CN112795571B

CN112795571B - 抗除草剂玉米转化体及其创制方法

Info

Publication number: CN112795571B
Application number: CN201911111428.2A
Authority: CN
Inventors: 韩宇; 韩志国; 杨桥; 左丹; 黄炜; 安吉翠; 田裴秀子; 杨亚洲; 周俊青; 朱小翌; 叶荣建; 章旺根
Original assignee: China National Seed Group Co Ltd
Current assignee: China National Seed Group Co Ltd
Priority date: 2019-11-14
Filing date: 2019-11-14
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2039-11-14
Also published as: CN112795571A

Abstract

本申请提供了抗除草剂玉米转化体，并提供了相关的创制方法、检测方法和应用。

Description

抗除草剂玉米转化体及其创制方法

技术领域

本申请涉及植物生物技术领域，具体涉及一种抗除草剂草铵膦和草甘膦玉米转化体的创制方法、检测方法和应用。

背景技术

玉米是重要的饲料和工业原料作物，其作为中国种植面积最大的农作物，长期自给有余，但自2010年以来，进口量逐年增加。

我国常年受杂草严重危害的农作物面积高达12亿亩，其中玉米1.9亿亩。田间杂草与作物竞争水、肥、光能及生长空间，同时又是危害作物的病菌及害虫的中间寄主，是作物增产的重要生物限制因子之一。当前，广泛采用的选择性除草剂施用量大，且残留期长、容易影响下茬作物的正常生长。草铵膦等灭生性除草剂具有高效、低毒、易降解、无残留等特点，但它们除草没有选择性，不能直接用于作物的生长期。植物转基因育种技术具有目的性强、周期短、效率高，能够实现不同物种间优良基因的转移等优点。自1996年第一个转基因作物商业化以来，这项技术已经为全球农业带来了巨大的改变。

为了延缓抗虫玉米对目标昆虫的抗性，通常的做法是按照一定的比例混合抗虫玉米和抗除草剂玉米。抗除草剂玉米作为庇护所，从而减少目标昆虫的选择压，延缓产生抗性。

发明内容

第一方面，本申请提供了核酸分子，其包含：

i)SEQ ID NO:1的第367-634位核苷酸和/或第5904-6232位核苷酸所示的序列，或其片段或其变体或其互补序列；

ii)SEQ ID NO:1的第1-634位核苷酸和/或第5904-6232位核苷酸所示的序列，或其片段或其变体或其互补序列；

iii)SEQ ID NO:1的第367-634位核苷酸和/或第5904-6763位核苷酸所示的序列，或其片段或其变体或其互补序列；

iv)SEQ ID NO:1的第1-634位核苷酸和/或第5904-6763位核苷酸所示的序列，或其片段或其变体或其互补序列；或

v)SEQ ID NO:1的第367-6232位核苷酸所示的序列，或其片段或其变体或其互补序列。

在一实施方案中，本申请所提供的核酸分子包含SEQ ID NO:1所示的序列，或其片段或其变体或其互补序列。

在另一实施方案中，本申请所提供的核酸分子，其包含以下表达盒：

表达抗草铵膦基因的第一表达盒，其包含SEQ ID NO:1的第405-1945位核苷酸所示的序列；

和表达抗草甘膦基因的第二表达盒，其包含SEQ ID NO:1的第2266-6203位核苷酸所示的序列。

在另一实施方案中，本申请所提供的核酸分子，其通过将以下表达盒导入玉米的基因组中获得：

本申请所提供的核酸分子存在于玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分中。

第二方面，本申请提供了用于检测玉米转化体的探针，其包含SEQ ID NO:1的第1-634位核苷酸和/或第5904-6763位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。

第三方面，本申请还提供了用于检测玉米转化体的引物对，其能够特异性扩增产生包含SEQ ID NO:1的第1-634位核苷酸或第5904-6763位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。

在一实施方案中，所述引物对为：

i)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第1-634位核苷酸所示序列的引物对；

ii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第5904-6763位核苷酸所示序列的引物对；

iii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第1-634位核苷酸所示的序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第368-6231位核苷酸所示序列的反向引物；

iv)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第368-6231位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第5904-6763位核苷酸所示的序列的反向引物；或者

v)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第1-634位核苷酸所示序列的引物对，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第5904-6763位核苷酸所示序列的引物对。

在一实施方案中，本申请所提供的引物对为SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列或其互补序列；和/或SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列或其互补序列。

第四方面，本申请还提供了用于检测玉米转化体的试剂盒或微阵列，其包含第二方面所述的探针和/或第三方面所述的引物对。

第五方面，本申请提供了检测玉米转化体的方法，其包括利用以下来检测待测样品中是否存在所述转化体：第二方面所述的探针；第三方面所述的引物对；第二方面所述的探针和第三方面所述的引物对；或者第四方面所述的试剂盒或微阵列。

第六方面，本申请还提供了对玉米进行育种的方法，所述方法包括以下步骤：1)获得包含第一方面所述的核酸分子的玉米；2)将步骤1)所获得的玉米通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到后代植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；以及任选地，3)对步骤2)所获得的后代植物进行抗除草剂草铵膦和草甘膦以及抗螟虫鉴定，并利用上述的方法来检测其中是否存在所述转化体。

第七方面，本申请还提供了由上述的方法获得的玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分等，以及由这些玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分等制成的制品，包括食品、饲料或工业原料等。

附图说明

图1为载体pZHZH15032的结构示意图，其中：

T-Border(right) T-DNA右边界序列

nos terminator 胭脂碱合酶NOS终止子

cp4 epsps 编码EPSPS耐草甘膦除草剂的基因

Ωsequence 源自烟草蚀纹病毒基因表达增强元件

ubiquitin promoter 来自玉米的泛素基因启动子

CaMV 35S promoter 花椰菜花叶病毒35S启动子

bar 抗草铵膦基因序列

CaMV 35S terminator 花椰菜花叶病毒35S终止子

T-Border(left) T-DNA左边界序列

Kanamycin(R) 卡那霉素抗性序列

pBR322 ori pBR322起始区序列

pBR322 bom pBR322骨架区序列

pVS1 rep pVS1复制子

pVS1 sta pVS1转录起始区

bp 碱基对

图2为草铵膦除草剂“保试达”处理一周后的植株照片，其中：

A为非转基因阴性对照野生型祥249，不喷施草铵膦，植株生长正常，无任何受害症状；

B为非转基因阴性对照野生型祥249，喷施250毫升/亩“保试达”，一周后叶片干枯、失绿、枯斑、生长停滞，表现明显药害症状；

C为ZZM032 T₃世代，喷施250毫升/亩“保试达”，一周后植株生长正常，无任何受害症状；

D为ZZM032 T₄世代，喷施250毫升/亩“保试达”，一周后植株生长正常，无任何受害症状。

图3为喷施草甘膦除草剂“农达”处理一周后的植株照片，其中：

A为非转基因阴性对照野生型祥249，不喷施“农达”，植株生长正常，无任何受害症状；

B为非转基因阴性对照野生型祥249，喷施200毫升/亩“农达”，一周后叶片干枯、失绿、枯斑、生长停滞，表现明显药害症状；

C为ZZM032 T₃世代，喷施200毫升/亩“农达”，一周后植株生长正常，无任何受害症状；

D为ZZM032 T₄世代，喷施200毫升/亩“农达”，一周后植株生长正常，无任何受害症状。

图4A和图4B为ZZM032 Southern杂交拷贝数检测结果，其中:

图4A示出了转化体ZZM032玉米基因组DNA分别由HindIII、EcoRI和KpnI酶切与bar特异探针分子杂交结果。三种酶切条件下分别显示一条阳性带，经HindIII酶切得到的条带为3.4kb，经EcoRI酶切得到的条带为9.2kb，经KpnI酶切得到的条带为1.5kb，均符合预期，表明外源基因bar单拷贝插入，该转化体为单拷贝转化体。

图4B示出了转化体ZZM032玉米基因组DNA分别由HindIII、EcoRI和KpnI+AflIII酶切与cp4 epsps特异探针分子杂交结果。三种酶切条件下分别显示一条阳性带，经HindIII酶切得到的条带为9.2kb，经EcoRI酶切得到的条带为6.4kb，经KpnI+AflIII酶切得到的条带为3.8kb，均符合预期，表明外源基因cp4 epsps单拷贝插入，该转化体为单拷贝转化体。

图5为转化体ZZM032特异性PCR检测结果，其中：

A为左边界检测结果；

B为右边界检测结果；

其中泳道1-4分别为：无菌水、祥249DNA、ZZM032 T₃ DNA和ZZM032 T₄ DNA。

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。

本技术领域人员公知，外源基因在植物体内的表达具有位置效应，即受到插入染色体位置的影响，这种影响可能是由于染色体结构或整合位点附近的转录调节元件造成的。因此，通常需要生产数百个不同的转化体，并从这些事件中筛选出外源基因表达水平及模式符合预期要求的优异转化体，以达到商业化生产应用的目的。

优异的转化体可通过常规育种方法即有性杂交的方式将外源基因转育到其它遗传背景的种质中，其后代保持了原始转化体的转基因表达特性。本申请涉及通过从诸多转化体中筛选出的优异转化体ZZM032。

在本申请中，“转化体ZZM032”是指以玉米自交系祥249为受体经过转基因，得到在特定基因组序列之间插入外源基因插入物(T-DNA插入物)的玉米植株，其中外源基因插入物包含以下两个基因：抗草铵膦基因和抗草甘膦基因。本申请所获得转化体ZZM032，所插入的外源基因位于玉米基因组的非功能位点，不影响植物自身其他基因的表达，在使转基因玉米植物获得抗除草剂特性的同时，保持了其良好的农艺性状。

在具体实例中，转基因后所得到的T-DNA插入物具有SEQ ID NO:1的第368-6224位核苷酸所示序列，以及随机插入7bp核苷酸，如SEQ ID NO:1的第6225-6231位核苷酸所示序列。转化体ZZM032可以指这一转基因过程，也可以指由这一过程所得到的基因组内的T-DNA插入物，或T-DNA插入物与侧翼序列的组合，或可以指由这一转基因过程得到的玉米植株。转化体ZZM032还可以指由上述植物进行无性繁殖、有性繁殖、减倍或加倍繁殖或以上的组合而得到的后代植物。

在其他实施方案中，该事件也适用于同样的外源基因(SEQ ID NO：1的第368-6224位核苷酸所示的序列)转化其他植物受体品种，从而将T-DNA插入物插入到同样基因组位置而获得的植物。适用的植物包括单子叶植物，如水稻、小麦、燕麦、大麦、青稞、粟、高粱和甘蔗等。

在本申请中，获得了以SEQ ID NO:1的第1-367位核苷酸为左侧侧翼序列和SEQ IDNO:1的第6232-6763位核苷酸为右侧侧翼序列的插入物(第368-6231位核苷酸)。侧翼序列并非仅限于SEQ ID NO:1的第1-367位核苷酸和第6232-6763位核苷酸，因为列出的侧翼序列仅是用于表示T-DNA插入物在基因组中的位置，即T-DNA插入物左侧插入点位于第9号染色体133,993,669bp；T-DNA插入物右侧插入点位于第9号染色体133,993,710bp。因此本申请的侧翼序列可以根据基因组序列而向两侧延伸，即左侧侧翼序列可向第9号染色体133,993,669bp上游延伸，右侧侧翼序列可向第9号染色体133,993,710bp下游延伸。

由于转化体ZZM032产生向基因组中特定位点插入的T-DNA插入物，因此其插入位点是特异性的，可以用于检测生物样品中是否包含转化体ZZM032。在具体实施方案中，包含转化体ZZM032的T-DNA插入物与侧翼序列的接合位点的任何序列，均可用于检测本申请的转化体ZZM032，包括但不限于包含上游插入位点(左侧翼序列与T-DNA插入物的接合位点)和/或下游插入位点(右侧翼序列与T-DNA插入物的接合位点)的以下序列或其片段或其变体或其互补序列中的一种或多种：i)包含SEQ ID NO:1的第367-634位核苷酸所示序列；ii)包含SEQ ID NO:1的第5904-6232位核苷酸所示的序列；iii)包含SEQ ID NO:1的第1-634位核苷酸所示的序列；iv)包含SEQ ID NO:1的第5904-6763位核苷酸所示的序列；v)包含SEQID NO:1所示的序列。

在具体实例中，可用于检测本申请的转化体ZZM032的序列为包含上游插入位点的序列或其片段或其变体或其互补序列，如包含SEQ ID NO:1的第1-634位核苷酸所示序列，或者为包含下游插入位点的序列，例如，包含SEQ ID NO:1的第5904-6763位核苷酸所示序列，或者为包含上游插入位点的序列与包含下游插入位点的序列的组合。

在另一实例中，可用于检测本申请的转化体ZZM032的序列为包含上游插入位点的序列或其片段或其变体或其互补序列与包含T-DNA插入物的序列或其片段或其变体或其互补序列的组合，例如，包含SEQ ID NO:1的第1-634位核苷酸所示序列，与包含SEQ ID NO:1的第368-6231位核苷酸所示序列的组合。

在另一实例中，可用于检测本申请的转化体ZZM032的序列为包含下游插入位点的序列或其片段或其变体或其互补序列与包含T-DNA插入物的序列或其片段或其变体或其互补序列的组合，例如，包含SEQ ID NO:1的第5904-6763位核苷酸所示序列，与包含SEQ IDNO:1的第368-6231位核苷酸所示序列的组合。

在另一实例中，可用于检测本申请的转化体ZZM032的序列为包含SEQ ID NO:1所示的序列或其片段或其变体或其互补序列。

因此，能够特异性检测转化体ZZM032的T-DNA插入物与侧翼序列的接合位点的引物对、探针、以及引物对和探针的组合均可用于检测本申请的转化体ZZM032。

如本文所用，“核苷酸序列”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，核苷酸序列以5’至3’方向从左向右书写。

在一些实施方案中，本申请还涉及核酸序列的片段，其是指完整部分中的不完整的更小片段的部分。例如，SEQ ID NO：1的片段包括SEQ ID NO：1的完整序列的至少约10个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、或至少约50个核苷酸的序列或更多。

在一些实施方案中，可以对本申请的核酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。在某些实施方案中，可以依照单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请还涉及核酸序列的变体。一般来讲，特定核酸片段的变体将与该特定核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互补序列。这样的变体序列包括一个或多个核酸残基的添加、缺失或替换，从而可以导致相应的氨基酸残基的添加、移除或替换。通过本领域内已知的序列比对程序包括杂交技术确定序列同一性。实施方案的核苷酸序列变体与本申请的序列的差异可以少至1-15个核苷酸、少至1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4、3、2或甚至1个核苷酸。

如本文所用，“探针”是附加了常规可检测的标记或报告分子例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶的分离的多核苷酸，其与靶多核苷酸的链是互补的。

在具体实施方案中，本申请所提供的用于检测转化体ZZM032的DNA探针，包括包含SEQ ID NO：1的足够长度的连续核苷酸的序列或其完全互补序列，该DNA探针在严格杂交条件下与包含上游插入位点或下游插入位点的核苷酸序列杂交并且在严格杂交条件下不与不含上游插入位点或下游插入位点的核苷酸序列杂交。

在具体实例中，本申请所提供的探针包含SEQ ID NO:1的第1-634位核苷酸或第5904-6763位核苷酸所示的序列，或其片段或其变体或其互补序列。如本文所用，“引物”是分离的多核苷酸，其通过核酸杂交形成引物和靶DNA链之间的杂交体而与互补靶DNA链退火，然后凭借例如DNA聚合酶沿着靶DNA链伸展。引物对涉及其靶多核苷酸扩增用途，例如通过聚合酶链反应(PCR)或其他常规核酸扩增方法。

在具体实施方案中，本申请所提供的用于检测转化体ZZM032的引物对包括第一DNA分子以及不同于第一DNA分子的第二DNA分子，其中所述第一DNA分子和第二DNA分子各自包含SEQ ID NO：1的足够长度的连续核苷酸的核苷酸序列或其完全互补序列，且其中所述第一DNA分子存在于SEQ ID NO：1的T-DNA插入物中和所述第二DNA分子存在于SEQ IDNO：1的侧翼序列中，当与来自转化体ZZM032的DNA在扩增反应中共同使用时，该DNA引物产生用于检测样品中转化体ZZM032 DNA的扩增子，且其中所述扩增子包含SEQ ID NO:1的第1-634位核苷酸或第5904-6763位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。

在具体实施方案中，本申请所提供的引物对为特异性识别包含SEQ ID NO:1的第1-634位核苷酸所示序列的引物对。

在具体实施方案中，本申请所提供的引物对为特异性识别包含SEQ ID NO:1的第5904-6763位核苷酸所示序列的引物对。

在具体实施方案中，本申请所提供的引物对为：i)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第1-634位核苷酸所示序列的引物对；和ii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第5904-6763位核苷酸所示序列的引物对；或者，所述引物对包含：特异性识别包含SEQ ID NO:1的第1-634位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第5904-6763位核苷酸所示序列的反向引物。

在另一具体实施方案中，本申请所提供的引物对为：i)特异性识别包含SEQ IDNO:1的第1-634位核苷酸所示序列的引物对；和ii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第368-6231位核苷酸所示序列的引物对；或者，所述引物对包含：特异性识别包含SEQ ID NO:1的第1-634位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第368-6231位核苷酸所示序列的反向引物。

在另一具体实施方案中，本申请所提供的引物对为：i)特异性识别包含SEQ IDNO:1的第368-6231位核苷酸所示序列的引物对；和ii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第5904-6763位核苷酸所示序列的引物对；或者，所述引物对包含：特异性识别包含SEQ IDNO:1的第368-6231位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第5904-6763位核苷酸所示序列的反向引物。

在另一具体实施方案中，本申请所提供的引物对为：i)特异性识别包含SEQ IDNO:1的第1-634位核苷酸所示序列的引物对，ii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第368-6231位核苷酸所示序列的引物对，和iii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第5904-6763位核苷酸所示序列的引物对。

在另一具体实施方案中，本申请所提供的引物对为特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列的引物对。

在具体实例中，所述引物对为SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列或其互补序列；或者SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列或其互补序列。

设计和使用引物和探针的方法是本领域熟知的，例如在Joseph Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press(2001)和Current Protocols in Molecular Biology，Wiley-Blackwell中描述。

如本文所用，“试剂盒”或“微阵列”是指用于生物样品中玉米转化体ZZM032的鉴定和/或检测目的的试剂组或芯片。为质量控制(例如种子批次的纯度)、植物材料中或包含植物材料或来源于植物材料的材料例如但不限于食品或饲料产品中转化体ZZM032的检测的目的，可以使用试剂盒或芯片，并且其组分可以具体地调整。

在具体实施方案中，本申请所提供的试剂盒或探针包括本申请所提供的任一种探针或任一种引物对。在另一具体实施方案中，本申请所提供的试剂盒或探针包括本申请所提供的任一种探针或任一种引物对的组合。

此外，本申请还提供了转基因玉米植物、后代、种子、植物细胞或植物部分及其制品，包括但不限于食品、饲料或工业原料。这些植物、后代、种子、植物细胞、植物部分及其制品中均包含可检测的本申请所提供的T-DNA插入物与侧翼序列的接合位点的核酸分子序列。

进一步地，本申请还提供了对玉米进行育种的方法，包括以下步骤：1)获得包含本申请所提供的T-DNA插入物与侧翼序列的接合位点的核酸分子序列的玉米；2)将步骤1)所获得的玉米通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到后代植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；以及任选地步骤3)，对步骤2)所获得的玉米植物进行抗除草剂草铵膦和草甘膦以及抗螟虫鉴定，并利用本申请所提供的探针、引物对、试剂盒或阵列来检测其中是否存在转化体ZZM032。

此外，本申请提供了在田间控制杂草的方法。

在具体实施方案中，本申请所提供的在田间控制杂草的方法，包括在田间种植包含转化体ZZM032的玉米植物，以及在所述田间应用有效剂量的能够在不伤害所述包含转化体ZZM032的转基因玉米植物的情况下控制杂草的草甘膦和草铵膦除草剂。

以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。在不背离本申请精神和实质的情况下，对本申请方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。

若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件进行。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例所涉及的玉米品种材料均由中国种子集团有限公司提供，其中玉米自交系祥249为玉米品种长城799的母本，是以国外引进的玉米种质资源为材料，用系谱法自交分离和严格选择，经过10个世代，于1996年选育而成。

实施例1.载体构建

1.抗除草剂外源基因的合成

bar基因序列参见Genebank登录号为X17220.1所示的序列，以人工合的方式合成如SEQ ID NO:1第613至1164位碱基所示的抗草铵膦除草剂基因。

委托南京金斯瑞生物科技有限公司按水稻密码子偏好性优化并合成epsps基因，如SEQ ID NO:1第4339至5931位碱基所示，并在5’端添加一段65个核苷酸的表达增强元件Ω序列，如SEQ ID NO:1第4274至4338位碱基所示。

2.载体构建

将已有的含有nos终止子(5’端有XhoI酶切位点，3’端有PmeI酶切位点)的中间载体pZZ001142，使用限制酶XhoI进行单酶切，回收获得骨架载体片段，用T4 DNA聚合酶补平产生的粘末端。

将已有的含有泛素基因启动子-epsps-CaMV 35S终止子片段(泛素基因启动子5’端有PmeI和HindIII酶切位点，epsps 3’端有SacI酶切位点)的中间载体pZZ00002，使用限制酶PmeI和SacI进行双酶切，回收获得泛素基因启动子-epsps片段，用T4 DNA聚合酶补平产生的粘末端。

用T4 DNA连接酶连接含有nos终止子的骨架载体片段和泛素基因启动子-epsps片段，获得含有泛素基因启动子-epsps-nos终止子片段的载体，命名为pZZ001199。

将已有的含有CaMV 35S启动子-bar-CaMV 35S终止子和泛素基因启动子-gfp-nos终止子片段(泛素基因启动子5’端有HindIII酶切位点，nos终止子3’端有PmeI酶切位点)的中间载体pZZ00015，使用限制酶HindIII和PmeI进行双酶切，切除泛素基因启动子-gfp-nos终止子片段，回收获得带有CaMV 35S启动子-bar-CaMV 35S终止子的骨架载体片段。

使用限制酶HindIII和PmeI处理pZZ001199，回收获得泛素基因启动子-epsps-nos终止子片段。T4 DNA连接酶连接泛素基因启动子-epsps-nos终止子片段和含有CaMV 35S启动子-bar-CaMV 35S终止子骨架载体片段，获得转化载体，命名为pZHZH15032。其物理图谱见图1。

实施例2转基因玉米的获得

使用农杆菌介导的遗传转化方法获得转基因玉米。

将载体pZHZH15032的质粒DNA通过电击法转化到农杆菌EHA105中，鉴定后备用。

然后利用鉴定合适的农杆菌EHA105转化玉米。简言之，玉米自交系祥249自交后取长度1.5mm左右的幼胚用于转化。收集约200个果穗的幼胚为一批次，置于EP管中把悬浮液吸出，加入含有200μM乙酰丁香酮的农杆菌菌液，共培养5分钟，然后把幼胚转移到共培养基上，暗培养三天。将暗培养后的幼胚放置在休息培养基上，待有愈伤组织长出后，放置含5mg/L双丙氨膦的选择培养基上，筛选培养，每两周继代一次。当抗性愈伤长出时，挑选出状态良好的胚性愈伤转到分化培养基上，培养条件为26℃，每日3000Lux光强，光照16小时，两周后出现再生小苗。将再生的小苗移到生根培养基中，待小苗长出二级次根后，移栽于混有营养土和蛭石(1∶3)的小盆中(具体方法和培养基请参见本申请人在中国发明专利申请CN104745622A中公开的玉米骨干自交系的高效转基因方法)。

按照下述步骤对获得的转化苗进行转基因阳性检测，挑选出转基因阳性植株。

(1)DNA抽提

采用天根生化技术公司的DNAsecure Plant Kit新型植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)抽提玉米基因组DNA。

(2)PCR

将下列试剂从-20℃冰箱中取出解冻：10倍PCR缓冲液(Takara)、脱氧核苷酸混合物(10mM，Sigma)、正向引物SEQ ID NO:2：5’-CAGCACAGGTTAAGTCTG-3’、反向引物SEQ IDNO:3：5’-GTCTGTCTCAACGGTAAG-3’、以及玉米叶片DNA模板。所有试剂解冻完毕后，离心数秒，置于冰上待用。配制PCR反应体系的混合液，混匀，离心数秒。PCR反应体系(20μL)：2μL10倍PCR缓冲液(Takara)，0.5μL脱氧核苷酸混合物(10mM，Sigma)，0.8μL正反向引物混合物(5μM)，0.2μL r-Taq(5U，Takara)，1μL玉米叶片DNA模板，其余为dd H₂O。将混合液分装至200μL规格的PCR管中，再加入1μL模板DNA，对于不同样品分别做好标记以便区分。将PCR反应管放入Thermo 9700型PCR扩增仪，选择预设PCR扩增程序，开始运行反应。PCR反应程序为：94℃预变性2分钟；30个循环：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒；最后72℃延伸5分钟。

(3)琼脂糖凝胶电泳检测

PCR结束后，取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。配制1.5％的琼脂糖凝胶，150V电泳25分钟后在溴化乙啶(EB)中染色10分钟，在紫外凝胶成像系统中拍照。

(4)结果的判断

能扩增出140bp大小条带的材料为转基因阳性植株，不能扩增出该条带大小的材料为转基因阴性植株。

将上述转基因阳性植株移栽至大花盆中，即为T₀代植株。

实施例3转基因玉米的抗性鉴定

T₀代植株自交，所得种子为T₁代种子。将T₁代种子播种于温室大棚中，得到T₁代植株。重复上述过程，直至获得T₄代种子。

对T₁至T₃代植株进行转基因阳性检测、抗除草剂分析鉴定、农艺性状分析。从每代植株中挑选出转基因阳性，具有抗除草剂特性，并且农艺性状表现优异的植株进入下一代筛选。

1.阳性检测

检测方法及步骤同实施例2所述。

2.抗除草剂性状鉴定

将经步骤1检测的阳性植株自交种子播种于温室大棚中，对6-8叶片期植株进行除草剂抗性鉴定，去除不耐受除草剂的植株。

(1)草铵膦除草剂耐受鉴定

喷施所用草铵膦除草剂“保试达”(Basta)为拜耳作物科学(中国)有限公司生产，有效成分为18％草铵膦可溶液剂。该除草剂的推荐用量为200-300毫升/亩，本申请采用推荐浓度中量250毫升/亩的用药量进行喷施。一周后观察并记录除草剂耐性表现。对草铵膦具有耐性的玉米植株生长正常，无任何受害症状；对草铵膦敏感的玉米植株表现出明显的药害症状，包括生长停滞、失绿、枯斑、畸形等，直至全株死亡。

在T₁、T₂和T₃代植株群体中，根据观测到草铵膦抗性的实际分离比与根据孟德尔遗传定律计算的预期分离比(表1)，按以下公式进行Chi平方检验：χ²＝Σ[(|o–e|–0.5)²/e]；其中，“o”为阳性植株数或阴性植株数观测值，“e”为阳性株数或阴性株数期望值，“0.5”为自由度为1时Yates分析校正因子。

表1转化体ZZM032各世代预期分离比

*：在单一位点单拷贝插入的情况下，按照孟德尔遗传定律计算的预期分离比。

表2中，“观测值”为喷施草铵膦后观测到的实际阳性植株数和阴性植株数；“期望值”为根据孟德尔遗传定律按照表1计算的理论转基因阳性植株数与转基因阴性植株数；“χ²”为根据Chi平方检验公式计算得到的Chi平方值；“χ² _0.05,1”为在显著性水平α＝0.05，自由度为1时，查χ²界值表得到的值；“概率”为χ²与χ² _0.05,1两者比较后的结果，当χ²<χ² _0.05,1时，则P>0.05，说明观测值与期望值之间无显著性差异。表2中χ²检验分析表明，在T₁-T₃调查世代中，观察到的遗传分离比和预期遗传分离比之间没有显著性的差异(P>0.05)，说明ZZM032在不同世代之间按照孟德尔遗传规律稳定遗传，且在T₂代达到纯合。

表2转化体ZZM032各世代分离分析-χ²检验

(2)草甘膦除草剂耐受鉴定

喷施所用草甘膦除草剂“农达”(Roundup)为孟山都公司生产，有效成分为41％异丙胺盐。该除草剂玉米田推荐用药量为150-250毫升/亩，本申请采用推荐浓度中量200毫升/亩的用药量进行喷施，一周后观察并记录除草剂耐性表现。对草甘膦具有耐性的玉米植株生长正常，无任何受害症状；对草甘膦敏感的玉米植株表现出明显的药害症状，包括生长抑制、褪绿、枯斑、畸形等，直至全株死亡。

3.玉米转化体ZZM032

经过上述过程，最终筛选出玉米转化体ZZM032。

结果如图2和图3所示。图2为草铵膦除草剂“保试达”一周后植株照片，其中：A为非转基因阴性对照野生型祥249，不喷施草铵膦，植株生长正常，无任何受害症状；B为非转基因阴性对照野生型祥249，喷施250毫升/亩“保试达”，一周后叶片干枯、失绿、枯斑、生长停滞，表现明显药害症状；C为ZZM032 T₃世代，喷施250毫升/亩“保试达”，一周后植株生长正常，无任何受害症状；D为ZZM032T₄世代，喷施250毫升/亩“保试达”，一周后植株生长正常，无任何受害症状。图3为喷施草甘膦除草剂“农达”一周后植株照片，其中：A为非转基因阴性对照野生型祥249，不喷施“农达”，植株生长正常，无任何受害症状；B为非转基因阴性对照野生型祥249，喷施200毫升/亩“农达”，一周后叶片干枯、失绿、枯斑、生长停滞，表现明显药害症状；C为ZZM032 T₃世代，喷施200毫升/亩“农达”，一周后植株生长正常，无任何受害症状；D为ZZM032 T₄世代，喷施200毫升/亩“农达”，一周后植株生长正常，无任何受害症状。

实施例4转化体ZZM032 Southern印迹鉴定

1.探针的制备

(1)bar探针的制备

以pZHZH15032质粒DNA为模板制备探针。以csp73(CAGTTCCCGTGCTTGAAG，SEQ IDNO:4)、csp74(CACCATCGTCAACCACTAC，SEQ ID NO:5)为引物，采用罗氏公司PCR地高辛探针合成试剂盒(货号：11636090910)合成用于检测bar的探针，探针大小为408bp(探针序列同SEQ ID NO.1第692-1099位所示核苷酸序列)。扩增体系包含：DNA模板5μL(50pg)，引物各0.5μL，PCR DIG混合物5μL，DNA聚合酶0.75μL，PCR缓冲液(10倍)5μL，ddH₂O 33.25μL。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；35个循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒；最后72℃延伸7分钟。使用1％琼脂糖凝胶检测标记扩增效果。将特异性扩增的扩增产物，即用于检测bar的探针，于-20℃保存。

(2)cp4 epsps探针的制备

使用如(1)所述的相同方法，利用引物对csp91和csp92(序列分别为TCAATAGCAGCAACCTCTC,SEQ ID NO:6和ATAGTCCTCACGCCATCA,SEQ ID NO:7)制备了cp4epsps基因的特异探针，其长度为856bp(探针序列同SEQ ID NO：1第4385-5240位所示的核苷酸序列)。

2.DNA提取

提取转基因玉米的叶片基因组总DNA，获得的DNA沉淀干燥后溶于无离子水，测定浓度后备用。

3.酶切、电泳、转膜、显影

当使用bar探针时，玉米基因组DNA需用HindIII、EcoRI和KpnI分别进行单酶切。

当使用cp4 epsps探针时，玉米基因组DNA需用HindIII、EcoRI和KpnI+AflIII组合分别进行酶切。

使用200μL酶切体系，其中含有20μg玉米基因组DNA、20μL限制性内切酶、20μL 10倍缓冲液，加ddH₂O补齐至200μL。酶切16h后取10μL进行电泳检测，检测酶切效果是否彻底。

酶切产物加ddH₂O补充至400μL，加入1/10体积的3M醋酸钠溶液(pH5.2)，加入4μL的TaKaRa Dr.GenTLE Precipitation Carrier，加入2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀，12,000rpm 4℃离心15分钟。将沉淀用50μLddH₂O溶解，加10μL 6倍上样缓冲液。

将DNA通过0.8％凝胶，20V电泳16h。切掉多余泳道及点样孔，剩余凝胶用变性溶液处理2次，每次15分钟，在摇床上轻摇。再用中和缓冲液处理2次，每次15分钟，在摇床上轻摇。超纯水清洗一次。20倍SSC处理10分钟中，用Whatman系统进行转膜4小时以上。

转膜结束后，将膜放置在用10倍SSC浸润的Whatman 3MM滤纸上，紫外交联仪交联3-5分钟。用ddH₂O简单洗膜，于空气中干燥。杂交及显影过程均按照罗氏地高辛检测试剂盒I(货号：11745832910)或者罗氏地高辛检测试剂盒II(货号：11585614910)的操作手册进行。

4.结果分析

图4A示出了转化体ZZM032玉米基因组DNA分别由HindIII、EcoRI和KpnI酶切与bar特异探针分子杂交结果。三种酶切条件下分别显示一条阳性带，经HindIII酶切得到的条带为3.4kb，经EcoRI酶切得到的条带为9.2kb，经KpnI酶切得到的条带为1.5kb均符合预期，表明外源基因bar单拷贝插入，该转化体为单拷贝转化体。

图4B示出了转化体ZZM032玉米基因组DNA分别由HindIII、EcoRI和KpnI+AflIII酶切与cp4 epsps特异探针分子杂交结果。三种酶切条件下分别显示一条阳性带，经HindIII酶切得到的条带为9.2kb，经EcoRI酶切得到的条带为6.4kb，经KpnI+AflIII酶切得到的条带为3.8kb均符合预期，表明外源基因cp4 epsps单拷贝插入，该转化体为单拷贝转化体。

实施例5转化体ZZM032序列分析

在转基因操作中，通常使用相同的转化载体进行大量的遗传转化，从获得的诸多转化体中筛选极少数优异的转化体。因此，对插入的外源序列中的载体、表达元件、外源基因等的检测，仅能证明检测样品含有该转基因成份，无法区分不同的转化体。而不同的转化体，是以其插入位点的侧翼序列与插入的外源序列的组合为特征。为此，本实施例分离并鉴定了玉米转化体的侧翼序列。

1.左侧翼序列分析

取待测转化体植株叶片提取总DNA(T₂代或者T₃代生长健壮的转基因植株)，利用接头PCR(Adaptor-PCR)方法进行插入玉米基因组的外源基因侧翼序列扩增、克隆、测序，得到序列结果。

具体步骤如下：

(1)人工合成接头PCR所需引物，稀释后备用；引物序列如表3所示。

表3引物序列

(2)制备高质量玉米基因组DNA备用，稀释后备用；

(3)用ddH₂O将接头引物AD-L和AD-S分别稀释到100μmol/L，等体积混合，94℃水浴变性4min，自然冷却至室温后即为50μmol/L的接头；

(4)酶切玉米基因组DNA，酶切体系如下：

37℃酶切3h。

(5)连接接头，连接体系如下：

16℃过夜连接。

(6)以步骤(5)中的基因组DNA酶切-接头连接产物作为第一轮PCR反应的模板，反应体系如下：

(7)反应程序为：94℃，5min；(94℃，30sec；72℃，3min)×7个循环；(94℃，30sec；67℃，3min)×32个循环；67℃，7min；25℃，10min。

(8)以第一轮PCR产物(混合液稀释40倍)为模板进行第二轮PCR扩增，反应体系如下：

(9)反应程序为：94℃，5min；(94℃，30sec；72℃，3min)×5个循环；(94℃，30sec；67℃，3min)×20个循环；67℃，7min；25℃，10min。

(10)取第二轮PCR的产物于1％(w/v)1×TAE琼脂糖凝胶中电泳检测，回收300bp-2kb之间的DNA片段；

(11)将回收的片段连接T载体，16℃过夜连接；

(12)转化步骤(11)的连接产物；

(13)用M13F和M13R引物扩增步骤(12)中的转化产物，并挑取阳性克隆摇床培养菌液，利用TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit快速质粒小提试剂盒(离心柱型)提取质粒DNA；测序引物为M13F和M13R引物；M13F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’(SEQ ID NO:14)，M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’(SEQ ID NO:15)；

(14)用测序引物对步骤(13)中的质粒DNA进行测序，利用

Terminatorv3.1 Cycle Sequencing Kit对质粒DNA进行测序PCR。

(15)用NaAc和无水乙醇纯化、甲酰胺变性步骤(14)中的PCR产物。

(16)将步骤(15)中纯化变性后的PCR产物利用ABI DNA测序仪3730开机测序并读出测序结果。

(17)测序结果在Plant GDB数据库中用BLASTN工具与玉米基因组序列进行同源搜索，以最好的匹配结果为插入位点的染色体号和碱基对位置号，通常序列一致性为90-100％。

(18)通过本实施例检测出插入T-DNA左侧序列634bp，见序列SEQ ID NO：1的核苷酸1-634。以玉米B73全基因组序列为参考(http://www.plantgdb.org/ZmGDB/cgi-bin/blastGDB.pl)，分析比较确定本申请转化体左侧插入点位于第9号染色体133,993,669bp。获得外源基因在玉米基因组整合位点的左边界634bp长的序列，包括第1-367共367bp的玉米基因组序列和第368-634共266bp的载体左边界序列。

2.右侧翼序列分析

取待测转化体植株叶片提取总DNA(T₂代或者T₃代生长健壮的转基因植株)，利用左侧翼插入位点数据库全基因组序列设计引物：

右侧翼载体引物：

csp1138：5’-TGAACTGTCGGATACCAAGGCGG-3’(SEQ ID NO:16)；

右侧翼基因组引物:

csp5891：5’-GTTGGGCGTCGTTTGTCAT-3’(SEQ ID NO:17)。

普通PCR方法进行插入玉米基因组的外源基因侧翼序列扩增、克隆、测序，得到序列结果，见序列SEQ ID NO：1的核苷酸5904-6763。以玉米B73全基因组序列为参考(http://www.plantgdb.org/ZmGDB/cgi-bin/blastGDB.pl)，分析比较确定本申请转化体右侧插入点位于第9号染色体133,993,710bp。

3.插入序列的大小和对玉米内源基因组的影响

本申请外源基因单拷贝插入序列包括左右边界序列的载体大小为5937bp。

通过分段PCR扩增外源DNA测序的方法，确定转化体中T-DNA插入物相对于表达载体左端缺失38bp，右端缺失42bp，随机插入7bp。插入序列实际大小为5864bp(SEQ ID NO:1的368-6231)，包括T-DNA插入物5857bp(SEQ ID NO:1的368-6224)，和右侧随机插入7bp(SEQ ID NO:1的6225-6231)。

扩增体系包含：DNA模板2μL(200ng)，引物各0.5μL(引物序列参见表4)，DNA聚合酶0.5μL，PCR缓冲液(10倍)2μL，ddH₂O14.5μL。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；35个循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3分钟；最后72℃延伸7分钟。使用1％琼脂糖凝胶检测标记扩增效果。回收特异性扩增的扩增产物，即目的片段。

表4侧翼序列PCR扩增引物信息

上述缺失的核苷酸位于非编码区的边界序列。其缺失不影响抗除草剂基因bar和cp4 epsps基因的完整性。DNA序列分析比对表明，转化体实际插入核苷酸序列与载体序列有一个碱基突变(SEQ ID NO:1的4824处由T变为G)致使密码子由CUU变为CUG，因为突变为同义密码子，所以不影响氨基酸的正常表达。

另外，插入位点处的玉米基因组为重复序列，核苷酸缺失没有破坏任何已知的玉米内源功能基因。

实施例6.转化体ZZM032的检测方法

1.左侧翼DNA序列检测：

利用玉米转化体的左侧翼基因组序列和外源片段中的bar的序列设计了一对引物FW-csp7743和RV-Bar-22，建立该转化体产品的定性PCR鉴定方法。

依据ZZM032转化体外源DNA片段整合位点左边界(LB)T-DNA5’端设计的引物为：

FW-csp7743:5’-TCCTACTACTGTTTACCATGCTTG-3’(SEQ ID NO:18，玉米基因组区)；

RV-Bar-22:5’-CCTGCCCGTCACCGAGATTTGA-3’(SEQ ID NO:19，Bar区域)。

上述特异引物在50-60℃条件下利用温度梯度PCR扩增DNA片段确定了最佳退火温度。结果证实用58℃为最佳扩增温度；PCR反应程序为95℃ 5min，(95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min)35个循环，72℃ 7min。

为测试上述引物(FW-csp7743；RV-Bar-22)特异扩增本转化体特性，不同来源的玉米DNA被用来进行PCR扩增。

PCR反应条件和程序为95℃ 5min，35个以下循环：95℃ 30s，58℃ 30s，72℃1min；72℃ 7min。结果表明只有本转化体DNA能够有阳性结果，阴性对照玉米为阴性结果，见图5中的A。其中，泳道1-4分别为无菌水、祥249DNA、ZZM032 T₃ DNA和ZZM032 T₄DNA。ZZM032 T₃和T₄基因组DNA泳道3和4有清晰可见的条带，其DNA片段大小634bp与预期一致，DNA片段克隆测序得到结果亦与预期一致。

2.右侧翼DNA序列检测：

利用外源片段中的cp4 epsps序列和玉米转化体的右侧翼基因组序列设计了一对引物(SEQ ID NO:20:FW-csp1138和SEQ ID NO:21:RV-csp5891)，建立该转化体的定性PCR鉴定方法。

依据ZZM032转化体外源DNA片段整合位点右边界(RB)T-DNA5’端设计的引物为：

FW-csp1138:5’-TGAACTGTCGGATACCAAGGCGG-3’(SEQ ID NO:20，cp4 epsps区域),

RV-csp5891:5’-GTTGGGCGTCGTTTGTCAT-3’(SEQ ID NO:21，玉米基因组区)。

上述特异引物在50-60℃条件下利用温度梯度PCR扩增DNA片段确定了最佳退火温度。结果证实用58℃为最佳扩增温度；,PCR反应程序为95℃ 5min；35个以下循环：95℃30s，58℃ 30s，72℃ 1min；72℃ 7min。

为测试上述引物(FW-csp1138；RV-csp5891)特异扩增本转化体特性，不同来源的玉米DNA被用来进行PCR扩增。PCR反应条件和程序为95℃ 5min；35个以下循环：95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min循环；72℃ 7min。结果表明只有本转化体DNA能够有阳性结果，阴性对照玉米品种为阴性结果，见图5中的B。其中，泳道1-4分别为无菌水、祥249DNA、ZZM032 T₃DNA和ZZM032 T₄ DNA；仅有ZZM032T₃和T₄基因组DNA泳道有清晰可见的条带，其DNA片段大小860bp与预期一致，DNA片段克隆测序得到结果亦与预期一致。

以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和修改，这些改进和修改也应视为本申请的保护范围。

参考文献

Joseph Sambrook，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001).

Current Protocols in Molecular Biology,Wiley-Blackwell.

Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001.

序列表

<110> 中国种子集团有限公司

<120> 抗除草剂玉米转化体及其创制方法

<130> 19C13699CN

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6763

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcctactact gtttaccatg cttgcaatgc ttcttttgta cttttatgca agaatgcaaa 60

agtagttgct aggaagttgg gatccaaata caagggagac aaaacttgca tatgggttcc 120

aaaaactgtt gtgactaacc ttgtagaacc caacaagagt tgggtaccta aaacccaagt 180

ttaaatttct tgcaggttta tgcatccggg gactcaagct ggattatcga cagcggatgc 240

acaaaccata tgacggggga gaagaagatg ttcacctcct acgtcaagaa caaggattcc 300

caggatacga tcatctttgg agatgggaat caaggcaagg tcaaaggttt ggacaagata 360

gccatcagac aacttaataa cacattgcgg acgtttttaa tgtactgaat taacgccgaa 420

ttaattcggg ggatctggat tttagtactg gattttggtt ttaggaatta gaaattttat 480

tgatagaagt attttacaaa tacaaataca tactaagggt ttcttatatg ctcaacacat 540

gagcgaaacc ctataggaac cctaattccc ttatctggga actactcaca cattattatg 600

gagaaactcg agtcaaatct cggtgacggg caggaccgga cggggcggta ccggcaggct 660

gaagtccagc tgccagaaac ccacgtcatg ccagttcccg tgcttgaagc cggccgcccg 720

cagcatgccg cggggggcat atccgagcgc ctcgtgcatg cgcacgctcg ggtcgttggg 780

cagcccgatg acagcgacca cgctcttgaa gccctgtgcc tccagggact tcagcaggtg 840

ggtgtagagc gtggagccca gtcccgtccg ctggtggcgg ggggagacgt acacggtcga 900

ctcggccgtc cagtcgtagg cgttgcgtgc cttccagggg cccgcgtagg cgatgccggc 960

gacctcgccg tccacctcgg cgacgagcca gggatagcgc tcccgcagac ggacgaggtc 1020

gtccgtccac tcctgcggtt cctgcggctc ggtacggaag ttgaccgtgc ttgtctcgat 1080

gtagtggttg acgatggtgc agaccgccgg catgtccgcc tcggtggcac ggcggatgtc 1140

ggccgggcgt cgttctgggc tcatggtaga ctcgagagag atagatttgt agagagagac 1200

tggtgatttc agcgtgtcct ctccaaatga aatgaacttc cttatataga ggaagggtct 1260

tgcgaaggat agtgggattg tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc acatcaatcc 1320

acttgctttg aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg 1380

ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttgaa cgatagcctt tcctttatcg 1440

caatgatggc atttgtaggt gccaccttcc ttttctactg tccttttgat gaagtgacag 1500

atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt cccgatatta ccctttgttg aaaagtctca 1560

atagcccttt ggtcttctga gactgtatct ttgatattct tggagtagac gagagtgtcg 1620

tgctccacca tgttcacatc aatccacttg ctttgaagac gtggttggaa cgtcttcttt 1680

ttccacgatg ctcctcgtgg gtgggggtcc atctttggga ccactgtcgg cagaggcatc 1740

ttgaacgata gcctttcctt tatcgcaatg atggcatttg taggtgccac cttccttttc 1800

tactgtcctt ttgatgaagt gacagatagc tgggcaatgg aatccgagga ggtttcccga 1860

tattaccctt tgttgaaaag tctcaatagc cctttggtct tctgagactg tatctttgat 1920

attcttggag tagacgagag tgtcgtgctc caccatgttg gcaagctgct ctagccaata 1980

cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 2040

cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag 2100

gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga 2160

taacaatttc acacaggaaa cagctatgac atgattacga attcgagctc ggtacccggg 2220

gatcctctag agtcgacctg caggcatgca agcttgcatg cctgcagtgc agcgtgaccc 2280

ggtcgtgccc ctctctagag ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac 2340

atattttttt tgtcacactt gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa 2400

actttactct acgaataata taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat 2460

catataaatg aacagttaga catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact 2520

ctacagtttt atctttttag tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc 2580

tatataatac ttcatccatt ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt 2640

tatagactaa tttttttagt acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa 2700

ctaaaactct attttagttt ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa 2760

gtgactaaaa attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc 2820

ttgtttcgag tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa 2880

ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg 2940

ctgcctctgg acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca 3000

tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc 3060

ctctcacggc accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc 3120

ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt 3180

tcggagcgca cacacacaca accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt 3240

caaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc ctctctacct tctctagatc ggcgttccgg 3300

tccatggtta gggcccggta gttctacttc tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt 3360

gttagatccg tgctgctagc gttcgtacac ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg 3420

attgctaact tgccagtgtt tctctttggg gaatcctggg atggctctag ccgttccgca 3480

gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt tcgttgcata gggtttggtt tgcccttttc 3540

ctttatttca atatatgccg tgcacttgtt tgtcgggtca tcttttcatg cttttttttg 3600

tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct agatcggagt agaattctgt 3660

ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat gtgtgtgcca tacatattca 3720

tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat 3780

gcgggtttta ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc gcttggttgt gatgatgtgg 3840

tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag aatactgttt caaactacct 3900

ggtgtattta ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata catcttcata gttacgagtt 3960

taagatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgtggg ttttactgat 4020

gcatatacat gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct ctaaccttga gtacctatct 4080

attataataa acaagtatgt tttataatta ttttgatctt gatatacttg gatgatggca 4140

tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc atacgctatt tatttgcttg 4200

gtactgtttc ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg ttacttctgc aggtcgactc 4260

tagaggatca aacattttta caacaattac caacaacaac aaacaacaaa caacattaca 4320

attacattta caattaccat ggcacagatt agaagcatgg cacagggcat tcaaacactt 4380

agcctcaata gcagcaacct ctccaagacg cagaagggtc cgctcgtgtc gaacagtttg 4440

ttctttggat ccaagaagct cacacagatc tcggcgaaga gtctgggggt gttcaagaag 4500

gacagcgtcc ttcgggtggt cagaaagtcc agctttcgga tttccgcaag cgtcgcaact 4560

gctgaggcac acggagcatc atctaggcct gcaaccgcac gcaagtcgag tggtctgtcg 4620

ggcacagttc ggatccccgg cgacaagtca atttctcata gatccttcat gtttggcgga 4680

cttgccagcg gcgagactag gatcacgggt ctcctggagg gcgaagatgt gattaacaca 4740

gggaaggcta tgcaagcaat gggagccagg atccgcaagg agggtgacac ttggatcatt 4800

gatggagtcg gtaacggagg tctgttggcg cctgaggctc ccctggactt cgggaatgcc 4860

gcgactggat gcaggttgac gatggggctc gtcggagttt acgacttcga ttcgactttt 4920

atcggcgatg cgagtctcac gaagcggcct atggggagag tgctgaatcc ccttcgggag 4980

atgggagtgc aggtcaagtc tgaagacggc gaccggctgc cggttaccct tagaggccca 5040

aagactccga cgccaatcac atatagagtg ccgatggctt cagcacaggt taagtctgcg 5100

gtgctcctgg ctggtctgaa cacaccgggc attaccacag tcatcgagcc aattatgact 5160

agggaccaca cggaaaagat gctgcagggc ttcggggcga atcttaccgt tgagacagac 5220

gctgatggcg tgaggactat cagactggaa ggaagaggca agctcacggg ccaagtgatt 5280

gacgtcccgg gggatccatc cagcactgcg tttcctctgg tggctgcact tttggtcccc 5340

ggctcagacg ttacgatctt gaacgtgctc atgaatccga ccaggacagg actcattctg 5400

acccttcagg agatgggtgc cgatatcgaa gtgattaacc caagactcgc gggcggggag 5460

gacgtcgctg atttgcgggt tagatcatct accctcaagg gagttacagt gcctgaggac 5520

agagcaccct ctatgatcga tgaataccct attctggctg tcgcagcagc tttcgcagag 5580

ggtgcaaccg tcatgaatgg cctggaggaa cttagggtta aggaatccga tagactcagc 5640

gcagtggcaa acgggttgaa gctcaacggc gtcgactgcg atgagggcga aacctcgttg 5700

gttgtgaggg gaagacctga cggcaaggga ctcggaaacg caagtggagc agcagtggca 5760

acgcacctcg atcataggat cgccatgtca ttcttggtca tgggcctcgt ttctgagaat 5820

ccggtcaccg ttgacgatgc aaccatgatt gccacatcct ttccagagtt tatggatttg 5880

atggcaggtc tgggggcgaa gattgaactg tcggatacca aggcggcgtg agtcgagcga 5940

atttccccga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg 6000

gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca 6060

tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca 6120

tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg 6180

tgtcatctat gttactagat cgggtttaaa ctatcagtgt ttgaaaaacg tacctattca 6240

ccccctctag gtgccctcaa tttataattt gacgataaat tgagcagata gatttattat 6300

ttttcgaaat taataatttt aaaaaacata taattagtat ttaaggtcaa aaaacactcc 6360

agagggtcca aaaattccaa gaaaatttat agagatattt tagatcatga gaaacttaaa 6420

taaagtattt agagttcatg aaaaatacat ttggaataat ctaaaactag atacgctcac 6480

ataagaatag ggaaaaaact ctagaataga tagaaaaatt cccaagaaga ttttcaagga 6540

taggttgata aacaatgaga acaaataata atttagaatg caagattttt ttgataagat 6600

tcaaataaaa gaattaaaaa tcaaggaatc tgatttgatt atctatacta tatttaaagc 6660

atcagtttca acggtcgtcg tgcgtcattt ttttacaaat aacccctcac agctatttta 6720

aattaatccg ttgcatatct ataaatgaca aacgacgccc aac 6763

<210> 2

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagcacaggt taagtctg 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtctgtctca acggtaag 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagttcccgt gcttgaag 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caccatcgtc aaccactac 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcaatagcag caacctctc 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atagtcctca cgccatca 18

<210> 8

<211> 43

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctaatacgag tcactatagc gctcgagcgg ccgccgggga ggt 43

<210> 9

<211> 8

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acctcccc 8

<210> 10

<211> 27

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggatcctaat acgagtcact atagcgc 27

<210> 11

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctatagcgct cgagcggc 18

<210> 12

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggaactggca tgacgtgggt ttct 24

<210> 13

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cctgcccgtc accgagattt ga 22

<210> 14

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

caggaaacag ctatgacc 18

<210> 16

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgaactgtcg gataccaagg cgg 23

<210> 17

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gttgggcgtc gtttgtcat 19

<210> 18

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tcctactact gtttaccatg cttg 24

<210> 19

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cctgcccgtc accgagattt ga 22

<210> 20

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgaactgtcg gataccaagg cgg 23

<210> 21

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gttgggcgtc gtttgtcat 19

<210> 22

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tcctactact gtttaccatg cttg 24

<210> 23

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ggaactggca tgacgtgggt ttct 24

<210> 24

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cagttcccgt gcttgaag 18

<210> 25

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ttccattgcc cagctatctg t 21

<210> 26

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

agagatagat ttgtagagag agact 25

<210> 27

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cgacactctc gtctactcca a 21

<210> 28

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ctcaatagcc ctttggtctt 20

<210> 29

<211> 26

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

atactcaatt gtcctttaga ccatgt 26

<210> 30

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

agtgcagcgt gacccggtcg 20

<210> 31

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

tcacaaccaa gcgaacaa 18

<210> 32

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tttggtttgc ccttttcc 18

<210> 33

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cttcgtgaga ctcgcatc 18

<210> 34

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ggcgaagatg tgattaacac 20

<210> 35

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gttgggcgtc gtttgtcat 19

Claims

1.核酸分子，其为SEQ ID NO: 1所示的序列，或其互补序列。

2.如权利要求1所述的核酸分子，其包含以下表达盒：

表达抗草铵膦基因的第一表达盒，其包含SEQ ID NO: 1的第405-1945位核苷酸所示的序列；和

表达抗草甘膦基因的第二表达盒，其包含SEQ ID NO: 1的第2266-6203位核苷酸所示的序列。

3.如权利要求1或2所述的核酸分子，其存在于玉米植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分中。

4.用于检测玉米转化体的探针，其包含SEQ ID NO: 1的第1-634位核苷酸和/或第5904-6763位核苷酸所示的序列，或其互补序列。

5.用于检测玉米转化体的引物对，其能够特异性扩增包含SEQ ID NO: 1的第1-634位核苷酸或第5904-6763位核苷酸所示的序列，其互补序列。

6.如权利要求5所述的引物对，其中所述引物对为：

i) 特异性识别包含SEQ ID NO: 1的第1-634位核苷酸所示序列的引物对；

ii) 特异性识别包含SEQ ID NO: 1的第5904-6763位核苷酸所示序列的引物对；或

) 特异性识别包含SEQ ID NO: 1的第1-634位核苷酸所示序列的引物对，和特异性识别包含SEQ ID NO: 1的第5904-6763位核苷酸所示序列的引物对。

7.如权利要求6所述的引物对，其中所述引物对为SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列；和/或SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列。

8.用于检测玉米转化体的试剂盒或微阵列，其包含权利要求4所述的探针和/或权利要求5-7中任一项所述的引物对。

9.检测玉米转化体的方法，其包括利用以下来检测待测样品中是否存在所述转化体：

-权利要求4所述的探针；

-权利要求5-7中任一项所述的引物对；

-权利要求4所述的探针和权利要求5-7中任一项所述的引物对；或者

-权利要求8所述的试剂盒或微阵列。

10.对玉米进行育种的方法，所述方法包括以下步骤：

1) 获得包含权利要求1至3中任一项所述的核酸分子的玉米；

2) 将步骤1)所获得的玉米通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到种子、植物细胞、后代植物或植物部分。

11.如权利要求10所述的方法，其还包括3) 对步骤2)所获得的后代植物进行抗除草剂草铵膦和草甘膦鉴定，并利用权利要求9所述的方法来检测其中是否存在所述转化体。