BR112015005674B1 - Polipeptídeos recombinantes para conferir tolerância à herbicidas - Google Patents

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    • C12Y113/11027—4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (1.13.11.27)

Abstract

Molécula de ácido nucleico, vetor a compreendendo, Gene quimérico compreendendo uma molécula de ácido nucleico operacionalmente ligado a um promotor expressável em plantas, Célula hospedeira bacteriana e Uso de uma planta ou semente transgênica para matar ou controlar de ervas em um campo contendo a referida planta ou semente transgênica, bem como Métodos de crescimento de plantas ou sementes em um campo e de colher um produto de planta da mesma, para a produção de um polipeptídeo com uma atividade de tolerância a herbicida inibidor de HPPD, para conferir tolerância a um herbicida inibidor de HPPD em uma planta, de controle de ervas em um campo, para produzir uma semente ou produto de grão desvitalizado e Polipeptídeo recombinante e Produto de base. São propostas composições e métodos para conferir tolerância a herbicidas a bactérias, plantas, células vegetais, tecidos vegetais e sementes. As composições incluem polinucleotídeos codificando polipeptídeos com tolerância a herbicida, vetores compreendendo estes polinucleotídeos e células hospedeiras compreendendo os vetores. As sequências de nucleotídeos da invenção podem ser usadas em construções de DNA ou em cassetes de expressão para a transformação e expressão em organismos, incluindo microorganismos e plantas. As composições também incluem bactérias, plantas, células vegetais, tecidos vegetais (...).

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO CORRELATO
[001] Este pedido reivindica a prioridade dos pedidos das patentes U.S. Nos. de Série 61/701.037, depositado em 14 de setembro de 2012; 61/766.057, depositado em 18 de fevereiro de 2013; e 61/790.404, depositado em 15 de março de 2013, cujo conteúdo é pelo presente documento integralmente incorporado ao presente documento a título de referência.
REFERÊNCIA A LISTA DE SEQUÊNCIAS APRESENTADA ELETRONICAMENTE
[002] Esta cópia da lista de sequências é apresentada eletronicamente por meio de EFS-Web s uma lista de sequências formatadas em ASCII com um arquivo denominado “2912939_19973WO01_SEQLIST.txt,” criado em 12 de setembro de 2013, e que tem um tamanho de 237 quilobites e está depositado concomitantemente com o relatório. A lista de sequências contida neste documento formato em ASCII faz parte do relatório e é incorporada ao presente documento a título de referência integralmente.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A presente invenção se refere à biologia molecular vegetal, especialmente a polipeptídeos HHPD inéditos que conferem uma tolerância aumentada a herbicidas inibidores de HPPD.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[004] As 4-hidroxifenilpiruvatodioxigenases (HPPDs) são enzimas que catalisam a reação em que o para- hidroxifenilpiruvato (abreviado no presente documento como HPP), um produto de degradação da tirosina, é transformado em homogentisato (abreviado no presente documento como HG), o precursor em plantas de tocoferol e de plastoquinona (Crouch N.P. et al. (1997), Tetrahedron, 53, 20, 6993-7010, Fritze et al. (2004), Plant Physiology 134: 1388-1400). O tocoferol atua como um antioxidante associado a membrana. A plastoquinona, em primeiro lado age como um portador de elétrons entre PSII e o complexo citocromo b6/f e em segundo lugar consiste em um cofator redox para a fitoeno desnaturase, que está envolvida na biossíntese de carotenóides.
[005] Até agora mais de 1000 sequências de ácidos nucleicos provenientes de diversos organismos presentes na base de dados de NCBI foram anotadas como codificando para uma proteína que se supõe que tenha um domínio de HPPD. Mas para a maior parte dessas, não foi provado que a proteína tivesse uma atividade enzimática de HPPD tanto em ensaio in vitro como na abordagem in planta, nem que tal proteína HPPD pudesse conferir uma tolerância a herbicida aos herbicidas inibidores de HPPD quando expressas em uma planta. Diversas proteínas de HPPD e suas sequências primárias foram descritas na técnica anterior, especialmente em proteínas de HPPD de bactérias tais como Pseudomonas (Ruetschi et al., Eur. J. Biochem., 205, 459466, 1992, WO 96/38567), Kordia (WO2011076889) Synechococcus (WO2011076877), e Rhodococcus (WO2011076892), de protistas tais como Blepharisma (WO2011076882), de euriarqueotas tais como Picrophilus (WO2011076885) de plantas tais como Arabidopsis (WO 96/38567, GENBANK® AF047834), cenoura (WO 96/38567, GENBANK® 87257), Avena sativa (WO 02/046387, WO 11/068567), trigo (WO 02/046387), Brachiaria platyphilla (WO 02/046387), Cenchrus echinatus (WO 02/046387), Lolium rigidum (WO 02/046387), Festuca arundinacea (WO 02/046387), Setaria faberi (WO 02/046387), Eleusine indica (WO 02/046387), sorgo (WO 02/046387, WO 12/021785), milho (WO 12/021785), Coccicoides (GENBANK® COITRP), de Coptis japonica (WO 06/132270), Chlamydomonas reinhardtii (ES 2275365)/WO2011/145015, ou de mamíferos tais como camundongo ou porco.
[006] A inibição de HPPD leva ao desacoplamento da fotossíntese, deficiência de pigmentos acessórios coletores de luz e, o que é mais importante, à destruição da clorofila por radiação UV e espécies de oxigênio reativo (descoramento) devido à falta de fotoproteção normalmente conferida pelos carotenóides (Norris et al. (1995), Plant Cell 7: 2139-2149). O descoramento de tecidos fotossinteticamente ativos leva à inibição do desenvolvimento e à morte da planta.
[007] Algumas moléculas que inibem HPPD, e que inibem a transformação da HPP em homogentisato ligando-se especificamente à enzima, provaram ser herbicidas muito eficazes.
[008] Atualmente, a maior parte de herbicidas inibidores de HPPD disponíveis no comércio pertence a uma das seguintes famílias químicas: 1) as tricetonas, tais como sulcotriona [isto é, 2- [2-cloro-4-(metilsulfonil)benzoil]-1,3-ciclohexanodiona], mesotriona [isto é, 2-[4-(metilsulfonil)-2-nitrobenzoil]- 1,3-ciclohexanodiona]; tembotriona [isto é, 2-[2-cloro-4- (metilsulfonil)-3-[(2,2,2,-tri-fluoretóxi)metil]benzoil]- 1,3-ciclo-hexanodiona]; tefuriltriona [isto é, 2-[2-cloro- 4-(metilsulfonil)-3-[[(tetraidro-2-furanil)metóxi]metil] benzoil]-1,3-ciclohexanodiona]]; biciclopirona [isto é, 4- hidróxi-3-[[2-[(2-metoxietóxi)metil]-6-(trifluormetil)-3- piridinil]carbonil]biciclo[3.2.1]oct-3-en-2-ona]; benzobiciclon [isto é, 3-(2-cloro-4-mesilbenzoil)-2- feniltiobiciclo[3.2.1]oct-2-en-4-ona]; 2) as dicetonitrilas, tais como 2-ciano-3- ciclopropil-1-(2-metilsulfonil-4-trifluormetilfenil)- propano-1,3-diona e 2-ciano-1-[4-(metilsulfonil)-2- trifluormetilfenil]-3-(1-metilciclopropil)propano-1,3- diona; 3) os isoxazóis, tais como isoxaflutol [isto é, (5- ciclopropil-4-isoxazolil)[2-(metilsulfonil)-4-(triflúor metil)fenil]metanona]. Nas plantas, o isoxaflutol é rapidamente metabolizado em DKN, um composto dicetonitrílico que apresenta a propriedade de inibidor de HPPD; 4) os pirazolinatos, tais como topramezona [isto é, [3-(4,5-diidro-3-isoxazolil)-2-metil-4-(metilsulfonil) fenil](5-hidróxi-1-metil-1H-pirazol-4-il)metanona], e pirassulfotol [isto é, (5-hidróxi-1,3-dimetilpirazol-4- il(2-mesil-4-trifluormetilfenil)metanona]; pirazofeno [isto é, 2-[4-(2,4-diclorobenzoil)-1,3-dimetilpirazol-5-ilóxi] acetofenona]; 5) N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas (WO 2011/035874); e 6) N-(tetrazol-4-il)- ou N-(triazol-3-il)- arilcarboxamidas (WO2012/028579).
[009] Estes herbicidas inibidores de HPPD podem ser usados contra invasoras gramíneas e/ou de folha larga em campos de plantas cultivadas que apresentam uma tolerância metabólica, tais como milho (Zea mays), arroz (Oryza sativa) e trigo (Triticum aestivum) nos quais eles se degradam rapidamente (Schulz et al. (1993), FEBS letters, 318, 162-166; Mitchell et al. (2001), Pest Management Science, Vol. 57, 120-128; Garcia et al. (2000), Biochem., 39, 7501-7507; Pallett et al. (2001), Pest Management Science, Vol 57, 133-142). Para ampliar o âmbito do uso destes herbicidas inibidores de HPPD, foram desenvolvidos diversos esforços para conferir às plantas, especialmente a plantas sem uma tolerância metabólica ou com uma tolerância metabólica com um desempenho menor, um nível de tolerância aceitável nas condições agronômicas em campo.
[0010] Além da tentativa de se contornar a produção mediada por HPPD de homogentisato (US 6.812.010), foi conduzida a sobre-expressão da enzima sensível de modo a produzir quantidades da enzima alvo na planta que fossem suficientes em relação ao herbicida (W096/38567). A sobre- expressão de HPPD resultou em uma tolerância maior, na pré- emergência, a derivado dicetonítrico (DKN) de isoxaflutol (IFT), mas a tolerância não foi suficiente para tolerância ao tratamento de pós-emergência (Matringe et al. (2005), Pest Management Science 61: 269-276).
[0011] Uma terceira estratégia consistiu em se produzir uma mutação de HPPD para se obter uma enzima alvo que, embora conservasse as suas propriedades de catalisar a transformação de HPP em homogentisato, fosse menos sensível a inibidores de HPPD do que a HPPD nativa antes da mutação.
[0012] Esta estratégia foi aplicada com sucesso para a produção de plantas tolerantes a 2-ciano-3- ciclopropil-1-(2-metilsulfonil-4-trifluormetilfenil)- propano-1,3-diona e a 2-ciano-1-[4-(metilsulfonil)-2- trifluormetilfenil]-3-(1-metilciclopropil)propano-1,3-diona (EP496630), dois herbicidas inibidores de HPPD pertencendo à família das dicetonitrilas (WO 99/24585). Pro215Leu, Gly336Glu, Gly336Ile, e mais especialmente Gly336Trp (as posições do aminoácido que sofreu mutação são indicadas com referência à HPPD de Pseudomonas) foram identificados como mutações que são responsáveis por uma maior tolerância ao tratamento com estes herbicidas de dicetonitrila.
[0013] Mais recentemente, a introdução de um gene de HPPD de Pseudomonas no genoma de plastídio de tabaco e soja mostrou ser mais eficaz do que uma transformação nuclear, conferindo uma tolerância à aplicação pós-emergência de isoxaflutol (Dufourmantel et al. (2007), Plant Biotechnol J.5(1): 118-33).
[0014] Em WO 04/024928, os inventores procuraram aumentar a biossíntese de prenilquinona (tal como a síntese de plastoquinonas, tocoferóis) nas células de plantas aumentando o fluxo do precursor de HPP nas células destas plantas. Isto foi feito conectando-se a síntese deste precursor ao trajeto “shikimate” pela sobre- expressão da enzima PDH. Eles também observaram que a transformação de plantas com um gene que codificava uma enzima PDH e com um gene que codificava uma enzima HPPD torna possível se aumentar a tolerância destas plantas a inibidores de HPPD.
[0015] No pedido de patente WO 2009/144079, foram divulgadas sequências de ácidos nucleicos que codificavam uma hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) com mutações específicas na posição 336 da proteína de HPPD de Pseudomonas fluorescens e o seu uso para a obtenção de plantas que são tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD.
[0016] Em WO 2002/046387, foram identificados diversos domínios de proteínas de HPPD que se originam de plantas que podem ser relevantes para conferir uma tolerância a diversos herbicidas inibidores de HPPD, mes nem os dados in planta nem bioquímicos demonstraram a confirmação do impacto das funções de domínio descritas.
[0017] Em WO 2008/150473, a combinação de dois mecanismos de tolerância distintos - um gene modificado de Avena sativa codificando para uma enzima mutante de HPPD e uma monooxigenase CYP450 do milho (gene nsf 1) - foi exemplificado para se obter uma maior tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, mas nenhum dado foi divulgado demonstrando os efeitos sinérgicos baseados na combinação das duas proteínas. .
[0018] Além disso, em U.S. 20110173718, é descrito um método para a geração de plantas tolerantes a inibidores de HPPD por sobre-expressão não somente de um gene que codifica para um HPPD tolerante, como, por exemplo, de Avena sativa, mas também em combinação com diversos genes de plantas que codificam para uma proteína de HST (homogentisato solanosiltransferase). No entanto, o nível de tolerância a alguns herbicidas inibidores de HPPD selecionados foi bastante limitado.
[0019] Em WO2011094199 e US20110185444, foi avaliada a tolerância de diversas centenas de linhagens de soja do tipo selvagem a isoxaflutol inibidor de HPPD. Muito poucas linhagens apresentaram um nível razoável de tolerância a os herbicidas. O QTL pressuposto (loci de característica quantitativa) responsável pela tolerância foi identificado. Nesta região do genoma, foi identificado um gene codificando para um transportador ABC como sendo a principal característica responsável pela tolerância maior ao herbicida inibidor de HPPD observada. No entanto, as plantas transgênicas que expressavam os genes identificados não apresentaram nenhuma maior tolerância aos herbicidas inibidores de HPPD testados.
[0020] Em WO2010/085705, foram divulgados diversos mutantes de HPPD de Avena sativa. Foi mostrado que algumas das variantes apresentavam uma maior tolerância in vitro à tricetona “mesotriona”, no entanto, somente alguns muito poucos mutantes foram expressos em plantas de tabaco. Adicionalmente, nenhuma das plantas de tabaco que expressavam estes mutantes apresentou uma maior tolerância a mesotriona ou a isoxaflutol em comparação com plantas de tabaco que expressavam o gene de HPPD de Avena sativa do tipo selvagem.
[0021] US 2012/0042413 descreve polipeptídeos que têm uma atividade de HPPD, mas também mostrando uma certa insensibilidade a pelo menos um inibidor de HPPD e sugere ainda um conjunto de mutações em diferentes posições das enzimas de HPPD e finalmente divulga dados bioquímicos assim como níveis de tolerância de plantas que contêm algumas das HPPDs com mutações.
[0022] Em EP 21453012, foram descritos muitos mutantes de HPPD; no entanto, a tolerância melhorada dos mutantes descritos não foi demonstrada in planta contra diversos herbicidas inibidores de HPPD.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0023] São propostas composições e métodos para conferir tolerância a herbicidas inibidores de HPPD. As composições incluem polipeptídeos de HPPD que são tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD e moléculas isoladas, recombinantes ou quiméricas de ácidos nucleicos tais como polipeptídeos, vetores e células hospedeiras compreendendo essas moléculas de ácido nucleico. As composições também incluem os anticorpos a estes polipeptídeos. As sequências de nucleotídeos podem ser usadas em construções de DNA e cassetes de expressão para a transformação e expressão em organismos, incluindo em microorganismos e plantas. As sequências de nucleotídeos podem ser sequências sintéticas que tenham sido projetadas para expressão em um organismo, incluindo, mas sem limitação, um microorganismo ou uma planta.
[0024] As composições incluem moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeos tolerantes a herbicida, incluindo moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína de HPPD que tem um ou mais substituições amino de aminoácidos nas posições que correspondem às posições de aminoácidos 188, 189, 215, 335, 336, 339, e 340 da SEQ ID NO: 1, incluindo a proteína de HPPD apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 2, 63, 64, ou 65, em que foi introduzia uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições que correspondem às posições correspondentes às posições aminoácidos 188, 189, 215, 335, 336, 339, e 340 da SEQ ID NO: 1, e incluindo qualquer sequência de ácidos nucleicos que codifica as sequências de aminoácidos apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NO: 3 - 59, assim como variantes e fragmentos seus. A presente invenção ainda compreende a proteína de HPPD tolerante a herbicida codificada pelas moléculas de ácidos nucleicos, assim como composições que compreendem a proteína de HPPD.
[0025] As composições também compreendem bactérias, plantas, células vegetais tecidos e sementes transformados, que são tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD, por meio da introdução da sequência de ácidos nucleicos da invenção no genoma das bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes. Nos casos em que o organismo é uma planta, a introdução da sequência permite que os herbicidas inibidores de HPPD sejam aplicados às plantas para matar seletivamente ervas sensíveis ao inibidor de HPPD ou outras plantas não transformadas, mas não o organismo transformado. As sequências podem, além disso, ser usadas como um marcador para a seleção de células vegetais que crescem na presença de um ou mais herbicidas inibidores de HPPD.
[0026] São adicionalmente propostos métodos para a identificação de enzima HPPD com atividade de tolerância ao inibidor de HPPD.
[0027] As composições e métodos da invenção são úteis para a produção de organismos com uma maior tolerância a herbicidas inibidores de HPPD. Estes organismos e composições que compreendem os organismos são desejáveis para fins agrícolas. As plantas ou sementes que compreendem a sequência de ácidos nucleicos da invenção podem ser cultivadas em um campo e colhidas para se obter um produto vegetal. As composições da invenção são também úteis para gerar proteínas alteradas ou melhoradas que têm uma atividade de tolerância a herbicidas inibidores de HPPD ou para detectar a presença de proteínas tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD ou ácidos nucleicos em produtos ou organismos.
DESCRIÇÃO SUCINTA DAS FIGURAS
[0028] A Figura 1 mostra um alinhamento de sequências de aminoácidos de HPPDs proveniente de espécies microbianas e vegetais, incluindo Pseudomonas fluorescens (SEQ ID NO: 1), Avena sativa (SEQ ID NO: 63), uma variante da HPPD proveniente de Avena sativa (SEQ ID NO:64), Zea mays (SEQ ID NO:65), Streptomyces avermitilis (SEQ ID NO:69), Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:66), Hordeum vulgare (SEQ ID NO:67), Daucus carota (SEQ ID NO:68), Mycosphaerella graminicola (SEQ ID NO:70), e Coccicoides immitis (SEQ ID NO:71).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0029] As presentes invenções serão agora descritas mais detalhadamente com referência aos desenhos apensos, em que são mostradas algumas, mas não todas as modalidades das invenções. Na verdade estas invenções podem ser incorporadas a muitas formas diferentes e não devem ser consideradas como sendo limitadas às modalidades apresentadas no presente documento; pelo contrário, estas modalidades são dadas com a finalidade de que esta descrição satisfaça as exigências legais aplicáveis. Números iguais se referem a elementos iguais em todo o documento.
[0030] Muitas modificações e outras modalidades das invenções apresentadas no presente documento ocorrerão aos versados na técnica à qual estas invenções pertencem, tendo o benefício das instruções apresentadas nas descrições acima e nos desenhos apensos. Portanto, deve ficar subentendido que as invenções não devem ser limitadas às modalidades específicas divulgadas e que modificações e modalidades se destinam a ser incluídas no âmbito das reivindicações apensas. Embora tenham sido empregados no presente documento termos específicos, eles são usados em um sentido genérico e descritivo somente e não com fins de limitação.
Visão Geral
[0031] Diversos esforços foram envidados para conferir às plantas um nível aceitável do ponto de vista agronômico de tolerância a uma ampla faixa de herbicidas inibidores de HPPD, incluindo contornar-se a produção mediada por HPPD de homogentisato (U.S. 6.812.010), sobre- expressar-se a enzima sensível de modo a produzir quantidades da enzima alvo na planta que sejam suficientes em relação ao herbicida (W096/38567), e produzindo-se mutações de HPPD para se obter uma enzima alvo que, embora retivesse suas propriedades de catalise da transformação de HPP em homogentisato, fosse menos sensível aos inibidores de HPPD do que a HPPD nativa antes da mutação.
[0032] Apesar destes sucessos obtidos para o desenvolvimento de plantas que apresentam tolerância a diversos herbicidas inibidores de HPPD descritos acima, continua a ser necessário o desenvolvimento e o aperfeiçoamento da tolerância de plantas a inibidores de HPPD mais novos ou a diversos diferentes, especialmente a inibidores de HPPD que pertencem às classes das tricetonas (tais como sulcotriona, mesotriona, tembotriona, benzobiciclon e biciclopirona), dos pirazolinatos (tais como topramezona e pirassulfotol), N-(1,2,5-Oxadiazol-3- il)benzamidas (WO 2011/035874), e de N-(tetrazol-4-il)- ou N-(triazol-3-il)arilcarboxamidas (WO2012/028579).
[0033] Assim, a presente invenção propõe composições melhoradas e métodos melhorados para a regulagem da tolerância a herbicidas inibidores de HPPD. Os herbicidas inibidores de HPPD como os da classe de N (1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(tetrazol-4-il)- ou N- (triazol-3-il)arilcarboxamidas, tais como 2-cloro-3-etóxi- 4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida e 2-Cloro-3-(metoximetil)-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida, tricetonas, tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, a classe de isoxasóis tais como isoxaflutol, ou da classe de pirazolinatos, tais como pirassulfotol e topramezona, especialmente selecionados de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol, e mesotriona, têm uma atividade notável herbicida contra um espectro amplo de plantas anuais nocivas monocotiledôneas e dicotiledôneas economicamente importante. As substâncias ativas também agem eficientemente sobre plantas nocivas perenes que produzem brotos de rizomas, galhos ou outros órgãos perenes e que são difíceis de serem controlados. Dentro do significado da presente invenção “herbicida” significa uma substância ativa do ponto de vista herbicida sozinha ou de tal modo que seja combinada com um aditivo que altere a sua eficácia, tal como, por exemplo, um agente que aumenta a sua atividade (um agente sinérgico) ou que limita a sua atividade (um fitoprotetor). O herbicida pode ainda compreender adjuvantes ou veículos sólidos ou líquidos que são habitualmente empregados na tecnologia de formulações (tais como substâncias, solventes, dispersantes, agentes umectantes, viscosificantes, emulsificantes, agentes promotores de crescimento naturais ou regenerados e semelhantes), assim como um ou mais herbicidas adicionais e/ou um ou mais pesticidas (tais como inseticidas, virucidas, microbicidas amebicidas, pesticidas, fungicidas bactericidas, nematocidas, moluscicidas e semelhantes).
[0034] Os métodos envolvem a transformação de organismos com sequências de nucleotídeos que codificam um gene de tolerância a inibidores de HPPD da invenção ou de um outro modo a introdução de tais genes de tolerância a inibidores de HPPD em organismos que não os contêm (tais como por cruzamento, fusão celular ou cruzando orgânico contendo um gene inibidor de HPPD introduzido da invenção com organismos que não os contenham e a obtenção de progênie contendo tal gene). As sequências de nucleotídeos da invenção são úteis para a preparação de plantas que apresentam uma maior tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, especialmente uma maior tolerância a herbicidas inibidores de HPPD da classe de N-(1,2,5-oxadiazol-3- il)benzamidas, N-(tetrazol-4-il)- ou de N-(triazol-3- il)arilcarboxamidas, tais como 2-cloro-3-etóxi-4- (metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida e 2- cloro-3-(metoximetil)-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida, tricetonas, tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, da classe dos isoxazóis tais como isoxaflutol, ou da classe de pirazolinatos, tais como pirassulfotol e topramezona, especialmente selecionados de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol, e mesotriona. O gene de tolerância a herbicidas inibidores de HPPD da invenção pode também apresentar um pouco de tolerância contra “herbicidas derivados de cumarona” (descritos em WO2009/090401, WO2009/090402, WO2008/071918, WO2008/009908). Neste sentido, qualquer um dos genes de tolerância a herbicidas inibidores de HPPD da invenção pode ser também expresso em uma planta também expressando um gene de homogentisato solanosil transferase (HST) quimérico ou uma mutação do gene de HST conforme descrito em WO2011/145015, WO2013/064987, WO2013/064964, ou WO2010/029311, para se obter plantas tolerantes a herbicidas de HST. Conforme usado no presente documento, um “herbicida derivado de cumarona” ou “herbicida inibidor de HST” abrange compostos que incidem na nomenclatura IUPAC de 5H-tiopirano[4,3- b]piridin-8-ol, 5H-tiopirano[3,4-b]pirazin-8-ol, oxatiino[5,6-b]piridin-4-ol, e oxatiino[5,6-b]pirazin-4-ol.
[0035] Assim, gene de “tolerância a herbicida inibidor de HPPD” da invenção se destina a significar um gene que codifica uma proteína que confere a uma célula ou a um organismo a capacidade de tolerar uma concentração mais elevada de um herbicida inibidor de HPPD do que tal célula ou orgânico que não expressa a proteína, ou para tolerar uma determinada concentração de um herbicida inibidor de HPPD durante um período de tempo mais prolongado que tal célula ou organismo que não expressa a proteína, ou que confere a uma célula ou organismo a capacidade de fazer fotossíntese, crescer e/ou reproduzir com menos dano ou inibição de crescimento observados em tal célula ou organismo que não expressa esta proteína. Uma “proteína de tolerância a inibidores de HPPD” inclui uma proteína que confere a uma célula ou organismo a capacidade de tolerar uma concentração mais elevada de herbicida inibidor de HPPD do eu esta célula ou organismo que não expressa a proteína, ou tolerar uma determinada concentração de herbicida inibidor de HPPD durante um período de tempo mais prolongado do que esta célula ou organismo que não expressa a proteína, ou que confere a uma célula ou organismo a capacidade de fazer fotossíntese, crescer e/ou se reproduzir com menos dano ou inibição de crescimento observado do que tal célula ou organismo que não expressa esta proteína. “Tolerar” ou “tolerância” significa ou a sobrevivência à aplicação de um herbicida inibidor de HPPD específico, ou a capacidade de desempenhar funções celulares essenciais tais como fotossíntese, síntese proteica ou respiração e reprodução de um modo que não é facilmente distinguível de células ou organismos sem tratamento, ou a capacidade não apresentar nenhuma diferença significativo em rendimento ou mesmo um rendimento maior para plantas tratadas com um herbicida inibidor de HPPD em comparação com tais plantas que não foram tratadas com tal herbicida (mas em que foram removidas ou prevenidas as plantas nocivas por um mecanismo diferente da aplicação do herbicida inibidor de HPPD, tais como pelos métodos descritos em WO2011/100302, que é integralmente incorporado ao presente documento a título de referência).
[0036] Além de conferir a uma célula uma tolerância aos inibidores de HPPD, as sequências de ácido nucleico de HPPD da invenção codificam polipeptídeos que tem uma atividade de HPPD, isto é, catalisam a reação em que o para-hidroxifenilpiruvato (pHPP) é transformado em homogentisato. É preferível que a atividade catalítica da proteína de HPPD da presente invenção, quando testada in vitro, não difira da de uma proteína de HPPD de referência de mais de 90%, de mais de 70%, ou de mais de 50%, quando testados em condições idênticas e na ausência dos herbicidas inibidores de HPPD descritos acima. Em algumas modalidades, a atividade catalítica é melhorada em relação à proteína de HPPD de referência. A atividade catalítica de uma enzima HPPD pode ser definida por diversos métodos bem conhecidos na técnica. WO 2009/144079 descreve diversos métodos de seleção adequados.
[0037] As enzimas HPPD que apresentam uma tolerância maior a um herbicida inibidor de HPPD podem assim proceder por apresentarem, em relação à HPPD: a) um valor Km superior para o substrato natural, 4- hidroxifenilpiruvato; b) um valor kcat inferior para a conversão de 4-hidroxifenilpiruvato em homogentisato; c) um valor mais baixo da constante de taxa, kon, governando a formação de um complexo enzima:herbicida inibidor de HPPD; d) um valor aumentado da constante de taxa, koff, governando a dissociação de um complexo enzima:herbicida inibidor de HPPD; e/ou e) como resultado de alterações em um de c) e d), ou nos dois, um valor aumentado da constante de equilíbrio, Ki (também denominada Kd), governando a dissociação de um complexo enzima: herbicida inibidor de HPPD.
[0038] A atividade enzimática das proteínas de HPPD pode ser medida por qualquer método que torne possível se medir a redução na quantidade de HPP ou substratos de O2 ou medir a acumulação de qualquer um dos produtos derivados da reação enzimática, do homogentisato ou CO2. Mais especificamente, a atividade de HPPD pode ser medida por meio do método descrito em WO2009/144079; Garcia et al. (1997), Biochem. J. 325, 761-769; Garcia et al. (1999), Plant Physiol. 119, 1507-1516; ou em WO2012/021785, que são incorporados ao presente documento a título de referência.
[0039] Para os fins da presente invenção, uma proteína de HPPD (ou um gene de HPPD) “de referência” consiste qualquer proteína ou ácido nucleico de HPPD com a qual é comparado a proteína de HPPD ou o ácido nucleico de HPPD da presente invenção. Esta HPPD de referência pode ser HPPD de uma planta nativa, bacteriana ou animal, ou pode ser uma forma de mutação de HPPD que é conhecida na técnica. Tal HPPD de referência pode ser usado para determinar se a proteína ou ácido nucleico de HPPD da invenção tem uma propriedade de interesse especial (tal como tolerância melhorada, comparável ou reduzida a herbicidas inibidores de HPPD ou atividade enzimática de HPPD; uma expressão maior, comparável ou reduzida em uma célula hospedeira; uma estabilidade maior, comparável ou reduzida da proteína, ou semelhantes).
[0040] Em diversas modalidades do presente documento, o ácido nucleico tolerante a herbicidas inibidores de HPPD (incluindo genes isolados, recombinantes e quiméricos seus, vetores, célula hospedeira, plantas, partes de plantas e sementes compreendendo o ácido nucleico, polipeptídeos de HPPD e suas composições codificadas pelo ácido nucleico, assim como métodos de uso do ácido nucleico para aumentar a tolerância de uma planta a herbicidas inibidores de HPPD, especialmente uma maior tolerância a herbicidas inibidores de HPPD da classe de N- (1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(tetrazol-4-il)- ou N- (triazol-3-il)arilcarboxamidas, tais como 2-cloro-3-etóxi- 4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida e 2-cloro-3-(metoximetil)-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida, tricetonas, tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, a classe de isoxazóis tais como isoxaflutol, ou da classe de pirazolinatos, tais como pirassulfotol e topramezona, especialmente selecionados de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol, e mesotriona) codifica uma proteína de HPPD que foi modificada para conter um ou mais substituições de aminoácidos, incluindo 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 substituições de aminoácidos, nas posições correspondentes às posições de aminoácidos 188, 189, 215, 335, 336, 339, e/ou 340 da SEQ ID NO: 1. “Correspondendo a” se destina a significar a posição do nucleotídeo ou do aminoácido em relação a essa posição na SEQ ID NO: 1 quando duas (ou mais) sequências são alinhadas usando-se algoritmos de alinhamento padrão descrito em um outro ponto no presente documento. Um alinhamento representativo da SEQ ID NO: 1 com sequências de aminoácidos de HPPD provenientes de diversas espécies microbianas e vegetais é mostrado na Figura 1. As posições de aminoácidos 188, 189, 215, 335, 336, 339, e 340 da SEQ ID NO: 1, por exemplo, correspondem às posições de aminoácidos 241, 242, 271, 412, 413, 416, e 417, respectivamente, da HPPD de Avena sativa (SEQ ID NO: 63); às posições de aminoácidos 235, 236, 265, 406, 407, 410, e 411, respectivamente, da HPPD de Hordeum vulgare (SEQ ID NO: 67) e às posições de aminoácidos 242, 243, 272, 413, 414, 417, e 418, respectivamente, da HPPD de Zea mays (SEQ ID NO: 65). Consequentemente, dependendo do comprimento da sequência de aminoácidos da HPPD envolvida, tendo um número maior ou menor do que a sequência da SEQ ID NO: 1, a posição correspondente pode estar localizada em uma posição diferente das posições 188, 189, 215, 335, 336, 339, e 340 em tal proteína de HPPD em questão.
[0041] Em uma modalidade, a HPPD da presente invenção foi modificada para compreender uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: (a) um triptofano, glicina, ou serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 188 da SEQ ID NO: 1; (b) uma serina, cisteína, ou arginina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 189 da SEQ ID NO: 1; (c) uma prolina, serina, histidina, alanina, glicina, ou glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1; (d) uma serina ou triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: l; (e) uma treonina, alanina, ou serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1; (f) uma glutamina, alanina, valina, ou ácido glutâmico na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; ou (g) uma leucina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 215 da SEQ ID NO: 1.
[0042] Em uma outra modalidade, a HPPD foi modificada para compreender uma substituição(ões) de um aminoácido(s) de: (a) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (b) uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma treonina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (c) um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 188 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, e um ácido glutâmico na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (e) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma alanina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; ou (f) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1.
[0043] Em modalidades específicas, a HPPD da invenção tem pelo menos 53%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade entre sequências à sequência de aminoácidos apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 1, em que a HPPD foi modificada para compreender uma substituição(ões) de um aminoácido(s) de: (a) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (b) uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma treonina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (c) um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 188 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, e um ácido glutâmico na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (e) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma alanina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; ou (f) uma prolina na posição de aminoácido correspondente à posição de aminoácido 335 SEQ ID NO: 1.
[0044] Em uma outra modalidade, a HPPD da invenção tem pelo menos 53%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade entre sequências à sequência de aminoácidos apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 1 e em que a HPPD compreende uma substituição(ões) de um aminoácido(s) de: (a) um triptofano na posição de aminoácido 188 e um triptofano na posição de aminoácido 336; ou (b) uma prolina na posição de aminoácido 335.
[0045] Em uma outra modalidade, a HPPD da invenção tem pelo menos 53%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% identidade entre sequências à sequência de aminoácidos apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 63, em que a HPPD foi modificada para compreender uma substituição(ões) de um aminoácido(s) de: (a) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (b) uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma treonina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (c) um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 188 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, e uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (e) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma alanina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; ou (f) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1.
[0046] Em uma outra modalidade, a HPPD da invenção tem pelo menos 53%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade entre sequências à sequência de aminoácidos apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 64, em que a HPPD foi modificada para compreender uma substituição(ões) de um aminoácido(s) de: (a) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (b) uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma treonina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (c) um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 188 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, e uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (e) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma alanina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (f) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1.
[0047] Em uma outra modalidade, a HPPD da invenção tem pelo menos 53%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade entre sequências à sequência de aminoácidos apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 65, em que a HPPD foi modificada para compreender uma substituição(ões) de um aminoácido(s) de: (a) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (b) uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, e uma treonina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1; (c) um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 188 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, e um ácido glutâmico na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (e) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, e uma alanina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1; (f) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1.
[0048] Em uma outra modalidade, a HPPD da invenção tem pelo menos 53%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade entre sequências à sequência de aminoácidos apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 57, ou é codificada por uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade entre sequências à sequência de nucleotídeos apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 60. A HPPD desta modalidade pode ainda compreender uma substituição(ões) de um aminoácido(s) de: (a) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (b) uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma treonina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (c) um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 188 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, e um ácido glutâmico na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (e) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma alanina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; ou (f) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1.
[0049] Em uma outra modalidade, a HPPD da invenção tem pelo menos 53%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade entre sequências à sequência de aminoácidos apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 58, ou é codificada por uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade entre sequências à sequência de nucleotídeos apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 61. A HPPD desta modalidade pode ainda compreender uma substituição(ões) de um aminoácido(s) de: (a) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (b) uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma treonina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (c) um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 188 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, e um ácido glutâmico na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (e) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma alanina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; ou (f) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1.
[0050] Em uma outra modalidade, a HPPD da invenção tem pelo menos 53%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade entre sequências à sequência de aminoácidos apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 59, ou é codificada por uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade entre sequências à sequência de nucleotídeos apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 62. A HPPD desta modalidade pode ainda compreender uma substituição(ões) de um aminoácido(s) de: (a) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (b) uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma treonina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (c) um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 188 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, e um ácido glutâmico na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (e) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma alanina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; ou (f) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1.
[0051] Em uma outra modalidade, a HPPD tem pelo menos 85% uma identidade entre sequências à sequência de aminoácidos apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 1, em que a HPPD foi modificada para compreende uma substituição(ões) de um aminoácido(s) de: (a) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (b) uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma treonina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (c) um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 188 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, e um ácido glutâmico na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (e) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma alanina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; ou (f) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1. (g) 52] Em uma outra modalidade, a HPPD da invenção tem pelo menos 85% de identidade entre sequências à sequência de aminoácidos apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 1, em que a HPPD compreende uma substituição(ões) de um aminoácido(s) de: (a) um triptofano na posição de aminoácido 188 e um triptofano na posição de aminoácido 336; ou (b) uma prolina na posição de aminoácido 335. (c) 53] Em uma outra modalidade, a HPPD da invenção tem pelo menos 85% de identidade entre sequências à sequência de aminoácidos apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 57. A HPPD desta modalidade pode ainda compreender uma substituição(ões) de um aminoácido(s) de: (a) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (b) uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma treonina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (c) um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 188 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, e um ácido glutâmico na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; ou (e) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma alanina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; ou (f) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1. (g) 54] Em uma outra modalidade, a HPPD da invenção tem pelo menos 85% de identidade de sequências à sequência de aminoácidos apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 58. A HPPD desta modalidade pode ainda compreender uma substituição(ões) de um aminoácido(s) de: (a) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (b) uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma treonina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (c) um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 188 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, e um ácido glutâmico na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; ou (e) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma alanina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; ou (f) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1.
[0052] Em uma outra modalidade, a HPPD da invenção tem pelo menos 85% de identidade entre sequências à sequência de aminoácidos apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 1, em que a HPPD compreende uma substituição(ões) de um aminoácido(s) de: (a) um triptofano na posição de aminoácido 188 e um triptofano na posição de aminoácido 336; ou (b) uma prolina na posição de aminoácido 335.
[0053] Em uma outra modalidade, a HPPD da invenção tem pelo menos 85% de identidade entre sequências Petição 870220042196, de 16/05/2022, pág. 46/153 35/137 à sequência de aminoácidos apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 57. A HPPD desta modalidade pode ainda compreender uma substituição(ões) de um aminoácido(s) de: (a) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (b) uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma treonina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (c) um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 188 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, e um ácido glutâmico na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; ou (e) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma alanina na Petição 870220042196, de 16/05/2022, pág. 47/153 36/137 posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; ou (f) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1.
[0054] Em uma outra modalidade, a HPPD da invenção tem pelo menos 85% de identidade de sequências à sequência de aminoácidos apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 58. A HPPD desta modalidade pode ainda compreender uma substituição(ões) de um aminoácido(s) de: (a) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (b) uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma treonina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (c) um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 188 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à Petição 870220042196, de 16/05/2022, pág. 48/153 37/137 posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, e um ácido glutâmico na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; ou (e) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma alanina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; ou (f) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1.
[0055] Em uma outra modalidade, a HPPD da invenção tem pelo menos 85% de identidade entre sequências à sequência de aminoácidos apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 59. A HPPD desta modalidade pode ainda compreender uma substituição(ões) de um aminoácido(s) de: (a) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (b) uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma treonina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (c) um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 188 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, e um ácido glutâmico na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (e) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma alanina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; ou (f) uma prolina na posição de aminoácido que corresponde à posição de aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1. (g)
[0056] Qualquer sequência de HPPD pode ser modificada para conter uma ou mais das substituições descritas no presente documento. A HPPD da invenção também abrange, por exemplo, quaisquer enzimas HPPD bacterianas vegetais ou animais que ocorram na natureza e que tenham sido modificadas para conter uma ou mais substituições descritas acima.
[0057] Ao se chegar à proteína de HPPD da presente invenção, uma sequência de aminoácidos de partida de uma proteína existente deve ser modificada pelo homem por substituição de pelo menos um aminoácido conforme definido no presente pedido, o que é mais conveniente feito, modificando-se a codificação de DNA de tal proteína por substituição de um determinado códon por outro códon codificando um outro aminoácido.
[0058] As sequências de HPPD exemplares que podem ser modificadas de acordo com a presente invenção incluem as provenientes de bactérias, tal como do tipo de Pseudomonas sp., Pseudomonas fluorescens, por exemplo, ou então cianobactérias do gênero Synechocystis. A sequência pode também ser de origem vegetal, especialmente derivada de plantas dicotiledôneas, plantas umbelíferas ou então de plantas monocotiledôneas. Exemplos vantajosos que podem ser citados são plantas tais como tabaco, Arabidopsis, Daucus carotta, Zea mays (milho), trigo, cevada, Avena sativa, Brachiaria platyphilla, Cenchrus echinatus, Lolium rigidum, Festuca arundinacea, Setaria faberi, Eleusine indica, sorgo, Cenchrus echinatus, festuca arundinacea. As sequências de codificação e o modo do seu isolamento e clonagem são conhecidos na técnica ou estão descritos em outro ponto da presente invenção (tais como SEQ ID NO: 6376). Em uma modalidade especial da presente invenção, a HPPD que pode ser modificada de acordo com a presente invenção é proveniente de uma origem bacteriana, especialmente de Pseudomonas sp., mais especificamente de Pseudomonas fluorescens, Rhodococcus sp., Blepharisma japonicum, Synechococcus sp., Picrophilus torridus, Kordia algicida ou de uma origem vegetal, inclusive de Arabidopsis thaliana, Sorghum bicolor, Oryza sativa, Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Lolium rigidum, ou Avena sativa.
[0059] Para os fins da presente invenção, a HPPD da presente invenção pode também compreender outras modificações, tal como aquelas em que alguns aminoácidos (tais como 1 a 10 aminoácidos) tenham sido substituídos, acrescentados ou deletados para fins de clonagem para produzir uma fusão de peptídeo de trânsito, e semelhantes que conserva a atividade de HPPD, isto é, a propriedade de catalisar a conversão do para-hidroxifenilpiruvato em homogentisato, ou pode consistir em qualquer HPPD que pode ser ainda mais melhorado. A HPPD, por exemplo, que pode ser ainda mais melhorada pelas modificações descritas no presente documento pode ser a HPPD variante derivada de Pseudomonas fluorescens apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 2, a HPPD variante de Avena sativa apresentada no presente documento como SEQ ID NO: 64, as sequências de HPPD variante apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NO: 3-326, 383-389, 393, 395, e 397-459 em WO2012/021785, que é incorporado ao presente documento a título de referência integralmente; as sequências de HPPD apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NO: 2-14 e 20-50 de WO2011/068567, que é integralmente incorporado ao presente documento a título de referência; as sequências de HPPD apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NO: 15-26 de WO2010/085705, que é integralmente incorporado ao presente documento a título de referência; uma HPPD tendo uma ou mais das substituições descritas em WO09/144079 ou na patente U.S. 6.245.968, sendo cada uma delas incorporada ao presente documento a título de referência integralmente; uma HPPD tendo uma ou mais das substituições descritas nas Tabelas 1, 2, 5, ou 6 de WO2010/085705; e/ou uma HPPD tendo uma ou mais substituições descritas na Tabela 1 de WO2011/068567.
[0060] Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos da invenção (incluindo genes isolados recombinantes e quiméricos seus, vetores, células hospedeiras, plantas, partes vegetais, e sementes compreendendo a sequência de ácidos nucleicos, as sequências de aminoácidos e suas composições codificadas pela sequência de ácidos nucleicos, assim como métodos de uso da sequência de ácidos nucleicos para aumentar a tolerância de uma planta a herbicidas inibidores de HPPD, especialmente uma maior tolerância a herbicidas inibidores de HPPD da classe de N-(1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N- (tetrazol-4-il)- ou N-(triazol-3-il)arilcarboxamidas, tais como 2-cloro-3-etóxi-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida e 2-cloro-3-(metoximetil)-4- (metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida, tricetonas, tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, da classe de isoxazóis tais como isoxaflutol, ou da classe de pirazolinatos, tais como pirassulfotol e topramezona, especialmente selecionados de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol, e mesotriona) codifica a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 359, e seus fragmentos e variantes que codificam um polipeptídeo de tolerância a herbicidas inibidores de HPPD. Portanto, nesta modalidade, a HPPD da invenção compreende a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 3-59, e seus fragmentos e variantes que conferem tolerância a herbicidas inibidores de HPPD em uma célula hospedeira.
A. Métodos para a medição de tolerância a inibidores de HPPD
[0061] Qualquer método adequado para a medição de tolerância a herbicidas inibidores de HPPD pode ser usado para se avaliar as sequências de HPPD da invenção. A tolerância pode ser medida monitorando-se a capacidade de uma célula ou de um organismo de sobreviver à aplicação de um herbicida inibidor de HPPD específico, ou a capacidade de conduzir as funções celulares essenciais tais como fotossíntese, síntese das proteínas ou respiração e reprodução de um modo que não seja facilmente distinguível das de células ou organismos sem tratamento, ou a capacidade de não apresentar nenhuma diferença significativamente em rendimento ou mesmo um maior rendimento para plantas tratadas com plantas tratadas com herbicida inibidor de HPPD em comparação com tais plantas não tratadas com tal herbicida (mas em que as plantas nocivas tenham sido prevenidas ou removidas por um mecanismo diferente da aplicação do herbicida inibidor de HPPD). Em algumas modalidades, a tolerância pode ser medida de acordo com um fenótipo indicador visível da célula o do organismo transformado com um ácido nucleico compreendendo o gene que codifica para a proteína de HPPD respectiva ou em um ensaio in vitro da proteína de HPPD, na presença de concentrações diferentes dos diversos inibidores de HPPD. As respostas à dose e os desvios relativos em respostas a dose associadas com estes fenótipos indicadores (formação de uma coloração marrom, inibição do crescimento, descoramento, efeito herbicida etc.) são expressos, por exemplo, convenientemente em termos de valores de GR50 (concentração para uma redução de 50% em crescimento) ou valores MIC (concentração inibidora mínima) em que os aumentos em valores correspondem aos aumentos em tolerância inerente da HPPD, no modo normal com base no dano à planta, sintomas de descoramento meristemático etc. dentro de limites diferentes de concentrações de herbicidas. Estes dados podem ser expressos em termos de valores de GR50, por exemplo, derivados de curvas dose/resposta tendo “dose” lançado no eixo de x e “porcentagem de destruição”, “efeito herbicida”, “números de plantas verdes emergentes” etc. lançados no eixo de y, correspondendo os valores aumentados de GR50 a níveis aumentados de tolerância inerente da HPPD expressa. Os herbicidas podem ser adequadamente aplicados na pré-emergência e na pós-emergência.
[0062] Em diversas modalidades, o nível de tolerância do ácido nucleico ou do gene que codifica uma proteína de HPPD de acordo com a invenção, ou da proteína de HPPD da invenção pode ser selecionado por meio de testes de transgênese, regeneração, cruzamento e pulverização de uma planta de teste como tabaco ou de uma planta de cultura tal como soja ou algodão. Em linha com os resultados obtidos por tal seleção, tais plantas são mais tolerantes, de preferência tolerantes a pelo menos duas vezes a dose normal recomendada para aplicações em campo, até mesmo mais de preferência tolerantes até 4 vezes a dose normal recomendada para aplicações em campo a inibidores de HPPD (tais como herbicidas inibidores de HPPD da classe de N- (1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(tetrazol-4-il)- ou N- (triazol-3-il)arilcarboxamidas, tais como 2-cloro-3-etóxi- 4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida e 2-cloro-3-(metoximetil)-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida, tricetonas, tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, da classe de isoxazóis tais como isoxaflutol, ou da classe de pirazolinatos, tais como pirassulfotol e topramezona, especialmente selecionados de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol, e mesotriona) do que tais plantas que não contêm nenhum gene exógeno codificando uma proteína de HPPD, ou do que plantas que contém um gene que compreende um DNA codificando a HPPD de referência, um DNA codificando HPPD de Arabidopsis thaliana, sob o controle do mesmo promotor que o ácido nucleico que codifica a proteína de HPPD da invenção. Consequentemente, o termo “capaz de aumentar a tolerância de uma planta a pelo menos um herbicida agindo sobre HPPD” indica uma tolerância pela planta que expressa a HPPD da invenção a pelo menos 2x, ou 3x, ou 4x, ou mais, a dose em campo normal do herbicida inibidor de HPPD quando comparada com uma planta que somente expressa a sua HPPD endógena ou com uma planta que expressa uma enzima HPPD de referência. Neste contexto, o termo “herbicida agindo sobre a HPPD” não é limitado a substâncias que são conhecidas e/ou usadas como herbicidas, mas a quaisquer substâncias que inibem a atividade catalítica de proteínas de HPPD.
[0063] Alternativamente, a nível quantitativo, dados como pI50 (valor pI50 significa o valor log da concentração de inibidor necessária para inibir 50% da atividade enzimática em concentração molar) podem ser obtidos para a proteína de HPPD da invenção e comparados a uma sequência de HPPD de referência na presença ou na ausência de qualquer herbicida inibidor de HPPD respectivo.
[0064] Um tipo de ensaio específico, embora não limitante que pode ser usado para avaliar as sequências de HPPD da invenção é o ensaio colorimétrico. Neste ensaio, um meio de cultura do tipo de caldo YT tendo 1% de agarose, 5 mM de L-Tirosina e 42 mM de Succinato, que contém o agente de seleção para o vetor pSE420 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) ou uma versão modificada de pSE420 (pSE420(RI)NX) é vertida em placas com cavidades profundas. Aplica-se uma cultura de E. coli na fase de crescimento exponencial que contém o vetor pSE420-HPPDx (HPPDx significa qualquer gene que codifica para uma enzima/proteína de HPPD pressuposta) a cada cavidade. Depois de 16 horas a 37°C, as cavidades que não continham o meio de cultura, aquelas que foram inoculadas com uma cultura de E. coli contendo o vetor vazio pSE420 estão transparentes, ou aquelas que foram inoculadas com uma cultura de E. coli contendo um vetor pSE420-HPPDx contendo um gene codificando para uma HPPD inativa estão transparentes, ao passo que as cavidades inoculadas com E. coli contendo o vetor pSE420-HPPDx codificando para uma HPPD ativa têm uma coloração marrom. Foi anteriormente demonstrado que este teste reflete a atividade de HPPD, qualquer que seja a origem desta atividade e permite a identificação de atividades de HPPD (US 6.768.044), isto é, a um nível qualitativo.
B. Métodos de introdução de mutações em sequências de HPPD
[0065] Na proteína de HPPD mutada codificada pelo ácido nucleico da invenção pelo menos um aminoácido foi substituído conforme foi definido acima.
[0066] A substituição pode ser efetuada na sequência de ácidos nucleico que codifica a HPPD de referência, conforme definido acima por qualquer meio que seja adequado para a substituição, na sequência citada, do códon que codifica o aminoácido a ser substituído com códon que corresponde ao aminoácido que deve substituí-lo, estando os códons amplamente descritos na literatura e bem conhecidos dos versados na técnica.
[0067] Diversos métodos da biologia molecular podem ser usados para se obter esta substituição. Um método útil para a preparação de uma sequência de ácidos nucleicos mutada de acordo com a invenção e a proteína correspondente que efetua uma mutagênese direcionada a sítio nos códons que codificam um ou mais aminoácidos que são selecionados com antecedência. Os métodos para a obtenção destas mutações direcionadas a sítios são bem conhecidos pelos versados na técnica e foram amplamente descritas na literatura (especialmente: Directed Mutagenesis: A Practical Approach, 1991, Editado por M.J. McPHERSON, IRL PRESS), ou então são métodos para os quais é possível se empregar kits comerciais (o kit QUIKCHANGE™ de mutagênese relâmpago de Qiagen, por exemplo). Depois da mutagênese direcionada a sítio, é útil se selecionar as células que contêm uma HPPD mutada que é menos sensível a um inibidor de HPPD usando um ajudante adequado de seleção. Os métodos adequados de seleção para tal fim foram descritos acima.
[0068] Alternativamente, uma sequência de DNA que codifica a HPPD de referência pode ser codificada in silico para codificar uma proteína de HPPD tendo uma ou mais das substituições citadas no presente documento, sendo então sintetizada de novo. A sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína mutada de HPPD pode ser introduzida em uma célula hospedeira conforme foi descrito em outro ponto no presente documento.
A. Polinucleotídeos isolados e variantes e fragmentos seus
[0069] Em algumas modalidades, a presente invenção compreende polinucleotídeos isolados ou recombinantes. Um polinucleotídeo ou polipeptídeo/proteína “isolado” ou “recombinante” ou uma porção sua biologicamente ativa, conforme definido no presente documento não se encontra mais presente no seu organismo original, nativo, tal como quando contido em uma célula hospedeira heteróloga ou em uma célula vegetal transgênica, semente ou planta transgênica. Em uma modalidade, um polinucleotídeo “isolado” é isento de sequências (sequências que codificam proteína ou reguladoras, por exemplo) que flanqueiam o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5’ e 3’ do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo do qual é derivado o polinucleotídeo. O termo “recombinante” abrange polinucleotídeos ou polipeptídeos que tenham sido manipulados no tocante ao polinucleotídeo ou polipeptídeo nativo, de modo tal, que o polinucleotídeo ou polipeptídeo difere (tal como na composição química ou em estrutura) do que ocorre na natureza. Em uma outra modalidade, um polinucleotídeo “isolado” ou “recombinante” é isento de sequências internas (isto é, de íntrons) que ocorrem naturalmente no DNA genômico do organismo do qual o polinucleotídeo foi derivado. Um exemplo típico de tal polinucleotídeo é um DNA denominado DNA Complementar (DNAc). Em diversas modalidades, o polinucleotídeo isolado que codifica tolerância a herbicidas inibidores de HPPD pode conter menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb da sequência de nucleotídeos que flanqueia naturalmente o polinucleotídeo no DNA genômico da célula da qual o polinucleotídeo é derivado. As moléculas de ácido nucleico da invenção incluem aquelas que codificam a HPPD da invenção, incluindo, por exemplo, as sequências de nucleotídeos apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NO: 60-62.
[0070] A presente invenção reivindica ainda variantes e fragmentos de qualquer sequência de ácidos nucleico que codifica as sequências de aminoácidos apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NO: 3-59. Um “fragmento” de um polinucleotídeo pode codificar uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo ou pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização como um primer de PCR usando-se os métodos descritos em outro ponto na presente documento. Os polinucleotídeos que são fragmentos de um polinucleotídeo compreendem pelo menos aproximadamente 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, nucleotídeos contíguos ou até o número de nucleotídeos presentes em um polinucleotídeo de comprimento total descrito no presente documento dependendo do uso pretendido (tal como um ácido nucleico de HPPD descrito no presente documento). Nucleotídeos “contíguos” significam nos termos do presente contexto resíduos de nucleotídeos que estão imediatamente adjacentes entre si.
[0071] Os fragmentos dos polinucleotídeos da presente invenção geralmente codificarão fragmentos de polipeptídeos que conserva a atividade da proteína com tolerância a herbicida inibidor de HPPD de comprimento total; isto é, atividade de tolerância a herbicida. “Conserva uma atividade de tolerância a herbicida” significa que o fragmento terá pelo menos aproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, pelo menos aproximadamente 300% ou mais de atividade de tolerância a herbicida da proteína de tolerância a herbicida inibidor de HPPD de comprimento total descrita no presente como a SEQ ID NO: 2. Os métodos para a medição da atividade de tolerância a herbicidas são bem conhecidos na técnica e métodos exemplares são descritos no presente documento. In um exemplo não limitante, um fragmento da invenção será tolerante à mesma dose de um herbicida inibidor de HPPD, ou tolerante a uma dose 2x, 3x, 4x, ou mais de um herbicida inibidor de HPPD, ou então os fragmentos serão tão tolerantes ou mais com base em pI50 ou Ki entre o fragmento e a SEQ ID NO: 2.
[0072] Um fragmento de um polinucleotídeo que codifica uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo da invenção codificará pelo menos aproximadamente 150, 175, 200, 250, 300, 350 aminoácidos contíguos ou até o número total de aminoácidos presentes em um polipeptídeo de comprimento total da invenção. Em um exemplo não limitante, um fragmento de um polinucleotídeo que codifica uma porção biologicamente ativa de um polipeptídeo da invenção compreende um ou mais posições de aminoácidos 188, 189, 215, 335, 336, 339 e 340 da SEQ ID NO: 2.
[0073] A invenção também abrange variantes de polinucleotídeos conforme foi descrito acima. “Variantes” do polinucleotídeo também incluem aquelas sequências que codificam a HPPD da invenção, mas que diferem de modo conservativo devido à degeneração do código genético, assim como aqueles que são suficientemente idênticos. Os variantes da presente invenção conservarão a atividade enzimática de HPPD e a tolerância a inibidores herbicidas de HPPD. O termo “suficientemente idênticos” significa um polipeptídeo ou uma sequência de polinucleotídeo que tem pelo menos aproximadamente 60% ou 65% de identidade entre sequências, aproximadamente 70% ou 75% de identidade entre sequências, aproximadamente 80% ou 85% de identidade entre sequências, aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade entre sequências em comparação com uma sequência de referência usando-se um dos programas de alinhamento usando parâmetros padrão. Os versados na técnica reconhecerão que estes valores podem ser adequadamente ajustados para determinar uma identidade correspondente de polipeptídeos codificados por dois polinucleotídeos levando em conta a degeneração dos códons, a similaridades de aminoácidos, o posicionamento da matriz de leitura e semelhantes.
[0074] Os genes bacterianos com grande frequência possuem uma multiplicidade de códons de iniciação de metionina na proximidade do início da matriz de leitura. Frequentemente, a iniciação da tradução em um ou mais destes códons de partida levará a uma geração de uma proteína funcional. Estes códons de partida podem incluir códons ATG. No entanto, bactérias tais como Bacillus sp. também reconhecem o códon GTG como um códon de partida e proteínas que iniciam a tradução nos códons GTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido. Além disso, frequentemente não é determinado a priori quais dos códons são usados naturalmente na bactéria. Assim, deve ficar subentendido que o uso de um dos códons de metionina alternado pode levar à geração de variantes que conferem uma tolerância a herbicidas. Estas proteínas de tolerância a herbicidas incidem no âmbito da presente invenção e podem ser usados nos métodos da presente invenção. Variantes alélicas que ocorrem naturalmente podem ser identificadas com o uso de técnicas conhecidas da biologia molecular, tais como reação em cadeia de polimerase (PCR) e técnicas de hibridização conforme relatadas abaixo. Variantes de polinucleotídeos também incluem polinucleotídeos sinteticamente derivados que foram gerados, por exemplo, usando-se estratégias de mutagênese direcionada a sítio ou outra, mas que ainda codifica o polipeptídeo que tem a atividade biológica desejada.
[0075] Os versados na técnica observarão ainda que alterações podem ser introduzidas por uma nova mutação dos polinucleotídeos da invenção, levando a outras alterações na sequência de aminoácidos dos polipeptídeos codificados, sem alterar a atividade biológica dos polipeptídeos. Assim variantes de polinucleotídeos isolados podem ser criadas introduzindo-se uma ou mais substituições adições ou deleções de nucleotídeos no polinucleotídeo correspondente que codifica a HPPD da invenção, tal como 15, 1-10, ou 1-15 substituições, adições ou deleções de aminoácidos, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 substituições, adições ou deleções de aminoácidos, são introduzidas no polipeptídeo codificado. Outras mutações podem ser introduzidas por técnicas padrão, tais como mutagênese direcionada a sítio e por mutagênese mediada por PCR ou técnicas de embaralhamento dos genes. Tais variantes de polinucleotídeos incidem também no âmbito da presente invenção.
[0076] Podem ser produzidos polinucleotídeos introduzindo-se aleatoriamente mutações ao longo de toda ou parte da sequência de codificação, tal como por mutagênese de saturação ou por mutagênese permutacional e os mutantes resultantes podem ser selecionados para a capacidade de conferir uma atividade de tolerância a herbicidas para identificar os mutantes que conservam a atividade.
[0077] Métodos adicionais para a geração de variantes incluem submeter-se uma célula que expressa uma proteína descrita no presente documento (ou sua biblioteca) a uma condição específica que cria uma tensão para a atividade da proteína. As condições específicas podem incluir (mas sem limitação) alterações em temperatura, alterações me pH, e alterações nas concentrações de substratos ou inibidores. A biblioteca da proteína pode ser submetida a estas condições durante o tempo da expressão de proteína (tal como em E. coli ou outra hospedeira) ou depois da criação de um extrato de proteína, ou depois da purificação da proteína.
[0078] A atividade funcional ou enzimática da biblioteca da proteína que foi submetida a uma condição de tensão pode então ser comparada à proteína de referência para identificar proteínas com propriedades melhoradas. Esta comparação das atividades pode ser conduzida como parte de uma seleção de crescimento, ou alternativamente, como parte de um ensaio enzimático que quantifica a atividade da proteína. As propriedades que podem ser identificadas como melhoradas podem incluir uma tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, alterações em constantes cinéticas (incluindo Km, Ki, Vmax), estabilidade da proteína, termoestabilidade da proteína ou um nível ótimo de temperatura da proteína.
C. Proteínas Isoladas e suas Variantes e Fragmentos
[0079] Polipeptídeos com tolerância a herbicidas também incidem no âmbito da presente invenção. Um polipeptídeo com tolerância a herbicida inclui preparações de polipeptídeos que têm menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, ou 5% (em peso seco) do polipeptídeo com tolerância a herbicida (a que se refere também neste documento como “proteína contaminante”) Na presente invenção, “proteína com tolerância a herbicida” significa um polipeptídeo de HPPD descrito no presente documento. Fragmentos, porções biologicamente ativas e seus variantes são também propostos e podem ser usados para colocar em prática os métodos da presente invenção.
[0080] “Fragmentos” ou “porções biologicamente ativas?” incluem fragmentos de polipeptídeo que compreendem uma porção da sequência de aminoácidos que codifica uma proteína com tolerância a herbicida e que conserva a atividade de tolerância a herbicida. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína com tolerância a herbicida pode ser um polipeptídeo que tem, por exemplo, 10, 25, 50, 100 ou mais aminoácidos de comprimento. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas para uma atividade de tolerância a herbicida.
[0081] “Variantes” significa dentro do contexto deste documento proteínas ou polipeptídeos que tem uma sequência de aminoácidos que tem uma identidade entre sequências de pelo menos aproximadamente 60%, 65%, aproximadamente 70%, 75%, aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% a qualquer uma das SEQ ID NO: 3-59, tendo cada variante a atividade enzimática de HPPD e tolerância a herbicidas inibidores de HPPD. Os versados na técnica observarão que estes valores podem ser adequadamente ajustados para se determinar a identidade correspondente de polipeptídeos codificados por dois polinucleotídeos levando-se em conta a degeneração dos códons, a similaridade dos aminoácidos, o posicionamento da matriz de leitura e semelhantes.
[0082] Podem ser feitas substituições de aminoácidos conservativas, por exemplo, em um ou mais resíduos de aminoácidos não essenciais. Um resíduo de aminoácido “não essencial” é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência de referência de um polipeptídeo sem alteração da atividade biológica, ao passo que um resíduo de aminoácido “essencial” é necessário para a atividade biológica. Uma “substituição de aminoácido conservativa” é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácidos que têm cadeias laterais similares já foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (tais como lisina arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (tais como ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (tais como glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (tais como alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais com ramos beta (tais como treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (tais como tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). As substituições de aminoácidos podem ser feitas em regiões não conservadas que conservam a função. Em geral, tais substituições tais substituições não seriam feitas para resíduos de aminoácidos conservados, ou para resíduos de aminoácidos que residem dentro de um motivo conservado, onde tais resíduos são essenciais para a atividade do polipeptídeo. No entanto, os versados na técnica observarão que variantes funcionais podem ter ligeiras alterações conservadas e não conservadas nos resíduos conservados.
[0083] Os anticorpos à HPPD da presente invenção ou a variantes ou fragmentos seus incidem também no âmbito da presente invenção. Os métodos para a produção de anticorpos são conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; patente U.S. No. 4.196.265).
[0084] Assim um aspecto da invenção se refere a anticorpos, moléculas de ligação a antígenos de cadeia única, ou outras proteínas que se ligam especificamente a um ou mais das moléculas de proteína ou peptídeo da invenção e seus homólogos, fusões e fragmentos. Em uma modalidade especialmente preferida, o anticorpo se liga especificamente a uma proteína que tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3-59 ou um fragmento seu. Em uma outra modalidade, o anticorpo se liga especialmente a uma proteína de fusão compreendendo a uma sequência de aminoácidos selecionada da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3-59, ou um fragmento seu.
[0085] Os anticorpos da presente invenção podem ser usados para detectar quantitativa ou qualitativamente as moléculas de proteína ou do peptídeo da presente invenção, ou para detectar modificações pós-traducionais das proteínas. Conforme usado no presente documento, diz-se que um anticorpo ou peptídeo “se liga especificamente” a uma molécula de proteína ou peptídeo da invenção, se tal ligação não for inibida competitivamente pela presença de moléculas não relacionadas.
D. Empilhamento de genes
[0086] Na produção comercial de culturas, é desejável se eliminar por um manejo pesticida confiável plantas indesejáveis (isto é, “pragas”) de um campo de cultura. Um tratamento ideal seria aquele que pudesse ser aplicado a um campo integral, mas que eliminaria somente as plantas indesejáveis deixando as plantas cultivadas intocadas. Um tal sistema de tratamento envolveria o uso de plantas cultivadas que são tolerantes a um herbicida, de modo que, quando o herbicida fosse pulverizado em um campo de plantas cultivadas tolerantes a herbicida, as plantas cultivadas continuariam a crescer, ao passo que as pragas não tolerantes a herbicidas seriam destruídas ou gravemente danificadas. O ideal é que tais sistemas de tratamento se beneficiassem das propriedades herbicidas variáveis de modo que o controle de pragas proporcionasse a melhor combinação possível de flexibilidade e economia. Herbicidas individuais têm longevidades diferentes no campo, por exemplo, e alguns herbicidas persistem e são eficazes durante um período de tempo relativamente prolongado depois de eles terem sido aplicados a um campo ao passo que outros herbicidas são rapidamente decomposto em outros compostos e/ou compostos não ativos. Um sistema de tratamento ideal permitiria o uso de diferentes herbicidas de modo que os cultivadores pudessem adaptar a escolha de herbicidas a uma situação especial.
[0087] Embora um número de plantas cultivadas tolerantes a herbicidas esteja atualmente disponível no comércio, surgiu um problema para muitos herbicidas e combinações herbicida/cultura comerciais em que herbicidas individuais tipicamente têm um espectro incompleto de atividade contra espécies comuns de pragas. Para a maioria dos herbicidas individuais que vem sendo usados durante algum tempo tornaram-se mais prevalentes populações de espécies e biótipos de pragas resistentes a herbicidas (veja, por exemplo, Tranel e Wright (2002) Weed Science 50: 700-712; Owen e Zelaya (2005) Pest Manag. Sci. 61: 301311). Plantas transgênicas que são tolerantes a mais de um herbicida foram descritos (veja, por exemplo, W02005/012515). No entanto, melhoramentos em todos os aspectos da produção de culturas, opções de controle de pragas vegetais, a extensão de controle residual de pragas vegetais, e o melhoramento em rendimento das culturas estão continuamente em demanda.
[0088] A proteína ou sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção é combinada com vantagem em plantas com outros genes que codificam proteínas ou RNAs que conferem propriedades agronômicas úteis a tais plantas. Dentre os genes que codificam proteínas ou RNAs que conferem propriedades agronômicas úteis às plantas transformadas, devem ser mencionadas sequências de DNA que codificam proteínas que conferem tolerância a um ou mais herbicidas que, de acordo com a sua estrutura química, diferem de herbicidas inibidores de HPPD e outros que conferem tolerância a determinados insetos, aqueles que conferem tolerância a determinadas doenças, DNAs que codificam RNAs que proporcionam controle de nematódeos ou insetos e semelhantes. Tais genes são especialmente descritos nos pedidos de patentes PCT WO 91/02071 e WO95/06128 e em patentes U.S. 7.923.602 e na publicação de pedido de patente U.S. No. 20100166723, sendo cada um deles integralmente incorporado ao presente documento a título de referência.
[0089] Dentre as sequências de DNA que codificam proteínas que conferem tolerância a determinados herbicidas às células vegetais e plantas transformadas podem ser mencionadas um gene bar ou PAT ou o gene de Streptomyces coelicolor descrito em WO2009/152359 que confere tolerância a herbicidas de glufosinato, um gene que codifica uma EPSPS que confere tolerância a herbicidas que tem EPSPS como alvo, tais como glifosato e seus sais (US 4.535.060, U.S. 4.769.061, U.S. 5.094.945, U.S. 4.940.835, U.S. 5.188.642, U.S. 4.971.908, U.S. 5.145.783, U.S. 5.310.667, U.S. 5.312.910, U.S. 5.627.061, U.S. 5.633.435), um gene que codifica glifosato-n-acetiltransferase (U.S. 8.222.489, U.S. 8.088.972, U.S. 8.044.261, U.S. 8.021.857, U.S. 8.008.547, U.S. 7.999.152, U.S. 7.998.703, U.S. 7.863.503, U.S. 7.714.188, U.S. 7.709.702, U.S. 7.666.644, U.S. 7.666.643, U.S. 7.531.339, U.S. 7.527.955, e U.S. 7.405.074, por exemplo), ou um gene que codifica glifosato oxidoreductase (U.S. 5.463.175, por exemplo).
[0090] Dentre as sequências de DNA que codificam uma EPSPS adequada que confere tolerância aos herbicidas que têm a EPSPS como alvo, deve ser mencionado especialmente o gene que codifica a EPSPS vegetal, mais especialmente EPSPS de milho, especialmente a epsps de milho que compreende duas mutações, especialmente uma mutação na posição de aminoácido 102 e uma mutação na posição de aminoácido 106 (WO 2004/074443), e que é descrito no pedido de patente U.S. 6566587, doravante denominada EPSPS de milho dupla mutante ou 2mEPSPS, ou o gene que codifica uma EPSPS isolada de Agrobacterium e que é descrita pela SEQ ID NO: 2 e pela SEQ ID NO: 3 da patente U.S. 5.633.435, também denominado CP4.
[0091] Dentre as sequências de DNA que codificam uma EPSPS adequada que confere tolerância aos herbicidas que tem EPSPS como alvo, deve ser mencionado especialmente o gene que codifica uma EPSPS GRG23 de Arthrobacter globiformis, mas também os mutantes GRG23 ACE1, GRG23 ACE2, ou GRG23 ACE3, especialmente os mutantes ou variantes de GRG23 conforme descritos em WO2008/100353, tais como GRG23(ace3)R173K da SEQ ID NO: 29 em WO2008/100353.
[0092] No caso das sequências de na que codificam EPSPS, e mais especialmente aquelas que codificam os genes acima, a sequência que codifica estas enzimas é precedida vantajosamente por uma sequência que codifica um peptídeo de trânsito, especialmente o “peptídeo de trânsito otimizado” descrito nas patentes U.S. 5.510.471 ou 5.633,448.
[0093] Características de tolerância a herbicidas exemplares que podem ser combinadas com a sequência de ácido nucleico da invenção incluem ainda pelo menos um inibidor de ALS (acetolactato sintase) (WO 2007/024782); um gene de ALS/AHAS mutado de Arabidopsis (patente U.S. 6.855.533); genes que codificam 2,4-D- monooxigenases conferindo tolerância a 2,4-D (ácido 2,4- diclorofenoxiacético) por metabolização (patente U.S. 6.153.401); e, genes codificando Dicamba monooxigenases conferindo tolerância a dicamba (ácido 3,6-dicloro-2- metoxibenzoico) por metabolização (US 2008/0119361 e U.S. 2008/0120739).
[0094] Em diversas modalidades, a HPPD da invenção é empilhada com um ou mais genes tolerantes a herbicidas, incluindo um ou mais genes tolerantes a herbicida inibidor de HPPD adicionais e/ou um ou mais genes tolerantes a glifosato e/ou a glufosinato. Em uma modalidade, a HPPD da invenção é combinada com 2mEPSPS e bar.
[0095] Dentre as sequências de DNA que codificam proteínas que se referem a propriedades de tolerância a insetos, deve se mencionar especialmente as proteínas Bt amplamente descrita na literatura e bem conhecidas dos versados na técnica. Devem ser também mencionadas proteínas extraídas de bactérias tais como Photorhabdus (WO 97/17432 e WO 98/08932).
[0096] Dentre tais sequências de DNA que codificam proteína de interesse que conferem propriedades inéditas de tolerância a insetos, deve-se mencionar mais especialmente as proteínas Bt Cry ou VIP amplamente descritas na literatura e bem conhecidas dos versados na técnica. Estas incluem a proteína Cry1F ou híbridos derivados de proteína Cry1F (tais como as proteínas híbridas Cri1A-Cri1F descritas em US 6.326.169; US 6.281.016; US 6.218.188, ou seus fragmentos tóxicos), as proteínas do tipo Cri1A ou seus fragmentos tóxicos, de preferência a proteína Cry1Ac ou híbridos derivados da proteína Cry1Ac (tais como a proteína híbrida Cri1Ab-Cri1Ac descrita em US 5.880.275) ou a proteína Cri1Ab ou Bt2 ou fragmentos inseticidas seus conforme descrito em EP451878, as proteínas Cry2Ae, Cry2Af ou Cry2Ag conforme descrito em WO02/057664 ou fragmentos tóxicos seus, a proteína Cri1A.105 descrita em WO 2007/140256 (SEQ ID No: 7) ou um fragmento tóxico seu, a proteína VIP3Aal9 de acesso NCBI ABG20428, a proteína VIP3Aa20 de acesso NCBI ABG20429 (SEQ ID NO: 2 em WO 2007/142840), as proteínas VIP3A produzidas nos eventos em algodão COT202 ou COT203 (WO 2005/054479 e WO 2005/054480, respectivamente), as proteínas Cry conforme descrito em WO 01/47952, a proteína VIP3Aa ou um fragmento tóxico seu conforme descrito em Estruch et al. (1996), Proc Natl Acad Sci U S A. 28;93(11): 5389-94 e US 6.291.156, as proteínas inseticidas de Xenorhabdus (conforme descrito em WO98/50427), Serratia (especialmente de S. entomophila) ou cepas de espécies de Photorhabdus, tais como proteínas Tc de Photorhabdus conforme descrito em WO98/08932 (tais como Waterfield et al., 2001, Appl Environ Microbiol. 67(11): 5017-24; Ffrench-Constant e Bowen, 2000, Cell Mol Life Sci.; 57(5): 828-33). Também são incluídos no presente invenção variantes ou mutantes de qualquer uma destas proteínas que diferem em alguns aminoácidos (1-10, de preferência 1-5) de qualquer uma das sequências acima, especialmente da sequência do seu fragmento tóxico, ou que são fundidas a um peptídeo de trânsito tal como um peptídeo de trânsito de plastídeo ou uma outra proteína ou peptídeo.
[0097] Em diversas modalidades, a sequência de HPPD da invenção pode ser combinada em plantas com um ou mais genes que conferem uma característica desejável, tal como tolerância a herbicida, tolerância a insetos, tolerância a seca, controle de nematódeos, eficiência do uso da água, eficiência do uso de nitrogênio, um maior valor nutricional, resistência a doenças, uma melhor fotossíntese, uma melhor qualidade de fibra, tolerância a tensão, uma melhor reprodução e semelhantes.
[0098] Eventos transgênicos especialmente úteis e que podem ser combinados com os genes da presente invenção em plantas da mesma espécie (tal como por cruzamento ou por retransformação de uma planta que contém um outro evento transgênico com um gene quimérico da invenção) incluem Evento 531/PV-GHBK04 (algodão, controle de insetos, descrito em WO2002/040677), Evento 1143-14A (algodão, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 06/128569); Evento 1143-5 IB (algodão, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 06/128570); Evento 1445 (algodão, tolerância a herbicida, não depositado, descrito em US-A 2002-120964 ou WO 02/034946 Evento 17053 (arroz, tolerância a herbicida, depositado como PTA-9843, descrito em WO 10/117737); Evento 17314 (arroz, tolerância a herbicida, depositado como PTA-9844, descrito em WO 10/117735); Evento 281-24-236 (algodão, controle de insetos-tolerância a herbicida, depositado como PTA-6233, descrito em WO 05/103266 ou US-A 2005-216969); Evento 3006210-23 (algodão, controle de insetos-tolerância a herbicida, depositado como PTA-6233, descrito em US-A 2007143876 ou WO 05/103266); Evento 3272 (milho, característica de qualidade, depositado como PTA-9972, descrito em WO 06/098952 ou US-A 2006-230473); Evento 33391 (trigo, tolerância a herbicida, depositado como PTA-2347, descrito em WO2002/027004), Evento 40416 (milho, controle de insetos-tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA- 11508, descrito em WO 11/075593); Evento 43A47 (milho, controle de insetos-tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-11509, descrito em WO 11/075595); Evento 5307 (milho, controle de insetos, depositado como ATCC PTA-9561, descrito em WO 10/077816); Evento ASR-368 (Agrostis, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-4816, descrito em US-A 2006-162007 ou WO 04/053062); Evento B16 (milho, tolerância a herbicida, não depositado, descrito em US-A 2003-126634); Evento BPS-CV127-9 (soja, tolerância a herbicida, depositado como NCIMB No. 41603, descrito em WO 10/080829); Evento BLR1 (colza, restauração da esterilidade masculina, depositado como NCIMB 41193, descrito em WO2005/074671), Evento CE43-67B (algodão, controle de insetos, depositado como DSM CC2724, descrito em US-A 2009-217423 ou WO 06/128573); Evento CE44-69D (algodão, controle de insetos, não depositado, descrito em US-A 2010-0024077); Evento CE44-69D (algodão, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 06/128571); Evento CE46-02A (algodão, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 06/128572); Evento COT102 (algodão, controle de insetos, não depositado, descrito em US-A 2006-130175 ou WO 04/039986); Evento COT202 (algodão, controle de insetos, não depositado, descrito em US-A 2007-067868 ou WO 05/054479); Evento COT203 (algodão, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 05/054480); Evento DAS21606- 3/1606 (soja, tolerância a herbicida, depositado como PTA- 11028, descrito em WO2012/033794), Evento DAS40278 (milho, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-10244, descrito em WO 11/022469); Evento DAS-44406- 6/pDAB8264.44.06.1 (soja, tolerância a herbicida, depositado como PTA-11336, descrito em WO2012/075426), Evento DAS-14536-7/pDAB8291.45.36.2 (soja, tolerância a herbicida, depositado como PTA-11335, descrito em WO2012/075429), Evento DAS-59122-7 (milho, controle de insetos-tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA 11384, descrito em US-A 2006-070139); Evento DAS-59132 (milho, controle de insetos-tolerância a herbicidas, não depositado, descrito em WO 09/100188); Evento DAS68416 (soja, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA- 10442, descrito em WO 11/066384 ou WO 11/066360); Evento DP-098140-6 (milho, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-8296, descrito em US-A 2009-137395 ou WO 08/112019); Evento DP-305423-1 (soja, característica de qualidade, não depositado, descrito em US-A 2008-312082 ou WO 08/054747); Evento DP-32138-1 (milho, sistema de hibridização, depositado como ATCC PTA-9158, descrito em US-A 2009-0210970 ou WO 09/103049); Evento DP-356043-5 (soja, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA- 8287, descrito em US-A 2010-0184079 ou WO 08/002872); Evento EE-1 (berinjela, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 07/091277); Evento FI117 (milho, tolerância a herbicida, depositado como ATCC 209031, descrito em US-A 2006-059581 ou WO 98/044140); Evento FG72 (soja, tolerância a herbicida, depositado como PTA-11041, descrito em WO2011/063413), Evento GA21 (milho, tolerância a herbicida, depositado como ATCC 209033, descrito em US-A 2005-086719 ou WO 98/044140); Evento GG25 (milho, tolerância a herbicida, depositado como ATCC 209032, descrito em US-A 2005-188434 ou WO 98/044140); Evento GHB119 (algodão, controle de insetos-tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-8398, descrito em WO 08/151780); Evento GHB614 (algodão, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-6878, descrito em US-A 2010-050282 ou WO 07/017186); Evento GJ11 (milho, tolerância a herbicida, depositado como ATCC 209030, descrito em US-A 2005-188434 ou WO 98/044140); Evento GM RZ13 (beterraba açucareira, resistência a vírus, depositado como NCIMB- 41601, descrito em WO 10/076212); Evento H7-1 (beterraba açucareira, tolerância a herbicida, depositado como NCIMB 41158 ou NCIMB 41159, descrito em US-A 2004-172669 ou WO 04/074492); Evento JOPLIN1 (trigo, tolerância a doenças, não depositado, descrito em US-A 2008-064032); Evento LL27 (soja, tolerância a herbicida, depositado como NCIMB41658, descrito em WO 06/108674 ou US-A 2008-320616); Evento LL55 (soja, tolerância a herbicida, depositado como NCIMB 41660, descrito em WO 06/108675 ou US-A 2008-196127); Evento LLcotton25 (algodão, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-3343, descrito em WO 03/013224 ou US-A 2003097687); Evento LLRICE06 (arroz, tolerância a herbicida, depositado como ATCC 203353, descrito em US 6.468.747 ou WO 00/026345); Evento LLrice62 (arroz, tolerância a herbicida, depositado como ATCC 203352, descrito em WO2000/026345), Evento LLRICE601 (arroz, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-2600, descrito em US-A 2008-2289060 ou WO 00/026356); Evento LY038 (milho, característica de qualidade, depositado como ATCC PTA-5623, descrito em US-A 2007-028322 ou WO 05/061720); Evento MIR162 (milho, controle de insetos, depositado como PTA-8166, descrito em US-A 2009-300784 ou WO 07/142840); Evento MIR604 (milho, controle de insetos, não depositado, descrito em US-A 2008167456 ou WO 05/103301); Evento MON15985 (algodão, controle de insetos, depositado como ATCC PTA-2516, descrito em US-A 2004-250317 ou WO 02/100163); Evento MON810 (milho, controle de insetos, não depositado, descrito em US-A 2002 102582); Evento MON863 (milho, controle de insetos, depositado como ATCC PTA-2605, descrito em WO 04/011601 ou US-A 2006-095986); Evento MON87427 (milho, controle de polinização, depositado como ATCC PTA-7899, descrito em WO 11/062904); Evento MON87460 (milho, tolerância a tensão, depositado como ATCC PTA-8910, descrito em WO 09/111263 ou US-A 2011-0138504); Evento MON87701 (soja, controle de insetos, depositado como ATCC PTA-8194, descrito em US-A 2009-130071 ou WO 09/064652); Evento MON87705 (soja, característica de qualidade-tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-9241, descrito em US-A 20100080887 ou WO 10/037016); Evento MON87708 (soja, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-9670, descrito em WO 11/034704); Evento MON87712 (soja, rendimento, depositado como PTA-10296, descrito em WO2012/051199), Evento MON87754 (soja, característica de qualidade, depositado como ATCC PTA-9385, descrito em WO 10/024976); Evento MON87769 (soja, característica de qualidade, depositado como ATCC PTA-8911, descrito em US-A 2011-0067141 ou WO 09/102873); Evento MON88017 (milho, controle de insetos-tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-5582, descrito em US-A 2008-028482 ou WO 05/059103); Evento MON88913 (algodão, tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-4854, descrito em WO 04/072235 ou US-A 2006-059590); Evento MON88302 (colza, tolerância a herbicida, depositado como PTA-10955, descrito em WO2011/153186), Evento MON88701 (algodão, tolerância a herbicida, depositado como PTA- 11754, descrito em WO2012/134808), Evento MON89034 (milho, controle de insetos, depositado como ATCC PTA-7455, descrito em WO 07/140256 ou US-A 2008-260932); Evento MON89788 (soja, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-6708, descrito em US-A 2006-282915 ou WO 06/130436); Evento MSI 1 (colza, controle de polinização- tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-850 ou PTA-2485, descrito em WO 01/031042); Evento MS8 (colza, controle de polinização-tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-730, descrito em WO 01/041558 ou US-A 2003188347); Evento NK603 (milho, tolerância a herbicida, depositado como ATCC PTA-2478, descrito em US-A 2007292854); Evento PE-7 (arroz, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 08/114282); Evento RF3 (colza, controle de polinização-tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-730, descrito em WO 01/041558 ou US-A 2003-188347); Evento RT73 (colza, tolerância a herbicida, não depositado, descrito em WO 02/036831 ou US-A 2008-070260); Evento SYHT0H2/SYN-000H2-5 (soja, tolerância a herbicida, depositado como PTA-11226, descrito em WO2012/082548), Evento T227-1 (beterraba açucareira, tolerância a herbicida, não depositado, descrito em WO 02/44407 ou US-A 2009-265817); Evento T25 (milho, tolerância a herbicida, não depositado, descrito em US-A 2001-029014 ou WO 01/051654); Evento T304-40 (algodão, controle de insetos- tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-8171, descrito em US-A 2010-077501 ou WO 08/122406); Evento T342- 142 (algodão, controle de insetos, não depositado, descrito em WO 06/128568); Evento TC1507 (milho, controle de insetos-tolerância a herbicidas, não depositado, descrito em US-A 2005-039226 ou WO 04/099447); Evento VIP1034 (milho, controle de insetos-tolerância a herbicidas, depositado como ATCC PTA-3925., descrito em WO 03/052073), Evento 32316 (milho, controle de insetos-tolerância a herbicidas, depositado como PTA-11507, descrito em WO 11/084632), Evento 4114 (milho, controle de insetos- tolerância a herbicidas, depositado como PTA-11506, descrito em WO 11/084621), Evento EE-GM3/FG72 (soja, tolerância a herbicida, número de acesso ATCC PTA-11041, WO2011/063413A2), Evento DAS-68416-4 (soja, tolerância a herbicida, número de acesso ATCC PTA-10442, WO2011/066360A1), Evento DAS-68416-4 (soja, tolerância a herbicida, número de acesso ATCC PTA-10442, WO2011/066384A1), Evento DP-040416-8 (milho, controle de insetos, número de acesso ATCC PTA-11508, WO2011/075593A1), Evento DP-043A47-3 (milho, controle de insetos, número de acesso ATCC PTA-11509, WO2011/075595A1), Evento DP-004114-3 (milho, controle de insetos, número de acesso ATCC PTA- 11506, WO2011/084621A1), Evento DP-032316-8 (milho, controle de insetos, número de acesso ATCC PTA-11507, WO2011/084632A1), Evento MON-88302-9 (colza, tolerância a herbicida, número de acesso ATCC PTA- 10955, WO2011/153186A1), Evento DAS-21606-3 (soja, tolerância a herbicida, No. de Acesso ATCC PTA-11028, WO2012/033794A2), Evento MON-87712-4 (soja, característica de qualidade, número de acesso ATCC. PTA-10296, WO2012/051199A2), Evento DAS-44406-6 (soja, tolerância empilhada a herbicidas, número de acesso ATCC. PTA-11336, WO2012/075426A1), Evento DAS-14536-7 (soja, tolerância empilhada a herbicidas, número de acesso ATCC. PTA-11335, WO2012/075429A1), Evento SYN-000H2-5 (soja, tolerância a herbicida, número de acesso ATCC. PTA-11226, WO2012/082548A2), Evento DP-061061-7 (colza, tolerância a herbicida, nenhum número de depósito disponível, WO2012071039A1), Evento DP-073496-4 (colza, tolerância a herbicida, nenhum número de depósito disponível, US2012131692), Evento 8264.44.06.1 (soja, tolerância empilhada a herbicidas, No. de acesso PTA- 11336, WO2012075426A2), Evento 8291.45.36.2 (soja, tolerância empilhada a herbicidas, No. de acesso PTA-11335, WO2012075429A2), Evento SYHT0H2 (soja, No. de acesso ATCC. PTA-11226, WO2012/082548A2), Evento MON88701 (algodão, número de acesso ATCC PTA-11754, WO2012/134808A1), Evento KK179-2 (alfafa, número de acesso ATCC PTA-11833, WO2013003558A1), Evento pDAB8264.42.32.1 (soja, tolerância empilhada a herbicidas, número de acesso ATCC PTA-11993, WO2013010094A1), Evento MZDT09Y (milho, número de acesso ATCC PTA-13025, WO2013012775A1).
E. Construções de Polinucleotídeos
[0099] Os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos de HPPD da presente invenção podem ser modificados para se obter ou melhorar a expressão em células vegetais. Os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos identificados no presente documento podem ser providos em cassetes de expressão na planta de interesse. Um “cassete de expressão de planta” inclui uma construção de DNA, incluindo uma construção de DNA recombinante, que é capaz de resultar na expressão de um polinucleotídeo em uma célula vegetal. O cassete pode incluir na direção 5’-3’ da transcrição, uma região de iniciação transcricional (isto é, promotor, especialmente um promotor heterólogo), ligado operacionalmente a um ou mais polinucleotídeos de interesse e/ou uma região de tradução e de terminação transcricional (isto é, região de terminação) funcional em plantas.; O cassete pode adicionalmente conter pelo menos um polinucleotídeo adicional a ser introduzido no organismo, tal como um gene marcador selecionável. Alternativamente, o(s) polinucleotídeos(s) adicional (ais) podem ser providos nos cassetes de expressão múltiplas. Tal cassete de expressão é dotado com uma multiplicidade de sítios de restrição para a inserção do(s) polinucleotídeo(s) para se encontrar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras.
[00100] Em uma outra modalidade, a presente invenção se refere a um gene quimérico que compreende uma sequência de codificação que compreende heterólogos do ácido nucleico da invenção ligado operacionalmente a um promotor expressável em plantas e opcionalmente uma região de terminação de transcrição e poliadenilação. “Heterólogo” em geral se refere ao polinucleotídeo ou ao polipeptídeo que não é endógeno à célula ou não é endógeno ao local no genoma nativo em que está presente e que foi acrescentado à célula por infecção transfecção, microinjeção, eletroporação, microprojeção ou semelhante. “Ligado operacionalmente” significa uma ligação funcional entre dois polinucleotídeos. Quando um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de DNA, por exemplo, a sequência de promotor inicia e medeia a transcrição da sequência de DNA. É fato reconhecido que polinucleotídeos operacionalmente ligados podem ser contíguos ou não, e, quando usados para referência à junção de duas regiões de codificação de polipeptídeos, os polipeptídeos são expressos na mesma matriz de leitura.
[00101] O promotor pode ser qualquer sequência de polinucleotídeos que apresenta uma atividade transcricional nas células vegetais, partes de plantas ou plantas escolhidas. O promotor pode ser nativo ou análogo, ou estranho ou heterólogo, à planta hospedeira e/ou à sequência de DNA da invenção. Nos casos em que o promotor for “nativo” ou “análogo” à planta hospedeira, pretende-se que o promotor se encontre na planta nativa na qual o promotor é introduzido. Nos casos em que o promotor for “estranho” ou “heterólogo” à sequência de DNA da invenção, pretende-se que o promotor não seja um promotor nativo ou ocorrendo naturalmente para a sequência de DNA operacionalmente ligada da invenção. O promotor de ocorrência natural pode ser composto por porções de diversos promotores de ocorrência natural, ou pode ser parcial ou totalmente sintético. As instruções para a projeção de promotores são providas por estudos da estrutura de promoções, tais como o de Harley e Reynolds (1987) Nucleic Acids Res. 15: 2343-2361. Além disso, a localização do promotor em relação ao início da transcrição pode ser otimizada. Veja, por exemplo, Roberts et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 760-764. Muitos promotores adequados para uso em plantas são conhecidos na técnica.
[00102] Os promotores constitutivos adequados para uso em plantas incluem, por exemplo: os promotores provenientes de vírus de plantas, tais como o promotor do caulimovirus de faixa clorótica do amendoim (PC1SV) (patente U.S. No. 5.850.019); o promotor 35S do vírus do mosaico da couve flor (CaMV) (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812); promotores de genes de metiltransferase do vírus de Clorella (patente U.S. No. 5.563.328) e o promotor de transcrição de comprimento total proveniente do vírus do mosaico de escrofulária (FMV) (patente U.S. No. 5.378.619); os promotores de tais cones como actina do arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171 e patente U.S. 5.641.876); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3: 2723-2730 e patente U.S. 5.510.474); histona H3 do milho (Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231: 276-285 e Atanassova et al. (1992) Plant J. 2(3): 291-300); ALS3 de Brassica napus (pedido de PCT WO 97/41228); um gene de subunidade pequena da ribulose-biscarboxilase/oxigenase (RuBisCO) vegetal; o circovírus (AU 689 311) ou o vírus do mosaico de veia de mandioca (CsVMV, US 7.053.205); e promotores de diversos genes de Agrobacterium (veja a patente U.S. Nos. 4.771.002; 5.102.796; 5.182.200; e 5.428.147).
[00103] Os promotores induzíveis para uso em plantas incluem: o promotor do sistema ACE1 que responde ao cobre (Mett et al. (1993) PNAS 90: 4567-4571); o promotor do gene In2 do milho que responde a fitoprotetores de herbicida de benzeno-sulfonamida (Hershey et al. (1991) Mol. Gen. Genetics 227: 229-237 e Gatz et al. (1994) Mol. Gen. Genetics 243: 32-38); e o promotor do repressor Tet repressor de Tn10 (Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227: 229-237). Um outro promotor induzível para uso em plantas é aquele que responde a um agente indutor ao qual as plantas não respondem normalmente. Um promotor exemplar induzível deste tipo é o promotor induzível de um gene de hormônio esteróide, cuja atividade transcricional é induzida por um hormônio glicocorticosteróide (Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10421) ou o recente pedido de um ativador de transcrição quimérico, XVE, para uso em um sistema de expressão em planta induzível com base em receptor de estrogênio ativado por estradiol (Zuo et al. (2000) Plant J., 24: 265-273). Outros promotores induzíveis para uso em plantas são descritos em EP 332104, PCT WO 93/21334 e PCT WO 97/06269 que são integralmente incorporadas ao presente documento a título de referência. Podem ser também usados promotores compostos de porções de outros promotores e promotores total ou parcialmente sintéticos. Veja, por exemplo, Ni et al. (1995) Plant J. 7: 661-676 e PCT WO 95/14098 descrevendo tais promotores para uso em plantas.
[00104] Em uma modalidade da presente invenção, uma sequência de promotor específica para regiões ou tecidos vegetais específicas podem ser usadas para expressar as proteínas da invenção, tais como promotores específicos para sementes (Datla, R. et al., 1997, Biotechnology Ann. Rev. 3, 269-296), especialmente o promotor de napina (EP 255 378 Al), o promotor de faseolina, o promotor de glutenina, o promotor de heliantinina (WO 92/17580), o promotor de albumina (WO 98/45460), o promotor de oleosina (WO 98/45461), o promotor SAT1 ou o promotor SAT3 (PCT/US98/06978).
[00105] Pode se também fazer uso de um promotor induzível vantajosamente selecionado da fenilalanina amônia liase (PAL), HMG-CoA reductase (HMG), quitinase, glucanase, inibidor de proteinase (PI), gene da família de PR1, nopalina sintase (nos) e promotores de vspB (US 5 670 349, Tabela 3), o promotor HMG2 (US 5 670 349), promotor da beta-galactosidase da maçã (ABG1) e o promotor de aminociclopropano carboxilato sintase da maçã (ACC sintase) (WO 98/45445). Uma multiplicidade de promotores pode ser usada nas construções da invenção, inclusive em sucessão.
[00106] O promotor pode incluir, ou ser modificado para incluir, um ou mais elementos intensificadores. Em algumas modalidades, o promotor pode incluir uma multiplicidade de elementos intensificadores. Os promotores que contêm elementos intensificadores proporcionam níveis mais elevados de transcrição em comparação com promotores que não os incluem. Elementos intensificadores adequados para uso em plantas incluem o elemento intensificador PC1SV (patente U.S. No. 5.850.019), o elemento intensificador de CaMV 35S (patente U.S. Nos. 5.106.739 e 5.164.316) e o elemento intensificador de FMV (Maiti et al. (1997) Transgenic Res. 6: 143-156); o ativador de tradução do vírus do mosaico do tabaco (TMV) descrito no pedido WO 87/07644, ou do vírus da gravura do tabaco (TEV) descrito por Carrington & Freed 1990, J. Virol. 64: 1590-1597, por exemplo, ou íntrons tais como o íntron adhl do milho ou o íntron 1 da actina do arroz. Veja também PCT WO 96/23898, WO2012/021794, WO2012/021797, WO2011/084370, e WO2011/028914.
[00107] Frequentemente estas construções podem conter regiões não traduzidas 5’ e 3’. Tais construções podem conter uma “sequência de sinal” ou “sequência líder” para facilitar o transporte traducional ou pós-traducional do peptídeo de interesse para determinadas estruturas intracelulares tais como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplasmático ou aparelho de Golgi, ou para serem secretadas. A construção pode, por exemplo, ser construída para conter um peptídeo de sinal para facilitar a transferência do peptídeo para o retículo endoplasmático. “Sequência de sinal” significa uma sequência que é conhecida como resultando ou suspeita de resultar em transporte de peptídeo contra-traducional ou pós-traducional através da membrana celular. Em eucariontes, isto tipicamente envolve a secreção para dentro do aparelho de Golgi, com alguma glicosilação resultante. “Sequência líder” significa qualquer sequência que, quando traduzida, resulta em uma sequência de aminoácidos suficiente para desencadear o transporte co- traducional da cadeia peptídica a uma organela sub-celular. Deste modo, isto inclui sequências líderes tendo como alvo o transporte e/ou a glicosilação por passagem para o retículo endoplasmático, passagem para vacúolos, plastídeos incluindo cloroplastos, mitocôndrias, e semelhantes. Pode também ser preferível se construir o cassete de expressão da planta para conter um íntron, tal que o RNAm que processa o íntron seja necessário para a expressão.
[00108] “Região 3’ não traduzida” é destinada a um polinucleotídeo localizado a jusante de uma sequência de codificação. As sequência de sinal de poliadenilação e outras sequências que codificam sinais reguladores capazes de afetar a adição de trecho de ácido poliadenílico à extremidade 3’ do precursor de RNAm são regiões 3’ não traduzidas. “Região 5’ não traduzida” significa um polinucleotídeo localizado a montante de uma sequência de codificação.
[00109] Outros elementos não traduzidos a montante ou a jusante incluem intensificadores. Os intensificadores são polinucleotídeos que atuam para aumentar a expressão de uma região de promotor. Os intensificadores são bem conhecidos na técnica e incluem, mas sem limitação, a região intensificadora SV40 e o elemento intensificador 35S.
[00110] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação transcricional, pode ser nativa com a sequência da presente invenção, ou pode ser derivada de uma outra fonte. Regiões de terminação convenientes são disponíveis do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação de octopina sintase e de nopalina sintase. Veja também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639; e pedido de patente européia EP 0 633 317 A1.
[00111] Em um aspecto da invenção, sequências de DNA sintéticas são projetadas para um polipeptídeo dado, tal como os polipeptídeos da invenção. A expressão da matriz de leitura aberta da sequência de DNA sintética em uma célula resulta na produção do polipeptídeo da invenção. As sequências de DNA sintéticas podem ser úteis para simplesmente remover sítios de endonuclease de restrição indesejáveis, para facilitar as estratégias de clonagem de DNA, para alterar ou remover qualquer tendência de códon potencial para alterar ou melhorar o teor de GC, para remover ou alterar matrizes de leitura, e/ou para alterar ou remover sítios de reconhecimento de splicing de íntrons/éxons, sítios de poliadenilação, sequências de Shine-Delgarno, elementos promotores indesejáveis e semelhantes, que podem estar presentes em uma sequência de DNA nativa. É também possível que as sequências de DNA sintéticas possam ser utilizadas para a introdução de outros melhoramentos a uma sequência de DNA, tais como a introdução de uma sequência de íntrons, a criação de uma sequência de DNA que é expressa em forma de uma proteína de fusão para sequências que tem como alvo organelas, tais como peptídeos de trânsito de cloroplastos, peptídeos tendo como alvo apoplastos/vacuolares, ou sequências de peptídeos que resultam na conservação do peptídeo resultante no retículo endoplasmático. Os genes sintéticos podem também ser sintetizados usando códons preferidos para células hospedeiras para uma melhor expressão, ou podem ser sintetizados usando-se códons em uma frequência de uso de códons preferidos de hospedeiras. Veja, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11; patentes U.S. Nos. 6.320.100; 6.075.185; 5.380.831; e 5.436.391, pedidos publicados U.S. Nos. 20040005600 e 20010003849, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498, incorporados ao presente documento a título de referência.
[00112] Em uma modalidade, os polinucleotídeos de interesse são tomados como alvo para os cloroplastos para expressão. Deste modo nos casos em que o polinucleotídeo de interesse não for diretamente inserido no cloroplasto, o cassete de expressão conterá adicionalmente um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de trânsito para direcionar o nucleotídeo de interesse aos cloroplastos. Tais peptídeos de trânsito são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233:478-481.
[00113] Os polinucleotídeos de interesse a serem direcionados ao cloroplasto podem ser otimizados para a expressão no cloroplasto para levar em conta as diferenças em uso de códons entre o núcleo da planta e esta organela. Deste modo os polinucleotídeos de interesse podem ser sintetizados usando códons preferidos por cloroplastos Veja, por exemplo, a patente U.S. No. 5.380.831, incorporada ao presente documento a título de referência.
[00114] Este cassete de expressão de planta pode ser inserido em um vetor de transformação de planta. “Veto de transformação” significa uma molécula de DNA que permite a transformação de uma célula. Tal molécula pode consistir em um o mais cassetes de expressão, e pode ser organizada em mais de uma molécula de DNA vetor. Os vetores binários, por exemplo, são vetores de transformação de planta que utilizam dois vetores de DNA contíguos para codificar todas as funções de ação cis e trans necessárias para a transformação de células das plantas (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5: 446-451). “Vetor” se refere a uma construção de polinucleotídeo projetada para transferência entre células hospedeiras diferentes. “Vetor de expressão” se refere a um vetor que tem a capacidade de incorporar, integrar e expressar sequências heterólogas de DNA ou fragmentos seus em uma célula estranha.
[00115] O vetor de transformação de planta compreende um ou mais vetores de DNA para a obtenção da transformação da planta. É uma prática comum, por exemplo, na técnica a utilização de vetores de transformação de plantas que compreendem mais de um segmento de DNA contíguo. A estes vetores se refere frequentemente na técnica como vetores binários. Os vetores binários assim como vetores com plasmídeos ajudantes são na maioria dos casos usados para a transformação mediada por Agrobacterium, em que o tamanho e a complexidade de segmentos de DNA necessários para se obter uma transformação eficiente são bastante grandes, e é vantajoso se separar funções em moléculas de DNA separadas. Os vetores binários tipicamente contêm um vetor plasmídeo que contém as sequências de ação cis necessárias para a transferência de T-DNA (tal como a margem esquerda e a margem direita), um marcador selecionável que é projetado para ser capaz de expressão em uma célula vegetal e um “polinucleotídeo de interesse” (um polinucleotídeo projetado para ser capaz de expressão de uma célula vegetal para a qual é desejada a geração de plantas transgênicas). Também presentes neste plasmídeo vetor são sequências necessárias para a replicação bacteriana. As sequências de ação cis são dispostas de um modo para permitir a transferência eficiente para as células vegetais e a expressão em seu interior. A sequência marcadora selecionável, por exemplo, e a sequência de interesse estão localizadas entre a borda esquerda e a direita. Frequentemente um segundo plasmídeo vetor contém os fatores de transação que medeiam a transferência de T-DNA de Agrobacterium para as células vegetais. Este plasmídeo frequentemente contém as funções de virulências (genes Vir) que permitem a infecção das células da planta pelo Agrobacterium e a transferência do DNA por clivagem nas sequências de bordas e a transferência de DNA mediada por vir, conforme é compreendido na técnica (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5: 446-451). Diversos tipos de cepas de Agrobacterium (tais como LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) podem ser usados para a transformação da planta. O segundo plasmídeo vetor não é necessário para a introdução de polinucleotídeos em plantas por outros métodos tais como microprojeção, microinjeção, eletroporação, polietileno glicol, etc.
F. Transformação da Planta
[00116] Os métodos da invenção envolvem a introdução de uma construção de nucleotídeo em uma planta. “Introdução” significa apresentar à planta a construção de nucleotídeo de tal modo que a construção ganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não exigem que se use um método especifico para a introdução de uma construção de nucleotídeos a uma planta, somente que a construção de nucleotídeo ganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Os métodos para a introdução das construções de nucleotídeos nas plantas são conhecidos na técnica, incluindo, mas sem limitação, métodos de transformação estável, métodos de transformação temporária e métodos mediados por vírus. Veja, por exemplo, os métodos para a transformação das células vegetais e a regeneração de plantas descritos em: US 4.459.355, US 4.536.475, US 5.464.763, US 5. 177.010, US 5.187.073, EP 267 159 A1, EP 604 662 A1, EP 672 752 A1, US 4.945.050, US 5.036.006, US 5.100.792, US 5.371.014, US 5.478.744, US 5.179.022, US 5.565.346, US 5.484.956, US 5.508.468, US 5.538.877, US 5.554.798, US 5.489.520, US 5.510.318, US 5.204.253, US 5.405.765, EP 442 174 A1, EP 486 233 A1, EP 486 234 A1, EP 539 563 A1, EP 674 725 A1, WO 91/02071, WO 95/06128, e WO2011/095460, sendo cada uma delas incorporada ao presente documento a título de referência, especialmente no tocante aos métodos de transformação descritos nelas.
[00117] Em geral, os métodos de transformação de plantas envolvem a transferência de DNA heterólogo em células de planta alvo (embriões imaturos ou maduros, culturas em suspensão, calos não diferenciados, protoplastos, por exemplo, etc.) seguindo-se uma aplicação de um nível de limiar máximo de seleção apropriado (dependendo do gene marcador selecionável) para recuperar as células da planta transformada de um grupo de massa de células não transformadas. Explantas são tipicamente transferidas para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivadas rotineiramente. Subsequentemente, as células transformadas são diferenciadas em brotos depois de terem sido colocadas no meio de regeneração suplementado com um nível de limiar máximo de agente de seleção. Os brotos são então transferidos para um meio de enraizamento seletivo para a recuperação de um broto enraizado ou plântula. A plântula transgênica então cresce em plantas maduras que produzem sementes férteis (Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750, por exemplo). Explantas são tipicamente transferidas para um suprimento fresco do mesmo meio e são cultivadas rotineiramente. Uma descrição geral das técnicas e dos métodos para a geração de plantas transgênicas é encontrada em Ayres e Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13: 219-239 e em Bommineni e Jauhar (1997) Maydica 42: 107-120. Como o material transformado contém muitas células, tanto células transformadas como as não-transformadas estão presentes em qualquer fragmento do calo alvo ou tecido ou grupo de células submetido. A capacidade de destruir as células não transformadas e de permitir que as células transformadas possam proliferar resulta em culturas de plantas transformadas. Frequentemente, a capacidade de se remover as células não transformadas é uma limitação à recuperação rápida das células vegetais transformadas e à geração bem sucedida de plantas transformadas. Podem ser usados métodos moleculares e bioquímicos para confirmar a presença do gene heterólogo integrado de interesse no genoma da planta transgênica.
[00118] A geração de plantas transgênicas pode ser conduzida por um de diversos métodos, incluindo, mas, sem limitação, a introdução de DNA heterólogo por Agrobacterium nas células das plantas (transformação mediada por Agrobacterium), o bombardeio de células das plantas com DNA estranho heterólogo aderindo a partículas, e diversos outros métodos não mediados a direcionamento a partículas (Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6: 271282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750; Ayres e Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13: 219-239; Bommineni e Jauhar (1997) Maydica 42: 107-120, por exemplo) para a transferência de DNA.
[00119] Os métodos para a transformação de cloroplastos são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526 8530; Svab e Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917; Svab e Maliga (1993) EMBO J. 12: 601-606. O método se apoia no fornecimento de partícula por pistola de DNA contendo um marcador selecionável e no direcionamento do DNA ao genoma do plastídeo através de recombinação homóloga. Adicionalmente a transformação de plastídeo pode ser obtida por transativação e um transgene portado por plastídeo silencioso por expressão preferida por tecido de uma RNA polimerase codificada nuclear e direcionada a plastídeo. Tal sistema foi relatado em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305.
[00120] As células que tiverem sido transformadas podem ser cultivadas até se tornarem plantas de acordo com modos convencionais. Veja, por exemplo, Cormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas podem então ser cultivadas, e então ou polinizadas com a mesma cepa transformada ou com diferentes cepas e o híbrido resultante que tiver uma expressão constitutiva da característica fenotípica desejada será identificado. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para ser assegurado que a expressão da característica fenotípica desejada é mantida e herdada de modo estável, sendo então as sementes colhidas para ser assegurado que a expressão da característica fenotípica desejada foi obtida. Deste modo, a presente invenção proporciona sementes transformadas (a que se refere também como “sementes transgênicas”) que tem uma construção de nucleotídeo da invenção, um cassete de expressão da invenção, por exemplo, incorporado estavelmente no seu genoma. Em diversas modalidades, a semente pode ser revestida com pelo menos um fungicida e/ou pelo menos um inseticida, pelo menos um herbicida e/ou pelo menos um fitoprotetor, ou com qualquer combinação deles.
G. Avaliação da Transformação da Planta
[00121] Depois da introdução de DNA estranho heterólogo em células de plantas, a transformação ou a integração do gene heterólogo no genoma da planta é confirmado por diversos métodos tais como a análise de ácidos nucleicos, proteínas e metabólitos associados com o gene integrado.
[00122] A análise por PCR é um método rápido para se selecionar células, tecido ou brotos transformados, em busca da presença do gene incorporado em um estágio mais precoce antes do seu transplante no solo (Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)). A PCR é conduzida usando-se primers de oligonucleotídeos específicos ao gene de interesse ou um fundo de vetor de Agrobacterium etc.
[00123] A transformação da planta pode ser confirmada por análise por Southern blot do DNA genômico (Sambrook e Russell (2001) acima). Em geral, extrai-se o DNA total do transformante digere-se com enzimas de restrição adequadas, fraciona-se em um gel de agarose e transfere-se para uma membrana de nitrocelulose ou náilon. A membrana ou “blot” pode então ser sondada com um fragmento de DNA de alvo 32P rádio-rotulado para confirmar a integração do gene introduzido no genoma da planta de acordo com técnicas padrão (Sambrook e Russell, 2001, acima).
[00124] Na análise Northern, o RNA é isolado dos tecidos específicos de transformante, fracionados em gel de agarose aldeído fórmico, e dispostos sobre um filtro de náilon de acordo com os procedimentos padrão que são rotineiramente usados na técnica (Sambrook e Russell (2001) acima). A expressão do RNA codificado por sequências de nucleotídeo da invenção é então testada, hibridizando-se o filtro com uma sonda radioativa derivada de um GDC por métodos conhecidos na técnica (Sambrook e Russell (2001) acima).
[00125] Western blot, ELISA, teste de fluxo lateral e ensaios bioquímicos e semelhantes podem ser conduzidos nas plantas transgênicas para se determinar a presença de proteína codificada pelo gene de tolerância a herbicida por procedimentos padrão (Sambrook e Russell (2001) acima) usando-se anticorpos que se ligam a um ou mais epítopos presentes na proteína de tolerância a herbicida.
[00126] Em um aspecto da invenção, os genes de HPPD descritos no presente documento são úteis como marcadores para se avaliar a transformação de células bacterianas ou vegetais.
H. Uso como um marcador para transformação
[00127] A invenção também se refere ao uso, em um método para a transformação de plantas, de um ácido nucleico que codifica uma HPPD de acordo com a invenção como um gene marcador ou como uma sequência de codificação que torna possível se conferir a uma planta tolerância a herbicidas que são inibidores de HPPD e o uso de um ou mais inibidor(es) de HPPD a plantas que compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica uma HPPD de acordo com a invenção. Veja, por exemplo, a patente U.S. 6.791.014, que é integralmente incorporada ao presente documento a título de referência.
[00128] Nesta modalidade, um inibidor de HPPD pode ser introduzido no meio de cultura das células de plantas competentes, de modo a descorar estas células antes da etapa de transformação. As células competentes descoradas são então transformadas com o gene para tolerância a inibidores de HPPD, como um marcador de seleção, e as células transformadas que tiverem integrado este marcador de seleção no seu genoma se tornam verdes, permitindo que sejam selecionadas. Tal processo torna possível se reduzir o tempo necessário para a seleção das células transformadas.
[00129] Assim, uma modalidade da presente invenção consiste em um método para a transformação das células de plantas por introdução de um gene heterólogo nas células das plantas com um gene para tolerância a inibidores de HPPD como marcadores de seleção, compreendendo o método a preparação e a cultivo de células de planta competentes capazes de receber o gene heterólogo em um meio adequado e de introduzir uma quantidade adequada de inibidor de HPPD no meio de cultura adequado das células vegetais competentes. As células competentes são então transformadas com o gene heterólogo e com o marcador de seleção, e as células transformadas compreendendo o gene heterólogo são cultivadas em um meio adequado, sendo dele selecionados os transformantes. As células transformadas podem então ser regeneradas tornando-se uma planta transformada fértil.
I. Plantas e Partes de Plantas
[00130] “Planta” significa plantas integrais, órgãos vegetais (tais como folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células de plantas, propágulos, embriões e progênie das mesmas. As células das plantas podem ser diferenciadas e indiferenciadas (tais como células do calo, células da cultura em suspensão, protoplastos, células das folhas, células da raiz, células do floema, pólen). A presente invenção pode ser usada para a introdução de polinucleotídeos em qualquer espécie vegetal, incluindo, sem limitação, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas sem limitação, milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentões, batata, algodão, arroz, soja, beterraba açucareira, cana de açúcar, tabaco, cevada, e colza, Brassica sp., alfafa, centeio, painço, cártamo, amendoim, batata doce, mandioca, café, coco, abacaxi, árvores cítricas, cacau, chá, banana, abacate, figo, goiaba, manga, oliva, mamão, caju, macadâmia, amêndoa, aveia, hortaliças, ornamentais, e coníferas.
[00131] As hortaliças incluem, mas sem limitação, tomates, alface, vagens, favas, ervilhas e membros do gênero Curcumis tais como pepino, cantalupo, e melão. As ornamentais incluem, mas sem limitação, azaléia, hortênsias, hibisco, rosas, tulipas, narcisos, petúnias, cravos, bico de papagaio e crisântemo. Plantas de cultura são também interessantes, incluindo, por exemplo, milho, sorgo, trigo, girassol, tomates, crucíferas, pimentões, batata, algodão, arroz, soja, beterraba açucareira, cana de açúcar, tabaco, cevada, colza etc.
[00132] A presente invenção é adequada para qualquer membro da família de plantas monocotiledôneas incluindo, mas sem limitação, milho, arroz, cevada, aveia, trigo, sorgo, centeio, cana de açúcar, abacaxi, inhame, cebola, banana, coco e tâmaras.
J. Métodos para aumentar o rendimento das plantas
[00133] São propostos métodos para aumentar o rendimento de plantas. Os métodos compreendem prover uma planta que compreende, ou a introdução em uma planta ou célula de planta, um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma HPPD da invenção, o cultivo da planta ou de uma semente dela em um campo e a produção de uma colheita a partir destas plantas ou sementes. Conforme definido no presente documento, o “rendimento” da planta se refere à qualidade ou à quantidade de biomassa produzia pela planta. “Biomassa” significa qualquer produto medido da pla O aumento do rendimento da planta tem diversas aplicações comerciais. O aumento da biomassa folhosa da planta, por exemplo, pode aumentar o rendimento de hortaliças folhosas para o consumo humano o animal. Adicionalmente, o aumento da biomassa folhosa pode ser usado para aumentar a produção de produtos farmacêuticos ou industriais derivados de plantas. Um aumento em rendimento pode compreender qualquer aumento estatisticamente significativo, incluindo, mas sem limitação, pelo menos um aumento de 1%, pelo menos um aumento de 3%, pelo menos um aumento de 5%, pelo menos um aumento de 10%, pelo menos um aumento de 20%, pelo menos de 30%, pelo menos de 50%, pelo menos de 70%, pelo menos de 100% ou um aumento maior.
[00134] Em métodos específicos, a planta compreendendo uma sequência de HPPD da invenção é tratada com uma concentração efetiva de um herbicida de HPPD, tais como um ou mais herbicida(s) inibidor(es) de HPPD selecionado(s) do grupo que consiste em herbicidas inibidores de HPPD da classe de N-(1,2,5-oxadiazol-3- il)benzamidas, N-(tetrazol-4-il)- ou N-(triazol-3- il)arilcarboxamidas, tais como 2-cloro-3-etóxi-4- (metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida e 2- cloro-3-(metoximetil)-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida, tricetonas, tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, da classe de isoxazóis tais como isoxaflutol, ou da classe de pirazolinatos, tais como pirassulfotol e topramezona, especialmente selecionado de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol, e mesotriona, resultando a aplicação do herbicida em um rendimento maior das plantas.
[00135] São também propostos métodos para se conferir tolerância a herbicida em uma planta ou parte de uma planta. Em tais métodos, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma HPPD da invenção é introduzida na planta, resultando a expressão do polinucleotídeo em uma tolerância a herbicidas inibidores de HPPD. As plantas produzidas por este método podem ser tratadas com uma concentração efetiva de um herbicida (tal como um ou mais herbicida(s) inibidor(es) de HPPD selecionado(s) do grupo que consiste em herbicidas inibidores de HPPD da classe de N-(1,2,5- oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(tetrazol-4-il)- ou N- (triazol-3-il)arilcarboxamidas, tais como 2-cloro-3-etóxi- 4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il) benzamida e 2-Cloro-3-(metoximetil)-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida, tricetonas, tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, da classe de isoxazóis tais como isoxaflutol, ou da classe de pirazolinatos, tais como pirassulfotol e topramezona, especialmente selecionados de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol, e mesotriona) e apresentam uma maior tolerância ao herbicida. Uma “concentração efetiva” de um herbicida nesta aplicação consiste em uma quantidade suficiente para retardar ou interromper o crescimento de plantas ou de partes de plantas que não são naturalmente tolerantes ou são tornadas tolerantes ao herbicida.
K. Método de controle de pragas vegetais em um campo
[00136] A presente invenção, portanto, também se refere a um método de controle de plantas indesejáveis ou para regular o crescimento de plantas em culturas de plantas que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica uma HPPD de acordo com a invenção, sendo um ou mais herbicida(s) inibidor(es) de HPPD, tal como, por exemplo, um ou mais herbicida(s) inibidor(es) de HPPD selecionado(s) da classe de N-(1,2,5-oxadiazol-3- il)benzamidas, N-(tetrazol-4-il)- ou N-(triazol-3- il)arilcarboxamidas, tais como 2-cloro-3-etóxi-4- (metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida e 2- cloro-3-(metoximetil)-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida, tricetonas, tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, da classe de isoxazóis tais como isoxaflutol, ou da classe de pirazolinatos, tais como pirassulfotol e topramezona, especialmente selecionados de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol, ou mesotriona, são aplicados às plantas (plantas nocivas tais como invasoras monocotiledôneas ou dicotiledôneas, por exemplo, ou plantas cultivadas indesejáveis), às sementes (a grãos, sementes ou propágulos vegetativos tais como tubérculo ou partes com brotos com gemas, por exemplo, à área em que as plantas crescem (a área sendo cultivada, por exemplo). Dentro deste contexto, uma concentração efetiva de um ou mais herbicida(s) inibidor(es) de HPPD, um ou mais herbicidas inibidores de HPPD selecionados, por exemplo, do grupo que consiste em herbicidas inibidores de HPPD da classe de N- (1,2,5-oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(tetrazol-4-il)- ou N- (triazol-3-il)arilcarboxamidas, tais como 2-cloro-3-etóxi- 4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida e 2-Cloro-3-(metoximetil)-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida, tricetonas, tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, da classe de isoxazóis tais como isoxaflutol, ou da classe de pirazolinatos, tais como pirassulfotol e topramezona, especialmente selecionados de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol, e mesotriona, podem ser aplicados no pré-plantio, por exemplo (se for apropriado também por incorporação ao solo), na pré- emergência ou na pós-emergência e podem ser combinados com a aplicação de outros herbicidas aos quais a cultura é naturalmente tolerante ou ao qual ele é resistente por meio da expressão de um ou mais transgenes de resistência de outros herbicidas. Veja, por exemplo, a publicação de pedido U.S. No. 2004/0058427 e publicação de pedido PCT No. WO 98/20144. “Concentração efetiva” significa a concentração que controla o crescimento ou a disseminação das invasoras ou de outras plantas não transformadas sem afetar significativamente a planta tolerante a inibidor de HPPD ou semente da sua planta. Os versados na técnica na técnica compreenderão que a aplicação de herbicidas pode assumir muitas formas diferentes e pode ocorrer em diferentes ocasiões antes e/ou durante a semeadura e o processo de crescimento. A aplicação “pré-emergente” se refere a um herbicida que é aplicado a uma área de interesse (um campo ou área de cultivo, por exemplo) antes que a planta possa emergir visivelmente do solo. Uma aplicação “pós-emergente” se refere a um herbicida que é aplicado a uma área depois que uma planta tenha emergido visivelmente do solo. Em alguns casos, os termos “pré- emergente” e “pós-emergente” são usados com referência a uma invasora em uma área de interesse, e em alguns casos estes termos são usados com referência a uma planta cultivada em uma párea de interesse. Quando usado com referência a uma invasora, estes termos podem se aplicar a um tipo especial de invasora ou espécie de invasora que se encontra presente ou que se acredita que esteja presente na área de interesse. A “incorporação pré-plantio” de um herbicida envolve a incorporação de compostos ao solo antes do plantio.
[00137] Portanto, a presente invenção compreende um método de controle de invasoras em um campo que compreende o plantio em um campo de uma planta ou de uma semente sua compreendendo uma HPPD da invenção e a aplicação desta planta ou área que envolve tal planta de uma concentração efetiva de um ou mais herbicidas inibidores de HPPD.
[00138] Em uma modalidade da presente invenção, o campo a ser plantado com plantas (tais como soja, algodão, milho ou trigo plantas, por exemplo) contendo uma sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção pode ser tratado com um herbicida inibidor de HPPD, tal como isoxaflutol (IFT), antes das plantas serem plantadas ou as sementes semeadas, o que limpa o campo das invasoras que são destruídas pelo inibidor de HPPD, permitindo práticas sem aragem, seguidas por plantio ou semeadura das plantas nesse mesmo campo pré-tratado mais tarde (aplicação de queima usando um herbicida inibidor de HPPD). A atividade de IFT também protegerá as plantas emergentes e em crescimento da competição com invasoras nos estágios de crescimento precoces. Quando as plantas tiverem um tamanho determinado, as invasoras tendem a reaparecer, pode ser aplicado glufosinato ou glifosato ou um inibidor de HPPD ou uma mistura de um inibidor de HPPD com um outro herbicida tal como glifosato, como herbicida pós-emergente sobre o topo das plantas, quando tais plantas forem tolerantes a tais herbicidas.
[00139] Em uma outra modalidade da presente invenção, um campo em que foram semeadas sementes contendo uma sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção, pode ser tratado comum herbicida inibidor de HPPD, tal como IFT, antes que as plantas possam emergir mas depois das sementes terem sido semeadas (o campo de ser liberado de invasoras antes da semeadura usando-se outros meios, tipicamente práticas convencionais de lavoura tais como aragem, escarificação ou preparação de leito de semeadura) conservando a atividade residual o campo livre das invasoras destruídas pelo herbicida, de modo que as plantas emergentes e em crescimento não tenham que competir com as invasoras (aplicação de pré-emergência de um herbicida inibidor de HPPD). Quando as plantas tiverem atingido um tamanho determinado, as invasoras tenderão a reaparecer, pode ser aplicado glufosinato ou glifosato, ou um inibidor de HPPD ou uma mistura de um inibidor de HPPD comum outro herbicida tal como glifosato, como herbicida pós-emergente sobre o topo das plantas, quando estas plantas são tolerantes a estes herbicidas.
[00140] Em uma outra modalidade da presente invenção, as plantas contendo uma sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção, podem ser tratadas com um herbicida inibidor de HPPD, sobre o topo das plantas que emergiram das semente que foram semeadas, e que limpa o campo das invasoras eliminadas pelo inibidor de HPPD, podendo a aplicação ser concomitante com o tratamento com o glifosato ou glufosinato (em uma mistura no tanque de pulverização, por exemplo), seguida ou precedida pelo tratamento como glifosato ou glufosinato como herbicida pós-emergente sobre o topo das plantas (aplicação de pós-emergência de um herbicida inibidor de HPPD (com ou sem glifosato)), quando tais plantas são tolerantes a tais herbicidas.
[00141] Exemplos de representantes individuais das invasoras monocotiledôneas e dicotiledôneas que pode ser controladas por um herbicida inibidor de HPPD incluem: - plantas nocivas monocotiledôneas dos gêneros: Aegilops, Agropiron, Agrostis, Alopecurus, Apera, Avena, Brachiaria, Bromus, Cenchrus, Commelina, Cynodon, Cyperus, Dactiloctenium, Digitaria, Echinocloa, Eleocharis, Eleusine, Eragrostis, Eriocloa, Festuca, Fimbristilis, Heteranthera, Imperata, Ischaemum, Leptocloa, Lolium, Monochoria, Panicum, Paspalum, Phalaris, Phleum, Poa, Rottboellia, Sagittaria, Scirpus, Setaria, Sorghum; - invasoras dicotiledôneas dos gêneros: Abutilon, Amaranthus, Ambrosia, Anoda, Anthemis, Aphanes, Artemisia, Atriplex, Bellis, Bidens, Capsella, Carduus, Cassia, Centaurea, Chenopodium, Cirsium, Convolvulus, Datura, Desmodium, Emex, Erysimum, Euphorbia, Galeopsis, Galinsoga, Galium, Hibiscus, Ipomoea, Kochia, Lamium, Lepidium, Lindernia, Matricaria, Mentha, Mercurialis, Mullugo, Myosotis, Papaver, Pharbitis, Plantago, Polygonum, Portulaca, Ranunculus, Raphanus, Rorippa, Rotala, Rumex, Salsola, Senecio, Sesbania, Sida, Sinapis, Solanum, Sonchus, Sfenoclea, Stellaria, Taraxacum, Thlaspi, Trifolium, Urtica, Veronica, Viola, Xanthium.
[00142] Os herbicidas inibidores de HPPD úteis na presente invenção incluindo, mas sem limitação herbicidas inibidores de HPPD da classe de N-(1,2,5- oxadiazol-3-il)benzamidas, N-(tetrazol-4-il)- ou N- (triazol-3-il)arilcarboxamidas, tais como 2-cloro-3-etóxi- 4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H-tetrazol-5-il)benzamida e 2-cloro-3-(metoximetil)-4-(metilsulfonil)-N-(1-metil-1H- tetrazol-5-il)benzamida, tricetonas, tais como tembotriona, sulcotriona e mesotriona, a classe de isoxazóis tais como isoxaflutol, ou da classe de pirazolinatos, tais como pirassulfotol e topramezona, especialmente selecionados de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol, e mesotriona, podem ser formulados de diversos modos, dependendo dos parâmetros biológicos e/ou físico-químicos prevalentes. Exemplos de formulações possíveis são: pós umectáveis (WP), pós hidrossolúveis (SP), concentrados hidrossolúveis, concentrados emulsificáveis (EC), emulsões (EW), tais como emulsões de óleo em água e de água em óleo, soluções pulverizáveis, concentrados em suspensão (SC), dispersões à base de óleo ou de água, soluções miscíveis em óleo, suspensões em cápsulas (CS), pós (DP), produtos de revestimento de sementes, grânulos para aplicação por dispersão e sobre o solo, grânulos (GR) na forma de microgrânulos, grânulos pulverizados, grânulos revestidos e grânulos de adsorção, grânulos dispersáveis em água (WG), grânulos hidrossolúveis (SG), formulações ULV, microcápsulas e ceras.
[00143] Estes tipos individuais de formulação são conhecidos em princípio e são descritos, por exemplo, em Winnacker-Kuchler, “Chemische Technologie” [Chemical technology], volume 7, C. Hanser Verlag Munich, 4a. Ed. 1986; Wade van Valkenburg, “Pesticide Formulations”, Marcel Dekker, N.Y., 1973; K. Martens, “Spray Drying” Handbook, 3a. Ed. 1979, G. Goodwin Ltd. Londres.
[00144] Os auxiliares de formulação necessários, tais como materiais, tensoativos solventes e outros aditivos inertes, são também conhecidos e são descritos, por exemplo, em: Watkins, “Handbook of Insecticide Dust Diluents and Carriers”, 2a. Ed., Darland Books, Caldwell N.J., H.v. Olfen, “Introduction to Clay Colloid Chemistry”; 2a. Ed., J. Wiley & Sons, N.Y.; C. Marsden, “Solvents Guide”; 2a. Ed., Interscience, N.Y. 1963; McCutcheon’s “Detergents and Emulsifiers Annual”, MC Publ. Corp., Ridgewood N.J.; Sisley e Wood, “Enciclopedia of Surface Active Agents”, Chem. Publ. Co. Inc., N.Y. 1964; Schonfeldt, “Grenzflachenaktive Atilenoxidaddukte” [Interface-active etilene oxide adducts], Wiss. Verlagsgesell., Stuttgart 1976; Winnacker-Kuchler, “Chemische Technologie” [Chemical technology], volume 7, C. Hanser Verlag Munich, 4a. Ed. 1986.
[00145] Com base nestas formulações, é também possível se preparar combinações com outras substâncias ativas do ponto de vista pesticida tais como, por exemplo, inseticidas, acaricidas, herbicidas, fungicidas, e com fitoprotetores, fertilizantes e/ou reguladores de crescimento, na forma de uma mistura pronta ou uma mistura para tanque, por exemplo.
Métodos de introdução de gene da invenção em uma outra planta
[00146] São também propostos métodos de introdução da sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção em uma outra planta. A sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção, ou um fragmento seu, pode ser introduzida na segunda planta por seleção recorrente, retrocruzamento, cruzamento por pedigree, seleção de linhagem, seleção de massa, cruzamento por mutação e/ou seleção melhorada por marcador genético.
[00147] Assim em uma modalidade, os métodos da invenção compreendem o cruzamento de uma primeira planta compreendendo uma sequência de nucleotídeos da invenção com uma segunda planta para produzir plantas com progênie F1 e a seleção de plantas da progênie F1 que são tolerantes a um herbicida inibidor de HPPD ou que compreendem a sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção. Os métodos podem ainda compreender o cruzamento das plantas da progênie selecionada com a primeira planta compreendendo a sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção para produzir plantas de progênie de retrocruzamento e a seção de plantas de progênie de retrocruzamento que são tolerantes a um herbicida inibidor de HPPD ou que compreendem a sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção. Os métodos para a avaliação de tolerância a herbicidas inibidores de HPPD são propostos em outro ponto do presente documento. Os métodos podem ainda compreender a repetição destas etapas uma ou mais vezes em sucessão para produzir segundas plantas selecionadas ou plantas de progênie de retrocruzamento superiores que são tolerantes a herbicidas inibidores de HPPD ou que compreendem a sequência de nucleotídeos de HPPD da invenção.
[00148] Qualquer método de criação que envolve a seleção de plantas para o fenótipo desejado pode ser usado no método da presente invenção. Em algumas modalidades, as plantas F1 podem ser auto-polinizadas para produzir uma geração F2 segregante. As plantas individuais podem então ser selecionadas que representam o fenótipo desejado (uma tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, por exemplo) em cada geração (F3, F4, F5 etc.) até os tratos se tornarem homozigóticos ou fixados em uma população de criação.
[00149] A segunda planta pode ser uma planta que tem uma característica desejada, tal como tolerância a herbicidas, tolerância a insetos, tolerância a seca, controle de nematódeos, eficiência no uso de água, eficiência no uso de nitrogênio, maior valor nutricional, resistência a doença, uma fotossíntese melhorada, uma qualidade de fibra melhorada, tolerância a tensão, uma reprodução melhorada e semelhantes. A segunda planta pode constituir um evento de elite conforme descrito em outro ponto na presente documento.
[00150] Em diversas modalidades, as partes das plantas (plantas integrais, órgãos de plantas (folhas, hastes, raízes, por exemplo, etc.), sementes, células vegetais, propágulos, embriões e semelhantes) podem ser colhidos do cruzamento resultante e ou serem propagadas ou coletadas para uso a jusante (tal como para alimento, ração, biocombustível, óleo, farinha, farinha fina etc.).
M. Métodos de obtenção de um produto da planta
[00151] A presente invenção também se refere a um processo para a obtenção de um produto comercial, compreendendo a colheita e/ou a trituração dos grãos provenientes de uma cultura que compreende uma sequência de HPPD da invenção para obter a mercadoria. Os produtos importantes do ponto de vista agronômico e comercial e/ou composições de substâncias que incluem, mas sem limitação, ração animal, mercadorias, e produtos vegetais e produtos secundários vegetais que se destinam a serem usados como alimento para o consumo humano ou para uso em composições e mercadorias que se destinam a consumo humano, especialmente produtos de sementes/grãos desvitalizados, incluindo produtos (semi-)processados produzidos a partir destes grãos/sementes, sendo este produto ou compreendendo este produto sementes ou grãos integrais ou processados, ração animal, farinha fina de milho ou de soja, farinha grossa de milho ou soja, milho, amido de milho, farinha fina de feijão de soja, farinha grossa de soja, flocos, concentrado de proteína de soja, isolados de proteína de soja, concentrado de proteína de soja texturizado, cosméticos, produtos para cuidados capilares, manteiga de noz de soja, natto, tempeh, proteína de soja hidrolisada, cobertura batida, óleo, lecitina, feijão de soja integral comestível (cru, torrado ou em forma de edamame), iogurte de soja, queijo de soja, tofu, yuba, assim como grãos cozidos, polidos, tratados com vapor, assados ou parboilizados, e semelhantes são destinados a incidir no âmbito da presente invenção se estes produtos e composições de substância contiverem quantidades detectáveis das sequências de nucleotídeos e/ou de aminoácidos apresentadas no presente documento como sendo diagnóstico para qualquer planta contendo tal sequências de nucleotídeos.
[00152] Os exemplos abaixo são dados a título de ilustração e não como uma limitação
EXPERIMENTAL Exemplo 1. Preparação de G336W mutante de HPPD de Pseudomonas fluorescens (PfG336W) e caracterização cinética das enzimas HPPD.
[00153] A sequência de nucleotídeos de HPPD de Pseudomonas fluorescens nativa (PfHPPD, 1077 pb, conforme descrito em WO2009144079), que codifica a sequência de aminoácidos relacionada no presente documento como SEQ ID NO: 1, e conforme descrita em WO2009144079, WO 96/38567, e em Ruetschi et al. (Eur. J. Biochem., 205, 459-466, 1992), foi inicialmente clonada no sítio Ncol único do vetor de expressão pKK233-2 (Pharmacia) que fornece um códon de partida.
[00154] Na extremidade 5’, diretamente a jusante de ATG, foi inserida uma sequência de ácidos nucleicos codificando um aminoácido alanina e uma sequência de ácidos nucleicos que codificam um HIS6-Tag de terminal N (6x HIS, codificado por: cat cac cat cac cat cac (SEQ ID NO: 77). A montante do ATG, foram acrescentados dois pares de bases de cisteína para se obter uma sequência que corresponde ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição Ncol e a jusante ao códon de parada foram acrescentadas as sequências que correspondem ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição Xbal. A sequência de DNA que corresponde ao gene, incluindo a sequência que codifica HIS-TAG, foi cortada com as enzimas de restrição Ncol e Xbal, sendo então clonada para dentro do vetor de expressão modificado pSE420(RI)NX (5261 pb).
[00155] O vetor de clonagem e expressão pSE420(RI)NX (5261 pb) é baseado no plasmídeo pSE420 por Invitrogen (Karlsruhe, Alemanha). As modificações deste vetor incluem a adição de um gene nptll (neomicina fosfotransferase; Sambrook e Russell, 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual (Terceira edição)) conferindo tolerância ao antibiótico canamicina e que não tem a maioria da região superlinker (sítio de clonagem múltipla).
[00156] O plasmídeo possui o promotor trp-lac (trc) e o gene lacIq gene que fornece o repressor lac em todas as cepas hospedeiras de E. coli. O repressor lac se liga ao operador lac (lacO) e restringe a expressão do gene alvo; esta inibição pode ser aliviada por indução com Isopropil β-D-l-tiogalactopiranosideo (IPTG).
[00157] O vetor resultante foi denominado pSE420(RI)NX-PfHPPD e foi usado para transformar células BL21 de Escherichia coli (Merck, Darmstadt, Alemanha).
[00158] O plasmídeo pSE420(RI)NX-PfHPPD foi submetido a mutagênese direcionada a sítio mediada por PCR para alterar um códon definido nos sítios correspondentes do gene PfHPPD. O códon que codifica glicina (G) na posição 336 foi substituído por um códon que codifica triptofano (W). O mutante resultante foi denominado PfG336W, e o vetor resultante pSE420(RI)NX-PfG336W.
[00159] A expressão de HPPD foi conduzida em K- 12 BL21 de E. coli contendo pSE420(RI)NX-PfHPPD ou pSE420(RI)NX-PfG336W. Deixou-se que as células crescessem até ser atingida uma DO de 0,5, sendo então a expressão iniciada a partir do promotor trp-lac (trc) por indução com IPTG a 1 mM que se liga ao repressor lac e produz a sua dissociação do óperon lac. A expressão foi conduzida durante 15 horas a 28°C.
[00160] Para a preparação da cultura de pré- partida, 2 mL de meio TB (100 μg*mL-1 de carbenicilina) foram inoculados com 50 μL de um estoque de K-12 BL21 glicerol de E. coli. A cultura de pré-partida foi incubada a 37°C com agitação a 140 rpm durante 15 horas. 200 μL da cultura de pré-partida foram usados para iniciar a cultura de partida (5 mL de suplemento de TB com 100 μg*L-1), que foi incubada durante 3 horas a 37°C.
[00161] Para se preparar a cultura principal, 400 mL de meio TB (100 μg*mL-1 de carbenicilina) foram inoculados com 4 mL da cultura de partida. Esta cultura de partida foi incubada a 37°C com agitação a 140 rpm até ser atingida uma DO600 de 0,5. Em seguida a expressão de proteína recombinante foi induzida com 400 μL de uma solução a 1M de IPTG. Deixou-se que as células crescessem durante outra hora nestas condições, sendo então a temperatura abaixada para 28°C e a cultura agitada a 140 rpm durante 15 horas. As células foram coletadas por centrifugação a 6000 x g durante 15 minutos a 4°C. Em seguida os pellets de células foram armazenados a -80°C.
Isolamento e purificação de HiSfi-PfHPPD e de HiSft-PfG336W na forma nativa Lise de células
[00162] As células foram submetidas a lise usando-se lisozima, uma enzima que cliva as ligações 1,4-P entre os resíduos de ácido N-acetilmurâmico e de N-acetil- D-glucosamina em peptidoglicano que forma a parede celular bacteriana. As membranas celulares foram então destruídas pela pressão interna da célula bacteriana. Além disso, o tampão de lise continha a nuclease BENZONASE®, uma endonuclease que hidrolisa todas as formas de DNA e de RNA sem danificaras proteínas e assim reduz muito a viscosidade do lisado de células. A lise nas condições nativas foi conduzida sobre gelo. Para a purificação de proteínas de His6-Tag foi usado o kit QIAEXPRESS® Ni-NTA Fast Start seguindo-se as instruções do manual.
Purificação de proteínas de His6-tag por cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC)
[00163] O lisado de células depurado (10 mL) obtido depois da centrifugação da reação de lise foi carregado em uma coluna Ni-NTA Fast Start do kit QIAEXPRESS® Ni-NTA Fast Start (Qiagen, Hilden, Alemanha) e a purificação foi conduzida de acordo com o manual de instruções. A proteína His6-tag foi eluída com 2,5 mL de tampão de eluição.
Dessalgamento de soluções de HPPD por filtração em gel
[00164] Soluções de HPPD eluídas de uma coluna Ni-NTA Fast Start com 2,5 mL de tampão de eluição foram aplicadas a uma coluna Sephadex G-25 PD-10 (GE Healthcare, Freiburg, Alemanha) seguindo as instruções do manual do usuário. Depois de toda a amostra ter penetrado no leito de gel, a eluição foi conduzida com 3,5 mL de tampão de armazenagem.
[00165] As soluções de HPPD eluídas da coluna de dessalgamento foram congeladas a -80°C em alíquotas de 1 mL.
Determinação da concentração da proteína de HPPD usando-se o ensaio de proteína de Bradford
[00166] A concentração da proteína foi determinada usando-se o ensaio de Bradford padrão (Bradford, (1976), Anal Biochem 72: 248-254).
Determinação de pureza de soluções de HPPD usando- se SDS-PAGE
[00167] A integridade da proteína eluída foi verificada por eletroforese sobre gel de proteína SDS-PAGE usando-se os géis Novex 4-12% Bis-Tris Gels da NUPAGE® (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha), e foram carregados aproximadamente 10 μg de proteína. Dez μL de Tampão de Amostra Laemmli foram acrescentados a 1-10 μL de solução de proteína e a mistura foi incubada a 90°C durante 10 minutos. Depois de uma breve etapa de centrifugação a totalidade da mistura foi carregada em uma fenda de um gel SDS anteriormente fixado em uma câmara de gel Novex MiniCell XCELL de SURELOCK™ cheia com tampão MOPS SDS Running Buffer de NUPAGE® (diluído a partir de uma solução a 20 x em ddH2O). Uma tensão de 150 volts foi então aplicada à câmara de gel durante 1 hora. Para o tingimento de faixas de proteína, o gel foi imerso em Solução de Tingimento Azul Brilhante Coomassie R-250. Para o destingimento do gel de poliacrilamida, ele foi imerso na Solução de Destingimento de Azul Brilhante Coomassie R-250 até que as faixas de proteína aparecessem azuis sobre um gel branco. Exemplo 2. Caracterização cinética e avaliação de tolerância a inibidores de HPPD das enzimas HPPD PfHPPD e PfG336W.
[00168] A atividade de HPPD foi verificada por um ensaio espectrofotométrico padrão (que é descrito em WO 2009/144079, integralmente incorporada ao presente documento a título de referência).
Determinação de propriedades cinéticas in vitro de HPPD
[00169] Os valores de Km, Vmax, e kcat para diferentes preparações de enzima HPPD diferentes e foram determinados Ki, K1 = Kon, e K-1 = Koff para diferentes inibidores de HPPD ou podem ser determinados usando um ensaio HPLC para as medições da atividade de HPPD. As misturas de ensaio continham em um volume de 1 mL tampão de Tris-HCl a 150 mM a um pH de 7,8, 10 mM de ascorbato de sódio, 650 unidades de catalase bovina (Sigma C30 (Sigma- Aldrich, Munique, Alemanha), 34 mg de proteína/mL, 23.000 unidades/mg), e quantidades adequadas de HPP, enzima HPPD purificada e inibidores de HPPD. Para a determinação dos valores de Ki, Km, Vmax, e kcat, as concentrações de HPP na mistura de ensaio variaram entre 10 e 400 μM. Para a determinação de valores de Ki, K1 = Kon, e K-1= Koff, foi usado ou pode ser usado HPP a 2 mM. Todos os ensaios foram iniciados pela adição da enzima HPPD à mistura de ensaio e interrompidos em uma série de momentos entre 0 e 240 s pela adição de 200 μL da mistura de reação aos tubos de ensaio de reação contendo 20 μL de ácido perclórico a 10%. A proteína que se precipitou foi reduzida a pellets por uma centrifugação de 5 minutos a 10.000 g. Cem μL do sobrenadante foram carregados em uma coluna Eurosfer 100-5 C18 de 250 x 4 mm de Knauer (Berlim, Alemanha) equilibrada com metanol a 10%, ácido trifluoracético a 0,1% (tampão A). A coluna foi eluída, também a 1,5 mL/minuto, usando-se um enxágue de 4 minutos com o tampão A, seguido por um enxágue de 3 minutos com metanol a 95% e por uma outro enxágue de 2 minutos com tampão A. A eluição de HGA (ácido homogentísico) e HPP (hidroxifenilpiruvato) foi monitorada a 292 nm. HGA eluiu a aproximadamente 5 minutos e HPP eluiu mais tarde. Um conjunto padrão de concentrações de HGA foi usado para proporcionar uma curva padrão para calibrar a absorbância de 292 nm do pico de HGA contra a concentração de HGA.
[00170] Para a determinação dos valores de Km e Vmax, as taxas iniciais da reação de HPPD a diferentes concentrações de substrato foram determinadas a partir de gráficos de HGA formado por tempo e ajustados à equação de Michaelis-Menten para enzimas uni-reagentes usando a série de softwares XLfit de ID Business Solutions Ltd. Para a determinação de valores de Ki, K1 = Kon, e K-1 = Koff, os períodos de tempo da reação de HPPD a diferentes concentrações de inibidor foram ajustados às equações para o Mecanismo A, inibição competitiva, para inibidores que se ligam firmemente (Cha, S. (1975) Tight-binding inhibitors- 1. Kinetic behaviour. Biochemical Pharmacology 24, 21772185) usando-se a série de software XLfit de ID Business Solutions Ltd.
Tabela 1: Caracterização cinética de enzimas HPPD (PfHPPD e PfG336W)
[00171] Na Tabela 1 abaixo, “Km” (constante de Michaelis-Menten) significa o parâmetro cinético que é usado para caracterizar uma enzima e ele é definido como a concentração do substrato que permite uma meia taxa máxima da reação. Km é ainda definido como a concentração do substrato à qual a taxa de reação atinge a metade do seu valor máximo (Vmax/2) em que Vmax tem o significado de ser a velocidade máxima da reação.
[00172] Kon=K1 é igual à constante da taxa de associação da ligação enzima-substrato e Koff = K-1 é igual à constante de taxa da dissociação do complexo enzima- inibidor. Ki define a constante de inibição. Para a determinação da atividade específica das enzimas, as amostras foram incubadas e a reação foi interrompida depois de 24 minutos. A atividade específica foi estimada por μg de proteína. TABELA 1
Figure img0001
[00173] A Tabela 1 demonstra que os parâmetros cinéticos Km e Kcat do HPPD bacteriano do tipo selvagem (PfHPPD e PfG336W) e do HPPD mutante(PfHPPD e PfG336W) não apresentam diferenças significativas. No entanto, a atividade específica é significativamente reduzida no mutante em comparação com a proteína do tipo selvagem.
Determinação da atividade de HPPD na presença de diversos inibidores de HPPD
[00174] Neste contexto, o valor de pI50 significa o valor de log da concentração do inibidor necessária para inibir 50% da atividade enzimática em concentração molar.
[00175] Os valores de pI50 para inibidores de HPPD inhibitors foram determinados de gráficos de dose- resposta da atividade de HPPD por concentração do inibidor usando-se o ensaio extensamente descrito em WO 2009/144079 a uma concentração fixa de HPP de 2 mM e durante 3 minutos fixos de incubação usando a série de software XLfit de ID Business Solutions Ltd.
[00176] O valor de pI50 das enzimas PfHPPD e PfG336W foi medido usando-se um método à base de espectrofotometria. Foi medida a tolerância a diversos inibidores de HPPD relacionados abaixo tembotriona, dicetonitrila, mesotriona. O símbolo “>“ significa que o valor é muito maior do que o indicado, mas não pode ser calculado com precisão dentro da faixa de concentração de inibidor testada (5,0 x 10-6, 1,0 x 10-5, 2,5 x 10-5, 4,0 x 10-5, 7,0 x 10-5, 1,0 x 10-4, 2,0 x 10-4 e 5,0x 10-4 M). Neste experimento, a leitura é feita 24 minutos depois do início do experimento. Os resultados são mostrados na Tabela 2. TABELA 2
Figure img0002
[00177] O valor de pI50 das enzimas HPPD foi também medido usando um método à base de HPLC. Foi medida a tolerância aos inibidores de HPPD tembotriona, dicetonitrila, e mesotriona. Neste experimento a medição é feita 3 minutos depois do início do experimento. Os resultados são mostrados na Tabela 3. TABELA 3
Figure img0003
[00178] Em um método alternativo para a medição de atividade de HPPD e tolerância de HPPD a inibidores de HPPD, a atividade de HPPD foi medida à temperatura ambiente acrescentando-se quantidades adequadas de HPPD a uma solução a 200 mM de Tris-HCl pH 7,6, a 10 mM de ascorbato, FeS04 a 20 μM, 650 unidades de catalase, HGA dioxigenase a 8 μg (HGA:Homogentisato) e HPP a 10-100 μM em um volume total de 1 mL. As taxas de reação iniciais foram determinadas a partir do aumento em absorvância a 318 nm devido à formação de maleilacetoacetato (ε = 11.900 M-1cm- 1). Os valores Km e Vmax foram determinados ajustando-se as velocidades iniciais da conversão de HPP, determinada a concentrações diferentes de HPP, à equação de Michaelis- Menten usando o Modelo 350 da série de software versão 5.1.0.0 de ID Business Solutions Ltd. Este método é denominado ensaio HGD.
[00179] O valor de pI50 das enzimas HPPD foi também medido usando-se um ensaio de acoplamento de HPPD (HGD; PfHPPD e PfG336W) e sua tolerância respectiva aos inibidores de HPPD inhibitors tembotriona, dicetonitrila, e mesotriona. Os resultados são apresentados na Tabela 4. TABELA 4
Figure img0004
[00180] Nas Tabelas 2, 3 e 4, pode ser claramente observado que a mutação na posição 336 da HPPD proveniente de Pseudomonas fluorescens aumentou significativamente a tolerância da HPPD a diversos inibidores de HPPD.
Exemplo 3. Biblioteca de mutantes de pontos de primeira geração.
[00181] A mutante PfG336W foi submetida ainda mais a mutagênese em 16 posições. A aleatorização destas posições foi conduzida usando-se o kit relâmpago QUIKCHANGE®. A diversidade teórica da biblioteca foi de aproximadamente 300. Os mutantes foram combinados e transformados em células DH5alpha de E. coli. Seiscentos clones individuais foram testados para tolerância ao inibidor de HPPD tembotriona (TBT). Os clones foram criados em meio LB mais canamicina a 37 graus C em um agitador até ser atingida uma DO600nm de 0,3. As culturas foram então mudadas para 30 graus C e incubadas durante outras 17 horas. As culturas foram centrifugadas e os pellets de células foram ressuspensos em Hepes a 10 mM/KOH pH 7,6, MgC12 a 4 mM, DTT a 1 mM. As células foram submetidas a lise por impacto de esferas e extratos de células solúveis foram obtidos depois de centrifugação.
[00182] Os mutantes foram analisados usando-se um ensaio de cor marrom. Especificamente os extratos de HPPD foram testados em formato de 96 cavidades para tolerância a inibidores de HPPD por disposição em pontos sobre meio sólido contendo LB-agar, canamicina, tirosina a 5 mM, succinato a 42 mM e um inibidor de HPPD. Na seleção primária, 20 μL de extrato foram dispostos em pontos em triplicata em placas contendo tempobriona a 250 μM. As placas foram cobertas com fita porosa e incubadas a 37 graus C. Depois de 24 horas, a formação do pigmento marrom foi visualmente comparada a uma amostra contendo PfG336W. As variantes que apresentavam uma formação aumentada de pigmento na presença de TBT foram novamente testadas em TBT a 250 μM e dicetonitrila (DKN) a 250 μM composto ativo de isoxaflutol (IFT). As variantes que novamente apresentaram uma tolerância maior a inibidores foram novamente expressas e foi titulado em TBT a 250 μM e DKN a 250 μM para determinar a extensão do melhoramento. As amostras dos extratos foram também analisadas por SDS-PAGE e foi constatado que os extratos continham quantidades iguais de proteína de HPPD.
[00183] A titulação mostrou que a variante PfHPPDEvo33 (SEQ ID NO: 6) tinha uma tolerância 4x melhor a TBT e a DKN em comparação com PfG336W. Esta variante tem uma substituição de ácido glutâmico por prolina na posição 335 em relação a PfG336W. Esta mutação está localizada na hélice alfa de terminal C que age como uma porta para o sítio ativo.
Exemplo 4. Seleção de biblioteca permutacional de segunda geração
[00184] As sequências das variantes de primeira geração com o melhor desempenho foram analisadas e foi gerada uma biblioteca permutacional de segunda geração na região combinando posições 335, 336, 339, 340. A diversidade teórica desta biblioteca foi de 640. A seleção foi conduzida como no Exemplo 3. Uma outra biblioteca permutacional de segunda geração foi gerada tendo como alvos as posições 188, 189 e 190 e foi medida usando-se o ensaio de cor marrom.
[00185] Os dados de titulação mostraram que a variante PfHPPDEvo36 (SEQ ID NO: 7) tinha uma tolerância 16x maior a TBT e a DKN em comparação com PfG336W. Ela tinha uma tolerância 4x maior em comparação com PfHPPDEvo33. Novamente a expressão de proteína foi analisada por SDS-PAGE e foi constatado que as variantes expressavam quantidades iguais de proteína de HPPD. PfHPPDEvo36 tem uma substituição de serina no lugar do ácido glutâmico na posição 335, serina no lugar de triptofano na posição 336, treonina no lugar de lisina na posição 339 e glutamina no lugar de alanina na posição 340 em relação a PfG336W.
[00186] Os dados de titulação mostraram que a variante PfHPPDEvo37 (SEQ ID NO: 3) tinha uma tolerância maior a TBT e a DKN em comparação com PfG336W. PfHPPDEvo37 tem uma substituição de triptofano no lugar de alanina na posição 188 em relação a PfG336W. A análise de SDS-PAGE foi conduzida e não mostrou nenhuma diferença nos níveis de expressão de HPPD entre as variantes.
[00187] Os dados de titulação abaixo mostram que a variante PfHPPDEvo40 (SEQ ID NO: 8) tinha uma melhor tolerância a TBT e a DKN em comparação com PfG336W. A análise de SDS-PAGE foi conduzida e não mostrou nenhuma diferença nos níveis de expressão de HPPD entre as variantes.
[00188] As variantes foram também testadas por disposição em placas de células integrais de E. coli expressando HPPDs nos meios contendo diversos inibidores de HPPD. Para estes experimentos, células DH5alfa contendo HPPD expressando plasmídeos foram cultivadas em meio LB + canamicina até ser atingida uma DO600nm = 0,5. Diluição em série de células foi preparada em meio LB + canamicina correspondendo a valores de DO600 de 0,016, 0,008, 0,004, e 0,002. Dez microlitros de cada diluição foram dispostos em triplicada em placas não contendo nenhum inibidor de HPPD, TBT a 250 μM, DKN a 250 μM e mesotriona (MST) a 250 μM. As placas foram incubadas durante 18 horas a 37 graus C. Foi conduzida uma análise por SDS-PAGE e não apresentou nenhuma diferença em níveis de expressão de HPPD entre variantes.
[00189] PfHPPDEvo40 e PfHPPDEvo41 (SEQ ID NO: 16) apresentaram uma maior tolerância a TBT e a MST neste ensaio em comparação com PfG336W.
Exemplo 5. Análise enzimática em mutantes permutacionais
[00190] A atividade cinética da enzima PfHPPD foi comparada a diversos dos mutantes permutacionais e os resultados são apresentados na Tabela 5 abaixo. “Km” (constante de Michaelis-Menten) significa o parâmetro cinético que é usado para caracterizar uma enzima e é definida como a concentração do substrato que permite uma meia taxa máxima da reação. Km é ainda definida como a concentração de substrato à qual a taxa de reação atinge a metade do seu valor máximo (Vmax/2) em que Vmax tem o significado de ser a velocidade máxima da reação.
[00191] Para a determinação da atividade específica das enzimas, foram incubadas amostras, e a reação foi interrompida depois de 24 minutos. A atividade específica foi estimada por μg de proteína. TABELA 5
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[00192] A atividade específica da HPPD proveniente de Pseudomonas fluorescens a HPPD (PfHPPD) e seus mutantes foi obtida usando-se o método espectrofotométrico. Foram incubadas amostras e a reação foi interrompida depois de 24 minutos. A atividade específica foi estimada por μg de proteína. TABELA 6
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[00193] Conforme mostrado na Tabela 6, não houve nenhuma diferença significativa em atividade entre o tipo selvagem e a maioria dos mutantes da enzima. Portanto, é provável que a tolerância observada seja devida a propriedades intrínsecas da enzima e não a uma disfunção ou a uma atividade mais lenta na conversão de 4-hidroxifenil piruvato em homogentisato.
[00194] A tolerância à dicetonitrila (forma ativa de isoxaflutol) e a mesotriona foi também medida usando-se o ensaio espectrofotométrico. Os valores representam pI50, “>” significa que o valor está fora dos limites de medição deste ensaio (a enzima é mais sensível do que o valor indicado subsequentemente, por exemplo). TABELA 7
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[00195] A tolerância a tembotriona, a dicetonitrila (forma ativa de isoxaflutol) e a mesotriona foi também medida usando-se um ensaio à base de HPLC. Valores representam pI50, “>“ significa que o valor se encontra fora dos limites de medição deste ensaio (a enzima é mais sensível do que o valor indicado em seguida). TABELA 8
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[00196] Conforme demonstrado na Tabela 8, diversos mutantes de HPPD apresentaram uma maior tolerância a cada uma de tembotriona, dicetonitrila (isoxaflutol) e mesotriona.
[00197] A tolerância a tembotriona, dicetonitrila e mesotriona de mutante de HPPD selecionados foi também medida usando-se um ensaio de acoplamento de HPPD (descrito no Exemplo 2). Os valores representam pI50. TABELA 9
Figure img0013
[00198] Conforme mostrado na Tabela 9, os mutantes de HPPD são mais tolerantes a qualquer inibidor de HPPD testado em comparação coma enzima HPPD do tipo selvagem. Assim, a presente invenção inclui enzimas HPPD mutantes que apresentam uma tolerância significativamente melhorada a diversos inibidores de HPPD ao mesmo tempo.
[00199] A tolerância a outros inibidores de HPPD da classe descrita em WO2012/028579 (que é integralmente incorporada ao presente documento a título de referência, mas especialmente no tocante aos compostos descritos na Tabela 10 do presente documento) foi também medida para as enzimas HPPD relacionadas na Tabela 10. A tolerância foi estimada in vitro usando-se o ensaio de acoplamento de HPPD (HGD) descrito acima. Os valores são pI50. TABELA 10
Figure img0014
[00200] Assim, os mutantes selecionados apresentaram uma tolerância a uma faixa ampla de herbicidas inibidores de HPPD.
Exemplo 6. Análise da tolerância a inibidores de HPPD in planta
[00201] Plantas de soja expressando uma enzima tolerante a inibidor de HPPD da presente invenção, juntamente com um gene que confere tolerância a glifosato e um gene conferindo tolerância a glufosinato, foram testados para tolerância a tembotriona. Um pulverizador DeVries Tracker Sprayer foi calibrado antes de cada pulverização. A formulação química usada para o teste com tembotriona foi a formulação SC de LAUDIS®. Os testes de pulverização foram conduzidos usando-se 184 g/hectare; TBT a 34,5%. A tolerância foi avaliada uma semana depois da pulverização. Uma classificação de “+” foi atribuída a plantas que foram completamente descoradas no tecido que estava ativamente crescendo. Uma classificação de “++” foi atribuída a plantas que tinham uma ligeira tolerância, isto é, os tecidos vegetais mais novos tinham alguma coloração verde e não tinham sido completamente descorados. Uma classificação de “+++” foi atribuída a plantas que sofreram um efeito muito pequeno da pulverização, isto é, havia um pouco de clorose ou um descoramento muito ligeiro. Os resultados destes testes são mostrados na Tabela 11. TABELA 11
Figure img0015
[00202] Os eventos T1 que expressam PfG336W e PfHPPDEvo41 (cada um deles também expressando um gene que confere tolerância a glifosato e um gene conferindo tolerância a glufosinato) foram avaliados em testes no campo. As plantas foram pulverizadas no estágio v2-v3 com 1 x glufosinato. Cinco dias depois do tratamento com glufosinato, as plantas sobreviventes foram pulverizadas com 2 x tembotriona, 2 x mesotriona, ou 2 x isoxaflutol e avaliadas para fitotoxicidade depois de 7 dias. Nove dos 18 eventos que expressavam PfHPPDEvo41 e 0 de 18 eventos que expressavam PfG336W apresentaram uma proporção inferior ou igual a 20% da fitotoxidade média a partir da aplicação pós-emergente de tembotriona a 200 g ai/ha.
[00203] No teste no campo na Argentina, 5 de 10 T2 PfHPPDEvo41 e 1 de 3 eventos de PfG336W apresentaram uma proporção inferior ou igual a 18% da fitotoxicidade máxima a partir de uma aplicação pós-emergente de isoxaflutol a 210 g ai/ha.
[00204] Em um teste no campo conduzido nos Estados Unidos (Minesota), 7 de 7 T2 PfHPPDEvo41 e 1 de 11 eventos PfG336W apresentaram uma proporção inferior o igual a 25% da fitotoxicidade máxima a partir de uma aplicação pós-emergente de tembotriona a 200 g ai/ha.
Exemplo 7: Geração de mutantes de outras enzimas HPPD
[00205] As cepas ATX22717 e ATX1974 foram identificadas usando-se um ensaio que acopla a atividade de HPPD a produção de cor rosa/laranja que pode ser visualmente detectada. A incorporação de agente extintores de quinona foi usada para aumentar a sensibilidade do ensaio in vitro. A extinção de quinona usada foi MBTH ou 3- metil-2-benzotiazolinona hidrazina. Tanto as fenol oxidases como as HPPDs são enzimas dioxigenases que produzem um composto de quinona como um produto intermediário; estas quinonas então rápida e espontaneamente passam por um rearranjo de elétrons que leva à formação de um produto a jusante que é mais estável, tal como melanina (no caso de fenol oxidases) ou homogentisato (no caso de HPPDs) e insolúvel. Quando complexado com a quinona, o produto MBTH- quinona produz uma coloração rosa/laranja. A adição do agente de extinção de MBTH aumenta a sensibilidade do ensaio de aproximadamente 5 vezes.
[00206] As cepas são cultivadas em LB-agar durante aproximadamente 24 horas. As células foram reduzidas a pellets por centrifugação, ressuspensas em 1/2 volume de tampão HEPES a 20 mM, pH 7,1 e submetidas a lise por impacto de esferas. Foram acrescentados 50 μL de extrato de cepa a 150 μL de mistura de ensaio de MBTH em um bloco de 96 cavidades de fundo cônico. A mistura de ensaio final continha MBTH a 10 mM, hidroxifenil piruvato (HPP) a 0 ou 1 mM, tampão HEPES a 20 mM, pH 7,1 e tembotriona (TBT) ou a 0,10 μM ou a 1 mM. Os blocos de ensaio de 96 cavidades foram então agitados a 200 rpm em um agitador de assoalho, a 30 graus C durante aproximadamente 22 horas antes da classificação. Foi demonstrado que as cepas ATX22717 e ATX1974 eram tolerantes a TBT.
[00207] A cepa ATX22717 é uma cepa de Pseudomonas aeruginosa isolada de uma amostra de solo coletada na Carolina do Norte, Estados Unidos.
[00208] A cepa ATX1974 é uma cepa de Pseudomonas agarici isolada de uma amostra de solo coletada na Carolina do Norte, Estados Unidos.
[00209] Os genes de HPPD foram identificados das cepas usando-se as seguintes etapas: • preparação de DNA total a partir da cepa. O DNA total contém tanto o DNA genômico como DNA extracromossômico. O DNA extracromossômico contém uma mistura de alguns ou de todos dos seguintes: plasmídeos de diversos tamanhos; cromossomos de bacteriófagos; outras moléculas extracromossômicas não caracterizadas; • sequenciamento do DNA. O DNA total é sequenciado por meio de Sequenciamento de Próxima Geração; • montagem da sequência de DNA por diversos programas de software, incluindo Newbler, phredPhrapm e CLC; • identificação de genes de HPPD por algoritmos de homologia de DNA e de proteína.
[00210] Axmi305H foi identificada a partir da cepa ATX22717. A sequência de nucleotídeos que codifica Axmi305H é apresentada em SEQ ID NO: 60 e a sequência de aminoácidos é apresentada em SEQ ID NO: 57. Axmi305H compartilha 99,7% de identidade a SEQ ID NO: 29696 na publicação de pedido de patente U.S.A. No. 20070020624.
[00211] Axmi309H foi identificada a partir da cepa ATX1974. A sequência de nucleotídeos que codifica Axmi309H é apresentada em SEQ ID NO: 61 e a sequência de aminoácidos é apresentada na SEQ ID NO: 58. Axmi309H compartilha 99,7% de identidade ao No. de acesso GENBANK® No. YP_348648.
[00212] A cepa Comamonas testosteroni foi selecionada como uma fonte potencial para uma HPPD favorável do vista enzimático, pois foi relatado que produz piomelanina, um derivado do ácido homogentísico que é o produto da atividade de HPPD (Turick et al., 2005, Microbial Metabolite Field Deployment Report. WSRC-TR-2005- 00455).
[00213] Buscas de bases de dados públicos BLAST indicaram que há duas HPPDs distintas na espécie bacteriana Comamonas testosteroni, uma tem 362 aminoácidos de comprimento e a outra tem 373 aminoácidos de comprimento. O DNA genômico de Comamonas testosteroni DNA (ATCC® número do catálogo 700441) foi amplificado por PCR usando-se primers projetados para cada um dos dois genes de HPPD com base na sequência de nucleotídeos relatada das cepas de Comamonas testosteroni CNB-2, KF-1, e S44 conforme encontradas na base de dados BLAST. Os produtos de PCR foram digeridos com BspHI e XbaI e clonados em pSE420 cortado com NcoI e XbaI.
[00214] A sequência de nucleotídeos e aminoácidos derivados da HPPD de 373 aminoácidos de comprimento não é idêntica a nenhuma sequência relatada de HPPD de Comamonas testosteroni conforme indicado nas buscas em BLAST. Ela tem uma similaridade de 99% a Comamonas testosteroni S44. Refere-se a esta sequência inédita como Axmi428H. A sequência de nucleotídeos que codifica Axmi428H é apresentada em SEQ ID NO: 62 e a sequência de aminoácidos é apresentada em SEQ ID NO: 59.
[00215] Uma enzima HPPD produzirá um pigmento marrom, piomelanina, à medida que converte o hidroxifenilpiruvato em ácido homogentísico. A produção deste pigmento pode ser visualizada. As células DH5alpha que expressam a proteína de Axmi428H foram cultivadas até saturação em meio LB e em seguida 10 μL de cultura saturada foram pingados em pontos sobre placas de LB-agar de 100 μL contendo 0, 0,5, 1,0, e 2,0 mM de tembotriona. As células foram fotografadas depois de aproximadamente 16 horas de crescimento adicional a 37 graus C.
[00216] Axmi428H foi também caracterizada cineticamente usando-se um ensaio cinético in vitro que acopla a produção de ácido homogentísico com a enzima homogentisato 1,2-dioxigenase (HGO). HGO converte ácido homogentísico em maleoacetoacetato que é monitorado à medida que ele absorve intensamente a 321 nm. A produção em tempo real do produto é monitorada continuamente em um espectrofotômetro de 96 cavidades na presença de concentrações variáveis de substrato, da limitante à saturante, tornando possível se determinar o Km da enzima usando-se a cinética Michaelis-Menten padrão. Um valor Ki pode ser determinada lançando-se em gráfico a alteração deste Km na presença de quantidades variáveis do inibidor tembotriona.
[00217] Para este ensaio, a enzima Axmi428H foi preparada cultivando-se células DH5alpha transformadas com agitação a 250 rpm a 37°C até as culturas terem atingido uma DO600 de 0,6-0,7. A temperatura foi então reduzida a 30°C e as culturas continuaram a ser agitadas durante aproximadamente 20 horas. As culturas de células foram reduzidas a pellets por centrifugação e ressuspensas em 1/20 do volume de HEPES a 20 mM, pH 7.0, tampão de NaCl a 50 mM. As células foram submetidas à lise pela adição de LYSONASE™ (Novagen) durante 45 minutos à temperatura ambiente e congelado a -20 graus C durante pelo menos 1 hora. Os extratos de células foram descongelados imediatamente antes do ensaio, clarificadas por centrifugação e tiveram avaliada a atividade na presença de diversos níveis de substrato e inibidor com excesso de enzima HGO. A análise dos dados cinéticos resultou nas constantes cinéticas indicadas na Tabela 12 abaixo. Axmi428H tem um nível similar de tolerância a tembotriona ao do gene de PfG336W mutado e ambos apresentam uma tolerância maior do que a HPPD da soja nativa. TABELA 12
Figure img0016
[00218] As mutações presentes em algumas das enzimas HPPD mutantes descritas no presente documento foram introduzidas nas posições correspondentes de outras enzimas HPPD nativas, incluindo Axmi305H, Axmi309H, e Axmi428H em uma tentativa de melhorar a tolerância destas enzimas.
[00219] A Tabela 13 mostra a identidade entre sequências entre diferentes proteínas de HPPD. O alinhamento foi conduzido com AlignX. TABELA 13
Figure img0017
[00220] Um kit de mutagênese relâmpago direcionado a sítio QUIKCHANGE® foi usado para a mutagênese direcionada a sítio dos genes no vetor pSE420. Os mutantes geados por esta abordagem foram transformados em células B121-DE3* e cultivados até saturação em meio LB. Alíquotas foram então pingadas em pontos contendo diversas quantidades de tembotriona. Com este método a enzima HPPD ativa produzirá um pigmento marrom depois de aproximadamente 14 horas de crescimento nas placas. Usando- se este ensaio, foi demonstrado que todos os mutantes gerados apresentavam atividade de HPPD que era extremamente resiste a inibição pela tembotriona.
[00221] A tolerância dos mutantes foi também medida contra tembotriona, dicetonitrila (isoxaflutol) e mesotriona, usando-se o método de acoplamento de HPPD. Os resultados são apresentados na Tabela 14. “>>” significa que se encontram fora dos limites da medição, mas extremamente superiores ao número que consta em seguida. TABELA 14
Figure img0018
Figure img0019
[00222] Os dados da Tabela 14 mostram que as mutações ou combinações de mutações identificadas no presente documento são efetivamente responsáveis pela tolerância melhorada aos inibidores de HPPD, qualquer que seja a natureza da proteína de HPPD em que elas tenham sido introduzidas.
Exemplo 8. Clonagem de genes de HPPD para dentro de um cassete de expressão vegetal
[00223] Para cada um dos genes de HPPD genes descrito no presente documento, a matriz de leitura aberta (ORF) pode ser amplificada por PCR a partir do gabarito de DNA de comprimento total. Podem ser acrescentados sítios de restrição Hind III a cada extremidade das ORFs durante a PCR. Adicionalmente, a sequência de nucleotídeos ACC pode ser acrescentada imediatamente 5’ ao códon de partida do gene para aumentar a eficiência traducional (Kozak (1987) Nucleic Acids Research 15: 8125-8148; Joshi (1987) Nucleic Acids Research 15: 6643-6653). O produto de PCR pode ser clonado e sequenciado usando-se técnicas bem conhecidas na técnica para ficar assegurado que as mutações são introduzidas durante a PCR.
[00224] O plasmídeo contendo o produto de PCR pode ser digerido com Hind III e o fragmento contendo o ORF intacto pode ser isolado. Este fragmento pode ser clonado no sítio Hind III de um plasmídeo tal como pAX200, um vetor de expressão vegetal contendo o promotor da actina do arroz (McElroy et al. (1991) Molec. Gen. Genet. 231: 150-160) e o terminador PinII (An et al. (1989) The Plant Cell 1: 115- 122). O fragmento de promotor-gene-terminador proveniente deste plasmídeo intermediário pode ser então subclonado no plasmídeo pSB11 (Japan Tobacco, Inc.) para formar um plasmídeo final à base de pSB11. Estes plasmídeos à base pSB11 são tipicamente organizados de modo tal, que o fragmento de DNA contendo a construção promotor-gene- terminador pode ser excisado por digestão dupla por enzimas de restrição tais como KpnI e PmeI, e usado para a transformação em plantas por injeção de feixe de aerossol. A estrutura dos clones à base do pSB11 pode ser verificada por digestão por restrição e eletroforese sobre gel, e por sequenciamento através das diversas junções de clonagem.
[00225] O plasmídeo pode ser mobilizado para dentro da cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens que também contém o plasmídeo pSBl1 (Japan Tobacco, Inc.), usando os procedimentos de cruzamento triparental bem conhecidos na técnica, e dispondo em placas contendo meio contendo espectinomicina. O clone de plasmídeo â base de pSB11 tem uma resistência a espectinomicina, mas é um plasmídeo com uma faixa estreita de hospedeiras e não pode se replicar em Agrobacterium. As colônias resistentes a espectinomicina se originam quando plasmídeos à base de pSB11 se integram a um plasmídeo pSB1 que tem uma faixa mais ampla de hospedeiros por meio de recombinação homóloga. O produto co-integrado de pSBl e do plasmídeo à base de pSB11 pode ser verificado por hibridização Southern. A cepa de Agrobacterium contendo o co-integrado pode ser usada para transformar milho por métodos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, o método PureIntro (Japan Tobacco).
Exemplo 9. Transformação de soja
[00226] A transformação de soja é obtida usando- se métodos bem conhecidos na técnica, tais como aquele descrito usando explantas de meia semente de soja por transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens usando essencialmente o método descrito por Paz et al. (2006), Plant cell Rep. 25: 206. Os transformantes foram identificados usando-se isoxaflutol ou tembotriona como marcador de seleção. O aparecimento de brotos verdes foi observado e documentado como um indicador de tolerância ao herbicida isoxaflutol ou tembotriona. Os brotos transgênicos tolerantes apresentarão uma coloração verde comparável aos brotos da soja do tipo selvagem e não tratados com isoxaflutol ou tembotriona, ao passo que os brotos de soja do tipo selvagem tratados com a mesma quantidade de isoxaflutol ou tembotriona estarão inteiramente descorados. Isto indica que a presença da proteína de HPPD permite a tolerância a herbicidas inibidores de HPPD, como isoxaflutol ou tembotriona.
[00227] Os brotos verdes tolerantes são transferidos para meio de enraizamento ou enxertados. As plântulas enraizadas serão transferidas para a estufa depois de um período de aclimatação. As plantas que contêm o transgene são então pulverizadas com herbicidas inibidores de HPPD, tal como, por exemplo, com tembotriona a uma taxa de 100 g AI/ha. Dez dias depois da aplicação, são avaliados os sintomas devidos à aplicação do herbicida e comparados aos sintomas observados nas plantas do tipo selvagem nas mesmas condições.
Exemplo 10: Estabelecimento e seleção de planta de Algodão TO.
[00228] A transformação do algodão é obtida usando-se métodos bem conhecidos na técnica, sendo o método especialmente preferido aquele que é descrito na publicação de patente PCT WO 00/71733. As plantas regeneradas são transferidas para a estufa. Depois de um período de aclimatação, plantas suficientemente desenvolvidas são pulverizadas como herbicidas inibidores de HPPD tal como, por exemplo, tembotriona numa quantidade equivalente a 100 g AI/ha suplementada com sulfato de amônio e óleo de colza éster metílico. Sete dias depois da aplicação da pulverização, avaliam-se os sintomas devidos ao tratamento e comparam-se aos sintomas observados em plantas de algodão do tipo selvagem submetidas ao mesmo tratamento nas mesmas condições.
Exemplo 11. Transformação de Células vegetais de Milho por Transformação Mediada por Agrobacterium
[00229] As espigas são de preferência colhidas 8-12 dias depois da polinização. Os embriões são isolados das espigas e os embriões tendo de 0,8 a 1,5 mm de tamanho são preferidos para uso na transformação. Os embriões são colocados em placas com o escutelo para cima em um meio de incubação adequado, e incubados de um dia para o outro a 25°C no escuro.
[00230] No entanto, não é necessário especificamente se incubar os embriões de um dia para o outro. Os embriões são colocados em contato com uma cepa de Agrobacterium contendo os vetores adequados tendo uma sequência de nucleotídeos da presente invenção para a transferência mediada por plasmídeo Ti durante aproximadamente 5-10 minutos, sendo então dispostos em placas sobre meio de co-cultivo durante aproximadamente 3 dias (25°C no escuro). Depois da co-cultura, as explantas são transferidas para um meio de período de recuperação durante aproximadamente cinco dias (a 25°C no escuro). As explantas são incubadas em meio de seleção durante um período de até oito semanas, dependendo da natureza e das características da seleção específica utilizada. Depois do período de seleção, o calo resultante é transferido para meio de maturação de embriões, até ser observada a formação de embriões somáticos maduros. Os embriões somáticos maduros resultantes são então colocados sob uma luz baixa, e o processo de regeneração é iniciado do modo conhecido na técnica. Deixa-se que os brotos enraízem em meio de enraizamento e as plantas resultantes são transferidas para vasos no viveiro e propagadas em forma de plantas transgênicas.
[00231] Todas as publicações e pedidos de patentes mencionados no relatório são indicativos do nível dos versados na técnica à qual pertence a presente invenção. Todas as publicações e pedidos de patentes são incorporados ao presente documento a título de referência como se cada publicação ou pedido de patente individual tivesse sido específica e individualmente indicado para ser incorporado ao presente documento a título de referência.
[00232] Embora a invenção acima tenha sido descrita com alguns detalhes a título de ilustração e exemplo, para fins de clareza da compreensão, será evidente que determinadas alterações e modificações podem ser colocadas em prática dentro do âmbito das reivindicações apensas.

Claims (3)

1. Polipeptídeo HPPD recombinante CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polipeptídeo HPPD é tolerante a um herbicida inibidor de HPPD selecionado do grupo de tembotriona, dicetonitrila e mesotriona, e em que a sequência de aminoácidos do referido polipeptídeo recombinante compreende substituição(ões) de aminoácido(s) de: (a) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (b) uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma treonina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; (c) um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 188 da SEQ ID NO: 1 e um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1; (d) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, uma serina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, e um ácido glutâmico na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1; ou (e) uma prolina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 335 da SEQ ID NO: 1, um triptofano na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 336 da SEQ ID NO: 1, uma alanina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 339 da SEQ ID NO: 1, e uma glutamina na posição de aminoácido correspondendo à posição do aminoácido 340 da SEQ ID NO: 1.
2. Polipeptídeo recombinante CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 3 - 59.
3. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de aminoácidos é fundida a um peptídeo de trânsito de cloroplasto para fazer um peptídeo de fusão.
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