CN102586236B - 玉米植物事件mon87460以及用于其检测的组合物和方法 - Google Patents

玉米植物事件mon87460以及用于其检测的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了转基因玉米事件MON87460，以及包含鉴别该玉米事件的DNA的细胞、种子和植物。本发明还提供了包含用于检测样品中MON87460事件的核苷酸序列的存在的组合物、用于检测样品中MON87460事件多核苷酸的存在的方法，以及用于检测鉴别样品中MON87460的存在的核苷酸序列的探针和引物。本发明还提供采用MON87460育种的方法以产生耐受水分亏缺的玉米植物。

Description

玉米植物事件MON87460以及用于其检测的组合物和方法
本申请是名称为“玉米植物事件MON87460以及用于其检测的组合物和方法”、申请日为2009年02月26日、申请号为200980109620.6的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2008年2月29日提交的美国临时申请序列No.61/032,568的优先权，其通过引用方式结合在本文中。
序列表的援引
19671字节(MS-Windows操作系统测量的)的名为“54813A_PCT.txt”的文件中包含的序列表创建于2009年2月4日，在此通过电子文档提交，并通过引用方式全部结合在本文中。
技术领域
本文公开了包含表达冷休克蛋白质的重组DNA的转基因细胞、种子和植物，该冷休克蛋白质使得植物具有提高的应激耐受性和/或提高的产率。本文还包括制备、使用和检测这样的细胞、种子和植物的方法。具体而言，本发明涉及名为MON87460的应激耐受的玉米植物，以及检测样品中MON87460 DNA的存在的方法和组合物。
背景技术
农场主和种子生产者渴望获得具有改良的农学性状的转基因植物，该农学性状例如产率、环境压力耐受性、虫害抗性、除草剂耐受性、改良的种子组成等。尽管在植物育种中的巨大努力已经在希望的性状上获得了重大进展，但将特定DNA引入植物基因组的能力还能够为产生具有改良性状和/或独特性状的植物提供了进一步的可能性。
发明内容
本文提供了涉及名为MON87460的转基因水分亏缺应激耐受的玉米植物、其后代和种群的组合物和方法。
一方面，本发明提供了名为MON87460的转基因玉米植物和所述植物的种子，这样的种子已通过2008年1月31日寄出的货品保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，被指定保藏号PTA-8910。本发明的另一方面包括植物MON87460的后代植物、种子或该植物和种子的可再生部分。本文还提供了包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：24的后代植物或种子或者该植物和种子的可再生部分。
本发明的另一方面提供了包含玉米植物MON87460的转基因/基因组接合区的多核苷酸。提供的多核苷酸包含至少一个选自SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：25及其互补序列的转基因/基因组接合核酸分子，其中所述接合分子跨越转基因插入位点。本发明的一个方面是包含SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4中的任一序列或SEQ IDNO：25的玉米种子及其植物材料。
本发明还涉及MON87460事件的玉米细胞的细胞核，其中所述细胞核包含含有提供改良的水分亏缺耐受性的异源多核苷酸插入片段的染色体，其中所述异源多核苷酸包含SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4中的任一序列。特别感兴趣的是其中异源多核苷酸包含表达cspB基因的截短的水稻肌动蛋白启动子和其中所述截短的水稻肌动蛋白启动子邻近玉米基因组序列SEQ ID NO：5的染色体。在某些实施方式中，提供了包含SEQ ID NO：1和含有与cspB基因可操作地连接的截短的水稻肌动蛋白启动子的异源转基因插入片段的玉米染色体。在某些实施方式中，异源转基因插入片段的5’末端可以重叠SEQ ID NO：1的3’末端。在某些实施方式中，玉米染色体可以包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：24。在某些实施方式中，本发明的染色体位于玉米细胞内，该玉米细胞还包含用于表达草甘膦抗性的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(CP4 EPSPS)蛋白质的第二种未连接的异源多核苷酸。本发明还提供了包含本发明的任意玉米染色体的植物或种子。本发明还提供了从具有包含SEQ ID NO：1和含与cspB基因可操作地连接的截短的水稻肌动蛋白启动子的异源转基因插入片段的染色体的玉米种子制备的加工食物或饲料产品，其中该加工食物或饲料产品包含可检测量的含有序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或其互补序列的多核苷酸。在某些实施方式中，食物或饲料产品包括玉米面、玉米粉、玉米麸、玉米油和玉米淀粉。在某些实施方式中，多核苷酸可包含核苷酸序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或其互补序列。在其它实施方式中，多核苷酸还可包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：24中含有的核苷酸序列。
根据本发明的另一方面，核苷酸引物对被用在DNA检测方法中，其中当用在核酸扩增方法中时，该引物对产生了包含SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4中任一序列的扩增子。以该方式产生的扩增子中SEQID NO：1-SEQ ID NO：4中的任一序列的检测用于鉴别以该检测方法分析的样品中来自玉米植物MON87460中的核酸的存在。这些方法包括：(a)将包含MON87460基因组DNA的样品与DNA引物对接触；和(b)进行核酸扩增反应，从而产生扩增子；和(c)检测所述扩增子，其中所述扩增子包含SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4。
根据本发明的另一方面，提供了检测样品中特别地对应于玉米植物MON87460 DNA的DNA存在的方法。这些方法包括：(a)将含有MON87460 DNA的样品与包含SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4中的任一序列的DNA探针、或在严格杂交条件下与来自玉米事件MON87460的基因组DNA杂交但在严格杂交条件下不与非MON87460玉米植物DNA杂交的与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4基本同源的DNA分子接触；(b)使样品和探针经受严格杂交条件；和(c)检测探针与玉米植物MON87460 DNA的杂交。
根据本发明的另一方面，提供了产生水分亏缺应激耐受的玉米植物的方法，且该方法包括将事件MON87460的第一亲本纯合玉米植物与缺乏水分亏缺应激耐受性状的第二亲本纯合玉米植物杂交的步骤，从而产生水分亏缺应激耐受的杂交后代植物。在某些实施方式中，提供了产生干旱耐受的玉米植物的方法，该方法包括将包含SEQ IDNO：1和含可操作地与cspB基因连接的截短的水稻肌动蛋白启动子的异源转基因插入片段的第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物杂交，从而产生多个干旱耐受的后代植物。在其他实施方式中，插入片段可包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：24。
本发明的另一方面为通过使用DNA扩增反应和两个引物组确定玉米事件MON87460的后代的接合性的方法。第一引物组被用于扩增MON87460玉米DNA，第二个引物组被用于扩增包含MON87460基因组DNA中的转基因插入位点的天然玉米序列。当用于扩增的模板是MON87460纯合的玉米植物DNA时，仅由第一引物组产生扩增子。当用于扩增的模板是MON87460杂合的玉米植物DNA时，第一和第二引物组均产生扩增子。
本发明还包括其基因组中包含SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4中任一序列的杂交玉米种子，其中在用于产生所述杂交种子的杂交中至少一个亲本为MON87460。
下面具体描述了本发明的其他具体实施方式。
附图简述
图1提供了pMON73608的质粒图谱。
图2表明了玉米植物MON87460中转基因插入片段的基因组构成。
图3提供了MON87460的转基因和基因组DNA接合区的序列(SEQ ID NO：24)。玉米基因组侧翼DNA序列以小写字母显示。由pMON73608插入的转基因序列以大写字母显示。
具体实施方式
本文称为“MON87460”或“CspB-Zm事件MON87460”的转基因玉米植物对水分亏缺应激是耐受的，这是由于在所述转基因植物的细胞中表达来自大肠杆菌的cspB蛋白质的结果。使用水分亏缺应激耐受的玉米将会给玉米生产者提供重要益处，例如在年平均降雨量不足以支持野生型玉米植物的农业高效生产的西部干旱地区的耕地提供高5-10％的玉米产量。此外，与野生型玉米植物相比，MON87460玉米植物通过在干旱条件下提供较高玉米产量为中部、东部和南部玉米带提供了干旱保障的益处。在玉米通常在灌溉下生长的区域中，玉米生产者也能受益于节省的灌溉成本。
如本文所使用的，“水分亏缺”是指当植物获得水分的速率不能补充植物消耗水分的速率的时期。长时期的水分亏缺被俗称为干旱，其可导致作物损失，即使是具有本发明的染色体的作物。对于植物的生长速率而言，如果存在地下水的储备，缺乏雨水或灌溉可能不会立即产生水应激。生长在地下水充足的土壤中的植物在没有雨水或灌溉的情况下可以存活数日，而不会对产量产生负面影响。而生长在干燥土壤中的植物容易在水缺乏的极短时间内遭受负面影响。严重的水应激会导致枯萎和植物死亡；中等程度的干旱会导致产量降低、生长阻碍或发育迟缓。植物可以从一定时期的水应激中恢复，而不会严重影响产量。但是，授粉时期的水应激会对产量降低造成不可逆转的影响。因此，在玉米生长周期中用于观察水应激耐受性的有用时期是抽穗之前的后营养生长阶段。水应激耐受性的测试通常是通过与对照植物的对比完成的。例如，本发明的植物比对照植物在水分亏缺的情况下以更高的产量存活。在实验室和田间试验中，可以通过给予本发明的植物和对照植物少于最佳施水的对照植物的水和测量性状的差异来模拟干旱。
通过自交玉米系用载体pMON73608(图1)进行的土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化来产生玉米植物MON87460。该载体包含由水稻肌动蛋白启动子、水稻肌动蛋白内含子和tr7 3’聚腺苷酸化序列调控的cspB编码区，和由CaMV 35S启动子和NOS 3’聚腺苷酸化序列调控的nptII编码区。通过具体的分子分析来鉴定由载体pMON73608产生的事件。
当重组DNA插入到细胞核染色体中的位置上时，在植物中发生转基因事件。在统计学上，任意两个独立的转基因事件相同是不可能的。由特定事件再生的植物通常具有性状上的一致性。并不是所有的转基因事件都提供本发明的转基因植物的种子、植物或细胞核，这是由于存在许多种因素，例如染色体中重组DNA的位置、拷贝数和完整性、其他DNA的意外的插入等。因此，通过筛选转基因植物或其后代种子的增强的水分亏缺耐受性来识别理想的转基因事件。
已知植物中外源基因的表达受它们的染色体位置的影响，这有可能是由于染色质的结构(例如异染色质)或转录调控元件(例如增强子)接近整合位点的邻近性(Weising等人，Ann.Rev.Genet 22：421-477，1988)。出于该原因，为了识别具有导入的目的基因的最佳表达的植物，通常需要筛选大量的植物。例如，已在植物和其他生物体中观察到，导入的转基因的表达水平在植物中存在很大差别。在表达的空间或时间模式中也有可能存在差异，例如在不同的植物组织中转基因的相对表达的差异，其可能与导入的基因构建体中存在的转录调控元件所预期的模式不对应。具有理想的转基因表达水平或模式的植物可使用常规的育种方法通过有性杂交将转基因渗入到其他遗传背景中。这种杂交的后代维持了原始转化体的转基因表达特性。该策略被用于确保在多种品种中的可靠的基因表达，这些品种良好地适应于当地的生长条件和市场需求。
使用Southern印迹分析对pMON73608转化所产生的事件进行筛选，得到插入数(玉米基因组内的整合位点的数目)、拷贝数(一个基因座内的T-DNA的拷贝数)、插入盒的完整性和骨架序列的缺失。探针包括完整的cspB和nptII编码区，以及它们相应的启动子、内含子和聚腺苷酸化序列和载体质粒骨架。从约140个初始转化体中，通过基于拷贝数和用于表型分析的骨架分析以识别具有cspB表达的改良表型的植物对事件进行选择。基于温室的水分亏缺耐受测试的结果确认具有水分亏缺耐受性的许多独立转化体。在田间生长条件下，对22个选择的水分亏缺耐受的转化体进行的田间测试识别到10个改良的事件，其被进一步测试它们的水分亏缺耐受性及产量提高和稳定性。这些进一步的分析的结果确认MON87460具有优良的改良表型。MON87460的大量分子鉴定表明，该事件包含单个T-DNA插入片段以及cspB和nptII盒的各一个拷贝。Northern印迹分析确认在MON87460中产生了预期大小的cspB和nptII的转录产物。该数据还令人意外地证明，在MON87460中不存在土壤杆菌的右边界片段，并出现调控cspB基因表达的水稻肌动蛋白启动子的截短，因而仅存在启动子DNA的(pMON73608中存在的844bp的)108bp。
进行PCR和DNA序列分析来确定5’和3’插入片段与植物基因组的接合、确认插入片段内元件的构成(图2)，和确定玉米植物MON87460中插入片段的完整DNA序列(SEQ ID NO：5)。分析确认，在MON87460中原位(in planta)T-DNA与来自pMON73608的相应序列相同。序列分析还识别到MON87460插入片段的1060bp的5’和1260bp的3’侧翼序列。与用于转化的自交系野生型DNA的序列进行对比显示，在MON87460 T-DNA的整合位点处出现了玉米基因组DNA的22bp的缺失。
为了确定有性杂交的后代是否包含感兴趣的转基因/基因组DNA，能够检测到MON87460转基因/基因组DNA的存在是有利的。此外，根据要求上市前批准和对源自重组作物的食品进行标记的规定，检测MON87460的方法是有用的。有可能通过任何公知的核酸检测方法(例如聚合酶链反应(PCR)或使用多核苷酸探针的DNA杂交)来检测转基因的存在。这些检测方法通常使用对作为DNA构建体的转基因部件的遗传元件(例如启动子、前导序列、内含子、编码区、3’转录终止子、标记基因等)具有特异性的DNA引物和探针分子。这样的方法对于区别不同的转基因事件(特别是使用相同的转基因DNA构建体产生的那些转基因事件)可能是无用的，除非邻近插入的转基因DNA的基因组DNA序列是已知的。本发明提供了用于检测MON87460的新型转基因/基因组DNA边界接合的序列和测定。
除非另外定义，所用所有技术和科学术语均与本发明所属技术领域技术人员的通常理解的意义相同。通常，所用的命名法和下面所述的制备和实验室程序是本领域公知的和常规使用的。在这些过程中使用常规方法，例如在现有技术和各种通用参考书中提供的方法。除非另外说明，本说明书文字中的核酸序列是按照5’到3’的方向(从左向右读)给出的。根据规定，提供的核酸序列可能是DNA或RNA；正如本领域技术人员公知的，公开其中的一个必然限定了另一个。此外，如本领域技术人员公知的，公开了本文给出的核酸序列必然限定了其互补序列。当术语是单数形式时，本发明人还设想了以该术语的复数形式描述本发明的方面。所用的命名法和下面所述的实验室程序是本领域公知和常规使用的。当与通过引用方式结合在本文中的参考文献中所用的术语和定义存在差异时，本发明所用的术语以给出的定义为准。所用的其他技术术语具有它们在所属技术领域中使用的如众多技术词典所示例的常规含义。分子生物学中常用术语的定义可参见Rieger等人，Glossary of Genetics：Classical and Molecular，5th edition，Springer-Verlag：New York，1991；和Lewin，Genes V，OxfordUniversity Press：New York，1994。
如本文所用的，术语“玉米”是指玉蜀黍(Zfea mays)，并包括可与玉米植物MON87460育种的所有植物品种。
转基因“事件”是通过用异源DNA(即包含目的转基因的核酸构建体)转化植物细胞、再生通过将转基因插入到植物的基因组中得到的植物群体、以及选择特征在于插入到特定基因组位点的特定植物而产生的。具有重组DNA杂合或纯合的染色体的相同细胞核的转基因后代被认为代表相同的转基因事件。一旦针对性状的转基因已被导入植物，该基因就可通过杂交被导入与第一植物性相容的任何植物中，而无需直接转化第二植物。当在育种程序中使用该事件时，异源DNA和邻近插入DNA的侧翼基因组序列将会被转入后代中，且通过向植物基因组中导入异源DNA所产生的增强的性状会在接受该异源DNA的后代中维持。
术语“事件”还指由于包含插入的DNA(例如原始转化体和由自交产生的后代)的一个亲本系与不包含插入的DNA的亲本系有性杂交，在接受插入DNA(包括目标转基因)的后代中存在来自原始转化体的DNA(包含插入的DNA和紧邻插入DNA的侧翼基因组序列)。术语“后代”是指根据本发明制备的亲本植物的任一世代的后代。转基因“事件”因此可为任何世代的。术语“事件”是指原始转化体和包含异源DNA的转化体的后代。术语“事件”还指通过转化体与包含该异源DNA的另一品种之间的有性异交所产生的后代。即使在重复的回交成回交亲本后，来自转化亲本的插入的DNA和侧翼DNA也存在于杂交后代的相同染色体位置上。
本发明涉及源自MON87460的事件MON87460 DNA、植物细胞、组织、种子和加工产品。MON87460玉米植物可以自花授粉，以产生MON87460多核苷酸纯合的自交系。纯合种子可以生长以产生用于与其他自交玉米植物杂交而产生杂合杂交玉米种子的纯合后代MON87460事件玉米植物。MON87460杂交玉米种子可生长成为与对照植物相比表现出水分亏缺耐受性和在应激条件下具有增加的产量的杂交玉米植物。
可以来自MON87460的产品包括由玉米事件MON87460产生的食品和商品。这样的食品和商品预期包含(如果在充分水平检测的话)诊断该商品和食品中玉米事件MON87460物质的存在的多核苷酸。这样的食品或商品的例子包括但不限于玉米油、玉米面、玉米粉、玉米麸、玉米蛋糕、玉米淀粉，以及意图作为动物或其它的食物源消费的任何其他食品、意图作为填充剂或意图作为化妆用途的化妆品组合物中的组分等。
还可以理解的是，两种不同的转基因植物可进行交配，以产生包含两种独立地隔离加入的外源基因的后代。适当后代的自交可产生对加入的两种外源基因纯合的植物。或者，包含单个外源基因的自交系可以杂交，产生对各基因为杂合的且可用于产生由于各外源基因的表达而表现出多种有益表型的杂交玉米植物的杂交种子。通常用于不同性状和作物的育种方法的描述可参见各种参考文献，例如Allard，“Principles of Plant Breeding，”John Wiley & Sons，NY，U.of CA，Davis，CA，50-98，1960；Simmonds，“Principles of Crop Improvement，”Longman，Inc.，NY，369-399，1979；Sneep和Hendriksen，“PlantBreeding Perspectives，”Wageningen(ed)，Center for AgriculturalPublishing and Documentation，1979。本发明特别感兴趣的是开发表达cspB蛋白质和来自土壤杆菌菌株CP4的草甘膦抗性5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(CP4 EPSPS)蛋白质(其使植物具有草甘膦的耐药性)(美国专利5633435)的MON87460事件玉米植物。“草甘膦”是指N-膦酰甲基甘氨酸及其盐。N-膦酰甲基甘氨酸是对广谱植物物种具有活性的公知的除草剂。草甘膦是(Monsanto Co.)的活性成分，是在环境中具有相当短的半衰期的安全的除草剂。草甘膦是除草剂(Monsanto Co.)的活性成分。使用“草甘膦除草剂”处理是指使用RoundupRoundup除草剂或任何其他含草甘膦的除草剂制剂。市售的草甘膦制剂的例子包括但不限于Monsanto Company销售的ULTRA、ULTRAMAX、WEATHERMAX、CT、EXTRA、BIACTIVE、BIOFORCE、和除草剂，它们均包含异丙基铵盐形式的草甘膦；MonsantoCompany销售的DRY和除草剂，它们包含铵盐形式的草甘膦；Monsanto Company销售的GEOFORCE，其包含钠盐形式的草甘膦；和Syngenta Crop Protection销售的除草剂，其包含三甲基锍盐形式的草甘膦。当应用到植物表面上时，草甘膦在整个植物系统中移动。草甘膦由于其抑制莽草酸途径(该途径提供了芳香氨基酸合成的前体)而具有植物毒性。草甘膦抑制植物中发现的5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSPS)。通过表达细菌EPSPS变体和植物EPSPS变体(这些变体对草甘膦具有较低的亲和力，因而在草甘膦的存在下可以保持它们的催化活性)，可以获得草甘膦耐受性(美国专利No.5,633,435、5,094,945、4,535,060和6,040,497)。
如本文所用的，当提到“分离的DNA分子”时，是指单独或与其他组成组合存在的、但不处于其天然环境中的DNA分子。例如，在玉米基因组DNA内天然发现的编码序列、内含子序列、未翻译的前导序列、启动子序列、转录终止序列等，只要它们还在玉米基因组中，就不认为是与玉米基因组分离的。但是，这些组件中的各个和这些组件的亚部分，只要该结构和组件不是在玉米基因组内，在本发明的范围内就被认为是“分离的”。
出于本发明的目的，无论其是否存在于用来转化产生MON87460事件的玉米细胞的质粒内、存在于事件MON87460的基因组内，或以可检测的量存在于源自事件MON87460的组织、后代、生物样品或商品中，任何转基因核苷酸序列(即插入到玉米植物事件MON87460的细胞基因组中的DNA的核苷酸序列)将会被认为是分离的核苷酸序列。如果DNA分子可从来自植物或种子或植物器官的细胞、组织，或匀浆提取的话，或如果DNA分子可作为来自植物或种子或植物器官的细胞、组织或匀浆提取的DNA或RNA的扩增子产生的话(以上任一种均源自从事件MON87460获得的这类材料)，核苷酸序列或由此获得的任何片段将会被认为是分离的或可分离的。对于该问题，如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的交接序列以及也包含这些交接序列的源自事件MON87460的核苷酸序列也被认为是分离的或可分离的，无论这些序列是否存在于事件MON87460的细胞的基因组内或以可检测的量存在于源自事件MON87460的组织、后代、生物样品或商品中。
如本文所用的，转基因/基因组接合区是被插入到基因组中的转化载体的异源DNA与玉米植物基因组DNA连接的点。接合多核苷酸跨越转基因/基因组接合区，且在任何特定的转基因植物事件中都是新颖的。因此，在生物样品中检测接合多核苷酸可鉴别特定植物事件的存在。在本发明中，样品中SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4接合多核苷酸的存在可鉴别样品中MON87460 DNA的存在。
“探针”是其上连接常规可检测的标记或报告分子(例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶)的多核苷酸。探针与目标核酸链互补，在本发明的情况中，探针与来自MON87460的基因组DNA链(无论是来自MON87460植物还是来自包含MON87460 DNA的样品)互补。根据本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括聚酰胺和其他特异性地与目标DNA序列结合并可用于检测该目标DNA序列的存在的探针物质。
DNA引物是通过核酸杂交与互补目标DNA链退火以在引物和目标DNA链之间形成杂化物，然后在聚合酶(例如DNA聚合酶)的作用下沿着目标DNA链延伸的分离的多核苷酸。本发明的DNA引物对或DNA引物组是指用于例如通过聚合酶链反应(PCR)或其他常规多核苷酸扩增方法扩增目标核酸序列的两个DNA引物。
DNA探针和DNA引物通常是11多核苷酸或更长，通常是18多核苷酸或更长、24多核苷酸或更长、30多核苷酸或更长。选择具有足够的长度的探针或引物，以在高严格性杂交条件下与目标序列特异性地杂交。尽管可以通过常规方法设计保留与目标序列杂交能力的不同于目标序列的探针，优选地本发明的探针和引物与目标序列具有完全的序列相似性。
制备和使用多核苷酸探针和引物的方法描述在例如MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，vol.1-3，ed.Sambrook等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989(hereinafter，″Sambrook等人，1989″)；Current Protocols in MolecularBiology，ed.Ausubel等人，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，1992(定期更新)(下文称为″Ausubel等人，1992”)；和Innis等人，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，AcademicPress：San Diego，1990。例如，通过使用用于该目的的计算机程序(例如Primer(Version 0.5，1991，Whitehead Institute for BiomedicalResearch，Cambridge，MA))可从如已知序列获得PCR DNA引物对。
本发明的核酸探针和引物在严格条件下与目标DNA分子杂交。任何常规核酸杂交或扩增方法均可用于鉴别样品中来自转基因植物的DNA的存在。也被称为核酸部分的多核酸分子或其片段在某些情况下能够特异性地与其他核酸分子杂交。如本文所用的，如果两个分子能够形成反平行双链核酸结构，则这两个核酸分子被称为能够特异性地相互杂交。如果核酸分子具有完全互补性，则一个核酸分子被称为是另一核酸分子的“互补序列”。如本文所用的，当一个分子的每个核苷酸均与另一个分子的核苷酸互补时，分子被称为具有“完全互补性”。如果两个分子在至少常规的“低严格性”条件下能够以允许它们彼此保持退火的稳定性相互杂交的话，则这两个分子被称为“最低互补的”。类似地，如果两个分子在常规的“高严格性”条件下能够以足以允许它们保持彼此退火的稳定性相互杂交的话，这两个分子被称为“互补的”。常规的严格性条件描述在Sambrook等人，1989，和Haymes等人，In：Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRLPress，Washington，DC(1985)中。因此，偏离完全互补性是允许的，只要该偏离不会完全排除分子形成双链结构的能力即可。为了使核酸分子用作引物或探针，仅需要在所用的特定的溶剂和盐浓度下在序列中具有能够形成稳定的双链结构的足够互补性即可。
如本文所用的，基本同源序列为在高严格性条件下特异性地与其所对比的核酸序列的互补序列杂交的核酸序列。促进DNA杂交的合适的严格性条件(例如在约45℃下使用6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，然后在50℃下再使用2.0xSSC洗涤)是本领域技术人员已知的，或可参见Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。例如，洗涤步骤中的盐浓度可选自50℃下约2.0xSSC的低严格性条件到50℃下约0.2xSSC的高严格性条件。此外，洗涤步骤中的温度可从室温下(约22℃)的低严格性条件上升至约65℃的高严格性条件。温度和盐均可以变化，或者温度或盐浓度中的任一个可以维持恒定而另一个变量改变。
在优选的实施方式中，本发明的多核苷酸将与SEQ ID NO：1-7所示的一个或多个核酸分子或其互补序列或片段在中等严格条件下(例如约2.0xSSC和约65℃)杂交。在特别优选的实施方式中，本发明的核酸将与SEQ ID NO：1-7所示的一个或多个核酸分子或其互补序列或片段在高严格性条件下杂交。
如本文所用的，“扩增的DNA”或“扩增子”是指使用扩增技术(例如PCR)合成的多核苷酸。本文所用的术语“扩增子”特别排除可能在DNA扩增反应中形成的引物二聚体。
对于使用特定的扩增引物对扩增目标核酸序列(例如通过PCR)，“严格条件”为允许引物对仅与目标核酸序列(具有对应的野生型序列(或其互补序列)的引物将与其结合)杂交并优选在DNA热扩增反应中产生独特的扩增产物(扩增子)的条件。术语“(目标序列)特异性的”是指在严格杂交条件下探针或引物仅与包含目标序列的样品中的目标序列杂交。
源自邻近转基因插入DNA的植物基因组序列的引物对的成员位置与插入的DNA序列间隔一定距离，该距离可为一个核苷酸碱基对至多达约两万个核苷酸碱基对。同样，源自转基因插入DNA的引物对的成员位置与植物基因组序列接合区间隔一定距离，该距离可为一个核苷酸碱基对至约转基因插入片段的全长。扩增子的长度可为引物对加上一个核苷酸碱基对，但优选为约50个碱基对或更长，例如多达500个或甚至于1000个核苷酸长度的总长度。通常，在PCR反应中较小尺寸的扩增子更加可靠地产生，允许使用较短的循环时间，且可以容易在琼脂糖凝胶上分离和显色或适应于TaqMan测定，例如末端和实时Taqman。或者，引物对可源自插入的异源DNA两侧的基因组序列，以产生包含完整的插入多核苷酸序列(例如从SEQ ID NO：5分离的正向引物和从SEQ ID NO：6分离的反向引物)的扩增子，其扩增了包含被插入到MON87460基因组中的pMON73608 DNA片段的DNA分子，该插入片段包含约3309个核苷酸(SEQ ID NO：7)，如图3中的大写字母所示。
为了确定来自有性杂交的玉米植物是否包含来自本发明的玉米植物MON87460植物的转基因植物基因组DNA，对从玉米植物组织样品中提取的DNA使用包括源自MON87460植物基因组中邻近插入的异源DNA(转基因DNA)插入位点的DNA序列的第一引物和源自插入的异源DNA的第二引物的引物对进行多核苷酸扩增方法，以产生用于鉴别MON87460植物DNA的存在的扩增子。用于鉴别的扩增子取决于引物位置具有特定的长度，并包含用于鉴别特定的植物事件基因组DNA的特定的接合多核苷酸序列。可以通过例如测序扩增子DNA或通过与特定探针杂交来确定扩增子中接合多核苷酸序列的存在。在本发明中，用于鉴别MON87460的存在的扩增子的DNA序列包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。更具体而言，在本发明的实施方式中，用于鉴别MON87460的存在的扩增子的长度为68nt并包含SEQ ID NO：2，并可通过与包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：10或SEQID NO：16中任一序列的标记探针杂交进行检测。
可以通过本领域已知的各种扩增方法中的任何方法(包括聚合酶链反应(PCR))来实现多核苷酸的扩增。扩增方法是本领域已知的，并描述在特别是美国专利No.4,683,195和4,683,202中和PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，ed.Innis等人，Academic Press，San Diego，1990中。已经发展了PCR扩增方法来扩增多达22kb(千碱基对)的基因组DNA和多达42kb的噬菌体DNA(Cheng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5695-5699，1994)。这些方法和DNA扩增领域中已知的其他方法可用于实施本发明。可以通过使用源自本发明提供的序列的引物扩增来自MON87460种子或从已经保藏在ATCC中(保藏号PTA-891O)的种子生长的植物的这类DNA分子，然后使用PCR扩增子或其克隆的DNA片段的标准DNA测序确认来自MON87460的异源DNA插入片段或侧翼基因组DNA序列(如果需要的话进行校正)。
基于DNA扩增方法的DNA检测试剂盒包含在合适的反应条件下特异性地与目标DNA杂交并扩增用于鉴别的扩增子的DNA引物分子。其中扩增子包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的由MON87460DNA产生的任何长度的扩增子是本发明的一个方面。本领域技术人员将会认识到第一和第二DNA引物分子并不要求仅由DNA构成，还可以仅由RNA、DNA和RNA的混合物，或DNA、RNA或不作为一个或多个聚合酶的模板的其他核苷酸或其类似物的组合构成。此外，本领域技术人员将会认识到，本文所示的探针或引物应该具有至少约11、12、13、14、15、16、17、18、19和20个连续核苷酸的长度，且选自如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3(随意地命名为5’接合区)、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4(随意地命名为3’接合区)、SEQ ID NO：5(随意地命名为5’侧翼序列)、SEQ ID NO：6(随意地命名为3’侧翼序列)和SEQ ID NO：7(插入的转基因序列)所示的核苷酸序列。当选自SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列时，具有至少约21-约50或更多连续核苷酸的长度的探针和引物也是可能的。
试剂盒可以提供基于琼脂糖凝胶的检测方法或许多本领域已知的用于鉴别的扩增子的检测方法。本发明的一个目的为包含与SEQID NO：5或SEQ ID NO：6的玉米基因组区域的任何部分和与SEQ IDNO：7的转基因插入区域的任何部分同源或互补的DNA引物的试剂盒。特异性地确认为可用于DNA扩增方法中的引物对的是：扩增与MON87460的5’转基因/基因组区域的一部分同源的用于鉴别的扩增子的SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9，其中该扩增子包含SEQ ID NO：2。可作为DNA引物的其他DNA分子可通过DNA扩增领域的技术人员从公开的MON87460转基因/基因组DNA序列中进行选择。
可以通过多种技术来检测通过这些方法产生的用于鉴别的扩增子。这样的一种方法为Genetic Bit分析(Nikiforov等人，Nucleic AcidRes.22：4167-4175，1994)，其中设计了与邻近的侧翼基因组DNA序列和插入的DNA序列重叠的DNA寡核苷酸。将该寡核苷酸固定在微量滴定板的孔内。在进行目标区的PCR后(使用插入序列中的一个引物和邻近侧翼基因组序列中的一个引物)，单链PCR产物可与固定的寡核苷酸杂交，并作为使用DNA聚合酶和对预期的下一碱基特异性的标记二脱氧核苷三磷酸(ddNTP)的单碱基延伸反应的模板。读数可以是基于荧光或ELISA的。信号由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸而表示存在转基因/基因组序列。
另一方法为如Winge(Innov.Pharma.Tech.00：18-24，2000)描述的焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术。该方法中，设计了与邻近基因组DNA和插入的DNA接合区重叠的寡核苷酸。该寡核苷酸与来自目标区域的单链PCR产物杂交(插入序列中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)，并在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、腺苷5’磷酸硫酸和荧光素的存在下进行温育。单独地加入DNTP，且掺入造成了所测量的光信号。光信号由于成功的扩增、杂交和单或多碱基延伸表明存在转基因/基因组序列。
Chen等人，(Genome Res.9：492-498，1999)描述的荧光偏振是可用于检测本发明的扩增子的方法。通过使用该方法，设计了与基因组侧翼和插入DNA接合区重叠的寡核苷酸。该寡核苷酸与来自目标区域的单链PCR产物杂交(使用插入的DNA中的一个引物和侧翼基因组DNA序列中的一个引物)，并在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP的存在下进行温育。单碱基延伸造成了ddNTP的掺入。可以使用荧光计通过偏振的改变来测量掺入。偏振中的改变由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸而表明存在转基因/基因组序列。
(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)被描述为检测和定量DNA序列的存在的方法，且在厂商所提供的说明书中有完整的描述。简而言之，设计了与基因组侧翼和插入DNA接合区重叠的FRET(荧光共振能量转移)寡核苷酸探针。在耐热聚合酶和dNTP的存在下，FRET探针和PCR引物(插入DNA序列中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)进行循环。FRET探针的杂交造成了荧光部分(例如6FAMTM和VICTM)的裂解和释放，离开猝灭染料(例如用于常规探针的TAMRA(四甲基-6-羧基罗丹明)或用于MGB探针的非荧光小沟结合化合物)。当使用TAMRA或MGB探针时，在PCR过程中聚合酶切割结合的探针，以FRET不能发生的程度分离荧光团和猝灭剂，因而荧光信号表明存在转基因/基因组序列。
Tyangi等人(Nature Biotech.14：303-308，1996)中已描述用于序列检测的分子信标(Molecular Beacon)。简而言之，设计了与侧翼基因组和插入DNA接合区重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构使其包含维持荧光和猝灭部分紧密接近的二级结构。在热稳定聚合酶和dNTP的存在下FRET探针和PCR引物(插入DNA序列中的一个引物和侧翼基因组序列中的一个引物)进行循环。在成功的PCR扩增后，FRET探针与目标序列的杂交导致了探针二级结构的破坏以及荧光和猝灭部分的空间分离。荧光信号由于成功的扩增和杂交表明存在侧翼/转基因插入序列。
其他描述的方法(例如微流体(美国专利公布No.2006068398、美国专利No.6,544,734))可用于分离和扩增DNA样品。光学染料可用于检测和定量特定的DNA分子(WO/05017181)。已描述了包含用于检测DNA分子的电子传感器或结合特定DNA分子的纳米珠的纳米管装置(WO/06024023)。
可以使用本文公开的组合物和DNA检测领域公知的方法研发DNA检测试剂盒。该试剂盒可用于识别样品中的玉米植物MON87460DNA，并可用于包含MON87460DNA的玉米植物的育种方法中。试剂盒包含用作引物或探针且与SEQ ID NO：1-7中的至少一部分同源或互补的DNA分子。DNA分子可用在DNA扩增方法(PCR)中，或作为核酸杂交方法(例如Southern分析和Northern分析)中的探针。
在本发明的另一方面中，用于鉴别MON87460 DNA的存在的优选的本发明多核苷酸具有SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：25所示的序列。SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4和较大的基因组/转基因接合多核苷酸(例如SEQ ID NO：5-7中的接合多核苷酸)还可在植物育种方法中用作标记来识别遗传杂交的后代，与″DNA markers：Protocols，applications，and overviews：(1997)173-185，Cregan等人，eds.，Wiley-Liss NY中描述的简单序列重复DNA标记分析的方法类似。可以使用本领域技术人员已知的许多方法来检测探针与目标DNA分子的杂交，这些方法包括但不限于荧光标签、放射性标签、基于抗体的标签和化学发光标签。本发明的另一方面中，本发明的优选的标记核酸分子与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：7所示的核酸序列或其互补序列或任一的片段具有80％-100％或90％-100％的序列同一性。在本发明的进一步的方面中，本发明优选的标记核酸分子与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：7所示的序列或其互补序列或任一的片段具有95％-100％的序列同一性。
本文还提供了缺乏选择标记基因或缺乏完整的选择标记基因的水分亏缺耐受的玉米植物。可以通过包括以下步骤的方法获得这样的植物：将包含赋予水分亏缺耐受性的异源转基因插入片段和选择标记基因的玉米染色体暴露于一种或多种重组诱导剂，并选择包含赋予水分亏缺耐受性的异源转基因插入片段的玉米植物，其中选择标记基因已被完全或部分除去或其中选择标记基因已被破坏。赋予水分亏缺耐受性并包含选择标记的异源转基因插入片段包括但不限于包含SEQID NO：7的插入片段或包含SEQ ID NO：1的插入片段、与cspB基因可操作地连接的截短的水稻肌动蛋白启动子、选择标记基因和SEQID NO：2。包含赋予水分亏缺耐受性的异源转基因插入片段和选择标记基因的玉米染色体还包括但不限于：包含SEQ ID NO：24的玉米染色体、已保藏在ATCC(保藏号PTA-8910，ATCC，10801 UniversityBlvd.，Manassas，VA，美国)的玉米植物及其后代的玉米染色体。赋予水分亏缺耐受性的异源转基因插入片包括但不限于：包含SEQ ID NO：1和与cspB基因可操作地连接的截短的水稻肌动蛋白启动子的插入片段，以及包含SEQ ID NO：1和与cspB基因可操作地连接的截短的水稻肌动蛋白启动子的插入片段，其中插入片段的5’端与SEQ ID NO：1的3’末端重叠。
本文所用的短语“可操作地连接的”是指核酸序列的连接以使得一个序列可为连接的序列提供所需的功能。当谈到启动子时，“可操作地连接的”是指启动子与目标序列相连，从而该目标序列的转录受该启动子的控制和调节。当目标序列编码蛋白质时和当希望获得该蛋白质的表达时，“可操作地连接的”是指启动子与序列连接的方式使得所获得的转录体能被有效地翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录融合体且希望获得编码蛋白质的表达的话，则形成连接以使得得到的转录体中的第一翻译起始密码子为编码序列的起始密码子。或者，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合体且希望获得编码蛋白质的表达的话，则形成连接以使得包含在5’未翻译的序列中的第一翻译起始密码子与启动子相关，且进行连接从而得到的翻译产物与编码所需蛋白质的翻译开放阅读框的同框(in frame)。可以可操作地连接的核酸序列包括但不限于：提供基因表达功能的序列(即基因表达元件，例如启动子、5’非翻译区、内含子、蛋白质编码区、3’非翻译区、聚腺苷酸化位点和/或转录终止子)、提供DNA转移和/或整合功能的序列(即T-DNA边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点)、提供选择性功能的序列(即抗生素耐药性标记、生物合成基因)、提供可记分的标记功能的序列(即报道基因)、有利于体外或体内序列操作的序列(即多接头序列、位点特异性重组酶的靶序列)和提供复制功能的序列(即细菌复制起点、自主复制序列、着丝粒序列)。
重组诱导剂可包括电离辐射和/或用于消除或改变多核苷酸序列的任何化合物、蛋白质和/或核酸。重组诱导剂因此包括但不限于：提供同源重组、非同源重组、位点特异性重组和/或基因组修饰的试剂。重组诱导剂提供的基因组修饰因此包括但不限于：插入、缺失、反转和/或核酸置换。已经公开了使用重组诱导剂在植物中诱导基因修饰(Lloyd等人，Proc Natl Acad Sci U S A.，102(6)：2232，2005)。重组剂可为天然的或工程化的。位点特异性重组酶包括但不限于：Cre-重组酶、FLP重组酶、翻转酶(Flippase)等。重组诱导剂还包括但不限于核酸酶。可用的核酸酶包括但不限于：大范围核酸酶(meganuclease)和锌指核酸酶。其他重组诱导剂包括但不限于：同源置换序列和非同源置换序列。在某些实施方式中，重组诱导剂可包括核酸酶和同源或非同源置换序列。在某些实施方式中，可以使用能够切割在SEQ ID NO：24的lox位点之间的选择标记的cre-重组酶。已经公开了植物中lox位点侧邻序列的Cre-介导的消除(美国专利No.5,658,772)。
通过诱导目标序列中双链断裂、提供缺乏选择标记基因的同源置换序列或其部分以及回收其中置换序列已经整合入原驻留序列(resident sequence)的位置的复植物，可以实现选择标记基因、其部分或其他序列的消除或破坏。同源置换序列可在用于染色体中的驻留序列用置换序列同源重组和置换的双链断裂的两个末端包含同源序列。已经公开了作物(例如烟草和玉米)中靶向双链断裂诱导的同源重组(Wright等人，Plant J.44，693，2005；D’Halluin等人，Plant Biotech.J.6：93，2008)。还有可能通过非同源末端连接或非同源末端连接和同源重组的结合将同源置换序列插入到目标核酸酶切割位点中(综述参见Puchta，J.Exp.Bot.56，1，2005)。还公开了通过非同源末端连接或非同源末端连接和同源重组的结合将同源置换序列靶向插入到特定植物基因组位点中(Wright等人，Plant J.44，693，2005)。在某些实施方式中，可以使用催化在选择标记基因中至少一个位点特异性的双链断裂的大范围核酸酶。已证明大范围核酸酶适用于遗传修饰，因而它们可被改造或工程化(WO/06097853A1、WO/06097784A1、WO/04067736A2)或合理设计(U.S.20070117128A1)，以在与特定目标序列完全匹配或非常相关的识别序列内进行切割。在这些情况中，给定合理大小的目标(例如选择标记基因序列)，人们可选择或设计将在目标选择标记基因序列内进行切割的核酸酶。或者，可以使用催化选择标记基因中至少一个位点特异性的双链断裂的锌指核酸酶。也公开了这种锌指核酸酶、工程化特异性锌指核酸酶的能力以及它们在植物中用于提供同源重组的用途(WO 03/080809、WO 05/014791、WO 07014275、WO08/021207)。
通过诱导目标序列中的双链断裂、提供缺乏选择标记基因或其部分的非同源置换序列以及其中回收非同源置换序列已经整合入目标序列中的植物，也可以实现选择标记基因、其部分或其他序列的消除或破坏。在某些实施方式中，非同源置换序列可以在两个末端包含与双链断裂的两个末端的单链序列互补的单链序列，以提供置换序列和双链断裂的非同源末端连接。
本文还提供了从头产生与事件MON87460的玉米植物基本相同的玉米植物的方法及生成的植物。这样的方法可以包括使用重组诱导剂。与事件MON87460的玉米植物基本相同的玉米植物包括但不限于：包含具有含与cspB基因可操作地连接的启动子的异源转基因插入片段的染色体的玉米植物，其中转基因插入片段存在于与MON87460中的相同或基本相同的染色体位置或染色体整合位点。可与cspB基因可操作地连接的启动子包括但不限于：水稻肌动蛋白启动子，包括截短的水稻肌动蛋白启动子、玉米RS81启动子、玉米RS324启动子、玉米A3启动子、病毒启动子等。在某些非限制性的实施方式中，人们可以选择、改造或设计核酸酶，以在与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、非转基因玉米植物中跨越SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6的玉米染色体序列或SEQ ID NO：23中的目标序列完全匹配或紧密相关的目标识别序列中进行切割。在这些或其他非限制性的实施方式中，包含与cspB基因可操作地连接的启动子的遗传修饰的玉米植物可通过以下步骤产生：i)将包含与cspB基因可操作地连接的启动子和与目标序列基本相同的侧翼序列的同源置换序列及切割目标序列的核酸酶导入玉米植物细胞中；和ii)选择其中同源置换序列已整合入目标序列中的玉米细胞或玉米植物。考虑到已发现本文公开的玉米染色体目标序列为转基因插入的有利位点，本发明还提供了获得具有一个或多个赋予水分亏缺耐受性以外的性状的转基因或包含赋予水分亏缺耐受性的cspB以外的基因的转基因插入本文公开的目标位点中的植物。
还提供了重组诱导剂和不同的同源置换序列对于包含一个或多个被整合到与赋予水分亏缺耐受性的异源转基因插入片段相同的染色体位置的附加基因的水分亏缺耐受的玉米植物的可用性。与赋予水分亏缺耐受性的基因相同位置的附加基因的整合是有利的，因为附加基因所携带的任何性状都将会与水分亏缺耐受性性状遗传连接，从而有利于育种。在某些实施方式中，附加的一个或多个基因可以是与赋予水分亏缺耐受性的驻留异源转基因插入片段协同工作的基因，以赋予额外的水分亏缺耐受性。在某些实施方式中，附加的一个或多个基因可以是提供水分亏缺耐受性以外的不同和有用性状的一个或多个基因。因此，赋予一个或多个性状的一个或多个基因包括但不限于：赋予除草剂耐药性、虫害抗性、在水充足条件下具有更高产量、改良的种子油、改良的种子淀粉、改良的种子蛋白和/或改善的氮利用的基因。可通过包括如下步骤的方法获得这样的植物：将包含赋予水分亏缺耐受性的异源转基因插入片段的玉米染色体暴露于包含一个或多个附加基因的同源置换序列，并选择包含赋予水分亏缺耐受性的异源转基因插入片段和一个或多个附加基因的玉米植物。在某些实施方式中，可通过使用附加的重组诱导剂来促进同源置换序列的插入。因此，所用的附加重组诱导剂包括但不限于：大范围核酸酶、锌指核酸酶或在双链断裂诱导同源重组的理想位点诱导双链断裂的其他试剂。赋予水分亏缺耐受性的异源转基因插入片段包括但不限于：包含SEQ IDNO：1和与cspB基因可操作地连接的截短的水稻肌动蛋白启动子的插入片段，以及其中插入片段的5’末端与SEQ ID NO：1的3’末端重叠的包含SEQ ID NO：1和与cspB基因可操作地连接的截短的水稻肌动蛋白启动子插入片段。在某些实施方式中，同源置换序列包含用于驻留异源转基因插入片段中的选择标记基因被一个或多个附加基因置换的序列。赋予水分亏缺耐受性并包含选择标记的异源转基因插入片段包括但不限于：包含SEQ ID NO：7的插入片段和包含SEQ ID NO：1和与cspB基因可操作地连接的截短的水稻肌动蛋白启动子的插入片段。包含赋予水分亏缺耐受性的异源转基因插入片段和选择标记基因的玉米染色体也包括但不限于：包含SEQ ID NO：24的玉米染色体、已保藏在ATCC(保藏号PTA-8910)的玉米植物及其后代的玉米染色体。在某些实施方式中，附加的一个或多个基因也可被插入SEQ IDNO：5和/或SEQ ID NO：6中。
还可以预想到，通过位点特异性重组，上述附加的一个或多个基因可被整合到包含SEQ ID NO：1和与cspB基因可操作地连接的截短的水稻肌动蛋白启动子和一个或多个lox位点的染色体中。用于该目的的位点特异性重组系统包括但不限于：FLP重组酶/FRT、cre重组酶/lox及其组合。已公开了位点特异性重组系统在植物和其他真核生物中的用途(美国专利No.5,801,030、美国专利No.5,658,772和美国专利No.6,262,341)。因此，在包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：24的玉米染色体和已经保藏(ATCC保藏号PTA-8910)的玉米植物或其后代的玉米染色体中lox位点特异性重组位点的存在用于将附加基因位点特异性地整合到这些玉米染色体中。在某些实施方式中，侧邻玉米染色体中的lox位点的选择标记序列首先被cre-重组酶切割，从而在染色体中留下单个lox位点。然后可以将附加基因引入包含附加基因和可操作地连接的lox位点的环形DNA分子中，并在染色体中遗留的单个lox位点处整合到玉米染色体中。已经公开了用于产生环形DNA分子和位点特异性地将基因整合到染色体中的示例性方案(Vergunst等人，Nucleic Acid Res.26(11)，279，1998)。本文还提供了在SEQ ID NO：24插入的染色体位置引入lox以外的位点特异性重组位点和在这些重组位点处插入附加基因。
下面的实施例意图显示本发明某些优选实施方式的实例。本领域技术人员知道，下面实施例中公开的技术代表了本发明人已发现能够很好实施本发明的途径，因此可认为构成了实施本发明的优选实施方式的实施例。但是，本领域技术人员根据本发明的公开可理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可对公开的具体实施方式做出许多改变，且仍然能够获得相同或相似的结果。
实施例
实施例1.转基因玉米植物的产生
通过土壤杆菌介导的LH59玉米用载体pMON73608(图1)的转化产生转基因玉米植物。该载体包含由水稻肌动蛋白启动子、水稻肌动蛋白内含子和tr7 3’聚腺苷酸化序列调控的cspB编码区及由35SCaMV启动子和NOS 3’聚腺苷酸化序列调控的nptII编码区。
表1：pMON73608中遗传元件的总结
LH59愈伤组织从未成熟的胚芽开始。从发育的玉米植物上切除1.5mm-2.0mm的未成熟的胚芽，并在愈伤组织初始化培养基上以胚芽轴侧向下培养8-21天。
经标准方法制备土壤杆菌，将50-100片愈伤组织转移到包含约15ml的0.1-1.0x109cfu/ml土壤杆菌悬浮液的Petri盘上。室温下将2mm-8mm直径的愈伤组织片与土壤杆菌悬浮液一起温育约30分钟，然后通过抽吸除去液体。将约50uL的灭菌蒸馏水加到60x20mmPetri盘中的滤纸上。将15-20片接种的愈伤组织转移到各滤纸上，并密封板。黑暗中在23℃下共培养愈伤组织和土壤杆菌约3天。
将愈伤组织从滤纸转移到含羧苄青霉素的愈伤组织起始培养基(medium callus initiation medium)中，并在27℃-28℃下黑暗中培养2-5天。通过将愈伤组织转移到含硝酸银、羧苄青霉素和mg/L巴龙霉素的愈伤组织起始培养基来开始选择。黑暗中在27℃-28℃下培养2周后，将愈伤组织转移到含较高浓度的巴龙霉素的培养基中。两周后将愈伤组织分培养在新鲜的培养基中，并在27℃-28℃下继续黑暗培养2周。再将愈伤组织转移到具有较高浓度的巴龙霉素的培养基中。在27℃-28℃下黑暗中培养2-3周后，鉴别具有巴龙霉素耐药性的愈伤组织。
从转化的愈伤组织再生植物(R0植物)，转移到土壤中，并在温室中生长。用PCR筛选存在cspB和nptII编码区的R0植物，并进行Southern分析来确定插入片段的拷贝。使用Taqman分析来确定载体骨架序列是否存在。选择对cspB和nptII基因两者的存在为阳性、对载体骨架序列的存在为阴性并具有一个或两个插入片段(玉米基因组内的整合位点)的转基因事件用于干旱耐受的生理学分析。阳性事件在温室中生长至成熟并自花授粉。从自花授粉的阳性植物中收集来自通过pMON73608的T-DNA的基因组插入获得的多个转基因事件的纯合、杂合和非转基因种子。
实施例2.温室筛选水分亏缺应激耐受性
由来自用pMON73608转化的转基因事件(实施例1)的杂合种子生长转基因杂合玉米植物，且通过温室筛选的高通量方法来筛选与对照植物相比的水分亏缺应激耐受性，该方法中抑制水分以产生“干旱处理”。通过与对照植物相比的干旱处理过程中高度和生物质的植物生长速率(例如至少10％的增长)来测量水使用效率。还测量了干旱以后苗组织的含水状态。苗初始高度(SIH)为最佳条件下生长三周后植物的高度。苗枯萎高度(SWH)是六天干旱结束时植物的高度。时程实验已经显示，在干旱处理约3天的时候，野生型玉米植物基本上停止生长并开始枯萎。因此，具有提高的水使用效率的转基因玉米植物将会继续生长(尽管可能比在有水的情况下生长速度慢)，并因此在干旱实验结束时明显更高。苗枯萎质量(SWM)是在干旱结束时苗(在土壤线处与根团分离的植物)中湿和干物质的量；在干燥室中2-3周后测量SDM。苗溶胀质量(STM)为SWM加上在黑暗中在40℃的水中浸泡3天转运到植物组织中的水的质量。实验已经表明，大多数的水在24小时内吸收进来，但需要再过2天的时间才能使得进一步的增加变得不显著。STM-SWM是植物中水使用效率的表征，其中从应激中恢复过来比应激耐受性本身更加重要。相对水含量(RWC)是在收获时植物中有多少(％)是水的量度。RWC＝(SWM-SDM)/(STM-SDM)x100。完全灌溉的玉米植物为约98％RWC。通常，在枯萎筛选中，植物为约60％的RWC。在干旱结束时具有较高RWC的植物被认为是更加健康的植物，且更适于干旱后的恢复和生长。使用公式RGR＝(SWH-SIH)/((SWH+SIH)/2)x100来计算各苗的相对生长率(RGR)。
来自包含pMON73608的T-DNA的多个转基因事件的转基因杂合玉米植物(包括MON87460)与对照植物相比，显示出提高的水分亏缺应激耐受性。
实施例3.在水分亏缺下MON87460玉米植物的改良的田间性能
使用市售等级的杂交玉米在水分亏缺处理的目标时期(即正好开花之前的10-14天的时期)内未降雨的试验环境中进行水分限制的田间试验。
在西部堪萨斯州地区，每行34株植物种植两行地块，密度为每英亩32,000个植株。各转基因地块与具有相同杂交背景的非转基因地块配对。以随机区组设计种植21个独立插入事件中的各个的12个配对地块重复及其非转基因配对。通过高架灌溉使植物处于灌溉良好的条件之下，直到发育的V8阶段，在此时停止供水14天。
在停止供水处理的第7天，对各个配对地块中3个转基因阳性和转基因阴性植物的每一个测定从土壤表面到最新的完全伸展的叶子顶端的距离。5天后，使用在第7天使用的相同的叶子重复该测量。从第7和第12天的测量计算各测量的植物的生长速率(以cm/d计)。该速率被称为叶子伸长率(LER)。
在处理的第8天，使用Minolta SPAD-502(Spectrum Technologies，Plainfield，IL)估算叶绿素含量。对21个事件中的6个事件，在最新的完全伸展的叶子的中页(从基部到顶端)位置进行该测量。对于各配对的地块重复，对各配对地块中的6个转基因阳性植物和6个转基因阴性植物中的各个收集SPAD读数。
同样，在处理的第8天，使用同样的21个事件中的6个的最新的完全伸展的叶子的中叶，在正午测量光合速率。使用PP系统(Amesbury，MA)Ciras-1便携式光合系统测量光合速率。在367mol·mol-1的大气[CO2]、2.3kPa的环境水蒸气压力和0.6-1.5kPa的叶-空气蒸汽压差下用1,200-1,400mol·m-2·s-1的光合光子流密度测量叶子的光合作用。
在堪萨斯州田间试验中评估了22个CspB事件。水分亏缺处理使得生长速度平均降低到良好灌溉时速率的50％。作为建群(construct)，相比于非转基因对照，CspB转基因产物在叶子伸长率上显示出3.6％的增长(表2)。MON87460和第二高性能事件显示出生长速率增长12％和24％。CspB阳性植物也显示出叶绿素含量和光合速率的显著提高(表2)。在建群水平上，叶绿素含量提高2.5％，而MON87460和第二高性能事件显示出4.4％和3.3％的增长。在建群水平，光合速率的提高为3.6％，而MON87460和第二高性能事件具有8.5％和7.7％的增长。
表2.在水分亏缺条件下cspB事件的生长改善
实施例4.在水分限制处理中MON87460玉米植物的产量提高
在其中进行水分限制处理的中加利福尼亚州的4个地区的原种杂交遗传背景中评估了10个独立整合的CspB事件(其大多数在之前的温室筛选或田间试验中显示出改良的植物性能)的产率性能。在发育的后营养生长阶段中，正好在开花之前，通过在14天中减少灌溉来进行水分限制处理。与良好灌溉方案相比，该处理造成了约49.2cm3水的净降低。在应激时期中，这通过省略三次24.6cm3的水施用中的两次实现。在处理期间，与灌溉良好的情况相比，该处理降低了相对生长率约50％，并同样降低了平均季末谷物产率的50％。各试验地区被设计为4因素组不平衡的区组设计，每个地区以三个重复种植植物。在各个重复中，基因型被随机作为第一因素，建群、事件和基因阳性对基因阴性地块被分别随机作为第二、第三和第四因素。该设计将用于各次选择的阳性和阴性基础上放在相邻的两行地块中。最终种群密度反映了地区种植行为，且每两行地块为65-76株植物。地块为21英尺长，行间距为30-40英寸宽，这反映了地区种植行为。
从水分限制田间试验中采集谷物产量数据，并提供在以下的表3中。在水分限制的加利福尼亚州田间的平均产量为6.8t/Ha，表明与中西部作物的平均产量相比，产量降低50％。作为建群的CspB阳性植物的平均产量高得多，高7.5％(p＜0.01)。许多的个体事件也显示出产量的明显优势。CspB-Zm MON87460为具有最佳性能的事件，且具有20.4％的产量提高。
表3.在田间水分限制条件下cspB的产量提高
  事件   产量(t/Ha)   提高％
  CspB非转基因平均值   6.86
  CspB-建群平均值   7.38   7.5％
  CspB-Zm事件MON87460   8.26   20.4％
  CspB-Zm事件2   7.61   10.9％
MON87460事件在叶子生长、叶绿素含量和光合速率上也显示出显著的提高，因而提供了营养性生产力上的这些改善导致再生性能和谷物产量上的改进的证据，且确认MON87460为温室或田间研究中测试的多个独立转基因事件中最好的事件。
实施例5.分子分析
通过详细的分子分析来表征MON87460，分子分析包括插入片段数目(玉米基因组内整合位点的数目)、拷贝数(一个基因座内T-DNA的拷贝数)、插入盒的完整性和骨架序列缺失的筛选。
Southern印迹分析
在冷冻干燥机中干燥约2-3g叶组织约48小时，并通过加入小金属珠和在油漆搅拌器中震动进行碾磨。各个样品与6ml提取缓冲液(0.1M Tris pH 8，0.05M EDTA，0.5M NaCl，1％SDS和新鲜配制的0.071％BME)混合，置于65℃的水浴中45分钟，并不时搅拌。加入5M(2ml)的醋酸钾，然后反转试管两次，并转移到冰浴中20分钟。加入冷氯仿(3ml)，通过反转轻轻混合10分钟。在3500rpm下离心样品15分钟。将上清液转移到新的试管中，并与4ml的冷异丙醇合并。在3500rpm下离心样品15分钟，弃去上清液。将沉淀重新悬浮于具有0.1mg/ml RNA酶的2ml T50E10缓冲液中，在65℃下温育20分钟。为了沉淀DNA，向各个试管中加入3ml的异丙醇/4.4M醋酸铵(7∶1)，并反转混合。在3500rpm下离心样品15分钟，并弃去上清液。用0.5-1.0ml的80％EtOH冲洗沉淀，然后转移到微量离心管中。在微型离心机中进行短暂旋转后，弃去上清液，使沉淀风干。将沉淀重新悬浮于约200μl的TE缓冲液中。
用500μl总体积中的100单位的各种不同限制性酶消化约10μg基因组DNA。消化物在37℃下温育过夜，并用EtOH进行沉淀。然后沉淀消化的DNA，并用20μl TE缓冲液重新溶解。通过质粒pMON73608的PCR扩增制备DNA探针模板。通过随机引物法(DNA labeling System，Invitrogen)，用约100μCi的32P-dCTP(Amersham catalog # AA0075)标记约25ng的各探针。用Sephadex G-50柱(Roche)纯化放射标记的探针。将样品上样到0.8％TAE凝胶上，在30-35V下运行14-18小时。电泳之后，在1.5μg/ml溴化乙锭中染色凝胶10-15分钟，然后照相。然后将凝胶置于脱嘌呤溶液(0.125N HCl)中10-15分钟，然后置于变性溶液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)中30-40分钟，然后置于中和溶液(0.5M Tris-HCl pH 7.0，1.5M NaCl)中30-40分钟。然后将凝胶转移到20XSSC溶液中5-15分钟。使用TurboblotterTM(Schleicher & Schuell)和20XSSC转移缓冲液来促进DNA(Southern，1975)毛细管转移到Hybond-N尼龙膜(Amersham)上。使用自交联设置用UV1800(Stratagene)使DNA共价交联到膜上，并在4℃下储存直到需要。60-65℃下膜在预杂交缓冲液(250mM Na2HPO4·7H2O pH 7.2，7％SDS，和0.1mg/ml tRNA)中温育1-4小时。向新鲜的预杂交缓冲液中加入32P-标记的探针，且在60-65℃下杂交过夜。在0.1％SDS和0.1XSSC水溶液洗涤膜15-20分钟，三次。
探针包含完整的cspB和nptII编码区和它们各自的启动子、内含子和聚腺苷酸化序列及质粒骨架。在这些玉米事件的基因组中未观察到来自原转化载体的、与完整盒连接或未连接的其他附加元件。没有检测到骨架序列。数据表明，玉米事件MON87460包含单个T-DNA插入以及cspB和nptII盒的一个拷贝。
使用水稻肌动蛋白启动子和内含子序列探针的反应结果表明，pMON73608中存在的完整水稻肌动蛋白启动子序列不存在于MON87460中。可以确认水稻肌动蛋白内含子元件在MON87460中是完整的。
Northern印迹分析
使用ToTALLY RNATM Kit(Ambion catalog # 1910)从1克组织样品中分离来自玉米事件MON87460和温室生长植物的野生型叶组织的RNA。制备含5、10、25和50μg MON87460和野生型RNA的样品，以120V在1.0％琼脂糖凝胶上跑胶约2小时。电泳之后，用去离子水漂洗凝胶，并转印到尼龙膜上。使得凝胶转移过夜。将印迹共价交联，并在4℃下短期保存。预杂交之前，用10XSSC预漂洗印迹2分钟。将印迹置于装有20ml Sigma Hyb缓冲液(catalog # H7033)的单个杂交瓶中，并在65℃下预杂交1小时。
通过随机引物法(DNA labeling System，Invitrogen)，用约50μCi的32P-dCTP标记约25ng的cspB和nptII探针模板。然后向含5ml预加热杂交缓冲液的单独的试管中加入变性的cspB和nptII放射标记探针。然后混合含各探针的缓冲液，并将其加入到合适的杂交瓶中，杂交过夜。杂交过夜以后，从瓶中移去印迹，置于玻璃盘中的低严格洗涤缓冲液(2XSSC，0.1％SDS)中，并在室温下置于摇动器上10分钟。将印迹置于吸墨纸上，然后置于装有25ml低严格性预加热洗涤缓冲液(65℃)的新杂交瓶中。在65℃下低严格性洗涤缓冲液中洗涤印迹15分钟，两次；并在65℃下高严格性洗涤缓冲液(0.5XSSC，0.1％SDS)中洗涤15分钟，一次。
Northern印迹分析确认了，在MON87460中产生了预期大小的转录体cspB(～600nt)和nptII(～1100nt)。
λ克隆中T-DNA插入片段和侧翼玉米基因组DNA的测序
使用SDS氯仿提取方法从玉米事件MON87460中分离出高质量基因组DNA。用MfeI消化MON87460基因组DNA，并用II凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化，以确保大于10kb的片段的纯化。该消化和纯化的基因组DNA被用于接合到λII/EcoRI载体试剂盒(Stratagene)中。使用32P-标记的Ract内含子和cspB探针筛选约2.5x105个克隆。来自纯噬菌体λ克隆的纯化DNA被用作测序反应中的模板，以确认MON87460插入片段的T-DNA核苷酸序列和侧邻MON87460插入片段的5’和3’末端的玉米基因组DNA。
DNA序列分析证实了，MON87460中的原位T-DNA与pMON73608中的相应序列相同。该序列分析还鉴定了已在Southern分析中观察到的水稻肌动蛋白启动子5’末端的截短的程度。序列分析表明，土壤杆菌RB和大部分P-ract启动子不存在于MON87460事件中。MON87460中的P-ract启动子由全长水稻肌动蛋白启动子区域(约850nt)中的仅108bp的3’末端构成。该结果还确认了，玉米事件MON87460中cspB和nptII的原位序列与转化载体pMON73608内的编码区精确匹配。该克隆还确认了MON87460插入片段的1060bp的5’侧翼序列、3309bp的T-DNA插入片段和1260bp的3’侧翼序列。
野生型等位基因分析
使用与MON87460插入片段的5’和3’侧翼区域杂交的引物，对转化中使用的非转基因玉米系的基因组DNA进行PCR。用分别与5’和3’侧翼区域杂交的引物组成的各组合进行多个引物组合。以50μl反应体积，使用约50ng的基因组DNA模板进行PCR分析。然后测序得到的扩增子。野生型等位基因的分析表明，在将MON87460T-DNA整合到玉米染色体中时发生了玉米基因组DNA的22bp的缺失(SEQ ID NO：23)。
实施例6.MON87460事件多核苷酸的检测
通过从玉米植物组织中提取基因组DNA以及分析MON87460特异性核苷酸，可以在用MON87460系育种得到的后代中进行MON87460事件的检测。对于识别MON87460多核苷酸特别感兴趣的是，使用PCR来扩增含转基因/基因组接合序列的基因组DNA。
用于鉴别MON87460的扩增子包含至少一个接合序列，SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2(图2)。SEQ ID NO：1对应于cspB表达构建体中随意命名的5’侧翼序列(SEQ ID NO：5的1051-1060位)和截短的水稻肌动蛋白启动子的5’区域(SEQ ID NO：7的1-10位)的接合区。SEQID NO：2对应于来自pMON73608的整合左边界(SEQ ID NO：7的3300-3309位)和随意命名的3’侧翼序列(SEQ ID NO：6的1-10位)的接合区。
产生MON87460的用于识别的扩增子的事件引物对包括基于pMON73608的侧翼序列和插入DNA的引物对。为了产生包含SEQ IDNO：1的至少11个核苷酸的用于鉴别的扩增子，制备了基于SEQ IDNO：5的正向引物和基于插入转基因序列SEQ ID NO：7的反向引物。类似地，为了产生包含SEQ ID NO：2的至少11个核苷酸的用于鉴别的扩增子，制备了基于插入转基因序列SEQ ID NO：7的正向引物和基于3’侧翼序列SEQ ID NO：6的反向引物。本领域技术人员很容易明白，还可以设计引物对以产生包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的至少11个核苷酸互补的多核苷酸的扩增子，在这种情况下正向和反向引物序列是基于与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7中的那些序列互补的序列。
设计了产生具有50-1000碱基的扩增子的引物。扩增条件如以下表4和表5所示，并包括事件MON87460的阳性组织对照、非事件MON87460的玉米植物的阴性对照和不包含玉米基因组DNA的阴性对照。将扩增内源玉米DNA分子(如来自ADH基因)的引物对可用作DNA扩增条件的内部控制。
用于DNA扩增反应的玉米植物DNA可从任何合适的玉米植物组织中分离出来，优选是从小于1个月大的植物的新形成的叶组织中分离出来用于本文描述的反应。使用标准7mm打孔器收集叶组织，以收集到相当于大约1厘米宽和1英寸长的叶碎片的组织。冻干组织样品，并通过向聚丙烯试管中的各个组织样品中加入4-6个3mm的氧化锆-氧化硅珠和在油漆搅拌器中震荡来碾磨干燥的组织。用395ul的预加热SDS提取缓冲液(0.1M Tris pH8，10mM EDTA，1.0M NaCl，1％SDS)在96孔板中混合均浆的组织样品，简短地旋震并在65℃下温育45分钟。加入135ul冷醋酸钾(5M)。通过旋震来混合样品，并将板在3300rpm进行旋转20分钟。将100ul的上清液转移到含100ul异丙醇的新96孔板中，旋震样品以混合。将板在3300rpm旋转20分钟，并弃去上清液。板倒置排液1分钟。然后加入300ul的70％冷乙醇，简短旋震该板，并置于4℃下30分钟。该板在3300rpm旋转20分钟，并弃去上清液。板倒置排液，并重复乙醇沉淀。最后的旋转(3300rpm 20分钟)后，该板排液1分钟，将板侧放在65℃的烤箱中约15-30分钟以干燥沉淀。将DNA重新悬浮在含RNA酶(10ug/ml)的100ul pH8.0的TE缓冲液中(Sigma)。在4℃下储存DNA过夜。DNA的产率为约1ug(10ng/ul)。
已经使用Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700，Stratagene Robocycler，MJ Engine，Perkin-Elmer 9700或EppendorfMastercycler Gradient温度循环仪或可用于产生MON87460的用于鉴别的扩增子的其他扩增系统进行MON87460扩增子的分析。
表4.玉米MON87460事件特异性PCR
表5.终点TaqMan温度循环仪条件
通过与特异于MON87460交接序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的探针杂交或通过分离和DNA序列分析，使用设计的引物对产生的扩增子表明包含MON87460多核苷酸。
实施例7.终点TaqMan事件特异性分析
本文描述了MON87460事件特异性终点TaqMan PCR反应。通过终点Taqman，在反应循环结束后使用荧光检测系统定量对应于特定扩增的信号。使用产生信号的三个位点特异性杂交(两个PCR引物和一个荧光标记探针)提供了高特异性的测定。探针与正向和反向引物之间的特异性核苷酸退火。当核苷酸延伸达到杂交的探针时，taq聚合酶降解探针，从而从猝灭剂释放荧光源，从而发出信号。在反应结束之后读取信号。
用于终点分析中的多核苷酸引物为引物SQ10443(SEQ ID NO：8)、SQ10445(SEQ ID NO：9)，且用于检测MON87460扩增子的探针是6FAMTM标记的MGBNFQ(小沟结合，非荧光猝灭剂)探针PB3814(SEQ ID NO：10)。内部玉米DNA引物也可用于确认模板DNA的完整性。例如，可使用引物SQ5263(SEQ ID NO：11)和SQ5264(SEQ IDNO：12)实现醇脱氢酶(ADH)(玉米基因组内单拷贝的内源基因)的扩增，并可以用VICTM(报告荧光染料)和TAMRATM(淬火荧光染料)探针PB2033(SEQ ID NO：13)进行检测。6FAMTM、VICTM和TAMRATM为连接到DNA探针上的Applied Biosystems(Foster City，CA)的荧光染料产品。在这些分析中，Taq DNA聚合物切割与扩增的DNA特异性杂交的探针，并释放荧光团。荧光团与猝灭剂的分离导致出现荧光，其在这些条件下鉴别MON87460多核苷酸的存在。
当如表6中所描述的使用时，SQ10443(SEQ ID NO：8)和SQ10445(SEQ ID NO：9)产生了68nt的DNA扩增子(SEQ ID NO：20)，其可用于鉴别事件MON87460DNA，并通过与多核苷酸探针(例如PB3814)的杂交进行检测。使用Applied Biosystems GeneAmp PCRSystem 9700或MJ Research DNA Engine PTC-225来优化使用96孔或384孔的该测定。本领域技术人员可能知道和使用其他方法和装置以产生确认事件MON87460 DNA的扩增子。可能需要调整循环参数来确保变温速度是等效的。玉米叶组织样品被用在以下分析中，并应该进行彻底碾磨以产生均一样品。如实施例6所述分离玉米叶DNA。待测叶DNA的浓度优选为5-10ng/PCR反应。使用提取待分析样品的相同方法来提取对照DNA。用于该分析的对照应该包括来自已知包含事件MON87460 DNA的玉米的阳性对照、来自非转基因玉米的阴性对照和不包含模板DNA的阴性对照。
对于使用Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700或MJResearch DNA Engine PTC-225温度循环仪的PCR反应，使用如表7中描述的循环参数。当在Perkin-Elmer 9700中运行PCR时，温度循环仪使用最大变温速度运行。
表6.玉米MON87460事件特异性终点TaqMan PCR
表7.终点TaqMan温度循环仪条件
实施例8.终点TaqMan PCR接合性分析
描述了在如实施例6所述从玉米叶组织中提取的基因组DNA中检测MON87460转基因事件的存在和接合性(纯合或杂合)的特定分析方法。使用事件特异性接合性终点TaqMan PCR(表8和表9描述了其条件的实例)确定了样品中事件MON87460的接合性。用在接合性分析中的DNA引物和探针为引物SQ21105(SEQ ID NO：14)和SQ21106(SEQ ID NO：15)，和用于检测MON87460接合多核苷酸的6FAMTM标记MGB(小沟结合)探针PB3771(SEQ ID NO：16)，及引物SQ21195(SEQ ID NO：17)和SQ21196(SEQ ID NO：18)，和用于检测在插入位点的野生型玉米DNA的VICTM标记的MGB探针PB10223(SEQ IDNO：19)。
当与PB3771(SEQ ID NO：16)一起用在这些反应中时，SQ21105(SEQ ID NO：14)和SQ21106(SEQ ID NO：15)产生了用于鉴别事件MON87460 DNA的134nt的标记DNA扩增子(SEQ ID NO：21)。当与PB3771(SEQ ID NO：16)一起用在这些反应中时，SQ21195(SEQ IDNO：17)和SQ21196(SEQ ID NO：18)产生了用于鉴别野生型等位基因的145nt的DNA扩增子(SEQ ID NO：22)。用于该反应的探针对存在于MON87460插入位点的基因组DNA(SEQ ID NO：23)的22bp缺失是特异性的。如从两个探针PB3771和PB10223释放荧光信号所表明的，通过存在两个扩增子确定了杂合性。通过仅来自PB3771的6FAMTM信号释放确认纯合的玉米植物遗传材料。该分析的对照应该包括来自对事件MON87460 DNA纯合和杂合的玉米植物样品的阳性对照、来自非转基因玉米的阴性对照和不包含模板DNA的阴性对照。
已经使用Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700或MJResearch DNA Engine PTC-225优化了用于96孔或384孔中的该分析。当在MJ Engine上运行PCR时，温度循环仪应该在计算模式下运行。当在Perkin-Elmer 9700上运行PCR时，温度循环仪以最大变温速度运行。
表8.玉米MON87460事件特异性接合性终点TaqMan PCR
表9.接合性终点TaqMan温度循环仪条件
实施例9.MON87460产量性能
利用CspB表达事件MON87460来进行进一步的田间试验，以进一步研究该事件提供对后营养性和生殖性发育阶段中的水分亏缺耐受性的能力。对于农业方面来说它们是非常重要的阶段，这是由于在这些生长阶段作物的敏感性以及在目标生长区域干旱在这些发展阶段中出现的频率。
在中加利福尼亚州和西堪萨斯州的5个重复地区评价了三种原种杂交遗传背景的MON87460的产量性能，其中施用了两种完全不同的水分限制处理。在正好开花之前的后营养发育阶段中通过减少灌溉14天来进行试验的后营养期处理。在处理期间该处理降低相对生长速率为良好灌溉的约50％，同样降低50％的季末谷物平均产量。通过在较晚阶段(相对于营养性处理)开始水分限制条件来实现谷物灌浆处理，从而在开花期或开花期前后减少土壤湿度特性并在谷物灌浆期获得最大应激。该处理由于施加的应激，导致了植物高度降低约25％，谷物产量降低约30-40％。通过使用各应激处理窗口的5个地区的20个复制数据，评估了表达CspB事件的三种杂交种。
各个试验地区被设计为3种因素组的不平衡区组设计，且每个地区按4个重复种植植物。在每个重复中，基因型随机为第一因素，及事件和基因阳性对基因阴性地块分别随机为第二和第三因素。该设计将用于各选择的阳性和阴性项目放在相邻的两行地块中。最终种群密度反映了地区种植行为，且每两行地块为65-76株植物。地块为21英尺长，行间距为30-40英寸宽，这反映了地区种植行为。
使用SAS/STAT软件的9.1.3版本(SAS Institute Inc.，2003)进行产量数据的分析。使用MIXED和GLIMMIX过程进行差异分析的计算。通过计算相对于单个地区的对应线性模型的剔除的学生化残差，使用Bonferroni-调节的p值以5％的逐实验I型误差率使用t检测来将这些残差与0对比，并除去识别的离群值而在单独地确定各个地区的离群值。运行数据两次以后，所有剩余的观察值均包含在分析中。确定各地块的产量，使用具有嵌套在建群内的建群和事件的固定效应和地区、地区内的重复(reps)和地区与建群相互关系的随机效应的混合模型进行分析。对各杂交种独立地进行这些分析。使用应用于最小二乘平均值的t检验进行事件和建群平均值与阴性配对项目的对比。通过对比来自阳性和阴性事件的简单线性回归评估来检验产量的稳定性。在两种情况下，回归模型包括某地区该事件的平均产量作为响应值(response)，而同一地区商业检查谱系的平均产量作为预测值。然后通过使用来自商业检查的各种不同基准产量的回归模型的其预测产量来对比阳性和阴性样品。
与具有相同遗传背景的常规野生型对照相比，在两种水应激方案中和在不同的杂交项目中，MON87460玉米植物都显示出谷物季末产量的提高(表10)。这些实验中获得的产量利益为平均6.4-8.5t/Ha的产量值的11％-21％。在15个生殖性应激处理中的12个和在15个营养性应激处理中的13个中，转基因CspB事件均超出非转基因对照至少0.5t/Ha。
表10.在控制灌溉水分亏缺条件下MON87460的产量结果
还对MON87460进行了多年分析，以评估在水分限制条件下不同地区的产量优势的稳定性。汇集和分析已经经历某种程度水应激的地区，在该地区产量降低了20-80％。在多年测试和在具有不同程度的水分亏缺应激的不同环境中，产量优势都得到证明。
在测试的4年期间，在控制的应激环境测试中，MON87460已经显示出三种杂交种测试杂交具有平均10.5％的产量优势。各年的平均产量优势分别为0.89、0.48、0.49和0.79t/Ha，分别代表13.4、6.7、10.5和11.3％的百分比增长。
在南达科塔州、内布拉斯加州和堪萨斯州进行了MON87460杂交种项目的干燥地区市场评估。在历史性气候模式和4.5-7.7t/Ha的平均县产量的基础上选择地区。各个测试地区被设计为裂区不平衡区组设计，每个地区以单个重复种植。地块为100英尺长和4行宽，在不灌溉条件下的约200种植物/100英尺行的最终种群密度反应了当地种植行为。行间距为30-40英寸宽，反应了局部种植行为。在各个地区设置气象站，并在整个季节中进行试验来监控水分亏缺应激的迹象。并不提供补充的水。收集环境数据，并使用季节气候模式(包括降雨蓄积)在各个干燥地区的季节中来划分水分亏缺应激。将这三个州中的12个种植地区归类为在后营养性到生殖发育阶段中经历水应激的地区，并用于分析。
在如表10中描述的控制水分亏缺条件下进行评估的相同的三种杂交种背景中观察到产量益处。当与非转基因对照相比时，MON87460事件提供了高达0.75t/Ha或15％的产量益处。这些干燥地区生长条件比控制水分亏缺地区产生更低的产率环境(对照的平均产量为4.9t/Ha)，其中对照的整体产量为6.4-8.5t/Ha。
因此，在控制的干旱环境以及水分应激的西部干燥地区条件下，MON87460获得了显著的产量提高。通过在水应激条件下实现提高的生长速率和谷物产量而同时使用等量或更少的水，MON87460通过比阴性对照更加有效地利用水而提供了水应激耐受性。
实施例10.植物育种以产生除草剂耐受的MON87460植物
MON87460事件植物与表达草甘膦耐药性的5-烯醇-丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因的除草剂耐受玉米植物杂交，以产生具有水分亏缺耐受性和除草剂耐受性的改良植物。特别感兴趣的是MON87460事件玉米植物与被称为事件PV-ZMGT32(nk603)并描述在US6825400中的除草剂耐受的玉米事件植物杂交。
使用两种纯合自交系进行杂交，一种是MON87460，一种是PV-ZMGT32(nk603)，以产生用于商业种植具有水分亏缺和除草剂耐受性的玉米作物的杂种种子。
或者，通过使用回交亲本回交育种方法来产生包含MON87460和PV-ZMGT32(nk603)两者的单个自交系，以产生对两种性状纯合的固定系。以这种方式产生的自交系显示出水分亏缺耐受性和除草剂耐受性性状。该自交系与第二自交系(其可为具有一种或多种改良性状的原种野生系或转基因事件系)杂交，以产生用于种植的杂种种子而产生改良的玉米作物。
根据以上内容的教导，本文公开和要求保护的所有材料和方法均无需通过过度的实验来完成和使用。尽管本文通过优选实施方式和示例性实施例来描述本发明的材料和方法，但是本领域技术人员明白，在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本发明的材料和方法做出改变。本领域技术人员显而易见的所有这样的类似替换和改变均在如所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。

Claims (11)

1.一种包含选自SEQ ID NO：2和25及其完全互补序列的转基因/基因组接合区序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含在SEQ IDNO：24中。
2.一种包含选自SEQ ID NO：2、3、4、24和25及其完全互补序列的转基因/基因组接合区序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸来自转基因玉米植物事件MON87460，包含玉米事件MON87460的代表性种子样品已经以ATCC保藏号PTA-8910进行了保藏。
3.与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：25同源或互补的DNA分子用于鉴别玉米植物事件MON87460的DNA的用途，该DNA分子在严格杂交条件下与来自玉米植物事件MON87460的基因组DNA杂交，其中包含玉米事件MON87460的代表性种子样品已经以ATCC保藏号PTA-8910进行了保藏。
4.DNA引物对的用途，该DNA引物对包含来自MON87460玉米植物基因组中与转基因DNA的插入位点相邻的SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的侧翼序列的长度至少15个核苷酸的第一引物和来自SEQ ID NO：7的插入转基因序列的长度至少15个核苷酸的第二引物，其中所述的第一和第二引物各包含足够长度的核苷酸序列，从而在其与来自事件MON87460的DNA一起用于扩增反应中时起到产生诊断样品中玉米事件MON87460 DNA的扩增子的DNA引物的功能，其中所述扩增子包含SEQ ID NO：1或2，且其中包含玉米事件MON87460的代表性种子样品已经以ATCC保藏号PTA-8910进行了保藏。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述第一和第二引物长度为至少18个核苷酸。
6.一种检测样品中对应于玉米植物MON87460DNA的DNA存在的方法，包括：(a)将含有MON87460 DNA的样品接触与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4同源或互补且在严格杂交条件下与来自玉米植物事件MON87460的基因组DNA杂交的DNA分子；(b)使样品和探针经受严格杂交条件；和(c)检测所述样品中所述DNA探针与DNA分子的杂交，其中所述DNA探针与所述DNA分子的杂交指示所述样品中来自玉米MON87460的DNA分子的存在，其中包含玉米事件MON87460的代表性种子样品已经以ATCC保藏号PTA-8910进行了保藏。
7.一种检测样品中来自玉米植物事件MON87460的DNA分子存在的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与权利要求4的DNA引物对接触；(b)进行足以产生扩增子的扩增反应，所述扩增子包含选自SEQ ID NO：1-4和25及其互补序列的序列；和(c)检测反应物中所述DNA扩增子的存在，其中所述反应物中所述DNA扩增子的存在指示所述样品中来自玉米植物事件MON87460的DNA分子的存在，其中包含玉米事件MON87460的代表性种子样品已经以ATCC保藏号PTA-8910进行了保藏。
8.用于鉴别样品中来自玉米植物MON87460的DNA检测试剂盒，其中所述试剂盒包含至少一种DNA分子，该DNA分子包含SEQID NO：2-4和25中任一的核苷酸序列，以起到用于检测来自包含事件MON87460的玉米植物的DNA存在的特异性DNA探针的功能，其中所述DNA的检测诊断样品中事件MON87460的DNA的存在，且其中包含玉米事件MON87460的代表性种子样品已经以ATCC保藏号PTA-8910进行了保藏。
9.用于鉴别样品中来自玉米植物MON87460的DNA的DNA检测试剂盒，其中所述试剂盒包含发挥引物对功能的至少两个DNA分子，其包含来自MON87460玉米植物基因组中与转基因DNA的插入位点相邻的SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的侧翼序列的长度至少15个核苷酸的第一引物和来自SEQ ID NO：7的插入转基因序列的长度至少15个核苷酸的第二引物，所述引物对在包含来自玉米植物事件MON87460的基因组DNA的扩增反应中产生诊断MON87460 DNA的扩增子，其中所述扩增子包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，且其中包含玉米事件MON87460的代表性种子样品已经以ATCC保藏号PTA-8910进行了保藏。
10.一种生长转基因的水分亏缺耐受玉米植物的方法，包括：
a)种植至少一个源自包含SEQ ID NO：1-4、24或25的称为MON87460的转基因玉米植物或其后代的种子，所述玉米植物的代表性种子已经以ATCC保藏号PTA-8910进行了保藏；和
b)从所述种子生长玉米植物，从而生长转基因植物，其中所述转基因植物包含SEQ ID NO：1-4、24或25。
11.一种产生耐受水分亏缺条件的玉米植物的方法，包括a)将包含具有选自SEQ ID NO：1-4、24或25及其互补序列的核苷酸序列的核酸分子的转基因玉米植物事件MON87460与第二玉米植物杂交，其中包含玉米事件MON87460的代表性种子样品已经以ATCC保藏号PTA-8910进行了保藏；b)收集由所述杂交产生的种子；c)生长所述种子以产生多个后代植物；和d)检测所述杂交的后代中SEQ IDNO：1-4、24或25的存在，其中包含SEQ ID NO：1-4、24或25的所述后代对于水分亏缺条件是耐受的。
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