BRPI0908267B1 - método de produção de uma planta de milho tolerante a seca - Google Patents

Description

(54) Titulo: MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA DE MILHO TOLERANTE A SECA (51) lnt.CI.: C12N 15/82; A01H 5/10 (30) Prioridade Unionista: 29/02/2008 US 61/032,568 (73) Titular(es): MONSANTO TECHNOLOGY LLC (72) Inventor(es): KIM A. BEAZLEY; PAOLO CASTIGLIONI; MARK A. DIZIGAN; REBECCA A. KELLY; JOHN A. KORTE; CHRISTINE VOYLES (85) Data do Início da Fase Nacional: 30/08/2010

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PLANTA DE MILHO TOLERANTE A SECA.

Referência - Cruzada aos Pedidos Relacionados [001] Este pedido de patente reivindica benefício de prioridade para pedido de patente provisório US N° de Série 61/032 568 depositado em 29 de fevereiro de 2008, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Incorporação de Listagem de Sequências [002] A listagem de sequência que está contida no nome de arquivo “54813A_PCT.txt”, que é de 19671 bytes (medidos no sistema de operação MS-Windows), criado em 04 de fevereiro de 2009, é depositado com o mesmo através de submissão eletrônica e aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Campo da Invenção [003] São aqui descritas células, sementes e plantas transgênicas que incluem DNA recombinante expressando uma proteína de choque frio que proporciona aperfeiçoada tolerância a tensão e/ou rendimento para plantas. A descrição também inclui Métodos de fabricação, uso e detecção de tais células, sementes e plantas. Em particular, a presente invenção refere-se a plantas de milho tolerantes a tensão designadas como MON87460, e Métodos e composições para detecção de presença de DNA MON87460 em uma amostra.

Antecedentes da Invenção [004] Plantas transgênicas com aperfeiçoadas características agronômicas tais como rendimento, tolerância a tensão ambiental, resistência a peste, tolerância a herbicida, composições de semente aperfeiçoadas, e semelhantes são desejadas por ambos, fazendeiros e produtores de sementes. Embora consideráveis esforços em cultivo de

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2/70 plantas tenham provido ganhos significantes em desejadas características, a habilidade para introduzir específico DNA em genomas de plantas ainda provê oportunidades para geração de plantas com características aperfeiçoadas e/ou únicas.

Sumário da Invenção [005] Composições e processos relacionados a plantas de milho transgênicas tolerantes a tensão de déficit de água designadas MON87460, e progênie das mesmas e populações são aqui providos. [006] Em um aspecto, esta invenção provê as plantas de milho transgênicas designadas MON87460 e sementes das ditas plantas como depositadas com expedição enviada em 31 de janeiro de 2008 com American Type Culture Collection (ATCC) e designada N°de Acesso PTA-8910. Um outro aspecto da invenção compreende plantas de progênie, ou sementes, ou partes regeneráveis das plantas e sementes da planta MON87460. Plantas de progênie, ou sementes, ou partes regeneráveis das plantas e sementes compreendendo SEQ ID No: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 24 também são aqui providas.

[007] Um outro aspecto da invenção provê polinucleotídeos compreendendo uma região de junção genômica / transgene a partir de planta de milho MON87460. Polinucleotídeos são providos que compreendem pelo menos uma molécula de ácido nucléico de junção genômica /transgene selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 25, e seus complementos, onde a molécula de junção abrange o sítio de inserção de transgene. Uma semente de milho e seu material de planta compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 25, é um aspecto desta invenção. [008] A presente invenção também é direcionada a um núcleo de uma célula de milho de evento MON87460, onde o dito núcleo comprePetição 870180046639, de 30/05/2018, pág. 7/83

3/70 ende um cromossoma tendo uma inserção de polinucleotídeo heterólogo que provê aperfeiçoada tolerância a déficit de água, onde o dito polinucleotídeo heterólogo compreende qualquer uma de SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 4. De particular interesse é um cromossoma onde o polinucleotídeo heterólogo compreende um promotor actina de arroz truncado para expressão de um gene espB, e onde o dito promotor de actina de arroz truncado é adjacente a sequência genômica de milho de SEQ ID NO: 5. Em certas realizações, um cromossoma de milho compreendendo SEQ ID NO: 1 e uma inserção transgênica heteróloga compreendendo um promotor actina de arroz truncado que está operavelmente ligado a um gene espB é provido. Um terminus 5’ da inserção transgênica heteróloga pode sobrepor um terminus 3’ de SEQ ID NO: 1 em certas realizações. Em certas realizações, o cromossoma de milho pode compreender SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 24. Em certas realizações, um cromossoma da invenção está localizado dentro de uma célula de milho que também contém um segundo polinucleotídeo heterólogo não-ligado para expressão de uma proteína 5-enol piruvil shikimate-3-fosfato sintase (CP4 EPSPS) resistente a glifosato. Plantas ou sementes compreendendo qualquer um dos cromossomas da invenção também são providas. São também providos um alimento processado ou mercadoria alimentícia preparada de uma semente de milho tendo um cromossoma compreendendo SEQ ID NO: 1 e uma inserção transgênica heteróloga compreendendo um promotor actina de arroz truncado que está operavelmente ligado a um gene espB, onde o alimento processado ou mercadoria alimentícia compreende uma quantidade detectável de um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, ou um complemento do mesmo. Em certas realizações, o alimento ou mercadoria alimentícia compreende refeição de milho, farinha de milho, glúten de milho, óleo de milho e amido de milho. Em certas realizações, o polinucleotídeo

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4/70 pode compreender uma sequência de nucleotídeos de SEQ \ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou um complemento do mesmo. Em outras realizações, o polinucleotídeo ainda pode compreender uma sequência de nucleotídeos contida em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 24.

[009] De acordo com um outro aspecto da invenção, um par de iniciadores nucleotídeos é usado em um processo de detecção de DNA, onde o par iniciador quando usado em um processo de amplificação de ácido nucléico produz um amplicon que contém qualquer uma de SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 4. Detecção de qualquer uma de SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 4 em um amplicon produzido desta maneira é diagnostica para a presença de ácidos nucléicos de planta de milho MON87460 na amostra analisada no processo de detecção. Tais processos compreendem: (a) contato de amostra compreendendo DNAgenômico de MON87460 com um par iniciador DNA; e (b) realização de uma reação de amplificação de ácido nucléico, pelo que produzindo um amplicon, e (c) detecção de amplicon, onde o amplicon compreende SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 4.

[0010] De acordo com um outro aspecto da invenção, processos de detecção de presença de DNA correspondendo especificamente ao DNA de planta de milho MON87460 em uma amostra são providos. Tais processos compreendendo: (a) contato de amostra compreendendo DNA MON87460 com uma sonda DNA compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 4, ou moléculas de DNA substancialmente homólogas a SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 4 que hibridizam sob condições de hibridização rigorosas com DNA genõmico de planta de milho MON87460 e não hibridizam sob condições de hibridização rigorosas com DNA de planta de milho não-MON87460; (b) submissão de amostra e sonda a condições de hibridização rigorosas, e (c) detecção de hibridização da sonda para o DNA de planta de milho MON87460.

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5/70 [0011] De acordo com um outro aspecto da invenção, processos de produção de plantas de milho tolerantes a tensão de déficit de água são providos e compreendem a etapa de cruzamento de uma primeira planta de milho homozigoto parente de evento MON87460 com uma segunda planta de milho homozigoto parente que carece de característica de tolerância a tensão de déficit de água, pelo que produzindo plantas de progênie híbrida tolerantes a tensão de déficit de água. Em certas realizações, um processo de produção de uma planta de milho tolerante a seca compreendendo cruzamento de uma planta de milho primeiro parente tolerante a seca compreendendo uma SEQ ID NO: 1 e uma inserção transgênica heteróloga compreendendo um promotor actina de arroz truncado que está operavelmente ligado a um gene cspB, e uma segunda planta de milho parente, pelo que é provida produção de uma pluralidade de plantas de progênie tolerantes a seca. Em outras realizações, a inserção pode compreender SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 24. [0012] Um outro aspecto da invenção é um processo de determinação de zigosidade da progênie de evento de milho MON87460 usando reações de amplificação de DNA e dois conjuntos de iniciadores. Um primeiro conjunto iniciador é usado para amplificação de MON87460 com DNA e um segundo conjunto iniciador é usado para amplificação de sequência de milho nativa abrangendo o sítio de inserção em DNA genômico de MON87460. Onde o molde para amplificação é uma planta de milho homozigoto para o DNA de MON87460 um amplicon é produzido somente a partir do primeiro conjunto iniciador. Onde o molde para amplificação é uma planta de milho heterozigoto para o DNA de MON87460, amplicons são produzidos de ambos, o primeiro e o segundo conjunto iniciador.

[0013] Também abrangida pela presente invenção é uma semente de milho híbrida compreendendo em seu genoma qualquer uma de SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 4 onde pelo menos um parente no cruzamento

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6/70 usado para criar a dita semente híbrida é MON87460.

[0014] Outras realizações específicas da invenção são mostradas na seguinte descrição detalhada.

Breve Descrição dos Desenhos [0015] A Figura 1 provê um mapa de plasmídeo de pMON73608. [0016] A Figura 2 ilustra a organização genômica da inserção transgene em planta de milho MON87460.

[0017] A Figura 3 provê sequência (SEQ ID NO: 24) do transgene e região de junção de DNA genômico de MON87460. Sequência de DNA flanqueante genômica de milho é mostrada em letras pequenas. Sequência de transgene inserida a partir de pMON73608 é mostrada em letras maiúsculas.

Descrição Detalhada da Invenção [0018] Uma planta de milho transgênica, aqui referida como “MON87460”, ou CspB-Zm Event MON87460” é tolerante a tensão de déficit de água como o resultado de expressão de uma proteína cspB de E. coli em células da dita planta transgênica. Uso do milho tolerante a tensão de déficit de água proporcionará maiores benefícios para plantadores de milho, por exemplo, provendo rendimentos de colheita 510% maiores em acres de terras secas no oeste onde o índice pluviométrico anual médio é insuficiente para suportar um rendimento agriculturalmente efetivo a partir de plantas de milho tipo selvagem. Adicionalmente, plantas de milho MON87460 proporcionam o benefício de seguro contra seca em cinturão de milho central, oeste & do sul através de provimento de maiores rendimentos de colheitas sob condições de seca como comparadas a plantas de milho tipo selvagem. Plantadores de milho também serão beneficiados a partir de economias de custos de irrigação em regiões onde milho tipicamente está crescendo sob irrigação.

[0019] Como aqui usado, “déficit de água” significa um período

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7/70 quando água disponível para uma planta não é re-enchida na taxa na qual é consumida pela planta. Um longo período de déficit de água é coloquialmente chamado seca que pode resultar em perda de uma colheita, mesmo uma colheita permitida com os cromossomas desta invenção. Falta de chuva ou irrigação pode não produzir imediata tensão de água se há um reservatório disponível de água no solo para a taxa de crescimento de plantas. Plantas crescidas em solo com ampla água do solo podem sobreviver dias sem chuva ou irrigação sem efeitos adversos sobre rendimento. Plantas crescidas em solo seco são prováveis de sofrerem efeitos adversos com períodos mínimos de déficit de água. Várias tensões de água podem murchar e matar planta, seca moderada pode causar rendimento reduzido, crescimento interrompido ou desenvolvimento retardado. Plantas podem recuperar-se de alguns períodos de tensão de água sem afetação significante de rendimento. Entretanto, tensão de água no momento de polinização pode ter um efeito irreversível em diminuição de rendimento. Assim, um período útil no ciclo de vida do milho para observação de tolerância de tensão de água é o estágio vegetativo tardio de crescimento antes da retirada de pendões. O teste de tolerância a tensão de água é frequentemente feito através de comparação a plantas controles. Por exemplo, plantas desta invenção podem sobreviver a déficit de água com um maior rendimento que plantas controles. Nos experimentos de laboratório e no campo seca pode ser simulada dando-se a plantas desta invenção e plantas controles menos água que uma planta controle aguda otimamente e medindo as diferenças em características.

[0020] A planta de milho MON87460 foi produzida através de transformação mediada com Agrobacterium de uma linhagem de milho endogâmica com o vetor pMON73608 (Figura 1). Este vetor contém a região codificante cspB regulada pelo promotor actina de arroz, o íntron

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8/70 actin de arroz, e a sequência de poliadenilação tr7 3’, e uma região codificante nptll regulada pelo promotor CaMV 35S, e a sequência de poliadenilação NOS 3’. Eventos gerados a partir do vetor pMON73608 foram caracterizados por detalhadas análises moleculares.

[0021] Um evento transgênico em uma planta ocorre quando DNA recombinante é inserido em uma localização em um cromossoma no núcleo. É estatisticamente improvável que quaisquer dois eventos transgênicos separados possam ser idênticos. Plantas reproduzidas de um específico evento gericamente terão consistência em característica. Nem todos eventos transgênicos proverão semente de planta, plantas, ou núcleos transgênicos desta invenção devido a uma variedade de fatores como a localização, número de cópias e integridade do DNA recombinante no cromossoma, inserção não-pretendida de outro DNA etc. Como um resultado um desejado evento transgênico é identificado por separação, a planta transformada ou semente da mesma de progênie para aperfeiçoada tolerância a déficit de água.

[0022] A expressão de genes estranhos em plantas é conhecida ser influenciada por sua posição cromossomal, talvez devido a estrutura cromatina (por exemplo, heterocromatina) ou a proximidade de elementos de regulação transcricionais (por exemplo, aperfeiçoadores) próximos do sítio de integração (Weising et al., Ann. Ver. Genet. 22:421-477, 1988). Por esta razão, é frequentemente necessário separar um grande número de plantas de modo a identificar-se uma planta caracterizada por ótima expressão de um gene de interesse introduzido. Por exemplo, foi observado em plantas e em outros organismos que pode haver uma ampla variação em níveis de expressão de um transgene introduzido entre plantas. Também podem existir diferenças em padrões espaciais ou temporais de expressão, por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transgene em vários tecidos de plantas, que podem não corPetição 870180046639, de 30/05/2018, pág. 13/83

9/70 responder aos padrões esperados de elementos reguladores transcricionais presentes na construção de gene introduzida. Uma planta que tem desejados níveis ou padrões de expressão de transgene é útil para introdução de transgene em outros fundos genéticos através de cruzamento sexual usando processos convencionais de cultivo. Progênies de tais cruzamentos mantêm as características de expressão de transgene do transformante original. Esta estratégia é usada para assegurar confiável expressão de gene em um número de variedades que são bemadaptadas a condições locais de crescimento e demandas de mercado. [0023] Eventos gerados por transformação com pMON73608 foram selecionados para número de inserções (número de sítios de integração dentro de genoma de milho), número de cópias (o número de cópias do T-DNA dentro de um lócus), a integridade dos cassetes inseridos e a ausência de sequência de cadeia principal usando análises Southern blot. Sondas incluíram as regiões codificantes cspB e nptll intactas e seus respectivos promotores, íntrons, e sequências de poliadenilação e a cadeia principal de plasmídeo vetor. A partir de aproximadamente 140 transformantes iniciais, eventos foram selecionados baseados no número de cópias e análise de cadeia principal para analise fenotípica para identificar plantas tendo um fenótipo aperfeiçoado a partir de expressão de cspB. Resultados de um teste baseado em estufa para tolerância de déficit de água, identificaram um número de transformantes independentes tendo tolerância a déficit de água. Testes de campo de 22 transformantes selecionados para tolerância a déficit de água sob condições de crescimento no campo resultaram na identificação de 10 eventos aperfeiçoados que foram ainda testados para tolerância a déficit de água e aperfeiçoamento de rendimento e estabilidade. Resultados destas análises ainda identificaram MON87460 como tendo fenótipos aperfeiçoados superiores. Extensiva caracterização molecular de MON87460 demonstrou que o evento contém uma única inserção de tPetição 870180046639, de 30/05/2018, pág. 14/83

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DNA com uma cópia de ambos cassetes cspB e nptll. Análises northern blot confirmaram que os transcritos de tamanho esperado para ambos cspB e nptll são gerados em MON87460. Os dados também demonstram surpreendentemente que o fragmento de borda direita de Agrobacterium não está presente em MON87460 e que uma truncação do promotor actina de arroz regulando expressão do gene cspB ocorreu de modo que somente 108 bp (de 844 bp presentes em pMON73608) do DNA promotor estão presentes.

[0024] Análises PCR e de sequência de DNA foram realizadas para determinar a inserção 5’ e 3’ para junções de genoma de planta, confirmam a organização dos elementos dentro de inserção (Figura 2), e determinam a completa sequência de DNA da inserção na planta de milho MON87460 (SEQ ID NO: 5). Análises confirmaram que o T-DNA em planta em MON87460 é idêntico à sequência correspondente de pMON73608. Análises de sequências também identificaram 1060 pb de sequência flanqueante 5’ e 1260 pb de sequência flanqueante 3’ para a inserção MON87460. Comparação à sequência de DNA tipo selvagem da linhagem endogâmica usada para transformação mostrou que uma supressão de 22 pb de DNA genômico de milho ocorreu no sítio de integração do T-DNA de MON87460.

[0025] É vantajoso ser capaz de detectar a presença de DNA genômico / transgene de MON87460 de modo a determinar se progênie de um cruzamento sexual contém o DNA transgene / genômico de interesse. Em adição, um processo para detecção de MON87460 é útil quando cumpre com regulações requerendo a aprovação pré-mercado e rotulação de alimentos derivados de plantas de colheita recombinantes. É possível detectar a presença de um transgene através de qualquer processo de detecção de ácido nucleico bem-conhecido tal como a reação de cadeia polimerase (PCR) ou hibridização de DNA usando sondas de polinucleotídeos. Estes processos de detecção geralmente

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11/70 usam iniciador DNA e moléculas sondas que são específicas para os elementos genéticos, tais como promotores, líderes, introns, regiões codificantes, terminadores de transcrição 3’, genes marcadores etc., que são os componentes dos transgenes de uma construção de DNA. Tais processos podem não ser úteis para discriminação entre diferentes eventos transgênicos, particularmente aqueles produzidos usando a mesma construção de DNA transgene a menos que a sequência de DNA genômico adjacente ao DNA transgene inserido seja conhecida. A presente invenção provê sequências e ensaios para detecção das novas junções de borda de DNA genômico / transgene de MON87460. [0026] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados têm o mesmo significado como comumente entendido por aqueles versados na técnica à qual esta invenção pertence. Geralmente, a nomenclatura usada e os procedimentos de fabricação ou laboratório descritos abaixo são bem-conhecidos e comumente empregados na técnica. Processos convencionais são usados para estes procedimentos, tais como aqueles providos na técnica e várias referências genéricas. A menos que estabelecido de outro modo, sequências de ácidos nucléicos no texto deste relatório descritivo são dadas, quando lidas da esquerda para direita, na direção 5’ para 3’. Sequências de ácidos nucléicos podem ser providas como DNA ou RNA, como especificado; descrição de um necessariamente define o outro, como é conhecido por aqueles versados na técnica. Além disso, descrição aqui de uma dada sequência de ácidos nucléicos necessariamente define sua sequência complementar, como é conhecido por aqueles versados na técnica. Onde um termo é provido no singular, os inventores também contemplam aspectos da invenção descritos pelo plural daquele termo. A nomenclatura usada e os procedimentos de laboratório descritos abaixo são aqueles bem-conhecidos e comumente empregados na técnica. Onde existem discrepâncias em termos e definições usadas em

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12/70 referências que são incorporadas por referência, os termos usados neste pedido de patente devem ter as definições dadas. Outros termos técnicos usados têm seus significados comuns na técnica onde eles são usados, como exemplificados por uma variedade de dicionários técnicos. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1991; e Lewin, Genes V, Oxford University Press, New York, 1994.

[0027] Como aqui usado, o termo “milho” significa Zea mays e inclui todas as variedades de plantas que podem ser reproduzidas com planta de milho MON87460.

[0028] Um “evento” transgênico é produzido por transformação de células de planta com DNA heterólogo, isto é, uma construção de ácido nucleico que inclui um transgene de interesse, regeneração de uma população de plantas resultantes da inserção do transgene no genoma da planta, e seleção de uma planta particular caracterizada por inserção em uma particular localização de genoma. Progênie transgênica tendo o mesmo núcleo com cromossomas heterozigotos ou homozigotos para o DNA recombinante são ditas para representar o mesmo evento transgênico. Uma vez um transgene para uma característica tenha sido introduzido em uma planta, este gene pode ser introduzido em qualquer planta sexualmente compatível com a primeira planta por cruzamento, sem a necessidade de transformação direta de segunda planta. O DNA heterólogo e sequência genômica flanqueante adjacente ao Dna inserido serão transferidos para progênie quando o evento é usado em um programa de multiplicação e a característica aperfeiçoada resultante da incorporação do DNA heterólogo no genoma de planta será mantida em progênie que recebe o DNA heterólogo.

[0029] O termo “evento”também refere-se à presença de DNA do

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13/70 transformante original, compreendendo o DNA inserido e sequência genômica flanqueante imediatamente adjacente ao DNA inserido, em uma progênie que recebe DNA inserido incluindo o transgene de interesse como o resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e progênie resultante da polinização) e uma linhagem parental que não contém o DNA inserido. O termo “progênie” representa a descendência de qualquer geração de uma planta parente preparada de acordo com a presente invenção. Um “evento” transgênico assim pode ser de qualquer geração. O termo “evento” refere-se ao transformante original e progênie do transformante que inclui o DNA heterólogo. O termo “evento” também refere-se a progênie produzida por um cruzamento sexual da mesma espécie entre o transformante e uma outra variedade que inclui o DNA heterólogo. Mesmo após repetido retrocruzamento para um parente recorrente, o DNA inserido e DNA flanqueante do parente transformante estão presentes na progênie do cruzamento na mesma localização cromossômica.

[0030] A presente invenção refere-se ao DNA de evento MON87460, células de planta, tecidos, sementes e produtos processados derivados de MON87460. Plantas de milho MON87460 podem ser autopolinizadas para produção de linhagens endogâmicas que são homozigoto para os polinucleotídeos de MON87460. A semente homozigoto pode ser cultivada para produzir progênie homozigoto de plantas de milho de evento MON87460 para cruzamento com outras plantas de milho endogâmicas para produção de semente de milho híbrido heterozigoto. Semente de milho híbrido MON87460 pode ser cultivada para plantas de milho híbrido que exibem tolerância a déficit de água e aperfeiçoado rendimento sob condições de tensão comparadas a plantas controles.

[0031] Produtos que podem ser derivados de MON87460 incluem

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14/70 alimentos e mercadorias produzidas de evento de milho MON87460. Tais alimentos e mercadorias são esperados conter polinucleotídeos que, se detectados em níveis suficientes são diagnósticos para a presença de materiais de evento de milho MON87460 dentro de tais mercadorias e alimentos. Exemplos de tais alimentos e mercadorias incluem, mas não são limitados a óleo de milho, refeição de milho, farinha de milho, glúten de milho, tortas de milho, amido de milho, e qualquer outro produto pretendido para consumo como uma fonte de alimento por um animal ou de outro modo, pretendido como um agente de volume, ou pretendido como um componente em uma composição de maquiagem para uso cosmético etc.

[0032] Também é para ser entendido que duas diferentes plantas transgênicas podem ser acasaladas para produção de descendência que contém dois genes exógenos, adicionados segregando independentemente. Polinização apropriada progênie pode produzir plantas que são homozigoto para ambos genes exógenos adicionados. Alternativamente, linhagens endogâmicas contendo os genes exógenos individuais podem ser cruzadas para produção de semente híbrida que é heterozigoto para cada gene, e útil para produção de plantas de milho híbrido que exibem múltiplos fenótipos benéficos como o resultado de expressão de cada um dos genes exógenos. Descrições de processos de multiplicação que são comumente usados para diferentes características e colheitas podem ser encontradas em várias referências, por exemplo, Allard, “Principies of Plant Breeding”, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98, 1960; Simmonds, “Principies of Crop Improvement,” Longman, Inc., NY, 369-399, 1979; Sneep and Hendriksen, “Plant Breeding Perspectives,” Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation, 1979. De particular interesse na presente invenção é o desenvolvimento de plantas de milho de evento

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ΜΟΝ87460 que expressam proteína cspB e uma proteína 5-enolpiruvilshikimate-3-fosfato sintase (CP4 EPSPS) resistente a glifosato (patente US 5 633 435) de Agrobacterium sp. linhagem CP4 que confere à planta tolerância a glifosato. “Glifosato” refere-se a N-fosfonometilglicina e seus sais. N-fosfonometilglicina é um herbicida bem-conhecido que tem atividade sobre um amplo espectro de espécies de plantas. Glifosato é o ingrediente ativo de Roundup® (Monsanto Co.), um herbicida seguro tendo uma meia - vida desejavelmente curta no ambiente. Glifosato é o ingrediente ativo de herbicida Roundup® (Monsanto Co.). Tratamentos com “herbicida glifosato” refere-se a tratamentos com herbicida Roundup®, Roundup Ultra®, Roundup Pro® ou qualquer outra formulação herbicida contendo glifosato. Exemplos de formulações comerciais de glifosato incluem, sem restrição, aquelas vendidas por Monsanto Company como herbicidas ROUNDUP®, ROUNDUP ULTRA® ROUNDUP ULTRAMAX®, ROUNDUP WEATHERMAX®, ROUNDUP CT®, ROUNDUP EXTRA®, ROUNDUP BIACTIVE®, ROUNDUP BIOFORCE®, RODEO®, POLARIS, SPARK® e ACCORD®, todos os quais contêm glifosato como seu sal de isopropil amônio; aqueles vendidos por Monsanto Company como herbicidas ROUNDUP® DRY e RIVAL®, que contêm glifosato como seu sal de amônio; aquele vendido por Monsanto Company como ROUNDUP® GEOFORCE, que contém glifosato como seu sal de sódio; e aquele vendido por Syngenta Crop Protection como herbicida TOUCHDOWN®, que contém glifosato como seu sal de trimetil sulfônio. Quando aplicado a uma superfície de planta, glifosato move-se sistemicamente através da planta. Glifosato é fitotóxico devido a sua inibição do caminho de ácido shikimico, que provê um precursor para a síntese de aminoácidos aromáticos. Glifosato inibe a enzima 5enolpiruvil-3-fosfoshikimate sintase (EPSPS) encontrada em plantas. Tolerância a glifosato pode ser obtida através de expressão de variantes de EPSPS bacterianas e variantes de EPSPS de plantas que têm menor

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16/70 afinidade para glifosato e por isso retêm sua atividade catalítica na presença de glifosato (patentes US 5 633 435, 5 094 945, 4 535 060 e 6 040 497).

[0033] Como aqui usado quando referindo-se a uma “molécula de DNA isolada”, é pretendido que a molécula de DNA seja uma que está presente, sozinha ou em combinação com outras composições, mas não dentro de seu ambiente natural. Por exemplo, uma sequência codificante, sequência íntron, sequência líder não-traduzida, sequência promotora, sequência de terminação transcricional, e semelhantes, que são naturalmente encontradas dentro de DNA de um genoma de milho não são consideradas serem isoladas do genoma de milho na medida em que elas estão dentro de genoma de milho. Entretanto, cada um destes componentes, e sub-partes destes componentes, pode ser “isolado” dentro do escopo desta descrição tanto quanto as estruturas e componentes não estejam dentro do genoma de milho.

[0034] Para os propósitos desta descrição, qualquer sequência de nucleotídeos transgênica, isto é, a sequência de nucleotídeos do DNA inserido no genoma das células do evento de planta de milho MONJ87460 pode ser considerada ser uma sequência de nucleotídeos isolada se ela está presente dentro de plasmídeo usado para transformar células de milho das quais surgiu o evento MON87460, dentro de genoma do evento MON87460, presente em quantidades detectáveis em tecidos, progênie, amostras biológicas ou produtos mercadorias derivados de evento mON87460. A sequência de nucleotídeos ou qualquer fragmento derivado da mesma pode ser considerado ser isolado ou isolável se a molécula de DNA pode ser extraída das células, ou tecidos, ou homogeneizado de uma planta ou semente ou órgão de planta; ou pode ser produzido como um amplicon a partir de DNA ou RNA extraído das células, tecidos, ou homogeneizados de uma planta ou semente ou órgão de planta, qualquer um dos quais é derivado de

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17/70 tais materiais derivados do evento MON87460. Para esta questão, a sequências de junção como mostradas em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO:2, e sequências de nucleotídeos derivadas de evento MON87460 que também contêm estas sequências de junção são consideradas serem isoladas ou isoláveis, se estas sequências estão presentes dentro de genoma das células de evento MON87460 ou presentes em quantidades detectáveis em tecidos, progênie, amostras biológicas ou produtos mercadorias derivados do evento MON87460.

[0035] Como aqui usado, uma junção transgene / genômica é o ponto no qual DNA heterólogo de um vetor de transformação que é inserido no genoma está ligado ao DNA genômico de planta de milho. Um polinucleotídeo de junção abrange a junção transgene / genômica, e é novo em qualquer particular evento de planta transgênica. Assim, detecção de um polinucleotídeo de junção em uma amostra biológica é diagnostica para a presença de um específico evento de planta. Na presente invenção, a presença de polinucleotideos de junção de SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 4 em uma amostra é diagnostica para a presença de DNA de MON87460 em uma amostra.

[0036] Uma “sonda” é um polinucleotídeo ao qual está ligado uma convencional molécula repórter ou etiqueta detectável, por exemplo, um isótopo radioativo, ligante, agente quimioluminescente, ou enzima. Sondas são complementares para uma fita de um ácido nucleico alvo, no caso da presente invenção, para uma fita de DNA genômico de MON87460, se de uma planta MON87460 ou de uma amostra que inclui DNA MON87460. Sondas de acordo com a presente invenção incluem não somente ácidos desoxirribonucleico ou ribonucleico, mas também poliamidas e outros materiais de sondas que se ligam especificamente a uma sequência de DNA alvo e podem ser usados para detecção de presença daquela sequência de DNA alvo.

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18/70 [0037] Iniciadores DNA são polinucleotídeos isolados que são anelados para uma fita de DNA alvo complementar através de hibridização de ácido nucleico para formação de um híbrido entre o iniciador e a fita de DNA alvo, então estendida junto com a fita de DNA alvo por uma polimerase, por exemplo, uma DNA polimerase. Um par de iniciadores DNA ou um conjunto iniciador DNA da presente invenção refere-se a dois iniciadores DNA úteis para amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo, por exemplo, através de reação de cadeia polimerase (PCR) ou outros processos de amplificação de polinucleotídeo convencionais.

[0038] Sondas de DNA e iniciadores de DNA são geralmente de 11 polinucleotídeos ou mais em comprimento, frequentemente 18 polinucleotídeos ou mais, 24 polinucleotídeos ou mais, 30 polinucleotídeos ou mais. Tais sondas e iniciadores são selecionados para serem de comprimento suficiente para hibridização específica para uma sequência alvo sob condições de hibridização de alta rigorosidade. Preferivelmente, sondas e iniciadores de acordo com a presente invenção têm completa identidade de sequência com a sequência alvo, embora sondas diferindo da sequência alvo que retenham a habilidade para hibridizar para sequências alvos possam ser designadas através de processos convencionais.

[0039] Processos para preparação e uso de sondas de polinucleotídeo e iniciadores são descritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (daqui por diante, “Sambrook et al., 1989”); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York, 1992 (com atualizações periódicas) (daqui por diante, “Ausubel et al., 1992”); e Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, academic Press: San Diego, 1990. Pares iniciadores de DNA de

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PCR podem ser derivados a partir de uma sequência conhecida, por exemplo, através do uso de programas de computador pretendidos para este propósito como Primer (Version 0.5,C 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, cambridge, MA).

[0040] Sondas de ácidos nucléicos e iniciadores da presente invenção hibridizam sob condições rigorosas a uma molécula de DNA alvo. Qualquer processo convencional de amplificação ou hibridização de ácido nucleico pode ser usado para identificar a presença de DNA de uma planta transgênica em uma amostra. Moléculas de ácido polinucleico, também referidas como segmentos de ácido nucleico, ou seus fragmentos são capazes de hibridizarem especificamente para outras moléculas de ácido nucleico sob certas circunstâncias. Como aqui usado, duas moléculas de ácido polinucleico são ditas serem capazes de hibridizarem especificamente uma para outra se as duas moléculas são capazes de formar uma estrutura de ácido nucleico de fita dupla, antiparalelas. Uma molécula de ácido nucleico é dita ser o “complemento” de uma outra molécula de ácido nucleico se elas exibem completa complementaridade. Como aqui usado, moléculas são ditas exibirem “completa complementaridade” quando todo nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são ditas serem “minimamente complementares” se elas podem hibridizar uma a outra com suficiente estabilidade para permitir que as mesmas permaneçam aneladas uma à outra sob pelo menos condições de “baixa rigorosidade”. Similarmente, as moléculas são ditas serem “complementares” se elas podem hibridizar uma à outra com suficiente estabilidade para permitir que as mesmas permaneçam aneladas uma à outra sob convencionais condições de “alta rigorosidade”. Convencionais condições de rigorosidade são descritas por Sambrook et al., 1989, e por Haymesetal., In: NucleicAcid Hybridization, A Practical Approach,

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IRL Press, Washington, DC (1985). Fugas de completa complementaridade por isso são permissíveis, tanto quanto tais fugas não impeçam completamente a capacidade das moléculas formarem uma estrutura de fita dupla. De modo que uma molécula de ácido nucleico sirva como um iniciador ou sonda ela precisa somente ser suficientemente complementar em sequência para ser capaz de formar uma estrutura de fita dupla estável sob as particulares concentrações de solvente e sal empregadas.

[0041] Como aqui usada, uma sequência substancialmente homóloga é uma sequência de ácido nucleico que especificamente hibridizará para o complemento da sequência de ácido nucleico à qual ela está sendo comparada sob condições de alta rigorosidade. Apropriadas condições de rigorosidade que promovem hibridização de DNA, por exemplo, 6,0 x cloreto de sódio / citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido por lavagem de 2,0 x SSC a 50°C, são conhecidas por aqueles versados na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma baixa rigorosidade de cerca de 2,0 x SSC a 50°C a uma alta rigorosidade de cerca de 0,2 x SSC a 50°C. Em adição, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada a partir de condições de baixa rigorosidade em temperatura ambiente, cerca de 22°C, para condições de alta rigorosidade em cerca de 65°C. Ambos, temperatura e sal podem ser variados, ou tanto a temperatura como a concentração de sal pode ser mantida constante enquanto a outra variável é alterada. [0042] Em uma realização preferida, um polinucleotídeo da presente invenção hibridizará especificamente para uma ou mais das moléculas de ácido nucleico mostradas em SEQ ID Nos: 1 - 7 ou seus complementos ou fragmentos sob condições moderadamente rigorosas, por exemplo, em cerca de 2,0 x SSC e cerca de 65°C. Em uma

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21/70 realização particularmente preferida, um ácido nucleico da presente invenção hibridizará especificamente para uma ou mais das moléculas de ácido nucleico mostradas em SEQ ID Nos: 1 - 7 ou seus complementos ou fragmentos sob condições de alta rigorosidade.

[0043] Como aqui usado, “DNA amplificado” ou “amplicon” referese aos polinucleotídeos que são sintetizados usando técnicas de amplificação, como PCR. O termo “amplicon” como aqui usado especificamente exclui dímeros iniciadores que podem ser formados em uma reação de amplificação de DNA.

[0044] Com relação a amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo (por exemplo, através de PCR) usando um particular par iniciador de amplificação, “condições rigorosas” são condições que permitem ao par iniciador hibridizar somente para a sequência de ácido nucleico alvo para a qual um iniciador tendo a correspondente sequência tipo selvagem (ou complemento do mesmo) pode se ligar e preferivelmente produzir um produto de amplificação único, o amplicon, em uma reação de amplificação térmica de DNA.O termo “específico para (uma sequência alvo)” indica que uma sonda ou iniciador hibridiza sob condições de hibridização rigorosas somente para a sequência alvo em uma amostra compreendendo a sequência alvo.

[0045] Um membro de um par iniciador derivado de uma sequência genômica de planta adjacente ao DNA de inserção de transgene está localizado a uma distância da sequência de DNA inserida, esta distância pode variar de um par de bases nucleotídeos até cerca de vinte mil pares de bases nucleotídeos. Similarmente, um membro de um par iniciador derivado de um DNA de inserção de transgene está localizado a uma distância da junção de sequência genômica de planta, esta distância pode variar de um par de bases nucleotídeos até cerca de inteiro comprimento da inserção de transgene. O amplicon pode variar em comprimento a partir do comprimento combinado do par iniciador mais

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22/70 um par de bases de nucleotídeos, mas é preferivelmente cerca de cinquenta pares de bases de nucleotídeos ou mais, por exemplo, até 500 ou mesmo 1000 nucleotídeos em comprimento. Amplicons de menor tamanho em geral são mais confiavelmente produzidos em reações PCR, permitem tempos de ciclos mais curtos e podem ser facilmente separados e visualizados sobre géis agarose ou adaptados para uso em ensaios TaqMan, como TaqMan de tempo real e de ponto final. Alternativamente, um par iniciador pode ser derivado de sequência genômica sobre ambos os lados do DNA heterólogo inserido de modo a produzir um amplicon que inclui a inteira sequência de polinucleotídeos de inserção (por exemplo, um iniciador para frente isolado de SEQ ID NO: 5 e um iniciador reverso isolado de SEQ ID NO: 6 que amplifica uma molécula de DNA compreendendo o fragmento de DNA de pMON73608 que foi inserido no genoma de MON87460, a inserção compreendendo cerca de 3309 nucleotídeos (SEQ ID NO: 7), mostrada como letras maiúsculas na Figura 3.

[0046] Para determinar se uma planta de milho resultante de um cruzamento sexual contém DNA genômico de planta transgênica da planta de milho MON87460 da presente invenção, DNA que é extraído de uma amostra de tecido de planta de milho é submetido a um processo de amplificação de polinucleotídeo usando um par iniciador que inclui um primeiro iniciador derivado de sequência de DNA no genoma da planta MON87460 adjacente ao sítio de inserção do DNA heterólogo inserido (DNA transgene), e um segundo iniciador derivado do DNA heterólogo inserido para produzir um amplicon que é um diagnóstico para a presença do DNA de planta MON87460. O amplicon diagnóstico é de um específico comprimento dependendo da localização dos iniciadores, e compreende uma sequência de polinucleotídeos de junção específica que é diagnóstico para o específico DNA genômico de evento de planta.

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A presença da sequência de polinucleotídeos de junção em um amplicon pode ser determinada, por exemplo, através de seqüenciamento de DNA de amplicon ou através de híbridização com uma sonda específica. Na presente invenção, a sequência de DNA do amplicon diagnóstico para a presença do MON87460 compreende SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2. Mais especificamente, em uma realização da presente invenção, um amplicon diagnóstico para a presença do MON87460 é de 68 nt em comprimento e compreende SEQ ID NO: 2, e pode ser detectado por híbridização com uma sonda marcada compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 16.

[0047] Amplificação de polinucleotídeo pode ser realizada através de qualquer um dos vários processos de amplificação conhecidos na técnica, incluindo a reação de cadeia polimerase (PCR). Processos de amplificação são conhecidos na técnica e são descritos, inter alia, em patentes US Ν'*⁵ 4 683 195 e 4 683 202 e em PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, etd. Innis et al., Academic Press, SanDiego, 1990. Processos de amplificação PCR foram desenvolvidos para amplificar até 22 kb (quilobase) de DNA genômico e até 42 kb de DNA bacteriófago (Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:5695-5699, 1994). Estes processos assim como outros processos conhecidos na técnica de amplificação de DNA podem ser usados na prática da presente invenção. A sequência da inserção de DNA heterólogo ou sequência de DNA genômico flanqueante de MON87460 pode ser verificada (e corrigida se necessário) através de amplificação de tais moléculas de DNA a partir da semente de MON87460 ou plantas crescidas da semente depositada com ATCC tendo n° de acesso PTA-8910, usando iniciadores derivados das sequências aqui providas, seguido por sequenciamento de DNA padrão do amplicon de PCR ou fragmentos de DNA clonados do mesmo.

[0048] Kits de detecção de DNA que são baseados em processos

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24/70 de amplificação de DNA contém moléculas iniciadoras de DNA que hibridizam especificamente para um DNA alvo e amplificam um amplicon diagnóstico sob as apropriadas condições de reação. Qualquer comprimento de amplicon produzido a partir de DNA de MON87460 onde o amplicon compreende SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 é um aspecto da invenção. Aqueles versados na técnica reconhecerão que as moléculas de primeiro e segundo iniciador de DNA não são requeridas consistirem somente em DNA mas também podem ser compreendidas exclusivamente de RNA, uma mistura de DNA e RNA, ou uma combinação de DNA, RNA, ou outros nucleotídeos ou seus análogos que não atuam como moldes para uma ou mais polimerases. Em adição, aqueles versados na técnica reconhecerão que uma sonda ou um iniciador como aqui mostrado deve ser pelo menos de cerca de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, e 20 nucleotídeos consecutivos em comprimento e selecionado do grupo de nucleotídeos como mostrado em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3 (arbitrariamente designados junção 5’), SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4 (arbitrariamente designados junção 3’), SEQ ID NO: 5 (arbitrariamente designada sequência flanqueante 5’), SEQ ID NO: 6 (arbitrariamente designada sequência flanqueante 3’), θ SEQ ID NO: 7 (sequência de transgene inserida). Sondas e iniciadores pelo menos de cerca de 21 a cerca de 50 ou mais nucleotídeos consecutivos em comprimento são possíveis quando selecionados do grupo de nucleotídeos como mostrados em SEQ ID NO:5 até SEQ ID NO: 7.

[0049] O kit pode prover um processo de detecção baseado em gel agarose ou qualquer número de processos de detecção de amplicon diagnóstico que são conhecidos na técnica. Um kit que contém iniciadores DNA que são homólogos ou complementares para qualquer porção da região genômica de milho de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 e para qualquer porção da região de inserção de transgene de SEQ ID NO: 7

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25/70 é um objeto da invenção. Especificamente identificado como par iniciador útil em um processo de amplificação de DNA são SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9 que amplificam um amplicon diagnóstico homólogo a uma porção da região 5’ transgene / genoma de MON87460, onde o amplicon compreende SEQ ID NO: 2. Outras moléculas de DNA úteis como iniciadores de DNA podem ser selecionadas da sequência de DNA transgene / genômica mostrada de MON87460 por aqueles versados na técnica de amplificação DNA.

[0050] O amplicon diagnóstico produzido por estes processos pode ser detectado através de uma pluralidade de técnicas. Um tal processo é Genetic Bit Analysis (Nikiforov, et al. Nucleic Acid Res. 22:4167-4175) onde um oligonucleotídeo DNA é projetado que sobrepõe ambas, a sequência de DNA genômico flanqueante adjacente e a sequência de DNA inserida. O oligonucleotídeo é imobilizado em cavidades de uma placa de microtitulação. Seguindo PCR da região de interesse (usando um iniciador da sequência inserida e um na sequência genômica flanqueante adjacente), um produto de PCR de fita única pode ser hibridizado para o oligonucleotídeo imobilizado e servir como um molde para uma reação de extensão de base única usando uma DNA polimerase e dideoxinucleotídeo trifosfatos marcados (ddNTPs) específicos para a base seguinte esperada. Leitura pode ser fluorescente ou baseada em ELISA. Um sinal indica presença da sequência de transgene / genômica devido a amplificação bem sucedida, hibridização, e extensão de base única.

[0051] Um outro processo é a técnica de piro-sequenciamento como descrita por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). Neste processo um oligonucleotídeo é projetado que sobrepõe a junção de DNA de inserção e DNA genômico adjacente. O oligonucleotídeo é hibridizado para produto de PCR de fita única a partir de região de interesse (um iniciador na sequência inserida e um na sequência genômica

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26/70 flanqueante) e incubado na presença de uma DNA polimerase, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5’ fosfossulfato e luciferina. DNTPs são adicionados individualmente e a incorporação resulta em um sinal de luz que é medido. Um sinal de luz indica a presença da sequência de transgene / genômica devido a amplificação bem sucedida, hibridização, e extensão de base simples ou múltipla.

[0052] Polarização de fluorescência como descrita por Chen, et al., (Genome Res. 9.492-498, 1999) é um processo que pode ser usado para detectar o amplicon da presente invenção. Usando este processo um oligonucleotídeo é projetado que sobrepõe a junção de DNA inserido e flanqueante genõmico. O oligonucleotídeo é hibridizado para produto de PCR de fita simples a partir da região de interesse (um iniciador no DNA inserido e um na sequência de DNA genõmico flanqueante ) e incubado na presença de uma DNA polimerase e um ddNTP marcado fluorescente. Extensão de base simples resulta em incorporração da ddNTP. Incorporação pode ser medida como uma mudança em polarização usando um fluorímetro. Uma mudança em polarização indica a presença da sequência de transgene / genômica devido a bem sucedida amplificação, hibridização, e extensão de base simples.

[0053] Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) é descrito como um processo de detecção e quantificação de presença de uma sequência de DNA e é inteiramente descrito nas instruções providas pelo fabricante. Em suma, uma sonda oligonucleotídeo FRET (transferência de energia de ressonância de fluorescência) é projetada que sobrepõe a junção de DNA de inserção e flanqueante genõmico. A sonda FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserção e um na sequência genômica flanqueante) são ciclados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Hibridização da sonda FRET resulta em clivagem e liberação da metade fluorescente, tal como 6FAM® e VIC®, fora do corante de resfriamento, tal como

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TAMRA (tetra metil-6-carboxirodamina) para sondas convencionais, ou compostos ligantes de ranhura menor não-fluorescentes para sondas MGB. Com sondas TAMRA ou MGB, a polimerase cliva sonda ligada durante PCR, separando o fluoróforo e resfrigerante para a extensão que FRET não pode ocorrer, e um sinal fluorescente indica a presença da sequência de transgene / genômica.

[0054] Molecular Beacons foram descritos para uso em detecção de sequência como descrito em Tyangi, et al. (NAture Biotech. 14, 303-308, 1996). Em suma, uma sonda oligonucleotídeo FRET é projetada que sobrepõe a junção de DNA de inserção e genômico flanqueante. A estrutura única da sonda FRET resulta na mesma contendo estrutura secundária que mantem as metades fluorescentes e de resfriamento em proximidade. A sonda FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA inserida e um na sequência genômica flanqueante) são ciclados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Seguindo amplificação PCR bem-sucedida, hibridização da sonda FRET para a sequência alvo resulta na remoção da estrutura secundária de sonda e separação espacial das metades fluorescente e extinto (quencher). Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserção transgene / flanqueante devido a bem sucedida amplificação e hibridização.

[0055] Outros processos descritos, tais como microfluidos (publicação de patente US 2006068398, patente US 6 544 734) podem ser usados para separar a amplificar amostras de DNA. Corantes óticos são usados para detectar e quantificar específicas moléculas de DNA (WO/05017181). Dispositivos de nanotubos foram descritos (WO/06024023) que compreendem um sensor eletrônico para a detecção de moléculas de DNA ou nanopérolas que ligam específicas moléculas de DNA.

[0056] Kits de detecção de DNA podem ser desenvolvidos usando

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28/70 as composições aqui mostradas e os processos bem-conhecidos na técnica de detecção de DNA. Os kits são úteis para a identificação de DNA de planta de milho MON87460 em uma amostra e podem ser aplicados e processos para multiplicação de plantas de milho contendo DNA de MON87460. Um kit contém moléculas de DNA que são úteis como iniciadores ou sondas que são homólogas ou complementares a pelo menos uma porção de SEQ ID NO: 1 - 7. As moléculas de DNA podem ser usadas em processo de amplificação de DNA (PCR) ou como sondas em processos de hibridização de ácido nucleico tais como análises Southern e análises Northern.

[0057] Em um outro aspecto da presente invenção, um polinucleotídeo preferido da presente invenção que é um diagnóstico para a presença de DNA MON87460 tem a sequência mostrada em SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 25. SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 4 e maiores polinucleotídeos de junção genômica / transgene, tais como aqueles em SEQ ID Nos: 5-7 também podem ser usados como marcadores em processos de multiplicação de plantas para identificação de progênie de cruzamentos genéticos similares aos processos descritos para análises de marcador de DNA de repetição de sequência simples, em DNA markers: Protocols, applications, e overviews: (1997) 173-185, Cregan et al., eds., Wiley-Liss, NY. A hibridização da sonda para a molécula de DNA alvo pode ser detectada através de qualquer número de processos conhecidos por aqueles versados na técnica, estes podem incluir, mas não são limitados a, etiquetas fluorescentes, etiquetas radioativas, etiquetas baseadas em anticorpo, e etiquetas quimioluminescentes. Um um outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico marcadora preferida da presente invenção compartilha entre 80% e 100% ou 90% e 100% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico mostrada em SEQ ID NO: 1 até SEQ

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ID NO: 7 ou seus complementos ou seus fragmentos. Ainda em um aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico marcadora preferida da presente invenção compartilha entre 95% e 100% de identidade de sequência com uma sequência mostrada em SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 7 ou seus complementos ou fragmentos.

[0058] Plantas de milho tolerantes a déficit de água que carecem de um gene marcador selecionável ou carece de um gene marcador selecionável intacto também são aqui providas. Tais plantas podem ser obtidas através de processos que compreendem descrição de um cromossoma de milho compreendendo uma inserção de transgene heterólogo que confere tolerância a déficit de água e um gene marcador selecionável para um ou mais agenets induzindo recombinação e selecionando uma planta de milho compreendendo uma inserção de transgene heterólogo que confere tolerância a déficit de água onde o gene marcador selecionável foi completa ou parcialmente eliminado ou onde o gene marcador selecionável foi interrompido. Inserções de transgene heterólogo que conferem tolerância a déficit de água e contêm um marcador selecionável incluem, mas não são limitadas a, inserções compreendendo SEQ ID NO: 7 ou inserções compreendendo SEQ ID NO: 1, um promotor actina de arroz truncado que está operativamente ligado a um gene cspB, um gene marcador selecionável, e SEQ ID NO: 2. Cromossomas de milho que compreendendo uma inserção de transgene heterólogo que confere tolerância a déficit de água e um gene marcador selecionável também incluem, mas não são limitados a, um cromossoma de milho que compreende SEQ ID NO: 24, um cromossoma de milho de uma planta de milho tendo sido depositada sob número de acesso ATCC PTA-8910 (ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA, USA), e sua progênie. Inserções de transgene heterólogo que conferem tolerância a déficit de água incluem , mas não são limitadas a, inserções compreendendo SEQ ID NO: 1 e um promotor actina de arroz truncado

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30/70 que sta operavelmente ligado a um gene cspB assim como inserções compreendendo SEQ ID NO: 1 e um promotor actina de arroz truncado que está operavelmente ligado a um gene cspB onde um terminus 5’ da inserção sobrepõe um terminus 3’ de SEQ ID NO: 1.

[0059] A frase “ligado operavelmente” como aqui usada refere-se à ligação de sequências de ácido nucleico de modo que uma sequência pode prover uma requerida função para uma sequência ligada. No contexto de um promotor, “ligado operavelmente” significa que o promotor está conectado a uma sequência de interesse de modo que a transcrição daquela sequência de interesse é controlada e regulada por aquele promotor. Quando a sequência de interesse codifica uma proteína e quando expressão desta proteína é desejada, “ligado operavelmente” significa que o promotor está ligado à sequência em uma maneira tal que o resultante transcrito será eficientemente traduzido. Se a ligação do promotor à sequência codificante é uma fusão transcricional e expressão da proteína codificada é desejada, a ligação é feita de modo que o primeiro códon de iniciação traducional no resultante transcrito é o códon de iniciação da sequência codificante. Alternativamente, se a ligação do promotor à sequência codificante é uma fusão traducional e expressão da proteína codificada é desejada, a ligação é feita de modo que o primeiro códon de iniciação traducional contido na sequência nãotraduzida 5’ associou com o promotor e está ligado de modo que o resultante produto de tradução está em estrutura com o quadro de leitura aberto traducional que codifica a desejada proteína. Sequências de ácido nucleico que podem ser operavelmente ligadas incluem, mas não são limitadas a, sequências que proporcionam funções de expressão de gene (isto é, elementos de expressão de gene como promotores, regiões não-traduzidas 5’, íntrons, regiões codificando proteína, regiões não-traduzidas 3’, sítios de poliadenilação, e/ou terminadores transcricionais), sequências que provêm transferência de DNA e/ou funções de

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31/70 integração (isto é, sequências de borda de T-DNA, sítios de reconhecimento de recombinase específica de sítio, sítios de reconhecimento de integrase), sequências que provêm funções seletivas (isto é, marcadores de resistência a antibióticos, genes biossintéticos), sequências que provêm funções marcadoras classificáveis (isto é, genes repórteres), sequências que facilitam manipulações in vitro e in vivo das sequências (isto é, sequências poli ligantes, sequências alvos para recombinases específicas de sítios) e sequências que provêm funções de replicação (isto é, origens bacterianas de replicação, sequências de replicação autônoma, sequências centroméricas).

[0060] Agentes de indução de recombinação podem compreender radiação ionizante e/ou qualquer composto, proteína, e/ou um ácido nucleico que proporcione eliminação ou modificação de uma sequência de polinucleotídeo. Agentes de indução de recombinação assim incluem, mas não são limitadas, agentes que provêm recombinação homóloga, recombinação não-homóloga, recombinação específica de sítio, e/ou modificações genômicas. Modificações genômicas providas por agentes de indução de recombinação assim incluem, mas não são limitados a, inserções, supressões, inversões, e/ou substituições de nucleotídeos. Uso de agentes de indução de recombinação para indução de modificações genéticas em plantas foi descrito (Lloyd et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, 102(6):2232, 2005). Agentes de recombinação podem ser nativos ou engenheirados. Recombinases específicas de sítio incluem, mas não são limitadas a, uma Cre-recombinase, uma FLP-recombinase, uma Flippase e semelhantes. Agentes de indução de recombinação também incluem, mas não são limitados a, nucleases. Nucleases que podem ser usadas incluem, mas não são limitadas a, meganucleases e zinco-dedo nucleases. Outros agentes de indução de recombinação incluem, mas não são limitados a, sequências de substituição homólogas e sequências de substituição não-homólogas. Em certas realizações, reagentes

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32/70 de indução de recombinação podem compreender uma nuclease e uma sequência de substituição homóloga ou não-homóloga. Em certas realizações, uma cre-recombinase capaz de excisar o marcador selecionável localizado entre os sítios lox de SEQ ID NO: 24 pode ser usada. Eliminação mediada por cre de sequências flanqueadas por sítios lox em plantas foi mostrada (patente US 5 658 772).

[0061] Eliminação ou interrupção de um gene marcador selecionável, uma sua porção, ou outra sequência pode ser efetuada através de indução de uma ruptura de fita dupla na sequência alvo, provendo uma sequência substituta homóloga que carece de gene marcador selecionável ou uma sua porção, e recuperando plantas onde a sequência de substituição foi integrada no lugar das sequências originalmente residentes. Uma sequência de substituição homóloga pode compreender sequências homólogas em ambas extremidades da da ruptura de fita dupla que são providas para recombinação homóloga e substituição da sequência residente no cromossoma com a sequência de substituição. Recombinação homóloga induzida por ruptura de fita dupla alvejada em plantas de colheitas como tabaco e milho foi mostrada (Wright et al., Plant J. 44, 693, 2005; D’Halluin, et al., Plant Biotech. J. 6:93, 2008). Também é possível inserir uma sequência de substituição homóloga em um sítio de divagem nuclease alvejado através de união de extremidade não-homóloga ou uma combinação de união de extremidade não-homóloga e recombinação homóloga ((revisto em Puchta, J. Exp. Bot. 56, 1, 2005). Inserção alvejada de sequências de substituição homólogas em sítios genômicos de planta específicos através de união de extremidade não-homóloga ou uma combinação de união de extremidade não-homóloga e recombinação homóloga também foi mostrada (Wright et al., Plant J. 44, 693, 2005). Em certas realizações, uma meganuclease que catalisa pelo menos uma ruptura de fita dupla específica de sítio no gene

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33/70 marcador selecionável pode ser usada. Meganucleases foram mostradas serem suscetíveis e modificação genética de modo que elas podem ser evoluídas ou engenheiradas (WO/06097853A1, WO/06097784A1, WO/04067736A2) ou projetadas racionalmente (US 20070117128A1) para corte dentro de uma sequência de reconhecimento que ajusta exatamente ou está relacionada de perto a específica sequência alvo. Nestes casos, dado um alvo de tamanho razoável tal como uma sequência de gene marcador selecionável, pode-se selecionar ou projetar uma nuclease que cortará dentro de sequência de gene marcador selecionável. Alternativamente, uma zinco dedo nuclease que catalias pelo menos uma ruptura de fita dupla específica de sítio no gene marcador selecionável pode ser usada. Tais zinco dedo nucleases, a habilidade para engenheirar específicas zinco-dedo nucleases, e seu uso em provimento de recombinação homóloga em plantas também foram descritos (W003/080809), WO 05/014791, WO 07014175, WO 08/021207). [0062] Eliminação ou interrupção de um gene marcador selecionável, uma sua porção, ou outra sequência também pode ser efetuada através de indução de uma ruptura de fita dupla na sequência alvo, provendo uma sequência de substituição não-homóloga que carece de gene marcador selecionável ou uma sua porção, e recuperando plantas onde a sequência de substituição não-homóloga foi integrada na sequência alvo. Em certas realizações, uma sequência substituição nãohomóloga pode compreender sequências de fita simples em ambas extremidades que são complementares para sequências de fita simplesem ambas extremidades da ruptura de fita dupla para prover ligação de extremidade não-homóloga da sequência substituição e ruptura de fita dupla.

[0063] Processos para geração de novo de uma planta de milho que é substancialmente equivalente a uma planta de milho de evento

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ΜΟΝ87460 e plantas resultantes também são aqui providos. Tais processos podem compreender uso de agentes de indução de recombinação. Plantas de milho que são substancialmente equivalentes a uma planta de milho de evento MON87460 incluem, ma s não são limitadas a, plantas de milho compreendendo um cromossoma tendo uma inserção de transgene heterólogo compreendendo um promotor que está operavelmente ligado a um gene cspB, onde a inserção transgênica está presente na mesma ou substancialmente a mesma localização cromossomal ou sítio de integração cromossomal como em MON87460. Promotores que podem ser operavelmente ligados a um gene cspB, incluem, mas não são limitados a, promotores actina de arroz, incluindo promotores actina de arroz truncados, um promotor RS81 de milho, um promotor RS324 de milho, um promotor A3 de milho, promotores virais, e semelhantes. Em certas realizações não-limitantes, pode-se selecionar, evoluir ou projetar uma nuclease para cortar dentro de uma sequência de reconhecimento alvo que exatamente ajusta ou está relacionada de perto a uma sequência alvo em SEQ ID NO: 5, em SEQ ID NO: 6, em uma sequência cromossômica de milho que abrange SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 em uma planta de milho não-transgênica, ou em SEQ ID NO: 23. Nestas ou em outras realizações não-limitantes, uma planta de milho modificada geneticamente que contém um promotor operavelmente ligado a um gene cspB pode ser produzida através de: i) introdução em uma célula de planta de milho de uma sequência substituição homóloga compreendendo um promotor que está operavelmente ligado a um gene cspB e sequências flanqueando que são substancialmente idênticas a uma sequência alvo e uma nuclease que cliva a sequência alvo; e ii) seleção de uma célula de milho ou planta de milho onde a sequência substituição homóloga integrou na sequência alvo. Dado que sequências alvo cromossômicas de milho aqui mostradas foram

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35/70 verificadas serem sítios favoráveis para inserção de transgene, processos de obtenção de plantas com inserções de um ou mais transgenes que conferem características outras que não tolerância a déficit de água ou transgenes que compreendem genes outros que não cspB que confere tolerância a déficit de água em sítios alvos aqui descritos também são providos.

[0064] A disponibilidade de agentes de indução de recombinação e várias sequências substituição homólogas também provêm plantas de milho tolerantes a déficit de água que compreendem um ou mais genes adicionais integrados na mesma localização cromossômica como a inserção transgene heteróloga que confere tolerância a déficit de água. Integração dos genes adicionais na mesma localização como o gene que confere tolerância a déficit de água é vantajosa em que quaisquer características elevadas pelos genes adicionais serão geneticamente ligadas à característica de tolerância a déficit de água, assim facilitando multiplicação. Em certas realizações, um adicional gene ou genes podem ser genes que trabalham em concerto com a inserção transgene heterólogo residente que confere tolerância a déficit de água para provimento de adicional tolerância a déficit de água. Em certas realizações, Um gene ou genes adicionais podem ser genes que proporcionam uma característica distinta e útil outra que não tolerância a déficit de água. Assim, um ou mais genes que conferem uma ou mais características incluem, mas não são limitados a, genes que conferem resistência a herbicida, resistência a peste, aperfeiçoado rendimento sob condições suficientes de água, aperfeiçoado óleo de semente, aperfeiçoado amido de semente, aperfeiçoada proteína de semente, e/ou aperfeiçoada utilização de nitrogênio. Tais plantas podem ser obtidas através de processos que compreendem descrição de um cromossoma de milho compreendendo uma inserção de transgene heterólogo que confere tolerância

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36/70 a déficit de água para uma sequência substituição homóloga compreendendo um ou mais genes adicionais e seleção de uma planta de milho compreendendo uma inserção de transgene heterólogo que confere tolerância a déficit de água e um ou mais genes adicionais. Em certas realizações, a inserção da sequência substituição homóloga pode ser facilitada através de uso de um adicional agente de indução de recombinação. Adicionais agentes de indução de recombinação usados incluem, mas não são limitados a, uma meganuclease, uma zinco - dedo nuclease, ou outro agente que induza uma ruptura de fita dupla em um desejado sítio de recombinação homóloga induzida por ruptura de fita dupla.Inserções de transgene heterólogas que conferem tolerância a déficit de água incluem, mas não são limitadas a, inserções compreendendo SEQ ID NO: 1 e um promotor actina de arroz truncado que está operavelmente ligado a um gene cspB assim como inserções compreendendo SEQ ID NO: 1 e um promotor actina de arroz truncado que está operavelmente ligado a um gene cspB onde um terminus 5’ da inserção sobrepõe um terminus 3’ de SEQ ID NO: 1. Em certas realizações, a sequência substituição homóloga compreende uma sequência que provê substituição de um gene marcador selecionável que está em uma inserção de transgene heteróloga residente com um ou mais adicionais genes. Inserções transgene heterólogas que conferem tolerância a déficit de água e contêm um marcador selecionável incluem ,mas não são limitadas a, inserções compreendendo SEQ ID NO: 7 ou inserções compreendendo SEQ ID NO: 1 e um promotor actina de arroz truncado que está operavelmente ligado a um gene cspB. Cromossomas de milho que compreendem uma inserção de transgene heterólogo que confere tolerância déficit de água e um gene marcador selecionável também incluem, mas não são limitadas a, um cromossoma de milho que compreende SEQ ID NO: 24, um cromossoma de milho de planta de milho tendo sido depositado sob número de acesso ATCC PTA-8910, e sua

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37/70 progênie. Em certas realizações, um gene adicional também pode ser inserido em SEQ ID NO: 5 e/ou SEQ ID NO: 6.

[0065] Também é antecipado que qualquer um dos genes adicionais mencionados anteriormente pode ser integrado em um cromossoma compreendendo SEQ ID NO: 1 e um promotor actina de arroz truncado que está operavelmente ligado a um gene cspB e um ou mais sítios lox através de sistemas de recombinação específica de sítio usados para este propósito incluem, mas não são limitados a, FLP recombinase / FRT, cre recombinase / lox, e suas combinações. O uso de sistemas de recombinação específicos - sítio em plantas e outros organismos eucarióticos foi mostrado (patente US 5 801 030, patente US 5 658 772, e patente US 6 262 341). A presença de sítios de recombinação específica de sítio lox em cromossomas de milho compreendendo SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 24 e um cromossoma de milho de uma planta de milho tendo sido depositado sob número de acesso ATCC PTA-8910, e sua progênie, assim provê integração específica de sítio de adicionais genes nestes cromossomas. Em certas realizações, a sequência marcadora selecionável que é flanqueada pelos sítios lox nos cromossomas de milho é primeiro excisada através de cre-recombinase, deixando um único sítio lox no cromossoma. Adicionais genes podem ser então introduzidos sobre uma molécula de DNA circular compreendendo os adicionais genes e um sítio lox ligado operavelmente e integrado no cromossoma de milho no sítio lox único que foi deixado no cromossoma. Esquemas exemplares para criação de moléculas de DNA circulares e integração específica de sítio de genes em cromossomas foram mostrados (Vergunst et al., Nucleic Acid Res. 26(11), 279, 1998). Introdução de sítios de recombinação específica de sítio outros que não lox na localização cromossômica da inserção de SEQ ID NO: 24 e inserção de adicionais genes naqueles sítios de recombinação também são aqui providas.

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38/70 [0066] Os exemplos que se seguem são incluídos para demonstrarem exemplos de certas realizações preferidas da invenção. Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas mostradas nos exemplos que se seguem representam abordagens que os inventores verificaram funcionarem bem na prática da invenção, e assim podem ser consideradas para constituírem exemplos de modos preferidos para sua prática. Entretanto, aqueles versados na técnica devem, à luz da presente descrição, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas específicas realizações que são mostradas e ainda obterem um resultado semelhante ou similar sem fugir do espírito e escopo da invenção. Exemplos

Exemplo 1 Produção de plantas de milho transgênicas [0067] Plantas de milho transgênicas foram produzidas através de transformação mediada por Agrobacterium de milho LH59 com o vetor pMON73608 (Figura 1). Este vetor contém a região codificante cspB regulada pelo promotor actina de arroz, o íntron actina de arrox, e a sequência de poliadenilação 3’ tr7, e a região codificante nptll regulada pelo promotor CaMV 35S, e a sequência de poliadenilação 3’ NOS. Tabela 1: Resumo de elementos genéticos em pMON73608

Elemento Genético	Posição na Figura 1	Função (Referência)
CR-Ec.rop-1:1:3	53-244	Sequência codificante para repressor de proteína inicia- dora
OR-Ec.ori-ColE-1:1:1	672-1260	Origem de replicação a partir de pBR322 para manutenção de plasmídeo em E. coli
P-Ec.aadA-SPC/STR- 1:1:1CR-Ec.aadA- SPC/STR-1:1:3 T-Ec.aadA-SPC/*STR- 1:1:1	1793-2681	Promotor bacteriano e sequência codificante para uma enzima de modificação de aminoglicosídeo, 3’(9)-O-nu- cleotidil transferase a partir de transposon Tn7 (Gen

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Elemento Genético	Posição na Figura 1	Função (Referência)
		Bank acession X03043)
B-AGRtu.right border- 1:1:12	2816-3172	Sequência de borda direita essencial para transferência de T-DNA derivado de Agrobacterium
P-Os.Actl-1:1:8 L-Os.Actl-1:1:5 l-Os.Actl-1:1:3	3205-4048 4049-4128 4129-4605	Promotor, líder e íntron do gene actina de arroz
CR-Bs.cspB-1:4:1	4608-4811	Região codificante para a proteína CSPB de Bacillus subtilis com uma mudança na segunda posição de aminoácido de leucina para valina (WO 05033318)
T-AGRtu.tr7-1:1:5	4842-5349	Região não-traduzida 3’ do transcrito 7 codificando sequência a partir de Agrobacterium que direciona poliadenilação
RS-P1.10x1-1:1:1	5424-5457	Sítio de recombinação reconhecido por Cre recombinase
P-CaMV.35S-1:1:6	5484-5776	Promotor de vírus mosaico de couve-flor (CaMV)
CR-Ec.npll-Tn5-1:1:3	5841-6635	Região codificante isolada de Tn5 que codifica neomicina fosfo transferase tipo II. Expressão deste gene em células de plantas confere resistência a canamicina e serve como um marcador selecio- nável para transformação
T-AGRtu.nos-1:1:13	6667-6919	Região não-traduzida 3’ da sequência codificante nopa- lina sintase (NOS) de

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Elemento Genético	Posição na Figura 1	Função (Referência)
		Agrobacterium TUmefasciens que dirige poliadenilação
RS-P1.10x1-1:1:1	6945-6978	Sítio de recombinação reconhecido por Cre recombinase
B-AGRtu.left border-1:1:5	6999-7440	Sequência de borda esquerda essencial para transferência de T-DNA derivado de Agrobacterium
OR-EC.oriV-RK2-1:1:6	7527-7923	Origem de replicação para Agrobacterium derivado do plasmídeo de ampla faixa de hospedeiro RK2

Ό068] Callus LH59 foi iniciado a partir de embriões imaturos. Embriões imaturos, 1,5 mm a 2,0 mm, foram excisados de plantas de milho em desenvolvimento e cultivados com o eixo embriônico para baixo sobre meio de iniciação de callus por 8-21 dias.

[0069] Agrobacterium foi preparado via processos padrões e 50 a 100 peças de callus foram transferidas para uma placa de Petri contendo cerca de 15 mL de suspensão de Agrobacterium em 0,1 a 1,0 x 10⁹ cfu/mL. Peças de callus, de 2 mm a 8 mm em diâmetro, foram incubadas por cerca de 30 minutos em temperatura ambiente com a suspensão de Agrobacterium, seguido por remoção do líquido por aspiração. Cerca de 50 uL de água destilada estéril foram adicionados ao papel de filtro em uma placa de Petri de 60 x 20 mm. Quinze a 20 peças de callus inoculadas foram transferidas para cada papel de filtro e a placa selada. O callus e Agrobacterium foram cocultivados por cerca de 3 dias a 23°C no escuro.

[0070] Calli foram transferidos de papel de filtro para meio de iniciação de callus contendo carbenicilina e cultivados no escuro a 27°C a 28°C por 2-5 dias. Seleção foi iniciada através de transferência de callus para meio de iniciação de callus contendo nitrato de prata, carbenicilina

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41/70 e mg/L paromomicina. Após 2 semanas de cultura no escuro a 27-28°C, callus foram transferidos para meio contendo maiores níveis de paromomicina. Callus foram subcultivados após duas semanas para meio novo e ainda cultivados por duas semanas no escuro a 27-28°C. Callus foram então novamente transferidos para meio com maiores níveis de paromomicina. Após 2-3 semanas de cultura no escuro a 27-28°C, callus resistentes a paromomicina foram identificados.

[0071] Plantas foram regeneradas (plantas RO) de callus transformados, transferidas para solo e crescidas na estufa. Plantas RO foram separadas por PCR para a presença das regiões codificantes espB e nptll, e análises Southern foram conduzidas para determinar cópia de inserção. Análises Taqman foram usadas para determinar a presença ou ausência de sequências de cadeia principal de vetor. Eventos transgênicos que foram positivos para a presença de ambos genes espB e nptll, negativos para a presença de sequências de cadeia principal de vetor e tiveram uma ou duas inserções (sítios de integração dentro de genoma de milho) foram selecionados para análise fisiológica para tolerância a seca. Os eventos positivos foram crescidos na estufa para maturidade e polimerizados. Semente homozigoto, heterozigoto e nãotransgênica de eventos transgênicos múltiplos obtida por inserções genômicas do T-DNA de pMON73608 foram coletados das plantas positivas polimerizadas.

Exemplo 2 Separação de estufa para tolerância de tensão de déficit de água [0072] Plantas de milho heterozigotas transgênicas foram crescidas a partir de semente heterozigota de eventos transgênicos transformados com pMON73608 (Exemplo 1) e separadas para tolerância a tensão de déficit de água comparadas a plantas controles através de um processo de alta produtividade de separação em estufa no qual água é retida para criar um “tratamento de seca”. Eficiência de uso de água é

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42/70 medida através de taxa de crescimento de planta, por exemplo, pelo menos um aperfeiçoamento de 10%, em altura e biomassa durante um tratamento de seca, como comparada a plantas controles. O status de hidratação dos tecidos de broto seguindo a seca também é medido. Altura Inicial de Broto (SIH) é altura de planta após 3 semanas de crescimento sob condições ótimas. Altura de apodrecimento de broto (SWH) é a altura de planta no fim de 6 dias de seca. Experimentos de curso de tempo mostraram que em cerca de 3 dias de tratamento de seca, plantas de milho tipo selvagem basicamente param o crescimento e começam a morrer. Assim, uma planta de milho transgênica com aperfeiçoada eficiência de uso de água continuará a crescer (embora possivelmente em uma menor extensão que com água) e pelo que ser significantemente mais alta no fim de um experimento de seca. Massa Morta de Broto (SWM) é a quantidade de matéria úmida e seca no broto ((planta separada de bola de raiz na linhagem do solo) no fim da seca; SDM é medido após 2 a 3 semanas em uma câmara de secagem. Massa Túrgida de Broto (STM) é a SWM plus a massa da água que é transportada em tecidos de planta em 3 dias de encharcamento em água a 40 graus Celsius no escuro. Experimentos mostraram que maior parte da água é retirada em 24 horas mas demora mais 2 dias antes de adicional aumento tornar-se insignificante. STM-SWM é indicativo de eficiência de uso de água em plantas onde recuperação de tensão é mais importante que tolerância de tensão per se. Teor de água relativo (RWC) é uma medida de quanto (%) da planta é água na colheita. RWC = (SWM-SDM)/(STM-SDM)x100. Plantas de milho inteiramente aguadas são cerca de 98% RWC. Tipicamente, em uma separação de apodrecimento as plantas são cerca de 60% RWC. Plantas com maior RWC no final de uma seca são consideradas serem plantas mais saudáveis e mais adaptadas para recuperação e crescimento após seca. Taxa de

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43/70 crescimento relativo (RGR) é calculada para cada broto usando a fórmula RGR- (SWH-SIH)/((SWH+SIH)/2)x100.

[0073] Plantas de milho heterozigotas transgênicas a partir de múltiplos eventos transgênicos compreendendo T-DNA de pMON73608, incluindo MON87460, exibiram aperfeiçoada tolerância a tensão de déficit de água como comparadas a plantas controle.

Exemplo 3 Aperfeiçoado Desempenho de Campo de Plantas de Milho MON87460 Sob Déficit de Água [0074] Experimentos de campo foram realizados usando milho híbrido grau comercial em ambientes que não receberam chuva durante o período alvo para o tratamento de déficit de água, uma abrangência de 10 a 14 dias imediatamente antes de florescência.

[0075] Hortas de duas fileiras, de 34 plantas por fileira foram plantadas em uma densidade 32 000 plantas por acre em uma localidade no oeste do Kansas. Cada horta transgênica foi feita par com uma horta não-transgênica do mesmo fundo híbrido. Doze réplicas de hortas - emparelhadas de cada uma de 21 eventos de inserção independentes, e seu par não-transgênico, foram plantados em um desenho de bloco randomizado. Plantas foram mantidas em uma condição bem aguada usando irrigação de cabeçote superior até o estágio V8 de desenvolvimento, em cujo tempo água é retida por um período de 14 dias.

[0076] No 7° dia do tratamento de retenção de água a distância a partir de superfície de solo para a ponta da folha inteiramente estendida mais jovem foi determinada para cada uma de 3 plantas positivas transgene e negativa transgene em cada horta emparelhada. Esta medição foi repetida 5 dias depois usando a mesma folha como no dia 7. A partir de medições de dia 7 e dia 12 uma taxa de crescimento, em cm/d, foi calculada para cada planta medida. Esta taxa é referida como Taxa de extensão de Folha (LER).

[0077] No 8° dia de tratamento uma estimativa de teor de clorofila

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44/70 foi feita usando o Minolta SPAD-502 (Spectrum Technologies, Plainfield, IL). Esta medfição foi tomada em uma posição de metade da folha (base para ponta) da folha inteiramente expandida mais jovem para 6 dos 21 eventos. Leituras SPAD foram coletadas para cada uma de 6 plantas positivas transgênicas e 6 negativas transgênicas em cada horta emparelhada, para cada réplica de horta emparelhada.

[0078] Similarmente, no 8° dia de tratamento, taxas fotossintéticas foram medidas ao meio-dia, usando a meia - folha da folha inteiramente expandida mais jovem para os mesmos 6 do 21 eventos. Taxas fotossintéticas foram medidas usando o PP Systmes (Amesbury, MA) Ciras1 Portable Photosynthesis System. Fotossíntese de folha foi medida em atmosférica [CO²] de 367 moles.mol'¹, uma pressão de wapor d’água ambiente de 2,3 kPa, e um déficit de pressão de vapor de ar de folha entre 0,6 e 1,5 kPa, com densidade de fluxo de fóton fotossintético entre 1200 e 1400 moles.m².s¹.

[0079] Vinte e dois eventos CspB foram avaliados no experimento de campo de Kansas. O tratamento de déficit de água resultou em uma redução média em taxas de crescimento para 50% da taxa bem aguada. Como uma construção, os transgênicos CspB demonstraram um aumento de 3,6% em taxas de extensão de folha em relação a controles não-transgênicos (Tabela 2). MON87460 e um segundo evento de alto desempenho demonstraram aumentos de taxa de crescimento de 12 e 24%. As plantas positivas CspB também demonstraram significantes aperfeiçoamentos em teor de clorofila e taxas fotossintética (Tabela 2). Em um nível de construção, teor de clorofila foi aumentado por 2,5%, comMON87460 e um segundo evento de alto desempenho exibindo aumentos de 4,4 e 3,3%. Os aperfeiçoamentos para as taxas fotossintéticas foram 3,6% em um nível de construção, com aumentos de 8,5 e 7,7% para MON87460 e um segundo evento de alto desempenho. Tabela 2 Crescimento aperfeiçoado de eventos cspB sob condições

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45/70 de déficit de água no campo

Evento - Gene	% de aumento de LER (campo)	% de aumento de teor de clorofila	% de aumento de fotossíntese
CspB-construct	3,6%	2,5%	3,6%
CspB-Zm Event MON87460	12%	4,4%	8,5%
CspB-Zm Event 2	24%	3,3%	7,7%

Exemplo 4: Rendimento aperfeiçoado de plantas de milho MON87460 sob tratamento de água limitada [0080] O desempenho de rendimento de 10 eventos CspB integrados independentemente, maioria dos quais demonstrou previamente aperfeiçoado desempenho vegetativo em seleções de estufa ou experimentos de campo, foi avaliada em um fundo genético híbrido elite em 4 localizações na Califórnia central onde um tratamento de água limitada foi aplicado. Tratamento de água limitada foi aplicado através de redução de irrigação por um período de 14 dias durante o estágio vegetativo tardio de desenvolvimento imediatamente antes de florescência. O tratamento resultou em uma redução líquida de aproximadamente 49,2 cm³ de água em relação a um regime bem aguado. Isto foi obtido através de omissão de duas de três aplicações de 24,6 cm³de água durante o período de tensão. O tratamento reduziu a taxa de crescimento relativo durante o tratamento por aproximadamente 50% de taxas bem aguadas e similarmente reduziu o final médio de rendimento de grão de estação por 50%. Cada localização de experimento foi designada como um desenho de bloco não-balanceado de grupo de fator 4, e plantado com 3 réplicas por localização. Dentro de cada replicação, os genótipos foram randomizados como o 1° fator, e construções, eventos, e hortas de gene - positivo vs. gene - negativo foram randomizadas como os 2°,

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3° e 4° fatores, respectivamente. O desenho colocou as entradas positiva e negativa para cada seleção em hortas de 2 fileiras adjacentes. Densidade de população final refletiu práticas de plantio local e variou de 65 a 75 plantas por horta de 2 fileiras. Hortas foram de 6,40 (21 pés) de comprimento e espaçamento de fileiras variou de 76,2 a 101,6 centímetros (30 a 40 polegadas) de largura, refletindo práticas de plantio locais.

[0081] Dados de rendimento de grãos foram coletados dos experimentos de campo de água limitada e são providos na Tabela 3 abaixo. Rendimento médio nos campos da Califórnia limitados - água foi de 6,8 t/Há, representando uma redução de 50% em rendimento em relação ao rendimento médio de colheitas no Meio-oeste. Médias de rendimentos de plantas positivas CspB como uma construção, foram significantemente maiores, por 7,5% (p<0,01). Um número de eventos individuais também exibiu significantes vantagens de rendimento. CspB-Zm MON87460 foi o evento de melhor desempenho e demonstrou um aperfeiçoamento de rendimento de 20,4%.

Tabela 3. Rendimento aperfeiçoado de eventos cspB sob condições de água limitada no campo

Evento	Rendimento (t/Há)	% de aperfeiçoamento
CspB - média não- transgênica	6,86
CspB-média construção	7,38	7,5%
CspB-Zm evento MON87460	8,26	20,4%
CspB-Zm evento 2	7,61	10,9%

Ό082] O evento MON87460 também demonstrou significantes aperfeiçoamentos em crescimento de folha, teor de clorofila e taxas de

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47/70 fotossíntese, provendo evidência de que estes aperfeiçoamentos em produtividade vegetativa se traduzem em aperfeiçoamentos em desempenho reprodutivo e rendimento de grão, e identificando MON87460 como o maior desempenho entre os eventos transgênicos independentes múltiplos testados em estudos de campo ou estufa.

Exemplo 5 Análises Moleculares [0083] MON87460 foi caracterizado por detalhadas análises moleculares, incluindo seleções para número de inserções (número de sítios de integração dentro de genoma de milho), número de cópias (o número de cópias do T-DNA dentro de um lócus), a integridade dos cassetes inseridos e a ausência de sequência de cadeia principal.

Análises de Southern blot [0084] Aproximadamente 2-3 g de tecido de folha foram secas em um Iiofilizador por ~48 horas e triturados através de adição de pequenas pérolas de metal e agitando em um misturador de tinta. Cada amostra foi misturada com 6 mL de tampão de extração (Tris 0,1 M pH 8,0, EDTA 0,05 M, NaCI 0,5 M, SDS 1% com BME 0,071% adicionado novo), colocada em um banho de água a 65°C por 45 minutos, e ocasionalmente misturada. Acetato de potássio 5M (2 mL) foi adicionado, os tubos foram então invertidos duas vezes e transferidos para um banho de gelo por 20 minutos. Clorofórmio frio (3 mL) foi adicionado e suavemente misturado por inversão por minutos. Amostras foram centrifugadas em 3500 rpm por 15 minutos. O sobrenadante foi transferido para novos tubos e combinado com 4 mL de isopropanol frio. Amostras foram centrifugadas em 3500 rpm por 15 minutos e o sobrenadante descartado, o pélete foi novamente suspenso em 2 mL de tampão T50E10 coOm 0,1 mg/mL de RNAse e incubado a 65°C por 20 minutos. Para precipitar o DNA, 3 mL de isopropanol / acetato de amônio 4,4 M (7:1) foram adicionados a cada tubo e invertido para misturar. Amostras foram centrifugadas em 3500 rpm por 15 minutos e o sobrenadante foi descartado, os péletes

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48/70 foram rinsados com 0,5-1,0 mL de EtOH 80% e então transferidos para tubos de microcentrífuga. Após uma breve rotação em uma microcentrífuga o sobrenadante foi descartado e os péletes foram permitidos secar ao ar. Péletes foram novamente suspensos em ~200 uL de tampão TE. [0085] Aproximadamente 10 ug de DNA genômico foram digeridos usando 100 unidades de várias enzimas de restrição em um volume total de 500 uL. Digestões foram incubadas a 37°C por toda noite e precipitadas EtOH. O DNA digerido foi então feito pélete e novamente dissolvido em 20 uL de tampão TE. Moldes de sonda de DNA foram preparados por amplificação PCR de plasmídeo pMON73608. aproximadamente 25 ng de cada sonda foram marcados com -100 uCi de ³²P-dCTP (Amersham catálogo # AA0075) usando iniciação randômica (Radprime DNA labeling System, invitrogen). Sondas radio marcadas foram purificadas usando uma coluna Sephadex G-50 (Roche). Amostras foram carregadas sobre géis TAE 0,8% e corridas 14-18 horas a 30-35 V. Após eletroforese, os géis foram manchados em 1,5 ug/mL de brometo de etídeo por 10-15 minutos e então fotografados. Os géis foram então colocados em solução de despurinação (HCI 0,125 N) por 10-15 minutos seguido por uma solução desnaturante (NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M) por 30-40 minutos e então uma solução neutralizante (Tris-HCI 0,5 M pH 7,0, NaCl 1,5 M) por 30-40 minutos. Os géis foram então transferidos para uma solução SSC 20X por 5-15 minutos. Transferência capilar de DNA (Southern, 1975) sobre membrana de náilon Hybond-N (Amersham) foi facilitada por toda noite usando um Turboblotter (Schleicher & Schuell) com tampão de transferência 20X SSC. DNA foi covalentemente reticulado para a membrana com uma UV Stratalinker 1800 (Stratagene) usando o fixação autorreticulação e estocado a 4°C até requerido. Membranas foram incubadas por 1-4 horas a 60-65°C em tampão de pré-hibridização (250 mM Na2HPO4.7H2O, pH 7,2, 7% SDS, e 0,1 mg/mL tRNA). A sonda marcada com ³²P foi adicionada a tampão de

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49/70 pré-hibridização novo e hibridizada por toda noite a 60-65°C. Membranas foram lavadas 3 vezes em solução aquosa de SDS 0,1 % e 0,1xSSC por 15-20 minutos.

[0086] Sondas incluíram as regiões codificantes cspB e nplll intactas e seus respectivos promotores, íntrons, e sequências de poliadenilação e a cadeia principal de plasmídeo. Nenhum elemento adicional a partir do vetor de transformação original, ligado ou não-ligado aos cassetes intactos, foi identificado no genoma destes eventos de milho. Nenhuma sequência de cadeia principal foi detectada. Os dados mostram que evento de milho MON87460 contém uma inserção de T-DNA simples com uma cópia dos cassetes cspB e nptll.

[0087] Resultados de reações usando promotor actina de arroz e sondas de sequência intron indicaram que a inteira sequência promotora actina de arroz prsente em pMON73608 não está presente em MON87460. O elemento intron actina de arroz foi confirmado estar intacto em MON87460.

Análises northern blot [0088] RNA de evento de milho MON87460 e tecido de folha tipo selvagem de plantas crescidas em estufa foi isolado de um grama de amostras de tecidos usando um ToTALLY RNA Kit (Ambion catalog # 1910). Amostras contendo 5, 10, 25 e 50 ug de MON87460 e RNA tipo selvagem foram preparadas e corridas sobre um gel agarose 1,0% a 120V por aproximadamente 2 horas. Seguindo eletroforese, os géis foram então rinsados em água deionizada e manchados para membranas de náilon. Os géis foram deixados transferir por toda noite. As manchas foram ligadas covalentemente e colocadas a 4°C para estocagem de curto termo. Antes de pré-hibriização, as manchas foram pré-rinsadas em SSC 10X por 2 minutos. As manchas foram então colocadas em garrafas de hibridização individuais com 20 mL de Sigma Hyb Buffer (catálogo # H7033) e pré-hibridizadas a 65°C por 1 hora.

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50/70 [0089] Aproximadamente 25 ng de moldes de sonda cspB e nptll foram marcados com -50 pCi de ³²P-dCTP usando iniciação randômica (Radprime DNA labeling System, Invitrogen). Sondas radio marcadas cspB e nptll desnaturadas foram então adicionadas a tubos separados contendo 5 mL de tampão de hibridização preaquecido. O tampão contendo cada sonda foi então misturado e adicionado à apropriada garrafa de hibridização e hibridizada por toda noite. Seguindo uma hibridização por toda noite as manchas foram removidas da garrafa e colocadas em tampão de lavagem de baixa rigorosidade (2X SSC, 0,1 % SDS) em uma bandeja de vidro e colocada sobre um agitador por 10 minutos em temperatura ambiente. As manchas foram colocadas sobre papel de manchamento e então em garrafas de hibridização novas com 25 mL de tampão de lavagem preaquecido de baixa rigorosidade (65°C). As manchas foram lavadas a 65°C, duas vezes em tampão de lavagem de baixa rigorosidade por 15 minutos e uma vez a 65°C em tampão de lavagem de alta rigorosidade (0,5X SSC, 0,1% SDS) por 15 minutos.

[0090] Análises northern blot confirmaram que os transcritos de tamanho esperado para ambas cspB (~600 nt) e nptll (—1100 nt) são gerados em MON87460.

[0091] Sequenciamento de inserção de T-DNA e DNA genômico de milho flanqueante em clone lambda [0092] Dna genômico de alta qualidade de evento de milho MON87460 foi isolado usando um processo de extração com clorofórmio SDS. DNA genômico de MON87460 foi digerido com Mfel e purificado usandoo QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen), para assegurar a purificação de fragmentos maiores que 10 kb. Este DNA genômico digerido e purificado foi usado para ligação no Lambda DASH ll/EcoRI Vector Kit (Stratagene). Aproximadamente 2,5x10⁵ colônias foram separadas usando íntron Ract marcado com ³²P e sondas cspB. DNA purificado de um clone lambda bacteriófago puro foi usado ocmo molde

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51/70 em reações de sequenciamento para confirmar a sequência de nucleotídeos de T-DNA da inserção MON87460 e DNA genômico de milho flanqueando as extremidades 5’ e 3’ da inserção MON87460.

[0093] Análises de sequência de DNA confirmam que o T-DNA em planta em MON87460 é idêntico à correspondente sequência em pMON73608. Esta análise de sequência também caracterizou a extensão da truncação da extremidade 5’ do promotor actina de arroz que foi observada em análises Southern. As análises de sequências revelaram que o Agrobacterium RB e maior parte do promotor P-ract não estavam presentes no evento MON87460. O promotor P-ract em MON87460 consiste em somente 108 pb da extremidade 3’ da inteira região promotora actina (~850 nt) em pMON73608. Este resultado também confirma que a sequência in planta para cspB e nptll em evento de milho MON87460 ajusta as exatas regiões codificantes dentro de vetor de transformação pMON73608. Este clone também confirmou 1060 bp de sequência flanqueante 5’, 3309 bp de inserção T-DNA e 1260 bp de sequência flanqueante 3’ para a inserção MON87460.

Análise de alelo tipo selvagem [0094] PCR foi realizada sobre DNA genômico a partir de linhagem de milho não-transgênica usada em transformação usando iniciadores que hibridizam para as regiões flanqueantes 5’ e 3’ da inserção MON87460. Múltiplas combinações de iniciador foram realizadas com cada combinação consistindo em um iniciador que hibridiza para a região flanqueante 5’ e 3’, respectivamente. As análises PCR foram realizadas usando ~50 ng de molde de DNA genômico em um volume de reação de 50 pL. Amplicons resultantes foram então sequenciados. Análises do alelo tipo selvagem mostraram que uma supressão de 22 bp de DNA de genoma de milho (SEQ ID NO: 23) ocorreram com integração do T-DNA de MON87460 no cromossoma de milho.

[0095] Exemplo 6 Detecção de poli nucleotídeos de evento

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ΜΟΝ87460 [0096] A detecção de evento MON87460 em progênie resultante de multiplicação com uma linhagem MON87460 pode ser realizada através de extração de DNA genômico de tecidos de planta e análises para polinucleotídeos específicos de MON87460. De particular interesse para identificação de polinucleotídeos MON87460 é o uso de PCR para amplificar DNA genômico compreendendo sequências de junção de transgene / genômica.

[0097] Um amplicon diagnóstico para MON87460 compreende pelo menos uma sequência junção, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 (Figura 2). SEQ ID NO: 1 corresponde à junção da sequência flanqueante 5’ designada arbitrariamente (posições 1051 até 1060 de SEQ ID NO: 5) e a região 5’ do promotor actina de arroz truncado (posições 1-10 de SEQ ID NO: 7) na construção de expressão cspB. SEQ ID NO: 2 corresponde à junção da borda esquerda integrada de pMON73608 (posições 3300 até 3309 de SEQ ID NO: 70 e a sequência flanqueante 3’ designada arbitrariamente (posições 1 até 10 de SEQ ID NO: 6).

[0098] Pares iniciadores de evento que produzirão um amplicon diagnóstico para MON87460 incluem pares iniciadores baseados nas sequências flanqueantes e o DNA inserido a partir de pMON73608. Para gerar um amplicon diagnóstico compreendendo pelo menos 11 nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, um iniciador para frente baseado em SEQ ID NO: 5 e um iniciador reverso baseado na sequência transgene inserida, SEQ ID NO: 7 são preparados. Similarmente, para gerar um amplicon diagnóstico compreendendo pelo menos 11 nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, um iniciador para frente baseado na sequência transgene inserida, SEQ ID NO: 7, e um iniciador reverso baseado na sequência de flanco 3’, SEQ ID NO: 6 são preparados. É facilmente aparente para aqueles versados na técnica que pares iniciadores também podem ser

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53/70 desenhados para produção de um amplicon compreendendo polinucleotídeos complementares para pelo menos 11 nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, em cujo caso as sequências para frente e reversa são baseadas em sequências complementares para aquelas em SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, e SEQ ID NO: 7.

[0099] Iniciadores são desenhados os quais produzem amplicons tendo entre 50 e 1000 bases. Condições de amplificação são como ilustradas na Tabela 4 e Tabela 5 abaixo e incluem um controle de tecido positivo a partir de evento MON87460, um controle negativo de uma planta de milho que não é evento MON87460, e um controle negativo que não contém DNA genômico de milho. Um par iniciador que amplificará uma molécula de DNA de milho endógena, tal como de gene ADH, pode ser usado como um controle interno para as condições de amplificação de DNA.

[00100] DNA de planta de milho para uso em reações de amplificação de DNA pode ser isolado a partir de qualquer tecido de planta de milho apropriado, e é preferivelmente isolado de tecido de folha recentemente formada de plantas < 1 mês de idade para reações como aqui descritas. Tecido de folha é colhido usando uma punção de orifício de 7 mm, para coletar tecido equivalente a uma largura de aproximadamente 1 centímetro e 2,54 centímetros de comprimento de rasgo de folha. Amostras de tecidos são liofilizadas e tecido secado é trõiturado pela adição de 4-6 pérolas de zircônia - sílica de 3 mm a cada amostra de tecido em um tubo de polietileno e agitando em um misturador de tinta. Amostras de tecido homogeneizadas são misturadas em uma placa de 96 cavidades com 395 uL de tampão de extração SDS preaquecido (0,1 M Tris pH 8, 10 mM EDTA , 1,0 M NaCI, 1% SDS), brevemente feitas vórtice e incubadas a 65°C por 45 minutos. 135 uL de acetato de potássio frio (5 M) são adicionados. Amostras são misturadas através de vórPetição 870180046639, de 30/05/2018, pág. 58/83

54/70 tice e a placa é girada em 3300 rpm por 20 minutos. 100 uL de sobrenadante são transferidos para uma placa de 96 cavidades contendo 100 uL de isopropanol e amostras são feitas vóritce para misturar. A placa é girada em 3300 rpm por 20 minutos e o sobrenadante descartado. Placas são drenadas de cabeça para baixo por 1 minuto. 300 uL de etanol 70% frio são adicionados e a placa é brevemente feita vórtice e colocada a 4°C por 30 minutos. A placa é girada em 3300 rpm por 20 minutos e sobrenadante é descartado. A placa é drenada invertida e a precipitação com etanol repetida. Após uma rotação final (3300 rpm, 20 minutos), a placa é drenada por um minuto e colocada sobre seu lado em um forno a 65°C por cerca de 15-30 minutos para secar o pélete. O DNA é novamente suspenso em 100 uL de tampão TE pH 8,0 (Sigma) contendo RNase (120 ug/mL). DNA é estocado a 4°C por toda noite. Rendimento de DNA é cerca de 1 ug (10 ng/uL).

[00101] O ensaio para o amplicon MON87460 pode ser realizdo usando um Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700, Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700 ou Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler ou qualquer outro sistema de amplificação que possa ser usado para produzir um amplicon diagnóstico de MON87460.

Tabela 4. Milho evento MON87460 específico PCR

Etapa	Reagente	Volume	Comentário
1	Água 18 megohm	Ajustar para volume final de 10 uL
2	2X Universal Máster Mix (contém dNTPs, enzima e tampão)	5,0 uL	1x concentração final de dNTPs, enzima e tampão
3	Mistura de Pimer 1 e Primr	0,5 uL	Concentração

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	2 (resuspendida em 18 megohm de água a uma concentração de 20 μ M para cada primer) Exemplo: Em um tubo de microcentrífuga, o seguinte deve ser adicionado para obter 500 uL em uma concentração final de 20 uM: 100 uL de Iniciador 1 em uma concentração de 100 uM 100 uL de Iniciador 2 em uma concentração de 100 uM 300 uL de água 18 megohm		final 1,0 uM
4	Molde DNA extraído (5-10 ng cada): Amostras de folha a serem analisadas Controle negativo (DNA não-transgênico) Controle de água negativo (nenhum controle molde) Controle positivo (DNA MON87460)	3,0 uL

Tabela 5. Condições de ttermociclador TaqMan de ponto final

N° de ciclo	Fixações
1	50°C 2 minutos
1	95°C 10 minutos
10	95°C 15 segundos 64°C 1 minuto (-1°C/ciclo)

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30	95°C 15 segundos 54°C 1 minuto
1	10°C para sempre

Ό0103] Amplicons produzidos usando os pares iniciadores projetados são mostrados conterem polinucleotídeos MON87460 através de hibridização a sondas específicas para sequências junção MON87460 SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, ou através de isolamento e análise de sequência de DNA.

Exemplo 7: Ensaio específico - evento TaqMan de ponto final [00104] Uma reação PCR TaqMan específica - evento MON87460 é aqui descrita. Com Taqman ponto final, o sinal correspondendo a uma particular amplificação é quantificado usando um sistema de detecção fluorescente após os ciclos de reação serem completos. O uso de três hibridizações específicas de sítio (dois iniciadores de PCR e uma sonda marcada fluorescentemente) para geração de sinal provê um ensaio altamente específico. A sonda anela para específicos nucleotídeos entre os iniciadores para frente e reverso. Quando extensão de nucleotídeo atinge a sonda hibridizada, taq polimerase degrada a sonda liberando o átomo de flúor do extinto (quencher) de modo que um sinal é emitido. O sinal é lido após as reações serem completas.

[00105] Iniciadores polinucleotídeos usados no ensaio de ponto final são iniciadores SQ10443 (SEQ ID NO: 8), SQ10445 (SEQ ID NO: 9) e a sonda usada para detectar o amplicon MON87460 MGBNFQ marcado com 6FAM (ligação de ranhura menor, extinto (quencher) não-fluorescente) sonda PB3814 (SEQ ID NO: 10). Um iniciador DNA de milho interno também pode ser usado para confirmar integridade do DNA molde. Por exemplo, amplificação de álcool desidrogenase (ADH), um gene endógeno de cópia única dentro de genoma de milho, pode ser realizada usando iniciadores SQ5263 (SEQ ID NO: 11) e SQ5264 (SEQ

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ID NO: 12) e detectada com VIC® (fluorocromo repórter) e TAMRA® (fluorocromo extinto (quencher))sonda PB2033 (SEQ ID NO: 13). 6FAM®, VIC® e TAMRA® são produtos corantes fluorescentes de Applied Biosystems (Foster City, CA) ligados às sondas DNA. Nestas análises, Taq DNA polimerase cliva sondas que hibridizam especificamente para o DNA amplificado e libera, o fluoróforo. A separação de fluoroforo e extinto (quencher) permite ocorrer fluorescência que é diagnostica sob estas condições para a presença de polinucleotídeos MON87460. [00106] SQ10443 (SEQ ID NO: 8) e SQ10445 (SEQ ID NO: 9) quando usadas como descrito na Tabela 2 abaixo produzem um amplicon DNA de 68 nt (SEQ ID NO: 20 ) que é um diagnóstico para evento MON87460 e detectado por híbridização para uma sonda polinucleotídeo, tal como PB3814. Este ensaio foi otimizado para uso em formato de 96 cavidades ou 384 cavidades usando um Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 ou MJ Research DNA Engine PTC-225. Outros processos e aparelhagens podem ser conhecidos por aqueles versados na técnica e usados para produção de amplicons que identificam evento DNA MON87460. Ajustes para parâmetros de ciclização podem ser necessários para assegurar que velocidades de rampa sejam equivalentes. Amostras de tecido de folha de milho são usadas nas análises abaixo, e devem ser inteiramente trituradas para produção de uma amostra homogênea. DNA de folha de milho é isolado como descrito no Exemplo 6. A concentração do DNA de folha a ser testado está preferivelmente dentro da faixa de 5-10 ng por reação PCR. DNA controle deve ser extraído usando o mesmo processo como para extração das amostras a serem analisadas. Controles para estas análises devem incluir um controle positivo de milho conhecido conter evento MON87460, um controle negativo de milho não-transgênico e um controle negativo que não contém DNA molde.

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58/70 [00107] Para reações PCR usando um Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 ou MJ Research DNA Engine PTC-225 Thermal cycler, parâmetros de ciclização como descritos na Tabela 3 abaixo foram usados. Quando correndo a PCR no Perkin-Elmer 9700, o termociclador é corrido com a velocidade de rampa fixada no máximo.

[00108] Tabela 6. PCR TaqMan Ponto Final Específico de Milho Evento MON87460

Etapa	Reagente	Volume	Comentários
1	Água 18 megohm	Ajustar para volume final de 10 uL
2	2X Universal Máster Mix (contém dNTPs, enzima e tampão)	5,0 uL	1X concentração final de dNTPs, enzima e tampão
3	Mistura de Iniciador 1 e Iniciador 2 (ressuspensa em água 18 megohm para uma concentração de 20 uM para cada iniciador) Exemplo: Em um tubo de microcentrífuga, o seguinte deve ser adicionado para obter 500 uL em uma concentração final de 20 uM: 100 uL de Iniciador SQ10443 em uma concentração de 100 uM 100 uL de Iniciador	0,5 uL	1,0 uM de concentração final

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Etapa	Reagente	Volume	Comentários
	SQ10445 em uma concentração de 100 uM 300 uL de água 18 megohm
4	Evento 6-FAM MGBNFQ® Sonda PB3814 (ressuspensa em água 18 megohm para uma concentração de 10 uM)	0,2 uL	0,2 uM de concentração final
5	Iniciador controle interno-1 (SQ5263) e iniciador controle interno-2 (SQ5264). Mistura (ressuspensa em água 18 megohm para uma concentração de 20 uM para cada iniciador)	0,5 uL	1,0 uM de concentração final
6	Sonda VIC® controle interno (PB2033; SEQ ID NO: 13) ressuspensa em água 18 megohm para uma concentração de 10 uM)	0,2 uL	0,2 uM de concentração final
7	Molde DNA extraído (5-10 ng cada): Amostras de folhas a serem analisadas Controle negativo (DNA não-transgênico) Controle de água negativo	3,0 uL

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Etapa	Reagente	Volume	Comentários
	(controle sem molde) Controle positivo (DNA MON87460)

Tabela 7. Condições de termociclador TaqMan de Ponto Final

N° de ciclo	Fixação
1	50°C 2 minutos
1	95°C 10 minutos
10	95°C 15 segundos 64°C 1 minuto (-1°C/ciclo)
30	95°C 15 segundos 54°C 1 minuto
1	10°C para sempre

Exemplo 8. Ensaio de zigosidade PCR TaqMan de ponto final [00109] Um ensaio específico é descrito para detectar a presença e zigosidade (homozigoto ou heterozigoto) de evento transgênico MON87460 em DNA genômico extraído de tecido de folha de milho como descrito no Exemplo 6. Determinação de zigosidade para evento MON87460 em uma amostra foi feita usando uma PCR TaqMan de ponto final de zigosidade específica de evento para a qual exemplos de condições são descritos na Tabela 8 e Tabela 9. Os iniciadores DNA e sondas usados no ensaio de zigosidade são iniciadores SQ2105 (SEQ IDNO: 14)eSQ21106 (SEQ ID NO: 15),ePB3771 sonda MGB (ligação de menor ranhura) marcada com 6FAM® (SEQ ID NO: 16) para detecção de polinucleotídeos de junção de MON87460, e iniciadores SQ21195 (SEQ ID NO: 17) e SQ21196 (SEQ ID NO: 18), e PB10223 sonda marcada com VIC® (SEQ ID NO: 19) para detecção de DNA de milho tipo selvagem no sítio de inserção.

[00110] SQ21105 (SEQ ID NO: 14) e SQ21106 (SEQ ID NO: 15) quando usados nestes processos de reação com PB3771 (SEQ ID NO:

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16) produzem um amplicon DNA marcado de 134 nt (SEQ ID NO: 21) que é um diagnóstico para evento DNA MON87460. SQ21195 (SEQ ID NO: 17 e SQ21196 (SEQ ID NO: 18), quando usados nestes processos de reação com PB2512 (SEQ ID NO: 12) produzem um amplicon DNA de 145 nt (SEQ ID NO: 22) que é um diagnóstico para o alelo tipo selvagem. A sonda para esta reação é específica para a supressão de 22 pb de DNA genômico (SEQ ID NO:> 23) que ocorreu no sítio de inserção de MON87460. Heterozigosidade é determinada através de presença de ambos amplicons como demonstrado pela liberação de sinal fluorescente de ambas sondas PB3771 e PB10223. Material genético de planta de milho homozigoto é identificado por liberação de somente o sinal 6FAM® de PB3771. Controles para esta análise devem incluir um controle positivo a partir de amostras de planta de milho homozigotas e heterozigotas para evento DNA MON87460, um controle negativo de milho não-transgênico, e um controle negativo que não contém DNA molde. [00111] Este ensaio foi otimizado para uso em formato de 96 cavidades ou 384 cavidades usando um Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 ou MJ Research DNA Engine PTC-225. Quando correndo a PCR no MJ Engine, o termociclador deve ser corrido no modo calculado. Quando correndo a PCR no Perkin-Elmer 9700, o termociclador é corrido com a velocidade de rampa fixada no máximo.

Tabela 8. PCR TaqMan Ponto Final de Zigosidade Específica - Milho Evento MON87460

Etapa	Reagente	Volume	Comentários
1	Água 18 megohms	Ajustar para volume final de 10 uL
2	2X Universal Máster Mix (contém dNTPs, enzima e	5,0 uL	1X concentração final de dNTPs,

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Etapa	Reagente	Volume	Comentários
	tampão)		enzima e tampão
3	Mistura de iniciador 1 e iniciador 2 (ressuspensa em água 18 megohms para uma concentração de 20 uM para cada iniciador) Exemplo: Em um tubo de microcentrífuga, o seguinte deve ser adicionado para obter 500 uL em uma concentração final de 20 uM: 100 uL de iniciador SQ21105 em uma concentração de 100 uM 100 uL de iniciador SQ21106 em uma concentração de 100 uM 300 uL de água 18 megohms	0,5 uL	1,0 uM concentração final
4	Evento 6-FAM® MGB Sonda PB3771 (ressuspensa em água 18 megohms para uma concentração de 10 uM)	0,2 uL	0,2 uM concentração final
5	Mistura de iniciador-1 tipo selvaghem (SQ21195) e ini- ciador-2 tipo selvagem (SQ21196) mix (ressuspensa em água 18 megohm para uma concentração de 20 uM para cada iniciador)	0,5 uL	1,0 uM concentração final

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Etapa	Reagente	Volume	Comentários
6	Sonda (PB10223) MGB VIC® tipo selvagem ressus- pensa em água 18 megohm para uma concentração de 10 uM	0,2 uL	0,2 uM concentração final
7	Molde DNA extraído (5-10 ng cada): Amostras de folhas a serem analisadas Controle negativo (DNA não- transgênico) Controle água negativo (sem controle molde) Controle positivo (DNA MON87460 homozigoto) Controle positivo (DNA MON87460 hemizigoto)	3,0 uL
Tabela £	. Condições de termociclad	or Taq Man de ponto final de zigo-

sidade

N° de ciclo	Fixações
1	50°C 2 minutos
1	95°C 10 minutos
10	95°C 15 segundos 64°C 1 minuto (-1°C/minuto)
30	95°C 15 segundos 54°C 1 minuto
1	10°C para sempre

Exemplo 9. Desempenho de rendimento de MON87460 [00112] Adicionais experimentos de campo foram conduzidos com

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64/70 evento expressando CspB, MON87460, para ainda investigar a habilidade deste evento para prover tolerância a déficits de água durante os estágios desenvolvidos vegetativo tardio e reprodutivo. Estes são estágios muito importantes a partir da perspectiva agricultural devido à sensitividade da colheita nestes estágios de crescimento e a frequência com a qual ocorre seca durante estes estágios desenvolvidos nas regiões de crescimento direcionados.

[00113] Desempenho de rendimento de MON87460 foi avaliado em três fundos genéticos híbridos de elite em 5 localizações réplicas através de Califórnia central e oeste de Kansas onde dois tratamentos distintos limitantes de água foram aplicados. O tratamento vegetativo tardio foi aplicado aos experimentos através de redução de irrigação por um período de 14 dias durante o estágio vegetativo tardio de desenvolvimento, imediatamente após florescência. O tratamento reduziu a taxa de crescimento relativo durante o tratamento por aproximadamente 50% de taxas bem aguadas e similarmente reduziu o finalmédio de rendimento de grão de estação por 50%. Um tratamento de enchimento de grão foi obtido através de iniciação de condições limitantes de água em um estágio posterior, em relação ao tratamento vegetativo, esgotando o perfil de umidade do solo sobre ou ao redor de florescência e obtendo tensão máxima durante o período de enchimento de grão. Este tratamento resultou em uma redução aproximada de 25% em alturas de plantas e uma redução de 30-40% em rendimento de grão como um resultado da imposição de tensão. Três híbridos expressando o evento CspB foram avaliados usando 20 replicações de dados através de 5 localizações para cada janela de tratamento de tensão.

[00114] Cada localização de experimento foi designada com um desenho de bloco não-balanceado de grupo fator 3, e plantada com 4 réplicas por localização. Dentro de cada réplica, os genótipos foram randomizados como o 1° fator, e eventos, e hortas gene-positivas vs. genePetição 870180046639, de 30/05/2018, pág. 69/83

65/70 negativa foram randomizadas como o 2° e 3° fatores, respectivamente. O desenho colocou as entradas positiva e negativa para cada seleção em hortas de 2 fileiras adjacentes. Densidade de população final refletiu práticas de plantio locais e variaram de 65 a 76 plantas por horta de 2 fileiras. Hortas foram de 6,40 (21 pés) de comprimento e espaçamento de fileiras variou de 76,2 a 101,6 centímetros (30 a 40 polegadas) em largura, refletindo práticas locais de plantio.

[00115] Análises dos dados de rendimento foram realizadas usando Vewrsion 9.1.3 de SAS/STAT software (SAS Institute Inc., 2003). Análises de cálculos de variância foram realizadas usando os procedimentos MIXED e GLIMMIX. Partes separadas foram identificadas individualmente em cada localização através de cálculo de residuais de Student suprimidos com relação ao correspondente modelo linear para uma localização única, comparando aqueles residuais a zero usando testes-t em uma taxa de erro Tipo I de experimento de 5% usando valores-p ajustados - Bonferroni, e removendo os não residentes identificados. Após dois passes através dos dados, todas as observações restantes foram incluídas nas análises. Rendimento foi determinado para cada horta, e analisado usando um modelo misto com efeitos fixos para construções e eventos abrigados dentro de construções e efeitos randômicos para localizações, revoluções dentro de localizações, e a interação de localizações com construções. Estas análises foram realizadas separadamente para cada híbrido. Comparações de evento e médias de construção para entradas emparelhadas negativas foram feitas com testes-t aplicados a médias de quadrados mínimos. Estabilidade de rendimento foi examinada através de comparação de estimativas de regressão linear simples derivadas de eventos positivos e negativos. Em ambos os casos, o modelo de regressão incluiu o rendimento médio do evento em uma localização como a resposta e o rendimento médio de um pedigree de verificação comercial na mesma localização como o

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66/70 preditor. Entradas positivas e negativas foram então comparadas através de uso de seus rendimentos previstos a partir de modelo de regressão em vários rendimentos marcos da verificação comercial.

[00116] Plantas de milho MON87460 exibiram aperfeiçoamento no fim de rendimento de grão de estação através de diferentes entradas híbridas e sob ambos regimes de tensão de água quando comparadas a um controle tipo selvagem convencional do mesmo fundo genético (Tabela 10). Benefícios de rendimento nestes experimentos variaram de 11 % a tanto quanto 21 % através de valores de rendimento que variaram de 6,4 a 8,5t/Há. O evento CspB transgênico consistentemente rendeu mais que controles não-transgênicos por pelo menos 0,5 t/Ha em 12 de 15 tratamentos de tensão reprodutiva e 13 de 15 tratamentos de tensão vegetatíva.

Tabela 10. Resultados de rendimento de MON87460 de condições de déficit de água de irrigação gerenciada

Classe de tensão	Entrada	Rendimento médio Os (VHa)	Rendimento médio de veri- ficação (VHa)	Diferença VHa	% diferença
Vegetatíva	Hpibrido 1 (positivo)	10,1	8,5	1,6	19
Reprodu- tiva	Híbrido 1 (positivo)	9,0	7,7	1,3	16
Toda tensão	Híbrido 1 (positivo)	9,1	7,9	1,1	14
Vegetatíva	Híbrido 2 (positivo)	7,7	6,5	1,2	18

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Reprodu- tiva	Híbrido 2 (positivo)	8,1	6,8	1,3	19
Toda tensão	Híbrido 2 (positivo)	7,7	6,4	1,3	21
Vegetativa	Híbrido 3 (positivo)	8,3	7,2	1,1	16
Reprodu- tiva	Híbrido 3 (positivo)	8,9	8,0	0,9	11
Toda tensão	Híbrido 3 (positivo)	8,8	7,9	0,9	12

Ό0117] Uma análise multi-anos também foi conduzida com MON87460 para avaliar a estabilidade das vantagens de rendimento através de localizações sob condições de limitação de água. Localizações que experimentaram algum nível de tensão de água, onde reduções de rendimento variaram de 20 a 80%, foram compiladas e analisadas. Vantagens de rendimento foram evidentes através de múltiplos anos de testes e sob uma ampla faixa de ambientes com variáveis graus de tensão de déficit de água.

[00118] Através de quatro anos de testes, MON87460 demonstrou um benefício de rendimento médio de 10,5% através de três cruzamentos de testes híbridos sob testes ambientais de tensão gerenciada. A vantagem de rendimento médio cada ano foi 0,89, 0,48, 0,49 e 0,79 t/Ha, representando porcentagens de aumentos de 13,4, 6,7, 10,5 e 11,3 %, respectivamente.

[00119] Avaliações de mercado Dryland de entradas de híbrido MON87460 foram conduzidas nos estados de Dakota do Sul, Nebraska e Kansas. Localizações foram selecionadas nas bases de padrões meteorológicos históricos e rendimentos de condado médios de 4,5 a 7,7 t/Há. Cada localização de experimento foi designada como um desenho de bloco não-balanceado horta-dividida e plantado com uma réplica

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68/70 única por localização. Hortas foram de 30,48 m (100 pés) de comprimento e quatro fileiras de largura e densidades de população final refletiram práticas locais de plantio sob condições não-irrigadas de aproximadamente 200 plantas por fileira de 30,48 m (100 pés). Espaçamento de fileiras variou de 76,2 a 101,6 centímetros (30 a 40 polegadas), refletindo práticas locais de plantio. Estações meteorológicas foram instaladas em cada localização e os experimentos foram monitorados para sinais de tensão de déficit de água por toda estação. Nenhuma água suplementar foi provida. Dados ambientais foram coletados e padrões meteorológicos sazonais, incluindo acumulação de chuva, foram utilizados para classificar a tensão de déficit de água durante a estação para cada localização de terra seca. 12 das localizações plantadas através destes três estados foram de categoria como tendo experimentado tensão de água durante estágios desenvolvimentais vegetativo tardio para reprodutivo e foram utilizadas para análises.

[00120] Benefícios de rendimento foram observados nos três fundos híbridos que foram avaliados sob condições de déficit de água controlado descritas na Tabela 10. Quando comparado com o controle nãotransgene, o evento MON87460 provê benefícios de rendimentos de até 0,75 t/Ha, ou 15%. Estas condições de crescimento em terra seca criaram um ambiente de menor rendimento (rendimento médio dos controles foi de 4,9 t/Ha) que as localizações de déficit de água controlado onde rendimentos totais dos controles variaram de 6,4 a 8,5 t/Ha. [00121] Assim, signiicantes aperfeiçoamentos de rendimento foram obtidos com MON87460 sob ambientes de seca controlada assim como sob condições de terra seca do oeste tensionada de água. MON87460 provê tolerância a tensão de água através de uso de água mais eficie ntemente que controles negativos através de liberação de aperfeiçoadas taxas de crescimento e rendimentos de grãos sob condições de tensão de água enquanto usando equivalente ou menos água.

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Exemplo 10. Multiplicação de plantas para produção de plantas MON87460 tolerantes a herbicida [00122] Plantas evento MON87460 são cruzadas com uma planta de milho tolerante a herbicida expressando um gene 5-enolpiruvilshikimate-3-fosfato sintase (EPSPS) resistente a glifosato para gerar pplantas aperfeiçoadas tendo ambas, tolerância déficit de água e tolerância a herbicida. De particular interesse é um cruzamento de planta de milho de evento MON87460 para uma planta eevento de milho tolerante a herbicida designada como evento PV-ZMGT32 (nk603) e descrita em US6825400.

[00123] Cruzamento é conduzido com as duas linhagens endogâmicas homozigotos, uma de MON87460 e uma de PV-ZMGT32 (nk603) para produzir semente híbrida para plantio comercial de uma colheita de milho tendo tolerância a herbicida e a déficit de água.

[00124] Alternativamente, uma linhagem endogâmica única compreendendo ambos MON87460 e PV-ZMGT32 (nk603) é gerada usando um processo de multiplicação de retrocruzamento de parente recorrente para produzir um homozigoto de linhagem fixa para ambas características. A linhagem endogâmica desenvolvida desta maneira exibe características de tolerância a déficit de água e tolerância a herbicida. A linhagem endogâmicas é cruzada com uma segunda linhagem endogâmica, que pode ser uma linhagem tipo selvagem elite ou uma linhagem evento elite demonstrando uma ou mais características aperfeiçoadas, para produção de semente híbrida para plantio para produção de uma colheita de milho aperfeiçoada.

[00125] Todos os materiais e processos aqui mostrados e reivindicados podem ser fabricados e usados sem indevida experimentação como instruído pela descrição acima. Embora os materiais e processos desta invenção tenham sido descritos em termos de realizações preferidas e exemplos ilustrativos, será aparente para aqueles versados na técnica

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70/70 que variações podem ser aplicadas aos materiais e processos aqui descritos sem se fugir do conceito, espírito e escopo da invenção. Todos tais substitutos e modificações similares aparentes para aqueles versados na técnica são julgadas estarem dentro do espírito, escopo e conceito da invenção como definida pelas reivindicações apostas.

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1/1

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método de produção de uma planta de milho tolerante a seca, caracterizado pelo fato de que compreende o cruzamento de uma primeira planta de milho parente tolerante a seca obtenível a partir de uma semente depositada no American Type Culture Collection (ATCC) e designado acesso No. PTA-8910 ou uma progênie da mesma, e uma segunda planta de milho parental, produzindo assim uma pluralidade de plantas de progênie tolerantes a seca.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ditas primeira e segunda plantas de milho são plantas endogâmicas e em que a semente de milho híbrida é produzida.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que SEQ ID NO 24 está presente nas sementes de progênie tolerantes à seca.

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   1/5

   CR-Ec.rop- θ'

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   2/5

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   3/5

   FIG 3

   Região de junção de DNA de transgene e genômico de MON87460 gaggtcctgtatggaatcgtgttcgtttatttcccgggggccggggcaaaaaagacggcaatgg attgttggacttgacatgtgcggtgcgtgggtccaacccggcctggcttttgggccagcgcggg ccgacatagtgaggcccaaaatttaaaaagcacagctgcaggcccacggaaccagtggttatga aaaacggaaacaaagatagtaaattttacctccttaaattgccaccgtatccaatatccaaatt caggtaatctattcctataaagcaccaatttccgctcttttcatctatcgtctgtcatgcgctc tgttcctctccatcgtgtatcgcagataaaaggttacatgcatttccatgcatgtgatgggata aaaacaagaaaaaaggttgacatgcatttccatgcagataaaaggttacatggatttccttgga gaaagtataataagactaaatgctgaggcggaggagagagagagaggagatgtgggtagtaaac ttttagtcatctttgacacaagatcaaagaagatttgtgaaattatgcattaaaatatcgaaga gctaactactacacgaataagctaaatggtaggctgcaaaggtgattacagctagcagttgact ctattattaaacttcctcttagggcaacagtagttggaaaggtttttttggtgctgcccagatg caaactaaaatccatgcatcctctctcaacctggaaggtgggcctaaaaaagatgatctaccat ccacggatccacctgtcagctcaagttattgggtttaggaaacagggacctacgtggagatgtg tgctggacgggcgggcctcccacctgtcacgccgcaggcggaacggtgcgaaacgacgcacgct tttgctgtgcgcctgtgcgtctggcggtcagcgcgagcgtgactgcgttttcgtttgcgttaga cgacgatcatcgctggaaatttggtattctctcacgttgaaggaaaatggattggagggagtat gtagataaattttcaaagcgttagacggctgtctttGAGGAGGATCGCGAGCCAGCGACGAGGC

   CGGCCCTCCCTCCGCTTCCAAAGAAACGCCCCCCATCGCCACTATATACATACCCCCCCCTCTC

   CTCCCATCCCCCCAACCCTACCACCACCACCACCACCACCTCCACCTCCTCCCCCCTCGCTGCC

   GGACGACGAGCTCCTCCCCCCTCCCCCTCCGCCGCCGCCGCGCCGGTAACCACCCCGCCCCTCT

   CCTCTTTCTTTCTCCGTTTTTTTTTTCCGTCTCGGTCTCGATCTTTGGCCTTGGTAGTTTGGGT

   GGGCGAGAGGCGGCTTCGTGCGCGCCCAGATCGGTGCGCGGGAGGGGCGGGATCTCGCGGCTGG

   GGCTCTCGCCGGCGTGGATCCGGCCCGGATCTCGCGGGGAATGGGGCTCTCGGATGTAGATCTG

   CGATCCGCCGTTGTTGGGGGAGATGATGGGGGGTTTAAAATTTCCGCCATGCTAAACAAGATCA

   GGAAGAGGGGAAAAGGGCACTATGGTTTATATTTTTATATATTTCTGCTGCTTCGTCAGGCTTA

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   CCATGGTAGAAGGTAAAGTAAAATGGTTCAACTCTGAAAAAGGTTTCGGATTCATCGAAGTAGA

   AGGTCAAGACGATGTATTCGTTCATTTCTCTGCTATTCAAGGCGAAGGCTTCAAAACTTTAGAA

   GAAGGCCAAGCTGTTTCTTTTGAAATCGTTGAAGGAAACCGCGGACCACAAGCTGCTAACGTTA

   CTAAAGAAGCGTGAATTTAAATGGGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGCTATATCATCAATTTA

   TGTATTACACATAATATCGCACTCAGTCTTTCATCTACGGCAATGTACCAGCTGATATAATCAG

   TTATTGAAATATTTCTGAATTTAAACTTGCATCAATAAATTTATGTTTTTGCTTGGACTATAAT

   ACCTGACTTGTTATTTTATCAATAAATATTTAAACTATATTTCTTTCAAGATATCATTCTTTAC

   AAGTATACGTGTTTAAATTGAATACCATAAATTTTTATTTTTCAAATACATGTAAAATTATGAA

   ATGGGAGTGGTGGCGACCGAGCTCAAGCACACTTCAATTCCTATAACGGACCAAATCGCAAAAA

   TTATAATAACATATTATTTCATCCTGGATTAAAAGAAAGTCACCGGGGATTATTTTGTGACGCC

   GATTACATACGGCGACAATAAAGACATTGGAAATCGTAGTACATATTGGAATACACTGATTATA

   TTAATGATGAATACATACTTTAATATCCTTACGTAGGATCGATCCGAATTCGCGACACGCGGCC

   GCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCCCTTAATTAAGGGGGCTGCAGGAATTCATAACTTCGTATAA
4. 4/5

   TGTATGCTATACGAAGTTATAGCTTGGTCGAGTGGAAGCTAGCTTTCCGATCCTACCTGTCACT

   TCATCAAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCACCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAA

   GGCTATCATTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGC

   ATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATACTTCCA

   CTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAG

   TTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTGAAATCACCAGTCTCTCTCTACAAGATCGGGGATCTCT

   AGCTAGACGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGG

   GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGT

   TCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAA

   TGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCT

   GTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGG atctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcg

   GCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGA

   GCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGC

   TCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGT

   GACGCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATC

   GACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTG

   CTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGA

   TTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCG

   ATCCCCAATTCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCC

   GGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGT

   AATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATA

   CGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATG

   TTACTAGATCGGGGATCGGGCCACTCGACCAAGCTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAA

   GTTATCGCGCCAAATCGTGAAGTTTCTCATCTAAGCCCCCATTTGGACGTGAATGTAGACACGT

   CGAAATAAAGATTTCCGAATTAGAATAATTTGTTTATTGCTTTCGCCTATAAATACGACGGATC

   GTAATTTGTCGTTTTATCAAAATGTACTTTCATTTTATAATAACGCTGCGGACATCTACATTTT

   TGAATTGAAAAAAAATTGGTAATTACTCTTTCTTTTTCTCCATATTGACCATCATACTCATTGC

   TGATCCATGTAGATTTCacgttgaagaaaaatggatggagggaggaagtagataaagttttttg ttgtatattgtgattttaatttgaaatcaagcttggtcaaaccgtggccgaaatttggcctggc cactaatggccatgaaccaagcgtagtttgccgattaccccgtcccgacggtacgactttctct aatcgctcggttactgtccctgcaacctgcatctcatgactccaggccggcccaacaccagcag cgaccgcgaccaggctcctcctcctcctccagccacgggcaagaggccgcgcgcatgctctcgc tcctgttcccggtaatccggcccagtaccttggtaccgcaccgtacctgtaatctctatctcta gttctctagtacatattaagtcaatagtgtagactgtaacactaccatgacttcatcctccctt acctcgctctctgcgcacgcacaaaccacccttccgccccatataggagccgatatcgtgcccc ccgtcctggccgcacgcttccctaacccctcgtggactaggcttcccctccacgacgaggccac gacaatggttgcccccgcacgacgaggccgcggtgtgggcgaaggaggcgacgtgacctacagt ccaaggcctcacatccacatacatgcgtcatctaattgattaatctatagcctggtcgcgctgt gctgctactgcttgatcgacgagtgctgttgcgacccgtctgtcatcttcgtcagctagacgaa gcatccgagtacaactctaaacatacgaacattttaataacgagagcatataacgataaatagt gcttctacattaatgtatgttatcaatacttattgactcagtgacaaagcacggacatacatct agtagttaataataaaaataaataattaccttattaaacgatcatttattatataaatgtattt attttttatgtacatataataagttattacaatctgacaatatatataagtgatagaacataaa gtagaggaacaaacggaacgtaaaggaaaacgaagctagtcaggtagatgctcccgaggacaaa
5. 5/5 aaaaaaggggcatagttgtcaagtttaatcttcccaagttttatcttacgtagtagtagagcga gagcggtccaattaagggcacgcacagttgcagcaggtgcagggctccagtagccgcggcgggt acgctcgcagtcgcagggcgccgcgcctagttctgctgcccggcccgggtcatgaaccaac