CN118109488A

CN118109488A - 抗鳞翅目害虫转基因水稻事件mfb-MH86及其检测方法

Info

Publication number: CN118109488A
Application number: CN202410188176.8A
Authority: CN
Inventors: 朱祯; 王�锋; 陈在杰; 张磊; 戴艳; 杨绍华; 魏晓丽; 林艳
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2024-02-20
Filing date: 2024-02-20
Publication date: 2024-05-31

Abstract

本发明公开了抗鳞翅目害虫转基因水稻事件mfb‑MH86及其检测方法。具体地公开了转Cry1Ab基因水稻mfb‑MH86外源插入片段的侧翼序列。本发明首先通过农杆菌介导把Cry1Ab基因转入水稻‘明恢86’中，经鉴定筛选出农艺性状优良、单拷贝、遗传稳定且无选择标记的水稻转化事件mfb‑MH86。该转化事件能够高抗二化螟、稻纵卷叶螟等主要鳞翅目害虫，尤其高抗夜蛾科大螟和草地贪夜蛾，在水稻种植过程中可减少杀虫剂的使用，减少生产投入，提高水稻产量。本发明还建立了水稻mfb‑MH86的转化事件特异性检测方法，该方法快速、准确、灵敏、稳定，能够用分子标记来追踪育种材料的转基因插入片段，从而提高育种效率。

Description

抗鳞翅目害虫转基因水稻事件mfb-MH86及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，主要涉及转基因植物及其检查方法，具体是涉及一种对昆虫具有抗性的转基因水稻事件mfb-MH86和用于检测生物样品中是否包含特定转基因水稻事件核酸序列的方法。

背景技术

水稻是中国最主要的粮食作物之一，水稻安全生产是维持中国粮食安全的砥柱。虫害是水稻生产上的一个重要制约因素。水稻鳞翅目害虫如二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟、大螟等是我国水稻生产中的主要害虫。目前，水稻生产虫害控制主要采取喷撒杀虫剂的途径。但另一方面，许多害虫也已逐步对杀虫剂产生抗药性。因此，虫害问题越来越突出。培育推广具有抗虫能力的水稻新品种是解决上述问题的有效途径。由于在水稻及其近缘种中没有发现鳞翅目害虫抗性种质资源，不可能通过常规育种及分子标记辅助选择技术方式培育抗虫水稻新品种，因此应用转基因培育抗虫水稻是现阶段及未来解决水稻虫害问题的主要策略。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种革兰氏阳性菌，是目前世界上应用最成功的微生物杀虫剂，在全球生物杀虫剂市场份额中占比超过一半。Bt菌广泛存在于土壤、水、昆虫尸体、树叶等环境中，并主要在昆虫尸体中进行繁殖。Bt菌在形成芽孢的过程中会产生具有杀虫活性的伴孢晶体，称为杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystalproteins，ICP)或δ-内毒素(δ-endotoxin)，包括晶体蛋白(crystal protein，Cry)和溶细胞素(cytolytic，Cyt)两大类，其对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等多种害虫具有杀虫活性。其中，Cry蛋白是在Bt细菌中发现最早、研究最多的一类杀虫蛋白，也是Bt菌杀虫活性的主要来源，因其极佳的杀虫效果和良好的生物安全性而成为了世界上应用最广泛、最成功的杀虫蛋白。人们常说的Bt基因通常就是指的Cry基因。

近年来，我国科学家培育转基因水稻所使用的抗虫基因包括Bt类的Cry1Ac、融合Cry1Ab/Cry1Ac、Cry1C、Cry2A和Cry1Ah，修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CPTI)抗虫基因sck，以及双价抗虫基因Cry1Ac/sck。这些基因针对鳞翅目螟蛾科害虫二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等具有高效毒杀作用，但针对鳞翅目夜蛾科害虫大螟的效应则相对弱，而大螟危害在近年来呈现逐年严重的趋势。另一方面，近年来传入我国的草地贪叶蛾为世界著名作物害虫，其食量大、危害重，世代周期短，具迁飞习性，其危害具有爆发性、毁灭性特点，因此历来受到重视。草地贪叶蛾传入我国后，除危害玉米外，也已经发现危害水稻，其可能成为威胁我国粮食生产的重要害虫。草地贪叶蛾属鳞翅目夜蛾科，上述转基因水稻针对其抗性效应可能相对弱，不足以达到生产应用的抗性水平。基于上述问题，迫切需要筛选出对水稻大螟和草地贪夜蛾均具有高效毒杀效应的Bt基因，以期进一步培育出高抗这两种害虫的水稻品种。

检测特定事件的方法对于后期杂交转育，鉴定后代是否包含目的基因将是有益的。此外，还将有助于遵守相关法规，产品保护。通过任何熟知的多核苷酸检测方法来检测转基因的存在都是可能的，例如聚合酶链式反应(PCR)或利用多核苷酸探针的DNA杂交。一般常利用跨越了插入的转基因和侧翼DNA的接合部位的一对引物通过PCR来鉴定转基因特定事件，具体包括位于侧翼序列的第一引物和插入序列的第二引物。T-DNA在受体植物基因组中的整合位置都是随机的，每个转基因事件的T-DNA左右端序列与受体基因组序列拼接而成的T-DNA插入位点侧翼序列是唯一的，是该转基因事件身份的特异性标识。因此，分离转基因植物的T-DNA侧翼序列，以及依据该侧翼序列而建立的特异性检测方法，是准确识别不同转基因作物，实现转基因作物及其产品产权保护、检测和有效监督管理的一个重要依据。转基因作物转化事件特异性检测技术是以其转基因T-DNA侧翼序列的部分序列为靶标进行扩增，扩增产物是T-DNA5’端或3’端序列与受体基因组的拼接序列，因此具有高度特异性，可准确识别不同的转基因作物品系。

发明内容

本发明的目的是提供一种转基因水稻事件mfb-MH86以及用于检测水稻事件mfb-MH86的侧翼序列及检测方法。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为实现上述目的，本发明首先提供了转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86外源插入片段的侧翼序列，为如下(1)或(2)或(3)：

(1)5’侧翼序列；

(2)3’侧翼序列；

(3)由所述5’侧翼序列和所述3’侧翼序列组成；

所述5’侧翼序列的核苷酸序列可如SEQ ID No.7所示，或者在转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86的基因组中至少含有SEQ ID No.7并且沿着转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86的基因组的方向向5’端延伸后所得的序列；

所述3’侧翼序列的核苷酸序列可如SEQ ID No.8所示，或者在转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86的基因组中至少含有SEQ ID No.8并且沿着转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86的基因组的方向向3’端延伸后所得的序列。

所述转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86已于2024年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.45700。

本发明还提供了所述侧翼序列在如下任一项中的应用：

A1)检测或辅助检测待测水稻是否为转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86；

A2)检测或辅助检测待测样本中是否含有转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86。

本发明还提供了用于检测或辅助检测转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86的引物组合，所述引物组合可为引物对1和/或引物对2；

所述引物对1的上游引物根据所述5’侧翼序列中的水稻基因组固有序列设计获得，下游引物根据T-DNA插入序列设计获得；

所述引物对2的上游引物根据T-DNA插入序列设计获得，下游引物根据所述3’侧翼序列中的水稻基因组固有序列设计获得；

所述T-DNA插入序列如SEQ ID No.6所示。

进一步地，所述引物对1可为如下(a1)或(a2)：

(a1)由SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

(a2)由SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的两条单链DNA分子组成的引物对；

所述引物对2可为由SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的两条单链DNA分子组成的引物对。

所述引物组合可为用于检测mfb-MH86转化事件中转化体的特异性PCR引物。

本发明还提供了所述引物对或引物组合在制备用于检测或辅助检测转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86的试剂盒中的应用。

本发明还提供了用于检测或辅助检测转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86的试剂盒，所述试剂盒含有所述引物组合或任一引物对。

本发明还提供了所述引物对或所述引物组合，或所述试剂盒在如下任一项中的应用：

B1)检测或辅助检测待测水稻是否为转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86；

B2)检测或辅助检测待测样本中是否含有转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86。

本发明还提供了检测或辅助检测待测水稻是否为转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86的方法，所述方法包括如下步骤：

C1)以所述待测水稻的基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，获得PCR产物；

C2)根据所述PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测水稻是否为转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86：若所述PCR产物中含有预期大小的DNA片段，则所述待测水稻为或候选为转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86；反之，则所述待测水稻不为或候选不为转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86。

本发明还提供了检测或辅助检测待测样本中是否含有转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86的方法，所述方法包括如下步骤：

D1)从所述待测样本中提取基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，获得PCR产物；

D2)根据所述PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测样本中是否含有转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86：若所述PCR产物中含有预期大小的DNA片段，则所述待测样本中含有或候选含有转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86；反之，则所述待测样本中不含有或候选不含有转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86。

上述方法中，当所述引物组合为由SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的两条单链DNA分子组成的引物对时，所述预期大小的DNA片段可为541bp的DNA片段；当所述引物组合为由SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的两条单链DNA分子组成的引物对时，所述预期大小的DNA片段可为989bp的DNA片段。

进一步地，所述541bp的DNA片段可为SEQ ID No.15所示的DNA片段。

进一步地，所述989bp的DNA片段可为SEQ ID No.16所示的DNA片段。

本发明还提供了创制转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86的方法，所述方法包括将目的水稻基因组第5号染色体的19094735-19094768位之间的碱基替换为外源DNA片段，得到转基因水稻；所述外源DNA片段含有Cry1Ab基因，所述转基因水稻的鳞翅目昆虫抗性高于所述目的水稻。

进一步地，所述外源DNA片段可为核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的T-DNA区。

本文所述外源插入片段、外源DNA片段、T-DNA插入序列、T-DNA区具有等同的含义，可互换使用。

本发明还提供了引物对3，所述引物对3由引物Cry1AbF和引物Cry1AbR组成，所述引物Cry1AbF的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述引物Cry1AbR的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示。

本发明还提供了引物对4，所述引物对4由引物hptF和引物hptR组成，所述引物hptF的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述引物hptR的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

所述引物对3可用于检测转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86中是否含有外源基因Cry1Ab基因。所述引物对4可用于检测转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86中是否含有外源基因hpt基因。进一步地，所述引物对3和引物对4可通过普通PCR定性检测mfb-MH86转化事件中外源基因存在。

本发明还提供了一种检测待测样本中含有水稻mfb-MH86转化事件存在的方法，所述方法包括如下步骤：

E1)提取待测样本基因组DNA并与所述引物对1(由上游引物spe5’F和下游引物spe5’R组成)和/或所述引物对2(由上游引物spe3’F和下游引物spe3’R组成)在核酸扩增反应中接触；

E2)进行核酸反应；

E3)检测扩增产物；所述扩增产物包括来自SEQ ID No.20及其互补序列的核酸序列，即表示所述检测样品包含转基因水稻事件mfb-MH86的DNA存在。

本发明还提供了抗虫转基因水稻的检测方法，包括以下步骤：

1)提取待测转基因水稻的总DNA；

2)以所述总DNA为模板，利用本文所述引物对或引物组合进行PCR扩增。

本发明还提供所述检测方法在水稻育种中的应用。涉及对上述转化事件的水稻植株的检测，以进行转基因标识、含量分析、基因漂移研究及杂交育种跟踪等应用。所述植株包含但不限于亲本、自交后代、杂交后代的种子、花粉、雌蕊、叶片、根等各器官及植物细胞、植物组织等。

本发明还提供了一种产生对昆虫有抗性的水稻植物的方法，所述方法包括：将转基因水稻事件mfb-MH86作为第一亲本水稻植株与缺少昆虫抗性的第二亲本水稻植株有性杂交，从而产生子代植株，用靶昆虫侵袭所述子代植株，收获与其它不具有所述转基因水稻事件mfb-MH86的植株相比具有减弱的植物损伤的植株，得到对昆虫有抗性的水稻植物，所述靶昆虫为鳞翅目昆虫。

本发明还提供了一种保护水稻植物免于昆虫侵袭的方法，所述方法包括在靶昆虫的膳食中提供至少一种包含转基因水稻事件mfb-MH86的转基因水稻植物细胞；摄食所述转基因水稻植物细胞的靶昆虫被抑制进一步摄食所述水稻植物，所述靶昆虫为鳞翅目昆虫。

本发明还提供了一种加工品，所述加工品产生自转基因水稻事件mfb-MH86。

所述加工品不属于专利法所称的植物。所述加工品无繁殖能力，也不具有借助光合作用，以水、二氧化碳和无机盐等无机物合成碳水化合物、蛋白质来维系生存的能力。

所述加工品可为食品、化妆品或填充剂。所述食品可为稻米、水稻粉和/或水稻油。

本文所述“转化事件”是指通过遗传转化的方法将外源基因及其表达盒成功整合入受体材料的细胞核基因组中，通过组织培养、筛选、鉴定从而创制形成具有应用价值的转基因株系。

本文所述水稻转化事件mfb-MH86(也称为转基因水稻事件mfb-MH86或转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86)，其是将包含Cry1Ab基因的遗传转化载体pCDMARUBb-Hyg(图1)的T-DNA区单拷贝整合到水稻基因组中，并培育出抗鳞翅目害虫农艺性状优良的转化事件。

本文所述鳞翅目昆虫可包括螟蛾科昆虫(螟虫)或夜蛾科昆虫。

进一步地，所述鳞翅目昆虫可包括稻纵卷叶螟、二化螟、大螟和草地贪夜蛾但不限于此。

本发明提供抗鳞翅目昆虫转基因水稻mfb-MH86的T-DNA区核苷酸序列，所述T-DNA区核苷酸序列如SEQ ID No.6所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列；所述T-DNA区核苷酸序列的左边界侧翼序列(5’侧翼序列)的核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列；所述T-DNA区核苷酸序列的右边界侧翼序列(3’侧翼序列)的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示、或其互补序列或与其同源性达到90％以上的核苷酸序列。

SEQ ID No.20所示的核苷酸序列或其互补序列为用于表征转基因水稻事件mfb-MH86的长度为7470个核苷酸的序列，包括5’水稻明恢86基因组侧翼序列(5’侧翼序列)，整个转基因表达盒和3’水稻明恢86基因组侧翼序列(3’侧翼序列)，其具体包含的基因组和遗传元件如表l所示。

表1、SEQ ID No.20包含的基因组和遗传元件

元件名称	起始位置	终止位置	大小(bp)	功能
					5’侧翼序列	1	374	374	插入位点水稻明恢86基因组左侧翼序列
LB碱基重排序列	375	377	3	T-DNA插入位点左边界序列重排
					T-DNA	378	655	278	T-DNA间隔区序列
MAR	656	1518	863	核基质结合区序列增强转录活性
					T-DNA	1519	1810	292	T-DNA间隔区序列
T-nos	1811	2063	253	NOS基因终止子
					T-DNA	2064	2085	17	载体T-DNA多克隆位点序列
Cry1Ab	2086	3933	1854	修饰的Cry1Ab毒蛋白基因
					Ubiquitin Promoter	3934	5944	2010	泛素基因启动子
T-DNA	5945	6209	265	T-DNA间隔区序列
					MAR	6210	6956	747	核基质结合区序列增强转录活性
T-DNA	6957	6962	6	载体T-DNA多克隆位点序列
					RB碱基重排序列	6963	6989	27	T-DNA插入位点右边界序列重排
3’侧翼序列	6990	7470	481	插入位点水稻明恢86基因组右侧翼序列

本文所述引物或其互补序列可用于DNA扩增法中以产生扩增子，利用所述扩增子的检测来诊断生物样品中转基因水稻事件mfb-MH86或其后代的存在。所述引物、外源插入片段、侧翼序列或其互补序列可用于核苷酸检测法中，以检测生物样品中转基因水稻事件mfb-MH86或其后代的存在。

本发明获得的抗鳞翅目昆虫转基因水稻mfb-MH86是以水稻品种‘明恢86’为受体通过转基因技术获得的，同时该转化事件也适用于具有同样的T-DNA片段、且插入到同样基因组位置，而利用其他受体品种改良而获得的植株。

本发明提供了抗鳞翅目昆虫转基因水稻mfb-MH86的检测方法及应用，适用于转基因水稻的安全评估和检测，以及由该转化事件获得的转基因水稻为供体而得到的各种转基因水稻新品种。

一方面，本发明提供了一种转基因水稻事件，由该转化事件获得的转基因水稻具有抗鳞翅目昆虫的特性，应用该转基因水稻可以进行转基因水稻新品种的培育和改良以防治螟虫、草地贪夜蛾等鳞翅目害虫的危害。

另一方面，本发明提供了一种抗鳞翅目昆虫转基因水稻的检测方法，应用该方法可以对包含与该转化事件具有同样的T-DNA片段、且插入到同样基因组位置的转基因水稻(包含亲本、杂种及其后代)及其制品(包括植株、组织、稻谷、大米及其制品)实施检测、监测和安全管理。

术语：

以下定义和方法可以更好地定义本发明和指导本领域的普通技术人员实施本发明，除非另作说明，根据本领域普通技术人员的常规的用法来理解术语。

所述“水稻”是稻属谷类作物(Oryza sativa L.)，并且包括可以与水稻交配的所有植物品种，包括野生水稻种。

术语“植物”包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛(plant clumps)和植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药等。应理解为本发明范围内的转基因植物的部分包括但不限于植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶和根，以上植物部分源自事先用本发明的DNA分子转化的并因此至少部分地由转基因细胞组成的转基因植物或其子代。

所述“加工品”是指植物、种子等原料经加工处理得到的产物，例如组合物等。

“侧翼序列"可以包含天然存在于例如植物的生物体中的基因组或通过转化过程引入的外源(异源)DNA，例如与转化事件相关的片段。因此，侧翼DNA可以包括天然和外源DNA的组合。在本发明中，“侧翼序列”是指转化受体的水稻基因组序列。其位于最初外源插入DNA分子的直接上游或下游并且与最初外源插入DNA分子相邻。当该侧翼区位于上游时，其也可以称为“左边界侧翼序列”或“5’侧翼序列”。当该侧翼区位于下游时，其也可以称为“右边界侧翼序列”或“3’侧翼序列”。

本发明涉及抗虫转基因水稻事件mfb-MH86，并提供了相关的创制方法、检测方法和应用。该申请通过农杆菌介导将Cry1Ab抗虫基因的双T-DNA载体pCDMARUBb-Hyg转化优良水稻恢复系明恢86，并通过多代自交、检测与选择，筛选获得了无选择标记转Cry1Ab抗虫基因水稻转化事件mfb-MH86。分子检测表明，该事件的选择标记基因在植物中已被剔除，而抗虫基因已整合到受体植物的染色体上，并且可稳定遗传与高效表达。本申请所获得的转化事件中，所插入的外源基因位于水稻基因组的非功能位点，不影响受体植物自身其它基因的表达，在使转基因获得抗虫特性的同时，保持了其良好的农艺性状。本发明的转基因水稻事件mfb-MH86能够高抗二化螟、稻纵卷叶螟等主要鳞翅目害虫，尤其高抗夜蛾科大螟，并对草地贪夜蛾具有较好抗性；在水稻种植过程中可减少杀虫剂的使用，减少生产投入，提高水稻产量。同时本发明提供的检测方法能够快速、准确、灵敏、稳定的鉴定出来源于转基因水稻事件mfb-MH86的DNA分子，能够用分子标记来追踪育种材料的转基因插入片段，从而提高育种效率。

附图说明

图1为本发明实施例1中pCDMARUBb-Hyg的质粒图谱。

图2为本发明实施例1中pCDMARUBb-Hyg的T-DNA结构示意图。

图3为本发明实施例1中T0代转基因植株潮霉素基因PCR检测结果。其中：1为Marker，2为阳性对照，3为阴性对照，4-10为部分潮霉素抗性阳性株。

图4为本发明实施例1中T0代转基因植株Cry1Ab表达试纸条检测结果。其中：1、2、4、6、7、9、10为Cry1Ab表达阳性样品；3、5、8为Cry1Ab表达阴性样品。

图5为本发明实施例1中T1代转基因植株hpt和Cry1Ab基因PCR检测电泳图谱。其中：1为Marker，2为阳性对照，3为阴性对照，4-18为筛选的植株。

图6为本发明实施例1中部分T2代转Cry1Ab基因纯合株系PCR检测结果。其中：A为Marker，B为阳性对照，C为阴性对照，D-O为纯合株系植株，所有单株均检测到Cry1Ab。

图7为本发明实施例1中部分T2代转Cry1Ab基因纯合株系BT蛋白试纸条检测结果。其中：右边为待检测转Cry1Ab基因植株；左边为检测结果，左边第一条试纸条为阴性对照，第二条为阳性对照，其余为T2代纯合株系。

图8为本发明实施例1中mfb-MH86纯合系目的基因(Cry1Ab基因)southern杂交检测结果。图中1-3为mfb-MH86纯合株系的基因组DNA经NcoI、SphI、SacI酶切，杂交探针为Cry1Ab。

图9为本发明实施例1中mfb-MH86纯合系标记基因(hpt基因)southern杂交检测结果。图中1-3为mfb-MH86纯合株系的基因组DNA经BstXI、EcoRV、PvuII酶切，杂交探针为hpt。

图10为本发明实施例1中mfb-MH86纯合系MAR序列southern杂交结果。其中：1-3为mfb-MH86纯合株系。

图11为本发明实施例1中mfb-MH86纯合系Ubiquitin启动子southern杂交结果。其中：1-3为mfb-MH86纯合株系。

图12为本发明实施例1中mfb-MH86纯合系T-nos终止子southern杂交结果。其中：1-3为mfb-MH86纯合株系。

图13为本发明实施例1中mfb-MH86纯合系非T-DNA区的骨架载体southern杂交结果图。其中：M为λ-EcoT14 I digest DNA Marker；1为载体pCDMARUBb-Hyg；2为mfb-MH86；3为非转基因对照明恢86。

图14为本发明实施例3中水稻mfb-MH86插入序列的PCR测序示意图。水稻mfb-MH86实际插入序列PCR测序的T-DNA大小为6615bp，图示各遗传元件介绍及T-DNA整合入水稻第5号染色体的19094735-19094768位点的位置示意图。

图15为本发明实施例3中外源插入片段5’端侧翼序列比对情况。

图16为本发明实施例3中外源插入片段3’端侧翼序列比对情况。

图17为本发明实施例4中转Cry1Ab基因抗虫水稻mfb-MH86纯合系的5’侧翼序列特异性PCR检测结果。1：Trans 2K plus marker；2-3：转Cry1Ab基因抗虫水稻mfb-MH86；4：其它转Cry1Ab基因转化事件水稻；5：转Cry1Ac基因转化事件水稻；6：受体材料MH86(阴性对照)；7：空白对照。

图18为本发明实施例4中转Cry1Ab基因抗虫水稻mfb-MH86纯合系的3’侧翼序列特异性PCR检测结果。1：Trans 2K plus marker；2-3：转Cry1Ab基因抗虫水稻mfb-MH86；4：其它转Cry1Ab基因转化事件水稻；5：转Cry1Ac基因转化事件水稻；6：受体材料MH86(阴性对照)；7：空白对照。

图19为本发明实施例4中转化事件的灵敏度检测结果。采用Real time-PCR对mfb-MH86的定量检测。1-5分别为mfb-MH86不同含量模板的扩增曲线产物。1，117pg基因组DNA；2，39pg基因组DNA；3，13pg基因组DNA；4，4.3pg基因组DNA；5，1.4pg基因组DNA。

保藏说明

生物材料的分类命名：水稻

拉丁文学名：Oryza sativa

参椐的生物材料(株)：mfb-MH86

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2024年02月01日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.45700

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的Cry1Ab基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第2023-3870位所示。

下述实施例中的载体pCDMAR记载于如下文献中：Chen S,Li X,Liu X,Xu H,MengK,Xiao G,Wei X,Wang F,Zhu Z.Green fluorescent protein as a vital eliminationmarker to easily screen marker-free transgenic progeny derived from plantsco-transformed with a double T-DNA binary vector system.Plant CellRep.2005Feb；23(9):625-31.doi:10.1007/s00299-004-0853-4.公众可以从申请人处获得，以重复本申请实验。

下述实施例中的载体pCAMBIA1300为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品，货号MCV033。

下述实施例中的生物材料mfb-MH86已经于2024年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45700，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、抗鳞翅目害虫转基因水稻的获得

1、遗传转化载体的构建以及转基因植株的获得

植物表达载体pCDMARUBb-Hyg构建过程如下：首先利用载体pCDMAR与商业化载体pCAMBIA1300构建了中间质粒pCDMAR-Hyg，具体过程为EcoR I/Hind III双酶切pCAMBIA1300(Klenow补平酶切位点)，连接后获得质粒pC1300LacZ-。Sac II/Sph I双酶切质粒pC1300LacZ-，获得含有植物选择标记基因的T-DNA结构域(T4DNA聚合酶削平Sac II和Sph I位点)，插入到pCDMAR的Sac II(T4DNA聚合酶削平Sac II)位点，获得双T-DNA植物转化载体pCDMAR-Hyg。其次人工合成Ubiqutin启动子-Cry1Ab-T-nos表达结构(SEQ IDNo.1)，其中，第12-2022bp为Ubiquitin启动子序列，第2023-3870bp为Cry1Ab基因序列，第3893-4145bp为T-nos终止子序列。合成时两边加上了Sma I酶切位点，然后用Sma I酶切合成后的质粒回收Ubiqutin启动子-Cry1Ab-T-nos表达结构片段插入到载体pCDMAR-Hyg的Sma I位点，筛选Ubiquitin启动子靠近RB的阳性克隆，即可得到植物表达载体pCDMARUBb-Hyg。pCDMARUBb-Hyg载体结构示意图如图1所示，T-DNA插入序列示意图如图2所示。图1和图2中的Cry1A(b)即为插入的Cry1Ab基因。

将重组载体pCDMARUBb-Hyg通过农杆菌介导的遗传转化方法导入到水稻品种‘明恢86’中。具体导入的步骤为：将构建得到的表达载体pCDMARUBb-Hyg转化入农杆菌中；将农杆菌菌液侵染水稻的胚性愈伤组织；将愈伤组织转移到添加了潮酶素的选择培养基上进行筛选培养，挑选抗性愈伤组织；将抗性愈伤组织转入分化培养基进行分化培养，将分化形成的再生小苗转入生根培养基中培养，幼苗生根后炼苗、移栽，得到T0代转基因水稻转化体。

2、水稻T0代转基因植株的分子鉴定

采用PCR和试纸条快速检测法(BT Cry1Ab/Ac抗虫检测试纸条，Lot：20221103，北京奥创金标生物公司)分析T0代转基因植株中Cry1Ab基因共转化情况。以hpt基因的引物hptF/hptR进行扩增，结果表明，所有潮酶素抗性阳性植株的基因组DNA中均能扩增出潮酶素抗性基因hpt的片段(部分检测结果如图3所示)。通过试纸条检测，在潮酶素抗性阳性植株中，有71.3％的株系能检测到Cry1Ab基因表达，即在这些株系中，同时共整合了Cry1Ab基因和hpt基因，部分检测结果如图4所示。分子鉴定中的引物序列如下：

引物hptF：5’-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3’(SEQ ID No.2)，

引物hptR：5’-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3’(SEQ ID No.3)。

3、水稻T1代转基因植株的检测

种植所筛选共转化Cry1Ab基因的转基因株系，选择农艺性状正常的株系，收获自交结实种子。根据所收获种子，种植T1株系，并在苗期对其进行分子检测，筛选选择标记基因被分离的转Cry1Ab基因株系。以hpt基因引物hptF/hptR，和Cry1Ab基因引物Cry1AbF/Cry1AbR扩增T1代各株系单株基因组，检测并筛选具有Cry1Ab基因但hpt基因已发生分离(即无hpt基因)的植株(部分检测结果如图5所示)，在所有检测株系的植株中，共获得19.7％的具有抗虫基因但选择标记基因hpt已发生分离的植株。Cry1Ab基因引物序列如下所示：

引物Cry1AbF：5’-AAGTTCCTCTCTTGTCCGTGTACG-3’(SEQ ID No.4)，

引物Cry1AbR：5’-GATGAATCCATGAGAACATAGGAGC-3’(SEQ ID No.5)。

4、转Cry1Ab基因T2代水稻植株潮霉素抗性检测

单株收获T1代中检测为Cry1Ab(+)hpt(-)材料的自交种子，进行潮霉素抗性测定。水稻种子催芽萌发后，以hygromycin 50mg l^-1的水溶液处理萌芽的水稻幼苗，鉴定其对潮霉素的抗性。分析结果见表2，结果表明，经PCR鉴定在T1发生选择标记基因分离的株系，其自交结实种子萌发的幼苗，均表现对潮霉素敏感，进一步证实选择标记基因已经被分离。Cry1Ab(+)hpt(-)表示只具有Cry1Ab基因而不具有hpt基因。

表2、部份T1代自交种子(T2代)的分离比测定的结果

注：H(+)表示潮霉素抗性阳性，H(-)表示潮霉素抗性阴性。

5、转Cry1Ab基因T2代水稻纯合株系的筛选

种植经PCR鉴定和潮霉素抗性鉴定，无选择标记hpt基因的T2代水稻株系。每个株系种植10株左右，提取每个单株基因组DNA进行PCR扩增(图6)，并结合Cry1Ab基因表达的试纸条检测(图7)，筛选无选择标记的转Cry1Ab基因水稻纯合株系。

6、无选择标记转Cry1Ab基因纯合株系基本农艺性状初步调查

对纯合无选择标记的转Bt杀虫蛋白基因株系(即转Cry1Ab基因纯合株系)进行了田间抗虫性(参试品种随机区组设计，3次重复。小区为2×10m的长方形小区，小区间间距40cm，株行距为23cm×23cm，单本插秧。抗虫性对比试验除不喷施水稻鳞翅目害虫杀虫剂外均正常田间管理。)与基本农艺性状调查，结果表明，相关克隆均表现出抗虫性，且农艺性状与转化亲本基本一致。结果详见表3。

表3、部分T2代无选择标记转Cry1Ab基因株系田间抗虫性与农艺性状调查

7、无选择标记转Cry1Ab基因纯合优异株系确定

综合上述鉴定、筛选结果，选择受体材料是明恢86的Bb172，作为抗虫转基因水稻育种的亲本，命名为mfb-MH86(即T2代纯合抗虫株系mfb-MH86)。本发明的发明人将该mfb-MH86株系于2024年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.45700。

进一步对mfb-MH86进行了southern杂交检测，实验步骤参考分子克隆。根据转化载体序列与插入位置信息，分别设计目的基因Cry1Ab、标记基因hpt、MAR序列、Ubiquitin启动子、T-nos终止子、载体骨架Kanamycin标记探针，选择不同内切酶进行southern杂交检测。

对T2代纯合抗虫株系mfb-MH86进行了目的基因southern杂交检测。杂交结果表明，经三个不同限制酶(NcoI、SacI和SphI)酶切的基因组DNA经目的基因探针杂交分析，均为单一条带，表明转基因水稻mfb-MH86是单拷贝整合到水稻染色体，NcoI与SacI酶切后实际杂交的片段经分析与预期的片段大小一致，进一步确认了T-DNA的整合的左右边界位置(图8)。

对T2代纯合抗虫株系mfb-MH86进行了标记基因southern杂交检测，不同的限制酶(BstXI、EcoRV、PvuII)酶切水稻基因组DNA，质粒载体含标记基因的T-DNA上BstXI(8330)、EcoRV(7678)是单切点且不在标记基因内，PvuII有两个切点8397与8668，也不在标记基因内。杂交结果显示经三个不同酶切的基因组DNA经标记基因探针杂交，均无条带，表明mfb-MH86材料中不含标记基因(图9)。

对T2代纯合抗虫株系mfb-MH86进行了MAR序列southern杂交检测，不同的限制酶(SpeI、NcoI、ApalI)酶切水稻基因组DNA，杂交探针为MAR序列，因插入的T-DNA上有两段重复的MAR序列，故杂交结果显示两个杂交条带，实际杂交的片段与预期的片段大小一致(图10)。

对纯合抗虫T2代株系mfb-MH86进行了启动子序列southern杂交检测，不同的限制酶(SpeI、ApalI、EcoRV)酶切水稻基因组DNA，杂交探针为Ubiquitin，故杂交结果显示一条杂交条带，实际杂交的片段与预期的片段大小一致。说明材料中含有一个Ubiquitin插入片段，是单拷贝整合到水稻染色体(图11)。

对T2代纯合抗虫株系mfb-MH86进行了终止子序列southern杂交检测，不同的限制酶(SpeI、ApalI、NcoI)酶切水稻基因组DNA，杂交探针为T-nos，故杂交结果显示一条杂交条带，实际杂交的片段与预期的片段大小一致。说明材料中含有一个T-nos插入片段，是单拷贝整合到水稻染色体(图12)。

以载体pCDMARUBb-Hyg中的非T-DNA区的Kanamycin基因为探针，质粒载体pCDMARUBb-Hyg、mfb-MH86与非转基因对照明恢86的基因组DNA经NotI酶切，杂交结果显示，质粒载体pCDMARUBb-Hyg获得一条13Kb的杂交条带，而mfb-MH86与非转基因对照明恢86没有杂交条带，说明转化体mfb-MH86中没有非T-DNA区的骨架载体序列(图13)。

综上所述，通过对目的基因、标记基因、启动子与终止子元件、MAR序列调控元件及非T-DNA区的载体骨架序列的southern杂交分析得知目的基因表达框以单拷贝整合，且不存在非T-DNA区的骨架载体序列整合，汇总结果如表4所示。

表4、T2代Southern杂交试验结果汇总表

实施例2、水稻转基因植株鳞翅目害虫抗性鉴定

1、对稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)的抗性室内生测

采用离体叶片鉴定法对接虫后第4d各供试材料的抗虫性进行检测。对其中尚未死亡的试虫，进一步观察到接虫后第8天，记载其死亡情况(因全部死亡，未进一步称重)。结果表明，mfb-MH86属高抗，接虫后4天试虫全部死亡，且株系间无明显差异；结果见表5。

表5、供试转基因材料对稻纵卷叶螟的抗性测定

2、对二化螟(Chilo suppressalis)的抗性室内生测结果

采用离体叶片鉴定法对供试材料的抗虫性进行检测。此外，还观察了接虫后第3、6、9、12、15天试虫的存活情况与体重。结果表明转Cry1Ab基因的mfb-MH86材料对二化螟均高抗，接虫6天后试虫全部死亡(表6、表7、表8)。

表6、不同转基因水稻材料对二化螟的抗性水平测定

表7、接虫后不同时间各转基因水稻上二化螟幼虫的存活率％

表8、接虫后不同时间转基因水稻上二化螟存活幼虫体重(mg/虫)及抑制率(％)

3、对大螟(Sesamia inferens)的抗性室内生测结果

采用离体叶片鉴定法对供试材料的抗虫性进行检测。对转Cry1Ab基因的mfb-MH86材料进行大螟抗性测定，表现高抗(表9)。

表9、不同转基因材料对大螟的抗性测定

4、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)抗性试验

转Cry1Ab基因的纯合材料mfb-MH86与对照材料明恢86，分别饲喂1-2龄草地贪夜蛾幼虫后，从结果表10可以看出，转Cry1Ab基因的纯合材料mfb-MH86对草地贪夜蛾的体重抑制最明显，接虫4天后达到67.33％，接虫6天后全部死亡，达到高抗级别。

表10、不同转基因水稻材料对草地贪夜蛾的抗性水平测定

实施例3、T-DNA区的侧翼序列分离及插入位置确定

选取农艺性状优良的株系分离T-DNA区的侧翼序列。得到的侧翼序列与水稻明恢86基因组数据库进行比对，明确外源T-DNA插入位置。利用左右边界特异性引物，对T2代纯合株系mfb-MH86进行Tail-PCR扩增。对Tail-PCR扩增产物进行DNA测序，得到5’端374bp和3’端481bp的基因组旁侧序列。分别在水稻明恢86基因组数据库(http://175.27.193.200/#/blast)进行BLASTn核酸比对，证明了插入序列整合在了水稻明恢86第5号染色体基因组。Cry1Ab基因所在的T-DNA整合到了水稻基因组的第5号染色体的19094735-19094768bp位点，该位点为非基因区，如图14所示。使用测序所得5’端共374bp和3’端共481bp基因组旁侧序列，分别在水稻明恢86公开基因组数据库(http://175.27.193.200/#/blast)进行BLASTn核酸-核酸比对，证明了插入序列整合在了水稻第5号染色体基因组，如图15、图16所示。利用以上步骤获得的转化事件mfb-MH86单拷贝插入水稻基因组第5号染色体的19094735-19094768bp位点位置，具有鳞翅目害虫的抗性，且其它农艺性状与‘明恢86’对照品种无明显差异。包含该转化事件的转基因植株可以防止鳞翅目害虫对水稻植株的危害，减少农药的施用量，从而保证产量的稳定，减少劳动投入，降低农药对环境的污染。此外，该转化事件可以作为供体通过有性杂交或定点插入等方法导入其他水稻植株中从而使得其他水稻植株获得抗鳞翅目害虫的特性。因此只要含有与mfb-MH86转化事件同样的T-DNA片段、且插入到同样基因组位置的水稻植株都属于本发明保护范畴。本发明水稻转化事件mfb-MH86为单拷贝且遗传稳定的优质事件。

所述T-DNA区的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

所述5’端374bp的基因组旁侧序列(5’侧翼序列)的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

所述3’端481bp的基因组旁侧序列(3’侧翼序列)的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

实施例4、抗鳞翅目害虫转基因水稻的检测方法

本实施例以mfb-MH86整合位点的侧翼序列和外源T-DNA区插入序列设计特异性PCR引物，通过PCR方法扩增特异性条带，以检测水稻样品中是否含有与mfb-MH86转化事件同样的T-DNA片段、且插入到同样基因组位置的事件以及转化事件的含量。

具体操作按照如下步骤进行。

1)抽提水稻叶片基因组DNA(参照分子克隆)。供试水稻为：转Cry1Ab基因抗虫水稻mfb-MH86；其它转Cry1Ab基因转化事件水稻；转Cry1Ac基因转化事件水稻；受体材料MH86(阴性对照)。

2)设计针对5’侧翼序列和T-DNA区的特异性引物对spe5’F/spe5’R和针对3’侧翼序列和T-DNA区的特异性引物对spe3’F/spe3’R，以及设计检测DNA模板质量的内参基因引物对spsF/R，检测引物序列如下所示：

引物spe5’F：5’-TGAAAGATGGGTGAAGGGC-3’(SEQ ID No.9)，

引物spe5’R：5’-AGGGTTTCGCTCATGTGTTGA-3’(SEQ ID No.10)。

引物spe3’F：5’-CAGCTGGCGTAATAGCGAAG-3’(SEQ ID No.11)，

引物spe3’R：5’-CGGGAACAAGGGGATGTTGG-3’(SEQ ID No.12)。

引物spsF：5’-ATCTGTTTACTCGTCAAGTGTCATCTC-3’(SEQ ID No.13)，

引物spsR：5’-GCCATGGATTACATATGGCAAGA-3’(SEQ ID No.14)。

采用普通PCR方法进行检测。详细的PCR反应程序、反应体系如下：50μL反应体系(0.5mL的Eppendorf管)：5μL缓冲液、两个引物各1μL(终浓度为1pM/L)，再加入样品模板，1μL dNTP(终浓度200μM/L)、1μL Taq酶(2U)，用无菌的双蒸水补足体积。PCR反应条件如下：94℃预变性4min，循环为94℃变性1min，62℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环结束后，72℃继续延伸5min。PCR产物用0.8％Agarose，85V电泳检测。结果如图17-18所示。采用两个特异性引物对(spe5’F/spe5’R和spe3’F/spe3’R)进行PCR扩增，均只有mfb-MH86材料扩增得到了目的条带。采用引物对spe5’F/spe5’R扩增得到大小为541bp的目的条带(图17)；采用引物对spe3’F/spe3’R扩增得到了大小为989bp的目的条带(图18)，而其他的转入Cry1Ab基因的转基因水稻株系，转化受体水稻品种明恢86以及空白对照均未得到目的条带(图17-18)。作为扩增内参基因的引物对spsF/R在所有检测水稻材料的样本中均扩增到了一条287bp的条带，表明用于PCR检测的水稻样品的DNA模板质量不存在问题。本发明的发明人进一步将扩增得到的大小为541bp的目的条带和大小为989bp的目的条带胶回收后送样测序，结果表明541bp的目的条带确实如序列表中SEQ ID No.15所示，989bp的目的条带确实如序列表中序列SEQ ID No.16所示。以上结果表明引物对spe5’F/spe5’R和引物对spe3’F/spe3’R具有较强的特异性。

3)采用Real time-PCR方法，设计特异性引物spe5’realF和spe5’realR，序列如下所示：

引物spe5’realF：5’-GAGAGAGTTGGCGCTAGAACC-3’(SEQ ID No.17)，

引物spe5’realR：5’-CCGAATTAATTCGGCGTTAATTCAGTAC-3’(SEQ ID No.18)。

采用SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的引物进行检测。实时定量PCR参照TaKaRa公司的TB Green Premix Ex TaqTM(Ti RNaseH Plus，AJ91707A)试剂盒说明书规范操作。配制20μL PCR反应体系：TB Green Premix Ex TaqTM buffer(2×)10μL，5'端引物(10μM)0.4μL，3'端引物(10μM)0.4μL，DNA模板0.5μL，灭菌的ddH₂O补至20μL。PCR扩增程序为：95℃，预变性5min，以95℃ 10s，58℃ 10s，72℃ 10s为一个PCR反应周期，共进行40个循环，然后95℃ 5s，65℃ 1min进行熔解曲线分析，最后40℃ 30s降温。每个反应平行重复三次，在Rocher LightCycler480定量PCR仪上进行扩增。Real time-PCR扩增曲线如图19所示，扩增产物如SEQ ID No.19所示。此方法最低检测到的mfb-MH86基因组DNA含量为4.3pg，表明该检测方法灵敏度高。

mfb-MH86转化事件检测方法的建立，可以确认转基因水稻样品是否含有该转化事件。这不仅能够应用于mfb-MH86转基因水稻大规模生产时对其转基因成分进行检测、监测和标识，还能在杂交育种过程中的目标片段跟踪方面发挥重要的作用。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims

1.转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86外源插入片段的侧翼序列，为如下(1)或(2)或(3)：

(1)5’侧翼序列；

(2)3’侧翼序列；

(3)由所述5’侧翼序列和所述3’侧翼序列组成；

所述5’侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，或者在转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86的基因组中至少含有SEQ ID No.7并且沿着转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86的基因组的方向向5’端延伸后所得的序列；

所述3’侧翼序列的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，或者在转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86的基因组中至少含有SEQ ID No.8并且沿着转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86的基因组的方向向3’端延伸后所得的序列。

2.权利要求1所述的侧翼序列在如下任一项中的应用：

A1)检测或辅助检测待测水稻是否为转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86；

3.用于检测或辅助检测转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86的引物组合，所述引物组合为引物对1和/或引物对2；

所述引物对1的上游引物根据权利要求1中所述5’侧翼序列中的水稻基因组固有序列设计获得，下游引物根据T-DNA插入序列设计获得；

所述引物对2的上游引物根据T-DNA插入序列设计获得，下游引物根据权利要求1中所述3’侧翼序列中的水稻基因组固有序列设计获得；

所述T-DNA插入序列如SEQ ID No.6所示。

4.根据权利要求3所述的引物组合，其特征在于，所述引物对1为如下(a1)或(a2)：

所述引物对2为由SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的两条单链DNA分子组成的引物对。

5.权利要求3或4中所述的引物对或引物组合在制备用于检测或辅助检测转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86的试剂盒中的应用。

6.用于检测或辅助检测转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求3或4中所述的引物组合或任一引物对。

7.权利要求3或4中所述的引物对或引物组合，或权利要求6所述的试剂盒在如下任一项中的应用：

B1)检测或辅助检测待测水稻是否为转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86；

8.检测或辅助检测待测水稻是否为转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86的方法，所述方法包括如下步骤：

C1)以所述待测水稻的基因组DNA为模板，采用权利要求3或4所述的引物组合进行PCR扩增，获得PCR产物；

9.检测或辅助检测待测样本中是否含有转Cry1Ab基因水稻mfb-MH86的方法，所述方法包括如下步骤：

D1)从所述待测样本中提取基因组DNA为模板，采用权利要求3或4所述的引物组合进行PCR扩增，获得PCR产物；

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，当所述引物组合为由SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的两条单链DNA分子组成的引物对时，所述预期大小的DNA片段为541bp的DNA片段；当所述引物组合为由SEQ ID No.11和SEQ IDNo.12所示的两条单链DNA分子组成的引物对时，所述预期大小的DNA片段为989bp的DNA片段。

11.一种保护水稻植物免于昆虫侵袭的方法，其特征在于，所述方法包括在靶昆虫的膳食中提供至少一种包含转基因水稻事件mfb-MH86的转基因水稻植物细胞；摄食所述转基因水稻植物细胞的靶昆虫被抑制进一步摄食所述水稻植物，所述靶昆虫为鳞翅目昆虫。

12.一种产生对昆虫有抗性的水稻植物的方法，所述方法包括：将转基因水稻事件mfb-MH86作为第一亲本水稻植株与缺少昆虫抗性的第二亲本水稻植株有性杂交，从而产生子代植株，用靶昆虫侵袭所述子代植株，收获与其它不具有所述转基因水稻事件mfb-MH86的水稻植株相比具有减弱的植物损伤的植株，得到对昆虫有抗性的水稻植物，所述靶昆虫为鳞翅目昆虫。

13.加工品，其特征在于，所述加工品产生自转基因水稻事件mfb-MH86。