofreu mutação” será utilizada abaixo para designar o aminoácido que é substituído por outro aminoácido, de forma a indicar o local da mutação na sequência primária da proteína.
[0068] Diversos HPPDs e suas sequências primárias foram descritos no estado da técnica, particularmente os HPPDs de bactérias tais como Pseudomonas (Ruetschi et al, Eur. J. Biochem., 205, 459-466, 1992, WO 96/38567), de plantas tais como Arabidopsis (WO 96/38567, Genebank AF047834) ou de cenoura (WO 96/38567, Genebank 87257) de coccicoides (Genebank COITRP), HPPDs de Brassica, algodão, Synechocystis e tomate (US 7.297.541), de mamíferos tais como camundongos ou porcos. Além disso, sequências de HPPD artificiais foram descritas, por exemplo, em US 6.768.044 e US 6.268.549.
[0069] Em uma realização preferida, a sequência de nucleotídeos de (i) compreende a sequência de SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 52, 54, 56, 68, 69 ou uma de suas variantes ou derivados.
[0070] Em uma realização particularmente preferida, o ácido nucleico mut-HPPD útil para a presente invenção compreende uma sequência de ácidos nucleicos que sofreu mutação de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 52 ou uma de suas variantes ou derivados.
[0071] Em outra realização preferida, a sequência de nucleotídeos de (ii) compreende a sequência de SEQ ID NO: 47, 49 ou uma de suas variantes ou derivados.
[0072] Além disso, os técnicos no assunto compreenderão que as sequências de nucleotídeos de (i) ou (ii) englobam homólogos, parálogos e ortólogos de SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 52, 54, 56, 68, 69 e, respectivamente, SEQ ID NO: 47 ou 49, conforme definido a seguir.
[0073] O termo “variante”, com relação a uma sequência (tal como uma sequência de polipeptídeos ou ácidos nucleicos, como uma sequência de nucleotídeos de regulagem da transcrição de acordo com a presente invenção), destina-se a indicar sequências substancialmente similares. Para sequências de nucleotídeos que compreendem um quadro de leitura aberta, as variantes incluem as sequências que, devido à degeneração do código genético, codificam a sequência de aminoácidos idêntica da proteína nativa. Variantes alélicas de ocorrência natural como essas podem ser identificadas com o uso de métodos de biologia molecular bem conhecidos, tais como métodos de hibridização e reação em cadeia de polimerase (PCR). Sequências de nucleotídeos variantes também incluem sequências de nucleotídeos derivadas sinteticamente, tais como as geradas, por exemplo, utilizando mutagênese dirigida a local e para quadros de leitura aberta, as que codificam a proteína nativa, bem como aquelas que codificam um polipeptídeo que possui substituições de aminoácidos com relação à proteína nativa. Geralmente, as variantes de sequências de nucleotídeos de acordo com a presente invenção possuirão pelo menos 30, 40, 50, 60 a 70%, tal como preferencialmente 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% a 79%, geralmente pelo menos 80%, tal como 81% a 84%, pelo menos 85%, tal como 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% a 98% e 99% de “identidade de sequências” de nucleotídeos com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 52, 54, 56, 68, 69, 47 ou 49. Por polipeptídeo “variante", indica-se um polipeptídeo derivado da proteína de SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 ou 67, por meio de exclusão (a chamada truncagem) ou adição de um ou mais aminoácidos à extremidade N-terminal e/ou C-terminal da proteína nativa; exclusão ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais locais na proteína nativa; ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais locais na proteína nativa. Essas variantes podem resultar, por exemplo, de polimorfismo genético ou de manipulação humana. Os métodos dessas manipulações são geralmente conhecidos na técnica.
[0074] Em uma realização preferida, variantes dos polinucleotídeos úteis para a presente invenção possuirão pelo menos 30, 40, 50, 60 a 70%, tal como preferencialmente 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% a 79%, geralmente pelo menos 80%, tal como 81% a 84%, pelo menos 85%, tal como 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% a 98% e 99% de “identidade de sequências” de nucleotídeos com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 52.
[0075] Reconhece-se que as moléculas de polinucleotídeos e polipeptídeos de acordo com a presente invenção englobam moléculas de polinucleotídeos e polipeptídeos que compreendem uma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos que é suficientemente idêntica às sequências de nucleotídeos descritas em SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 52, 54, 56, 68, 69, 47, 49 ou às sequências de aminoácidos descritas em SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 48 ou 50. A expressão “suficientemente idêntica" é utilizada no presente para designar uma primeira sequência de aminoácidos ou nucleotídeos que contém uma quantidade mínima ou suficiente de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos idênticos ou equivalentes (por exemplo, com cadeia lateral similar) a uma segunda sequência de nucleotídeos ou aminoácidos, de tal forma que as primeira e segunda sequências de nucleotídeos ou aminoácidos possuam domínio estrutural comum e/ou atividade funcional comum.
[0076] “Identidade de sequências” designa a extensão à qual duas sequências de DNA ou de aminoácidos idealmente alinhadas são invariáveis ao longo de toda uma janela de alinhamento de componentes, tais como nucleotídeos ou aminoácidos. Uma “fração de identidade” para segmentos alinhados de uma sequência de teste e uma sequência de referência é o número de componentes idênticos que são compartilhados pelas duas sequências alinhadas divididas pelo número total de componentes no segmento de sequências de referência, ou seja, a sequência de referência completa ou uma parte definida menor da sequência de referência. “Percentual de identidade” é a fração de identidade vezes 100. O alinhamento ideal de sequências de alinhmento de uma janela de comparação é bem conhecido dos técnicos no assunto e pode ser conduzido por meio de ferramentas tais como o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, a busca de método de similaridade de Pearson e Lipman, preferencialmente por meio de implementação computadorizada desses algoritmos tais como GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA disponíveis como parte do Pacote Wisconsin CGC (Accelrys Inc., Burlington, Mass.).
[0077] As expressões “polinucleotídeo(s)”, “sequência(s) de ácido(s) nucleico(s)”, “sequência(s) de nucleotídeo(s)", “ácido(s) nucleico(s)” e “molécula de ácido nucleico” são utilizados de forma intercambiável no presente e designam nucleotídeos, sejam eles ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos ou uma de suas combinações, em forma não ramificada polimérica com qualquer comprimento.
[0078] “Derivados” de uma proteína englobam peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e/ou enzimas que possuem substituições, exclusões e/ou inserções de aminoácidos com relação à proteína não modificada em questão e possuem atividade funcional e biológica similar à proteína não modificada da qual são derivados.
[0079] “Homólogos” de uma proteína englobam peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e/ou enzimas que possuem substituições, exclusões e/ou inserções de aminoácidos com relação à proteína não modificada em questão e possuem atividade funcional e biológica similar à proteína não modificada da qual são derivados.
[0080] Uma exclusão designa a remoção de um ou mais aminoácidos de uma proteína.
[0081] Inserção designa um ou mais resíduos de aminoácidos que são introduzidos em um local previamente determinado em uma proteína. Inserções podem compreender fusões N-terminais e/ou C-terminais bem como inserções intrassequenciais de aminoácidos isolados ou múltiplos. Geralmente, inserções na sequência de aminoácidos serão menores que fusões N ou C- terminais, da ordem de cerca de um a dez resíduos. Exemplos de proteínas de fusão N ou C-terminais ou peptídeos incluem o domínio de ligação ou domínio de ativação de um ativador de transcrição conforme utilizado no sistema bi- híbrido de levedura, proteínas de revestimento de fagos, marca de (histidina)-6, marca de glutationa S-transferase, proteína A, proteína de ligação de maltose, di-hidrofolato reductase, epítopo Marca 100, epítopo c-myc, epítopo FLAG®, lacZ, CMP (peptídeo de ligação de calmodulina), epítopo HA, epítopo de proteína C e epítopo VSV.
[0082] Substituição designa a substituição de aminoácidos da proteína por outros aminoácidos que possuam propriedades similares (tais como hidrofobicidade, hidrofilicidade, antigenicidade, propensão à formação ou rompimento de estruturas α-helicoidais ou estruturas de folhas β similares). Substituições de aminoácidos são tipicamente de resíduos isolados, mas podem ser reunidos dependendo de restrições funcionais colocadas sobre o polipeptídeo e podem variar de um a dez aminoácidos; as inserções serão normalmente da ordem de cerca de um a dez resíduos de aminoácidos. As substituições de aminoácidos são preferencialmente substituições de aminoácidos conservadoras. Tabelas de substituições conservadoras são bem conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Creighton (1984), Proteins, W. H. Freeman & Company (Eds)).
TABELA 3
[0083] Exemplos de substituições de aminoácidos conservadoras:
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[0084] Substituições, exclusões e/ou inserções de aminoácidos podem ser realizadas facilmente utilizando métodos sintéticos de peptídeos bem conhecidos na técnica, tais como síntese de peptídeos em fase sólida e similares, ou por meio da manipulação de DNA recombinante. Os métodos de manipulação de sequências de DNA para produzir variantes de substituição, inserção ou exclusão de uma proteína são bem conhecidos na técnica. Métodos de elaboração de mutações de substituição em locais previamente determinados em DNA são bem conhecidos dos técnicos no assunto, por exemplo, e incluem mutagênese de M13, mutagênese in vitro de Gene T7 (USB, Cleveland OH), mutagênese dirigida a local QuikChange (Stratagene, San Diego CA), mutagênese dirigida a local mediada por PCR ou outros protocolos de mutagênese dirigida a local.
[0085] “Derivados” incluem adicionalmente peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos que podem, em comparação com a sequência de aminoácidos da forma de ocorrência natural da proteína, tal como a proteína de interesse, compreender substituições de aminoácidos com resíduos de aminoácidos não de ocorrência natural ou adições de resíduos de aminoácidos não de ocorrência natural. “Derivados” de proteínas também englobam peptídeos, oligopeptídeos e polipeptídeos que compreendem resíduos de aminoácidos não alterados de ocorência natural ou alterados de ocorrência natural (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados, miristoilados, sulfatados etc.) em comparação com a sequência de aminoácidos de uma forma de ocorrência natural do polipeptídeo. Um derivado pode também compreender uma ou mais adições ou substituintes não de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos da qual é derivado, tal como uma molécula relatora ou outro ligante, ligado de forma covalente ou não covalente à sequência de aminoácidos, tal como uma molécula relatora que é ligada para facilitar a sua detecção, e resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural com relação à sequência de aminoácidos de uma proteína de ocorrência natural. Além disso, “derivados” também incluem fusões da forma de ocorrência natural da proteína com peptídeos marcadores tais como FLAG, HIS6 ou tiorredoxina (para análise de peptídeos marcadores, vide Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003).
[0086] “Ortólogos” e “parálogos” englobam conceitos evolucionários utilizados para descrever as relações ancestrais de genes. Os parálogos são genes dentro da mesma espécie que se originaram da duplicação de um gene ancestral; ortólogos são genes de diferentes organismos que se originaram por meio da formação de espécies e também são derivados de um gene ancestral comum. Uma lista não limitadora de exemplos desses ortólogos é exibida na Tabela 1.
[0087] É bem conhecido na técnica que parálogos e ortólogos podem compartilhar domínios distintos que abrigam resíduos de aminoácidos apropriados em dados locais, tais como bolsos de ligação para substratos específicos ou motivos de ligação para interação com outras proteínas.
[0088] O termo “domínio” designa um conjunto de aminoácidos conservados em posições específicas ao longo de um alinhamento de sequências de proteínas com evolução relacionada. Embora os aminoácidos em outras posições possam variar entre homólogos, aminoácidos que são altamente conservados em posições específicas indicam aminoácidos que são provavelmente essenciais na estrutura, estabilidade ou função de uma proteína. Identificados pelo seu alto grau de conservação em sequências alinhadas de uma família de homólogos de proteína, eles podem ser utilizados como identificadores para determinar se qualquer polipeptídeo em questão pertence a uma família de polipeptídeos identificada anteriormente.
[0089] A expressão “motivo” ou “sequência de consenso” designa uma região conservada curta na sequência de proteínas com evolução relacionada. Os motivos são partes de domínios que frequentemente possuem alta conservação, mas podem também incluir apenas parte do domínio ou estar localizadas fora do domínio conservado (se todos os aminoácidos do motivo se encontrarem fora de um domínio definido).
[0090] Existem bancos de dados especializados para identificação de domínios, tais como SMART (Schultz et al (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 5857-5864; Letunic et al (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242-244), InterPro (Mulder et al (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher e Bairoch (1994), A Generalized Profile Syntax for Biomolecular Sequences Motifs and its Function in Automatic Sequence Interpretation, em ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, Altman, R., Brutlag, D., Karp, P., Lathrop, R., Searls, D., Eds., págs. 53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al, Nucl. Acids Res. 32: D134-D137 (2004)) ou Pfam (Bateman et al, Nucleic Acids Research 30 (1): 276-280 (2002)). Um conjunto de ferramentas para análise in silico de sequências de proteínas é disponível no servidor proteômico ExPASy (Instituto Suíço de Bioinformática (Gasteiger et al, ExPASy: The Proteomics Server for In-Depth Protein Knowledge and Analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784-3788(2003)). Domínios ou motivos podem também ser identificados utilizando métodos rotineiros, tais como alinhamento de sequências.
[0091] Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica e esses métodos incluem GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. GAP utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443-453), para encontrar o alinhamento global (ou seja, que cobre as sequências completas) de duas sequências que maximiza o número de coincidências e minimiza o número de intervalos. O algoritmo BLAST (Altschul et al (1990), J. Mol. Biol. 215: 403-10) calcula o percentual de identidade de sequências e realiza análise estatística da similaridade entre as duas sequências. O software para realização de análises BLAST é disponível ao público por meio do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas (NCBI). Homólogos podem ser facilmente identificados utilizando, por exemplo, o algoritmo de alinhamento de sequências múltiplas ClustalW (versão 1.83) com os parâmetros de alinhamento em pares padrão e um método de avaliação percentual. Percentuais globais de similaridade e identidade podem também ser determinados utilizando um dos métodos disponíveis no pacote de software MatGAT (Campanella et al, BMC Bioinformatics, dez de julho de 2003; 4: 29, MatGAT: an Application that Generates Similarity/Identity Matrices Using Protein or DNA Sequences). Podem ser realizadas pequenas edições manuais para otimizar o alinhamento entre motivos conservados, como seria evidente para os técnicos no assunto. Além disso, em vez de utilizar sequências com comprimento total para identificação de homólogos, podem também ser empregados domínios específicos. Os valores de identidade de sequências podem ser determinados ao longo de toda a sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos ou de domínios selecionados ou motivo(s) conservado(s), utilizando os programas mencionados acima utilizando os parâmetros padrão. Para alinhamentos locais, o algoritmo de Smith-Waterman é particularmente útil (Smith, T. F., Waterman, M. S. (1981), J. Mol. Biol. 147 (1); 195-7).
[0092] Os inventores da presente invneção descobriram, surpreendentemente, que, substituindo um ou mais dos resíduos de aminoácidos principais, a resistência ou tolerância a herbicidas poderá ser notadamente aumentada em comparação com a atividade das enzimas HPPD do tipo selvagem com SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67. Substituições preferidas de mut-HPPD são aquelas que aumentam a tolerância a herbicidas da planta, mas deixam a atividade biológica da atividade de dioxigenase substancialmente não afetada.
[0093] Consequentemente, em outro objeto da presente invenção, os resíduos de aminoácidos principais de uma enzima de HPPD que compreende SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 ou uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos são substituídos por qualquer outro aminoácido.
[0094] Em uma realização, os resíduos de aminoácidos principais de uma enzima HPPD, sua variante, derivado, ortólogo, parálogo ou homólogo são substituídos por um aminoácido conservado conforme ilustrado na Tabela 3 acima.
[0095] Os técnicos no assunto compreenderão que os aminoácidos localizados em boa proximidade das posições de aminoácidos mencionadas acima podem também ser substituídos. Desta forma, em outra realização, o mut-HPPD útil para a presente invenção compreende uma sequência de SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 ou uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que um aminoácido a ±3, ±2 ou ±1 posições de aminoácidos de um aminoácido principal é substituído por qualquer outro aminoácido.
[0096] Com base em métodos bem conhecidos na técnica, pode ser desenvolvido um padrão de sequência altamente característico, por meio do qual possíveis mut-HPPDs adicionais com a atividade desejada podem ser pesquisados.
[0097] A pesquisa por possíveis mut-HPPD adicionais por meio da aplicação de um padrão de sequências apropriado também seria englobada pela presente invenção. Os técnicos no assunto compreenderão que o padrão de sequências do presente não é limitado pelas distâncias exatas entre dois resíduos de aminoácidos adjacentes do mencionado padrão. Cada uma das distâncias entre dois vizinhos nos padrões acima pode variar independentemente entre si, por exemplo, em até ±10, ±5, ±3, ±2 ou ±1 posições de aminoácidos sem afetar substancialmente a atividade desejada.
[0098] De forma alinhada com a análise funcional e espacial mencionada acima de resíduos de aminoácidos individuais com base nos dados cristalográficos obtidos de acordo com a presente invenção, podem ser identificadas sequências de aminoácidos parciais exclusivas e características de possíveis mut-HPPD potencialmente úteis de acordo com a presente invenção.
[0099] Em uma realização particularmente preferida, mut-HPPD refere-se a uma variante ou derivado de SEQ ID NO: 2, em que as substituições são selecionadas a partir da Tabela 4a a seguir.
TABELA 4A
[00100] SEQ ID N° 2: substituições de aminoácidos isoladas.
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[00101] Dever-se-á compreender que qualquer aminoácido além dos mencionados nas tabelas acima poderá ser utilizado como substituinte. Testes para determinar a funcionalidade desses mutantes são facilmente disponíveis na técnica e, respectivamente, descritos no capítulo de Exemplos da presente invenção.
[00102] Em realização preferida, a sequência de aminoácidos de mut-HPPD difere de uma sequência de aminoácidos de HPPD do tipo selvagem em uma ou mais das posições a seguir correspondente às posições: 212, 213, 215, 236, 238, 250, 252, 254, 265, 267, 278, 279, 309, 320, 321, 334, 353, 366, 371, 375, 377, 403, 404, 406, 407, 409, 411, 410, 412 ou 416 of SEQ ID NO: 2.
[00103] Exemplos de diferenças nessas posições de aminoácidos incluem, mas sem limitações, uma ou mais das seguintes: - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 236 é diferente de alanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 411 é diferente de ácido glutâmico; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 320 é diferente de leucina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 403 é diferente de glicina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 334 é diferente de leucina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 353 é diferente de leucina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 321 é diferente de prolina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 212 é diferente de valina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 407 é diferente de glicina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 377 é diferente de fenilalanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 412 é diferente de leucina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 278 é diferente de glutamina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 406 é diferente de lisina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 404 é diferente de fenilalanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 409 é diferente de fenilalanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 416 é diferente de isoleucina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 250 é diferente de leucina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 267 é diferente de asparagina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 252 é diferente de serina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 265 é diferente de prolina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 371 é diferente de glicina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 375 é diferente de treonina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 309 é diferente de arginina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 279 é diferente de isoleucina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 366 é diferente de fenilalanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 238 é diferente de fenilalanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 213 é diferente de valina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 215 é diferente de asparagina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 410 é diferente de serina; e - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 254 é diferente de valina.
[00104] Em algumas realizações, a enzima mut-HPPD compreende um polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, uma de suas variantes, derivados, homólogos ou ortólogos que possuem uma ou mais substituições nas posições a seguir: - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 236 é leucina, serina ou arginina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 411 é treonina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 320 é asparagina, glutamina, histidina ou tirosina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 403 é arginina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 334 é ácido glutâmico ou cisteína; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 353 é metionina, tirosina, alanina ou serina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 321 é alanina, arginina, glicina ou asparagina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 212 é isoleucina ou leucina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 407 é cisteína ou histidina; o aminoácido localizado ou correspondente à posição 377 é alanina, leucina ou serina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 412 é metionina, fenilalanina, triptofano, alanina ou serina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 278 é histidina, asparagina ou serina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 406 é treonina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 404 é leucina ou prolina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 409 é isoleucina ou histidina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 416 é valina ou fenilalanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 250 é valina ou metionina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 267 é tirosina ou glutamina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 252 é treonina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 265 é alanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 371 é isoleucina ou fenilalanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 375 é prolina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 309 é lisina ou alanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 279 é treonina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 366 é isoleucina, leucina ou tirosina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 238 é valina ou alanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 213 é treonina ou alanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 215 é alanina ou histidina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 410 é glicina; e - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 254 é alanina.
[00105] Além disso, os inventores da presente invenção descobriram, surpreendentemente, que, substituindo pelo menos dois dos resíduos de aminoácidos principais de SEQ ID NO: 2 por resíduos específicos, a resistência ou tolerância a herbicidas poderá ser notadamente aumentada em comparação com a atividade das enzimas HPPD do tipo selvagem ou enzimas HPPD nas quais somente um resíduo de aminoácido tenha sido substituído. Portanto, em outra realização preferida da presente invenção, a variante ou o derivado de mut-HPPD designa um polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, em que dois, três, quatro ou cinco aminoácidos principais são substituídos por outro resíduo de aminoácido. Mutações duplas, triplas, quádruplas ou quíntuplas particularmente preferidas são descritas na Tabela 4b.
TABELA 4B
[00106] Com referência a SEQ ID NO: 2 - substituições de aminoácidos combinadas:
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[00107] Em uma realização particularmente preferida, a enzima mut-HPPD que compreende um polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, uma de suas variantes, derivados, homólogos, parálogos ou ortólogos, úteis para a presente invenção compreende um ou mais dos seguintes: o aminoácido localizado ou correspondente à posição 320 é histidina, asparagina ou glutamina; a posição de aminoácido 334 é ácido glutâmico; a posição de aminoácido 353 é metionina; o aminoácido localizado ou correspondente à posição 321 é alanina ou arginina; e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 212 é isoleucina.
[00108] Em uma realização de preferência especialmente específica, mut-HPPD designa um polipeptídeo que compreende SEQ ID NO: 2, em que a leucina localizada ou correspondente à posição 320 é substituída por histidina e a prolina localizada ou correspondente à posição 321 é substituída por alanina.
[00109] Em outra realização de preferência especialmente específica, mut-HPPD designa um polipeptídeo que compreende SEQ ID NO: 2, em que a leucina localizada ou correspondente à posição 353 é substituída por metionina, a prolina localizada ou correspondente à posição 321 é substituída por arginina e a leucina localizada ou correspondente à posição 320 é substituída por asparagina.
[00110] Em outra realização de preferência especialmente específica, mut-HPPD designa um polipeptídeo que compreende SEQ ID NO: 2, em que a leucina localizada ou correspondente à posição 320 é substituída por metionina, a prolina localizada ou correspondente à posição 321 é substituída por arginina e a leucina localizada ou correspondente à posição 320 é substituída por glutamina.
[00111] Em outra realização preferida, mut-HPPD designa uma variante ou derivado de SEQ ID NO: 53, em que as substituições são selecionadas a partir da Tabela 4c a seguir.
TABELA 4C
[00112] SEQ ID N° 53 - substituições de aminoácidos isoladas:
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[00113] Dever-se-á compreender que qualquer aminoácido diferente dos mencionados nas tabelas acima poderá ser utilizado como substituto. Testes para determinar a funcionalidade desses mutantes são facilmente disponíveis na técnica e, respectivamente, descritos no capítulo de Exemplos da presente invenção.
[00114] Em outra realização preferida, a sequência de aminoácidos de mut-HPPD difere de uma sequência de aminoácidos de HPPD do tipo selvagem em uma ou mais das posições correspondentes às posições de SEQ ID NO: 53 a seguir: 228, 230, 251, 253, 265, 267, 280, 282, 291, 293, 294, 324, 335, 336, 337, 339, 340, 363, 368, 381, 385, 386, 390, 392, 393, 419, 421, 422, 424, 427, 431, 425, 269.
[00115] Exemplos de diferenças nessas posições de aminoácidos incluem, mas sem limitações, um ou mais dos seguintes: - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 228 é diferente de valina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 230 é diferente de asparagina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 251 é diferente de alanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 253 é diferente de fenilalanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 265 é diferente de leucina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 267 é diferente de serina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 280 é diferente de prolina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 282 é diferente de asparagina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 291 é diferente de lisina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 293 é diferente de glutamina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 294 é diferente de isoleucina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 324 é diferente de arginina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 é diferente de metionina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 é diferente de prolina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 é diferente de serina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 é diferente de prolina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 é diferente de prolina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 é diferente de ácido glutâmico; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 368 é diferente de leucina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 381 é diferente de fenilalanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 é diferente de leucina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 386 é diferente de glicina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 390 é diferente de treonina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 392 é diferente de fenilalanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 393 é diferente de isoleucina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 419 é diferente de fenilalanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 421 é diferente de lisina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 422 é diferente de glicina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 424 é diferente de fenilalanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 427 é diferente de leucina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 431 é diferente de isoleucina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 425 é diferente de serina; e - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 269 é diferente de valina.
[00116] Em algumas realizações, a enzima mut-HPPD compreende uma ou mais substituições em posições correspondentes às posições a seguir de SEQ ID NO: 53: - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 228 é Thr ou Ala; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 230 é Ala ou His; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 251 é Ser ou Arg; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 253 é Val ou Ala; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 265 é Val ou Met; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 267 é treonina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 280 é Ala; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 282 é Tyr ou Gln; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 291 é Arg ou Ala; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 293 é alanina, leucina, isoleucina, valina, histidina, asparagina ou serina, preferencialmente histidina, asparagina ou serina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 294 é treonina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 324 é Lys ou Ala; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 é alanina, triptofano, fenilalanina, leucina, isoleucina, valina, asparagina, glutamina, histidina, tirosina, serina, treonina ou cisteína, preferencialmente Gln, Asn, His ou Tyr; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 é alanina, arginina, Gly ou Asn, preferencialmente alanina ou glicina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 é alanina, treonina ou prolina, preferencialmente treonina ou prolina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 é excluído; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 é glicina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 é glutamina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 368 é metionina ou tirosina, preferencialmente metionina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 381 é Ile, Leu ou Tyr, preferencialmente isoleucina ou leucina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 é valina, alanina, Gln ou Asp, preferencialmente valina ou ácido aspártico; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 386 é Ile ou Phe; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 390 é Pro; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 392 é alanina, leucina ou serina, preferencialmente alanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 393 é Ala, Leu, Phe ou Val, preferencialmente leucina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 419 é Leu ou Pro; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 421 é treonina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 422 é histidina, metionina, fenilalanina ou cisteína, preferencialmente histidina ou cisteína; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 424 é Ala ou His; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 427 é fenilalanina, triptofano, Ala, Ser ou Met, preferencialmente fenilalanina; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 431 é Val ou Phe; - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 425 é glicina; e - o aminoácido localizado ou correspondente à posição 269 é alanina.
[00117] Além disso, os inventores da presente invenção descobriram que, substituindo pelo menos dois dos resíduos de aminoácidos principais de SEQ ID NO: 53 por resíduos específicos, a resistência ou tolerância a herbicidas poderá ser notadamente aumentada em comparação com a atividade das enzimas HPPD do tipo selvagem ou enzimas HPPD nas quais somente um resíduo de aminoácido tenha sido substituído. Portanto, em outra realização preferida da presente invenção, a variante ou o derivado de mut-HPPD designa um polipeptídeo de SEQ ID NO: 53, seu homólogo, ortólogo ou parálogo, em que dois, três, quatro ou cinco aminoácidos principais são substituídos por outro resíduo de aminoácido. Mutações duplas, triplas, quádruplas ou quíntuplas particularmente preferidas são descritas na Tabela 4d.
TABELA 4D
[00118] Com referência a SEQ ID NO: 53 - substituições de aminoácidos combinadas:
Figure img0015
Figure img0016
[00119] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala ou Arg e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 353 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00120] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00121] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00122] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala ou Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 de SEQ ID NO: 53 é Ala, Val.
[00123] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00124] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 de SEQ ID NO: 53 é Val.
[00125] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00126] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 de SEQ ID NO: 53 é Val.
[00127] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 de SEQ ID NO: 53 é Ala, Val e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 393 de SEQ ID NO: 53 é Ala, Leu.
[00128] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 393 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00129] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 393 de SEQ ID NO: 53 é Leu.
[00130] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 de SEQ ID NO: 53 é Val e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 393 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00131] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 de SEQ ID NO: 53 é Val e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 393 de SEQ ID NO: 53 é Leu.
[00132] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 393 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00133] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 393 de SEQ ID NO: 53 é Leu.
[00134] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 de SEQ ID NO: 53 é Val e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 393 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00135] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 de SEQ ID NO: 53 é Val e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 393 de SEQ ID NO: 53 é Leu.
[00136] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 de SEQ ID NO: 53 é Ala, Val e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 393 de SEQ ID NO: 53 é Ala, Leu.
[00137] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 393 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00138] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 393 de SEQ ID NO: 53 é Leu.
[00139] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 de SEQ ID NO: 53 é Val e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 393 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00140] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 385 de SEQ ID NO: 53 é Val e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 393 de SEQ ID NO: 53 é Leu.
[00141] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ala, Trp, Phe, Leu, Ile, Val, Asn, Gln, His, Tyr, Ser, Thr, Cys e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, Arg, Gly.
[00142] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00143] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg.
[00144] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00145] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Trp e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00146] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Trp e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg.
[00147] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Trp e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00148] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Phe e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00149] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Phe e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg.
[00150] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Phe e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00151] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Leu e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00152] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Leu e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg.
[00153] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Leu e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00154] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ile e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00155] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ile e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg.
[00156] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ile e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00157] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Val e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00158] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Val e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg.
[00159] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Val e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00160] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Asn e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00161] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Asn e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg.
[00162] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Asn e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00163] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Gln e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00164] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Gln e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg.
[00165] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Gln e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00166] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é His e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00167] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é His e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg.
[00168] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é His e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00169] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Tyr e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00170] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Tyr e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg.
[00171] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Tyr e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00172] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ser e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00173] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ser e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg.
[00174] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ser e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00175] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Thr e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00176] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Thr e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg.
[00177] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Thr e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00178] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Cys e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala.
[00179] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Cys e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg.
[00180] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Cys e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00181] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende a sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ala, Trp, Phe, Leu, Ile, Val, Asn, Gln, His, Tyr, Ser, Thr, Cys e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, Arg, Gly e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00182] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende a sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00183] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00184] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00185] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Trp, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00186] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Trp, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00187] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Trp, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00188] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende a sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Phe, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00189] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Phe, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00190] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Phe, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00191] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Leu, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00192] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Leu, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00193] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Leu, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00194] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ile, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00195] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ile, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00196] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ile, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00197] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Val, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00198] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Val, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00199] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Val, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00200] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Asn, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00201] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Asn, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00202] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Asn, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00203] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00204] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00205] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00206] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é His, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00207] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é His, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00208] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é His, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00209] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Tyr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00210] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Tyr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00211] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Tyr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00212] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ser, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00213] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ser, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00214] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ser, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00215] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00216] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00217] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00218] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Cys, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00219] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Cys, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00220] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Cys, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 363 de SEQ ID NO: 53 é Gln.
[00221] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ala, Trp, Phe, Leu, Ile, Val, Asn, Gln, His, Tyr, Ser, Thr, Cys, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, Arg, Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, Pro, Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00222] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00223] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00224] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00225] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00226] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00227] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00228] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00229] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende a sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00230] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00231] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Trp, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00232] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Trp, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00233] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Trp, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00234] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Trp, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00235] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Trp, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00236] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Trp, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00237] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Trp, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00238] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Trp, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00239] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Trp, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00240] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Phe, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00241] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Phe, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00242] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Phe, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00243] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Phe, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00244] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Phe, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00245] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Phe, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00246] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Phe, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00247] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Phe, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00248] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Phe, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00249] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Leu, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00250] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Leu, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00251] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Leu, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00252] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Leu, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00253] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Leu, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00254] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Leu, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00255] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Leu, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00256] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Leu, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00257] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Leu, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00258] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ile, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00259] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ile, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00260] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ile, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00261] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ile, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00262] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ile, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00263] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ile, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00264] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ile, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00265] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ile, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00266] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ile, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00267] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Val, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00268] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Val, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00269] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Val, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00270] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Val, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00271] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Val, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00272] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Val, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00273] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Val, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00274] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Val, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00275] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Val, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00276] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Asn, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00277] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Asn, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00278] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Asn, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00279] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Asn, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00280] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Asn, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00281] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Asn, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00282] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Asn, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00283] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Asn, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00284] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Asn, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00285] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00286] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00287] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00288] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00289] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00290] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00291] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00292] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00293] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Gln, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00294] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é His, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00295] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é His, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00296] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é His, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00297] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é His, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00298] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é His, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00299] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é His, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00300] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é His, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00301] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é His, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00302] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é His, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00303] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Tyr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00304] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Tyr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00305] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Tyr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00306] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Tyr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00307] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Tyr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00308] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Tyr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00309] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Tyr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00310] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Tyr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00311] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Tyr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00312] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ser, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00313] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ser, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00314] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ser, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00315] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ser, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00316] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ser, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00317] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ser, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00318] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ser, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00319] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ser, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00320] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Ser, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00321] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00322] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00323] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00324] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00325] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00326] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00327] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00328] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00329] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00330] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Cys, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00331] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Cys, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00332] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Cys, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00333] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Cys, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00334] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Cys, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00335] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Cys, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Arg, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00336] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Cys, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Ala, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00337] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende uma sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Cys, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Pro, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00338] Em outra realização preferida, o mut-HPPD compreende a sequência de SEQ ID NO: 53, uma de suas variantes, derivados, ortólogos, parálogos ou homólogos, em que o aminoácido localizado ou correspondente à posição 335 de SEQ ID NO: 53 é Cys, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 336 de SEQ ID NO: 53 é Gly, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 337 de SEQ ID NO: 53 é Thr, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 339 de SEQ ID NO: 53 é excluído e o aminoácido localizado ou correspondente à posição 340 de SEQ ID NO: 53 é Gly.
[00339] Em outra realização, a variante ou derivado da enzima HPPD de SEQ ID NO: 67 compreende uma ou mais das substituições a seguir: - a alanina localizada ou correspondente à posição 8 é substituída por treonina; - a glicina localizada ou correspondente à posição 68 é substituída por alanina; - a valina na posição 261 é substituída por alanina; - a metionina localizada ou correspondente à posição 301 é substituída por isoleucina; - a metionina localizada ou correspondente à posição 327 é substituída por leucina; - a alanina localizada ou correspondente à posição 328 é substituída por prolina; - a treonina localizada ou correspondente à posição 331 é substituída por prolina; - a arginina localizada ou correspondente à posição 341 é substituída por ácido glutâmico; - a lisina localizada ou correspondente à posição 352 é substituída por asparagina; - a leucina localizada ou correspondente à posição 360 é substituída por metionina; - a leucina localizada ou correspondente à posição 383 é substituída por fenilalanina; e - a glicina localizada ou correspondente à posição 414 é substituída por ácido aspártico.
[00340] Em outra realização, a variante ou derivado da enzima HPPD de SEQ ID NO: 67 compreende uma ou mais das substituições a seguir: - a alanina localizada ou correspondente à posição 8 é substituída por treonina; - a histidina localizada ou correspondente à posição 44 é substituída por glutamina; - a glicina na posição 68 é substituída por alanina; - a alanina localizada ou correspondente à posição 71 é substituída por valina; - a fenilalanina na posição 98 é substituída por leucina; - a fenilalanina localizada ou correspondente à posição 233 é substituída por metionina; - a alanina localizada ou correspondente à posição 253 é substituída por treonina; - a valina localizada ou correspondente à posição 261 é substituída por alanina; - a metionina localizada ou correspondente à posição 301 é substituída por isoleucina; - a glutamina localizada ou correspondente à posição 316 é substituída por arginina; - a metionina localizada ou correspondente à posição 327 é substituída por leucina; - a alanina localizada ou correspondente à posição 328 é substituída por prolina; - a treonina localizada ou correspondente à posição 331 é substituída por prolina; - a arginina localizada ou correspondente à posição 341 é substituída por cisteína; - a lisina localizada ou correspondente à posição 352 é substituída por asparagina; - a leucina localizada ou correspondente à posição 360 é substituída por metionina; - a leucina localizada ou correspondente à posição 383 é substituída por fenilalanina; e - a serina localizada ou correspondente à posição 417 é substituída por glicina.
[00341] Em uma realização preferida adicional, a sequência de aminoácidos difere de uma sequência de aminoácidos de HPPD de SEQ ID NO: 57 correspondente à posição 418. Preferencialmente, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 418 é diferente de alanina. De maior preferência, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 418 é treonina.
[00342] Em uma realização preferida adicional, a sequência de aminoácidos difere de uma sequência de aminoácidos de HPPD de SEQ ID NO: 57 correspondente à posição 237. Preferencialmente, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 237 é diferente de serina. De maior preferência, o aminoácido localizado ou correspondente à posição 237 é leucina.
[00343] As posições correspondentes, ou seja, os locais preferidos para substituição encontram-se relacionados na Tabela 4e a seguir TABELA 4E
Figure img0017
Figure img0018
TABELA 4E (CONTINUAÇÃO)
Figure img0019
Figure img0020
[00344] Encontrar-se-á dentro do conhecimento dos técnicos no assunto a identificação de regiões conservadas e motivos compartilhados entre os homólogos, ortólogos e parálogos de SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 e, respectivamente, SEQ ID NO: 48 ou 50, tais como os ilustrados na Tabela 1. Após a identificação dessas regiões conservadas que podem representar motivos de ligação apropriados, aminoácidos correspondentes aos aminoácidos relacionados na Tabela 4a e 4b, 4c e 4d podem ser selecionados para substituição por qualquer outro aminoácido, preferencialmente por aminoácidos conservados conforme exibido na Tabela 3 e, de maior preferência, pelos aminoácidos das Tabelas 4a e 4b, 4c e 4d.
[00345] Além disso, a presente invenção refere-se a um método de identificação de um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, utilizando mut-HPPD codificado por um ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 52, 54, 56, 68, 69 ou uma de suas variantes ou derivados e/ou utilizando um mut-HST codificado por um ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 47, 49 ou uma de suas variantes ou derivados.
[00346] O mencionado método compreende as etapas de: (a) geração de planta ou célula transgênica que compreende um ácido nucleico que codifica um mut-HPPD, em que o mut-HPPD é expresso; (b) aplicação de um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, à planta ou célula transgênica de (a) e a uma planta ou célula controle da mesma variedade; (c) determinação do crescimento ou da viabilidade da planta ou célula transgênica e da planta ou célula controle após a aplicação do mencionado herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona; e (d) seleção de “herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona”, que conferem redução do crescimento à planta ou célula controle em comparação com o crescimento da planta ou célula transgênica.
[00347] Por “célula controle” ou “célula hospedeira, célula vegetal, tecido vegetal ou planta do tipo selvagem similar”, indica-se uma planta, tecido vegetal, célula vegetal ou célula hospedeira respectivamente, que não apresenta as características de resistência a herbicidas e/ou polinucleotídeo específico de acordo com a presente invenção que são descritas no presente. O uso da expressão “tipo selvagem”, portanto, não se destina a indicar que uma planta, tecido vegetal, célula vegetal ou outra célula hospedeira não possui DNA recombinante no seu genoma e/ou não possui características resistentes a herbicidas que são diferentes das descritas no presente.
[00348] Outro objeto refere-se a um método de identificação de uma sequência de nucleotídeos que codifica um mut-HPPD que é resistente ou tolerante a um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em que o método compreende: (e) geração de uma biblioteca de ácidos nucleicos codificadores de mut-HPPD; (f) seleção de uma população dos ácidos nucleicos que codificam mut-HPPD resultantes por meio da expressão de cada um dos mencionados ácidos nucleicos em uma célula ou planta e tratamento da mencionada planta ou célula com um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona; (g) comparação dos níveis de tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, fornecidos pela mencionada população de ácidos nucleicos codificadores de mut-HPPD com o nível de tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, fornecido por um ácido nucleico codificador de HPPD controle; e (h) seleção de pelo menos um ácido nucleico codificador de mut-HPPD que fornece nível significativamente aprimorado de tolerância a um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em comparação com o fornecido pelo ácido nucleico codificador de HPPD controle.
[00349] Em uma realização preferida, o ácido nucleico codificador de mut-HPPD selecionado na etapa (d) fornece pelo menos duas vezes mais tolerância ou resistência de uma célula ou planta a um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em comparação com o fornecido pelo ácido nucleico codificador de HPPD controle.
[00350] Em uma realização preferida adicional, o ácido nucleico codificador de mut-HPPD selecionado na etapa (d) fornece pelo menos duas vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos vinte vezes, pelo menos cinquenta vezes, pelo menos cem vezes ou pelo menos quinhentas vezes mais tolerância ou resistência de uma célula ou planta a um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em comparação com o fornecido pelo ácido nucleico codificador de HPPD controle.
[00351] A resistência ou tolerância pode ser determinada por meio da geração de uma planta transgênica ou célula hospedeira, preferencialmente uma célula vegetal, que compreende uma sequência de ácidos nucleicos da biblioteca da etapa (a) e comparação da mencionada planta transgênica com uma planta controle ou célula hospedeira, preferencialmente célula vegetal.
[00352] Outro objeto refere-se a um método de identificação de uma planta ou alga que contém um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um mut-HPPD ou mut-HST que é resistente ou tolerante a um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em que o método compreende: (a) identificação de quantidade eficaz de um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em um cultivo de células vegetais ou algas verdes que gera a morte das mencionadas células; (b) tratamento das mencionadas células vegetais ou algas verdes com um agente de mutagênese; (c) contato da mencionada população de células que sofreram mutagênese com quantidade eficaz de herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, identificado em (a); (d) seleção de pelo menos uma célula que sobrevive a essas condições de teste; e e. amplificação por PCR e sequenciamento de genes HPPD e/ou HST a partir de células selecionadas em (d) e comparação dessas sequências com sequências genéticas de HPPD ou HST do tipo selvagem, respectivamente.
[00353] Em uma realização preferida, o mencionado agente de mutagênese é metanossulfonato de etila (EMS).
[00354] Muitos métodos bem conhecidos dos técnicos no assunto são disponíveis para obter posíveis ácidos nucleicos apropriados para identificar uma sequência de nucleotídeos que codifica mut-HPPD a partir de uma série de potenciais organismos originais diferentes, incluindo micróbios, plantas, fungos, algas, culturas misturadas etc., bem como fontes ambientais de DNA tais como solo. Estes métodos incluem, entre outros, a preparação de bibliotecas de cDNA ou DNA genômico, o uso de primers de oligonucleotídeos adequadamente degenerados, o uso de sondas com base em sequências conhecidas ou testes de complementação (por exemplo, para crescimento mediante tirosina), bem como o uso de mutagênese e comutação para fornecer sequências de codificação de mut-HPPD recombinadas ou comutadas.
[00355] Ácidos nucleicos que compreendem posíveis sequências de codificação de HPPD e controle podem ser expressos em leveduras, em uma linhagem hospedeira bacteriana, em algas ou em plantas superiores, tais como fumo ou Arabidopsis, e os níveis relativos de tolerância inerente das sequências de codificação de HPPD selecionadas de acordo com um fenótipo indicador visível da planta ou linhagem transformada na presença de diferentes concentrações do herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, selecionado. Reações de dosagem e alterações relativas das reações de dosagem associadas a esses fenótipos indicadores (formação de coloração marrom, inibição de crescimento e efeito herbicida etc.) são convenientemente expressas, por exemplo, em termos de valores GR50 (concentração para redução de 50% do crescimento) ou MIC (concentração mínima inibidora), em que aumentos de valores correspondem a aumentos da tolerância inerente do HPPD expresso. Em um sistema de teste relativamente rápido com base na transformação de bactérias tais como E. coli, por exemplo, cada sequência codificadora de mut-HPPD pode ser expressa, por exemplo, na forma de sequência de DNA sob controle de expressão de um promotor controlável, tal como o promotor lacZ, e considerando adequadamente, por exemplo com o uso de DNA sintético, questões como o uso de códons para obter o nível mais comparável possível de expressão de diferentes sequências de HPPD. Essas linhagens que expressam ácidos nucleicos que compreendem possíveis sequências de HPPD podem ser colocadas em placas sobre diferentes concentrações do herbicida inibidor de HPPD selecionado, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, opcionalmente, em um meio suplementado com tirosina e os níveis relativos de tolerância inerente das enzimas de HPPD expressas são estimados com base na extensão e MIC para inibição da formação do pigmento oncronótico marrom.
[00356] Em outra realização, possíveis ácidos nucleicos são transformados em material vegetal para gerar uma planta transgênica, regenerados em plantas férteis morfologicamente normais que são medidas em seguida para determinar a tolerância diferencial para herbicidas inibidores de HPPD selecionados, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona. Vários métodos apropriados de transformação utilizando marcadores de seleção apropriados tais como canamicina, vetores binários tais como de Agrobacterium e regeneração vegetal, por exemplo, a partir de discos de folhas de fumo são bem conhecidos na técnica. Opcionalmente, uma população controle de plantas é transformada, de forma similar, com um ácido nucleico que expressa o HPPD controle. Alternativamente, uma planta dicotiledônea não transformada tal como Arabidopsis ou fumo pode ser utilizada como controle, pois, neste caso, ela expressa o seu próprio HPPD endógeno. Os níveis de tolerância a herbicidas médios e distribuição de uma série de eventos de transformação vegetal primários ou sua prole a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona são avaliados da forma normal com base em danos às plantas, sintomas de branqueamento meristemático etc. em uma série de concentrações diferentes de herbicidas. Estes dados podem ser expressos, por exemplo, em termos de valores GR50 derivados de curvas de reação à dosagem que possuem “dose” plotada sobre o eixo x e “percentual de morte”, “efeito herbicida", "quantidade de plantas verdes emergentes" etc. plotados sobre o eixo y, em que valores GR50 mais altos correspondem a níveis mais altos de tolerância inerente do HPPD expresso. Os herbicidas podem ser adequadamente aplicados de forma pré- emergente ou pós-emergente.
[00357] Outro objeto designa um ácido nucleico isolado que codifica mut-HPPD, em que o ácido nucleico é identificável por meio de um método conforme definido acima.
[00358] Em outra realização, a presente invenção refere-se a uma célula vegetal transformada por um ácido nucleico HPPD do tipo selvagem ou que sofreu mutação ou a uma célula vegetal que tenha sofrido mutação para obter uma planta que expressa nucleico HPPD do tipo selvagem ou que sofreu mutação, em que a expressão do ácido nucleico na célula vegetal resulta em aumento da resistência ou tolerância a um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em comparação com uma variedade do tipo selvagem da célula vegetal.
[00359] O termo “expressão” ou “expressão genética” indica a transcrição de um ou mais genes específicos ou construção genética específica. O termo “expressão” ou “expressão genética” indica particularmente a transcrição de um ou mais genes ou construção genética em RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou mRNA com ou sem tradução subsequente desta última em uma proteína. O processo inclui a transcrição de DNA e o processamento do produto de mRNA resultante.
[00360] Para obter o efeito desejado, ou seja, plantas que são tolerantes ou resistentes ao herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona de acordo com a presente invenção, compreender-se-á que pelo menos um ácido nucleico é "sobre- expresso" por meio de métodos e meios conhecidos dos técnicos comuns no assunto.
[00361] A expressão “aumento da expressão” ou “sobre- expressão”, da forma utilizada no presente, indica qualquer forma de expressão que seja adicional ao nível de expressão do tipo selvagem original. Métodos de aumento da expressão de genes ou produtos genéticos são bem documentados na técnica e incluem, por exemplo, sobre-expressão dirigida por promotores apropriados, uso de amplificadores da transcrição ou amplificadores da tradução. Ácidos nucleicos isolados que servem de elementos promotores ou amplificadores podem ser introduzidos em uma posição apropriada (tipicamente acima no fluxo) de uma forma não heteróloga de um polinucleotídeo, de forma a regular para cima a expressão de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de interesse. Promotores endógenos, por exemplo, podem ser alterados in vivo por meio de mutação, exclusão e/ou substituição (vide Kmiec, US 5.565.350; Zarling et al, WO 9322443) ou promotores isolados podem ser introduzidos em uma célula vegetal na orientação e distância apropriadas de um gene de acordo com a presente invenção, de forma a controlar a expressão do gene.
[00362] Caso se deseje a expressão de polipeptídeo, geralmente é desejável incluir uma região de poliadenilação na extremidade 3’ de uma região de codificação de polinucleotídeos. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma série de outros genes vegetais ou de T-DNA. A sequência terminal 3’ a ser adicionada pode ser derivada, por exemplo, dos genes nopalino sintase ou octopino sintase ou, alternativamente, de outro gene vegetal ou, de menor preferência, de qualquer outro gene eucariótico.
[00363] Uma sequência de introns pode também ser adicionada à região não traduzida (UTR) 5’ ou à sequência de codificação da sequência de codificação parcial para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol. Demonstrou-se que a inclusão de um intron divisível na unidade de transcrição em construções de expressão animal e vegetal aumenta a expressão genética nos níveis de mRNA e de proteína em até mil vezes (Buchman e Berg (1988), Mol. Cell Biol. 8: 4395-4405; Callis et al (1987), Genes Dev. 1: 1183-1200). Este aumento de introns da expressão genética é tipicamente maior quando colocado perto da extremidade 5’ da unidade de transcrição. O uso dos introns de milho Adh1-S intron 1, 2 e 6 e do intron Bronze-1 é conhecido na técnica. Para informações gerais, vide: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling e Walbot, Eds., Springer, Nova Iorque (1994).
[00364] O termo “introdução” ou “transformação”, da forma utilizada no presente, engloba a transferência de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, independentemente do método utilizado para transferência. Tecidos vegetais capazes de propagação clonal subsequente, seja por meio de organogênese ou embriogênese, podem ser transformados com uma construção genética de acordo com a presente invenção e uma planta inteira pode ser regenerada a partir dela. O tecido específico selecionado variará dependendo dos sistemas de propagação clonal disponíveis e mais apropriados para as espécies específicas sendo transformadas. Exemplos de alvos de tecido incluem discos de folhas, pólen, embriões, cotilédones, hipocotilédones, megagametófitos, tecido de calo, tecido meristemático existente (tal como meristema de ápice, botões axilares e meristemas de raízes) e tecido de meristema induzido (tal como meristema de cotilédone e meristema de hipocotilédone). O polinucleotídeo pode ser introduzido de forma transitória ou estável em uma célula hospedeira e pode ser mantido não integrado, por exemplo, na forma de plasmídeo. Alternativamente, ele pode ser integrado ao genoma hospedeiro. A célula vegetal transformada resultante pode ser utilizada em seguida para regenerar uma planta transformada de forma conhecida dos técnicos comuns no assunto.
[00365] A transferência de genes exógenos para o genoma de uma planta é demoninada transformação. A transformação de espécies vegetais é agora um método razoavelmente rotineiro. Convenientemente, qualquer um dentre diversos métodos de transformação pode ser utilizado para introduzir o gene de interesse em uma célula ancestral apropriada. Os métodos descritos de transformação e regeneração de plantas a partir de tecidos vegetais ou células vegetais podem ser utilizados para transformação transitória ou estável. Os métodos de transformação incluem o uso de lipossomos, eletroporação, substâncias que aumentam a absorção de DNA livre, injeção do DNA diretamente na planta, bombardeamento de partículas, transformação utilizando vírus ou pólen e microprojeção. Métodos podem ser selecionados a partir do método de cálcio e polietileno glicol para protoplastas (Krens, F. A. et al (1982), Nature 296, 72-74; Negrutiu, I. et al (1987), Plant Mol. Biol. 8: 363-373); eletroporação de protoplastas (Shillito, R. D. et al (1985), Bio/Technol. 3, 1099-1102); microinjeção em material vegetal (Crossway, A. et al, (1986), Mol. Gen. Genet. 202: 179-185); bombardeamento de partículas revestidas com RNA ou DNA (Klein, T. M. et al (1987), Nature 327: 70), infecção com vírus (não integrantes) e similares. Plantas transgênicas, incluindo plantas produtoras transgênicas, são produzidas preferencialmente por meio de transformação mediada por Agrobacterium. Um método de transformação vantajoso é a transformação in planta. Com este propósito, é possível, por exemplo, permitir que as agrobactérias ajam sobre sementes vegetais ou inoculem o meristema vegetal com agrobactérias. Comprovou-se ser particularmente válido de acordo com a presente invenção permitir que uma suspensão de agrobactérias transformadas aja sobre a planta intacta ou pelo menos sobre os primórdios florais. A planta é cultivada em seguida até a obtenção das sementes da planta tratada (Clough e Bent, Plant J. (1998), 16, 735-743). Métodos de transformação de arroz mediada por Agrobacterium incluem métodos bem conhecidos de transformação de arroz, tais como os descritos em qualquer um dos seguintes: Pedido de Patente Europeu n° EP 1198985 A1, Aldemita e Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J. 6 (2): 271-282, 1994), cujas revelações são incorporadas ao presente como referência, como se totalmente descritas. No caso de transformação de milho, o método preferido é conforme descrito em Ishida et al (Nat. Biotechnol. 14 (6): 745-50, 1996) ou Frame et al (Plant Physiol. 129 (1): 13-22, 2002), cujas revelações são incorporadas ao presente como referência, como se totalmente descritas. Os mencionados métodos são adicionalmente descritos como forma de exemplo em B. Jenes et al, Techniques for Gene Transfer, em Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung e R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 e em Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Os ácidos nucleicos ou a construção a ser expressa são preferencialmente clonados em um vetor, que é apropriado para transformação de Agrobacterium tumefaciens, tal como pBin19 (Bevan et al, Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Agrobactérias transformadas por esse vetor podem ser utilizadas em seguida, de forma conhecida, para a transformação de plantas, tais como plantas utilizadas como modelo, como Arabidopsis (Arabidopsis thaliana, dentro do escopo da presente invenção, não é considerada planta produtora) ou plantas produtoras tais como plantas de fumo, por exemplo, por meio da imersão de folhas esmagadas ou folhas picadas em uma solução agrobactericida e seu cultivo em seguida em meios apropriados. A transformação de plantas por meio de Agrobacterium tumefaciens é descrita, por exemplo, por Hofgen e Willmitzer em Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 ou é conhecida, entre outros, por meio de F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; em Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, págs. 15-38.
[00366] Além da transformação de células somáticas, que necessitam ser regeneradas em seguida em plantas intactas, também é possível transformar as células de meristemas vegetais e, particularmente, as células que se desenvolvem em gametas. Neste caso, os gametas transformados seguem o desenvolvimento natural das plantas, gerando plantas transgênicas. Desta forma, por exemplo, sementes de Arabidopsis são tratadas com agrobactérias e são obtidas sementes das plantas em desenvolvimento, das quais uma certa proporção é transformada e, portanto, transgênica (Feldman, K. A. e Marks, M. D. (1987), Mol. Gen. Genet. 208: 274-289; Feldmann, K. (1992), em C. Koncz, N-H Chua e J. Shell, Eds., Methods in Arabidopsis Research, World Scientific, Cingapura, págs. 274-289). Métodos alternativos são baseados na remoção repetida das inflorescências e incubação do local de extirpação no centro da roseta com agrobactérias transformadas, por meio do quê sementes transformadas podem ser obtidas de forma similar posteriormente (Chang (1994), Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994), Mol. Gen. Genet., 245: 363-370). Um método especialmente eficaz, entretanto, é o método de infiltração a vácuo, com suas modificações tais como o método de “mergulho floral”. No caso de infiltração a vácuo de Arabidopsis, plantas intactas sob pressão reduzida são tratadas com uma suspensão agrobacteriana (Bechthold, N. (1993), C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194-1199), enquanto, no caso do método de "mergulho floral", o tecido floral em desenvolvimento é incubado rapidamente com uma suspensão agrobacteriana tratada com tensoativo (Clough, S. J. e Bent A. F. (1998), The Plant J. 16, 735-743). Uma certa proporção de sementes transgências é colhida nos dois casos e essas sementes podem ser diferenciadas de sementes não transgênicas por meio de cultivo sob as condições seletivas descritas acima. Além disso, a transformação estável de plastídeos é vantajosa, pois os plastídeos são herdados maternalmente na maior parte das safras, reduzindo ou eliminando o risco de fluxo de transgene através do pólen. A transformação do genoma de cloroplasta é geralmente atingida por meio de um processo que foi exibido esquematicamente em Klaus et al, 2004 (Nature Biotechnology 22 (2), 225-229). Resumidamente, as sequências a serem transformadas são clonadas em conjunto com um gene marcador selecionável entre sequências laterais homólogas ao genoma de cloroplasta. Essas sequências laterais homólogas dirigem a integração específica de local para o plastoma. A transformação de plastídeos foi descrita para diversas espécies de plantas diferentes e uma análise geral é fornecida em Bock (2001), Transgenic Plastids in Basic Research and Plant Biotechnology, J. Mol. Biol., 21 de setembro de 2001; 312 (3): 425-38 ou Maliga, P. (2003), Progress Towards Commercialization of Plastid Transformation Technology, Trends Biotechnol. 21, 20-28. Progresso biotecnológico adicional foi relatado recentemente na forma de transformadores de plastídeos livres de marcadores, que podem ser produzidos por um gene marcador cointegrado transitório (Klaus et al, 2004, Nature Biotechnology 22 (2), 225-229). As células vegetais geneticamente modificadas podem ser regeneradas por meio de todos os métodos com os quais os técnicos no assunto são familiares. Métodos apropriados podem ser encontrados nas publicações mencionadas acima de S. D. Kung e R. Wu, Potrykus ou Hofgen e Willmitzer.
[00367] Geralmente após a transformação, células vegetais ou agrupamentos celulares são selecionados para determinar a presença de um ou mais marcadores que são codificados por genes que podem ser expressos por plantas cotransferidos com o gene de interesse, após o quê o material transformado é regenerado em uma planta inteira. Para selecionar plantas transformadas, o material vegetal obtido na transformação é, via de regra, submetido a condições seletivas, de forma que plantas transformadas possam ser diferenciadas de plantas não transformadas. As sementes obtidas da forma descrita acima podem ser plantadas, por exemplo, e, após um período de crescimento inicial, submetidas a seleção apropriada por meio de pulverização. Uma possibilidade adicional consiste no cultivo das sementes, se apropriado após esterilização, sobre placas agar utilizando um agente de seleção apropriado, de tal forma que apenas as sementes transformadas possam crescer na forma de plantas. Alternativamente, as plantas transformadas são selecionadas para determinar a presença de um marcador selecionável tal como os descritos acima.
[00368] Após a transferência e a regeneração de DNA, plantas supostamente transformadas podem também ser avaliadas, utilizando, por exemplo, análise Southern, para determinar a presença do gene de interesse, número de cópias e/ou organização genômica. Alternativa ou adicionalmente, níveis de expressão do DNA recém introduzido podem ser monitorados utilizando análise Northern e/ou Western, em que os dois métodos são bem conhecidos dos técnicos comuns no assunto.
[00369] As plantas transformadas geradas podem ser propagadas por uma série de meios, tais como por meio de propagação clonal ou métodos clássicos de cultivo. Uma planta transformada de primeira geração (ou T1), por exemplo, pode ser isolada, transformadores de segunda geração (ou T2) homozigóticos são selecionados e as plantas T2 podem ser propagadas adicionalmente em seguida por meio de métodos clássicos de cultivo. Os organismos transformados gerados podem assumir uma série de formas. Eles podem ser, por exemplo, quimeras de células transformadas e células não transformadas; transformadores clonais (todas as células, por exemplo, transformadas para conter o cassete de expressão); enxertos de tecidos transformados e não transformados (em plantas, por exemplo, um estoque de raiz transformado e enxertado em uma muda não transformada).
[00370] Preferencialmente, o ácido nucleico de HPPD mutante ou do tipo selvagem (a) ou o ácido nucleico de HST mutante ou do tipo selvagem (b) compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste de: (a) um polinucleotídeo conforme exibido em SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 52, 54, 56, 68, 69 ou uma de suas variantes ou derivados; (b) um polinucleotídeo conforme exibido em SEQ ID NO: 47 ou 49 ou uma de suas variantes ou derivados; (c) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo conforme exibido em SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 ou uma de suas variantes ou derivados; (d) um polinucleotídeo que compreende pelo menos sessenta nucleotídeos consecutivos de qualquer um dentre (a) a (c); e (e) um polinucleotídeo complementar ao polinucleotídeo de qualquer um dentre (a) a (d).
[00371] Preferencialmente, a expressão do ácido nucleico na planta resulta em aumento da resistência a herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em comparação com variedade da planta do tipo selvagem.
[00372] Em outra realização, a presente invenção refere-se a uma planta, preferencialmente planta transgênica, que compreende uma célula vegetal de acordo com a presente invenção, em que a expressão do ácido nucleico na planta resulta em aumento da resistência da planta a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em comparação com uma variedade da planta do tipo selvagem.
[00373] As plantas descritas no presente podem ser plantas produtoras transgênicas ou plantas não transgênicas.
[00374] Para os propósitos da presente invenção, “transgênico”, “transgene" ou “recombinante” indica com relação, por exemplo, a uma sequência de ácidos nucleicos, um cassete de expressão, construção genética ou vetor que compreende a sequência de ácidos nucleicos ou um organismo transformado com as sequências de ácidos nucleicos, vetores ou conjuntos de expressão de acordo com a presente invenção, em que todas essas contruções são elaboradas por meio de métodos recombinantes nos quais: (a) as sequências de ácidos nucleicos que codificam proteínas úteis nos métodos de acordo com a presente invenção; ou (b) sequência(s) de controle genético que é(são) ligada(s) operativamente à sequência de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, tal como um promotor; ou (c) a e b; não estão localizadas no seu ambiente genético natural ou foram modificadas por meio de métodos recombinantes, em que é possível que a modificação assuma a forma, por exemplo, de uma substituição, adição, exclusão, inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeos. O ambiente genético natural é compreendido como indicando o local cromossômico ou genômico natural na planta original ou a presença em uma biblioteca genômica. No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da sequência de ácidos nucleicos é preferencialmente mantido, ao menos em parte. O ambiente ladeia a sequência de ácidos nucleicos pelo menos em um lado e possui comprimento de sequências de pelo menos 50 bp, preferencialmente pelo menos 500 bp, de preferência especial pelo menos 1000 bp e, de preferência superior, pelo menos 5000 bp. Um cassete de expressão de ocorrência natural (tal como a combinação de ocorrência natural do promotor natural das sequências de ácidos nucleicos com a sequência de ácidos nucleicos correspondente que codifica uma proteína útil nos métodos de acordo com a presente invenção, conforme definido acima) torna-se um cassete de expressão transgênica quando esse cassete de expressão é modificado por meio de métodos sintéticos não naturais (“artificiais”), tais como tratamento mutagênico. Métodos apropriados são descritos, por exemplo, em US 5.565.350 ou WO 00/15815.
[00375] Uma planta transgênica para os propósitos da presente invenção é compreendida, portanto, como indicando, conforme acima, que os ácidos nucleicos utilizados no método de acordo com a presente invenção não se encontram no seu local natural no genoma da mencionada planta, em que é possível que os ácidos nucleicos sejam expressos de forma homóloga ou heteróloga. Conforme mencionado, entretanto, transgênico também indica que, embora os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção ou utilizados no método de acordo com a presente invenção encontrem-se na sua posição natural no genoma de uma planta, a sequência foi modificada com relação à sequência natural e/ou as sequências reguladoras das sequências naturais foram modificadas. Transgênico é preferencialmente compreendido como indicando a expressão dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção em um local não natural no genoma, ou seja, tem lugar expressão homóloga ou, preferencialmente, heteróloga dos ácidos nucleicos. São mencionadas no presente plantas transgênicas preferidas. Além disso, o termo “transgênico” designa qualquer planta, célula vegetal, calo, tecido vegetal ou parte de planta que contém, no todo ou em parte, pelo menos um polinucleotídeo recombinante. Em muitos casos, o polinucleotídeo recombinante, no todo ou em parte, é integrado de forma estável a um cromossomo ou elemento extracromossômico estável, de forma a ser passado para gerações sucessivas. Para os propósitos da presente invenção, a expressão “polinucleotídeo recombinante” designa um polinucleotídeo que tenha sido alterado, redisposto ou modificado por meio de engenharia genética. Exemplos incluem qualquer um ou mais polinucleotídeos clonados que são ligados ou unidos a sequências heterólogas. O termo “recombinante” não se refere a alterações de polinucleotídeos resultantes de eventos de ocorrência natural, tais como mutações espontâneas, ou de mutagênese não espontânea seguida por cultivo seletivo.
[00376] Plantas que contêm mutações decorrentes da mutagênese não espontânea e do cultivo seletivo são denominadas no presente plantas não transgênicas e incluídas na presente invenção. Em realizações nas quais a planta é transgênica e compreende diversos ácidos nucleicos mut-HPPD, os ácidos nucleicos podem ser derivados de diferentes genomas ou do mesmo genoma. Alternativamente, em realizações nas quais a planta não é transgênica e compreende diversos ácidos nucleicos mut-HPPD, os ácidos nucleicos podem estar posicionados sobre genomas diferentes ou sobre o mesmo genoma.
[00377] Em certas realizações, a presente invenção envolve plantas resistentes a herbicidas que são produzidas por meio de cultivo de mutação. Essas plantas compreendem um polinucleotídeo que codifica mut- HPPD e/ou mut-HST e são tolerantes a um ou mais “herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona”. Esses métodos podem envolver, por exemplo, a exposição das plantas ou sementes a mutagene, particularmente mutagene químico, tal como, por exemplo, metanossulfonato de etila (EMS) e seleção em busca de plantas que possuem tolerância aprimorada a pelo menos um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona.
[00378] A presente invenção não se limita, entretanto, a plantas tolerantes a herbicidas que são produzidas por meio de um método de mutagênese que envolve o mutagene químico EMS. Qualquer método de mutagênese conhecido na técnica pode ser utilizado para produzir as plantas resistentes a herbicidas de acordo com a presente invenção. Esses métodos de mutagênese podem envolver, por exemplo, o uso de qualquer um ou mais dos mutagenes a seguir: radiação, tal como raio X, raio gama (por exemplo, cobalto 60 ou césio 137), nêutrons (por exemplo, produção de fissão nuclear por urânio 235 em um reator atômico), radiação beta (por exemplo, emitida por radioisótopos tais como fósforo 32 ou carbono 14) e radiação ultravioleta (preferencialmente de 250 a 290 nm), e mutagenes químicos tais como análogos de bases (por exemplo, 5-bromouracil), compostos relacionados (por exemplo, 8-etóxi cafeína), antibióticos (por exemplo, estreptonigrina), agentes alquilantes (tais como mostardas de enxofre, mostardas de nitrogênio, epóxido, etilenoaminas, sulfatos, sulfonatos, sulfonas e lactonas), azida, hidroxilamina, ácido nitroso ou acridinas. Plantas resistentes a herbicidas podem também ser produzidas utilizando métodos de cultivo de tecidos para selecionar células vegetais que compreendem mutações de resistência a herbicidas e, em seguida, regeneração de plantas resistentes a herbicidas a partir delas. Vide, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas n° 5.773.702 e 5.859.348, ambas as quais são integralmente incorporadas ao presente como referência. Detalhes adicionais de cultivo por mutação podem ser encontrados em Principles of Cultivar Development, Fehr, 1993, Macmillan Publishing Company, cujas revelações são incorporadas ao presente como referência.
[00379] Além da definição acima, o termo “planta” destina-se a englobar plantas produtoras em qualquer estágio de amadurecimento ou desenvolvimento, bem como quaisquer tecidos ou órgãos (partes de plantas) retirados ou derivados de qualquer planta, a menos que indicado claramente em contrário pelo contexto. Partes de plantas incluem, mas sem limitações, hastes, raízes, flores, óvulos, estames, folhas, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, cultivos de anteras, gametófitos, esporófitos, pólen, microesporos, protoplastas e similares.
[00380] A planta de acordo com a presente invenção compreende pelo menos um ácido nucleico de mut-HPPD ou ácido nucleico de HPPD do tipo selvagem sobre-expresso e possui maior tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em comparação com uma variedade da planta do tipo selvagem. É possível que as plantas de acordo com a presente invenção possuam diversos ácidos nucleicos do tipo selvagem ou mut-HPPD de diferentes genomas, pois essas plantas podem conter mais de um genoma. A planta contém, por exemplo, dois genomas, normalmente denominados genomas A e B. Como HPPD é uma enzima metabólica necessária, considera-se que cada genoma possui pelo menos um gene que codifica a enzima HPPD (ou seja, pelo menos um gene HPPD). Da forma utilizada no presente, a expressão “local de gene HPPD” designa a posição de um gene HPPD sobre um genoma e as expressões “gene HPPD” e “ácido nucleico HPPD” designam um ácido nucleico que codifica a enzima HPPD. O ácido nucleico de HPPD sobre cada genoma difere da sua sequência de nucleotídeos de um ácido nucleico de HPPD sobre outro genoma. Os técnicos no assunto podem determinar o genoma de origem de cada ácido nucleico de HPPD por meio de cruzamento genético e/ou métodos de sequenciamento ou métodos de digestão de exonucleases conhecidos dos técnicos no assunto.
[00381] A presente invenção inclui plantas que compreendem um, dois, três ou mais alelos de mut-HPPD, em que a planta aumentou a tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em comparação com uma variedade da planta do tipo selvagem. Os alelos de mut-HPPD podem compreender uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste de um polinucleotídeo conforme definido em SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 52, 54, 56, 68, 69 ou uma de suas variantes ou derivados, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo conforme definido em SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 ou uma de suas variantes, derivados, homólogos, ortólogos ou parálogos, um polinucleotídeo que compreende pelo menos sessenta nucleotídeos consecutivos de qualquer um dos polinucleotídeos mencionados acima; e um polinucleotídeo complementar a qualquer um dos polinucleotídeos mencionados acima.
[00382] “Alelos” ou “variantes alélicas” são formas alternativas de um dado gene, localizado na mesma posição cromossômica. Variantes alélicas englobam Polimorfismos de Nucleotídeos Isolados (SNPs), bem como Polimorfismos de Inserção/Exclusão Pequenos (INDELs). O tamanho de INDELs normalmente é de menos de 100 bp. SNPs e INDELs formam o maior conjunto de variantes de sequência em linhagens polimórficas de ocorrência natural da maior parte dos organismos.
[00383] O termo “variedade” designa um grupo de plantas dentro de uma espécie definida pelo compartilhamento de um conjunto comum de características ou traços aceitos pelos técnicos no assunto como suficientes para diferenciar um cultivar ou variedade de outro cultivar ou variedade. Não há implicação em nenhum dos termos que todas as plantas de qualquer dada variedade ou cultivar sejam geneticamente idênticas em todo o gene ou nível molecular, nem que qualquer dada planta seja homozigótica em todos os locais. Um cultivar ou variedade é considerado “cultivo verdadeiro” para uma característica específica se, quando a variedade ou o cultivar de cultivo verdadeiro for autopolinizado, toda a prole contiver a característica. As expressões “linhagem de cultivo” ou “linhagem” designam um grupo de plantas dentro de um cultivar definido pelo compartilhamento de um conjunto comum de características ou traços aceitos pelos técnicos no assunto como suficientes para diferenciar uma linhagem de cultivo ou linhagem de outra linhagem ou linhagem de cultivo. Não há implicação em nenhum dos termos que todas as plantas de qualquer dada linhagem de cultivo ou linhagem sejam geneticamente idênticas em todo o gene ou nível molecular, nem que qualquer dada planta seja homozigótica em todos os locais. Uma linhagem de cultivo ou linhagem é considerada “cultivo verdadeiro” para uma característica específica se, quando a linhagem de cultivo ou linhagem de cultivo verdadeiro for autopolinizada, toda a prole contiver a característica. Na presente invenção, a característica surge de uma mutação em um gene de HPPD da planta ou semente.
[00384] Em algumas realizações, é empregado o cultivo de plantas tradicional, em que a característica tolerante a herbicidas inibidores de HPPD que é introduzida na planta de prole dele resultante. Em uma realização, a presente invenção fornece um método de produção de plantas de prole tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD, em que o método compreende: cruzamento de uma planta parental com uma planta tolerante a herbicidas inibidores de HPPD para introduzir as características de tolerância a herbicidas inibidores de HPPD da planta tolerante a herbicidas inibidores de HPPD no germoplasma da planta de prole, em que a planta de prole possui maior tolerância aos herbicidas inibidores de HPPD com relação à planta parental. Em outras realizações, o método compreende adicionalmente a etapa de introgressão das características de tolerância a herbicidas inibidores de HPPD por meio de métodos tradicionais de cultivo de plantas para obter uma planta descendente que possui as características de tolerância a herbicidas inibidores de HPPD.
[00385] As plantas resistentes a herbicidas de acordo com a presente invenção que compreendem polinucleotídeos que codificam polipeptídeos mut-HPPD e/ou mut-HST também encontram uso em métodos de aumento da resistência de plantas a herbicidas por meio de cultivo de plantas convencional que envolve a reprodução sexual. Os métodos compreendem o cruzamento de uma primeira planta que é uma planta resistente a herbicidas de acordo com a presente invenção com uma segunda planta que pode ou não ser resistente ao(s) mesmo(s) herbicida(s) da primeira planta ou pode ser resistente a um ou mais herbicidas diferentes da primeira planta. A segunda planta pode ser qualquer planta que seja capaz de produzir plantas de prole viáveis (ou seja, sementes) em cruzamento com a primeira planta. Tipicamente, mas não necessariamente, as primeira e segunda plantas são da mesma espécie. Os métodos podem envolver opcionalmente a seleção de plantas de prole que compreendem os polipeptídeos mut-HPPD e/ou mut- HST da primeira planta e as características de resistência a herbicidas da segunda planta. As plantas de prole produzidas por meio deste método de acordo com a presente invenção aumentaram a resistência a herbicidas em comparação com a primeira ou a segunda planta, ou ambas. Quando as primeira e segunda plantas são resistentes a herbicidas diferentes, as plantas de prole possuirão as características de tolerância a herbicidas combinadas das primeira e segunda plantas. Os métodos de acordo com a presente invenção podem envolver ainda uma ou mais gerações de retrocruzamento das plantas de prole do primeiro cruzamento com uma planta da mesma linhagem ou genótipo da primeira ou da segunda planta. Alternativamente, a prole do primeiro cruzamento ou qualquer cruzamento subsequente pode ser cruzada em uma terceira planta de um genótipo ou linhagem diferente da primeira ou da segunda planta. A presente invenção também fornece plantas, órgãos de plantas, tecidos vegetais, células vegetais, sementes e células hospedeiras não humanas que são transformadas com a pelo menos uma molécula de polinucleotídeo, cassete de expressão ou vetor de transformação de acordo com a presente invenção. Essas plantas transformadas, órgãos de plantas, tecidos vegetais, células vegetais, sementes e células hospedeiras não humanas aumentaram a tolerância ou a resistência a pelo menos um herbicida, em níveis do herbicida que matam ou inibem o crescimento de plantas não transformadas, tecidos vegetais, células vegetais ou células hospedeiras não humanas, respectivamente. Preferencialmente, as plantas transformadas, tecidos vegetais, células vegetais e sementes de acordo com a presente invenção são Arabidopsis thaliana e plantas produtoras.
[00386] Em outros aspectos, plantas de acordo com a presente invenção incluem as plantas que, além de serem tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD, foram submetidas a modificações genéticas adicionais por meio de cultivo, mutagênese ou engenharia genética; por exemplo, que tenham se tornado tolerantes a aplicações de outras classes específicas de herbicidas, tais como inibidores de AHAS; herbicidas auxínicos; herbicidas branqueadores tais como inibidores de hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) ou inibidores de fitoeno dessaturase (PDS); inibidores de EPSPS tais como glifosato; inibidores de glutamino sintetase (GS) tais como glufosinato; inibidores da biossíntese de lipídios tais como acetil CoA carboxilase (ACCase); ou herbicidas de oxinil (ou seja, bromoxinil ou ioxinil), como resultado de métodos convencionais de cultivo ou engenharia genética. Portanto, plantas tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD de acordo com a presente invenção podem tornar-se resistentes a diversas classes de herbicidas por meio de diversas modificações genéticas, tais como resistência a glifosato e glufosinato ou a glifosato e um herbicida de outra classe, tais como inibidores de HPPD, inibidores de AHAS ou inibidores da ACCase. Essas tecnologias de resistência a herbicidas são descritas, por exemplo, em Pest Management Science (volume, ano, página): 61, 2005, 246; 61, 2005, 258; 61, 2005, 277; 61, 2005, 269; 61, 2005, 286; 64, 2008, 326; 64, 2008, 332; Weed Science 57, 2009, 108; Australian Journal of Agricultural Research 58, 2007, 708; Science 316, 2007, 1185; e referências ali mencionadas. Plantas tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD de acordo com a presente invenção podem, em algumas realizações, ser tolerantes, por exemplo, a inibidores de ACCase, tais como “dims” (por exemplo, cicloxidim, setoxidim, cletodim ou tepraloxidim), “fops” (por exemplo, clodinafop, diclofop, fluazifop, haloxifop ou quizalofop) e “dens” (por exemplo, pinoxaden); a herbicidas auxínicos, tais como dicamba; a inibidores de EPSPS, tais como glifosato; a outros inibidores de HPPD; e a inibidores de GS, tais como glufosinato.
[00387] Além dessas classes de inibidores, plantas tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD de acordo com a presente invenção podem também ser tolerantes a herbicidas que possuem outros modos de ação, tais como inibidores de pigmentos de clorofila/carotenoides, agentes de rompimento da membrana celular, inibidores da fotossíntese, inibidores da divisão celular, inibidores do enraizamento, inibidores de brotos e suas combinações.
[00388] Essas características de tolerância podem ser expressas, por exemplo, como proteínas HPPD do tipo selvagem ou mutantes, proteínas AHASL mutantes, proteínas ACCase mutantes, proteínas EPSPS mutantes ou proteínas de glutamino sintetase mutantes; ou como ariloxialcanoato dioxigenase (AAD ou DHT), haloarilnitrilase (BXN), desalogenase de ácido 2,2-dicloropropiônico (DEH), glifosato N- acetiltransferase (GAT), glifosato descarboxilase (GDC), glifosato oxidorreductase (GOX), glutationa-S-transferase (GST), fosfinotricino acetiltransferase (PAT ou bar) mutantes nativas, congênitas ou transgênicas, ou proteínas CYP450s que possuem atividade degradante de herbicidas. As plantas tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD de acordo com o presente podem também ser reunidas com outras características, incluindo, mas sem limitações, características pesticidas tais como Bt Cry e outras proteínas que possuem atividade pesticida contra coleópteros, lepidópteros, nematoides ou outras pragas; características nutritivas ou nutracêuticas, tais como teor de óleo modificado ou características de perfil de óleo, alto teor de proteína ou características de alta concentração de aminoácidos, bem como outros tipos de características conhecidos na técnica.
[00389] Além disso, em outras realizações, também são cobertas plantas tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD que, utilizando métodos de DNA recombinantes e/ou por meio de cultivo e/ou selecionados de outra forma por essas características, tornam-se capazes de sintetizar uma ou mais proteínas inseticidas, especialmente as conhecidas do gênero bacteriano Bacillus, particularmente de Bacillus thuringiensis, tais como [delta]- endotoxinas, por exemplo, CrylA(b), CrylA(c), CrylF, CryIF(a2), CryllA(b), CrylllA, CrylllB(bl) ou Cry9c; proteínas inseticidas vegetais (VIP), tais como VIP1, VIP2, VIP3 ou VIP3A; proteínas inseticidas de nematoides colonizadores de bactérias, tais como Photorhabdus spp ou Xenorhabdus spp; toxinas produzidas por animais, tais como toxinas de escorpião, toxinas de aracnídeos, toxinas de vespa ou outras neurotoxinas específicas de insetos; toxinas produzidas por fungos, tais como toxinas de estreptomicetes; lectinas vegetais, tais como lectinas de ervilha ou cevada; aglutininas; inibidores da proteinase, tais como inibidores de tripsina, inibidores de serino protease, patatina, cistatina ou inibidores de papaína; proteínas desativadoras de ribossomos (RIP), tais como rícina, milho-RIP, abrina, lufina, saporina ou briodina; enzimas do metabolismo de esteroides, tais como 3-hidroxiesteroide oxidase, ecdisteroide-IDP-glicosiltransferase, colesterol oxidases, inibidores de ecdisona ou HMG-CoA-reductase; bloqueadores de canais de íons, tais como bloqueadores de canais de sódio ou cálcio; esterase de hormônio juvenil; receptores de hormônios diuréticos (receptores de helicoquinina); estilbeno sintase, bibenzil sintase, chitinases ou glucanases. No contexto da presente invenção, estas toxinas ou proteínas inseticidas devem também ser expressamente compreendidas como pré-toxinas, proteínas híbridas, proteínas truncadas ou modificadas de outra forma. Proteínas híbridas são caracterizadas por uma nova combinação de domínios de proteína (vide, por exemplo, WO 02/015701). Exemplos adicionais dessas toxinas ou plantas geneticamente modificadas capazes de sintetizar essas toxinas são descritos, por exemplo, em EP-A 374.753, WO 93/007278, WO 95/34656, EP-A 427.529, EP-A 451.878, WO 03/18810 e WO 03/52073. Os métodos de produção dessas plantas geneticamente modificadas são geralmente conhecidos dos técnicos no assunto e descritos, por exemplo, nas publicações mencionadas acima. Essas proteínas inseticidas contidas nas plantas geneticamente modificadas proporcionam às plantas produtoras dessas proteínas tolerância a pragas daninhas de todos os grupos taxonômicos de artrópodes, especialmente a besouros (coleópteros), insetos com duas asas (dípteros), traças (lepidópteros) e nematoides (Nematoda).
[00390] Em algumas realizações, expressão de uma ou mais toxinas de proteínas (por exemplo, proteínas inseticidas) nas plantas tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD para o controle de organismos que incluem, por exemplo, membros das classes e ordens: coleópteros, tais como o gorgulho do feijão americano Acanthoscelides obtectus; o besouro das folhas Agelastica alni; elaterídeos (Agriotes lineatus, Agriotes obscurus e Agriotes bicolor); o besouro dos grãos Ahasverus advena; o besouro de junho Anphimallon solstitialis; o besouro da mobília Anobium punctatum; Anthonomus spp (gorgulhos); o besouro mangold Pygmy Atomaria linearis; besouros do carpete (Anthrenus spp, Attagenus spp); o gorgulho do grão de bico Callosobruchus maculates; o besouro das frutas secas Carpophilus hemipterus; o gorgulho das vagens de repolho Ceutorhynchus assimilis; o gorgulho das hastes de inverno da canola Ceutorhynchus picitarsis; as brocas Conoderus vespertinus e Conoderus falli; o gorgulho da banana Cosmopolites sordidus; a larva da grama da Nova Zelândia Costelytra zealandica; o besouro de junho Cotinis nitida; o gorgulho do caule do girassol Cylindrocopturus adspersus; o besouro da despensa Dermestes lardarius; as larvas das raízes do milho Diabrotica virgifera, Diabrotica virgifera virgifera e Diabrotica barberi; o besouro do feijão mexicano Epilachna varivestis; a broca das casas velhas Hylotropes bajulus; o gorgulho da alfafa Hypera postica; o besouro aranha brilhante Gibbium psylloides; o besouro do cigarro Lasioderma serricorne; o besouro da batata do Colorado Leptinotarsa decemlineata; besouros Lyctus (Lyctus spp , o besouro do pólen Meligethes aeneus; o besouro comum Melolontha melolontha; o besouro aranha americano Mezium americanum; o besouro aranha dourado Niptus hololeucs; os besouros dos grãos Oryzaephilus surinamensis e Oryzaephilus Mercator; o gorgulho preto das uvas Otiorhynchus sulcatus; o besouro mostarda Phaedon cochleariae, o besouro saltador das crucíferas Phyllotreta cruciferae; o besouro saltador listrado Phyllotreta striolata; o besouro saltador das hastes do repolho Psylliodes chrysocephala; Ptinus spp (besouros aranha); a broca menor dos grãos Rhizopertha dominica; o gorgulho do feijão e da ervilha Sitona lineatus; os besouros do arroz e dos grãos Sitophilus oryzae e Sitophilus granaries; o gorgulho vermelho da semente de girassol Smicronyx fulvus; o besouro da farmácia Stegobium paniceum; o besouro amarelo da farinha Tenebrio molitor, os besouros da farinha Tribolium castaneum e Tribolium confusum; besouros dos armazéns e depósitos (Trogoderma spp); o besouro do girassol Zygogramma exclamationis; Dermaptera (lacraias) tais como a lacraia europeia Forficula auricularia e a lacraia listrada Labidura riparia; Dictyoptera tais como a barata oriental Blatta orientalis; a centopeia das estufas Oxidus gracilis; a mosca da beterraba Pegomyia betae; a mosca das fritas Oscinella frit; moscas das frutas (Dacus spp, Drosophila spp); Isoptera (cupins), incluindo espécies das famílias Hodotermitidae, Kalotermitidae, Mastotermitidae, Rhinotermitidae, Serritermitidae, Termitidae e Termopsidae; o besouro envernizado das plantas Lygus lineolaris; o afídeo preto dos grãos Aphis fabae; o afídeo do algodão ou do melão Aphis gossypii; o afídeo da maçã verde Aphis pomi; a mosca branca dos cítricos Aleurocanthus spiniferus; a mosca branca da batata doce Bemesia tabaci; o afídeo do repolho Brevicoryne brassicae; psila da pera Cacopsylla pyricola; afídeo da groselha Cryptomyzus ribis; filoxera das uvas Daktulosphaira vitifoliae; psila dos cítricos Diaphorina citri; a cigarrinha da batata Empoasca fabae; a cigarrinha do feijão Empoasca solana; a cigarrinha das uvas Empoasca vitis; o afídeo da lã Eriosoma lanigerum; mede-palmos das frutas europeu Eulecanium corni; o afídeo da ameixa Hyalopterus arundinis; fulgoromorfos marrons pequenos Laodelphax striatellus; o afídeo da batata Macrosiphum euphorbiae; o afídeo verde do pêssego Myzus persicae; fulgoromorfos verdes do arroz Nephotettix cinticeps; fulgoromorfos marrons Nilaparvata lugens; o afídeo do lúpulo Phorodon humuli; o afídeo da cerejeira brava Rhopalosiphum padi; o afídeo dos grãos Sitobion avenae; lepidópteros, tais como Adoxophyes orana (traça das frutas do verão); Archips podana (traça das árvores frutíferas); Bucculatrix pyrivorella (larva das folhas das peras); Bucculatrix thurberiella (larva das folhas do algodão); Bupalus piniarius (traça do pinheiro); Carpocapsa pomonella (mariposa das maçãs); Chilo suppressalis (broca listrada do arroz); Choristoneura fumiferana (larva dos abetos); Cochylis hospes (mariposa listrada do girassol); Diatraea grandiosella (broca do milho do sudoeste); Eupoecilia ambiguella (mariposa europeia das uvas); Helicoverpa armigera (lagarta do algodão); Helicoverpa zea (lagarta do algodão); Heliothis virescens (lagarta do fumo), Homeosoma electellum (mariposa do girassol); Homona magnanima (mariposa oriental das plantas de chá); Lithocolletis blancardella (lagarta da macieira); Lymantria dispar (mariposa Gypsy); Malacosoma neustria (traça das tendas); Mamestra brassicae (lagarta do repolho); Mamestra configurata (lagarta Bertha); Operophtera brumata (mariposa do inverno); Ostrinia nubilalis (broca europeia do milho), Panolis flammea (mariposa do pinho), Phyllocnistis citrella (lagarta dos cítricos); Pieris brassicae (borboleta branca do repolho); Rachiplusia ni (lagarta da soja); Spodoptera exigua (traça da beterraba); Spodoptera littoralis (lagarta do algodão); Sylepta derogata (lagarta das folhas do algodão); Trichoplusia ni (lagarta do repolho); Orthoptera tais como o grilo comum Acheta domesticus, grilos das árvores (Anacridium spp), o gafanhoto migratório Locusta migratoria, o gafanhoto listrado Melanoplus bivittatus, o gafanhoto diferencial Melanoplus differentialis, o gafanhoto das patas vermelhas Melanoplus femurrubrum, o gafanhoto migratório Melanoplus sanguinipes, o grilo do norte Neocurtilla hexadectyla, o gafanhoto vermelho Nomadacris septemfasciata, o grilo de asas curtas Scapteriscus abbreviatus, o grilo do sul Scapteriscus borellii, o grilo escuro Scapteriscus vicinus e o gafanhoto do deserto Schistocerca gregaria; Symphyla, como o sínfilo do jardim Scutigerella immaculata; Thysanoptera, como tripes do fumo Frankliniella fusca, tripes das flores Frankliniella intonsa, tripes das flores do oeste Frankliniella occidentalism, tripes dos botões do algodão Frankliniella schultzei, tripes listrados das estufas Hercinothrips femoralis, tripes da soja Neohydatothrips variabilis, tripes dos cítricos Pezothrips kellyanus, tripes do abacate Scirtothrips perseae, tripes do melão Thrips palmi e tripes da cebola Thrips tabaci; e similares, bem como suas combinações que compreendem um ou mais dos organismos acima.
[00391] Em algumas realizações, a expressão de uma ou mais toxinas de proteínas (tais como proteínas inseticidas) nas plantas tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD é eficaz para o controle de besouros saltadores, ou seja, membros da família de besouros saltadores Chrysomelidae, preferencialmente contra Phyllotreta spp, tal como Phyllotreta cruciferae e/ou Phyllotreta triolata. Em outras realizações, a expressão de uma ou mais toxinas de proteínas (tais como proteínas inseticidas) em plantas tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD é eficaz para o controle do gorgulho das vagens de repolho, lagarta Bertha, besouros Lygus ou a traça das crucíferas.
[00392] Deve-se compreender que a planta de acordo com a presente invenção pode compreender um ácido nucleico HPPD do tipo selvagem além de um ácido nucleico mut-HPPD. Contempla-se que as linhagens tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, podem conter uma mutação em apenas uma dentre várias isoenzimas de HPPD. A presente invenção inclui, portanto, uma planta que compreende um ou mais ácidos nucleicos mut-HPPD além de um ou mais ácidos nucleicos de HPPD do tipo selvagem.
[00393] Em outra realização, a presente invenção refere-se a uma semente produzida por uma planta transgênica que compreende uma célula vegetal de acordo com a presente invenção, em que a semente é reprodução verdadeira de aumento da resistência a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em comparação com uma variedade da semente do tipo selvagem.
[00394] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um método de produção de células vegetais transgênicas com resistência aprimorada a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em comparação com uma variedade do tipo selvagem da célula vegetal que compreende a transformação da célula vegetal com um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico que codifica HPPD do tipo selvagem ou que sofreu mutação conforme definido acima.
[00395] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um método de produção de plantas transgênicas que compreende (a) transformação de células vegetais com um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico que codifica HPPD do tipo selvagem ou que sofreu mutação e (b) geração de plantas com resistência aprimorada a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou ticetona, da célula vegetal.
[00396] Consequentemente, ácidos nucleicos HPPD que codificam HPPD do tipo selvagem ou que sofreu mutação útil para a presente invenção são fornecidos em conjuntos de expressão para expressão na planta de interesse. O conjunto incluirá sequências reguladoras ligadas operativamente a uma sequência de ácido nucleico de HPPD que codifica um HPPD do tipo selvagem ou que sofreu mutação de acordo com a presente invenção. A expressão “elemento regulador”, da forma utilizada no presente, designa um polinucleotídeo que é capaz de regular a transcrição de um polinucleotídeo ligado operativamente. Ela inclui, mas sem limitações, promotores, amplificadores, introns, 5’ UTRs e 3’ UTRs. “Ligado operativamente” indica uma ligação funcional entre uma sequência promotora e uma segunda sequência, em que a sequência promotora inicia e media a transcrição da sequência de DNA correspondente à segunda sequência. Geralmente, ligado operativamente indica que as sequências de ácido nucleico sendo ligadas são contíguas e, quando necessário para ligar duas regiões de codificação de proteínas, contíguas e no mesmo quadro de leitura. O conjunto pode conter adicionalmente pelo menos um gene adicional a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(is) pode(m) ser fornecido(s) sobre diversos conjuntos de expressão.
[00397] Esse cassete de expressão é equipado com uma série de locais de restrição para inserção da sequência de ácidos nucleicos de HPPD que fica sob a regulagem de transcrição das regiões reguladoras. O cassete de expressão pode conter adicionalmente genes marcadores selecionáveis.
[00398] O cassete de expressão incluirá, na direção 5’-3’ de transcrição, uma região de início de transcrição e tradução (ou seja, um promotor), uma sequência de ácidos nucleicos de mut-HPPD de acordo com a presente invenção e uma região de término de tradução e transcrição (ou seja, região de término) funcional em plantas. O promotor pode ser nativo ou análogo, externo ou heterólogo, para a planta hospedeira e/ou para a sequência de ácidos nucleicos de HPPD de acordo com a presente invenção. Além disso, o promotor pode ser a sequência natural ou, alternativamente, uma sequência sintética. Quando o promotor é “externo” ou “heterólogo” para a planta hospedeira, indica-se que o promotor não é encontrado na planta nativa na qual o promotor é introduzido. Quando o promotor é “externo” ou “heterólogo” para a sequência de ácidos nucleicos de HPPD de acordo com a presente invenção, indica-se que o promotor não é o promotor nativo ou de ocorrência natural para a sequência de ácidos nucleicos de HPPD ligada operativamente de acordo com a presente invenção. Da forma utilizada no presente, gene quimérico compreende uma sequência de codificação ligada operativamente a uma região de início de transcrição que é heteróloga para a sequência de codificação.
[00399] Embora possa ser preferível expressar os ácidos nucleicos de HPPD de acordo com a presente invenção utilizando promotores heterólogos, podem ser utilizadas as sequências promotoras nativas. Essas construções alterariam os níveis de expressão da proteína HPPD na planta ou célula vegetal. Desta forma, o fenótipo da planta ou célula vegetal é alterado.
[00400] A região de término pode ser nativa com a região de início de transcrição, pode ser nativa com a sequência de HPPD de interesse ligada operativamente, pode ser nativa com a planta hospedeira ou pode ser derivada de outra fonte (ou seja, exógena ou heteróloga para o promotor, a sequência de ácido nucleico de HPPD de interesse, o hospedeiro vegetal ou qualquer de suas combinações). Regiões de término convenientes são disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de término de octopino sintase e nopalino sintase. Vide também Guerineau et al (1991), MoI. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991), Cell 64: 671-674; Sanfacon et al (1991), Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al (1990), Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al (1990), Gene 91: 151-158; Ballas et al (1989), Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; e Joshi et al (1987), Nucleic Acids Res. 15: 96279639. Quando apropriado, o(s) gene(s) pode(m) ser otimizado(s) para maior expressão na planta transformada. Isso significa que os genes podem ser sintetizados utilizando códons preferidos de plantas para maior expressão. Vide, por exemplo, Campbell e Gowri (1990), Plant Physiol. 92: 1-11 para discussão do uso de códons preferidos de hospedeiro. São disponíveis na técnica métodos de síntese de genes preferidos de plantas. Vide, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas n° 5.380.831 e 5.436.391, e Murray et al (1989), Nucleic Acids Res. 17: 477-498, incorporados ao presente como referência.
[00401] São conhecidas modificações de sequências adicionais para aumentar a expressão genética em hospedeiros celulares. Estas incluem a eliminação de sequências que codificam sinais de poliadenilação espúrios, sinais de locais de divisão de exon-intron, repetições similares a transposson e outras sequências bem caracterizadas que podem ser prejudiciais para a expressão genética. O teor de G-C da sequência pode ser ajustado em níveis médios para um dado hospedeiro celular, conforme calculado por meio de referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas de mRNA secundárias de grampo de cabelo previstas. Sequências de nucleotídeos para aumentar a expressão genética podem também ser utilizadas nos vetores de expressão vegetal. Estes incluem os introns de AdhI de milho, gene intron I (Callis et al, Genes and Development 1: 1183-1200, 1987) e sequências líderes (sequência W) do vírus mosaico do fumo (TMV), vírus mascarado do milho e vírus mosaico da alfafa (Gallie et al, Nucleic Acid Res. 15: 8693-8711, 1987 e Skuzeski et al, Plant Mol. Biol. 15: 65-79, 1990). Demonstrou-se que o primeiro intron do local contraído 1 de milho aumenta a expressão de genes em construções de genes quiméricos. As Patentes Norte- Americanas n° 5.424.412 e 5.593.874 descrevem o uso de introns específicos em construções de expressão genética e Gallie et al (Plant Physiol., 106: 929939, 1994) também demonstraram que introns são úteis para regular a expressão genética em base específica de tecido. Para ampliar ainda mais ou otimizar a expressão de gene mut-HPPD, os vetores de expressão vegetal de acordo com a presente invenção podem também conter sequências de DNA que contenham regiões de ligação de matrizes (MARs). Células vegetais transformadas com esses sistemas de expressão modificados podem então exibir sobre-expressão ou expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeos de acordo com a presente invenção.
[00402] Os conjuntos de expressão podem conter adicionalmente sequências líderes 5’ na construção de cassete de expressão. Essas sequências líderes podem agir para aprimorar a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem: líderes de picornavírus, tais como líder de EMCV (região não codificadora 5' de encefalomiocardite) (Elroy- Stein et al (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 6126-6130); líderes de potivírus, tais como líder de TEV (vírus da corrosão do fumo) (Gallie et al (1995), Gene 165 (2): 233-238), líder de MDMV (Vírus Mosaico Anão de Milho) (Virology 154: 9-20) e proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al (1991), Nature 353: 90-94); líder não traduzido do mRNA de proteína de revestimento de vírus mosaico da alfafa (RNA AMV 4) (Jobling et al (1987), Nature 325: 622-625); líder de vírus mosaico do fumo (TMV) (Gallie et al (1989) em Molecular Biology of RNA, Ed. Cech (Liss, Nova Iorque), págs. 237-256); e líder de vírus de manchas cloróticas de milho (MCMV) (Lommel et al (1991), Virology 81: 382-385). Vide também Della- Cioppa et al (1987), Plant Physiol. 84: 965-968. Outros métodos conhecidos por aprimorarem a tradução podem também ser utilizados, tais como introns e similares.
[00403] Durante a preparação do cassete de expressão, os diversos fragmentos de DNA podem ser manipulados, de forma a fornecer as sequências de DNA na orientação adequada e, conforme apropriado, no quadro de leitura apropriado. Com este propósito, adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem ser envolvidas para fornecer locais de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de locais de restrição ou similares. Com este propósito, podem ser envolvidos mutagênese in vitro, reparo de primers, restrição, combinação e ressubstituições, tais como transições e transversões.
[00404] Diversos promotores podem ser utilizados na prática da presente invenção. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Os ácidos nucleicos podem ser combinados com promotores constitutivos, preferidos de tecido ou outros promotores para expressão em plantas. Esses promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor central do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos descritos em WO 99/43838 e na Patente Norte-Americana n° 6.072.050; o promotor 35S de CaMV central (Odell et al (1985), Nature 313: 810-812); actina de arroz (McElroy et al (1990), Plant Cell 2: 163-171); ubiquitina (Christensen et al (1989), Plant Mol. Biol. 12: 619-632 e Christensen et al (1992), Plant Mol. Biol. 18: 675-689); pEMU (Last et al (1991), Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten et al (1984), EMBO J. 3: 2723-2730); promotor de ALS (Patente Norte- Americana n° 5.659.026) e similares. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas n° 5.608.149, 5.608.144, 5.604.121, 5.569.597, 5.466.785, 5.399.680, 5.268.463, 5.608.142 e 6.177.611.
[00405] Promotores preferidos de tecidos podem ser utilizados para dirigir a expressão aprimorada de HPPD em um tecido vegetal específico. Esses promotores preferidos de tecidos incluem, mas sem limitações, promotores preferidos de folhas, promotores preferidos de raízes, promotores preferidos de sementes e promotores preferidos de caules. Os promotores preferidos de tecidos incluem Yamamoto et al (1997), Plant J. 12 (2): 255-265; Kawamata et al (1997), Plant Cell Physiol. 38 (7): 792-803; Hansen et al (1997), MoI. Gen. Genet. 254 (3): 337-343; Russell et al (1997), Transgenic Res. 6 (2): 157-168; Rinehart et al (1996), Plant Physiol. 112 (3): 1331-1341; Van Camp et al (1996), Plant Physiol. 112 (2): 525-535; Canevascini et al (1996), Plant Physiol. 112 (2): 513-524; Yamamoto et al (1994), Plant Cell Physiol. 35 (5): 773-778; Lam (1994), Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196; Orozco et al (1993), Plant Mol. Biol. 23 (6): 1129-1138; Matsuoka et al (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (20): 9586-9590; e Guevara-Garcia et al (1993), Plant J. 4 (3): 495-505. Esses promotores podem ser modificados, se necessário, para expressão fraca. Em uma realização, os ácidos nucleicos de interesse são dirigidos ao cloroplasta para expressão. Desta forma, quando o ácido nucleico de interesse não for inserido diretamente no cloroplasta, o cassete de expressão conterá adicionalmente uma sequência de direcionamento de cloroplastas que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplastas para dirigir o produto genético de interesse para os cloroplastas. Esses peptídeos de trânsito são conhecidos na técnica. Com relação às sequências de direcionamento de cloroplastas, “ligado operativamente” indica que a sequência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo de trânsito (ou seja, a sequência de direcionamento de cloroplastas) é ligada ao ácido nucleico de HPPD de acordo com a presente invenção, de tal forma que as duas sequências sejam contíguas e encontrem-se no mesmo quadro de leitura. Vide, por exemplo, Von Heijne et al (1991), Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al (1989), J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa et al (1987), Plant Physiol. 84: 965968; Romer et al (1993), Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; e Shah et al (1986), Science 233: 478-481. Qualquer peptídeo de trânsito de cloroplasta conhecido na técnica pode ser fundido à sequência de aminoácidos de uma proteína HPPD madura de acordo com a presente invenção por meio da ligação operativa de uma sequência de direcionamento de cloroplastas à extremidade 5’ de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína mut-HPPD madura de acordo com a presente invenção. Sequências de direcionamento de cloroplastas são conhecidas na técnica e incluem a subunidade pequena de cloroplasta e ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al (1996), Plant Mol. Biol. 30: 769-780; Schnell et al (1991), J. Biol. Chem. 266 (5): 3335-3342); 5- (enolpiruvil)shikimato-3-fosfato sintase (EPSPS) (Archer et al (1990), J. Bioenerg. Biomemb. 22 (6): 789-810); triptofano sintase (Zhao et al (1995), J. Biol. Chem. 270 (11): 6081-6087); plastocianina (Lawrence et al (1997), J. Biol. Chem. 272 (33): 20357-20363); corismato sintase (Schmidt et al (1993), J. Biol. Chem. 268 (36): 27447-27457); e a proteína de ligação de clorofila a/b de colheita leve (LHBP) (Lamppa et al (1988), J. Biol. Chem. 263: 14996 14999). Vide também Von Heijne et al, (1991), Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al (1989), J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa et al (1987), Plant Physiol. 84: 965-968; Romer et al (1993), Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; e Shah et al (1986), Science 233: 478-481.
[00406] Métodos de transformação de cloroplastas são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Svab et al (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87: 8526-8530; Svab e Maliga (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90: 913-917; Svab e Maliga (1993), EMBO J. 12: 601-606. O método depende do fornecimento de disparador de partículas de DNA que contém um marcador selecionável e direcionamento do DNA ao genoma de plastídeo por meio de recombinação homóloga. Além disso, a transformação de plastídeos pode ser realizada por meio de transativação de um transgene contido em plastídeo silencioso por meio da expressão preferida de tecidos de uma RNA polimerase codificada nuclear e dirigida a plastídeos. Esse sistema foi relatado em McBride et al (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 7301-7305. Os ácidos nucleicos de interesse a serem dirigidos ao cloroplasta podem ser otimizados para expressão no cloroplasta para compensar as diferenças do uso de códons entre o núcleo da planta e essa organela. Desta forma, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados utilizando códons preferidos de cloroplastas. Vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 5.380.831, incorporada ao presente como referência.
[00407] Em uma realização preferida, o ácido nucleico de HPPD que codifica um HPPD do tipo selvagem ou que sofreu mutação (a) ou o ácido nucleico de HST (b) compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste de: (a) um polinucleotídeo conforme exibido em SEQ ID NO: 1, 51, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 52, 54, 56, 68, 69 ou uma de suas variantes ou derivados; (b) um polinucleotídeo conforme exibido em SEQ ID NO: 47 ou 49 ou uma de suas variantes ou derivados; (c) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo conforme exibido em SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 53, 55, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 ou uma de suas variantes ou derivados; (d) um polinucleotídeo que compreende pelo menos sessenta nucleotídeos consecutivos de qualquer um dentre (a) a (c); e (e) um polinucleotídeo complementar ao polinucleotídeo de qualquer um dentre (a) a (d).
[00408] Preferencialmente, o cassete de expressão compreende adicionalmente uma região reguladora do início de transcrição e uma região reguladora do início de tradução que são funcionais na planta.
[00409] Embora os polinucleotídeos de acordo com a presente invenção encontrem uso como genes marcadores selecionáveis para transformação vegetal, os conjuntos de expressão de acordo com a presente invenção podem incluir outro gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Genes marcadores selecionáveis, incluindo os da presente invenção, são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes marcadores incluem, mas sem limitações, genes que codificam a resistência a antibióticos, tais como os que codificam neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), bem como genes que conferem resistência a compostos herbicidas, tais como glufosinato amônio, bromoxinil, imidazolinonas e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Vide, de forma geral, Yarranton (1992), Curr. Opin. Biotech. 3: 506-511; Christopherson et al (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 6314-6318; Yao et al (1992), Cell 71: 63-72; Reznikoff (1992), MoI. Microbiol. 6: 2419-2422; Barkley et al (1980), The Operon, págs. 177-220; Hu et al (1987), Cell 48: 555-566; Brown et al (1987), Cell 49: 603-612; Figge et al (1988), Cell 52: 713-722; Deuschle et al (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 5400-5404; Fuerst et al (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 2549-2553; Deuschle et al (1990), Science 248: 480-483; Gossen (1993), Tese de Ph.D, Universidade de Heidelberg; Reines et al (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90: 1917-1921; Labow et al (1990), MoI. Cell Biol. 10: 3343-3356; Zambretti et al (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 3952-3956; Bairn et al (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88: 50725076; Wyborski et al (1991), Nucleic Acids Res. 19: 4647-4653; Hillenand- Wissman (1989), Topics Mol. Struc. Biol. 10: 143-162; Degenkolb et al (1991), Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591-1595; Kleinschnidt et al (1988), Biochemistry 27: 1094-1104; Bonin (1993), Tese de Ph.D, Universidade de Heidelberg; Gossen et al (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 5547-5551; Oliva et al (1992), Antimicrob. Agents Chemother. 36: 913-919; Hlavka et al (1985), Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlim); Gill et al (1988), Nature 334: 721-724. Essas descrições são incorporadas ao presente como referência. A lista acima de genes marcadores selecionáveis não se destina a ser limitadora. Qualquer gene marcador selecionável pode ser utilizado na presente invenção.
[00410] A presente invenção fornece ainda um vetor de expressão recombinante isolado que compreende o cassete de expressão que contém um ácido nucleico de HPPD conforme descrito acima, em que a expressão do vetor em uma célula hospedeira resulta em aumento da tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, em comparação com uma variedade do tipo selvagem da célula hospedeira. Da forma utilizada no presente, o termo “vetor” designa uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual tenha se ligado. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que designa um circuito de DNA de fita dupla circular ao qual podem ser ligados segmentos de DNA adicionais. Outro tipo de vetor é um vetor viral, no qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Certos vetores são capazes de reprodução autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (tais como vetores bacterianos que possuem uma origem bacteriana de reprodução e vetores de mamíferos epissomais). Outros vetores (tais como vetores de mamíferos não epissomais) são integrados ao genoma de uma célula hospedeira mediante introdução na célula hospedeira e, portanto, são reproduzidos junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais são ligados operativamente. Esses vetores são denominados no presente “vetores de expressão”. De forma geral, os vetores de expressão úteis em métodos de DNA recombinantes encontram-se frequentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, “plasmídeo” e “vetor” podem ser utilizados de forma intercambiável, pois o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente utilizada. A presente invenção destina-se, entretanto, a incluir essas outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus com defeitos de reprodução, adenovírus e vírus adenoassociados), que atendem a funções equivalentes.
[00411] Os vetores de expressão recombinantes de acordo com a presente invenção compreendem um ácido nucleico de acordo com a presente invenção em forma apropriada para expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira, o que significa que os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais sequências reguladoras, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem utilizadas para expressão, que são ligadas operativamente à sequência de ácidos nucleicos a ser expressa. Sequências regulatórias incluem aquelas que dirigem a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeos em muitos tipos de células hospedeiras e as que dirigem a expressão da sequência de nucleotídeos somente em certas células hospedeiras ou sob certas condições. Os técnicos no assunto apreciarão que o projeto do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de polipeptídeo desejado etc. Os vetores de expressão de acordo com a presente invenção podem ser introduzidos em células hospedeiras, de forma a produzir polipeptídeos ou peptídeos, incluindo polipeptídeos ou peptídeos de fusão, codificados por ácidos nucleicos conforme descrito no presente (por exemplo, polipeptídeos mut-HPPD, polipeptídeos de fusão etc.).
[00412] Em uma realização preferida da presente invenção, os polipeptídeos HPPD são expressos em plantas e células vegetais tais como células vegetais unicelulares (por exemplo, algas) (vide Falciatore et al, 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239-251 e referências ali contidas) e células vegetais de plantas superiores (por exemplo, os espermatófitos, tais como plantas produtoras). Um polinucleotídeo HPPD pode ser “introduzido” em uma célula vegetal por qualquer meio, incluindo transfecção, transformação ou transdução, eletroporação, bombardeamento de partículas, agroinfecções, biolística e similares.
[00413] Métodos apropriados de transformação ou transfecção de células hospedeiras, incluindo células vegetais, podem ser encontrados em Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989) e outros manuais de laboratório, tais como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium Protocols, Ed.: Gartland e Davey, Humana Press, Totowa, Nova Jérsei. Como a maior tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, é uma característica geral cuja herança é desejada em uma ampla variedade de plantas como milho, trigo, centeio, aveia, triticale, arroz, cevada, soja, amendoim, algodão, colza, canola, mandioca, pimenta, girassol e tagetes, plantas solanáceas como batata, fumo, berinjela e tomate, espécies de Vicia, ervilha, alfafa, arbustos (café, cacau e chá), espécies de Salix, árvores (palma oleaginosa, coco) e gramas perenes. Safras de forragem também são plantas alvo preferidas para engenharia genética como realização adicional da presente invenção. Em uma realização preferida, a planta é uma planta produtora. Safras de forragem incluem, mas sem limitações, erva de trigo, alpiste, Bromus, azevém selvagem, erva de febra, Dactylis, alfafa, salfoína, cornichão, trevo híbrido, trevo vermelho e trevo de cheiro.
[00414] Em uma realização da presente invenção, a transfecção de um polinucleotídeo mut-HPPD em plantas é atingida por meio de transferência genética mediada por Agrobacterium. Um método de transformação conhecido dos técnicos no assunto é o mergulhamento de planta em floração em uma solução de Agrobacteria, em que a Agrobacteria contém o ácido nucleico mut-HPPD, seguido por cultivo dos gametas transformados. Transformação vegetal mediada por Agrobacterium pode ser realizada utilizando, por exemplo, o GV3101 (pMP90) (Koncz e Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396) ou linhagem LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens (Clontech). A transformação pode ser realizada por meio de métodos de transformação e regeneração padrão (Deblaere et al, 1994, Nucl. Acids Res. 13: 4777-4788; Gelvin, Stanton B. e Schilperoort, Robert, A., Plant Molecular Biology Manual, segunda edição - Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. - in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R. e Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-51642). Canola, por exemplo, pode ser transformada por meio da transformação de cotilédones ou hipocotilédones (Moloney et al, 1989, Plant Cell Report 8: 238242; De Block et al, 1989, Plant Physiol. 91: 694-701). O uso de antibióticos para a seleção de plantas de Agrobacterium depende do vetor binário e da linhagem de Agrobacterium utilizada para transformação. A seleção de canola é normalmente realizada utilizando canamicina como marcador vegetal selecionável. Transferência genética mediada por Agrobacterium para linho pode ser realizada utilizando, por exemplo, um método descrito por Mlynarova et al, 1994, Plant Cell Report 13: 282-285. Além disso, a transformação de soja pode ser realizada utilizando, por exemplo, um método descrito na Patente Europeia n° 0.424.047, Patente Norte-Americana n° 5.322.783, Patente Europeia n° 0.397.687: Patente Norte-Americana n° 5.376.543; ou Patente Norte-Americana n° 5.169.770. A transformação de milho pode ser atingida por meio de bombardeamento de partículas, absorção de DNA mediada por polietileno glicol ou pelo método de fibra de carbureto de silício (vide, por exemplo, Freeling e Walbot, The Maize Handbook, Springer Verlag: Nova Iorque (1993), ISBN 3-540-97826-7). Um exemplo específico de transformação de milho é encontrado na Patente Norte-Americana n° 5.990.387 e um exemplo específico de transformação de trigo pode ser encontrado no Pedido PCT n° WO 93/07256.
[00415] Segundo a presente invenção, o polinucleotídeo HPPD introduzido pode ser mantido na célula vegetal de forma estável caso seja incorporado em uma réplica autônoma não cromossômica ou integrado aos cromossomos da planta. Alternativamente, o polinucleotídeo mut-HPPD introduzido pode estar presente sobre um vetor sem reprodução extracromossômico e pode ser expresso de forma transitória ou ser transitoriamente ativo. Em uma realização, pode ser criado um microorganismo recombinante homólogo no qual o polinucleotídeo mut-HPPD é integrado a um cromossomo, é preparado um vetor que contém pelo menos uma parte de um gene HPPD no qual tenha sido introduzida uma exclusão, adição ou substituição, de forma a alterar, por exemplo romper funcionalmente, o gene HPPD endógeno e criar um gene mut-HPPD. Para criar uma mutação pontual por meio de recombinação homóloga, podem ser utilizados híbridos de DNA-RNA em um método conhecido como quimeroplastia (Cole-Strauss et al, 1999, Nucleic Acids Research 27 (5): 1323-1330 e Kmiec, 1999, Gene Therapy American Scientist 87 (3): 240-247). Outros procedimentos de recombinação homóloga em espécies de Triticum também são conhecidos na técnica e contemplados para uso no presente.
[00416] No vetor de recombinação homóloga, o gene HPPD do tipo selvagem ou que sofreu mutação pode ser ladeado nas suas extremidades 5’ e 3’ por uma molécula de ácido nucleico adicional do gene HPPD para permitir a ocorrência de recombinação homóloga entre o gene HPPD do tipo selvagem ou que sofreu mutação exógeno conduzido pelo vetor e um gene HPPD endógeno em micro-organismos ou plantas. A molécula de HPPD lateral adicional possui comprimento suficiente para recombinação homóloga bem sucedida com o gene endógeno. Tipicamente, várias centenas de pares de bases até quilobases de DNA lateral (nas extremidades 5’ e 3’) são incluídas no vetor (vide, por exemplo, Thomas, K. R. e Capecchi, M. R., 1987, Cell 51: 503 para uma descrição de vetores de recombinação homóloga de Strepp et al, 1998, PNAS 95 (8): 4368-4373 para recombinação com base em cDNA em Physcomitrella patens). Como o gene mut-HPPD normalmente difere do gene HPPD em muito poucos aminoácidos, entretanto, nem sempre é necessária uma sequência lateral. O vetor de recombinação homóloga é introduzido em um micro-organismo ou célula vegetal (por exemplo, por meio de DNA mediado por polietileno glicol) e células nas quais o gene mut-HPPD introduzido recombinou-se de forma homóloga com o gene HPPD endógeno são selecionadas utilizando métodos conhecidos na técnica.
[00417] Em outra realização, podem ser produzidos micro organismos recombinantes que contêm sistemas selecionados que permitem a expressão regulada do gene introduzido. A inclusão de um gene mut-HPPD sobre um vetor colocando-o sob o controle do operador de lac, por exemplo, permite a expressão do gene mut-HPPD somente na presença de IPTG. Esses sistemas reguladores são bem conhecidos na técnica.
[00418] Outro aspecto da presente invenção refere-se a células hospedeiras nas quais foi introduzido um vetor de expressão recombinante de acordo com a presente invenção. As expressões “célula hospedeira” e “célula hospedeira recombinante” são utilizadas de forma intercambiável no presente. Compreende-se que essas expressões não designam apenas a célula objeto específica, mas também se aplicam à prole ou prole potencial dessa célula. Como certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devio à mutação ou influências ambientais, essa prole não pode, na verdade, ser idêntica à célula parental, mas ainda é incluída no escopo da expressão utilizada no presente. Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Um polinucleotídeo mut-HPPD pode ser expresso, por exemplo, em células bacterianas, tais como C. glutamicum, células de insetos, células fúngicas ou células de mamíferos (tais como células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células COS), algas, ciliatos, células vegetais, fungos ou outros micro-organismos, tais como C. glutamicum. Outras células hospedeiras apropriadas são conhecidas dos técnicos no assunto.
[00419] Uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção, tal como uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica em cultivo, pode ser utilizada para produzir (ou seja, expressar) um polinucleotídeo mut-HPPD. Consequentemente, a presente invenção fornece ainda métodos de produção de polipeptídeos mut-HPPD utilizando as células hospedeiras de acordo com a presente invenção. Em uma realização, o método compreende o cultivo da célula hospedeira de acordo com a presente invenção (na qual foi introduzido um vetor de expressão recombinante que codifica um polipeptídeo mut-HPPD ou em cujo genoma foi introduzido um gene que codifica um polipeptídeo HPPD do tipo selvagem ou que sofreu mutação) em um meio apropriado até a produção de um polipeptídeo mut-HPPD. Em outra realização, o método compreende adicionalmente o isolamento de polipeptídeos mut- HPPD do meio ou da célula hospedeira. Outro aspecto da presente invenção refere-se a polipeptídeos mut-HPPD isolados e suas porções biologicamente ativas. Polipeptídeo “isolado”, “purificado” ou sua parte biologicamente ativa é livre de parte do material celular quando produzido por meio de métodos de DNA recombinantes, precursores químicos ou outras substâncias quando quimicamente sintetizado. A expressão “substancialmente livre de material celular” inclui preparações de polipeptídeo mut-HPPD nas quais o polipeptídeo é separado de alguns dos componentes celulares das células nas quais é produzido de forma natural ou recombinante. Em uma realização, a expressão “substancialmente livre de material celular” inclui preparações de um polipeptídeo mut-HPPD que contém menos de cerca de 30% (em peso seco) de material HPPD que não sofreu mutação (também denominado no presente “polipeptídeo contaminante”), de maior preferência menos de cerca de 20% de material de HPPD que não sofreu mutação, de preferência ainda maior menos de cerca de 10% de material de HPPD que não sofreu mutação e, de preferência superior, menos de cerca de 5% de material de HPPD que não sofreu mutação.
[00420] Quando o polipeptídeo mut-HPPD ou sua porção biologicamente ativa é produzido de forma recombinante, ele, preferencialmente, também é substancialmente livre de meio de cultivo, ou seja, o meio de cultivo representa menos de cerca de 20%, de maior preferência menos de cerca de 10% e, de preferência superior, menos de cerca de 5% do volume da preparação de polipeptídeo. A expressão “substancialmente livre de precursores químicos ou outras substâncias” inclui preparações de polipeptídeo mut-HPPD nas quais o polipeptídeo é separado de precursores químicos ou outras substâncias que são envolvidas na síntese do polipeptídeo. Em uma realização, a expressão “substancialmente livre de precursores químicos ou outras substâncias” inclui preparações de polipeptídeos mut-HPPD que contêm menos de cerca de 30% (em peso seco) de precursores químicos ou substâncias de HPPD que não sofreu mutação, de maior preferência menos de cerca de 20% de precursores químicos ou substâncias de HPPD que não sofreu mutação, de preferência ainda maior menos de cerca de 10% de precursores químicos ou substâncias de HPPD que não sofreu mutação e, de preferência superior, menos de cerca de 5% de precursores químicos ou sustâncias de HPPD que não sofreu mutação. Em realizações preferidas, polipeptídeos isolados ou suas porções biologicamente ativas não contêm polipeptídeos contaminantes do mesmo organismo do qual é derivado o polipeptídeo mut-HPPD. Tipicamente, esses polipeptídeos são produzidos por meio da expressão recombinante, por exemplo, de um polipeptídeo mut-HPPD em plantas diferentes ou em micro-organismos tais como C. glutamicum, ciliatos, algas ou fungos.
[00421] Conforme descrito acima, a presente invenção ensina composições e métodos de aumento da tolerância a inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, de uma semente ou planta produtora em comparação com uma variedade do tipo selvagem da planta ou semente. Em uma realização preferida, a tolerância a inibidores de HPPD de uma semente ou planta produtora aumenta de tal forma que a planta ou semente pode suportar uma aplicação de herbicida inibidor de HPPD preferencialmente de cerca de 1-1000 g i.a./ha-1, de maior preferência de 20-160 g i.a./ha-1 e, de preferência superior, 40-80 g i.a./ha-1. Da forma utilizada no presente, “suportar” uma aplicação de herbicida inibidor de HPPD indica que a planta não é morta nem danificada por essa aplicação.
[00422] Além disso, a presente invenção fornece métodos que envolvem o uso de pelo menos um herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona conforme relacionado acima.
[00423] Nesses métodos, o herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, pode ser aplicado por meio de qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas sem limitações, tratamento de sementes, tratamento de solo e tratamento foliar. Antes da aplicação, o herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, pode ser convertido nas formulações costumeiras, tais como soluções, emulsões, suspensões, pós secos, pós, pastas e grânulos. A forma de uso depende do propósito pretendido específico; em cada caso, ela deverá garantir distribuição fina e homogênea do composto de acordo com a presente invenção.
[00424] Fornecendo plantas que possuem maior tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, uma ampla variedade de formulações pode ser empregada para proteger plantas contra ervas, de forma a aumentar o crescimento das plantas e reduzir a competição por nutrientes. Herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, podem ser utilizados isoladamente para controle pré- emergência, pós-emergência, pré-plantio e no plantio de ervas em áreas ao redor das plantas produtoras descritas no presente ou pode ser utilizada uma formulação de herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, que contenha outros aditivos. O herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, pode também ser utilizado como tratamento de sementes. Aditivos encontrados em uma formulação de herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, incluem outros herbicidas, detergentes, adjuvantes, agentes espalhantes, agentes aglutinantes, agentes estabilizantes ou similares. A formulação de herbicida inibidor de HPPD, preferencialmente derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona, pode ser uma preparação seca ou úmida e pode incluir, mas sem limitações, pós fluidos, concentrados emulsionáveis e concentrados líquidos. As formulações de herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, podem ser aplicadas de acordo com métodos convencionais, por exemplo, por meio de pulverização, irrigação, polvilhamento ou similares.
[00425] Formulações apropriadas são descritas em detalhes em PCT/EP2009/063387 e PCT/EP2009/063386, que são incorporadas ao presente como referência.
[00426] Dever-se-á também compreender que o acima refere-se a realizações preferidas da presente invenção e que numerosas alterações podem ser elaboradas sem abandonar o escopo da presente invenção. A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos exemplos a seguir, que não devem ser considerados, de nenhuma forma, como impondo limitações ao seu escopo. Ao contrário, deve-se compreender claramente que se pode recorrer a várias outras realizações, modificações e seus equivalentes que, após a leitura do presente relatório descritivo, podem ser sugeridos aos técnicos no assunto, sem abandonar o espírito da presente invenção e/ou o escopo das reivindicações anexas.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
[00427] Clonagem de genes codificadores de HPPD:
(A) CLONAGEM DE HPPD DE ARABIDOPSIS THALIANA:
[00428] A sequência de codificação de AthPPD de Arabidopsis thaliana parcial (SEQ ID NO: 52) é amplificada por meio de métodos de PCR padrão de cDNA de Arabidopsis thaliana utilizando os primers HuJ101 e HuJ102 (Tabela 5).
TABELA 5
[00429] Primers de PCR para amplificação de AtHPPD (SEQ ID NO: 70, 71):
Figure img0021
[00430] O produto de PCR é clonado no vetor pEXP5- NT/TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos), de acordo com as instruções do fabricante. O plasmídeo resultante pEXP5-NT/TOPO®-AtHPPD é isolado de E. coli TOP10 realizando-se uma minipreparação de plasmídeos. O cassete de expressão que codifica AtHPPD marcado com His6 N-terminal é confirmado por meio de sequenciamento de DNA.
(B) CLONAGEM DE HPPD1 DE CHLAMYDOMONAS REINHARDTII :
[00431] A sequência de codificação de HPPD1 de C. reinhardtii (CrHPPD1) (SEQ ID NO: 54) é otimizada por códons para expressão em E. coli e fornecida na forma de gene sintético (Entelechon, Regensburg, Alemanha). O gene sintético parcial é amplificado por meio de métodos de PCR padrão utilizando os primers Ta1-1 e Ta1-2 (Tabela 6).
TABELA 6
[00432] Primers de PCR para amplificação de CrHPPD1 (SEQ ID NO: 72, 73):
Figure img0022
[00433] O produto de PCR é clonado no vetor pEXP5- NT/TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos), de acordo com as instruções do fabricante. O plasmídeo resultante pEXP5-NT/TOPO®-CrHPPD1 é isolado de E. coli TOP10 realizando-se uma minipreparação de plasmídeos. O cassete de expressão que codifica CrHPPD1 marcado com His6 N-terminal é confirmado por meio de sequenciamento de DNA.
(c) CLONAGEM DE HPPD2 DE C. REINHARDTII:
[00434] A sequência de codificação de HPPD2 de C. reinhardtii (CrHPPD2) (SEQ ID NO: 56) é otimizada por códons para expressão em E. coli e fornecida na forma de gene sintético (Entelechon, Regensburg, Alemanha). O gene sintético parcial é amplificado por meio de métodos de PCR padrão utilizando os primers Ta1-3 e Ta1-4 (Tabela 7).
TABELA 7
[00435] Primers de PCR para amplificação de CrHPPD2 (SEQ ID NO: 74, 75):
Figure img0023
[00436] O produto de PCR é clonado no vetor pEXP5- NT/TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos), de acordo com as instruções do fabricante. O plasmídeo resultante pEXP5-NT/TOPO®-CrHPPD2 é isolado de E. coli TOP10 realizando-se uma minipreparação de plasmídeos. O cassete de expressão que codifica CrHPPD2 marcado com His6 N-terminal é confirmado por meio de sequenciamento de DNA.
(D) CLONAGEM DE HPPD DE GLYCINE MAX:
[00437] A sequência de codificação de HPPD de Glycine max (GmHPPD; Glyma14g03410) é otimizada por códons para expressão em E. coli e fornecida na forma de gene sintético (Entelechon, Regensburg, Alemanha). O gene sintético parcial é amplificado por meio de métodos de PCR padrão utilizando os primers Ta2-65 e Ta2-66 (Tabela 8).
TABELA 8
[00438] Primers de PCR para amplificação de GmHPPD (SEQ ID NO: 76, 77):
Figure img0024
[00439] O produto de PCR é clonado no vetor pEXP5- NT/TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos), de acordo com as instruções do fabricante. O plasmídeo resultante pEXP5-NT/TOPO®- GmHPPD é isolado de E. coli TOP10 realizando-se uma minipreparação de plasmídeos. O cassete de expressão que codifica GmHPPD marcado com His6 N-terminal é confirmado por meio de sequenciamento de DNA.
E. CLONAGEM DE HPPD DE ZEA MAYS:
[00440] A sequência de codificação de HPPD de Zea mays (ZmHPPD; GRMZM2G088396) é otimizada por códons para expressão em E. coli e fornecida na forma de gene sintético (Entelechon, Regensburg, Alemanha). O gene sintético parcial é amplificado por meio de métodos de PCR padrão utilizando os primers Ta2-45 e Ta2-46 (Tabela 9).
TABELA 9
[00441] Primer de PCR para amplificação de ZmHPPD (SEQ ID NO: 78, 79):
Figure img0025
[00442] O produto de PCR é clonado no vetor pEXP5- NT/TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos), de acordo com as instruções do fabricante. O plasmídeo resultante pEXP5-NT/TOPO®-ZmHPPD é isolado de E. coli TOP10 realizando-se uma minipreparação de plasmídeos. O cassete de expressão que codifica ZmHPPD marcado com His6 N-terminal é confirmado por meio de sequenciamento de DNA.
F. CLONAGEM DE HPPD DE ORYZA SATIVA :
[00443] A sequência de codificação de HPPD de Oryza sativa (OsHPPD; Os02g07160) é otimizada por códons para expressão em E. coli e fornecida na forma de gene sintético (Entelechon, Regensburg, Alemanha). O gene sintético parcial é amplificado por meio de métodos de PCR padrão utilizando os primers Ta2-63 e Ta2-64 (Tabela 10).
TABELA 10
[00444] Primer de PCR para amplificação de OsHPPD (SEQ ID NO: 80, 81):
Figure img0026
[00445] O produto de PCR é clonado no vetor pEXP5- NT/TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos), de acordo com as instruções do fabricante. O plasmídeo resultante pEXP5-NT/TOPO®-OsHPPD é isolado de E. coli TOP10 realizando-se uma minipreparação de plasmídeos. O cassete de expressão que codifica OsHPPD marcado com His6 N-terminal é confirmado por meio de sequenciamento de DNA.
G. SÍNTESE GENÉTICA E SUBCLONAGEM:
[00446] Outros genes codificadores de HPPD do tipo selvagem, tais como gene HPPD de Hordeum vulgare (SEQ ID NO: 1/2) ou Picrophilus torridus (SEQ ID NO: 39/40), foram sintetizados pela Geneart (Regensburg, Alemanha) ou Entelechon (Regensburg, Alemanha) e subclonados em um vetor de expressão pET24D modificado (Novagen), resultando em construções de expressão marcadas com His N-terminais.
EXEMPLO 2
[00447] Expressão heteróloga e purificação de enzimas HPPD recombinantes:
[00448] Enzimas HPPD recombinantes são produzidas e sobre-expressas em E. coli. Células BL21 quimicamente competentes (DE3) (Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos) são transformadas com pEXP5- NT/TOPO® (vide o Exemplo 10 ou com outros vetores de expressão de acordo com as instruções do fabricante.
[00449] Células transformadas são cultivadas em meio de autoindução (ZYM 5052 suplementado com 100 μg/ml de ampicilina) por seis horas a 37 °C, seguido por 24 horas a 25 °C.
[00450] As células são colhidas por meio de centrifugação (8000 x g) a OD600 (densidade óptica a 600 nm) de 8 a 12. A pelota celular é novamente suspensa em um tampão de lise (50 mM de tampão fosfato de sódio, 0,5 M de NaCl, 10 mM de imidazol, pH 7,0) suplementado com mistura de inibidor de protease livre de EDTA completa (Roche-Diagnostics) e homogeneizado utilizando Avestin Press. O homogeneizado é limpo por meio de centrifugação (40.000 x g). HPPD marcado com His6 ou variantes mutantes são purificados por meio de cromatografia de afinidade em uma Coluna Embalada Protino Ni-IDA 1000 (Macherey-Nagel) de acordo com as instruções do fabricante. HPPD purificado ou variantes mutantes sofrem diálise contra 100 mM de tampão fosfato de sódio, pH 7,0, suplementado com 10% de glicerina e armazenado a -86 °C. O teor de proteína é determinado de acordo com Bradford, utilizando o teste de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Estados Unidos). A pureza da preparação de enzimas é estimada por meio de SDS-PAGE.
EXEMPLO 3
[00451] Teste da atividade de HPPD:
[00452] HPPD produz ácido homogentísico e CO2 a partir de 4-hidroxifenilpiruvato (4-HPP) e O2. O teste de atividade de HPPD é baseado na análise de ácido homogentísico por meio de HPLC de fase reversa.
[00453] A mistura de teste pode conter 150 mM de tampão fosfato de potássio, pH 7,0, 50 mM de ácido L-ascórbico, 100 μM de Catalase (Sigma-Aldrich), 1 μM de FeSO4 e 0,2 unidades de enzima HPPD purificada em volume total de 505 μl. Uma unidade é definida como a quantidade de enzima que é necessária para produzir 1 nmol de HGA por minuto a 20 °C.
[00454] Após incubação prévia de trinta minutos, a reação inicia-se com a adição de 4-HPP até concentração final de 0,05 mM. A reação é mantida em processamento por 45 minutos à temperatura ambiente. A reação é suspensa por meio da adição de 50 μl de 4,5 M ácido fosfórico. A amostra é filtrada utilizando um dispositivo de filtragem de PVDF com tamanho de poro de 0,2 μM.
[00455] 5 μl da amostra limpa são analisados em uma coluna UPLC HSS T3 (tamanho de partícula de 1,8 μm, dimensões de 2,1 x 50 mm; Waters) por meio de eluição isocrática utilizando 90% de 20 mM de NaH2PO4, pH 2,2 e 10% de metanol (v/v).
[00456] HGA é detectado eletroquimicamente a 750 mV (modo: DC; polaridade: positiva) e quantificado por meio de integração das áreas de pico (software Empower, Waters).
[00457] Os inibidores são dissolvidos em DMSO (sulfóxido de dimetila) até concentração de 0,5 mM. A partir desta solução padrão, são preparadas diluições em série por cinco vezes em DMSO, que são utilizadas no teste. A solução inibidora correspondente representa 1% do volume de teste. Portanto, as concentrações de inibidor final variam de 5 μM a 320 pM, respectivamente. As atividades são normalizadas definindo-se a atividade enzimática não inibida em 100%. Os valores IC50 são calculados utilizando regressão não linear.
EXEMPLO 4
[00458] Caracterização in vitro de enzimas HPPD do tipo selvagem:
[00459] Utilizando métodos que são descritos nos exemplos acima ou bem conhecidos na técnica, enzimas HPPD do tipo selvagem recombinantes purificadas são caracterizadas com relação às suas propriedades cinéticas e sensiblidade a herbicidas inibidores de HPPD. Constantes Michaelis aparentes (Km) e velocidades máximas de reação (Vmax) são calculadas por meio de regressão não linear com o software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, Estados Unidos) utilizando um modelo de inibição de substratos. Valores kcat aparentes são calculados a partir de Vmax, considerando 100% de pureza da preparação de enzimas. Médias ponderadas (por meio de desvio padrão) de valores Km e IC50 são calculadas a partir de pelo menos três experimentos independentes. A equação de Cheng- Prusoff para inibição competitiva (Cheng, Y. C., Prusoff, W. H., Biochem. Pharmacol. 1973, 22, 3099-3108) é utilizada para calcular constantes de dissociação (Ki).
[00460] O desempenho de campo da enzima HPPD, que é utilizada como característica de tolerância a herbicidas, pode depender não apenas da sua falta de sensibilidade para herbicidas inibidores de HPPD, mas também da sua atividade. Para determinar o desempenho potencial de uma característica de tolerância a herbicidas, é calculado um índice de tolerância (TI) utilizando a fórmula a seguir:
Figure img0027
[00461] Permite-se fácil comparação e avaliação de cada característica normalizando-se os índices de tolerância sobre HPPD do tipo selvagem de Arabidopsis.
[00462] Exemplos dos dados obtidos em teste in vitro são ilustrados na Tabela 11 e na Tabela 12.
TABELA 11
[00463] Determinação de constantes Michaelis (Km) para 4- HPP, números de rendimento (kcat), eficiências catalíticas (kcat/Km) e constantes de dissociação (Ki) para diversas enzimas HPPD.
Figure img0028
Os herbicidas inibidores de HPPD utilizados neste exemplo são [3-(4,5-di-hidroisoxazol-3-il)-2-metil-4-metilsulfonilfenil]-(5-hidróxi-1- metilpirazol-4-il)metanona (Inibidor 1) e 2-(4-metilsulfonil-2-nitrobenzoil)ciclohexano-1,3-diona (Inibidor 2).
TABELA 12
[00464] Índices de tolerância e diversas enzimas HPPD normalizadas em HPPD de Arabidopsis:
Figure img0029
* Os herbicidas inibidores de HPPD utilizados neste exemplo são [3-(4,5-di-hidroisoxazol-3-il)-2-metil-4-metilsulfonilfenil]-(5-hidróxi-1- metilpirazol-4-il)metanona (Inibidor 1) e 2-(4-metilsulfonil-2-nitrobenzoil)ciclohexano-1,3-diona (Inibidor 2), 2-hidróxi-3-[2-(2-metoxietoximetil)-6- (trifluorometil)piridino-3-carbonil]biciclo[3.2.1]oct-2-en-4-ona (Inibidor 3) e 2-[2- cloro-4-metilsulfonil-3-(2,2,2-trifluoroetoximetil)benzoil]ciclo-hexano-1,3-diona (Inibidor 4).
[00465] A referência SEQ ID NO: 53 foi incluída como controle comparativo em uma quantidade representativa de experimentos e os valores fornecidos na Tabela 12 são os valores médios de uma série de experimentos. Os valores de TI fornecidos para diversas enzimas HPPD de diferentes organismos são normalizados no valor da referência SEQ ID NO: 53 no exemplo acima.
[00466] Pode-se observar a partir do exemplo acima, portanto, que um polinucleotídeo que compreende uma região que codifica HPPD de cevada é selecionada como codificando HPPD resistente a inibidores, pois descobriu-se que o índice de tolerância contra o Inibidor 1 é 3,7 vezes mais alto que o índice de tolerância similar do HPPD de Arabidopsis. Pode-se observar ainda que todos os polinucleotídeos que compreendem uma região que codifica enzimas HPPD de diferentes organismos são pelo menos 1,7 vezes mais resistentes a Inibidor 1 com relação à referência SEQ ID NO: 53.
[00467] Além disso, os polinucleotídeos que compreendem uma região que codifica HPPD de Lolium ou Avena são selecionados como transgenes que codificam HPPD resistente a inibidores porque se descobriu que o índice de tolerância contra todos os inibidores testados na presente invenção são muito maiores que o encontrado para a referência SEQ ID NO: 53. HPPD de Lolium e Avena são, portanto, úteis como características que conferem tolerância a herbicidas na presente invenção.
[00468] É evidente que qualquer enzima HPPD que é resistente a herbicidas, mesmo se essa proteína não for exemplificada neste texto, é parte do objeto da presente invenção.
EXEMPLO 5
[00469] Mutagênese racional:
[00470] Por meio de alinhamento de sequências e biologia estrutural, é possível selecionar uma certa quantidade de aminoácidos que pode ser direta ou indiretamente envolvida na ligação de “herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona” e, em seguida, sua mutagênese e obtenção de enzimas HPPD tolerantes.
(A) MUTAGÊNESE DIRIGIDA A LOCAL:
[00471] Mutagênese dirigida a local com base em PCR de pEXP5-NT/TOPO®-AtHPPD é realizada com o kit de mutagênese dirigida a local QuikChange II (Stratagene, Santa Clara, Estados Unidos) de acordo com as instruções do fabricante. Este método exige dois primers de DNA quimicamente sintetizados (primer frontal e reverso) para cada mutação. Exemplos de primers que podem ser utilizados para mutagênese dirigida a local de AtHPPD (SEQ ID NO: 52/53) são relacionados na Tabela 13.
TABELA 13
[00472] Primers de PCR para mutagênese dirigida a local de AtHPPD (SEQ ID NO: 82 a 147):
Figure img0030
Figure img0031
Figure img0032
Figure img0033
[00473] Exemplos de primers que podem ser utilizados para mutagênese dirigida a local de HvHPPD (SEQ ID NO: 1/2) são relacionados na Tabela 14.
TABELA 14
[00474] Primers de PCR para mutagênese dirigida a local de HvHPPD (SEQ ID NO: 148 a 155):
Figure img0034
[00475] Plasmídeos mutantes são isolados de E. coli TOP10 realizando-se uma minipreparação de plasmídeos e confirmados por meio de sequenciamento de DNA.
[00476] A combinação de substituições de aminoácidos isoladas é atingida por meio de abordagem de mutagênese em etapas.
(B) CARACTERIZAÇÃO IN VITRO DE MUTANTES DE HPPD:
[00477] Enzimas HPPD mutantes purificadas são obtidas por meio dos métodos descritos acima. Medições cinéticas e de reação à dosagem são conduzidas utilizando o teste de atividade de HPPD descrito. Constantes Michaelis aparentes (Km) e velocidades máximas de reação (Vmax) são calculadas por meio de regressão não linear com o software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, Estados Unidos) utilizando um modelo de inibição de substratos. Valores kcat aparentes são calculados a partir de Vmax, considerando 100% de pureza da preparação de enzimas. Médias ponderadas (por meio de desvio padrão) de valores Km e IC50 são calculadas a partir de pelo menos três experimentos independentes. A equação de Cheng-Prusoff para inibição competitiva (Cheng, Y. C., Prusoff, W. H., Biochem. Pharmacol. 1973, 22, 3099-3108) é utilizada para calcular constantes de dissociação (Ki).
[00478] O desempenho de campo da enzima HPPD otimizada, que é utilizada como característica de tolerância a herbicidas, pode depender não apenas da sua falta de sensibilidade para herbicidas inibidores de HPPD, mas também da sua atividade. Para determinar o desempenho potencial de uma característica de tolerância a herbicidas, é calculado um índice de tolerância (TI) utilizando a fórmula a seguir:
Figure img0035
[00479] Permite-se fácil comparação e avaliação de cada característica normalizando-se os índices de tolerância sobre HPPD do tipo selvagem correspondente.
[00480] Exemplos dos dados obtidos são ilustrados na Tabela 15 e na Tabela 16.
TABELA 15
[00481] Índices de tolerância normalizados de diversas enzimas HPPD geradas em HPPD de Arabidopsis (SEQ ID NO: 53):
Figure img0036
* Os herbicidas inibidores de HPPD utilizados neste exemplo são [3-(4,5-di-hidroisoxazol-3-il)-2-metil-4-metilsulfonilfenil]-(5-hidróxi-1- metilpirazol-4-il)metanona (Inibidor 1) e 2-(4-metilsulfonil-2-nitrobenzoil)ciclo- hexano-1,3-diona (Inibidor 2), 2-hidróxi-3-[2-(2-metoxietoximetil)-6- (trifluorometil)piridino-3-carbonil]biciclo[3.2.1]oct-2-en-4-ona (Inibidor 3) e 2-[2- cloro-4-metilsulfonil-3-(2,2,2-trifluoroetoximetil)benzoil]ciclo-hexano-1,3-diona (Inibidor 4).
TABELA 16
[00482] Índices de tolerância normalizados de diversos mutantes de HPPD gerados em HPPD de Hordeum (SEQ ID NO: 2):
Figure img0037
*Os herbicidas inibidores de HPPD utilizados neste exemplo são [3-(4,5-di-hidroisoxazol-3-il)-2-metil-4-metilsulfonilfenil]-(5-hidróxi-1- metilpirazol-4-il)metanona (Inibidor 1) e 2-(4-metilsulfonil-2-nitrobenzoil)ciclo- hexano-1,3-diona (Inibidor 2), 2-hidróxi-3-[2-(2-metoxietoximetil)-6- (trifluorometil)piridino-3-carbonil]biciclo[3.2.1]oct-2-en-4-ona (Inibidor 3) e 2-[2- cloro-4-metilsulfonil-3-(2,2,2-trifluoroetoximetil)benzoil]ciclo-hexano-1,3-diona (Inibidor 4).
[00483] Diversas conclusões podem ser derivadas dos dados das Tabelas 15 e 16. As propriedades de mutantes de HPPD indicaram que certas substituições de aminoácidos na sequência de codificação forneceram aprimoramentos significativos de HPPD SEQ ID NO: 2 e 53 com relação aos índices de tolerância contra herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente herbicidas derivados de pirazolona, isoxazolona ou tricetona.
[00484] Pode-se observar a partir dos resultados ilustrados na Tabela 15 que certas substituições para fenilalanina na posição 381 em SEQ ID NO: 53 forneceram aprimoramentos significativos com relação a HPPD SEQ ID NO: 53 com relação ao índice de tolerância para o Inibidor 1. Além disso, a mutação combinada de metionina na posição 335 em histidina em conjunto com a alteração de prolina na posição 336 para alanina ou glicina (SEQ ID NO: 53) resultou em aprimoramento significativo da enzima HPPD porque se descobriu que as enzimas HPPD que sofreram mutação apresentaram maior tolerância ao Inibidor 1 que a encontrada para a HPPD de referência SEQ ID NO: 53. A mutação adicional de glutamato na posição 363 em glutamina em conjunto com M335H, P336A resultou em aprimoramento adicional da enzima HPPD, pois essa versão que sofreu mutação conferiu índice de tolerância 6,4 vezes mais alto medido com o Inibidor 1 que o encontrado para a enzima de referência SEQ ID NO: 53.
[00485] Além disso, pode-se observar por meio dos resultados ilustrados na Tabela 16 que certas substituições para leucina na posição 320 em SEQ ID NO: 2, preferencialmente substituições para histidina, forneceram aprimoramentos significativos da enzima HPPD de cevada (SEQ ID NO: 2) com referência ao aumento do índice de tolerância com relação a todos os inibidores testados conforme descrito na Tabela 16. Esses mutantes, preferencialmente os mutantes que codificam um polinucleotídeo que compreende HPPD de cevada em que leucina 320 é substituído por histidina, podem ser selecionados, portanto, como mutantes que codificam HPPD resistente a inibidor e são úteis para gerar plantas tolerantes a herbicidas.
[00486] Além disso, a mutação combinada de leucina na posição 320 em histidina em conjunto com a substituição de prolina na posição 321 por alanina (SEQ ID NO: 2) resultou em aumento significativo da enzima HPPD, pois descobriu-se que a enzima HPPD que sofreu mutação apresentou comportamento significativamente aprimorado contra herbicidas inibidores de HPPD, pois o seu índice de tolerância aumentou em 5,1 vezes para o Inibidor 1, 3,5 vezes para o Inibidor 2, 2,5 vezes para o Inibidor 3 e 4,3 vezes para o Inibidor 4, em comparação com HPPD de referência SEQ ID NO: 2.
[00487] Além disso, um polinucleotídeo que compreende uma região que codifica HPPD de cevada (SEQ ID NO: 2), em que argina 309 é substituída por lisina, pode ser selecionado como transgene que codifica HPPD resistente a inibidor porque se descobriu que o índice de tolerância do mutante é significativamente aprimorado contra todos os inibidores testados na presente invenção.
[00488] É evidente que estes exemplos indicam que uma enzima HPPD mutante pode ser selecionada como sendo resistente a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, pois os índices de tolerância dos mutantes são maiores que o índice de tolerância da enzima do tipo selvagem. Além disso, qualquer mutação ou combinação de mutações que possibilitaria a obtenção de enzima HPPD resistente a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, mesmo se essa proteína não for exemplificada no presente texto, é parte do objeto da presente invenção.
EXEMPLO 6
[00489] Preparação de plantas que expressam enzimas HPPD e/ou HST heterólogas e que são tolerantes a “herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona”:
[00490] Diversos métodos de produção de plantas transformadas de forma estável são bem conhecidos na técnica.
[00491] Plantas de soja (Glycine max) ou milho (Zea mays) tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, podem ser produzidas por meio de um método descrito por Olhoff et al (Patente Norte-Americana n° 2009/0049567). Resumidamente, polinucleotídeos que codificam HPPD ou HST são clonados em um vetor binário utilizando métodos de clonagem padrão conforme descito por Sambrook et al (Molecular Cloning (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press). A construção de vetor final contém uma sequência de codificação de HPPD ou HST ladeada por uma sequência promotora (por exemplo, a sequência promotora de ubiquitina (PcUbi) e uma sequência terminal (por exemplo, a sequência terminal de nopalino sintase (NOS)) e um conjunto genético marcador de resistência (por exemplo, AHAS) (Figura 2). Opcionalmente, o gene HPPD ou HST pode fornecer o meio de seleção.
[00492] Transformação mediada por Agrobacterium é utilizada para introduzir o DNA em células de meristema axilar de soja no nó primário de explantes de mudas. Após a inoculação e o cocultivo com Agrobacteria, os explantes são transferidos para meio de indução de brotos sem seleção por uma semana. Os explantes são transferidos em seguida para meio de indução de brotos com 1-3 μM de imazapir (Arsenal) por três semanas para selecionar células transformadas. Explantes com almofadas de brotos/calos saudáveis no nó primário são transferidos em seguida para meio de alongamento de brotos contendo 1-3 μM de imazapir até o alongamento de um broto ou a morte do explante. Após a regeneração, os transformadores são transplantados para solo em pequenos vasos, colocados em câmaras de crescimento (16 horas de dia/8 horas de noite; 25 °C durante o dia/23 °C durante a noite; umidade relativa de 65%; 130-150 mE m-2 s-1) e testados em seguida para determinar a presença do T-DNA por meio de análise Taqman. Após algumas semanas, eventos de cópia simples positivos transgênicos saudáveis são transplantados para vasos maiores e mantidos em crescimento na câmara de crescimento.
[00493] A transformação de plantas de milho é realizada por meio de um método descrito por McElver e Singh (WO 2008/124495). Construções de vetores de transformação vegetal que contêm sequências HPPD ou HST são introduzidas em embriões imaturos de milho por meio de transformação mediada por Agrobacterium. Células transformadas são selecionadas em meio de seleção suplementado com 0,5 a 1,5 μM de imazetapir por três a quatro semanas. Plantículas transgênicas são regeneradas sobre meio de regeneração vegetal e enraizadas em seguida. Plantículas transgênicas são submetidas a análise TaqMan para determinar a presença do transgene antes do transplante para mistura de vasos e cultivo até a maturidade em estufa.
[00494] Arabidopsis thaliana é transformada com sequências HPPD ou HST por meio do método de mergulhamento floral conforme descrito por McElver e Singh (WO 2008/124495). Plantas de Arabidopsis transgênicas são submetidas a análise TaqMan para analisar a quantidade de locais de integração.
[00495] Realiza-se transformação de Oryza sativa (arroz) por meio de transformação de protoplastas conforme descrito por Peng et al (US 6653529).
[00496] Planta transgênica T0 ou T1 de soja, milho, arroz e Arabidopsis thaliana contendo sequências HPPD ou HST é testada para determinar a tolerância a “herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona” em estudos em estufa.
EXEMPLO 7
[00497] Experimentos em estufa:
[00498] Plantas transgênicas que expressam enzimas HPPD ou HST heterólogas são testadas para determinar a tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona em experimentos em estufa.
[00499] Para o tratamento pré-emergência, os herbicidas são aplicados diretamente após o plantio por meio de bocais finamente distribuídos. Os recipientes são irrigados suavemente para promover a germinação e o crescimento e cobertos em seguida com capelas de plástico transparente até o enraizamento das plantas. Essa cobertura causa germinação uniforme das plantas de teste, a menos que ela tenha sido impedida pelos herbicidas.
[00500] Para o tratamento pós-emergência, as plantas de teste são cultivadas em primeiro lugar até altura de 3 a 15 cm, dependendo do hábito da planta, e só então tratadas com os herbicidas. Com este propósito, as plantas de teste são cultivadas diretamente e cresceram nos mesmos recipientes ou são primeiramente cultivadas separadamente e transplantadas para os recipientes de teste alguns dias antes do tratamento.
[00501] Para o teste de plantas T0, podem ser utilizados cortes. No caso de plantas de soja, um broto ideal para corte possui altura de cerca de 7,5 a 10 cm, com pelo menos dois nós presentes. Cada corte é tomado do transformador original (planta mãe) e mergulhado em pó de hormônio de enraizamento (ácido indolo-3-butírico, IBA). O corte é colocado em seguida em cunhas oásis no interior de uma biocapela. Cortes do tipo selvagem também são tomados simultaneamente para servir de controles. Os cortes são mantidos na biocapela por cinco a sete dias, transplantados em seguida para vasos e então aclimatados na câmara de crescimento por mais dois dias. Em seguida, os cortes são transferidos para a estufa, aclimatados por cerca de quatro dias e, em seguida, submetidos a testes de pulverização conforme indicado.
[00502] Dependendo da espécie, as plantas são mantidas a 10-25 °C ou 20-35 °C. O período de teste estende-se por três semanas. Durante esse período, as plantas recebem cuidados e a sua reação aos tratamentos individuais é avaliada. Avaliações de danos por herbicidas são tomadas em duas e três semanas após o tratamento. Os danos às plantas são avaliados em escala de 0 a 9, em que 0 é ausência de dano e 9 é morte completa.
[00503] A tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, pode também ser determinada em Arabidopsis. Neste caso, plantas de Arabidopsis thaliana transgênicas são testadas para determinar a tolerância aprimorada a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona em placas com 48 cavidades. As sementes são esterilizadas na superfície por meio de agitação por cinco minutos em etanol + água (70+30 em volume), enxágue por uma vez com etanol + água (70+30 em volume) e duas vezes com água deionizada estéril. As sementes são novamente suspensas em 0,1% de agar dissolvido em água (p/v). Quatro a cinco sementes por cavidade são colocadas em placas sobre meio nutriente sólido que consiste de solução nutriente de Murashige Skoog, pH 5,8 (Murashige e Skoog (1962), Physiologia Plantarum 15: 473-497). Os compostos são dissolvidos em sulfóxido de dimetila (DMSO) e adicionados ao meio antes da solidificação (concentração final de DMSO de 0,1%). Placas com múltiplas cavidades são incubadas em câmara de crescimento a 22 °C, umidade relativa de 75% e 110 μmol de Phot * m-2 * s-1 com fotoperíodo de 14:10 h de luz: escuro. Sete a dez dias após a semeadura, a inibição do crescimento é avaliada por meio de comparação com plantas do tipo selvagem. O fator tolerância é calculado por meio de divisão do valor IC50 de crescimento vegetal de plantas transgências que contêm uma sequência de HPPD e/ou HST pelo de plantas do tipo selvagem.
[00504] Além disso, plantas de Arabidopsis transgênicas T1 e T2 podem ser testadas para determinar o aumento da tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, preferencialmente derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona em estudos em estufa. A avaliação de danos por herbicida é realizada em duas a três semanas após o tratamento e avaliada em escala de 0 a 100%, em que 0% é ausência de lesão e 100% é morte completa.
TABELA 17
[00505] Teste de germinação de plantas de Arabidopsis transgênicas na presença de inibidores de HPPD. O fator de tolerância é um valor médio de cinco eventos T2 avaliados em paralelo. Resultados representativos são exibidos na Figura 3.
Figure img0038
* Os herbicidas inibidores de HPPD utilizados neste exemplo são [3-(4,5-di-hidroisoxazol-3-il)-2-metil-4-metilsulfonilfenil]-(5-hidróxi-1- metilpirazol-4-il)metanona (Inibidor 1) e 2-(4-metilsulfonil-2-nitrobenzoil)ciclo- hexano-1,3-diona (Inibidor 2). N. d. = não determinado.
[00506] Os resultados demonstram que as plantas que compreendem um polinucleotídeo que codifica HPPD de Arabidopsis apresentaram maior tolerância, que foi de nove vezes para o Inibidor 1 e dez vezes para o Inibidor 2, a herbicidas inibidores de HPPD em comparação com as plantas controle não transformadas. Além disso, pode-se observar a partir dos resultados ilustrados na Tabela 17 que a substituição de fenilalanina na posição 381 em SEQ ID NO: 53 por leucina ou isoleucina forneceu tolerância significativa ao Inibidor 1. Este mutante exibiu tolerância noventa vezes mais alta em comparação com o tipo selvagem. Além disso, a mutação combinada de metionina na posição 335 em histidina em conjunto com a substituição de prolina na posição 336 por alanina e glutamato na posição 363 por glutamina (SEQ ID NO: 53) resultou em aumento significativo da enzima HPPD, pois descobriu-se que a enzima HPPD que sofreu mutação apresentou tolerância 25 vezes mais alta contra Inibidor 1 em comparação com o controle do tipo selvagem não transformado. Portanto, as substituições de aminoácidos introduzidas na sequência HPPD de Arabidopsis (SEQ ID NO: 53) e a sobre- expressão subsequente em Arabidopsis resultaram em plantas tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD e, portanto, esses polinucleotídeos podem ser utilizados para gerar plantas produtoras tolerantes a herbicidas. É evidente que mutantes adicionais não ilustrados no presente são parte da presente invenção.
[00507] Além disso, pode-se observar a partir dos resultados ilustrados acima que certas substituições de leucina na posição 320 em SEQ ID NO: 2, preferencialmente substituição por histidina, forneceram aprimoramentos significativos da enzima HPPD em comparação com o controle do tipo selvagem não transformado. Portanto, esses mutantes, preferencialmente o mutante que codifica um polinucleotídeo que compreende HPPD de cevada com leucina 320 substituída por histidina, podem ser selecionados como mutantes que compreendem um HPPD resistente a inibidor, pois essas plantas apresentaram aumento de mais de cem vezes da tolerância ao composto inibidor de HPPD em comparação com o tipo selvagem e, portanto, são úteis para gerar plantas tolerante a herbicidas. Além disso, as plantas que expressam um polinucleotídeo com base em SEQ ID NO: 2 que compreende a mutação combinada de leucina na posição 320 em histidina e prolina na posição 321 em alanina demonstraram tolerância significativa ao composto inibidor de HPPD (Inibidor 1), pois descobriu-se que essas plantas apresentaram tolerância 300 vezes mais alta ao herbicida inibidor de HPPD que o controle não transformado. É evidente, portanto, que as linhagens de Arabidopsis transgênicas transformadas com polinucleotídeos que codificam HPPD de Hordeum e suas variantes que sofreram mutação são de interesse notável na presente invenção, pois essas plantas apresentaram tolerância mais alta ao Inibidor 1 e podem ser utilizadas para gerar plantas produtoras tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD.
[00508] Os resultados demonstram ainda que plantas que compreendem polinucleotídeos que codificam enzimas HPPD de diferentes taxonomias, tais como a Archaea Picrophilus ou a bactéria Rhodococcus, possuem fator de tolerância dez vezes e 32 vezes mais alto, respectivamente, para o Inibidor 1. Pode-se, portanto, selecionar polinucleotídeos que codificam HPPD de diferentes clados de vida para gerar plantas resistentes a HPPD.
[00509] É evidente que qualquer mutação ou combinação de mutações que possibilite a obtenção de uma enzima HPPD que seja resistente a herbicidas inibidores de HPPD e possa ser transformada em plantas para mediar a tolerância a herbicidas, mesmo se essa proteína não for exemplificada neste texto, é parte do objeto da presente invenção.
TABELA 18
[00510] Teste em estufas de plantas de Arabidopsis transgênicas (T2) que compreendem sequências de polinucleotídeos que codificam HPPD de Arabidopsis ou HPPD de Picrophilus. As avaliações de lesões foram realizadas duas semanas após o tratamento com herbicida. Resultados representativos são exibidos na Figura 4.
Figure img0039
* Os herbicidas inibidores de HPPD utilizados nete exemplo são [3-(4,5-di-hidroisoxazol-3-il)-2-metil-4-metilsulfonilfenil]-(5-hidróxi-1-metilpirazol- 4-il)metanona (Inibidor 1) e 2-(4-metilsulfonil-2-nitrobenzoil)ciclo-hexano-1,3- diona (Inibidor 2).
TABELA 19
[00511] Teste em estufa de plantas de Arabidopsis transgênicas (T2) que sobre-expressam sequências de polinucleotídeos com base em HPPD de Hordeum. As avaliações de lesões foram realizadas duas semanas após o tratamento com herbicida. Resultados representativos são exibidos na Figura 5.
Figure img0040
* Os herbicidas inibidores de HPPD utilizados nete exemplo são [3-(4,5-di-hidroisoxazol-3-il)-2-metil-4-metilsulfonilfenil]-(5-hidróxi-1- metilpirazol-4-il)metanona (Inibidor 1) e 2-(4-metilsulfonil-2-nitrobenzoil)ciclo- hexano-1,3-diona (Inibidor 2).
[00512] Plantas de Arabidopsis transgênicas foram pulverizadas com uma faixa de dosagens de 0,78 a 6,25 g/ha de diferentes herbicidas inibidores de HPPD e avaliações de lesão foram realizadas duas semanas após o tratamento. Conforme ilustrado na Tabela 18, as plantas de controle sofreram danos severos devido a todas as doses de herbicidas aplicadas, com pelo menos 85% do material de folha danificado na taxa de aplicação mais baixa. Em comparação com o controle, as plantas que expressam HPPD de Picrophilus foram 1,6 vezes menos susceptíveis ao Inibidor 1 ao aplicar-se uma dose de 3125 g/ha e a tolerância foi aumentada após a pulverização das duas taxas de aplicação mais baixas, resultando em tolerância de 6,8 vezes. Além disso, plantas de Arabidopsis que sobre- expressam HPPD de Picrophilus (SEQ ID NO: 40) foram resistentes para o Inibidor 2, pois nenhuma lesão às folhas pôde ser observada nas taxas de aplicação testadas, enquanto as plantas controle do tipo selvagem foram severamente danificadas.
[00513] Além disso, plantas de Arabidopsis transgênicas que compreendem uma sequência de polinucleotídeos que codifica SEQ ID NO: 53 com os aminoácidos M335, P336 e E363 substituídos por H335, A335 e Q363 exibiram maior tolerância aos inibidores de HPPD testados na presente invenção. A aplicação da concentração mais alta de ingredientes ativos resultou apenas em danos a, no máximo, 15% do material de folhas, em comparação com 100% em plantas do tipo selvagem.
[00514] Além disso, os resultados ilustrados na Tabela 19 demonstraram que plantas de Arabidopsis transgênicas que compreendem um polinucleotídeo que codifica SEQ ID NO: 2 com leucina 320 substituída por histidina foram resistentes a Inibidor 2, apresentando ao mesmo tempo aumento de 6,5 vezes da tolerância a Inibidor 1 quando aplicado na concentração mais baixa testada na presente invenção. A mutação combinada de leucina 320 em histidina e prolina 321 em alanina resultou em uma linhagem vegetal resistente a inibidor de HPPD que não sofreu danos mediante tratamento com inibidor de HPPD conforme descrito no exemplo. Portanto, as mutações introduzidas no HPPD de Hordeum (SEQ ID NO: 2) são de notável interesse e podem ser utilizadas para gerar plantas resistentes a herbicidas inibidores de HPPD.
[00515] É evidente que qualquer mutação ou combinação de mutações que possibilite a obtenção de uma enzima HPPD que seja resistente a herbicidas inibidores de HPPD e possa ser transformada em plantas, mesmo se essa proteína não for exemplificada neste texto, é parte do objeto da presente invenção.
TABELA 20
[00516] Testes em estufa de plantas de soja transgênicas. As avaliações de lesões, em escala de 1 a 100, são baseadas em um fenótipo branqueador e foram tomadas quatorze dias após o tratamento com herbicida. Os dados são a média de oito indivíduos T1 que são segregados para o transgene 1:2:1 (homozigótico:heterozigótico:nulo). Resultados representativos são exibidos na Figura 6.
Figure img0041
Figure img0042
*O herbicida inibidor de HPPD, particularmente o herbicida derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona utilizado neste exemplo, é [3-(4,5- di-hidroisoxazol-3-il)-2-metil-4-metilsulfonilfenil]-(5-hidróxi-1-metilpirazol-4- il)metanona (Inibidor 1).
[00517] Plantas de soja transgênicas foram pulverizadas com uma faixa de dosagens de 6,25 a 100 g/ha com um herbicida inibidor de HPPD e avaliações de lesão foram realizadas duas semanas após o tratamento. Conforme ilustrado na Tabela 20, as plantas controle sofreram danos severos devido a todas as doses de herbicidas aplicadas, com pelo menos 87,5% do material de folha danificado na taxa de aplicação mais baixa. Em comparação com o tipo selvagem sem transformação, as plantas que compreendem polinucleotídeos que codificam HPPD de Arabidopsis do tipo selvagem ou suas versões que sofreram mutação foram menos susceptíveis ao Inibidor 1. Plantas de soja que compreendem um polinucleotídeo que codifica SEQ ID NO: 53, por exemplo, exibiram apenas 3% de lesões do material de folha quando tratadas com o Inibidor 1 aplicado a 25 g/ha e apresentaram tolerância duas vezes maior após pulverização com 100 g/ha de ingrediente ativo (Inibidor 1).
[00518] Pode-se observar a partir do exemplo acima que um polinucleotídeo que codifica HPPD que é transformado em plantas produtoras pode ser selecionado como aquele que confere resistência a herbicidas inibidores de HPPD, particularmente herbicidas derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona, pois descobriu-se que as plantas que são transformadas com esse polinucleotídeo são menos danificadas por herbicidas derivados de pirazolona, isoxazol ou tricetona que as plantas controle não transformadas.
EXEMPLO 8
[00519] Teste de campo:
[00520] Plantas transgênicas que expressam enzimas HPPD ou HST heterólogas são testadas para determinar a tolerância a herbicidas inibidores de HPPD em experimentos de campo.
[00521] Pode ser conduzido um estudo em um local de teste de campo para avaliar o efeito de herbicidas de HPPD sobre as características fenotípicas e fenológicas de uma variedade de soja que contém diferentes transgenes.
[00522] O teste é projetado como um bloco completo aleatorizado com projeto de tratamento em parcelas divididas (split-plot). O teste contém plotagens principais definidas por “tratamento com herbicida” (combinação de herbicida e taxa de aplicação). Os tratamentos com herbicida são aplicados pós-emergência no estágio de crescimento de plantas V2-V3. Cada plotagem principal contém subplotagens definidas por “evento transgênico” (variedade de soja comercial “Jake” que contém uma das diferentes construções que expressam HPPD) e Jake (controle).
Figure img0043
[00523] Cada plotagem consiste de uma única fileira com 1,2 m e plotagens adjacentes são espaçadas a 0,76 m de distância. Cada plotagem que contém um evento transgênico é plantada com 24 sementes T1. A variedade controle, Jake, é plantada na mesma taxa de semeadura. A zigosidade de cada planta de evento transgênico é determinada antes da aplicação do tratamento com herbicida.
[00524] O efeito dos tratamentos com herbicida HPPD sobre as características fenotípicas e fenológicas das plantas que representam cada evento transgênico e variedade de controle, incluindo a tolerância a cada tratamento com herbicida, é determinado durante diferentes estágios vegetativos e reprodutivos do crescimento vegetal. É conduzida análise de variação com base em dados coletados de cada subplotagem e é calculado um teste T de Student ou Tukey, quando apropriado, para comparar as médias. O inibidor utilizado no teste de campo do presente é [3-(4,5-di-hidroisoxazol-3-il)- 2-metil-4-metilsulfonilfenil]-(5-hidróxi-1-metilpirazol-4-il)metanona (Inibidor 1).
[00525] Como se pode observar por meio da Figura 7, plantas de soja que expressam polinucleotídeos que compreendem sequências de HPPD de Arabidopsis que sofreu mutação exibiram lesões baixas a moderadas sete dias após o tratamento com 50 g/ha de Inibidor 1. Por outro lado, plantas controle não transformadas exibiram severos danos por herbicida.
[00526] O exemplo indica, portanto, que uma enzima HPPD mutante pode ser selecionada por ser resistente a herbicidas inibidores de HPPD, pois a tolerância de campo das plantas de soja que expressam a proteína HPPD de Arabidopsis que sofreu mutação era maior que a encontrada para as plantas controle do tipo selvagem.
[00527] É evidente que qualquer mutação ou combinação de mutações que possibilite a obtenção de uma enzima HPPD que seja resistente a herbicidas inibidores de HPPD e possa ser transformada em plantas, mesmo se essa proteína não for exemplificada neste texto, é parte do objeto da presente invenção.

Claims (3)

1. MÉTODO PARA CONTROLAR VEGETAÇÃO INDESEJADA, em um local de cultivo de plantas, caracterizado pelo método compreender as etapas de: - a) fornecimento, no mencionado local, de uma planta que compreende um ácido nucleico que consiste na SEQ ID NO: 52, que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma hidroxifenil piruvato dioxigenase que sofreu mutação (mut-HPPD) que é resistente ou tolerante a um derivado de pirazolona, isoxazol, ou tricetona; - b) aplicação, ao mencionado local, de uma quantidade eficaz do mencionado herbicida, em que o mut-HPPD codificado compreende um polipeptídeo que difere de uma sequência de aminoácidos de um HPPD do tipo selvagem em uma ou mais posições correspondentes às posições de SEQ ID NO: 53 a seguir: - o aminoácido correspondente à ou na posição 335 é Gln, Asn, His, ou Tyr; - o aminoácido correspondente à ou na posição 336 é Ala, Arg, Gly, ou Asn; - o aminoácido correspondente à ou na posição 363 é Gln; - o aminoácido correspondente à ou na posição 368 é Met ou Tyr; - o aminoácido correspondente à ou na posição 381 é Ile, Leu ou Tyr; - o aminoácido correspondente à ou na posição 385 é Ala, Val, Asp, ou Gln; - o aminoácido correspondente à ou na posição 393 é Ala, Leu, Phe, ou Val; - o aminoácido correspondente à ou na posição 419 é Leu ou Pro; - o aminoácido correspondente à ou na posição 324 é Lys ou Ala; - o aminoácido correspondente à ou na posição 293 é Ala, Leu, Ile, Val, His, Asn ou Ser.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela planta compreender pelo menos um ácido nucleico heterólogo adicional que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima tolerante a herbicidas.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo derivado de pirazolona, isoxazol ou tricetona ser aplicado em conjunto com um ou mais herbicidas diferentes.
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