CN110144363A

CN110144363A - 抗虫耐除草剂玉米转化事件

Info

Publication number: CN110144363A
Application number: CN201810140851.4A
Authority: CN
Inventors: 刘博林; 佘秋明; 谭超; 许洁婷; 王绪霞; 田裴秀子; 聂东明; 韩宇; 马崇烈; 章旺根
Original assignee: Sub-Group Co ltd Of China Seed
Current assignee: Sub-Group Co ltd Of China Seed
Priority date: 2018-02-11
Filing date: 2018-02-11
Publication date: 2019-08-20
Anticipated expiration: 2038-02-11
Also published as: US11479790B2; US20210054402A1; WO2019154373A1; BR112020014816A2; CN110144363B

Abstract

本申请提供了抗虫耐除草剂玉米转化事件，并提供了相关的创制方法、检测方法和应用。本申请以玉米自交系祥249为受体，经过农杆菌介导的遗传转化，得到在特定基因组位点插入外源基因插入物的玉米植株，其中外源基因插入物包含以下三个基因：抗虫基因、抗草铵膦基因和抗草甘膦基因。本申请所获得的转化事件中，所插入的外源基因位于玉米基因组的非功能位点，不影响受体植物自身其他基因的表达，在使转基因玉米植物获得抗虫和耐除草剂特性的同时，保持了其良好的农艺性状。

Description

抗虫耐除草剂玉米转化事件

技术领域

本申请涉及植物生物技术领域，具体涉及一种抗虫耐除草剂玉米转化事件的创制方法、检测方法和应用。

背景技术

玉米是重要的饲料和工业原料作物，其作为中国种植面积最大的农作物，长期自给有余，但自2010年以来，进口量逐年增加。

玉米螟俗称玉米钻心虫，其危害是造成玉米常年减产的重要生物灾害之一，严重影响玉米的产量和质量，包括亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)和欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis)。中国是亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)的多发区和重发区，几乎每两年就大规模发生一次。一般年份玉米受玉米螟危害减产10％-15％，大发生年减产可达30％以上，甚至绝收。因玉米螟的危害，每年损失的玉米就达600-900万吨。玉米螟不仅直接造成玉米产量损失，而且还诱发和加重玉米穗腐病的发生，使玉米的品质下降。目前防治玉米螟的主要方式仍然以农药防治为主。农药的大量使用，既增加种植成本，又破坏生态环境。田间杂草与作物竞争水、肥、光能及生长空间，同时又是危害作物病菌及害虫的中间寄主，是作物增产的重要生物限制因子之一。我国常年受杂草严重危害的农作物面积高达12亿亩，其中玉米1.9亿亩。当前，广泛采用的选择性除草剂施用量大，且残留期长、容易影响下茬作物的正常生长。草铵膦等灭生性除草剂具有高效、低毒、易降解、无残留等特点，但它们除草没有选择性，不能直接用于作物的生长期。植物转基因育种技术具有目的性强、周期短、效率高，能够实现不同物种间优良基因的转移等优点。自1996年第一个转基因作物商业化以来，这项技术已经为全球农业带来了巨大的改变。

就转基因玉米而言，以防治鳞翅目玉米螟虫的Cry1Ac、Cry1F等基因为主，除此外，亦有多个具有鞘翅目抗性的品系如MON88017等，以及利用Cry3类基因获得抗玉米根虫品系如MON863等投入商业化生产。

世界范围内，1996年至今已有40余种转Bt基因抗虫玉米被26个国家批准投入商业化生产或饲料食品加工，如美国孟山都公司的MON810、MON89034等。

发明内容

一方面，本申请提供了核酸分子，其包含：i)包含SEQ ID NO:1的第381-780位核苷酸和/或第10815-11214位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；ii)包含SEQID NO:1的第381-780位核苷酸和第6239-6338位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；iii)包含SEQ ID NO:1的第6239-6338位核苷酸和第10815-11214位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；或者iv)包含SEQ ID NO:1的第381-780位核苷酸，第6239-6338位核苷酸和第10815-11214位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。

在一实施方案中，本申请所提供的核酸分子包含SEQ ID NO:1所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。

在另一实施方案中，本申请所提供的核酸分子，其包含以下表达盒：表达抗草铵膦基因的第一表达盒，如SEQ ID NO:1的第748-2288位核苷酸所示序列；表达抗虫基因的第二表达盒，如SEQ ID NO:1的第2620-6959位核苷酸所示序列；和表达抗草甘膦基因的第三表达盒，如SEQ ID NO:1的第6968-10892位核苷酸所示序列。

在另一实施方案中，本申请所提供的核酸分子，其通过将以下表达盒导入玉米的基因组中获得：表达抗草铵膦基因的第一表达盒，如SEQ ID NO:1的第748-2288位核苷酸所示序列；表达抗虫基因的第二表达盒，如SEQ ID NO:1的第2620-6959位核苷酸所示序列；和表达抗草甘膦基因的第三表达盒，如SEQ ID NO:1的第6968-10892位核苷酸所示序列。

本申请所提供的核酸分子存在于玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分中。

另一方面，本申请提供了用于检测玉米转化事件的探针，其包含SEQ ID NO:1的第381-780位核苷酸或第10815-11214位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。

本申请还提供了用于检测玉米转化事件的引物对，其能够特异性扩增产生包含SEQ ID NO:1的第381-780位核苷酸或第10815-11214位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。

在一实施方案中，所述引物对为：i)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第381-780位核苷酸所示序列的引物对；ii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第10815-11214位核苷酸所示序列的引物对；iii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第381-780位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第681-10915位核苷酸所示序列的反向引物；iv)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第681-10915位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第10815-11214位核苷酸所示序列的反向引物。

在一实施方案中，本申请所提供的引物对为SEQ ID No:8和SEQ ID No:9所示的核苷酸序列或其互补序列；或者SEQ ID No:10和SEQ ID No:11所示的核苷酸序列或其互补序列。

此外，本申请还提供了用于检测玉米转化事件的试剂盒或微阵列，其包含上述的探针和/或上述的引物对。

还一方面，本申请提供了检测玉米转化事件的方法，其包括利用以下来检测待测样品中是否存在所述转化事件：上述的探针；上述的引物对；上述的探针和引物对；或者上述的试剂盒或微阵列。

本申请还提供了对玉米进行育种的方法，所述方法包括以下步骤：1)获得包含上述的核酸分子的玉米；2)将步骤1)所获得的玉米通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到后代植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；以及任选地，3)对步骤2)所获得的后代植物进行除草剂草铵膦和草甘膦以及螟虫和/或粘虫的抗性鉴定，并利用上述的方法来检测其中是否存在所述转化事件。

进一步地，本申请还提供了由上述的方法获得的玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分等，以及由这些玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分等制成的制品，包括食品、饲料或工业原料等。

此外，本申请提供了控制鳞翅目害虫群体的方法，包括使所述鳞翅目害虫群体接触由上述的方法获得的玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分。

本申请还提供了杀死鳞翅目害虫的方法，包括使所述鳞翅目害虫接触杀虫有效量的由上述的方法获得的玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分。

本申请还提供了减轻鳞翅目害虫对玉米的伤害的方法，包括将以下表达盒导入玉米的基因组中：表达抗草铵膦基因的第一表达盒，如SEQ ID NO:1的第748-2288位核苷酸所示序列；表达抗虫基因的第二表达盒，如SEQ ID NO:1的第2620-6959位核苷酸所示序列；和表达抗草甘膦基因的第三表达盒，如SEQ ID NO:1的第6968-10892位核苷酸所示序列。

在具体实施方案中，上述方法中所述的鳞翅目害虫为亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)或东方粘虫(Mythimna separate(Walker))。

附图说明

图1为载体pZHZH35006的结构示意图，其中：

ubiquitin promoter 来自玉米的泛素基因启动子

Ω sequence 源自烟草花叶病毒基因表达增强元件

Kozak sequence 存在于真核生物mRNA的一段序列，用于翻译起始

cry1Ab/cry1Ac Zm 优化的Bt基因序列

polyA 多聚腺苷酸序列

nos terminator 农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子

T-Border(right) T-DNA右边界序列

CaMV 35S promoter 花椰菜花叶病毒35S启动子

bar 抗草铵膦基因序列

CaMV 35S terminator 花椰菜花叶病毒35S终止子

T-Border(left) T-DNA左边界序列

Kanamycin(R) 卡那霉素抗性序列

pBR322 ori pBR322起始区序列

pBR322 bom pBR322骨架区序列

pVS1 rep pVS1复制子

pVS1 sta pVS1转录起始区

cp4 Zm 编码EPSPS蛋白的抗草甘膦基因序列

Ω sequence1 源自烟草蚀纹病毒基因表达增强元件

ubiquitin4 promoter 来自甘蔗的泛素基因启动子

bp 碱基对

图2为250毫升/亩喷施草铵膦除草剂“保试达”4-5天后植株照片，其中：

A为ZZM030，植株生长正常，无任何受害症状；

B为非转基因阴性对照野生型祥249，叶片干枯、失绿、枯斑、生长停滞，表现明显药害症状。

图3为200毫升/亩喷施草甘膦除草剂“农达”一周后植株照片，其中：

A为ZZM030，植株生长正常，无任何受害症状；

B为非转基因阴性对照野生型照祥249，叶片干枯、褪绿、生长停滞，表现明显药害症状。

图4为植株螟虫抗性鉴定的田间实验照片，图中白色斑点为虫孔,其中：

A为ZZM030叶片，针孔状虫孔，虫孔稀少、分散；

B为非转基因阴性对照野生型祥249叶片，绿豆大小虫孔，个别呈短条孔花叶。

图5为植株粘虫抗性鉴定的田间实验照片，图中叶片边缘及叶片上缺失部分为被粘虫蚕食后的虫孔，其中：

A为ZZM030叶片；

B为非转基因阴性对照野生型祥249叶片。

图6为ZZM030Southern杂交拷贝数检测结果，其中:

图6A为cry1Ab/cry1Ac ZM基因插入拷贝数检测结果，其中：泳道1，DNA分子标记；泳道2，空白；泳道3，HindIII酶切的ZZM030基因组DNA与cry1Ab/cry1Ac ZM特异性探针杂交；泳道4，HindIII酶切的野生型祥249基因组DNA与cry1Ab/cry1Ac ZM特异性探针杂交,作为阴性对照；泳道5，KpnI酶切的ZZM030基因组DNA与cry1Ab/cry1Ac ZM特异性探针杂交；泳道6，KpnI酶切的野生型祥249基因组DNA与cry1Ab/cry1Ac ZM特异性探针杂交，作为阴性对照；泳道7，EcoRI酶切的ZZM030基因组DNA与cry1Ab/cry1Ac ZM特异性探针杂交，作为阳性对照；泳道8，EcoRI酶切的野生型祥249基因组DNA与cry1Ab/cry1Ac ZM特异性探针杂交，作为阴性对照；泳道9，EcoRI酶切的质粒及野生型祥249基因组DNA与cry1Ab/cry1Ac ZM特异性探针杂交，作为阳性对照；

图6B为bar基因插入拷贝数检测结果，其中：泳道1，DNA分子标记；泳道2，空白；泳道3，HindIII酶切的ZZM030基因组DNA与bar特异性探针杂交；泳道4，HindIII酶切的野生型祥249基因组DNA与bar特异性探针杂交,作为阴性对照；泳道5，EcoRI酶切的ZZM030基因组DNA与bar特异性探针杂交；泳道6，EcoRI酶切的野生型祥249基因组DNA与bar特异性探针杂交，作为阴性对照；泳道7，KpnI酶切的ZZM030基因组DNA与bar特异性探针杂交，作为阳性对照；泳道8，KpnI酶切的野生型祥249基因组DNA与bar特异性探针杂交，作为阴性对照；泳道9，KpnI酶切的质粒及野生型祥249基因组DNA与bar特异性探针杂交，作为阳性对照；

图6C为cp4 Zm基因插入拷贝数检测结果，其中：泳道1，DNA分子标记；泳道2，空白；泳道3，HindIII酶切的ZZM030基因组DNA与cp4 Zm特异性探针杂交；泳道4，HindIII酶切的野生型祥249基因组DNA与cp4 Zm特异性探针杂交,作为阴性对照；泳道5，KpnI酶切的ZZM030基因组DNA与cp4 Zm特异性探针杂交；泳道6，KpnI酶切的野生型祥249基因组DNA与cp4 Zm特异性探针杂交，作为阴性对照；泳道7，EcoRI酶切的ZZM030基因组DNA与cp4 Zm特异性探针杂交，作为阳性对照；泳道8，EcoRI酶切的野生型祥249基因组DNA与cp4 Zm特异性探针杂交，作为阴性对照；泳道9，EcoRI酶切的质粒及野生型祥249基因组DNA与cp4 Zm特异性探针杂交，作为阳性对照。

图7为ZZM030事件特异性PCR检测结果，其中：

图7A为左边界检测结果；

图7B为右边界检测结果；

其中泳道1-4分别为：无菌水、祥249基因组DNA、ZZM030基因组DNA、相同载体转化后获得的非ZZM030事件基因组DNA。

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。

本技术领域人员公知，外源基因在植物体内的表达具有位置效应，即受到插入染色体位置的影响，这种影响可能是由于染色体结构或整合位点附近的转录调节元件造成的。因此，通常需要生产数百个不同的转化事件，并从这些事件中筛选出外源基因表达水平及模式符合预期要求的优异转化事件，以达到商业化生产应用的目的。

优异的转化事件可通过常规育种方法即有性杂交的方式将外源基因转育到其它遗传背景的种质中，其后代保持了原始转化体的转基因表达特性。本申请涉及通过从诸多转化事件中筛选出的优异转化事件ZZM030。

在本申请中，“转化事件ZZM030”是指以玉米自交系祥249为受体经过农杆菌介导的遗传转化，得到在特定基因组位点插入外源基因插入物(T-DNA插入物)的玉米植株，其中外源基因插入物包含以下三个基因：抗虫基因、抗草铵膦基因和抗草甘膦基因。本申请所获得转化事件ZZM030，所插入的外源基因位于玉米基因组的非功能位点，不影响受体植物自身其他基因的表达，在使转基因玉米植物获得抗虫和耐除草剂特性的同时，保持了其良好的农艺性状。

在具体实例中，转基因后所得到的T-DNA插入物具有SEQ ID NO:1的第681-10915位核苷酸所示序列。转化事件ZZM030可以指这一转基因过程，也可以指由这一过程所得到的基因组内的T-DNA插入物，或T-DNA插入物与侧翼序列的组合，或可以指由这一转基因过程得到的玉米植株。转化事件ZZM030还可以指由上述植物进行无性繁殖、有性繁殖、减倍或加倍繁殖或以上的组合而得到的后代植物。

在其他实施方案中，该事件也适用于同样的外源基因(SEQ ID NO:1的第681-10915位核苷酸所示序列)转化其他植物受体品种，从而将T-DNA插入物插入到同样基因组位置而获得的植物。适用的植物包括单子叶植物，如水稻、小麦、燕麦、大麦、青稞、粟、高粱和甘蔗等。

在本申请中，获得了以SEQ ID NO:1的第1-680位核苷酸为左侧侧翼序列和SEQ IDNO:1的第10916-11375位核苷酸为右侧侧翼序列的T-DNA插入物(第681-10915位核苷酸)。侧翼序列并非仅限于SEQ ID NO:1的第1-680位核苷酸和第10916-11375位核苷酸，因为列出的侧翼序列仅是用于表示T-DNA插入物在基因组中的位置，即T-DNA插入物左侧插入点位于第4号染色体40636901bp；T-DNA插入物右侧插入点位于第4号染色体40636883bp。因此本申请的侧翼序列可以根据基因组序列而向两侧延伸，即左侧侧翼序列可向第4号染色体40636901bp下游延伸，右侧侧翼序列可向第4号染色体40636883bp上游延伸。

由于转化事件ZZM030产生向基因组中特定位点插入的T-DNA插入物，因此其插入位点是特异性的，可以用于检测生物样品中是否包含转化事件ZZM030。在具体实施方案中，包含转化事件ZZM030的T-DNA插入物与侧翼序列的接合位点的任何序列，均可用于检测本申请的转化事件ZZM030，包括但不限于包含上游插入位点(左侧翼序列与T-DNA插入物的接合位点)或下游插入位点(右侧翼序列与T-DNA插入物的接合位点)的以下序列或其片段或其变体或其互补序列中的一种或多种：i)包含SEQ ID NO:1的第381-780位核苷酸所示序列；ii)包含SEQ ID NO:1的第1-898位核苷酸所示序列；iii)包含SEQ ID NO:1的第6239-6338位核苷酸所示序列；iv)包含SEQ ID NO:1的第10815-11214位核苷酸所示序列；v)包含SEQ ID NO:1的第10578-11373位核苷酸所示序列；vi)包含SEQ ID NO:1的第381-11241位核苷酸所示序列；vii)包含SEQ ID NO:1所示的序列。

在具体实例中，可用于检测本申请的转化事件ZZM030的序列为包含上游插入位点的序列或其片段或其变体或其互补序列，如包含SEQ ID NO:1的第381-780位核苷酸所示序列或包含SEQ ID NO:1的第1-898位核苷酸所示序列，或者为包含下游插入位点的序列，例如，包含SEQ ID NO:1的第10815-11214位核苷酸所示序列或包含SEQ ID NO:1的第10578-11373位核苷酸所示序列，或者为包含上游插入位点的序列与包含下游插入位点的序列的组合。

在另一实例中，可用于检测本申请的转化事件ZZM030的序列为包含上游插入位点的序列或其片段或其变体或其互补序列与包含T-DNA插入物的序列或其片段或其变体或其互补序列的组合，例如，包含SEQ ID NO:1的第381-780位核苷酸所示序列或包含SEQ IDNO:1的第1-898位核苷酸所示序列，与包含SEQ ID NO:1的第6239-6338位核苷酸所示序列或包含SEQ ID NO:1的第681-10915位核苷酸所示序列的组合。

在另一实例中，可用于检测本申请的转化事件ZZM030的序列为包含下游插入位点的序列或其片段或其变体或其互补序列与包含T-DNA插入物的序列或其片段或其变体或其互补序列的组合，例如，包含SEQ ID NO:1的第10815-11214位核苷酸所示序列或包含SEQID NO:1的第10578-11373位核苷酸所示序列，与包含SEQ ID NO:1的第6239-6338位核苷酸所示序列或包含SEQ ID NO:1的第681-10915位核苷酸所示序列的组合。

在另一实例中，可用于检测本申请的转化事件ZZM030的序列为包含SEQ ID NO:1的第381-11241位核苷酸所示序列或其片段或其变体或其互补序列，或者为包含SEQ IDNO:1所示的序列或其片段或其变体或其互补序列。

因此，能够特异性检测转化事件ZZM030的T-DNA插入物与侧翼序列的接合位点的引物对、探针、以及引物对和探针的组合均可用于检测本申请的转化事件ZZM030。

如本文所用，“核苷酸序列”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，核苷酸序列以5’至3’方向从左向右书写。

在一些实施方案中，本申请还涉及核酸序列的片段，其是指完整部分中的不完整的更小片段的部分。例如，SEQ ID NO：1的片段包括SEQ ID NO：1的完整序列的至少约10个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、或至少约50个核苷酸的序列或更多。

在一些实施方案中，可以对本申请的核酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。在某些实施方案中，可以依照单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请还涉及核酸序列的变体。一般来讲，特定核酸片段的变体将与该特定核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互补序列。这样的变体序列包括一个或多个核酸残基的添加、缺失或替换，从而可以导致相应的氨基酸残基的添加、移除或替换。通过本领域内已知的序列比对程序包括杂交技术确定序列同一性。实施方案的核苷酸序列变体与本申请的序列的差异可以少至1-15个核苷酸、少至1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4、3、2或甚至1个核苷酸。

如本文所用，“探针”是附加了常规可检测的标记或报告分子例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶的分离的多核苷酸，其与靶多核苷酸的链是互补的。

在具体实施方案中，本申请所提供的用于检测转化事件ZZM030的DNA探针，包括包含SEQ ID NO：1的足够长度的连续核苷酸的序列或其完全互补序列，该DNA探针在严格杂交条件下与包含上游插入位点或下游插入位点的核苷酸序列杂交并且在严格杂交条件下不与不含上游插入位点或下游插入位点的核苷酸序列杂交。

在具体实例中，本申请所提供的探针包含SEQ ID NO:1的第381-780位核苷酸或第10815-11214位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。如本文所用，“引物”是分离的多核苷酸，其通过核酸杂交形成引物和靶DNA链之间的杂交体而与互补靶DNA链退火，然后凭借例如DNA聚合酶沿着靶DNA链伸展。引物对涉及其靶多核苷酸扩增用途，例如通过聚合酶链反应(PCR)或其他常规核酸扩增方法。

在具体实施方案中，本申请所提供的用于检测转化事件ZZM030的引物对包括第一DNA分子以及不同于第一DNA分子的第二DNA分子，其中所述第一DNA分子和第二DNA分子各自包含SEQ ID NO：1的足够长度的连续核苷酸的核苷酸序列或其完全互补序列，且其中所述第一DNA分子存在于SEQ ID NO：1的T-DNA插入物中和所述第二DNA分子存在于SEQ IDNO：1的侧翼序列中，当与来自转化事件ZZM030的DNA在扩增反应中共同使用时，该DNA引物产生用于检测样品中转化事件ZZM030 DNA的扩增子，且其中所述扩增子包含SEQ ID NO:1的第381-780位核苷酸或第10815-11214位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。

在具体实施方案中，本申请所提供的引物对为特异性识别包含SEQ ID NO:1的第381-780位或第1-898位核苷酸所示序列的引物对。

在具体实施方案中，本申请所提供的引物对为特异性识别包含SEQ ID NO:1的第10815-11214位或第10578-11373位核苷酸所示序列的引物对。

在具体实施方案中，本申请所提供的引物对为：i)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第381-780位或第1-898位核苷酸所示序列的引物对；和ii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第10815-11214位或第10578-11373位核苷酸所示序列的引物对；或者，所述引物对包含：特异性识别包含SEQ ID NO:1的第381-780位或第1-898位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第10815-11214位或第10578-11373位核苷酸所示序列的反向引物。

在另一具体实施方案中，本申请所提供的引物对为：i)特异性识别包含SEQ IDNO:1的第381-780位或第1-898位核苷酸所示序列的引物对；和ii)特异性识别包含SEQ IDNO:1的第6239-6338位或第681-10915位核苷酸所示序列的引物对；或者，所述引物对包含：特异性识别包含SEQ ID NO:1的第381-780位或第1-898位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第6239-6338位或第681-10915位核苷酸所示序列的反向引物。

在另一具体实施方案中，本申请所提供的引物对为：i)特异性识别包含SEQ IDNO:1的第6239-6338位或第681-10915位核苷酸所示序列的引物对；和ii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第10815-11214位或第10578-11373位核苷酸所示序列的引物对；或者，所述引物对包含：特异性识别包含SEQ ID NO:1的第6239-6338位或第681-10915位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第10815-11214位或第10578-11373位核苷酸所示序列的反向引物。

在另一具体实施方案中，本申请所提供的引物对为：i)特异性识别包含SEQ IDNO:1的第381-780位或第1-898位核苷酸所示序列的引物对，ii)特异性识别包含SEQ IDNO:1的第6239-6338位或第681-10915位核苷酸所示序列的引物对，和iii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第10815-11214位或第10578-11373位核苷酸所示序列的引物对。

在另一具体实施方案中，本申请所提供的引物对为特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列的引物对。

在具体实例中，所述引物对为SEQ ID No:8和SEQ ID No:9所示的核苷酸序列或其互补序列；或者SEQ ID No:10和SEQ ID No:11所示的核苷酸序列或其互补序列。

设计和使用引物和探针的方法是本领域熟知的，例如Sambrook等人的《分子克隆实验手册》(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)和Wiley-Blackwell出版的《分子生物学实验室指南》(Current Protocols in MolecularBiology)中描述。

如本文所用，“试剂盒”或“微阵列”是指用于生物样品中玉米转化事件ZZM030的鉴定和/或检测目的的试剂组或芯片。为质量控制(例如种子批次的纯度)、植物材料中或包含植物材料或来源于植物材料的材料例如但不限于食品或饲料产品中事件ZZM030的检测的目的，可以使用试剂盒或芯片，并且其组分可以具体地调整。

在具体实施方案中，本申请所提供的试剂盒或探针包括本申请所提供的任一种探针或任一种引物对。在另一具体实施方案中，本申请所提供的试剂盒或探针包括本申请所提供的任一种探针或任一种引物对的组合。

此外，本申请还提供了转基因玉米植物、后代、种子、植物细胞或植物部分及其制品，包括但不限于食品、饲料或工业原料。这些植物、后代、种子、植物细胞、植物部分及其制品中均包含可检测的本申请所提供的T-DNA插入物与侧翼序列的接合位点的核酸分子序列。

进一步地，本申请还提供了对玉米进行育种的方法，包括以下步骤：1)获得包含本申请所提供的T-DNA插入物与侧翼序列的接合位点的核酸分子序列的玉米；2)将步骤1)所获得的玉米通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到后代植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；以及任选地步骤3)，对步骤2)所获得的玉米植物进行抗除草剂草铵膦和草甘膦以及抗虫鉴定，并利用本申请所提供的探针、引物对、试剂盒或阵列来检测其中是否存在转化事件ZZM030。

此外，本申请提供了在田间控制杂草的方法，以及控制或杀死鳞翅目害虫的方法。

在具体实施方案中，本申请所提供的在田间控制杂草的方法，包括在田间种植包含转化事件ZZM030的玉米植物，以及在所述田间应用有效剂量的能够在不伤害所述包含事件ZZM030的转基因玉米植物的情况下控制杂草的草甘膦和草铵膦除草剂。

在具体实施方案中，本申请所提供的控制或杀死鳞翅目害虫的方法，包括使所述鳞翅目害虫接触有效量的转化事件ZZM030的玉米植物，或者向所述鳞翅目害虫喂食有效量的转化事件ZZM030的玉米植物，或者使所述鳞翅目害虫进食有效量的转化事件ZZM030的玉米植物。所述鳞翅目害虫，包括但不限于亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、东方粘虫(Mythimna separate(Walker))等。

如本文所用，“有效量”或“杀虫有效量”是指存在于害虫环境的具有杀虫活性的物质或生物体的量。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。

若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的《分子克隆实验手册》(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例所涉及的玉米品种材料均由中国种子集团有限公司提供，其中玉米自交系祥249为玉米品种长城799的母本，是以国外引进的玉米种质资源为材料，用系谱法自交分离和严格选择，经过10个世代，于1996年选育而成。

实施例1载体构建

1.抗虫基因的合成

利用本申请人在PCT国际申请WO2017012577A1中公开的在植物中表达并产生抗虫效果的抗虫基因cry1Ab/cry1Ac ZM。该基因以经过融合与改造的Cry1Ab和Cry1Ac N端608个氨基酸序列为基础，使用植物偏爱的密码子置换编码序列，并通过置换密码子的方法对DNA序列中存在的造成植物转录不稳定的富含AT序列以及常用限制性酶切位点进行改正消除。同时，在5’端增加了一段67个核苷酸的Ωsequence和3个核苷酸(ACC)的Kozaksequence用来增强真核基因的翻译效率。3’端添加135bp的polyA序列。该基因编码的蛋白质含有3个功能区段，其中N端两个功能区高度同源于Cry1Ab对应部分，C端的功能区高度同源于Cry1Ac。以人工合成的方式合成如SEQ ID NO:1第4624至6670位碱基所示的抗虫基因cry1Ab/cry1Ac Zm。

2.抗除草剂基因外源基因的合成

利用Vector NTI软件对抗草甘膦基因cp4编码区序列进行玉米密码子偏好性优化，并在5’端添加表达增强元件Ωsequence1，改造后的DNA序列命名为cp4Zm。以人工合的方式合成如SEQ ID NO:1第8954至10611位碱基所示的抗草甘膦除草剂基因。

bar基因序列参见Gene bank登录号为X17220.1所示的序列，以人工合的方式合成如SEQ ID NO:1第957至1508位碱基所示的抗草铵膦除草剂基因。

3.载体构建

在合成的cry1Ab/cry1Ac Zm的5’端添加HindIII和PstI酶切位点，3’端添加PmeI酶切位点，并将合成的序列克隆在Puc57simple载体上，命名为pZZ01194。

对已有含ubiquitin promoter(5’端有HindIII酶切位点，3’端有BamHI酶切位点)的中间载体pZZ00005，使用限制酶HindIII和BamHI进行双酶切，用T4DNA聚合酶补平产生的粘末端，获得ubiquitin promoter片段。

限制酶PstI处理pZZ01194，用T4DNA聚合酶补平产生的粘末端，将ubiquitinpromoter通过平末端连接方式连入，获得含有ubiquitin promoter-cry1Ab/cry1Ac Zm片段的载体，命名为pZZ01201。

对已有含有nos terminator(5’端有EcoRI酶切位点，3’端有PmeI，EcoRI位点)的中间载体pZZ01188，使用限制酶EcoRI进行单酶切，用T4DNA聚合酶补平产生的粘末端，获得nos terminator序列。

PmeI处理pZZ01201，将nos terminator通过平末端连接方式连入，获得含有ubiquitin promoter-cry1Ab/cry1Ac Zm-nos terminator片段的载体，命名为pZZ01205。

对中间载体pZZ00015(含有CaMV 35S promoter-bar-CaMV 35S terminator和ubiquitin promoter–egfp-nos terminator表达元件)，通过限制酶HindIII和PmeI去除ubiquitin promoter-egfp-nos terminator。使用限制酶HindIII和PmeI处理pZZ01205载体，获得ubiquitin promoter-cry1Ab/cry1Ac Zm-nos terminator片段。将两者进行连接，获得含有ubiquitin promoter-cry1Ab/cry1Ac Zm-nos terminator和CaMV 35Spromoter-bar-CaMV 35S terminator两个表达盒的表达载体,命名为pZHZH25017。

对中间载体pZZ01337(CaMV 35S promoter-cp4Zm-nos terminator)使用限制酶HindIII和BamHI切除CaMV 35S promoter。对中间载体pZZ00033使用限制酶HindIII和BamHI获得ubiquitin4promoter。将两者进行连接，获得含有ubiquitin4 promoter-cp4Zm-nos terminator片段的载体，命名为pZZ01383。

使用限制酶HindII和PmeI双酶切处理pZZ01383获得ubiquitin4 promoter-cp4Zm-nos terminator片段，用T4DNA聚合酶补平产生的粘末端。

使用限制酶PmeI处理pZHZH25017，将ubiquitin4 promoter-cp4 Zm-nosterminator通过平末端连接方式连入，获得含有ubiquitin promoter-cry1Ab/cry1Ac Zm-nos terminator,CaMV 35S promoter–bar-CaMV 35S terminator和ubiquitin4promoter-cp4Zm-nos terminator三个表达盒的植物表达载体，命名为pZHZH35006，其物理图谱见(图1)。

实施例2转基因玉米的获得

使用农杆菌介导的遗传转化方法获得转基因玉米。

将载体pZHZH35006的质粒DNA通过电击法转化到农杆菌EHA105中，鉴定后备用。

利用本申请人在中国发明专利申请CN104745622A中公开的玉米骨干自交系的高效转基因方法进行转化。

具体地，玉米自交系祥249自交后取长度1.5mm左右的幼胚用于转化。收集约200个果穗的幼胚为一批次，置于EP管中把悬浮液吸出，加入含有200μM乙酰丁香酮的农杆菌菌液，共培养5min，然后把幼胚转移到共培养基上，暗培养3天。将暗培养后的幼胚放置在愈伤诱导培养基上，待有愈伤组织长出后，放置含5mg/L双丙氨膦的筛选培养基上，筛选培养，每两周继代一次。当抗性愈伤长出时，挑选出状态良好的胚性愈伤转到分化培养基上，培养条件为26℃，每日3000Lux光强，光照16h，两周后出现再生小苗。将再生的小植株移到生根培养基中，待小苗长出二级次根后，移栽于混有营养土和蛭石(1∶3)的小盆中。

按照下述步骤对获得的转化苗进行转基因阳性检测，挑选出转基因阳性植株。

(1)DNA抽提

采用天根生化技术公司的DNAsecure Plant Kit新型植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)抽提玉米基因组DNA。

(2)PCR

将下列试剂从-20℃冰箱中取出解冻：10倍PCR缓冲液(Takara)、脱氧核苷酸混合物(10mM，Sigma)、包括正向引物SEQ ID NO:2(CSP759)：5’-CACGCAGATTCCAGCGGTCAA-3’；反向引物SEQ ID NO:3(CSP760)：5’-GACGAGGTGAAGGCGTTAGCA-3’)以及玉米叶片DNA模板。所有试剂解冻完毕后，离心数秒，置于冰上待用。配制PCR反应体系的混合液，混匀，离心数秒。PCR反应体系(20μL)：2μL10倍PCR缓冲液(Takara)，0.5μL脱氧核苷酸混合物(10mM，Sigma)，0.8μL正反向引物混合物(5μM)，0.2μL r-Taq(5U，Takara)，其余为dd H₂O。将混合液分装至200μL规格的PCR管中，再加入1μL玉米叶片DNA模板，对于不同样品分别做好标记以便区分。将PCR反应管放入ABI 9700型PCR扩增仪，选择预设PCR扩增程序，开始运行反应。PCR反应程序为：94℃预变性2min；30个循环：94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec；最后72℃延伸5min。

(3)琼脂糖凝胶电泳检测

PCR结束后，取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。配制1.5％的琼脂糖凝胶，150V电泳25min后在溴化乙啶(EB)中染色10min，在紫外凝胶成像系统中拍照。

(4)结果的判断

能扩增出333bp大小条带的材料为转基因阳性植株，不能扩增出该条带大小的材料为转基因阴性植株。

将上述转基因阳性植株移栽至大花盆中，即为T₀代植株。

实施例3转基因玉米的抗性鉴定

T₀代植株自交，所得种子为T₁代种子。将T₁代种子播种于温室大棚中，得到T₁代植株。重复上述过程，直至获得T₄代种子。

对T₁至T₃代植株进行转基因阳性检测、耐除草剂分析、抗虫鉴定、农艺性状分析。从每代植株中挑选出转基因阳性，具有抗虫、耐除草剂特性，并且农艺性状表现优异的植株进入下一代筛选。

1.阳性检测

检测方法及步骤同实施例2所述。

2.耐除草剂性状鉴定

将经步骤1检测的阳性植株自交种子播种于温室大棚中，对6-8叶片期植株进行除草剂抗性鉴定，去除不耐受除草剂的植株。

(1)草铵膦除草剂耐受鉴定

喷施所用草铵膦除草剂“保试达”(Basta)为拜耳作物科学(中国)有限公司生产，有效成分为18％草铵膦可溶液剂。该除草剂的推荐用量为200-300毫升/亩，本申请采用推荐浓度中量250毫升/亩的用药量进行喷施。4-5天后观察并记录除草剂耐性表现。对草铵膦具有耐性的玉米植株生长正常，无任何受害症状；对草铵膦敏感的玉米植株表现出明显的药害症状，包括生长停滞、失绿、枯斑、畸形等，直至全株死亡。

在T₁、T₂和T₃代植株群体中，根据观测到草铵膦抗性的实际分离比与根据孟德尔遗传定律计算的预期分离比(表1)，按以下公式进行Chi平方检验：χ²＝Σ[(|o–e|–0.5)²/e]；其中，“o”为阳性株数或阴性株数观测值，“e”为阳性株数或阴性株数期望值，“0.5”为自由度为1时Yates分析校正因子。

表1 转化体ZZM030各世代预期分离比

*：在单一位点单拷贝插入的情况下，按照孟德尔遗传定律计算的预期分离比。

表2 转化体ZZM030各世代分离分析-χ²检验

表2中，“观测值”为喷施草铵膦后观测到的实际阳性植株数和阴性植株数；“期望值”为根据孟德尔遗传定律按照表1计算的理论转基因阳性植株数与转基因阴性植株数；“χ²”为根据Chi平方检验公式计算得到的Chi平方值；“χ² _0.05,1”为在显著性水平α＝0.05，自由度为1时，查χ²界值表得到的值；“概率”为χ²与χ² _0.05,1两者比较后的结果，当χ²<χ² _0.05,1时，则P>0.05，说明观测值与期望值之间无显著性差异。表2中χ²检验分析表明，在T₁-T₃调查世代中，观察到的遗传分离比和预期遗传分离比之间没有显著性的差异(P>0.05)，说明ZZM030在不同世代之间按照孟德尔遗传规律稳定遗传，且在T₃代达到纯合。

(2)草甘膦除草剂耐受鉴定

喷施所用草甘膦除草剂“农达”(Roundup)为孟山都公司生产，有效成分为41％异丙胺盐。该除草剂玉米田推荐用药量为150-250毫升/亩，本申请采用推荐浓度中量200毫升/亩的用药量进行喷施，一周后观察并记录除草剂耐性表现。对草甘膦具有耐性的玉米植株生长正常，无任何受害症状；对草甘膦敏感的玉米植株表现出明显的药害症状，包括生长抑制、褪绿、枯斑、畸形等，直至全株死亡。

3.转基因玉米植株螟虫抗性鉴定

采用心叶期活体接虫法在田间对植株的螟虫抗性进行了鉴定。

在玉米植株生长发育至心叶中期(7叶片期)进行接虫。供试昆虫为亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)，将黑头期卵约60粒放入离心管中，用脱脂棉塞住管口。将离心管放入28℃、湿度80％的培养箱中，或置于室温条件下盖上湿毛巾保湿，待卵块孵化后将脱脂棉拔掉，投放入心叶丛中。每个植株接虫10-20头。接虫2-3周后逐株调查植株心叶的被害程度，根据被害叶片上的虫孔大小和多少划分受害等级，称为食叶级别。本申请采用国际玉米螟协作组制定的9级分级标准(表1)。逐株调查食叶级别，以各株平均值作为供鉴定品系的食叶级别，并根据表3的评价标准确定其抗螟性级别。

表3.玉米抗螟虫性田间鉴定评价标准

注：*蛀茎评估时隧道2.5cm为1个孔。

**HR：高抗；R：抗；MR：中抗；S：感；HS：高感

4.玉米转化事件ZZM030

经过上述过程，最终筛选出玉米转化事件ZZM030。

图2为250毫升/亩喷施草铵膦除草剂“保试达”4-5天后植株照片，其中图2A为ZZM030，植株生长正常，无任何受害症状，图2B为野生型对照祥249，叶片干枯、失绿、枯斑、生长停滞，表现明显药害症状。表明该事件对草铵膦除草剂表现为高抗。

图3为200毫升/亩喷施草甘膦除草剂“农达”一周后植株照片，其中图3A为ZZM030，植株生长正常，无任何受害症状。图3B为野生型对照祥249，叶片干枯、褪绿、生长停滞，表现明显药害症状。表明该事件对草甘膦除草剂均表现为高抗。

图4为植株螟虫抗性鉴定的田间实验照片，利用亚洲玉米螟，采用心叶期活体接虫法进行，图中白色斑点为虫孔。图4A为ZZM030叶片，针孔状虫孔，虫孔稀少、分散。图4B为非转基因阴性对照祥249叶片，绿豆大小虫孔，个别呈短条孔花叶。表明该事件对亚洲玉米螟虫达到高抗级别，其叶片平均食叶级别达为1.2-1.5(见表4)。

表4.转化体不同世代螟虫食叶级别生测结果

备注：调查株数n＝10；“*”代表与阴性对照相比差异显著

实施例4玉米转化事件ZZM030的粘虫抗性鉴定

1)粘虫抗性离体生测实验I以先正达商业化转基因玉米品种Bt11为阳性对照，该材料含有Cry1Ab基因，已报道具有粘虫抗性；以构建转基因事件所使用的受体材料祥249为阴性对照；对转化事件ZZM030进行粘虫抗性的离体生测；供试粘虫为东方粘虫(Mythimnaseparate(Walker))。

具体的鉴定方法如下：分别取生长至3-4和8-10叶期的新鲜玉米植株地上部分带回室内，取幼嫩心叶，放入培养皿内，接入10头1日龄虫；每皿一个处理，每个处理重复3次；放置在温度28±1℃、光周期14:20h(L:D)、相对湿度70-80％的人工气候箱中培养。3d后统计存活幼虫数并计算幼虫存活率。

对不同品种玉米粘虫存活率进行多重比较分析，显著水平为0.05，存活率在统计分析前进行一次开方和反正弦转化，比较各处理间差异显著性。根据取食转基因玉米和对照玉米组织幼虫存活率差异显著性，参考表5定性判定其对粘虫的抗性，鉴定结果如表6所示。。

表5.东方粘虫离体生测评价标准

表6.不同玉米材料粘虫抗性离体生测结果

2)粘虫抗性离体生测实验II

以先正达商业化转基因玉米品种Bt11为阳性对照，该材料含有Cry1Ab基因，已报道具有粘虫抗性；以构建转基因事件所使用的受体材料祥249和中国农业科学院植物保护研究所迁飞害虫研究组累代饲养粘虫的常规玉米苗为阴性对照；对ZZM030进行粘虫抗性的离体生测；供试粘虫为东方粘虫(Mythimna separate(Walker))。

具体的鉴定方法如下：选择材料3-4和8-10叶期的新鲜叶片为供试粘虫的食物；所有的玉米叶片用0.1％的次氯酸纳溶液浸泡3min消毒，然后用蒸馏水冲洗干净晾干；将l整株玉米放入750ml的罐头瓶中，每瓶接入初孵幼虫40头，每个处理做3次重复；置于温度(24±1)℃，湿度(70±5)％，光周期14L:10D的人工气候箱中饲养；每隔2天更换新鲜的相应处理的玉米植株，分别于试验开始后的第3、6、9天检查幼虫的死亡情况。

试验得到不同处理的第3、6、9天幼虫的存活数据用Excel整理后，采用美国SPSSInc公司的SPSS软件(SPSS 16.0)对不同处理的粘虫存活率进行方差分析，差异显著后采用Tukey's HSD进行多重比较。存活率数据在统计分析前进行一次开方和反正弦转化。

表7为不同材料3-4叶期对初孵粘虫存活率的影响，表中数据为平均数±标准误，同一列中相同字母表示经Tukey's HSD法检验在P<0.05水平差异不显著。常规玉米苗的粘虫幼虫存活率在处理后和第3、6、9天的存活率均在95％以上，表明试验所用虫体健康，试验操作可行。不同材料3-4叶期对初孵幼虫存活率有显著影响，第3天的各材料幼虫存活率均较高，除Bt11的幼虫存活率显著低于其他材料外(P<0.05)，其余处理间无显著差异(P>0.05)。第6天各处理间幼虫存活率差异更加明显，特别是Bt11的幼虫存活率显著下降，仅为3l.7％，根据表5的评价标准，抗虫水平为中抗。第9天各处理间幼虫存活率差异进一步加剧。

表7.不同材料3-4叶期对初孵粘虫存活率的影响

表8为不同材料8-10叶期对初孵粘虫存活率的影响，表中数据为平均数±标准误，同一列中相同字母表示经Tukey's HSD法检验在P<0.05水平差异不显著。从试验后3天的幼虫存活率来看，Bt11的幼虫存活率显著低于祥249和常规玉米苗。处理后第6天的幼虫存活率差异显著增大：其中ZZM030幼虫存活率低于45％，表现为中抗；祥249和常规玉米苗表现为高感。处理后9天的幼虫存活率以祥249和常规玉米苗表现为高感，并显著高于其它材料；ZZM030表现为高抗。

表8.不同材料8-10叶期对初孵粘虫存活率的影响

3)田间粘虫抗性鉴定

在吉林公主岭、济南饮马泉、云南景洪分别设立三个试验地点，以活体接虫的方式分别对ZZM030进行了田间粘虫抗性鉴定，以祥249为对照，供试粘虫为东方粘虫(Mythimnaseparate(Walker))。

接虫方法为：4-6叶期接虫，每小区人工接40株，每株接初孵幼虫40头；接虫两次，间隔3天；最后一次接虫14天后，逐株调查每个小区接虫株被粘虫为害的食叶级别，并根据标准评价材料心叶期抗性水平。分级标准及抗性级别判定标准按照农业部953号公告-10.1-2007的规定执行。

鉴定结果见表9和图5。表9中，数值以3次重复的平均值±标准差表示，同列小写字母不同表示相同地点不同材料之间差异显著(P<0.01)。图5中，A为转基因事件ZZM030，B为阴性对照249。叶片边缘及叶片上缺失部分为被粘虫蚕食后的虫孔。公主岭试验点ZZM030的平均食叶级别为1.2，抗性类型为高抗，阴性对照受体玉米祥249的平均食叶级别为5.8，抗性类型为中抗；济南试验点ZZM030的平均食叶级别为2.7，抗性类型为抗，阴性对照受体玉米祥249的平均食叶级别为5.4，抗性类型为中抗；景洪试验点ZZM030的平均食叶级别为1.5，抗性类型为高抗，阴性对照受体玉米祥249的平均食叶级别为9.0，抗性类型为高感。三个试验点转化事件ZZM030与阴性对照(受体玉米祥249)对粘虫的抗性差异显著，表明田间条件下转化事件ZZM030在4-6叶期对粘虫的抗性较好。

表9.不同材料田间抗性鉴定结果

实施例5 玉米转化事件ZZM030 Southern印迹鉴定

1.探针的制备

(1)cry1Ab/cry1AcZM探针的制备

以pZHZH35006质粒DNA为模板制备探针。以CSP759(SEQ ID NO 2)、CSP760(SEQ IDNO 3)为引物，采用罗氏公司PCR地高辛探针合成试剂盒(货号：11636090910)合成用于检测cry1Ab/cry1AcZM的探针，探针大小为333bp(探针序列同Seq ID No：1第6084-6416位所示核苷酸序列)。扩增体系包含：DNA模板5μL(50pg)，引物各0.5μL，PCR DIG混合物5μL，DNA聚合酶0.75μL，PCR缓冲液(10倍)5μL，ddH₂O 33.25μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环：94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec；最后72℃延伸7min。使用1％琼脂糖凝胶检测标记扩增效果。将特异性扩增的扩增产物，即用于检测cry1Ab/cry1AcZM的探针，于-20℃保存。

(2)bar探针的制备

使用如(1)所述相同方法，利用引物对(SEQ ID NO 4:FW-Csp73，SEQ ID NO 5:RV–Csp74)制备了bar基因的特异探针，其长度为408bp(探针序列同Seq ID No：1第1035-1442位所示核苷酸序列)。

(3)cp4Zm探针的制备

使用如(1)所述相同方法，利用引物对(SEQ ID NO 6:FW-Csp1337，SEQ ID NO 7:RV-Csp1338)制备了cp4Zm基因的特异探针，其长度为1138bp(探针序列同Seq ID No：1第9058-10195位所示核苷酸序列)。

2.DNA提取

提取转基因玉米T₁、T₂或者T₃代材料的叶片基因组总DNA，获得的DNA沉淀干燥后溶于无离子水，测定浓度后备用。

3.酶切、电泳、转膜、显影

当使用cry1Ab/cry1AcZM探针时，玉米基因组DNA需用HindIII或KpnI进行单酶切。

当使用bar探针时，玉米基因组DNA需用HindIII或EcoRI进行单酶切。

当使用cp4Zm探针时，玉米基因组DNA需用HindIII或KpnI进行单酶切。

使用200μL酶切体系，其中含有20μg玉米基因组DNA、20μl限制性内切酶、20μL10倍缓冲液，加ddH₂O补齐至200μL。酶切16h后取20μL进行电泳检测，检测酶切效果是否彻底。

酶切产物加ddH₂O补充至400μl，加入1/10体积的3M醋酸钠溶液(pH 5.2)，加入4μL的TaKaRa Dr.GenTLE Precipitation Carrier，加入2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀，12,000rpm 4℃离心15min。将沉淀用50μL ddH₂O溶解，加5μL 6倍上样缓冲液。

将DNA通过0.8％凝胶，20V电泳16h。切掉多余泳道及点样孔，剩余凝胶用变性溶液处理2次，每次15min，在摇床上轻摇。再用中和缓冲液处理2次，每次15min，在摇床上轻摇。超纯水清洗一次。20倍SSC处理10min中，用Whatman系统进行转膜4小时以上。

转膜结束后，将膜放置在用10倍SSC浸润的Whatman 3MM滤纸上，紫外交联仪交联3-5min。用ddH₂O简单洗膜，于空气中干燥。杂交及显影过程均按照罗氏地高辛检测试剂盒I(货号：11745832910)或者罗氏地高辛检测试剂盒II(货号：11585614910)的操作手册进行。

4.结果分析

图6A示出了转化事件ZZM030玉米基因组DNA分别由HindIII和KpnI酶切与cry1Ab/cry1AcZM特异探针分子杂交结果。两种酶切条件下分别显示一条阳性带，经HindIII酶切得到的条带为10.9kb，经KpnI酶切得到的条带为10.5kb，表明外源基因cry1Ab/cry1AcZM单拷贝插入，该转化事件为单拷贝转化事件。

图6B示出了转化事件ZZM030玉米基因组DNA分别由HindIII和EcoRI酶切与bar特异探针分子杂交结果。两种酶切条件下分别显示一条阳性带，经HindIII酶切得到的条带为4.2kb，经EcoRI酶切得到的条带为10.0kb，均符合预期，表明外源基因bar单拷贝插入，该转化事件为单拷贝转化事件。

图6C示出了转化事件ZZM030玉米基因组DNA分别由HindIII和KpnI酶切与cp4Zm特异探针分子杂交结果。两种酶切条件下分别显示一条阳性带，经HindIII酶切得到的条带为10.9kb，经KpnI酶切得到的条带为10.5kb，均符合预期，表明外源基因cp4Zm单拷贝插入，该转化事件为单拷贝转化事件。

实施例6玉米转化事件ZZM030序列分析

在转基因操作中，通常使用相同的转化载体进行大量的遗传转化，从获得的诸多转化事件中筛选极少数优异的转化事件。因此，对插入的外源序列中的载体、表达元件、外源基因等的检测，仅能证明检测样品含有该转基因成份，无法区分不同的转化事件。而不同的转化事件，是以其插入位点的侧翼序列与插入的外源序列的组合为特征。为此，本实施例分离并鉴定了玉米转化事件的侧翼序列。

1.左侧翼序列分析

取待测转化事件植株叶片提取总DNA(T₂代或者T₃代生长健壮的转基因植株)，利用FPNI-PCR方法进行插入玉米基因组的外源基因侧翼序列扩增、克隆、测序，得到序列结果。

(1)Tail-PCR引物序列如表10所示。

表10.引物序列

其中W＝A/T，N＝A/G/C/T。

(2)制备高质量玉米基因组DNA备用，稀释至100ng/μL后备用；

(3)以步骤(2)中的基因组DNA作为第一轮PCR反应的模板，反应体系如下表6。反应程序为：95℃，2.5min；2个以下循环：94℃，10sec，62℃，30sec，72℃，2min；94℃，10sec；25℃，2min；72℃(5.1％ramp)，2min；5个以下循环：94℃，10sec；62℃，30sec；72℃，2min；94℃，10sec；62℃，30sec；72℃，2min；94℃，10sec；44℃，30sec；72℃，2min；72℃，5min；20℃，10min。

表11.第一轮PCR反应体系

(4)以第一轮PCR产物(混合液母液)为模板进行第二轮PCR扩增，反应体系如下表7。反应程序为：94℃，1.5min；(94℃，10sec；62℃，30sec；72℃，2min)×30cycles；72℃，7min；20℃，10min。

表12.第二轮PCR反应体系

(5)以第二轮PCR产物(混合液稀释50倍)为模板进行第三轮PCR扩增，反应体系如下表8。反应程序为：94℃，1.5min；(94℃，10sec；62℃，30sec；72℃，2min)×30cycles；72℃，7min；20℃，10min。

表13.第三轮PCR反应体系

(6)取第三轮PCR的产物于1％(w/v)1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测，回收300bp-2kb之间的DNA片段；

(7)将回收的片段连接T载体，16℃过夜连接；

(8)转化(7)的连接产物；

(9)用M13F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’和M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’引物扩增(8)中的转化产物，并挑取阳性克隆摇床培养菌液，利用TIANprep Rapid MiniPlasmid Kit快速质粒小提试剂盒(离心柱型)提取质粒DNA；

(10)用测序引物对(9)中的质粒DNA进行测序，利用Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit对质粒DNA进行测序PCR。测序引物为M13F和M13R引物；M13-F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’，M13-R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’；

(11)用NaAc和无水乙醇纯化、甲酰胺变性(10)中的PCR产物

(12)将(11)中纯化变性好的PCR产物利用ABI DNA测序仪3730开机测序并读出测序结果。

(13)测序结果在PlantGDB数据库中用BLASTN工具与玉米基因组序列进行同源搜索，以最好的匹配结果为插入位点的染色体号和碱基对位置号，通常序列一致性为90-100％。

(14)通过本实验检测出插入T-DNA的左侧翼序列680bp，见序列SEQ ID NO：1的核苷酸1-680。以玉米B73全基因组序列为参考(http://www.plantgdb.org/ZmGDB/cgi-bin/blastGDB.pl)，分析比较确定本申请转化事件左侧插入点位于第4号染色体40636901bp。

2.右侧翼序列分析

取待测转化事件植株叶片提取总DNA(T₂代或者T₃代生长健壮的转基因植株)，利用接头PCR方法进行插入玉米基因组的外源基因侧翼序列扩增、克隆、测序，得到序列结果。

(1)人工合成接头PCR所需引物，稀释后备用；引物序列如表14所示。

表14.引物序列

(2)制备高质量玉米基因组DNA备用，稀释后备用；

(3)用ddH₂O将接头引物AD-L和AD-S分别稀释到100μmol/L，等体积混合，94℃水浴变性4min，自然冷却至室温后即为50μmol/L的接头；

(4)酶切玉米基因组DNA，酶切体系如下：

37℃酶切3h。

(5)连接接头，连接体系如下：

16℃过夜连接。

(6)以步骤(5)中的基因组DNA酶切-接头连接产物作为第一轮PCR反应的模板，反应体系如下表10。反应程序为：94℃，5min；7个以下循环：94℃ 30sec，72℃ 3min；32个以下循环：94℃ 30sec；67℃ 3min；67℃ 7min；25℃ 10min。

表15.第一轮PCR反应体系

(7)以第一轮PCR产物(混合液稀释40倍)为模板进行第二轮PCR扩增，反应体系如下表11。反应程序为：94℃，5min；5个以下循环：94℃ 30sec；72℃ 3min；20个以下循环：94℃ 30sec，67℃ 3min；67℃ 7min；25℃ 10min。

表16.第二轮PCR反应体系

(8)取第二轮PCR的产物于1％(w/v)1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测，回收300bp-2kb之间的DNA片段；

(9)将回收的片段连接T载体，16℃过夜连接；

(10)转化(9)的连接产物；

(11)用M13F和M13R引物扩增(10)中的转化产物，并挑取阳性克隆摇床培养菌液，利用TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit快速质粒小提试剂盒(离心柱型)提取质粒DNA；

(12)用测序引物对(11)中的质粒DNA进行测序，利用Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit对质粒DNA进行测序PCR。测序引物为M13F和M13R引物；M13-F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’，M13-R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’；

(13)用NaAc和无水乙醇纯化、甲酰胺变性(12)中的PCR产物。

(14)将(13)中纯化变性好的PCR产物利用ABI DNA测序仪3730开机测序并读出测序结果。

(15)测序结果在Plant GDB数据库中用BLASTN工具与玉米基因组序列进行同源搜索，以最好的匹配结果为插入位点的染色体号和碱基对位置号，通常序列一致性为90-100％。

(16)通过本实验检测出插入T-DNA的右侧翼序列460bp，见序列SEQ ID NO：1的核苷酸10915-11374。以玉米B73全基因组序列为参考(http://www.plantgdb.org/ZmGDB/cgi-bin/blastGDB.pl)，分析比较确定本申请转化事件右侧插入点位于第4号染色体40636883bp。

3.插入序列的大小和对玉米原内源基因组的影响

本申请外源基因单拷贝插入序列包括左右边界序列的载体大小为10282bp。

通过分段PCR扩增外源DNA测序的方法，确定转化事件插入序列实际大小为10235bp(SEQ ID NO:1的681-10915)，T-DNA插入物相对于表达载体左端缺失7bp，右端缺失40bp。

扩增体系包含：DNA模板2μL(200ng)，引物各0.5μL，DNA聚合酶0.5μL，PCR缓冲液(10倍)2μL，ddH₂O 14.5μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环：94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min；最后72℃延伸7min。使用1％琼脂糖凝胶检测标记扩增效果。回收特异性扩增的扩增产物，即目的片段。

上述47bp核苷酸位于非编码区的边界序列。其缺失不影响抗虫基因cry1Ab/cry1AcZM和筛选标记bar和cp4Zm基因的完整性。DNA序列分析比对表明，转化事件实际插入核苷酸序列与载体序列完全一致，没有发生任何碱基突变。

另外，插入位点处的玉米基因组为重复序列，47bp核苷酸缺失没有破坏任何已知的玉米内源功能基因。

实施例7.玉米转化事件ZZM030的检测方法

1.左侧翼DNA序列检测：

利用玉米转化事件的左侧翼基因组序列和外源片段中的35S polyA终止子的序列设计了一对引物(SEQ ID NO.8:FW-csp3758和SEQ ID NO.9:RV-csp2344)，建立该转化事件产品的定性PCR鉴定方法。

依据玉米转化事件ZZM030外源DNA片段整合位点左边界(LB)T-DNA 5’端设计的引物为：

Seq ID No.8(FW-csp3758):5’-TGATGGTTAATGAGGCAAGA-3’(玉米基因组区)；

Seq ID No.9(RV-csp2344):5’-TATAGGGTTTCGCTCATGTG-3’(35S PolyA区域)。

上述特异引物在50-60℃条件下利用温度梯度PCR扩增DNA片段确定了最佳退火温度。结果证实用58℃为最佳扩增温度；PCR反应程序为95℃ 5min，(95℃ 30s，50-60℃ 30s，72℃ 1min)35个循环，72℃ 7min。

为测试上述引物(FW-csp3758；RV-csp2344)特异扩增本转化事件特性，不同来源的玉米DNA被用来进行PCR扩增。

PCR反应条件和程序为95℃ 5min，35个以下循环：95℃ 30s，58℃ 30s，72℃1min；72℃ 7min。结果表明只有本转化事件DNA能够有阳性结果，其他转化事件或者阴性对照玉米品种均为阴性结果，见图7A。其中，泳道1-4分别为无菌水、祥249DNA、ZZM030DNA、其他相同载体转化事件DNA；仅有ZZM030基因组DNA泳道3有带清晰可见，其DNA片段大小898bp与预期一致，DNA片段克隆测序得到结果亦与预期一致。

2.右侧翼DNA序列检测：

利用外源片段中的cp4 Zm序列和玉米转化事件的右侧翼基因组序列设计了一对引物(SEQ ID NO.10:FW-csp3879和SEQ ID NO.11:RV-csp3889)，建立该转化事件的定性PCR鉴定方法。

依据ZZM030转化事件外源DNA片段整合位点右边界(RB)T-DNA 5’端设计的引物为：

Seq ID No.10(FW-csp3879):5’-AAGATTGAGCTGTCGGATAC-3’(cp4 Zm区域),

Seq ID No.11(RV-csp3889):5’-TTTGATCATGTGAGGAACGT-3’(玉米基因组区)。

上述特异引物在46-61℃条件下利用温度梯度PCR扩增DNA片段确定了最佳退火温度。结果证实用58℃为最佳扩增温度；PCR反应程序为95℃ 5min；35个以下循环：95℃ 30s，46-61℃ 30s，72℃1min；72℃ 7min。

为测试上述引物(FW-csp3879；RV-csp3889)特异扩增本转化事件特性，不同来源的玉米DNA被用来进行PCR扩增。

PCR反应条件和程序为95℃ 5min；35个以下循环：95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min循环；72℃ 7min。结果表明只有本转化事件DNA能够有阳性结果，其他转化事件或者阴性对照玉米品种均为阴性结果，见图7B。其中，泳道1-4分别为无菌水、祥249DNA、ZZM030DNA、其他相同载体转化事件DNA；仅有ZZM030基因组DNA泳道3有带清晰可见，其DNA片段大小796bp与预期一致，DNA片段克隆测序得到结果亦与预期一致。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和修改，这些改进和修改也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国种子集团有限公司

<120> 抗虫耐除草剂玉米转化事件

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11374

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgatggttaa tgaggcaaga tatgtgaatg gcaccttgaa tggtccactg cccgtctatg 60

agccgcagcc cgttgctctc aaagcaacta gcagcaggga ggcgctacca agcaagttag 120

cacaagtgga ggctgccggg ctcaatgagg atgagatggc gcttatcatc aagcgcttca 180

agaccgcgct aaaaggacgc aaggagtacc ccaacaagaa caagtcaagg ggaaaacgct 240

cctgcttcaa atgcggtaag aatggtcatt ttatagctca atgcctcgat aacgaatgac 300

caggcacaag agaagcatgg gaaaagagag aagaagaaga actaccggaa ggccaagggc 360

gaggcacaca ttgggaagga atgggactcc aactgctcct cctccgactc tgaggatgaa 420

ggactagctg cctcagcctt caacaaatct tcactcttcc ccaacgaacg ccatacatgc 480

cttatggcta aggagaagaa ggtatgtatt cgagacactc ctaagtactc ttcttctagc 540

gatgaggaat cttccgatga tgaggtagat tacactgatt tgtttaagga attatataga 600

gctaaagtag acaaaattaa tgaattaatt gatgctcttg atgaaaaaga taaactacaa 660

gaaaagcaag aggatatttt atatttgtgg tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa 720

taacacattg cggacgtttt taatgtactg aattaacgcc gaattaattc gggggatctg 780

gattttagta ctggattttg gttttaggaa ttagaaattt tattgataga agtattttac 840

aaatacaaat acatactaag ggtttcttat atgctcaaca catgagcgaa accctatagg 900

aaccctaatt cccttatctg ggaactactc acacattatt atggagaaac tcgagtcaaa 960

tctcggtgac gggcaggacc ggacggggcg gtaccggcag gctgaagtcc agctgccaga 1020

aacccacgtc atgccagttc ccgtgcttga agccggccgc ccgcagcatg ccgcgggggg 1080

catatccgag cgcctcgtgc atgcgcacgc tcgggtcgtt gggcagcccg atgacagcga 1140

ccacgctctt gaagccctgt gcctccaggg acttcagcag gtgggtgtag agcgtggagc 1200

ccagtcccgt ccgctggtgg cggggggaga cgtacacggt cgactcggcc gtccagtcgt 1260

aggcgttgcg tgccttccag gggcccgcgt aggcgatgcc ggcgacctcg ccgtccacct 1320

cggcgacgag ccagggatag cgctcccgca gacggacgag gtcgtccgtc cactcctgcg 1380

gttcctgcgg ctcggtacgg aagttgaccg tgcttgtctc gatgtagtgg ttgacgatgg 1440

tgcagaccgc cggcatgtcc gcctcggtgg cacggcggat gtcggccggg cgtcgttctg 1500

ggctcatggt agactcgaga gagatagatt tgtagagaga gactggtgat ttcagcgtgt 1560

cctctccaaa tgaaatgaac ttccttatat agaggaaggg tcttgcgaag gatagtggga 1620

ttgtgcgtca tcccttacgt cagtggagat atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt 1680

ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc 1740

actgtcggca gaggcatctt gaacgatagc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta 1800

ggtgccacct tccttttcta ctgtcctttt gatgaagtga cagatagctg ggcaatggaa 1860

tccgaggagg tttcccgata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaatagccc tttggtcttc 1920

tgagactgta tctttgatat tcttggagta gacgagagtg tcgtgctcca ccatgttcac 1980

atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg 2040

tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt cggcagaggc atcttgaacg atagcctttc 2100

ctttatcgca atgatggcat ttgtaggtgc caccttcctt ttctactgtc cttttgatga 2160

agtgacagat agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc cgatattacc ctttgttgaa 2220

aagtctcaat agccctttgg tcttctgaga ctgtatcttt gatattcttg gagtagacga 2280

gagtgtcgtg ctccaccatg ttggcaagct gctctagcca atacgcaaac cgcctctccc 2340

cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg 2400

cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca 2460

ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 2520

aaacagctat gacatgatta cgaattcgag ctcggtaccc ggggatcctc tagagtcgac 2580

ctgcaggcat gcaagcttat ccagcttgca tgcctgcagt gcagcgtgac ccggtcgtgc 2640

ccctctctag agataatgag cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc acatattttt 2700

tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat ctatctttat acatatattt aaactttact 2760

ctacgaataa tataatctat agtactacaa taatatcagt gttttagaga atcatataaa 2820

tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat tgagtatttt gacaacagga ctctacagtt 2880

ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt tttttttgca aatagcttca cctatataat 2940

acttcatcca ttttattagt acatccattt agggtttagg gttaatggtt tttatagact 3000

aattttttta gtacatctat tttattctat tttagcctct aaattaagaa aactaaaact 3060

ctattttagt ttttttattt aataatttag atataaaata gaataaaata aagtgactaa 3120

aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg 3180

agtagataat gccagcctgt taaacgccgt cgacgagtct aacggacacc aaccagcgaa 3240

ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc agacggcacg gcatctctgt cgctgcctct 3300

ggacccctct cgagagttcc gctccaccgt tggacttgct ccgctgtcgg catccagaaa 3360

ttgcgtggcg gagcggcaga cgtgagccgg cacggcaggc ggcctcctcc tcctctcacg 3420

gcaccggcag ctacggggga ttcctttccc accgctcctt cgctttccct tcctcgcccg 3480

ccgtaataaa tagacacccc ctccacaccc tctttcccca acctcgtgtt gttcggagcg 3540

cacacacaca caaccagatc tcccccaaat ccacccgtcg gcacctccgc ttcaaggtac 3600

gccgctcgtc ctcccccccc ccctctctac cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt 3660

tagggcccgg tagttctact tctgttcatg tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc 3720

cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa 3780

cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg ggatggctct agccgttccg cagacgggat 3840

cgatttcatg attttttttg tttcgttgca tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt 3900

caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt 3960

gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact 4020

acctggtgga tttattaatt ttggatctgt atgtgtgtgc catacatatt catagttacg 4080

aattgaagat gatggatgga aatatcgatc taggataggt atacatgttg atgcgggttt 4140

tactgatgca tatacagaga tgctttttgt tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg 4200

ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt 4260

tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca tacatcttca tagttacgag tttaagatgg 4320

atggaaatat cgatctagga taggtataca tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac 4380

atgatggcat atgcagcatc tattcatatg ctctaacctt gagtacctat ctattataat 4440

aaacaagtat gttttataat tattttgatc ttgatatact tggatgatgg catatgcagc 4500

agctatatgt ggattttttt agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt 4560

tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg tgttacttct gcaggtcgac tctagaggat 4620

cgtattttta caacaattac caacaacaac aaacaacaaa caacattaca attactattt 4680

acaattacaa ccatggattg ccggccctac aactgcctgt cgaaccctga ggtggaggtc 4740

ctgggcggcg agcggattga gactggctac acaccgattg acatctcact ctccctgacc 4800

cagttcctcc tgtcggagtt cgtgccaggc gctgggttcg ttctcggcct ggtggatatc 4860

atttggggca tcttcgggcc aagccagtgg gacgctttcc tggtccagat cgagcagctc 4920

attaatcaga ggatcgagga gttcgcgcgg aaccaggcta ttagccgcct cgagggcctg 4980

tcgaacctct accagatcta cgccgagagc ttcagggagt gggaggctga tccgacgaac 5040

cccgccctga gggaggagat gcggattcag ttcaatgaca tgaactccgc tctgaccacg 5100

gctatcccac tcttcgcggt gcagaattac caggtcccac tcctgagcgt ctacgtgcag 5160

gctgcgaacc tccacctgtc tgtgctgcgc gatgtttcag tgttcggcca gacctggggg 5220

ttcgacgctg ctacgattaa ttccaggtac aacgatctga cacggctcat cggcaattac 5280

actgaccatg ccgttcggtg gtacaacacc ggcctcgaga gggtgtgggg gccagactcc 5340

agggattgga ttaggtacaa ccagttccgc agggagctca cactgactgt cctggacatc 5400

gtttccctct tcccaaacta cgatagccgg acctacccta ttcgcacggt gtcccagctg 5460

acaagggaga tctacactaa tccagtcctc gagaacttcg acggctcttt ccgcgggtca 5520

gctcagggca ttgaggggtc catcaggagc cctcacctga tggatatcct caactcaatc 5580

accatctaca cggacgctca ccgcggcgag tactactggt ccgggcatca gatcatggct 5640

tccccagtcg gcttcagcgg gccagagttc accttcccac tgtacggcac gatggggaac 5700

gctgctccac agcagaggat cgttgctcag ctcggccagg gggtgtaccg cacactgtcc 5760

agcactctct accggcgccc gttcaacatc ggcattaaca atcagcagct gagcgtgctc 5820

gacggcacag agttcgccta cgggacttcg tctaacctgc cctcggcggt ctacaggaag 5880

tcgggcaccg ttgactctct cgatgagatc ccgccccaga acaataacgt cccacctcgc 5940

cagggcttct cgcacaggct gtcgcatgtt tctatgttcc ggtcaggctt ctccaactca 6000

tccgtctcca tcattagggc cccgatgttc tcatggatcc accggtccgc ggagttcaat 6060

aacatcattg ctagcgattc gatcacgcag attccagcgg tcaagggcaa tttcctcttc 6120

aacgggagcg ttatctcggg ccctgggttc acaggcgggg acctggtgag gctcaatagc 6180

tcgggcaata acatccagaa caggcggtac attgaggtcc caatccactt cccttctacc 6240

tcaacgcgct acagggtccg ggttcgctac gcgtccgtga caccaattca tctgaatgtc 6300

aactggggca attcttcaat cttctcgaac actgtgcctg ccacagcgac ttctctggac 6360

aatctccagt ccagcgattt cggctacttc gagtctgcta acgccttcac ctcgtctctc 6420

ggcaatatcg tgggggtccg caacttcagc ggcacggctg gcgttattat tgataggttc 6480

gagttcatcc ctgttactgc taccctggag gctgagtaag taggtgagga attctttgag 6540

tattatggca ttggaaaagc cattgttctg cttgtaattt actgtgttct ttcagttttt 6600

gttttcggac atcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tttaacaaaa aaaaaaaaaa 6660

aaaaaaaaaa gtttaattcg attatcctcg agcgaatttc cccgatcgtt caaacatttg 6720

gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt 6780

tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag 6840

atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat 6900

atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagatcgggt 6960

ttagcttgaa ttcattatgt ggtctaggta ggtctatata taatgtcagt ctcagtgggg 7020

atttcatgtc cctgttacca atgcacccat attttggaaa caatgtaaaa agagttttat 7080

ccccataaaa ctctctctac tcccatgaaa cttttatcat ctctctattc atcaatacgg 7140

tgtcacatca gcctatttaa tgcgtttaaa actctgatga aaccccactt agactggcct 7200

cagaaaactt gaaatgttct aaaaaaattc aagcccatgc atgattgaag caaacggtat 7260

agcaacggtg ttaacctggt ctagtgatct cttgtaatcc ttaacggcca cctaccgcag 7320

gtagcaaacg gcgtccccct cctcgatatc tccgcggcgg cctctggctt tttccgcgga 7380

attgcgcggt ggggacggat tccacgagac cgcgacgcaa ccgcctctcg ccgctgggcc 7440

ccacaccgct cggtgccgta gcctcacggg actctttctc cctcctcccc cgttataaat 7500

tggcttcatc ccctcccggc ctcatccatc caaatcccag tccccaatcc cagcccatcg 7560

tcggagaaat tcatcgaagc gaagcgaatc ctcgcgatcc tctcaaggta ctgcgagttt 7620

tcgatccccc tctcgacccc tcgtatgttt gtgttcgtcg tagcgtttga ttaggtatgc 7680

tttccctgtt tgtgttcgtc gtagcgtttg attaggtatg ctttccctgt tcgtgttcat 7740

cgtagtgttt gattaggtcg tgtgaggcga tggcctgcta gcgtccttcg atctgtagtc 7800

gatttgcggg tcgtggtgta gatctgcggg ccgtgatgaa gttatttggt gtgatcgtgc 7860

tcgcctgatt ctgcgggttg gctcgagtag atatgatggt tggaccggtt ggttcgttta 7920

ccgcgctagg gttgggctgg gatgatgttg catgcgccgt tgcgcgtgat cccgcggtag 7980

gacttgcgtt tgattgccag atctcgttac gattatgtga tttggtttgg actttttaga 8040

tctgtagctt ctgcttatgt gccagatgcg cctactgctc atatgcctga tgataatcat 8100

aaatggctgt ggaactatgt atcagctaca ggtgtaggga cttgcgtcta attgtttggt 8160

cctgtactca tgttgcaatt atgcgattta gtttaggttg tttgttccac tcatctaggc 8220

tgtaaaaggg acactgctta gattgctgtt taatcttttt agtagattat attatattgg 8280

taacttatta cccttattac atgccatacg tgacttctgc tcatgcctga tgataatcat 8340

agatcactgt ggaattaatt agttgattgt tgaatcatgt ttcatgtaca taccatggca 8400

caattgctta gttccttaac aaatgcaaat tttactgatc catgtatgat ttgcgtggtt 8460

ctctaatgtg aaatactata gctacttgtt agtaagaatc aggttcgtat gcttaatgct 8520

gtatgtgcct tctgctcatg cctgatgata atcatatatc actggaatta attagttgat 8580

cgtttaatca tatatcaagt acataccatg gcacaatttt tagtcactta acccatgcag 8640

attgaactgg tccctgcatg ttttgctaaa ttgttctatt ctgattagac catatatcat 8700

gtattttttt tttggtaatg gttctcttat tttaaatgct atatagttct ggtacttgtt 8760

agaaagatct gcttcatagt ttagttgcct atccctcgaa ttaggatgct gagcagctga 8820

tcctatagct ttgtttcatg tatcaattct tttgtgttca acagtcagtt tttgttagat 8880

tcattgtaac ttatggtcgc ttactcttct ggtcctcaat gcttgcagct gcaggtcgac 8940

tctagaggat ccatttttac aacaattacc aacaacaaca aacaacaaac aacattacaa 9000

ttacatttac aattaccatg gctcagattc gcagcatggc tcagggcatt cagacactct 9060

cgctcaactc gtccaacctc agcaagactc agaaggggcc gctcgtgtcc aacagcctgt 9120

tcttcggctc gaagaagctc acgcagatca gcgcgaagtc gctgggcgtg ttcaagaagg 9180

acagcgtcct ccgcgtggtc aggaagtcca gcttccggat ctcggcttct gtggctaccg 9240

cggaggctca cggcgcctcg tctcgcccag ctaccgctag gaagtcatcc gggctgagcg 9300

gcacggtccg catccctggc gacaagtcaa tttcccatag gtcattcatg ttcggcgggc 9360

tcgcttccgg cgagacaagg atcactgggc tcctggaggg cgaggacgtg attaacacgg 9420

ggaaggctat gcaggcgatg ggcgctcgca tcaggaagga gggggacaca tggatcattg 9480

atggcgtcgg gaacggcggg ctcctggctc cagaggctcc tctggacttc gggaatgctg 9540

ctacaggctg ccgcctgact atggggctcg tcggcgttta cgacttcgat tcgacattca 9600

tcggcgatgc ctctctcact aagaggccaa tgggccgggt gctgaaccct ctcagggaga 9660

tgggcgtgca ggtcaagtcc gaggacgggg ataggctgcc agttaccctc aggggcccaa 9720

agacaccaac tccaatcacg taccgggtcc cgatggcttc cgctcaggtt aagagcgcgg 9780

tgctcctggc tgggctgaac accccgggca tcaccacggt catcgagccc attatgacac 9840

gcgaccacac tgagaagatg ctccagggct tcggggcgaa tctcaccgtt gagacggacg 9900

ctgatggcgt gcggacaatc cgcctggagg gcagggggaa gctcactggc caggtcatcg 9960

acgtcccagg cgacccgtcc tccaccgctt tcccactggt ggctgctctc ctggtccctg 10020

gctccgacgt tactatcctg aacgtgctca tgaatccgac ccggacgggc ctcattctga 10080

ccctccagga gatgggcgcc gatatcgagg tcatcaaccc aaggctcgct ggcggggagg 10140

acgtcgccga tctgcgggtt cgctcttcaa ccctcaaggg cgttacggtg ccagaggaca 10200

gggctccttc catgatcgat gagtacccaa ttctggctgt cgcggctgcc ttcgctgagg 10260

gggccacggt catgaatggc ctggaggagc tgagggttaa ggagtctgac cggctctcag 10320

cggtggctaa cgggctgaag ctcaatggcg tggactgcga tgagggcgag acctctctgg 10380

ttgtgagggg gcggccggac ggcaaggggc tcggcaacgc tagcggcgcg gctgtggcta 10440

ctcacctcga tcataggatc gccatgagct tcctggtcat gggcctcgtt tcggagaatc 10500

cggtcacagt tgacgatgcc accatgattg cgacgtcctt ccccgagttc atggacctga 10560

tggctgggct gggggcgaag attgagctgt cggataccaa ggctgcgtga gagctcatcg 10620

aattccgaat ttccccgatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc 10680

tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat 10740

aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca 10800

attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc 10860

gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcg ggtttaaact atcagtgttt gacaagtttg 10920

ttagtgttca aaaatctctt gctttagaaa ttaagaaaaa tgaaatattg tcatctgagt 10980

tatcttcctg tcatgaatct attgctagct taaaggattt aaataatgat ttgaatacta 11040

agttagaaaa agcaaatgca actagttcat gtgtagaaca cgtagttatt tgcaatagat 11100

gtaaagatgt taattttgat gaacatgctg ctactattgc taagttaaat aatgatgttg 11160

caagtcttaa tgatcaattt aagacttgca aaaatgatta tgagaaatta aaatttgcta 11220

gggatgccta caccgttggt agacacccct caattaaaaa tgaacttggt tttcgaaagg 11280

aaaccaagaa cttaacaagc caaaggactt ccgatctcaa ggggaaaggg aaggctccta 11340

tggtcagtag ctcacgttcc tcacatgatc aaaa 11374

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cacgcagatt ccagcggtca a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacgaggtga aggcgttagc a 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagttcccgt gcttgaag 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caccatcgtc aaccactac 19

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tctcgctcaa ctcgtccaac ct 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tctggcaccg taacgccctt ga 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgatggttaa tgaggcaaga 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tatagggttt cgctcatgtg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aagattgagc tgtcggatac 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tttgatcatg tgaggaacgt 20

Claims

1.核酸分子，其为：

i)包含SEQ ID NO:1的第381-780位核苷酸和/或第10815-11214位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；

ii)包含SEQ ID NO:1的第381-780位核苷酸和第6239-6338位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；

iii)包含SEQ ID NO:1的第6239-6338位核苷酸和第10815-11214位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；

iv)包含SEQ ID NO:1的第381-780位核苷酸，第6239-6338位核苷酸和第10815-11214位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；或者

v)包含SEQ ID NO:1所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。

2.如权利要求1所述的核酸分子，其包含以下表达盒：

表达抗草铵膦基因的第一表达盒，如SEQ ID NO:1的第748-2288位核苷酸所示序列；

表达抗虫基因的第二表达盒，如SEQ ID NO:1的第2620-6959位核苷酸所示序列；和

表达抗草甘膦基因的第三表达盒，如SEQ ID NO:1的第6968-10892位核苷酸所示序列。

3.如权利要求1所述的核酸分子，其通过将以下表达盒导入玉米的基因组中获得：

表达抗草甘膦基因的第三表达盒，如SEQ ID NO:1的第6968-10892位核苷酸所示序列；

任选地，所述的核酸分子，其存在于玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分中。

4.用于检测玉米转化事件的探针，其包含SEQ ID NO:1的第381-780位核苷酸或第10815-11214位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。

5.用于检测玉米转化事件的引物对，其能够特异性扩增产生包含SEQ ID NO:1的第381-780位核苷酸或第10815-11214位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；

任选地，所述引物对为：

i)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第381-780位核苷酸所示序列的引物对；

ii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第10815-11214位核苷酸所示序列的引物对；

iii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第381-780位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第681-10915位核苷酸所示序列的反向引物；或者

iv)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第681-10915位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第10815-11214位核苷酸所示序列的反向引物；

任选地，所述引物对为SEQ ID No:8和SEQ ID No:9所示的核苷酸序列或其互补序列；或者SEQ ID No:10和SEQ ID No:11所示的核苷酸序列或其互补序列。

6.用于检测玉米转化事件的试剂盒或微阵列，其包含权利要求4所述的探针和/或权利要求5所述的引物对。

7.检测玉米转化事件的方法，其包括利用以下来检测待测样品中是否存在所述转化事件：

-权利要求4所述的探针；

-权利要求5所述的引物对；

-权利要求4所述的探针和权利要求5所述的引物对；或者

-权利要求6所述的试剂盒或微阵列。

8.对玉米进行育种的方法，所述方法包括以下步骤：

1)获得包含权利要求1所述的核酸分子的玉米；

2)将步骤1)所获得的玉米通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；以及任选地，

3)对步骤2)所获得的后代植物进行除草剂草铵膦和草甘膦以及螟虫和/或粘虫的抗性鉴定，并利用权利要求7所述的方法来检测其中是否存在所述转化事件。

9.由权利要求8的方法获得的玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分制成的制品，包括食品、饲料或工业原料。

10.控制鳞翅目害虫群体的方法，包括使所述鳞翅目害虫群体接触由权利要求8的方法获得的玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；优选地，其中所述鳞翅目害虫为亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)或东方粘虫(Mythimna separate(Walker))。

11.杀死鳞翅目害虫的方法，包括使所述鳞翅目害虫接触杀虫有效量的由权利要求8的方法获得的玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；优选地，其中所述鳞翅目害虫为亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)或东方粘虫(Mythimna separate(Walker))。

12.减轻鳞翅目害虫对玉米的伤害的方法，包括将以下表达盒导入玉米的基因组中：

优选地，其中所述鳞翅目害虫为亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)或东方粘虫(Mythimna separate(Walker))。